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CRECIMIENTO BACTERIANO

Maier R.M & Pepper I.L. Chapter 3, Bacterial Growth en: Pepper I.L., Gerba Ch.P. &
Gentry T.J. 2015 (2014). Environmental Microbiology. 3 rd Edition, Academic Press.
U.S.A. p 37-56.
Los microorganismos dirigen una serie de reacciones qumicas altamente
organizadas que colectivamente son conocidas como metabolismo. Hay varios
cientos de reacciones potenciales en una clula microbiana, muchas de las cuales
son utilizadas para hacer nuevas clulas. Estas reacciones son conocidas como
metabolismo del crecimiento. Otras reacciones son conocidas como reacciones de
no-crecimiento, y son necesarias para la actividad celular tales como el
mantenimiento de la poza de metabolitos celulares, reparacin de la estructura
celular, movilidad y respuesta al estrs ambiental. (Schaechter et al., 2006). En el
laboratorio, nosotros podemos manipular las condiciones para que las clulas
mantengan el metabolismo de crecimiento la mayor parte del tiempo. En el
ambiente es una historia diferente muchos microorganismos estn en el estado de
no-crecimiento, simplemente sobreviven y estn a la espera de nuevas fuentes de
nutrientes.
Absolutamente, el metabolismo es un proceso complejo que involucra
numerosas reacciones: anablicas (sntesis de constituyentes y metabolitos
celulares) y catablicas (rompimiento de constituyentes y metabolitos celulares).
Finalmente, esas reacciones biosintticas darn como resultado la divisin celular
como se muestra en la Figura 3.1. En un medio de cultivo rico y homogneo, bajo
condiciones ideales, una bacteria puede dividirse en tan poco tiempo como cada 10
min. En contraste, ha sido sugerido que la divisin celular puede ocurrir tan
lentamente como una vez cada 100 aos en un ambiente terrestre en el subsuelo.
Este crecimiento lento es el resultado de la combinacin de factores, incluyendo el
hecho de que la mayora de ambientes del subsuelo son tanto pobres en nutrientes
como heterogneos. Como resultado, las clulas estn como aisladas y no pueden
compartir nutrientes y mecanismos de proteccin, y as tienen tasas de crecimiento
muy bajas.
Mucha de la informacin concerniente al crecimiento de los microorganismos
es el resultado de estudios de laboratorio controlados usando cultivos puros de
microorganismos. Hay dos aproximaciones al estudio del crecimiento bajo
condiciones controladas: cultivo por lote y cultivo continu. En un cultivo por lote, el
crecimiento de un nico organismo o de un grupo de organismos, llamado consorcio,
es evaluado usando un medio definido para el cul la cantidad de sustrato
(alimento) adicionado es determinado o fijo. En el cultivo continuo, hay una entrada
estable de medio y sustrato de crecimiento, de tal forma que la cantidad de sustrato
disponible siempre permanece igual. Las condiciones de cultivo del crecimiento,
tanto por lote como continuo, han sido fisiolgicamente bien caracterizadas y
tambin descritas matemticamente. Esta informacin ha sido usada para optimizar
la produccin comercial de una variedad de productos microbianos incluyendo:
antibiticos, vitaminas, aminocidos, enzimas, levadura, vinagre y bebidas
alcohlicas. Estos materiales frecuentemente son producidos en grandes lotes
(hasta de 500,000 litros), tambin llamado fermentacin a gran escala.
Desafortunadamente, es difcil trasferir el conocimiento del crecimiento bajo
condiciones controladas de laboratorio, al entendimiento del crecimiento en
ambientes como el terrestre o el acutico, donde los niveles de complejidad que se
encuentran son enormes (Figura 3.2). Esta complejidad proviene de n nmero de
factores, incluyendo un arreglo de diferentes tipos de superficies slidas,
1

microambientes que tienen propiedades fsicas y qumicas alteradas y una


comunidad de diferentes microorganismos que compiten por los mismos nutrientes
limitados (ver captulo 4). As, el reto que tenemos es entender el crecimiento
microbiano en el ambiente natural. Ese entendimiento facilitar nuestra habilidad
para calcular las tasas de los ciclos biogeoqumicos (captulo 16), la respuesta
microbiana a las perturbaciones antropognicas, las interacciones microbianas con
los contaminantes orgnicos y metales (captulos 17 y 18) y el crecimiento y
sobrevivencia de los patgenos en el ambiente (captulo 22). En este captulo,
iniciamos con la revisin del crecimiento bajo condiciones de cultivo puro, y despus
discutimos como esto se compara al crecimiento en el ambiente.
3.1 CRECIMIENTO EN CULTIVO PURO EN MATRAZ
Tipicamente, para entender y definir el crecimiento de un aislado microbiano
particular, se colocan las clulas en un medio lquido en el cual los nutrientes y las
condiciones ambientales son controladas. Si el medio proporciona todos los
nutrientes requeridos para el crecimiento y los parmetros ambientales son
ptimos, el incremento en el nmero o biomasa bacteriana puede medirse como
una funcin del tiempo para obtener la curva de crecimiento. Varias son las fases
que pueden ser observadas en una curva de crecimiento (Figura 3.3). Estas
incluyen: fase lag, fase exponencial o log, fase estacionaria y fase de muerte. Cada
una de estas fases representa un periodo de crecimiento distinto que est asociado
con cambios fisiolgicos en el cultivo celular. Como veremos en las siguientes
secciones, las tasas de crecimiento asociadas con cada fase son totalmente
diferentes.
3.1.1 FASE LAG o FASE DE ADAPTACIN.
La primera fase observada bajo condiciones por lote es la fase lag, en la cual la
tasa de crecimiento poblacional es esencialmente CERO. Cuando un inculo es
puesto en un medio fresco, el crecimiento comienza despus de un periodo de
tiempo llamado fase lag. Por definicin, la transicin de la fase lag a la fase
exponencial ser despus de que la poblacin inicial se ha duplicado. La fase lag
puede deberse a la adaptacin fisiolgica de las clulas a las nuevas condiciones de
cultivo. Esto puede involucrar un tiempo requerido para la induccin de mRNA, y
subsecuente sntesis de protenas. La fase lag tambin puede deberse a la baja
densidad de organismos que resulta en la dilucin de exoenzimas (enzimas
liberadas
por las clulas) y nutrientes liberados por las clulas al crecer.
Normalmente, tales materiales son compartidos por las clulas de alrededor. Pero
cuando la densidad celular es baja, esos materiales estn diluidos y no son
adquiridos fcilmente. (Se puede decir que no hay quorum es decir, el nmero de
clulas que al segregar compuestos qumicos inducen la respuesta de la poblacin
quorum sensing; o algn tipo de simbiosis positiva)*. Como resultado, la iniciacin
del crecimiento y divisin celular puede retrasarse.
La fase lag usualmente dura de minutos a varias horas. La duracin de la fase lag
puede ser controlada, hasta cierto punto, porque depende del tipo de medio, as
como del tamao del inculo inicial. Por ejemplo, si el inculo es tomado de una fase
exponencial del medio de cultivo, soya tripticasa agar (TSB) y se coloca en el mismo
medio fresco a una concentracin de 10 6 clulas/ml, bajo las mismas condiciones
(temperatura, velocidad de agitacin), no se notar la fase lag. Sin embargo, si el
inculo proviene de un cultivo en fase estacionaria habr fase lag hasta que las
clulas de la fase estacionaria se ajusten a las nuevas condiciones, y cambien
2

fisiolgicamente las clulas de fase estacionaria a fase exponencial. Similarmente, si


el inculo es colocado en un medio diferente del que proviene (TSB), por ejemplo, a
un medio de sales minerales con glucosa como nica fuente de carbono, se
observar fase lag mientras las clulas se ajustan fisiolgicamente para sintetizar
las enzimas apropiadas para catabolizar la glucosa.
Finalmente, si el tamao del inculo es pequeo, por ejemplo 10 4 cels/ml, y se
mide actividad, tal como desaparicin de sustrato, la fase lag se observar hasta
que las clulas alcancen una poblacin de 10 6 cels/ml. Esto es ilustrado en la figura
3.4. la cul compara la degradacin de fenantreno en cultivos inoculados con 10 7 y
104 unidades formadoras de colonia (UFC) por mililitro. Aunque la tasa de
degradacin alcanzada es similar en ambos casos (compare la pendiente de cada
una de las curvas), la fase lag fue 1.5 das para el inculo de menor tamao (10 4
cels/ml), en contraste, la fase lag solo fue de 0.5 das cuando el inculo usado fue
mayor (107 cels/ml).

3.1.2 FASE EXPONENCIAL O FASE LOG


La segunda fase del crecimiento observado en un sistema estacionario es la fase
exponencial. Esta fase se caracteriza por un periodo de crecimiento exponencial el
crecimiento ms rpido posible bajo las condiciones establecida en el sistema
estacionario. Durante la fase exponencial la tasa de incremento en el nmero de
clulas en el cultivo es proporcional al nmero de clulas en cualquier tiempo. Hay
varias formas de expresar este concepto. Una forma es imaginar que durante el
crecimiento exponencial las clulas incrementan en progresin geomtrica: 2 0, 21,
22, 23, 24, despus de n divisiones, el nmero de clulas es 2 n. Esto puede
expresarse cuantitativamente como:
X = 2 n X0
(Ec. 3.1)
Donde: X0 = nmero inicial de clulas
X = nmero de clulas al tiempo t
n = nmero de generaciones o de divisiones celulares
Sacando logaritmos a la ecuacin 3.1 tenemos:
(Ec. 3.2)

ln X = n ln2 + ln X0

Durante la fase exponencial de crecimiento, si se conoce el nmero de clulas inicial


y el nmero de clulas en el tiempo t se puede calcular el nmero de
generaciones:
n = (ln X - ln X0)/0.693
(Ec.
3.3)
El ejemplo (mostrado como: Example Calculation 3.1 pgina 40) muestra que si uno
inicia con un nmero bajo de clulas, el crecimiento exponencial no produce
inicialmente nmeros grandes de clulas. Sin embargo, como las clulas se
acumulan despus de varias generaciones, el nmero de clulas nuevas incrementa
drsticamente con cada divisin celular. El ejemplo (Example Calculation 3.2)
demuestra cmo puede calcularse el nmero de generaciones y el tiempo de
generacin media.
Mientras que el cultivo este en la fase exponencial o logartmica, se dice que el
cultivo mantiene un crecimiento balanceado.

3.1.2.1
Tiempo de generacin media versus tasa de crecimiento
especfico
Dos trminos son usados para describir el crecimiento en fase exponencial, que son:
el tiempo de generacin y la tasa de crecimiento especfico. Conociendo n y el
tiempo que dur la fase, podemos calcular el tiempo de generacin: g = t/n, el
cual se refiere al tiempo que la clula requiere para duplicarse. Otro trmino
utilizado para describir la fase de crecimiento exponencial es la tasa de
crecimiento especfico que es la tasa mxima de crecimiento que puede alcanzar
dadas las condiciones ambientales en las que se encuentra (sustrato ilimitado,
temperatura, etc.). Cuando el sustrato llega hacer limitante o se producen
subproductos txicos, las clulas dejarn la fase exponencial con el concomitante
decrecimiento de la tasa de crecimiento.
En esta fase exponencial se dice que el crecimiento es balanceado y
matemticamente se expresa como:
dX/dt = X
(Ec.3-4)
donde:

Por integracin:

dX/dt = es el cambio en el nmero de clula en el tiempo t


= es la tasa de crecimiento especfico expresado en h -1
X/X0 = et

(Ec. 3.5)
ln X/X0 = ln X ln X0 = t

Sacando logaritmo natural a ambos lados

= (ln X ln X0)/t

(Ec.

3.6)
As, la tasa de crecimiento especfico en la fase exponencial es la pendiente de la
curva de crecimiento.
3.1.3 FASE ESTACIONARIA.
La tercera fase del crecimiento en un cultivo estacionario puede definirse como un
estado de NO crecimiento neto, el cul puede ser expresado por la siguiente
ecuacin:
dX/dt = 0
(Ec. 3.8)
Aunque NO hay crecimiento neto en la fase estacionaria, las clulas aun crecen y se
dividen. El crecimiento esta simplemente equilibrado por igual nmero de clulas
que mueren. Hay varias razones para que el crecimiento alcance la fase estacionaria
en un cultivo por lote:
La fuente de carbono y de energa o un nutriente esencial se vuelve limitante.
(Cuando una fuente de carbono se usa completamente, no quiere decir que
necesariamente el crecimiento se detenga; esto es porque las clulas que
mueren pueden lisarse y proveer de fuentes de nutrientes reciclados). El
crecimiento obtenido del uso de clulas muertas es llamado metabolismo
endgeno. El metabolismo endgeno se presenta durante el ciclo de
crecimiento, pero puede ser mejor observado durante la fase estacionaria
cuando el crecimiento es medido en trminos de consumo de oxgeno o
produccin de CO2. As se puede observar un ligero crecimiento.
Los productos de desechos aumentan a un punto que inhiben el crecimiento
celular o son txicos para las clulas. Esto generalmente ocurre en cultivos
con alta densidad celular.
4

En esta fase se presenta un crecimiento desbalanceado, porque es ms fcil para


las clulas sintetizar algunos compuestos pero no otros. Finalmente, desde que el
reuso de algunos componentes no es 100% eficiente, mueren ms clulas de las
que se producen y el cultivo entrar en la fase de muerte.
3.1.4 FASE DE MUERTE.
La fase final de la curva de crecimiento es la fase de muerte, la cual se caracteriza
por la prdida neta de clulas cultivables. La fase de muerte es frecuentemente
exponencial, aunque la tasa de clulas que mueren es ms lenta que la tasa de
crecimiento durante la fase exponencial. La fase de muerte puede describirse por la
siguiente frmula:
dX/dt = -kd X
donde kd es la tasa de muerte especfica
(Ec. 3.9)
La tcnica en la que se mide el crecimiento puede influir la forma de la curva de
crecimiento. Por ejemplo: si el crecimiento es medido por densidad ptica, en lugar
de por cuenta viable, la fase de muerte no ser aparente. De la misma manera, si
uno examina el crecimiento por la cantidad de CO 2 producido, mostrar un ligero
crecimiento debido a la utilizacin del carbono y nutrientes que liberan las clulas
que se mueren y que aprovechan las clulas viables.
3.1.5 EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO EN EL CRECIMIENTO.
Las ecuaciones que describen el crecimiento microbiano pueden ser muy complejas.
Sin embargo, Monod (1940) hizo la primera y simple descripcin con la siguiente
ecuacin:
= max S/ (Ks + S)

(Ec. 3.10)

Donde:
= tasa de crecimiento especfico (1/tiempo)
max = tasa de crecimiento especfico mxima (1/tiempo) para el cultivo
S = concentracin del sustrato (masa/volumen)
Ks = constante de afinidad (masa/volumen), o
constante a la mitad de saturacin (masa/volumen)
La ecuacin se obtuvo de unos experimentos donde demostr que a baja
concentracin de sustrato, la tasa de crecimiento est en funcin del sustrato.
Las dos constantes max y Ks reflejan propiedades fisiolgicas intrnsecas de un
microorganismo particular. Tambin dependen del sustrato utilizado y de la
temperatura de crecimiento. En su ecuacin, Monod asume que solo el sustrato es
limitante en el crecimiento y no otros nutrientes, as como que no hay produccin de
compuestos txicos por el metabolismo.
La ecuacin de Monod puede ser expresada en funcin del nmero de clulas, al
sustituir en la ecuacin la tasa de crecimiento especfico ():
dX/dt = max S X / (Ks + S)
(Ec. 3.11)
La ecuacin tiene dos casos limitantes, uno es cuando el sustrato est en una
concentracin mucho mayor que Ks, por lo que = max entonces:
dX/dt = max
X
(Ec. 3.12)
Este tipo de crecimiento ideal es poco probable que se lleve a cabo en condiciones
naturales como el suelo o el agua, donde el sustrato o nutrientes comnmente son
limitantes.
5

Y el segundo caso ocurre cuando el sustrato est en muy baja concentracin, en


este caso hay una dependencia de primer orden sobre la concentracin de sustrato
dX/dt = max S X / Ks
(Ec. 3.13)
Es decir, el crecimiento depende totalmente de la concentracin de sustrato. Este
tipo de crecimiento sera ms tpicamente esperado bajo las condiciones
prevalecientes en ambientes naturales, donde el sustrato y los nutrientes son
limitantes.
La ecuacin de Monod puede tambin ser expresada en funcin de la utilizacin del
sustrato, dado que el crecimiento est relacionado a la utilizacin del sustrato por
una constante llamada Y (cell yield) rendimiento, produccin o cosecha celular:
dS/dt = -(1/Y *dX/dt)
(Ec. 3.14)
donde Y = rendimiento celular (masa/masa)
El coeficiente del rendimiento o produccin celular est definido como la unidad de
masa celular producida por unidad de sustrato consumido. Entonces, entre mayor
sea la eficiencia en la degradacin del sustrato mayor ser el valor del coeficiente
de produccin celular. Como se muestra abajo se puede expresar el crecimiento
microbiano en trminos de la desaparicin del sustrato:
dS/dt = -(1/Y * ( max S X / (Ks + S))
(Ec- 3.15)
La descripcin del crecimiento en cultivo por lote es de gran
importancia econmica en trminos de produccin de una amplia
variedad de productos microbianos.
3.2.

CULTIVO CONTINUO

El cultivo continuo puede ser operado por largos periodos de tiempo porque es un
sistema abierto, con una alimentacin continua de una solucin que contiene
nutrientes y sustratos. Por lo que tambin tiene una continua salida de solucin que
tiene clulas, metabolitos, productos de desecho y cualquier nutriente y sustrato no
utilizado. El contenedor es llamado BIORREACTOR o QUIMIOSTATO y uno puede
controlar la tasa de flujo y mantener constante la concentracin de sustrato, as
como tener un continuo control del pH, temperatura y niveles de oxgeno. Esto
permite el control de la tasa de crecimiento, lo cual puede ser usado para optimizar
la produccin de productos microbianos especficos. Por ejemplo, metabolitos
primarios o productos asociados al crecimiento, tales como etanol, son producidos
en tasas de dilucin altas las cuales estimulan el crecimiento celular, en contraste,
un metabolito secundario o producto asociado a no-crecimiento tal como los
antibiticos son producidos en tasas de dilucin bajas, lo cual mantiene un alto
nmero de clulas.
La ventaja del quimiostato es la remocin constante de efectos del crecimiento
secundario que pueden enmascarar o alterar cambios fisiolgicos bajo condiciones
de cultivo estacionario. (El crecimiento secundario, como se mencion
anteriormente, se refiere al uso de las molculas que constituyen a las clulas que
se mueren).
La velocidad de dilucin y la concentracin de sustrato que entra son los dos
parmetros controlados en un quimiostato para estudiar el crecimiento microbiano o
para optimizar la produccin de metabolitos. Controlando la velocidad de dilucin
uno puede controlar la tasa de crecimiento () en el quimiostato. Controlando la
concentracin de sustrato que entra, uno puede controlar el nmero de clulas
producidas o la produccin o rendimiento celular (Y) en el quimiostato, ya que las
6

clulas producidas sern directamente proporcionales a la cantidad de sustrato


proveda. Porque la tasa de crecimiento y el nmero de clulas pueden ser
controladas independientemente, el quimiostato ha sido una herramienta
importante en el estudio de la fisiologa del crecimiento microbiano. Tambin son
tiles en el desarrollo a largo trmino de cultivos y consorcios que son aclimatados a
contaminantes orgnicos que son txicos o difciles de degradar. El quimiostato
tambin produce productos microbianos de forma ms eficiente que las
fermentaciones estacionarias. Esto es porque el quimiostato puede esencialmente
mantener la fase exponencial del crecimiento por largos periodos de tiempo. Sin
embargo, el quimiostato no es ampliamente utilizado para obtener productos
microbianos porque frecuentemente es difcil mantener las condiciones de
esterilidad por largos periodos de tiempo.
En un quimiostato, el cambio en biomasa con el tiempo es:
dX/dt = X DX
(Ec. 3.16)
donde:
X = masa celular (masa/volumen)
= tasa de crecimiento especfico (1/tiempo)
D = velocidad de dilucin (1/tiempo)
Vemos que en un estado en equilibrio (no incremento ni decremento en biomasa)
ser alcanzado cuando = D. Si > D, la utilizacin de sustrato exceder el
abastecimiento de sustrato, ocasionando que la tasa de crecimiento disminuya
hasta que iguale la velocidad de dilucin. Si <D la cantidad de sustrato adicionado
rebasar la cantidad de sustrato utilizado, as la tasa de crecimiento aumentar
hasta igualar la velocidad de dilucin.
Este estado en equilibrio (steady state) puede ser obtenido y mantenido tanto
tiempo como la tasa o velocidad de dilucin no exceda la velocidad crtica, D c.
Sustituyendo ecuaciones:
Dc = max S / (Ks + S)
o
Dc = max (S / (Ks + S))
De la ecuacin se deduce que la operacin eficiente de un quimiostato puede ser
optimizada bajo condiciones en las cuales S>>K s y as Dc prcticamente ser igual
que max. Dc es un parmetro importante porque si el quimiostato es operado en
velocidades de dilucin menores que D c, la eficiencia no est optimizada; mientras
que si la velocidad de dilucin excede Dc, ocurrir el lavado de las clulas.

3.3

CRECIMIENTO EN EL AMBIENTE.

Cmo se relaciona el crecimiento en el ambiente con el crecimiento en matraz o


cultivo continuo?
Histricamente se ha clasificado a las bacterias del suelo con base al sustrato de
carbono que utilizan. El primero fue Winogradsky quien introdujo el sistema de
clasificacin ecolgico de autctonos vs zimgenos. Los autctonos metabolizan
lentamente en suelo, utilizan lentamente los nutrientes liberados de la materia
orgnica del suelo como un sustrato. Los zimgenos estn adaptados a intervalos
de latencia cuando el sustrato disponible es bajo, o crecen rpidamente cuando se
adiciona un sustrato fresco al suelo. En adicin a estas dos categoras, estn los
organismos alctonos, los cules son organismos recientemente introducidos
(dispersin o inoculacin) en el suelo y usualmente sobreviven por breves periodos
de tiempo.
La terminologa actual distingue dos tipos de microorganismos del suelo:
oligotrofos, aquellos que prefieren baja concentracin de sustrato y copiotrofos,
aquellos que prefieren alta concentracin de sustrato. Esto es similar a las
7

estrategias reproductivas r y k. Organismos que responden a la adicin de


nutrientes con una alta tasa de crecimiento son designados como estrategas r.
Mientras que los organismos k tienen una baja pero constante tasa de crecimiento
y bajo nmero de clulas en ambientes con pocos nutrientes. En realidad, la
comunidad del suelo normalmente tiene una permanencia continua de
microorganismos con varios niveles de requerimientos de nutrientes que van de
estrategas r obligados, o copiotrofos, a estrategas k obligados, u oligotrofos.
Tasas mximas de crecimiento y constantes de afinidad (Ks) se dan en la naturaleza
para ambos grupos de microorganismos.
Cuando consideramos microbios oligotrficos en el ambiente, es improbable que
ellos exhiban los estados de crecimiento observados en el matraz o en el
quimiostato. Estos microbios metabolizan lentamente y como resultado tienen
tiempos de generacin muy largos. Frecuentemente ellos usan energa obtenida de
metabolismo simple para mantenerse. Por otro lado, lo microbios copiotroficos
pueden presentar tasas de crecimiento elevadas y quizs crecimiento exponencial
por periodos de tiempo cortos, o pueden encontrarse en estado de latencia. El
crecimiento exponencial normalmente NO dura largos periodos de tiempo en el
ambiente. Ms bien, frecuentemente las bacterias alternan periodos de crecimiento
con periodos de NO crecimiento, (ej. Constantemente entran y salen de la fase
estacionaria). Las clulas latentes pueden llegar a ser viables pero no cultivables
(VBNC viable but not culturable) tiempo debido a condiciones de ayuno extenso o
daos reversibles.
Ambos casos (microbios oligotrficos y microbios copiotrficos en latencia)
contribuyen al hecho de que cuentas directas de una muestra ambiental, la cual
incluye todas las clulas vivas, son frecuentemente una o dos rdenes de magnitud
ms grandes que las cuentas viables, las cuales incluyen nicamente clulas
capaces de crecer en el medio de cultivo utilizado. Estudios utilizando ambas
metodologas, dependiente de cultivo e independiente de cultivo, sobre la misma
muestra, han mostrado que las bacterias cultivables del suelo, realmente son el
resultado de seleccionar a las especies menos abundantes o a los miembros de la
biosfera menos comn del suelo (soil rare biosphere) (Shade et al., 2012).
Las bacterias cultivables son realmente miembros atpicos de la
comunidad?...
(ver ejemplo en la pag. 201, inciso 10.3.1.2.)
Ejemplo insertado:
10.3.1.2. Miembros de la bisfera atpica
del suelo.
Los microorganismos que se encuentran en baja abundancia han
sido referidos como la bisfera atpica (Sogin et al., 2006). Sin
embargo, poco se conoce del significado de los microorganismos
atpicos dentro de la compleja comunidad microbiana. En estudio
reciente, muestras de suelo agrcola fueron analizadas por ambas
tcnicas: cultivo convencional y tecnologas independientes de
cultivo,
la
pirosecuenciacin
(Shade
et
al.,
2012).
Especficamente, las muestras de suelo fueron diluidas y
sembradas sobre un medio de aislamiento para rizsfera (tcnica
dependiente-cultivo). En adicin, las mismas muestras de suelo
fueron sometidas a extraccin de DNA de la comunidad (tcnica
independiente de cultivo). Tanto el DNA de la comunidad como el
DNA de las bacterias cultivadas estuvieron sujetas a
pirosecuenciacin de los genes 16S rRNA. Interesantemente, el
anlisis mostr que las bacterias obtenidas por cultivo estuvieron
en muy baja abundancia o ausentes de la comunidad cultivo8

independiente. As, el ensayo molecular cultivo-independiente


tiende a identificar los microbios ms abundantes en una matriz
ambiental,
mientras
los
ensayos
cultivo-dependientes
actualmente dan mayor acceso a la bisfera atpica. As surge
la pregunta:
Las bacterias cultivables son realmente miembros atpicos de
la comunidad?
3.3.1 FASE LAG DEL CRECIMIENTO EN EL AMBIENTE
La fase lag observada en un ambiente natural puede ser mucho ms larga que la
observada normalmente en cultivo estacionario. En algunos casos, esta fase tan
larga puede ser causada por un pequeo nmero de individuos de la poblacin que
son capaces de metabolizar el sustrato adicionado. Considere tambin que
compuestos qumicos considerados como contaminantes por el humano pueden ser
utilizados como fuente de sustrato para el crecimiento de aquellos microbios que
tengan el conjunto de enzimas necesarias para degradar el contaminante. En este
caso, ni la desaparicin del sustrato ni un aumento significativo del nmero de
clulas sern observados por varias generaciones. Note que en un cultivo puro la
transicin entre las fases lag y exponencial ocurre una vez que la poblacin ha
iniciado a duplicarse. Sin embargo, en el ambiente es difcil medir exactamente la
duplicacin de un pequeo subconjunto de la comunidad microbiana que est
respondiendo
a
la
adicin
de
nutrientes
incluyendo
contaminantes.
Alternativamente, poblaciones que pueden metabolizar el sustrato pueden estar
latentes o daadas, y requieren tiempo para recobrarse fisiolgicamente y continuar
metablicamente activas. El hecho de que el tiempo de generacin en el
crecimiento ambiental sea mucho ms largo puede deberse a una combinacin de la
disponibilidad de nutrientes limitantes y condiciones ambientales tales como la
temperatura o la humedad que no son ptimas para microbios especficos. As, no
es inusual observar periodos lag de meses o an aos despus de una aplicacin
inicial de un nuevo plaguicida sintetizado antropognicamente, para observar una
degradacin significativa. Sin embargo, una vez que un ambiente ha sido expuesto
a un nuevo plaguicida y desarrollado una comunidad para su degradacin, la
degradacin de subsecuentes aplicaciones del plaguicida ocurrirn con periodos lag
cada vez ms cortos. Este fenmeno es llamado aclimatacin o adaptacin y ha sido
observado con aplicaciones sucesivas de muchos plaguicidas inclusive el herbicida
cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D).
Una segunda explicacin para periodos lag largos en el ambiente es que la
comunidad con microbios genticamente capaces de utilizar una fuente de carbono
especfica puede no estar presente inicialmente dentro de las poblaciones
existentes. Esta situacin puede requerir una mutacin o un evento de transferencia
de genes para introducir los genes degradadores dentro de los microbios
autctonos. Por ejemplo, uno de los primeros casos documentados de transferencia
de genes en el suelo fue la transferencia del plsmido pJP4 de un organismo
introducido a una poblacin indgena del suelo. La transferencia del plsmido resulto
en una rpida y completa degradacin del herbicida 2,4 D dentro de un
microcosmos. En este estudio la transferencia de genes a la poblacin indgena fue
seguida por el crecimiento y sobrevivencia de los transconjugantes a niveles
significativos para realizar la degradacin.
3.3.2.

FASE EXPONENCIAL DEL CRECIMIENTO EN EL AMBIENTE


9

En el ambiente, la segunda fase del crecimiento, fase exponencial, ocurre por


periodos muy breves de tiempo seguida a la adicin de un sustrato. El sustrato
puede ser residuos de un cultivo, litera vegetal, exudados de races o contaminantes
adicionados o derramados en el ambiente. Seguido a la adicin del sustrato, esto es
las clulas zimgenas, muchas de las cuales estn inicialmente latentes, pueden
rpidamente responder a los nutrientes adicionados. Con la adicin del sustrato, las
clulas latentes comienzan a ser activas fisiolgicamente y en poco tiempo entran a
la fase exponencial hasta que el sustrato es utilizado o hasta que algn factor
limitante cause la disminucin de la degradacin del sustrato. As, en muchas
muestras ambientales las bacterias alternan entre periodos cortos de crecimiento
exponencial o balanceado y no crecimiento o crecimiento desbalanceado.
(En columnas de Winogradsky podemos observar en la columna 2 (adicionada
de sacarosa) como en la mayora de los casos en 24 o 48 horas aumento la turbidez
del agua y se agot el oxgeno presente (la resazurina quedo incolora o
completamente reducida), explicando que los organismo copiotrficos, zimgenos o
estrategas r, con la capacidad de utilizar sacarosa crecieron exponencialmente en
un tiempo muy corto. Evento que no sucedi en la columna 1 (testigo) ni en la 4
(oscuridad). Por otro lado, en la columna 3 (adicionada de detergente) se van
presentando cambios muy lentamente, es decir, si hay microbios capaces de tolerar
y degradar el contaminante, poco a poco van manifestando su actividad, la cual
podemos relacionar con su capacidad de degradar al detergente)*.
3.3.3 FASES ESTACIONARIA Y DE MUERTE DEL CRECIMIENTO EN AMBIENTES
NATURALES.
Como la mayora de clulas tienen periodos exponenciales muy cortos por las
limitaciones nutricionales y el estrs ambiental, las clulas morirn o, para prolongar
sobrevivencia, pueden regresar a la fase de latencia hasta que haya una nueva
fuente de nutrientes disponible. As, el periodo de la fase estacionaria es muy corto,
similar al de la fase exponencial. En contraste, la fase de muerte en muestras
ambientales puede ciertamente ser observado, por lo menos en trminos de
cuentas viables. Una vez que el nutriente adicionado es consumido, tanto clulas
viables como muertas llegan a ser presas de los protozoarios que actan como
predadores microbianos. Bacteriofagos tambin pueden infectar y lisar porciones
significativas de comunidades bacterianas vivas. Clulas muertas son rpidamente
utilizadas por microbios necrfagos, que reutilizan los sustratos de carbono y
nitrgeno disponible. As, el nmero de clulas cultivables incrementa en respuesta
a la adicin de nutrientes pero decrecer otra vez tan rpido para reestablecer los
niveles de antes de haber utilizado todos los nutrientes.
3.4

BALANCE DE MASAS DEL CRECIMIENTO

Durante el crecimiento hay normalmente un incremento en la masa celular lo cual


es reflejado en un incremento en el nmero de clulas. En este caso, uno puede
decir que las clulas estn metabolizando el sustrato bajo condiciones de
crecimiento. Sin embargo, en algunos casos, cuando la concentracin del sustrato o
algn otro nutriente es limitante, la utilizacin del sustrato se presenta sin
produccin de clulas nuevas. En este caso, la energa del sustrato utilizado es
usada para el mantenimiento requerido por la clula bajo condiciones de no
crecimiento. El nivel de energa requerido para el mantenimiento de la clula es
llamado energa de mantenimiento (Neidhardt et al., 1990).
Bajo condiciones de crecimiento o no-crecimiento, la cantidad de energa obtenida
por un microorganismo a travs de la oxidacin de un sustrato es reflejada en la
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cantidad de biomasa producida, o productividad celular (Y). El coeficiente de


produccin celular es definido como la cantidad de masa celular producida por
cantidad de sustrato consumido. Aunque la productividad celular es una constante,
el valor de la productividad celular es dependiente del sustrato que est siendo
utilizado. En general, entre ms reducido este el sustrato, mayor ser la cantidad de
energa que pueda ser obtenida a travs de su oxidacin. Por ejemplo, es
generalmente asumido que aproximadamente la mitad del carbono en
una
molcula de azcar o cido orgnico ser utilizada para producir masa celular
nueva, y la otra mitad ser convertida en CO 2, correspondiente a una productividad
celular (Y) de aproximadamente 0.4. Note que la molcula de glucosa (C 6H12O6) est
parcialmente oxidada porque la molcula tiene 6 tomos de oxgeno. Podemos
comparar esto con una productividad celular muy baja, Y=0.05 para
pentaclorofenol, el cual est altamente oxidado debido a la presencia de 5 tomos
de cloro; y una productividad celular muy alta, Y=1.49 para el octadecano, el cual
est completamente reducido. Como muestran estos ejemplos, algunos sustratos
soportan altos niveles de crecimiento y la produccin de ms biomasa celular que
otros.
Expliquemos porque hay tales diferencias en la productividad celular de esos tres
sustratos. Como los microbios han evolucionado, han desarrollado vas metablicas
estndar para carbohidratos comunes y sustratos que contienen protenas. Para
este tipo de sustratos, aproximadamente la mitad del carbono es utilizada para
construir masa celular nueva. Esto se traduce en una productividad celular de 0.4
para azcares como la glucosa. Sin embargo, desde que inicio la industrializacin,
iniciada a finales de 1880s, muchas molculas nuevas han sido manufacturadas
para las cuales no hay vas metablicas estndar. El pentaclorofenol es un ejemplo
de esas molculas. Este material ha sido producido desde 1936, y es uno de los
compuestos ms usados para el tratamiento de la madera y postes. Para utilizar una
molcula tal como el pentaclorofenol, la cual apareci en el ambiente relativamente
en forma reciente en escala evolutiva, un microbio debe de alterar la estructura
qumica para luego poder usar las vas catablicas estndar. Para el pentaclorofenol,
el cual tiene 5 enlaces C-Cl, significa que un microbio debe invertir una gran
cantidad de energa para romper los enlaces fuertes entre el carbono y un halgeno
antes de que el sustrato pueda ser utilizado para producir energa. Debido a que se
requiere de mucha energa para remover los cloros del pentaclorofenol,
relativamente poca energa queda para construir masa celular nueva. Esto resulta
en un valor muy bajo de productividad celular (Y).
En contraste, porque la productividad celular es tan alta para un hidrocarburo como
el octadecano? El octadecano es un hidrocarburo tpico de los que se encuentran en
los componentes del petrleo. Porque el petrleo es una antigua mezcla de
molculas formadas en los principios de la Tierra, existen vas catablicas estndar
para muchos de los componentes del petrleo incluido el octadecano. La
productividad celular es tan alta porque el octadecano es una molcula reducida.
Por lo que un hidrocarburo almacena mucha ms energa que una molcula que est
parcialmente reducida como los azcares. Esta energa es liberada durante el
metabolismo, permitiendo que el microorganismo obtenga ms energa de la
degradacin del octadecano que de la degradacin de la glucosa. Esto se refleja en
el mayor valor de productividad celular.
Ejemplo de clculos. Conversin del sustrato carbonado en masa celular y dixido
de carbono durante el crecimiento:
Problema: Un cultivo bacteriano es crecido con glucosa como nica fuente de
carbono y energa. El valor de produccin celular es determinado por anlisis del
peso seco siendo de 0.4 (ej. 0.4 g de masa celular son producidos por 1 g de
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glucosa utilizado). Qu porcentaje del carbono del sustrato (glucosa) ser


encontrado como masa celular y cuanto como CO 2?
Asumiendo que usted inicia con 1 mol de glucosa (C 6H12O6) el peso molecular es =
180 g/mol
(masa del sustrato) (valor de la produccin celular) = masa celular producida
(180 g)(0.4) = 72 g
La masa celular puede ser estimada como: C5H7NO2 con peso molecular = 113g/mol
mol de masa celular = 72 g masa celular/ 113 g/mol masa celular = 0.64 mol
masa celular
En trminos de carbono:
Para la masa celular: (0.64 mol masa cel.)(5 mol C/mol masa cel.)(12 g/mol C) =
38.4 g carbono
Para el sustrato: (1 mol glucosa)(6 mol C/mol glucosa)( 12 g/mol C) = 72 g carbono
El porcentaje de carbono de la glucosa encontrado en la masa celular es:
(38.4 g carbono / 72 g carbono)(100) = 53%
Y por diferencia 47 % de carbono es liberado como CO 2.
3.4.1 Condiciones aerbicas
Bajo condiciones aerbicas los microorganismos metabolizan sustratos por un
proceso conocido como respiracin aerbica. La completa oxidacin de una hexosa
bajo condiciones aerbicas es representada por la siguiente ecuacin de balance de
masas:
C6H12O6 + 6(O2) ----------- 6(CO2) + 6(H2O)
La oxidacin de la glucosa por microorganismos es ms compleja de lo que se
muestra en esta ecuacin porque algo del sustrato carbono es utilizado para
construir masa celular nueva y es por eso que no es oxidada completamente.
Entonces, la oxidacin aerbica de la glucosa puede ser descrita completamente por
la siguiente ecuacin de balance de masas (ligeramente ms compleja):
a (C6H12O6) + b(NH3) + c(O2) ------- d(C5H7NO2) e(CO2) + f(H2O)
donde a, b, c, d, e y f representan nmero de moles
Debe de enfatizarse que el proceso de degradacin es el mismo ya sea que el
sustrato sea rpidamente utilizado (glucosa) o solo utilizado lentamente como en el
caso de un contaminante tal como el benceno. La segunda ecuacin difiere de dos
formas: por un lado representa la produccin de masa celular nueva, estimada por
la frmula C5H7NO2 y para balancear la ecuacin tiene una fuente de nitrgeno entre
los reactantes, mostrado aqu como amoniaco NH 3.
La ecuacin de balance de masas tiene un nmero de aplicaciones prcticas. Este
puede ser usado para estimar la cantidad de oxgeno o nitrgeno requerido para el
crecimiento y utilizacin de un sustrato en particular. Esto es til para el tratamiento
de aguas, para la produccin de productos microbianos de alto valor (ej. Antibiticos
o vitaminas) y para remediacin de sitios contaminados.
3.4.2 Condiciones anaerbicas
La cantidad de oxgeno en la atmsfera (21%) asegura la degradacin aerbica para
la super produccin de materia orgnica producida anualmente. En ausencia de
oxgeno, la materia orgnica puede ser mineralizada a dixido de carbono por
fermentacin o por respiracin anaerbica, aunque estos son procesos menos
eficientes que la respiracin aerbica. En general el metabolismo anaerbico est
restringido a nichos saturados de agua como los sedimentos, cuerpos de agua
aislados dentro de lagos y ocanos y microambientes en suelos. La degradacin
anaerbica requiere de aceptores de electrones alternativos, ya sea un compuesto
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orgnico para la fermentacin o uno de una serie de compuestos inorgnicos (NO 3-,
Mn, SO4=, CO2) para la respiracin anaerbica. Durante la respiracin anaerbica el
aceptor de electrones terminal usado depender de la disponibilidad, y sigue una
secuencia que corresponde a la afinidad por los electrones de los aceptores de
electrones. Ejemplos de aceptores de electrones alternativos en orden decreciente
de afinidad de electrones son: nitratos (condiciones de nitrato reduccin),
manganeso, fierro, sulfato (en condiciones de reduccin para cada uno) y carbonato
(condiciones metanognicas). Ms recientemente se han identificado nuevos
aceptores de electrones terminales, entre ellos estn: arsenato, arsenito, selenato y
uranio IV (Stolz et al., 2006). Esto puede ser importante en ambientes donde stos
puedan ser encontrados en abundancia.
Frecuentemente, bajo condiciones anaerbicas, compuestos orgnicos son
degradados por un grupo interactivo o consorcio de microorganismos. Cada
individuo dentro del consorcio lleva a cabo un reaccin especializada que juntas
conducen a la mineralizacin del compuesto (Stams et al., 2006). El paso final en la
degradacin anaerbica es la metanognesis, la cual ocurre cuando otros aceptores
de electrones como nitrato y sulfato se han agotado. El resultado de la
metanognesis es la produccin de metano y es el tipo de metabolismo anxico ms
importante en los sedimentos de lagos de agua dulce. Metanognesis es tambin
importante en el tratamiento anaerbico de lodos residuales, en los cuales la
cantidad de nitrato o sulfato es muy pequea, comparada con la entrada de sustrato
orgnico. En este caso, aunque la concentracin de nitrato y sulfato son bajas, ellos
son de importancia bsica para el establecimiento y mantenimiento de un potencial
de electrones suficientemente bajo para permitir la proliferacin de la compleja
comunidad microbiana metanognica.
Se puede escribir una ecuacin de balance de masas muy similar a la de la
respiracin aerobia, para la respiracin anaerobia. Por ejemplo, la siguiente ecuacin
puede ser usada para describir la transformacin de materia orgnica en metano y
dixido de carbono:
CnHaOb + (n - a/2 b/4) H2O
-->
(n/2 a/8 + b/4)CO2 + (n/2 a/8 +
b/4)CH4
donde n, a y b representan el nmero de moles.
Note que despus de que ocurre la biodegradacin, el sustrato carbono es
encontrado en su forma ms oxidada CO2 o en su forma ms reducida CH4. Esto es
llamado desproporcin del carbono orgnico (algo similar ocurre en la sulfato
reduccin)*. La proporcin de metano a dixido de carbono encontrado en la mezcla
de gases, la cual resulta de la degradacin anaerbica depende del estado de
oxidacin del sustrato usado. Los carbohidratos son convertidos a aproximadamente
la misma cantidad de CH4 y CO2. Sustratos que son ms reducidos tales como el
metanol o lpidos producen relativamente cantidades mayores de metano, mientras
que sustratos que estn ms oxidados tales como el cido frmico u cido oxlico
producen relativamente menos metano.
(*) informacin adicional, no est en el texto del captulo.

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