Introdeucere

Biologia molecular a evoluat n ultimii 10 ani datorit progreselor

realizate n cercetrile de biochimie, genetic, tehnicilor de microscopie
electronic, tehnologia ADN recombinat i a informaticii. Toate acestea au
permis modificarea experimentului biologic cu a substratului molecular.
Ultimii ani s-au caracterizat prin accelerarea cercetrilor la nivelul
ntregului genom la multe specii.
Secvenializarea genomului uman a avut un rol important n biologia
molecular prin care, lumea tiinific de azi sper s neleag modul n care
acesta este organizat, cum funcioneaz i va permite tratarea unor boli. Gradul
nalt de conservare ale secvenelor genomului uman i a principalelor specii de
ferm, a permis folosirea hrilor fizice ale acestora.
Primul genom secvenializat aparinnd unei specii de ferm a fost cel
de gin (Hillier i col., 2004; Wong i col., 2004), taurine, iar n 2005 a
nceput cel de la suine. Existena acestor informaii va permite localizarea
genelor cu efect major asupra caracterelor economico-productive, va asigura
informaiile din domeniul molecular n managementul i ameliorarea
animalelor.
Numrul de markeri moleculari descoperii a crescut, iar o parte din
acetia vor fi folosii n programele de ameliorare, acolo unde se va considera
c pot mbunti progresul genetic. Informaiile provenite de la aceti markeri
vor fi completate cu performanele rezultate n urma testrii, ambele fiind luate
n considerare la estimarea valorii de ameliorare a unui anumit caracter,
mbuntindu-se acurateea estimrii sale i crend astfel, o generaie mai
valoroas din punct de vedere productiv sau al rezistenei la mbolnviri.
n Romnia exist o serie de uniti de cercetare dezvoltare cu
preocupri n ameliorarea i n identificarea markerilor moleculari la rasele
crescute de noi. Primele studii au fost realizate utiliznd markeri
imunohistochimici i biochimici (grupe sanguine i proteine serice pentru
taurine cabaline i ovine la IBNA Baloteti i la ICDB Baloteti. Alte uniti de
cercetare determin profilele proteinelor serice i din lapte pe care le coreleaz
cu diferitele caractere fenotipice de interes economic folosite n ameliorarea
ovinelor, ICDOC Palas Constana, SCDO Popui, SR Romsuin.
n domeniul diagnosticului i profilaxiei unor boli majore la animale
(gripa aviar, pesta porcin, etc) s-au fcut progrese remarcabile. Tehnicile de
biologie molecular se aplic n cadrul Institutului de Diagnostic i Sntate
Animal dar i n multe laboratoare sanitare veterinare judeene.
7

I. EVOLUIA CELULELOR
Lehninger (1992), consider celula ca o combinaie complex de
molecule organice capabile de autoorganizare, autoreplicare, schimb de energie
i materie cu mediul, prin intermediul unor reacii organice consecutive i
catalizate enzimatic.
Primii polimeri biologici sunt considerai acizii nucleici deoarece sunt
singurele molecule capabile de autoreglare (care ar fi putut servi drept matrice
pentru propria lor replicare).
n orice proces de copiere se produc inevitabil erori, care vor genera
copii imperfecte. Prin replicri repetate, secvena de nucleotide din
polinucleotidul original va suferi modificri importante. n acest mod va aprea
o varietate de molecule cu informaie diferit. n cazul ARN aceste molecule
diferite, care apar, pot explica proprietile fundamentale, forma i
comportamentul acestuia. Molecula de ADN posed dou caracteristici
speciale;
conine n secvena nucleotidelor informaia pe care o poate
transmite n procesul de sintez a proteinelor prin ARN mesager;
molecula are o structur unic de nfurare care permite s
interacioneze cu alte molecule si s rspund la condiiile de
mediu (ARN ribozomal i ARN de transfer).
Cele dou caracteristici una informaional i alta funcional reprezint
dou proprieti eseniale pentru evoluie. Secvena nucleotidic din ADN
reprezint genotipul, adic informaie transmisibil a unui organism, n timp ce
forma structural reprezint fenotipul, adic expresia informaiei genetice
asupra creia opereaz selecia natural (1, 34, 56, 86).
Dintre acizii nucleici ARN a aprut primul
Cercetrile de biologie molecular (1981) au artat c intronul, o
secven care se gsete n molecula de ARN premesager, dar care este
eliminat din ARN mesager matur, poate s se autoexcizeze din molecula
precursor, fr intervenie enzimatic. Apare prima dovad c ARN poate
funciona ca o enzim i c secvena intronic poate reprezenta enzima ARN
replicaza care ar cataliza propria replicareas.
n 1983 s-a descoperit a doua specie de ARN catalitic ARN replicaza,
care poate fi considerat, primul sistem viu sau molecula primordial a vieii.
ARN replicaza se presupune c a aprut ca o condensare prebiotic aleatorie
care a condus la formarea de polimeri cu o cretere progresiv n lungime a
catenelor. La nceput, aceti polimeri nu aveau nici o funcie dar o molecul
dintre acestea a putut s dobndeasc funcia de ARN polimeraza-replicaza,
capabil de a introduce erori din cnd n cnd. ARN replicaza ipotetic a
8

evoluat spre variante capabile de a asigura replicri mai rapide i cu o precizie

mai mare de copiere a moleculelor parentale (52, 56, 86).
ARN este considerat molecula primordial a vieii i nu ADN,
deoarece:
riboza (glucidul coninut de ARN) se realizeaz mult mai uor dect
dezoxiriboza (glucidul coninut de ADN);
structura ciclic a dezoxiribozei (din ADN) nu posed gruparea 2hidroxil.
Gruprile 2 i 3 joac rol structural n ARN i sunt implicate n formarea
structurii teriare a ARN de transport (forma de trefl), prin legturi de H;
ADN neavnd gruparea 2hidroxil nu se poate replia pentru a lua forme
tridimensionale compelxe, impuse de activitatea catalitic.
o gruparea 2hidroxil a ribozei joac ea nsi un rol catalitic direct.
Exemplu capacitatea de autoexcizie (matisare) a intronilor din ARN
mitocondrial
o celulele cunoscute azi, toate au n genom ADN, dar precursorii
ADN sunt todeauna sintetizai prin reducerea precursorilor
difosfai nucleotidici ai ARN cu ajutorul unei enzime conservate dea lungul evoluiei: ribonucleoziddifosfat reductaza.
S-a demonstrat astfel c molecula de ARN posed cele dou proprieti
obligatorii evoluiei: de replicare al informaiei genetice i de catalizator
enzimatic (ribozomii).
Se sugereaz c acum 3,5-4 miliarde ani molecula de ARN a devenit un
sistem autoreplicativ. Cu acest sistem ncepe evoluia sistemelor vii pe pmnt,
pentru ca mult mai trziu ADN s preia funciile ARN, la nivelul celulei
organizate. Aceast schimbare apare atunci cnd celula devine mai complex i
cnd ea va necesita o cantitate mai mare de informaie i mai stabil dect cea
oferit de moleculele de ARN. Deci ADN apare ca o adaptare la creterea
complexitii sistemului celular i nu ca o parte component a celulei
ancestrale.
Este foarte greu de stabilit momentul n care molecula de ADN a
preluat funcia exercitat de ARN. Ambele tipuri de molecule se gsesc n
celulele actuale, ndeplinind funcii diferite , fiind n strns colaborare.
Funciile distincte se datoresc diferenelor chimice mici (ADN conine
timin i dezoxiriboz, iar ARN conine n loc de timin, uracil i riboz n loc
de dezoxiriboz).
ADN ca depozit al informaiei genetice, este mult mai stabil din punct
de vedere chimic (genetic) dect ARN. Stabilitatea moleculei de ADN este dat
de:

structura dublu catenar, care permite moleculei s se repare rapid, n

cazul n care apare o modificare n secvena ei (n timpul replicrii) sau
o leziune la nivelul catenei
datorit dezoxiribozei care nu are gruparea 2hidroxil ceea ce o face
mai rezistent la hidroliz comparativ cu riboza din ARN.
ADN care conine ntreg setul de gene i sisteme de control care permit
transcripia sub forma moleculelor de ARNm specifice proteinelor celulare i
celorlalte tipuri de ARN (de transport i ribozomal) necesare pentru sinteza lor
(2, 15, 29, 34).
1.1 Caracteristicile procariotelor
Celula procariot (pro- nainte, karyion smbure sau nucelu).
Din categoria procariotelor fac parte toate bacteriile de forme i mrimi
diferite. Au membrana celular care formeaz un singur compartiment
citoplasmatic, fr o structur intern bine organizat. Conine un singur
cromozom, constituit dintr-o singur molecul de ADN circular, fr a
prezenta un nucleu bine conturat (fig.1.1). Bacteriile se multiplic prin
diviziune simpl, n dou pri, numit diviziune binar, n funcie de condiiile
de mediu. Neexistnd compartimente intracelulare transcripia ADN i
transducia ARNm (sintez proteic) au loc concomitent. Un singur tip de ARN
polimerizeaz, transcrie cele trei tipuri de ARNm, ARN r, ARNt.

Fig.1. 1. Celula procariot.ADN circular, specific procariotelor.

Bacteria cea mai cunoscut din punct de vedere biochimic i genetic
este Escherichia coli (E.coli).
Cercetrile de biologie molecular au demonstrat c 90-99% din
informaia genetic, existent n genomul unei celule eucariote, este represat,
10

deci este netranscriptibil i nu se exprim fenotipic. Exist gene funcionale

comune aproape tuturor tipurilor celulare ale organismului respectiv, sunt n
mod selectiv activate sau represate n funcie de tipul i stadiul de difereniere
al celulei respective. Dac toate genele din organism ar fi transcrise, toate
celulele constitutive ar produce acelai tip de proteine i n consecin ar fi
identice. Realitatea nu este aceasta, pentru c dei toate celulele conin ntreg
patrimoniul genetic, provenit de la oul fecundat, exist un sistem de control
care decide i menine expresia anumitor gene i represia altora, n funcie de
necesitile celulei respective.
Factorii de control sunt proteinele reglatoare. Aceste proteine sunt
codificate de gene reglatoare, mai mult sau sau mai puin active n funcie de
tipul celular funciile i vrsta celulei. Proteinele reglatoare au capacitatea de a
se lega de ADN, la nivelul unor secvene (regiuni) care controleaz activitatea
unei anumite gene structurale i pot bloca represa) sau activa expresia acestei
gene (transcripia ARNm necesar sintezei unei proteine specifice), n funcie de
cerinele fiziologice ale celuei.
Diferitele forme de via nu sunt stabile, de aceea ele au putut da
natere n mod continuu, la organisme diferite fa de predecesori. La
schimbarea mediului organismele rspund prin capacitatea de adaptare.
Teoria darwinist implic repetarea a trei procese:
1) selecia, procesul care triaz indivizii api;
2) reproducerea, procesul de generare a progeniturilor i
3) mutaia, care introduce variaii, fr de care nu ar exista alternative
asupra crora selecia ar putea aciona.
1.2. Caracteristicile celulelor eucariote
Nucleul, component fundamental prezent la toate celulele eucariote,
conine aproape ntreaga cantitate de ADN care formeaz genomul celular.
Nucleul ocup aproximativ 10% din volumul total al celulei, dar acesta
variaz n funcie de esut, vrsta celulei, activitatea metabolic, gradul de
difereniere, patologia celulei.
n structura nucleului s-au pus n eviden patru componente distincte:
cromatina nuclear, nucleolul i matrixul nucleolar care formeaz
nucleoplasma (sau carioplasma) i membrana nuclear care nchide acest
compartiment.

11

Membrana nuclear
Nucleul este nconjurat de o membran dubl trilaminat:
- membrana nuclear intern, prin proteinele specifice se leag de
lamina nuclear. Membrana nuclear este n contact cu ADN i ARNurile transcrise n nucleu;
- membrana nuclear extern, care se continu cu membrana reticulului
endoplasmatic.
ntre cele dou membrane nucleare exist un spaiu perinuclear care are
diametrul de 20-40 nm. Proteinele sintetizate de ribozomii legai de membrana
nuclear extern, sunt transportate n spaiul perinuclear, care se continu cu
lumenul reticulului endoplasmatic (fig.1.2).

Fig.1.2. Structura nucleului la microscopul electronic.

Nucleul reprezint centrul metabolic activ care realizeaz funcii

primordiale pentru celul: replicarea ADN, transcripia informaiei n ARN,
realizarea diviziunii celulare, repararea ADN. n desfurarea acestor funcii
proteinele joac un rol important. ARN-urile sintetizate i procesate n nucleu,
sunt urmate de sinteza proteic care se desfoar n citoplasm (fig. 1.3).

Fig.1.3 Celula prokariot i eukariot.Transcripia i transducia la celula eukariot.

12

ARN-urile i alte componente ca proteinele din nucleu trebuiesc

exportate n citoplasm, i invers. Toate aceste componente traverseaz
membrana nuclear prin porii nucleari, fiind un proces selectiv, nepermind
dect anumitor proteine ptrunderea n nucleu.
Porii nucleari apar ca nite canale de legtur ntre coninutul
nucleoplasmatic i cel citoplasmatic (fig. 1.4). Numrul porilor variaz cu
specia i tipul celular.

Fig. 4. Porii membranei nucleare la ME.

n centrul fiecrui complex al porului nuclear apare un canal prin care

moleculele solubile n ap pot circula din nucleu i citoplasma i invers. Acest
canal conine adesea i un complex proteic granular, situat n zona central,
care apare ca o diafragm n mijlocul canalului.
Diametrul porului (tunelul cilindric) este de 9 nm i lungimea de 15 nm.
S-a observat c moleculele mici (greutate molecular pn la 1500 daltoni)
difuzeaz rapid, iar cele mari, mai greu. Proteinele porului nuclear sunt n
numr de 100, diferite. Unele au rol de receptori specifici pentru proteinele
selectate i un mecanism deosebit de utilizare a energiei pentru trecerea lor n
interiorul nucleului sau spre citoplasm. Astfel de proteine conin o peptid
caracteristic, numit secven de localizare nuclear (NLS) care este esenial
pentru traversare. Transportul nuclear este selectiv necesit un semnal nuclear
de import care este prezent numai n proteinele nucleare (enzime, histone,
factori de transcripie). Acest semnal este reprezentat de o secven scurt de
aminoacizi (4 pn la 8 aminoacizi) care are sarcina electric pozitiv
(conferit de obicei de lizin i arginin) i este recunoscut de receptorii
specifici din complexul por.
Moleculele mai mari dect diametrul porului (de exemplu, ARNm) sunt
complexate cu diferite proteine (nucleoproteine), i interacioneaz cu
receptorii specifici coninui de proteinele globulare ale porului (2, 30, 34, 56).

13

Receptorii activeaz tranzitul acestor particule n sau n afara nucleului, prin

lrgirea canalelor porilor.
1.2.1 Structura cromatinei
Cromatina este complexul ADN-proteine al unei mase dezorganizate de
fibre n care, sunt agregai cromozomii n interfaz. Moleculele de ADN ale
unui cromozom de la organisme superioare s-ar ntinde pe o distan de
centimetri dac ar fi desfurat, dar ea trebuie s fie foarte mpachetat (printrun proces numit compactare) n nucleu. Molecula de ADN trebuie, de
asemenea, s se organizeze n uniti funcionale care s permit exprimarea
genelor i replicarea lor.
Prin colorare se pot distinge dou zone care formeaz eucromatina i
heterocromatina. Genele active transcriptibile n ARNm formeaz zona
eucromatic, pe cnd cele inactive zona heterocromatic. Cele dou zone se
disting prin sensibilitatea la atacul ADN-azei. La nivelul eucromatinei,
cromatina fiind mai puin condensat, enzima are acces i poate aciona, n
timp ce la nivelul heterocromatinei enzima este inactiv, accesul ei fiind
mpiedicat de gradul mare de condensare a acesteea. Cromatina eucariotelor
conine i proteine nehistonice (proteine reglatoare, factori de transcripie
precum i enzime ca ADN polimeraza sau ARN polimeraza, enzime de
reparare, topoizomeraze).
Toat informaia genetic coninut de nucleu constituie aa numitul
genom. Genomul bacteriei E.coli este format de 4, 7x10 6 pb coninute de o
singur molecul de ADN (deci un singur cromozom). Genomul uman
(celulele diploide) conine 46 de cromozomi i ADN este format din 6x10 9 pb
iar celulele haploide conin 3x109 pb (6, 25, 32, 34, 75, 86).
1.1.2. Nucleolul
Nucleolul (fig. 1.5) este situat la celulele aflate n interfaz (excepie
fac celulele embrionare care nu au nceput sinteza proteinelor proprii).
La microscopul electronic, nucleolul este format din:
- centru fibrilar, de ADN netranscriptibil;
- o regiune fibrilar dens, de ARN n curs de sintez;
- o component granular care conine particulele de preribozomi (15,
56, 86).

14

Fig.1.5 . Nucleolul la MO n plasmocite (a) i la ME (b).

n 1960 s-a descoperit c nucleolul joac rol n sinteza ARN ribozomal

(ARNr) i n asamblarea componentelor ribozomale. Sinteza ARNr n nucleol a
fost pus n eviden prin folosirea uridinei marcate (3H uridin). Astfel a fost
relevat sinteza unui singur tip de transcript primar, reprezentat de molecule
precursor de ARNr 45S. Din ARNr 45S, prin clivarea parial rezult cele 3
tipuri de ARN ribozomal: ARNr 18S (ncorporat n subunitatea mic a
ribozomilor, ARNr 5,8S i ARN 28S (ncorporate n subunitatea mare a
ribozomilo). Aceste molecule de ARN, nainte de a fi exportate n citoplasm,
formeaz complexe ribonucleoproteice cu mai multe tipuri de proteine (peste
70 proteine). Proteinele necesare sunt sintetizate n citoplasm i importate de
nucleu. Complexele formate stau la baza formrii ribozomilor.
Transcripia ADN deci sinteza ARNr, are loc numai n interfaz. Pe
msur ce se apropie faza mitotic, cromozomii se condenseaz, nucleolul se
micoreaz iar n metafaza el dispare complet. n telofaz sinteza ARNr este
reluat i mininucleolii se reformeaz n apropierea genelor ARNr localizate, n
regiunile bine delimitate a 10 cromozomi.
La sfritul mitozei mininucleolii fuzioneaz rapid i formeaz un
nucleol mare, care obinuit se observ n interfaz. n mod normal nucleolul
15

ocup 30% din volumul nucleului. n celulele canceroase nucleolii apar

hipertrofiai avnd o form neregulat. Gradul lor de hipertrofie este
proporional cu gradul de malignitate (2, 15, 34, 86).
1.2.3. Matricea nuclear
Matricea nuclear este structurat dintr-o reea de filamente insolubile,
care ar fi echivalent citoscheletului citoplasmei. Se consider c fiecare tip
celular ar avea un set distinct de proteine, pe acestea fiind structurate loopsurile din structura cromozomilor. Acestea ajut la organizarea cromozomilor,
reglarea replicrii i a transcripiei ADN.
S-a observat de asemenea, c i ARNm i de transport este coninut n
cadrul unor compartimente specifice din nucleu. S-a pus n eviden c sinteza
acestor molecule de ARN are loc n zone numite domenii de transcripie. n
aceste domenii are loc i ndeprtarea intronilor din transcriptul primar
(matisare ), nainte ca ARNm s fie exportat n citoplasm (1, 2, 32, 86, 88).

2. STUCTURA ACIZILOR NUCLEICI

2.1. Fosfaii
Moleculele biologice care conin informaia genetic sunt acizii
nucleici. Acizii nucleici sunt polimeri.
Exist dou tipuri de acizi nucleici: acidul dezoxiribonucleic (ADN) i
acidul ribonucleic (ARN). Acizii nucleici sunt produi de policondensare,
unitatea monomer fiind un nucleotid, astfel c toi acizii nucleici sunt
polinucleotidici.
Un nucleotid este format din fosfat, glucid cu 5 atomi de C (pentoza) i
baze azotate (purine sau pirimidine).
Fosfatul anorganic este un complex stabil, format pornind de la acidul fosforic
PO4H3 (scris Pi).
Esterii fosfat se pot forma dintr- un fosfat i o grupare hidroxil liber
(alcool, enol, fenol).
Condensarea unui fosfat i a unui acid de exemplu, sau a unui fosfat cu
un alt fosfat d o anhidrid. Exist i anhidride mixte ntre un acid fosforic i
un acid carboxilic de exemplu.
16

Pirofosfatul care este o anhidrid a acidului fosforic (14, 42, 52, 67).

Fig. 2.1. Fosfaii.

2.2. Riboza i deoxiriboza

Glucidul specific ARN-ului este riboza iar al ADN-ului este
deoxiriboza.
Riboza este o pentoz din seria D n care toi hidroxilii sunt orientai la
dreapta.
Deoxiriboza deriv din riboz printr-o reducere a funciei alcool a C2
-hidroxil. Gruparea 2-hidroxil prezent n ARN l face susceptibil la hidroliz
alcalin, n timp ce ADN este rezistent. n schimb att ADN ct i ARN sunt
hidrolizai n mediu acid.

Fig. 2.2. Riboza i deoxiriboza.

17

2.3. Baze azotate

Bazele azotate sunt mprite n dou grupe: purinice-adenina, guanina
i pirimidinice-citozina, uracil,timin.
Singura diferen ntre ele este c ADN conine timin (T) n timp ce
ARN conine uracil (U). n ARNt, este prezent i inozina (I). Inozina este
nucleozidul hipoxantinei, adenina care este deaminat. ARNt conine, de
asemenea, alte nucleozide neuzuale cum pseudouridina, ribotimidina i
dihidrouridina.
Bazele azotate ale acizilor nucleici aparin celor dou molecule n
funcie de nucleul aromatic de baz care constituie scheletul. Nucleul aromatic
pirimidinic este format din 6 atomi din care 4 de C i 2 de N (fig.2.3). Cei doi
atomi de N se afl n poziia meta (numrul 1 i 3).
O baz purinic este constituit din doi nuclei heterociclici alipii, unul
de 6 atomi i altul de 5 atomi, avnd 2 atomi de C n comun (situai la mijloc).
n raport cu carbonii comuni, atomii de N ocup poziii simetrice 1 i 3 la
stnga, 7 i 9 la dreapta(fig.2.3).

Fig.2.3. Nucleu purinic i pirimidinic.

Diferite baze ntlnite n compoziia acizilor nucleici se deosebesc prin

substituienii purtai de acetia.
Bazele purinice
Adenina este constiuit dintr-un nucleu purinic n care atomul de C 6
este substituit cu gruparea amin. Ea este singura baz azotat nucleotidic a
crei formul nu conine atomi de oxigen (fig.2.4).
18

Guanina este constituit dintr-un nucleu purinic la care atomul carbon

2 este substituit cu o grupare amin i carbonul 6 printr-o legtur cetonic.

Fig. 2.4. Baze purinice.

Bazele pirimidinice
Sunt reprezentate de citozin, uracil i timina.
Citozina este format dintr-un nucleu pirimidinic n care C4 este
substituit de gruparea amin i C2 ceton.
Uracilul este constituit din nucleu pirimidinic n care carbonii 2, 4
poart gruparea ceton (fig. 14).
Timina este constiuit din nucleu pirimidinic n care C2 i C4 posed
gruparea ceton dar C5 are legat un metil i se mai numete metil-uracil.

Fig.2.5. Baze pirimidinice.

2.4. Nucleozide i nucleotide

19

Glucidele, riboz sau deoxiriboz se leag de bazele azotate prin

legturi care implic unii din atomii de N ai bazei (N 1 la bazele pirimidinice
sau N9 la purinice). Legtura dintre o baz azotat cu zaharurile (ozele) d un
nucleozid; acestea sunt legturi N-ozidice. ntr-o nucleozid atomii bazei se
numeroteaz prin cifre 1 ...n, iar pentru a se distinge carbonii ozei sunt
numerotai 1 - 2 (4, 42, 46, 52, 67, 69).
Legtura unei ozide cu un fosfat se face prin esterificare la funcia
alcool primar (C5) a ozei cu una din cele 3 grupri acide ale fosfatului.
Esterul obinut este o nucleotid format dintr-o baz azotat legat printr-o
legtur N-ozidic cu o oz i aceasta fiind de asemenea, legat esteric de un
fosfat (fig. 2.6).

Fig. 2.6. Nucleozide i nucleotide

2.4.1 Denumirea nucleotidelor

Bazele azotate sunt notate convenional printr-o iniial i o culoare.
Adenina cu A i verde; G cu galben. Fiecare baz poate intra n structura a 2
nucleozide n funcie de oz, riboz sau deoxiriboz, fiecare nucleozid poate fi
legat de una, dou sau trei grupri fosfat. Se noteaz prin sigla convenional
GMPguanozin monofosfat, ADP adenozindifosfat sau ATP adenozintrifosfat.
20

Nucelotidelor li se desemneaz baza nucleozidei monofosfat exemplu

adenozin monofosfat sau AMP.
Nucleozidele polifosfat sunt difosfat ADP sau trifosfat, ultimile fiind
mai bogate n energie ATP.
Adenozina
Este o nucleozid format dintr-o pentoz riboz legat printr-o
legtur N ozidic la o baz azotat adenina (fig 2.7). Alte ribonucleozide sunt
guanozina, citidina i uridina.

Fig. 2.7. Adenozina.

Dezoxiguanozina
Este o molecul format din pentoz-dezoxiriboz legat de o baz
azotat-guanina (fig.2.8).
Alte dezoxiribonucleozide sunt dezoxiguanozina, dezoxitimina.

Fig. 2.8. Dezoxiguanozina.

21

Uridinmonofosfat
Uridinmonofosfatul sau acidul uridinic UMP este o molecul rezultat
prin legtur esteric a fosfatului cu riboza i N ozidic cu uracilul (fig. 2.9).

Fig. 2.9. Uridina monofosfat sau uridilat.

Dezoxitimidinmonofosfat
O nucleotid timin monofosfat sau acidul timidilic este o nucleotid
format din timina legat de dezoxiriboz. Se neglijeaz adesea precizarea
denumirii de dezoxitimidin monofosfat dTMP. Dezoxiriboz se leag numai de
timin i riboz de uracil (fig. 2.10).

22

Fig. 2.10. Dezoxitimidina Mono Fosfat.

Adenozin Tri Fosfat -ATP

Un nucleotid n care trei grupri fosfat sunt ataate la un nucleozid la
poziia C5 a glucidului se numete nucleozid trifosfat (fig.2.11). Asfel ATP se
numete adenozin trifosfat (P-P-P- C5- riboz-adenin).

Fig 2.11. Adenozin Tri Fosfat ATP.

23

Dezoxicitozina trifosfat este o nucleotid compus, cu structura bazat

pe adenina legat N ozidic de D riboz trifosfat (fig. 2.12). Funciile acide ale
acizilor fosforici distali sunt foarte ionizate la pH fiziologic. Legturile
anhidridice sunt bogate n energie. Dintre gruprile fosfat CTP este unul din
substratul ADN polimerazei. Enzimele care utilizeaz nucleotid trifosfat
necesit Mg cofactor. Alte nucleotide trifosfat sunt ATP, GTP, CTP, UTP, TTP
(14, 31, 42, 52, 67).

Fig. 2.12. Dezoxicitozina trifosfat

2.5. Legturile de hidrogen

O legtur de hidrogen este o legtur srac n energie ntre doi
atomi care se atrag electrostatic primul fiind bogat n electroni- nucleofil i
cellalt bogat n protoni deci electrofil (atrage electroni).
Astfel, atomul de H cu electron unic necesit pentru completarea
orbitalului un alt electron deci nu poate fi dect electrofil fiind atras de atomi
care au dublete electronice libere (fig.2.13). Atomii de N i O au 2 i respectiv
4e- pe stratul perifric care nu particip la orbitalii legturilor covalente ai
moleculei, (O2 are 2e- neparticipani) i N are 4 e-. Aceasta le confer caracter
nucleofil care le permite atracia atomilor electrofili, n special a atomilor de H
aceast atracie constituie o legtur de H. Atunci cnd orbitalii care unesc
atomul de H cu molecula la stnga i dubletele electronice libere cu atom
nucleofil sunt pe aceeai ax legtura de H este mai puternic.
24

Fig. 2.13. Legturi de H

2.6. Hibridizarea bazelor azotate

Hibridizarea AT
Un acid nucleic prezent n soluie molecular formeaz legturi de H
asociind nucleotidele 2 cte 2 astfel c o nucleotid cu A s se lege cu T sau cu
U n ARN i o nucleotid de G cu C (fig.2.14). Aceast legtur se numete
hibridizare (46, 52, 59).

Fig. 2.14 Hibridizarea adenina- timina.

Legtura-hibridizare AT este mai puin stabil dect G C, deoarece

ntre adenin i timin se formeaz dou legturi de H iar ntre citozin i
gunin 3 (fig. 2.15).

25

Fig. 2.15. Hibridizarea Guanin-Citozin.

2.8. Conformaia helixului dublu catenar al ADN

Moleculele ADN exist ca un dublu helix cu dou lanuri (catene) care
au direcii opuse (antiparalele), extremitatea 5 a uneia este opus cu 3 a
celeilalte (modelul Watson i Crick 1953). Ele difer prin conformaie,
fenomen numit polimorfism structural.
La ADN se cunosc dou conformaii dublu helicoidale orientate spre
dreapta: ADN-A i ADN-B (lanurile se rsucesc spre dreapta pe msur ce
progreseaz n sus). ADN-B este caracterizat printr-o repetiie regulat a
anurilor de tip minor i major. O form diferit de ADN este ADN-Z care un
helix orientat spre stnga dar care are un schelet neregulat. Neregularitatea
ADN-Z este ilustrat prin linia groas care leag gruprile fosfat. Se speculeaz
c este posibil schimbarea conformatiei ADN in vivo i c aceasta poate fi
important n exprimarea genic. Astfel, transcripia ADN are loc, probabil, la
jonciunea dintre ADN-B i ADN-Z unde are loc desfacerea helixului.
ADN este format din dou catene n care nucleotidelele sunt hibridate
2 cte 2 pe baz de complementaritate pe toat lungimea, prin legturi de H,
AT, GC. Pentru ca toate nucleotidele s se poat hibridiza trebuie ca ordinea n
care se leag s fie complementar catenei opuse. Bazele azotate legate prin
legturi de H se orienteaz spre interior n timp ce ribozele i acizii fosforici
hidrofili sunt orientai spre exterior.

26

Fig. 2.16 Tipuri de ADN.

Se formeaz o secven complementar secvenei originale. Datorit

enzimelor specfice o secven de acid nucleic zis original este capabil de
a dirija sinteza unei secvene de acid nucleic complementar (14, 42, 46, 52,
67).
n al doilea rnd aceast secven complementar izolat va fi de
asemenea capabil s dirijeze sinteza secvenei originale care i este
complementar (Fig. 2.17).

Fig. 2.17. Complementaritatea bazelor azotate

Se denumesc nucleotidele prin A, C, G i T n funcie de bazele azotate

care le conin i se poate astfel citi un text.

27

Fig. 2.18. Complementaritatea purin-pirimidin sau pirimidin-purin

Complementaritatea purin-pirimidin sau pirimidin-purin confer

structurii helicoidale bicatenare a ADN o form filiform regulat cu un
diametru constant de-a lungul ntregului traiect (fig.2.18). O mperechere
purin-purin sau pirimidin-pirimidin ar face ca dublul helix ADN s
prezinte de-a lungul su neuniformiti, regiuni cu diametru mai mare (purinapurin) sau mai mici (pirimidin-pirimidin). Ar aprea astfel distorsiuni
neregulate, care ar mpiedica funcionarea normal, ceea ce nu se ntmpl n
condiii normale. Planurile bazelor azotate sunt perpendiculare pe axa fibrei.
Fiecare spir a dublului helix cuprinde cte 10 perechi de nucleotide (fig. 2.19).

Fig. 2.19 Dublu helix- structura secundar a ADN

28

Cele dou catene se pot disocia la cldur. Structura bicatenar a ADN

prezint de regul o mare stabilitate fizic la temperatura camerei, asigurat de:
- punile fosfodiesterice intracatenare, pe vertical ntre dezoxiriboze;
- legturile de H, pe orizontal, intercatenare, ntre bazele azotate;
- fore de stivuire (staking) a perechilor de baze azotate n cadrul dublului
helix.
n cadrul dublului helix ADN, din nfurarea relaional a celor dou
catene rezult o alternan regulat de ferestre minore i majore, astfel c la
acelai nivel al dublului helix, o adncitur minor de pe o parte corespunde
cu una major de pe cealalt parte numite i ferestre (fig.2.20).

Fig. 2.20. Ferestre minore i majore.

Aceste ferestre reprezint zone de interaciune cu diferite proteine

(ARN polimeraza), ageni de intercalare de tip bromur de etidiu sau situsuri
de inserie a profagilor.
Compoziia de baze azotate este specific fiecrei specii. Secvena de
baze azotate din ADN reprezint forma n care informaia genetic este nscris
n macromolecula de ADN, aceste secvene codificnd o anumit protein.
Dublul helix n seciune transversal prezint bazele azotate paralele
ntre ele, nucleotidele acestora fiind aezate ca farfuriile, stivuite n interiorul
dublului helix (fig. 2.21).

29

Fig. 2.21. Dezoxiribozele i fosfaii orientai spre exterior.

Nucleotidele complementare nu sunt diametral opuse, axul helixului

este gol (Fig. 2.22).

Fig. 2.22. Bazele azotate orientate ctre interiorul dublului helix.

2.8.1 Condensarea i hidroliza nucleotidelor

30

Creterea lanului de acizi nucleici se face totdeauna prin extremitatea

3OH terminal a acidului nucleic. Condensarea se face pornind de la un
substrat activat o nucleotid trifosfat. Hidroliza ultimilor doi fosfai va
furniza energia necesar condensrii. Nucleotida monofosfat rmas va fi
esterificat printr-o funcie acid a fosfatului cu funcia alcool eliberat din
carbonul 3 al ribozei.
Va fi eliberat o molecul de ap.
Invers adugarea unei molecule de ap pe aceast legtur ester va
produce o reacie de hidroliz care va detaa ultima nucloetid i va elibera C3
a nucleotidei precendente (fig. 2.23).

Fig. 2.23 Condensare i hidroliza nucleotidelor.

2.9 Acidul dezoxiribonucleic (ADN)

Un comportament caracteristic doar nucleului celulelor eucariote, este
asocierea unor proteine mici , bazice cu ADN, numite histone. Patru din cele
cinci tipuri se grupeaz n perechi pentru a forma octamerul histonic, n jurul
creia se nfoar ADN.Aceast structur se numete nucleozom.
ADN este protejat de ctre proteine atunci cnd nu se realizeaz
transcripia sau replicarea genelor. Aceast protecie se face prin rulare n jurul
proteinelor bazice (cationice) capabile de a se lega cu ADN care este un
complex de polianioni. Octomerul histonic prezint n jur ADN rulat, care
realizeaz dou ture n jurul lui. ADN format din 146-166 perechi de baze (fig.
2. 24).
31

Fig. 2.24 Nucleozomul (21, 97).

Octamerul histonic conine cte dou molecule din fiecare tip de

histon: H2A, H2B, H3 i H4. Nucleozomii core sunt conectai ntre ei prin
segmente de ADN formate de 20-100 pb i care reprezint regiunile de legtur
denumite ADN linkeri. La punctul de intrare i ieire ADN se asociaz cu o alt
histon H1, situat n afara octamerului. Ea este asociat att cu nucleozomul,
ct i cu segmentul ADN linker i are rol n stabilitatea nucleozomului.
O endonucleaz poate digera ADN linker dintre perle i detaa particule
de 11 nm, nucleozomii (Fig. 2.25).

32

Fig. 2.25. Structura nucleozomului (91).

Nucleozomul este o form de organizare a cromatinei. Celulele umane

conin aproximativ 3x107 nucleozomi.
Nucleozomii legai prin intermediul linkerilor asemntor unui irag
de perle realizeaz o structur compact, cu un diametru de 250-300nm
numite fibre groase care conin aproximativ 45000 pb (fig 2.27).

Fig. 2.27. Fibre de cromatin (46).

Studiile fizico-chimice sugereaz c aceste fibre groase se formeaz

printr-o mpachetare helicoidal (a 6-9 nucleozomi), care se ruleaz pe ele
nsele i formeaz un solenoid (fig. 2.28). n aceast structur mpachetarea
crete foarte mult.

Fig. 2.28. Organizarea cromatinei in diverse trepte pn la stadiul de cromozom

n metafaz (14).

33

Fibrele devin mult mai condensate, prin mpachetri adiionale,

formnd structuri mai complexe denumite domenii (sau loops-uri) care cuprind
35000-90000 pb de ADN. Acest tip structural de cromatin este bine legat de
un suport structural din nucleu, denumit matrix nuclear sau scaffold care
sufer la rndul lui mpachetri i structureaz cromozomul din metafaz.

Proprietile fizice ale ADN

Denaturarea ADN poate fi termic i chimic.
Denaturarea termic. Peste anumite limite de temperatur (63-100C)
stabilitatea legturilor de H cedeaz, astfel se desface dublul helix n cele 2
catene polinucleotidice, complementare, fenomen numit denaturarea termic;
ADN trece de la condiia de dublu catenar la cea monocatenar nsoit de
reducerea vscozitii soluiei ADN.
Denaturarea este de obicei efectuat experimental prin nclzire.
Temperatura la care 50% dintre catene sunt separate se numete temperatur de
topire (Tm).
Aspectul curbei de denaturare a ADN ne permite s concluzionm
coninutul n perechi de baze azotate avnd n vedere c perechile A-T cu 2
puni de H denatureaz mai uor dect perechile G-C ntre care sunt 3 legturi
de hidrogen. Timpul de topire crete odat cu creterea coninutului G-C, fapt
evideniat de ADN diferitelor specii de bacterii, al cror coninut G-C variaz
ntre 20-80%.
Denaturarea chimic. Pentru denaturare se pot utiliza i alcalii. La pH
mare ncrctura multor gene angajate n formarea legturilor de H se schimb.
Astfel bazele pierd capacitatea de a forma legturi de hidrogen. La pH mai
mare de 11,3-12 toate legturile de hidrogen sunt rupte i ADN este complet
denaturat. n tehnicile de bandare cromozomial se utilizeaz denaturarea cu
alkali, ADN fiind destul de rezistent la hidroliza alcalin .
Dac amestecul se rcete brusc, monocatenele rmn permanent
separate i ADN se numete denaturat. Cnd o soluie de ADN este supus
unor temperaturi mai mari de 100C are loc ruperea legturilor fosfodiesterice,
cu destrmarea coloanei glucido-fosforice . Denaturarea ADN este nsoit de
efectul hipercromatic, adic de cretere a intensitii absorbiei razelor UV de
ctre bazele azotate expuse la exterior. Bazele azotate sunt cromofile i
hidrofile.
Pentru a preveni reasocierea monocatenelor (dup o denaturare
complet la 90) prin mperecheri de baze se pstreaz ADN denaturant la
concentraii saline mari la temperatura camerei (14, 42, 46, 52, 67, 69).
34

Fig. Denaturarea i renaturarea ADN (97).

Renaturarea
Renaturarea reprezint refacerea structurii native, dublu catenar a
ADN, pornind de la monocatene separate prin denaturare.
Pentru renaturare sunt necesare dou condiii:
- concentraia salin trebuie s fie suficient de mare pentru a nltura
repulsia electrostatic dintre fosfaii celor dou catene polinucleotidice
(se utilizeaz 0,15-0,5 M NaCl).
- temperatura trebuie s fie cu 20-25C sub valoarea temperaturii de
topire, i are rolul de a elimina legturile de hidrogen intracatenare
aprute la ntmplare (randomizat)..
In urma filtrrii o soluie de ADN renaturat are i monocatene rmase
nesociate. Prin utilizarea filtrelor de nitroceluloz, ADN renaturat trece, pe
cnd monocatenele sunt reinute de filtru putnd fi msurat astfel fracia de
ADN care a renaturat.
Renaturarea ADN este nsoit de efectul hipocromatic deoarece prin
refacerea structurii dublu catenare, bazele azotate se afl spre interiorul
structurii bicatenare. Dac denaturarea ncepe de la nivelul unor sectoare ale
dublului helix ADN bogate n A-T, renaturarea este iniiat n sectoarele bogate
n G-C mai stabile. Aceste sectoare la nivelul crora se iniiaz renaturarea se
numesc centre de nucleaie sau de renaturare.
Denaturarea i renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice folosite
pentru studiul relaiilor filogenetice dintre specii fie in tehnologia ADN
recombinant. Speciile nrudite filogenetic au secvene de baze azotate cu un
grad mare de similitudine i prezint temperaturi apropiate de denaturarea
ADN, realiznd o renaturare mai rapid a monocatenelor amestecate.
Renaturarea este un proces mult mai lent dect denaturarea n urma
creia ia natere o structur bicatenar hibrid.
35

Procentul de renaturare ntre monocatene de ADN de la om si de la

cimpanzeu este de aproximativ 90% pe cnd cel dintre ADN uman i de
oarece este de 25%.
n tehnologia ADN recombinant, hibridarea molecular ajut la
stabilirea exact i rapid a transferului unei gene eucariote n celula bacterian
prin folosirea sondei moleculare. Aceasta este o monocaten de ADN sau ARN
marcat radioactiv sau neradioactiv i care este complementar segmentului
genei eucariote transferate. Dac are loc asocierea sondei moleculare cu un
segment ADN extras de la celula bacterian n care a fost clonat gena
eucariot nseamn c transferul acestei gene n celula bacterian a fost
eficient.
Totodat prin hibridri moleculare ADN-ARN se poate realiza cartarea
genelor rspunztoare de sinteza ARN prin hibridarea in situ adic fr
extracie de ADN, denaturarea acesteia realizndu-se la nivelul cromozomilor,
n preparate citologice, pe lame microscopice. Aceste preparate sunt incubate
cu molecule de ARN ribozomal, de un tip dat, marcate i aflate ntr-o soluie
salin corespunztoare. Monocatenele ARN se vor uni pe baz de
complementaritate cu un segment dat al monocatenelor ADN pe care se afl
gena pentru acel tip de ARN ribozomal. Dup splarea preparatelor, pentru a
ndeprta restul de monocatene ARN rmase neasociate, pe aceste lame se
aplic emulsie fotografic, se incubeaz la ntuneric spre a realiza
impresionarea, se developeaz i se analizeaz la microscop. Zona unde a avut
loc hibridarea ADN-ARN, la nivelul cromozomului, este marcat prin urme de
argint fiind localizat astfel gena pentru tipul ARN, folosit n hibridare. Prin
astfel de modele de hibridare se pot localiza poziia altor gene, folosind alte
tipuri de ARN, cum ar fi ARN solubil i ARNm. De exemplu, folosind n
hibridare ARNm purttor al mesajului genetic pentru sinteza insulinei (ARN nu
poate fi extras uor din celulele pancreasului endocrin) aceasta se poate
localiza pe cromozom la poziia genei pentru insulin (14, 31, 42, 52, 67).
2.10.3 Respiraia i absorbia ADN
ADN este o structur dinamic n care regiunile bicatenare se deschid
frecvent spre a forma ochiuri sau bucle monocaternare. Acest fenomen se
numete respiraie ADN i-i permite acestuia interaciunea cu diferite proteine
spre a-i fi citit informaia codificat. Respiraia apare mai frecvent n regiunile
bogate n perechi A-T dect n cele cu G-C, deoarece perechile A-T sunt mai
uor de denaturat fiziologic. Nu ntmpltor la nivelul originii replicrii
perechile A-T sunt foarte frecvente.
Absorbia reprezint capacitatea unei soluii ADN de a absorbi lumina
UV. Bazele acizilor nucelici absorb lumina UV de 260 nm.
36

2.11 ADN mitocondrial

Furnizeaz energie prin fosforilare oxidativ. Conin propriul lor ADN
diferit de ADN nuclear, este extracromozomial. ADN mitocondrial este dublu
catenar de 16,5 kb circular, codant pentru 13 subuniti proteice, constituind 4
complexe biochimice i 24 molecule de ARN structural (2 ARNr i 22 ARNz)
indispensabil pentru transducia mitocondrial a proteinelor. ARNm este
independent de ADN nuclear. Replicarea, transcripia i transducia este
independent de a ADN nuclear. El codific proteinele care particip la
fosforilarea oxidativ, necesare funcionrii i structurii mitocondriale. Aceste
proteine (codificate de gene nucleare) sunt produse n citoplasm nainte de a
ajunge n mitocondrie. Exist o interelaie ADN nucelar ADN mitocondrial.
Caracteristicile ADN mitocondrial:
- nu are introni
- are un repertoriu de mutaii de 10 ori mai mare dect ADN nuclear.
Nu are sistem de reparaie, nici histone care s protejeze ADN
- are un mare polimorfism genetic
- este transmis de la celula mam
- nu se recombin
- fiecare mitocondrie conine 2-10 molecule de ADN
- fiecare celul conine numeroase mitocondrii... mii
- n aceeai mitocondrie poate coexista ADN normal i mutant,
fenomen numit heteroplasmie
- prezena doar a ADN normal sau numai a ADN mutant, se numete
homoplasmie
- n cursul replicrii proporionale a ADN normal i a celui mutant n
heteroplasmie, ADN poate fi modificat n celulele fiice ca urmare a
repartiiei la ntmplare.
2.12 Acidul ribonucleic -ARN
Pentru a forma ARN nucleotidele GMP, AMP, UMP, CMP sunt
condensate prin legturi fosfodiesterice ntre C3 a primei nucleotide i 5 a
nucleoditei urmtoare.
Prima nucleotid a lanului polinucleotidic poart pe carbonul 5 al
ribozei, un fosfat, a crui funcie acid nu este esterificat. Aceasta este
extremitatea 5 fosfat terminal a acidului nucleic este desemnat convenional
ca nceputul secvenei (fragmentului) de acid nucleic. Ultima nucleotid a
lanului poart o funciune alcool pe C3 a ribozei neesterificat. Aceasta este
extremitatea 3OH terminal a acidului nucleic descris convenional ca
37

sfritul fragmentului de acid nucleic. Aceste legturi definesc sensul

moleculei.

Fig. 2.29. Extremitile 3-5 ale acidului ribonucleic (97).

Dup funcie se disting mai multe tipuri de ARN:
ARNracid-ribonucleic ribozomal (82 %) intr n structura
ribonucleotidelor ribozomilor alturi de proteine (fig. 2.29). Se cunosc dou
tipuri de ribozomi: de tip procariot cu constanta de sedimentare 70S
(subunitatea mic 30S, subunitatea mare 50S) i eucariot de 80S (subunitatea
mic 40S, subunitatea mare 60S). n funcie de constanta de sedimentare se
distig urmtarele fraciuni de ARNr:
-la procariote: ARNr 23S i ARNr 5S n subunitatea mare i ARNr 16S
n subunitatea mic;
-la eucariote, ARN 18S intr n structura subunitii mici a ribozomilor;
-ARN 28 S, ARN 5,8 S i ARN 5S structureaz alturi de proteine
subunitatea mare a ribozomilor. Ribozomii sunt implicai n sinteza proteinelor.
ARNt Acid ribonucleic de transfer (16 %) transport aminoaiczii
activai pentru transducie.
38

snARN (< 1 %) ribonucleoproteine mici nucleare ARN structureaz

particula de recunoatere a proteinei- semnal. Altele, mai puine, particip la
structura diferit a ribonucleoprotidelor responsabile de excizie a intronilor,
legarea sau matisarea exonilor, n procesul de maturare a transcriptului
primar din timpul transcripiei i de selecie a poliribozomilor pentru sinteza
proteinelor semnal, orientarea proteinelor sau altor activiti enzimatice,
metabolice.
ARNm- Acid ribonucleic mesager(2%) realizeaz transcripia genei
purttoare de informaie pentru a fi tradus (reprezint o copie a genei) i este
modelul pentru dirijarea transduciei. Prin intermediul ARNm ribozomii
primesc informaia pentru sinteza proteinelor.
Alte molecule sunt coenzime transportoare de aminoacizi;

Fig. 2.30 Ribozomii la procariote i eucariote (97).

2.12.1 Diferenele dintre ARN i ADN
Diferenele dintre ARN i ADN sunt:
- ARN este mai scurt, are 70-100 000 nucleotide;
- conine riboz n loc de dezoxiriboz (ADN);
- uracilul nlocuiete timina din ADN.
ARN este monocatenar. Totui n unele regiuni, pe distan scurt,
monocatenele sunt unite prin legturi de H pe baz de complementare, deci
devine bicatenar i formeaz structura secundar a ARN. Un exemplu tipic
este structura n form de frunz de trifoi a ARNt (fig. 2.31).
39

Fig. 2.31 Structura secundar a ARN (46).

Structura secundar a ARN este prezentat i n fig 2.32. Lanul

monocatenar formeaz urmtoarele structuri: agraf de pr, bucl multipl,
pseudonod, bucl interioar, tulpin (stem).

Fig. 2.32. Structura secundar a ARN (102).

3. GENA
Genomul uman este constituit din 3,5 miliarde de perechi de nucleotide
sau perechi de baze (pb). Gena este estimat ntre 50000 i 100000pb i nu
reprezint dect 3-5% din acest ansamblu. Restul de ADN este constitut din
secvenele de reglare a expresiei genei, secvene repetitive i secvene cu
funcii necunoscute.
Varianta nepatologic a genomului este polimorfismul

40

La om, ntre 2 indivizi exist mici variante de secvene estimate ntre 1

i 2% considerate ca nepatogene i numite gene de polimorfism (exp. de
polimorfism, culoarea ochilor: bleo, maron, verde). Acest polimorfism
genotipic se poate gsi n regiuni codante i necodante ale unei gene. n cursul
studiilor de patologie (maladii genetice, cancer) sau n alte cazuri
(epidemiologie bacterian) astfel de secvene specifice pot servi ca markeri
genetici (2,14, 25, 26, 36, 44, 49 67).

Fig. 3.1 Alele (104).

Un polimorfism const ntr-o diferen purtat de o singur nucleotid

ntre 2 secvene ale aceleeai perechi de cromozomi (de exp. A pe o alel i G
pe o alt alel). Vorbim deci de polimorfism alelic a unei singure nucleotide
(SNP).
Polimorfisumul, este dat de secvene scurte, repetate, a unui numr mai
mic sau mai mare baze care pot varia pe fiecare din cei 2 cromozomi, numrul
repetiiilor poate s nu fie identic. Numrul de variaii ale secvenelor poate s
nu fie aceleai ntre 2 indivizi diferii (fig. 3.2 ).

Fig.3.2 Polimorfisumul alelic dat de secvene scurte, repetate.

41

Se vorbete deci de un polimorfism multialelic n care se disting dup

talia lor:
- secvene scurte repetate STRs (short tandem reapeats) acestea sunt
2, 3, 4 i 5 nucleotide de exp. [AC]n = 5AC AC AC repetare de n ori; numrul
lor este estimat ntre 50000 i 100000 copii n genom;
- secvene repetate n tandem n numr variabil sau VNTRs (variabile
number of tandem repeats). Printre aceste secvene VNTRs se pot distinge i
secvene repetate scurte de mai puin 500 pb SINEs (short interopersed
repetitive nucleotides elements).
O secven particular din cadrul SINEs este secvena Alu. Secvenele
Alu sunt repartizate n genom la nivelul intronilor.

Fig. 3.3 Secvene repetate n tandem.

Secven Alu, este considerat de 4 kb- 5 kb. Aa se face c secvena

Alu este repartizat n grupe separate prin cteva sute de baze de ADN numite
non Alu. Aceste secvene sunt compuse din 2 pri omoloage dreapta i
stnga, distincte, derivate din gena ARN 7SL. n anumite cazuri, aceste
secvene sunt responsabile de mutaii sau de modulare a expresiei genelor;
- secvene mai lungi de cteva milioane de pb (n jur de 6-7 kb) sau
LINEs (long interpersed repetitive nucleotides elements);
- ADN satelit i . Sateliii , prezeni la nivelul centromerilor sunt
secvene repetate n tandem de 171 pb constituie ntre 1-3% din cromozomi.
Sateliii sunt secvene repetate n tandem de 68 pb situate n cromatina
cromozomilor 9 i a celor acrocentrici.
3.1 Structura genei
42

Secvenele de nucleotide ADN conin informaia necesar pentru

sinteza ARNm i ulterior a unei proteine.
n secvena genei se disting :
-secvene n amonte reglatoare care structureaz promotorul,
- un situs de iniiere al transcripiei, sau start point notat cu +1,
locul unde este ncorporat primul nucleotid de unde ncepe transcripia
-o succesiune variabil de exoni i introni.
n general intronii nu exist la virusuri i bacterii. Ei sunt prezeni
doar la eucariote. intronii coninnd eventual alte secvene reglatoare i n
sfrit
-ultimul exon sau terminator unde se termin transcripia.

Fig.3.4 Structura genei i expresia ei.

Ansamblul mecanismelor care stau la baza secvenelor genei conduc

la producerea unui acid ribonucleic sau a unei proteine desemnate prin
termenul de expresia genei.
Promotorul este situat n amonte de gen, n poziia 5', are ntre 800 i
1000 pb. El nu este transcris i tradus, intervine n iniierea transcripiei i
orientarea direciei n care aceasta se va derula, secvene consens pentru situl
de fixare a ARN polimerazei II i a unui capion pe ARNm indispensabil
pentru transducia sa ulterioar.
n poziia 3' a genei pe ultimul exon, se afl unul din 3 codoni STOP
TAA, care se continu cu o secven de poliadenilare AAAAA care va semnala
oprirea transduciei la nivelul ribozomilor. Coada de poliadenilare este situat
n aval de codonul STOP, secven care nu va fi tradus. Ea reprezint un sit de
recunoatere a ARNm primar i este indispensabil pentru stabilitatea ARNm.
43

Pot exista mai multe situri de poliadenilare corespunztoare mrimii diferite a

ARNm. Ele sunt specifice esuturilor.
Exist gene care se exprim n toate esuturile (ubicvitare sau gene de
menaj) sunt coninute constant n aceeai regiune. Acestea, conin secvene
bogate n GC (5'GGG CGG3') pe care se fixeaz factori de transcripie SP1.
Factorii proteici numii i factori de transcripie interactiv prezint secvene
reglatoare care moduleaz expresia genei.O gen poate avea mai mui
promotori. Unii promotori pot fi specifici esuturilor (2, 14, 26, 36, 44, 46, 49,
67).

3.2 Secvena unei gene apoA II

Apolipoproteina apoA este componenta proteic a oricrei lipoproteine,
n special a celor plasmatice. Ea este protein asociat lipoproteinelor cu
densitate mare (HDL) i realizeaz stabilizarea acestora.
Scrierea pe baz de litere ACGT n ordinea n care se ntlnesc
nucleotidele pe un lan ADN de la extremitatea 5-3 duce la un text
indescifrabil. Suportul acestui text astfel transcris conine toat informaia
necesar pentru sinteza unei proteine apolipoproteina AII. Ansamblul
informaiei genetice transcris astfel cu 3 miliarde de litere (o biblioteca de
7000 cri cu 300 pagini fiecare).

Secvena unei gene (apoA-II).

Proteinele implicate n transcripie se vor fixa pe lanurile dublului helix
ADN, pentru transcripia unor secvene specifice i va permite expresia
informaiei .
44

Expresia unei gene

Expresia unei gene este o succesiune de sinteze chimice i reacii care
conduc la producerea unei proteine. n prima etap are loc sinteza ARN
premesager sau ARN precursor (denumit i ARN heterogen sau Hn-ARN) a
crei secven este complementar catenei antisens a genei deci identic
catene sens i este orientat n aceai direcie cu aceasta (Fig. 18).
Dup reacii de maturare a transcriptului primar ARN devine ARNm i
trece din nucleu n citoplasm. Ulterior ARNm este citit de un grup de cte 3
nucleotide de la 5 la 3 i are loc sinteza proteinelor de ctre ribozomi.
Cuplarea aminoacizilor se realizeaz de la extremitatea NH2 terminal ctre
extremitatea COOH terminal. Dup reacia de maturare proteina matur este
gata s-i ndeplineasc funcia n celul.

Fig. 18. Expresia unei gene.

TRANSCRIPIA
Sinteza ARNpremesager este catalizat de ARN polimeraze, ADNdependente, utiliznd catena antisens ca matria ADN folosind nucleozid
trifosfai ca substraturi care polimerizeaz n direcia 5'-3', la fel ca i sub
influena ADN polimerazelor. Numai un singur lan al dublului helix ADN,
complementar catenei sens este utilizat ca matri. ntruct dubla caten a
ADN este conservat, sinteza ARN este descris ca fiind conservativ i
asimetric, ntruct se produce numai un lan polinucleotidic.

45

Fig. Prima etap a transcripiei.

Secvena de baze a ARN sintetizat va fi identic fa de catena
codificatoare, cu meniunea c uracilul nlocuiete timina. ARN polimerazele
sunt enzime multisubunitare mari i complexe, care au capacitatea de a
identifica locul n care este iniiat sinteza ARN pe matria ADN. Spre
deosebire de ADN polimeraze, ARN polimerazele nu au nevoie de amors.
Cele dou catene de ADN se separ la locul de iniiere a sintezei.

Fig. Derulerea transcripiei.

Atunci cnd ARN polimeraza ajunge la terminator se va desprinde
ARNpremesager, dublul helix se reface i ARNpolimeraza se desprinde de
ADN(fig).

Fig. Terminarea transcripiei.

46

Nucleii celulelor eucariote conin 3 tipuri distincte de ARNpolimeraze:

-ARN polimeraza I este localizat n nucleoli, unde se gsesc genele
ribozomale i catalizeaz sinteza precursorilor majoritii moleculelor de
ARNr 18S, 5, 8S, 28S;
-ARN polimeraza II este localizat n nucleoplasm i catalizeaz
sinteza precursorilor ARNm i a unor snARN (ribonucleoproteine mici). Ea
este inhibat specific de toxic extras Amanite phalloide, amanitin. Masa
molecular este de 500 000 Da pentru 10 subuniti.
-ARN polimeraza III este localizat n nucleoplasm i catalizeaz
sinteza precursorilor moleculelor ARNr, 5S i o varietate de mici
fragmente de ARN nucleari i citoplasmatici (ARNt, , snARN, 7SL-ARN).
Promotorul apolipoproteina AII
Ultima linie a acestei imagini este secvena primului exon a genei
apolipoproteinei AII. Cele 900 nucleotide care o preced conin numeroase
secvene recunoscute de proteine care permit nceperea transcripiei sau
reglarea acestei etape i formeaz promotorul.
Poriunea de ADN care va fi transcris se numete unitate de
transcripie. Aceasta este delimitat de promotor, urmat de un punct de
iniiere sau start point notat cu +1, locul unde este ncorporat primul
nucleotid de unde ncepe transcripia i un terminator unde se termin
transcripia (Fig. 19).

Fig. 19.Secvena unui promotor.

.Nucleotidul aflat dinaintea situsului start este notat cu -1. Acesta se
refer la catena sens, nu la catena matri (antisens). Catena sens are aceeai
secven ca i catena ARNm (doar c T este nlocuit cu U). Promotorii
pentru fixarea ARN polimerazei sunt pe latura 5' a startului (n amonte de
situsul start).
47

Secvena aflat naintea punctului start, se numete din amonte, iar cea
de dup punctul start, n aval.
Promotorului i se disting urmtoarele secvene:
-secven numit caseta TATA(sau domeniu) , care este recunoscut
specific prin proteinele TPB ca subuniti ale TFIID, cofactor al ARN
polimeraza II;
-secvene sau caset CAAT i GG box, situat pe catena sens, pe care
vin s se fixeze alte proteine de transcripie CTF i SP1.
Genele apolipoproteinei AI i AIII care sunt vecine i sunt situate pe
cele dou lanuri ADN de la stnga la dreapta i de la dreapta la stnga.
Transcripia se face sintetiznd ARNpremesager de pe secvena
lanului antisens, deci identic cu catena sens.

Fig. 20. Caten sens i antisens.

Modularea activitii promotorilor

Activitile multor promotori sunt amplificate de ctre secvene de
ADN numite enhanceri sau activatori, situai la distan, pn la cteva sute
de perechi de baze de promotor. Legarea poate fi la captul 5' n amonte, sau
3'(n aval) i chiar n interiorul genei, ntr-un exon sau intron. Funcia lor este
independent de poziie i orientare. Asemenea amplificatori sunt recunoscui
de proteine specifice denumite factori de transcriere care stimuleaz legarea
ARN polimerazei de un promotor vecin. Fiecare enhancer conine cel puin
un sit de fixare pentru un factor de transcripie. n general sunt mai multe
situsuri pentru factorii de transcripie care acioneaz sinergic.

48

Enhancerii sunt secvene care stimuleaz expresia genei.Faptul c

amplificatorii sunt aezai la distan (considernd ADN liniar) fa de
promotorii pe care i controleaz este explicat pe baza foldingului (mpachetrii
sau plierii) ADN prin care ia natere o structur teriar care aduce cele 2
elemente n poziii apropiate.

Fig. Enhancerii sau activatorii.

Silancerii. Aceaste secvene diminu sau inhib expresia genei. Sunt
localizai adesea ntre promotori i enhanceri, sunt antienhanceri.
49

Factori care acioneaz n transcripie. Sunt proteine care acioneaz

asupra ADN prin inhibarea parial sau total a receptorilor transcripiei.
Rolul cromatinei. Este un ansamblu complex care constituie asocierea
ADN-ului cu proteine histonice i nehistonice.
Enzima cheie pentru transcrierea genelor pentru proteinele structurale
este ARNpolimeraza aa cum s-a descris mai sus.Promotorii recunoscui de
aceast enzim sunt mult mai mari i mai diveri.
Operonul lac
n timp ce toate celulele unui individ au acelai ADN, natura proteinelor
sintetizate de celule difereniate variaz. Aceasta este valabil nu numai pentru
celulele eucariote din organisme multicelulare, dar de asemenea, pentru bacterii
atunci cnd au loc schimbri nutriionale i de mediu. Cea mai frecvent cale
de sintez proteic difereniat se face prin controlul transcrierii ADN pentru
producerea de ARNm.
Prima demonstraie a controlului transcrierii a fost fcut de Jacob i
Monod pentru operonul lac. Un operon este definit ca un grup de gene
adiacente care structureaz promotorul, operatorul i gene structurale care
sunt transcrise ntr-un singur ARNm. Operonul controleaz transcrierea
ARNm pentru 3 proteine. Segmentul de ADN care conine toat informaia
pentru producerea unui singur polipeptid este numit cistron i operonul lac este
numit ARN policistronic.
Demonstrarea sintezei proteice specifice unui segment de ADN
stabilete modul general de aciune i controlul transcrierii n toate tipurile de
celule. Operonul lactozei este format din operator care include i promotorul, i
trei gene structurale. n amonte de operator sunt situate gene reglatoare care
sintetizeaz proteine represoare. Cnd n celule lactoza este absent represorul
se ataeaz la operator iar promotorul realizeaz o bucl, i modific
configuraia i nu permite transcripia genelor structurale. Genele sunt astfel
blocate transcripiei.

Fig. Genele sunt blocate transcripiei.

50

Atunci cnd lactoza este prezent, bacteriile convertesc lactoza n

alolactoz care se leag de represor. Funcia acestuia din urm este alterat,
elibereaz promotorul operatorului i este permis transcripia genelor
structurale.

Fig. Prezena lactozei permite transcripia genelor structurale.

Vor fi sintetizate 3 enzime galactozidaza, permeaza i transacetilaza
care degradeaz lactoza avnd un rol important n metabolismul lactozei.
ntruct starea normal este aceea n care operonul lac este inhibat,
fenomenul descris este cunoscut ca i control negativ.
Operonul lac este i subiectul unui control pozitiv. Astfel AMPciclic
(cAMP) se leag de o protein de activare a genei catabolit (CAP) i complexul
format stimuleaz transcrierea prin intensificarea legrii ARNpolimerazei la
promotor.

Fig. Controlul pozitiv al operonului lac.

Circumstana prin care glucoza este sursa preferat de energie i n
prezena sa sunt numai cantiti mici de galactozidaza format i alte enzime
catabolice, este explicat prin fenomenul de represie a catabolismului. Prezena
glucozei determin scderea concentraiei cAMP i prin urmare scade controlul
pozitiv menionat mai sus.
Controlul sintezei proteice la eucariote

51

n majoritatea esuturilor, toi ribozomii sunt legai de ARNm i sunt

implicai n sinteza proteic. n anumite esuturi, cum este glanda mamar la
animale gestante, unii ribozomi nu sunt asociai cu ARNm. Activitatea de
sintez proteic a unei celule poate, prin urmare, s fie schimbat, fie prin
formare de poliribozomi din ribozomii existeni fie prin producerea de
poliribozomi adiionali. n situaia n care sinteza unei anumite proteine este
schimbat este cunoscut ca i control specific.
Sinteza proteic le eucariote poate fi controlat pe ci multiple. Astfel
structura cromatinei sufer schimbri probabil datorate modificrii
histonelor n nucleozomi. Este dovedit deja contolul nivelului traducerii prin
fosforilarea factorilor de iniiere. n acest caz controlul primar este la
nivelul transcrierii. Aa cum s-a descris pentru operonul lac, acest control
specific este fcut de ctre poriunea n amonte a ADN fa de situsul de
transcriere i prin prezena multor proteine diferite. Enzima cheie u
transcrierea genelor pentru proteine structurale este ARN polimeraza II.
Promotorii recunoscui de aceast enzim sunt mult mai mari i mai diveri
dect cei ai operonului lac.
Factorii care sunt produi ai genelor, altele dect cele pe care ei le
controleaz, sunt denumii factori trans-activatori. n organisme superioare
acest fenomen nu are loc ntruct nu sunt ARN policistronici i genele
individuale sunt transcrise n ARN monocistronici individuali codificnd
proteine singulare. Astfel trebuie s existe alte ci de coordonare, mai ales c
adesea, genele implicate sunt pe cromozomi diferii. n acest fel, producerea
unei molecule de anticorp funcional necesit sinteza de proteine
imunoglobulinice cu lan greu (H) sau uor (L). n timp ce locusul lanului greu
H este pe cromozomul 14 la om, genele lanului uor sunt pe ambii cromozomi
2 i 22. O situaie similar exist i n cazul hemoglobinei, unde familia globinei este pe cromozomul 16 la om, i gena -globinelor pe cromozomul 11.
Antibioticul actinomicina D inhib transcripia prin legarea de matri,
n timp ce rifampicina o inhib prin legarea de ARNpolimeraza.
La virusurile cu ADN dublu catenar, transcrierea va avea loc la fel ca n
celulele normale, de obicei utiliznd ARNpolimeraza din nucleul celulei gazd.
O excepie o reprezint virusul vaccinia care determin boala vrsatul vacilor
(cawpox). n acest caz replicarea are loc n citoplasma deoarece particulele
virale posed ARNpolimeraza proprie. Dac ADN viral este monocatenar,
replicarea sa implic o form replicativ bicatenar, ADN viral fiind
obinut prin sinteza asimetric numai a unei singure catene din cele dou.
n anumite cazuri, genomul virusului este reprezentat de ARN, care
apare n dou forme. Dac ARN servete ca ARNm, este notat (+),
polimeraza implicat este o protein format din 4 subuniti, numai una dintre
ele este virus specific, celelalte subuniti fiind oferite de ctre celula gazd.
52

Dac ARN viral nu servete ca ARNm este notat cu -, celula gazd nu l

poate replica i virionul trebuie s poarte o replic pentru a forma catene
(+) ce servesc ca ARNm. Exemple de astfel de virusuri: influenza, pojar,
rabie.
Controlul transcrierii prin hormoni
Muli hormoni i exercit efectele biologice prin legarea la receptori
de suprafaa celular care activeaz mesageri secundari cum este AMPc.
Hormonii steroizi i tiroxina acioneaz n mod diferit. Ei intr n celula int i
se leag de proteine receptor specifice n citosol. Acetia migreaz n nucleu i
controleaz transcrierea prin legare la ADN i controleaz exprimarea a 50-100
de gene. Diferitele proteine receptor posed o arhitectur similar i reprezint
o superfamilie, Ele conin un domeniu nalt conservat de legare a ADN, un
domeniu de legare a hormonilor, un domeniu variabil N terminal care
interacioneaz cu ali reglatori ai transcrierii. Cnd hormonul leag receptorul,
domeniul de legare al ADN este blocat.
Reglarea expresiei genelor
Sinteza ARNm se mai numete expresie genic, deoarece din molecula
de ADN reprezentat de o gen, cand este activat se transcrie un ARNm
pentru o protein dat. Genele din genomul celulelor eucariote sunt ntrerupte
de secvene care nu vor fi regsite n secvena proteinelor. Astfel unitatea
transcriptibil a genei la eucariote este format din introni i exoni.
Reglarea ntregii ci metabolice se face n principal de la prima reacie
pentru a nu sintetiza intermediari inutili i este legat de 4 nivele:
- transcripia;
- maturarea transcriptului;
- transducia;
- activarea proteinelor mature.
Punctul de control principal al transcripiei este ARN polimeraza II,
enzima cheie a expresiei unei gene (Fig. 21).

53

Fig. 21. Reglarea expresiei genei

Secvene cis i transreglatoare (Fig. 22.)
Secvena nucleotidelor promotorului formeaz factorul cis reglator i
este recunoscut printr-o clas de proteine specifice, 8 factori transreglatori, a
cror structur permite o legtur cu ADN (ADN proteine de legtur).
Factorii transreglatori influenez viteza de transcripie. Ei pot fi
enhanceri cu rol activator, sau pot fi inhibitori (secvene silencer).
Legtura lor cu ADN depinde de circumstane fiziologice care induc sau
reprim expresia genelor.

Fig. 22. Cis i transreglatori.

54

Exist elemente eseniale prezente n majoritatea genelor:

- elementul principal este caseta TATA ;
- elemente de baz, ca octamer recunoscut de factorul OCT1 prezent n
aproape toate celulele.
Exist elemente care rspund la factori a cror prezen depinde de
semnale care parvin la celule, n special hormoni ca insulina sau mesagerii de
ordinul II ca AMPc. Exist elemente specifice tipului celular care permit
expresia diferit a genelor n fiecare esut. Astfel, promotorul lipoproteinlipazei conine TATA box, elemente ale promotorului de baz, elemente de
rspuns la hormoni i elemente de expresie tisular specifice. n promotorul
genelor exist 20-30 situsuri de fixaie pentru factorii transreglatori din care
majoritatea au efect inductor, sau represor asupra expresiei unei gene.
Recunoaterea ADN de ctre proteine
Au fost identificate 3 motive sau domenii proteice importante care
recunosc ADN: motivul elice-cot-elice (helix-turn-helix), protein de tip
amprentde Zn (zinc finger) i proteine fermoar de leucin (leucine zipper).

Fig. 23. Proteine de legtur ADN.

Primul descoperit, motivul sau domeniul helix-turn-helix este prezent n

proteine care leag gene homeotice (cele care controleaz planul
arhitectonic al embrionului) n proteine de structur, factori de
transcripie i elemente transreglatoare. n structura spaial a acestor
proteine se recunosc domenii proprii acestei legri specifice.. Acest
motiv este format dintr-o regiune scurt care seamn cu o elice
urmat de un cot i apoi o alt elice . Domeniu helix-bucl-helix,
55

permite legarea specific a helixului cu nucleotide n marele silon,

n jur de 10 perechi de baze.

Fig. Domeniu helix-bucl-helix

Amprenta Zinc (Zinc finger)

Acest motiv conine o pereche de resturi de cistein, urmat de
aproximativ 12 resturi de aminoacid i o alt pereche de resturi de
cistein sau histidin. Perechile de cistein coordoneaz ionii de zinc,
aa nct ceilali aminoacizi formeaz o proeminen asemntoare unui
deget (finger). Fiecare deget de zinc se leag cu 5 nucleotide n marele
silon a ADN.

Fig. Amprenta Zinc (Zinc finger)

Exist adesea mai multe prelungiri de zinc n aceeai protein.

Aceast structur este repetat de 9 ori n factorul de transcriere TFIIIA
(factor de transcriere pentru ARN polimeraza III), care se leag de gena pentru
ARN5S, fiecare deget legndu-se n anul mare al helixului ADN. Acest
model s-a gsit n civa factori de transcriere ai ARN polimerazei II.
Fermoarul de leucin
Factorul de transcriere C/EBP, care este implicat n stimularea
exprimrii unor gene specific hepatice, are o regiune de 35 aminoacizi, din care
tot al 7-lea este leucina. O asemenea structur a fost gsit n protooncogenele
Myc, Fos i Jun. Interaciunea cu ADN const n faptul c forma de tip fermoar
(zipper) leucin nu se leag direct de ADN; mai degrab faciliteaz dimerizarea
56

proteinei i ofer structura proteic corect pentru legarea ADN prin domenii
specifice de legare a ADN bogate n arginin i lizin. Pentru a aciona ca
factori de transcriere, proteinele trebuie s dimerizeze fie ca homodimeri
paraleli (de exp. Fos-Fos), fie ca heterodimeri (Fos-Jun) spre fermoarul de
leucin.
Reglarea expresiei genelor n timpul hipoglicemiei
n cursul hipoglicemiei concentraia glucozei n snge diminueaz.
Creierul a crui nutrient major este glucoza reacioneaz, determin secreia de
ctre hipofiz a unor factori de stimulare, corticotrofine sau ACTH. Acestea
provoac secreia unui hormon, de ctre celulele din zona fasciculat a
corticosuprarenalei, respectiv a cortisolului (Fig. 24).
Cortisolul acioneaz asupra ficatului i se leag de proteine specifice,
receptorii pentru cortisol. Aceste proteine leag hormonii constituind factorii
trans-reglatori.
Factorii transreglatori trec n nucleul hepatocitelor se leag de ADN la
nivelul promotorului anumitor gene care au elemente cis reglatoare specifice:
GRE (glucocorticoid responsive element).

Fig. 24. Reglarea hipoglicemiei

Legtura factorilor transreglatori (proteine+hormoni) pe secvena
elementelor cis-reglatoare (secvena AGAACA) vor activa transcripia genei n
aval de acest promotor de unde se sintetizeaz mesagerul n concentraie mare.
Mesagerii astfel produi vor induce sinteza enzimelor ce aparin cii
57

gluconeogenezei. Creterea concentraiei acestor enzime n hepatocite va

permite transformarea aminoacizilor n glucoz, care va fi eliberat n
circulaie i va ajunge la creier; are loc o cretere a nivelului glicemiei.
Reglarea la efort
Stresul activeaz mecanisme care pregtesc organismul pentru efort
fizic, care necesit utilizarea glicogenului pentru contracia muscular.
Creierul activeaz medulosuprarenala pe cale nervoas pentru
producerea adrenalinei. Dac concentraia glucozei n snge este sczut
(hipoglicemie) pancreasul secret glucagon. Cei doi hormoni acioneaz asupra
muchilor i a ficatului activnd sinteza AMPc.
Acesta din urm este activator a protein-kinazei A, care este capabil s
fosforileze CREB (AMPcilcic element responsabil de legarea proteinelor).
Fosforilarea CREB-P va trece n nucleul celulei i se leag de ADN la nivelul
promotorului unor gene, care au un element cis reglator specific: CRE
(elemente responsabile de AMP cilcic).
Legarea factorilor trans-reglatori (CREB fosforilate) pe secvena
elementelor cis-reglatoare (secvene TGACGTCA), vor activa transcripia
genei n aval de promotori, care atrage sinteza mesagerilor. Mesagerii astfel
produi vor induce sinteza enzimelor aparinnd cii de glicogenoliz.
Creterea concentraiei acestor enzime n muchi vor permite transformarea
glicogenului n energie care va fi utilizat pentru contracia muscular (Fig.
25).

58

Fig. 25. Reglarea la efort.

59

Mecanismul transcripiei
Iniierea transcripiei
n urma cercetrilor analitice s-a reuit s se izoleze i purifice din
extractul nuclear o serie de factori de transcripie. Primul care recunoate
promotorul i n special TATAbox, este factorul de transcripie D (s-a notat
TFIID de la transcriptional factor TF i II de la ARN polimeraza II). El se
leag de secvena TATAbox printr-o protein denumit i TBP (TATA Binding
Protein). Acest factor odat legat de ADN v-a atrage i ali factori de
transcripie, de la TFIIA pn la TFIIJ i ARN polimeraz II. Energia de reacie
este furnizat prin hidroliza legturilor bogate n energie a nucleotidelor
trifosfat (42 KJ/mol).

Fig.27 Legarea TFIID pe ADN.

Dac ARN polimerazele sunt universale, identice pentru toate celulele
i esuturile, factorii de transcripie sunt specifici pentru anumite esuturi. Ei
joac un rol important n diferenierea celular i meninerea tipurilor de celule.
Pe lng aceti factori de transcripie implicai direct n sinteza ARN,
exist i proteine care regleaz desfurarea procesului, n sensul c l
intensific, atenueaz dar nu-l blocheaz.
Adugarea succesiv a TFIIB i a RAP30, o subunitate mic a TFIIF
este necesar pentru fixarea polimerazei pe lanul transcris n sensul
transcripiei.
La acest complex ADN-TFIID-TFIIB-RAP30 polimeraza II se adaug
succesiv subunitile mari TFIIF (RAP74), TFIIE i TFIIH. Atunci transcripia
poate ncepe dac sunt prezente i ribonucleotidele substrat.
60

Complexul de iniiere al transcripiei recunoate o secven de

aproximativ 100 nucleotide a lanului antisens de ADN. TFIIH provoac
deschiderea i derularea parial a dublului helix la acest nivel.

Fig. 26. Iniierea transcripiei.

Transcripia ncepe la a 22-a nucleotid de pe TATA box, n direcia
opus elementelor GC-CAAT i se continu crescnd lanul antisens n direcia
extremitii sale 5. Formarea acestui complex este activat sau inhibat de
factori transreglatori legai de secvena cis reglatoare a aceluiai promotor.
Fixarea factorului TFIID pe TATAbox este prima etap a complexului
de iniiere a transcripiei. Dup aceast fixare se deformeaz dublul helix de
manier important. Acest ansamblu va servi ca punct de ancoraj pentru ali
factori de iniiere a transcripiei, dup cum urmeaz:
-complexul ADN-TFIID acioneaz ca un situs de legare pentru un alt
factor: TFIIB care leagndu-se va stabiliza complexul. Acest factor are
aciune ATP-azic, elibernd energia necesar desfacerii catenelor de
ADN, pentru formarea complex lui deschis (open);
-la acest complex se asociaz ali factori: TFIIE i TFIIH;
-ARN polimeraza II i n urma unui proces ATP-dependent ncepe
iniierea transcripiei. Iniierea ncepe cnd s-a format complexul de
iniiere, la nivelul promotorului genei int la care se asociaz un alt
factor : TFIIF, care este factorul de elongaie.
Acest factor mpiedic terminarea prematur a sintezei ARN.
ARN polimeraza I i II formaez complexe cu factori de transcripie
care se leag upstream n amonte (deci naintea punctului de iniiere) pe cnd
61

majoritatea factorilor de transcripie pentru ARN polimeraza II se leag

downstrem-n aval (chiar la mijlocul unitii de transcripie).

Reglarea ARN polimerazei

Activatorii sau inhibitorii transcripiei (factori trans-reglatori) sunt
proteine produse de ARN polimeraza II i ca urmare induc sau reprim
expresia genelor transcrise.
Aceti factori transreglatori se leag de ADN (ADN proteine de
legtur) n regiunea genei situate n amonte de partea transcris. Situsul de
fixare a acestor factori transreglatori pe ADN sunt secvene specifice numite
elemente cis reglatoare.
Cuplul elemente cis reglatoare cu factorii transreglatori legai, intr n
contact cu complexul de iniiere a ARN polimerazei prin intermediul unui
ansamblu de proteine numite mediatori.

Fig. 28. Reglarea ARN polimerazei.

ARN polimeraza poate deci demara transcripia, dac este activat prin
factorii de transcripie, unii fiind legai de aceste elemente ca TATA box sau
CAAT i dac prin intermediul mediatorilor ele au primit un semnal de
activare sau inhibare. Acest semnal depinde de prezena unui factor
transreglator legat la elemente din promotor. Legarea de reglatori ai
mediatorilor necesit o repliere a ADN din promotor pentru a permite legarea
de aceste proteine.
Elongaia transcripiei
62

Fiecare nucleotid trifosfat este aleas specific, pentru a fi

complementar cu baza din lanul antisens care vine n faa ei. Legturile
bogate n energie ntre primul fosfat, care esterific C5 a ribozei i ceilali doi
fosfai sunt hidrolizate elibernd pirofosfat, care la rndul lui va fi hidrolizat
printr-o pirofosfataza. Fosfatul rmas se leag printr-o legtur ester la
carbonul 3 a ultimei nucleotide a transcrisului n curs de sintez.
ARN polimeraza construiete un ARN hibrid cu lanul de ADN
antisens, a crei secven primar este o copie a lanului sens dar compus din
ribonucleotide n loc de dezoxiribonucleotide i de uracil n locul timinei. n
cursul acestei elongri ARN polimeraza II este nsoit de o serie de factori de
elongaie care modific cromatina pentru a permite avansarea enzimei, care
mpiedic formarea de obstacole, ca o agraf de pr i faciliteaz avansarea
policondensrii.
Transcriptul primar rmne hibridat pe cteva nucleotide cu lanul
antisens apoi se detaeaz pentru a permite dublului helix s se reformeze
dup trecerea polimerazei

Fig. 29 Elongaia transcripiei

.
Extremitatea 5 a transcriptului primar eliberat se condenseaz n
diverse structuri secundare. Polimeraza se aeaz pe catena antisens i merg n
sensul 3-5 Ea lectureaz sinteza transcrisului primar prin condensarea
ribonucleotidelor, pn ntlnete semnalele de terminare. La ntlnirea
63

semnalului de terminare, ARN polimeraza se detaeaz de ADN elibernd

transcriptul primar i dublul helix se renchide.
Viteza de sintez a ARN este de 45 nucleotide/secund. Transcripia
trebuie fcut cu acuratee pentru c la nivelul ARN nu exist sisteme de
corectare a erorilor. Daca au aprut erori, ARN avnd un timp de injumtire
biologic (T) relativ scurt, nu se pot produce perturbaii de ordin genetic
(transmisibile) ca n cazul ADN.

Fig. 30. Elongaia transcripiei.

Discontinuitatea genelor
Moleculele de ADN ale fiecrui cromozom sunt foarte lungi pn la
sute de milioane de perechi de nucleotide i conin mai multe mii de gene. La
om genele sunt foarte dispersate i nu reprezint dect 10% din ADN genomic
total.
Fiecare gen conine regiuni care prezint secvene codate care vor fi
exoni, dar i regiuni reglatoare ca promotori i regiuni netraduse numite introni
care separ exonii. O gen poate s nu conin dect un singur exon i s nu
conin intron dar exist gene cu peste o sut de exoni. Dup transcripia ARN
produs de ARN polimeraza transcrisul primar conine de asemenena introni
i exoni dar nu i promotor.
Dup excizia intronilor i matisarea sau nndirea exonilor, mesagerul
nu conine dect exoni reunii ntr-o singur secven codant.

64

Fig.31 Discontinuitatea genelor.

Exonul
Exonul reprezint partea secvenei unei gene transcrise n structura
ARNm pn la transducie. Exonii sunt fragmente ale secvenei primare ale
unor gene care vor fi recopiate n structura primar a ARNm dup matisare.
Exist exoni de lungimi variabile: fragmente scurte (34 nucleotide pentru
exonul 1 al apoAII), lung (7572 nucleotide pentru exonul 26 al apoB).
Un exon codific cel mai adesea un domeniu funcional al proteinei sau
o parte a acestuia. Astfel c poteinele eucariotelor sunt formate din mai multe
domenii codificate de gene care posed cel puin atea exoni (ct are proteina).
n cursul evoluiei, gena poate fi modificat prin substituia, inseria sau deleia
unui exon ntreg (conversia genei) ceea ce modific proteina (aduce sau retrage
proteinei un domeniu funcional n ntregime).
Exemplu de exon. Exon 1 apoAII.
Dup fixarea ARN polimerazei pe caseta TATA prin intermediul
factorului TFIID, transcripia va ncepe. n acest punct, secvena lanului sens
este de 5AGGCACAGA3 cea a lanului antisens va fi deci 3TCCGTGTGT ...
5 (complementar i antiparalel).

65

Fig. 32. Exon I.

Pentru a alege ca substrat ribonucleotidele complementare ale acestei
catene antisens ARN polimeraza va compune 5AGGCACAGA3 care va fi
nceputul secvenei ARN transcris. Transcripia se desfoar pe toat lungimea
catenei antisens prin ncorporarea a 1329 nucleotide n ARN transcris de
apoAII.
Sfritul transcripiei
Transcripia genei apoAII se desfoar pn la a 1329-a nucleotid.
Ctre sfritul genei factorii legai de ARN polimeraza recunosc pe lanul
antisens o secven 3TTATTT5 urmat la majoritatea genelor de alt semnal
3ATACAAAC5 este eliberat ARN polimeraza. Transcripia se oprete cu
puin dup primul semnal i sfritul transcripiei se scrie
5AAUAAAUGCUGA ... AUCC 3OH.
ARN polimeraza fiind eliberat de ADN i transcriptul primar, care
conine copia informaiiei genetice, va reprezenta expresia genei sub form de
proteine.
Modificri ale transcrisului
Capion sau bonet: o enzim adug o guanina la fosfatului 5 a
primei nucleotide a transcrisului formnd 7-metilguanilat trifosfat i transfer
radicalii metil pe primele nucleotide. Aceste modificri au loc n debutul
tuturor transcripilor

66

Fig. Capion sau boneta ARNm.

Enzimele de bonetare (Fig. 33). Elongarea transcrisului primar ncepe
de la extremitatea COOH terminal a polimerazei compelxului de iniiere.
Pentru adugarea coifului un complex multienzimatic excercit trei activiti:
- hidroliza fosfatului printr-o fosfataz la nucleotidul 5 a transcriptului
primar;
- transferul pe fosfatul rmas a unui guanilat de la GTP de ctre o
guanililtransferaz;
- metilarea acestui guanilat pe N7 realizat de o metilaz.
67

Fig. 33. Enzime de bonetare.

Primele 2 reacii sunt catalizate de o protein de 68Kda, iar metilarea de
o alt subunitate de 57Kda.
ARNm sunt distrui de ribonucleazele din citoplasm. Prin hidroliza lor
se elibereaz nucleotide care vor fi refolosite la sinteza altor acizi nucleici.
Pentru a proteja ARNm de acest catabolism, o structur special ascunde
extremitatea 5 terminal a acestuia de exonucleaze specifice. Aceast structur
este numit coiful mesagerului. Exist cel puin o fixare a GMP pe al II-lea
fosfat din nucleotida trifosfat care se gsete la extremitatea 5 din transcris.
Acest GMP este metilat pe azotul nr.7. Dac nucleotida iniial conine o
adenin aceast poate fi metilat pe N6.

68

Ribozele nucleotidelor iniiale sunt uneori metilate pe oxigenul

fraciunii alcool n 2.
Coada poli A. O enzim -endonucleaza- secioneaz transcrisul primar
cu 10-20 nucleotide nainte de secvena AAUAAA i o polimearaz A
sintetizeaz pe C3OH liber a ultimei nucleotide a transcrisului rmas, o caten
de adenin numit cutia de poliadenilare (coada polyA). Este o caten cu o
lungime de 500-2000 nucleotide a adeninei policondensate.
Semnalul de sfrit al transcripiei se afl la sfritul majoritii genelor
mamiferelor TATGTTTC. Citirea acestor semnale de ctreARN polimerazei II,
se oprete din transcripie i prsete ADN elibernd transcrisul primar.
Aceast coad polyA este indispensabil maturrii i activitii ARNm
pe care-l poart. Ea va fi digerat lent de o exonucleaz din citoplasm dac
mesagerul va fi activ. Dac va fi redus la cteva sute de nucleotide mesagerul
va fi distrus total pentru a fi nlocuit de un mesager nou.

69

Fig. 35. Coada poly A.

Transcrisul primar al apoAII
Transcrisul primar al apoAII conine 1329 nucleotide. El primete un
coif, bonet sau 7 metilguanilat care se fixeaz pe fosfatul a ATP n poziia 5
a transcrisului primar. Primete de asemenea i o coad poly A sintetizat n 3
dup sfritul transcrierii.
Trei introni vor fi excizai: ei vor fi recunoscui printr- un situs donor
GU n 5 a fiecrui intron, urmat de o secven bogat n purine; un situs
primitor n 3AG a fiecrui intron precedat de o secven bogat n pirimidin.
Dup aceast maturare transcriptul primar devenit ARNm va fi transportat ctre
citoplasm pentru transducie.

70

Fig. 36 Transcrisul primar.

Excizia, matisarea.
Excizia, matisarea este o etapa de maturare a ARNm, unde intronii,
prile necodante ale structurii primare a transcrisului sunt secionai din
structura primar i exonii legai unul cte unul formnd o singur secven
codant. Dup excizia intronilor i matisarea exonilor, mesagerul nu conine
dect exoni
Etapa de eliminare a intronilor. Intronii, prile necodante a genelor
eucariote, sunt decupai (excizai) din structura primar a ARN n cursul
maturrii mesagerului.
Exonii, pri codante, sunt temporar legai cap la cap (matisare) pentru
a forma secvena primar a ARNm. Excizia i matisarea se realizeaz prin
aciunea unor enzime i a ribozomilor care catalizeaz secionarea ARN
(endoribonucleaze mici nucleare) i inchiderea breelor prin ARN ligaze.
Matisarea poate fi alternativ adic poate conduce la mai multe structuri ale
ARNm. ARNm alternativ are fiecare anumii exoni proprii ca i unii exoni n
comun.
Formarea lasoului
Excizia intronilor i matisarea exonilor este o etap foarte important a
maturrii transcrisului n nucleul celular. Se face apel la factori specifici:
ribonucleoproteine coninnd mici subuniti de ARN nuclear (snRNP), ARN
avnd proprieti catalitice, ribozomi, enzime specifice (maturaze).
Structura secundar a transcrisului pune n contact 3 secvene ale
intronului:
- secvena de debut a intronului (extremitatea 5 sau situsul donor),
-secvena de sfrit a intronului (extremitatea 3 sau sistus acceptor) i
- un situs situat ntre 20-50 nucleotide n amonte de situsul de tiere 3
numit situs de ramificare. Situsul de ramificare este folosit pentru formarea
unui lasou (la).
71

Procesul are loc prin dou reacii transesterificare. Situsul donor ncepe
obinuit printr-o guanin a crui fosfat este detaat de exonul precedent
pentru a fi transferat pe C2 a A situsului de ramificare. Se formeaz un
grup 2, 5 fosfodiesteric, cu detaarea concomitent a exonului n
potiia 5. Ultima nucleotid a situsului acceptor este de asemenea o
guanin, care este detaat de exonul urmtor a primei nucleotide, este
legat prin fosfatul 5 la C3 a ultimei nucleotide a exonului precedent.
Apoi gruparea 3-hidroxil a exonului 5 formeaz o legtur
fosfodiesteric cu captul 5 terminal al exonului 3, rezultnd produsul
nndit.
Intronul eliberat sub form de lasou este distrus de nucleaze.
Transcrisul pierde succesiv toi intronii si i exonii se leag constituind
secvena codant a ARNm.
Jonciunile de nndire sunt recunoscute i cei doi exoni care trebuiesc
unii sunt adui mpreun prin intermediul unor molecule mici de ARN nuclear
(snARNs) care formeaz complexe proteice mici, numite ribonucleoproteine
mici nucleare (snRNPs). Complexul este cunoscut ca spliceosome o structur
foarte mare de 50-60S. Anticorpii de la pacienii cu lupus eritematos sistemic
diseminat au avut un rol crucial n descoperirea snRNPs.n aceast boal
autoimun, pacienii au o gam larg de anticorpi fa de componentele
nucleare. S-a demonstrat c anticorpii specifici anti- snRNPs blocheaz
procesul de splicing.

Fig.37 Formarea lasoului.

Splicing alternativ care duce la formarea de proteine diferite
n genaral, exonii sunt coliniari cu domeniile proteice. Astfel prin
selectarea exonilor ntr-un pre-ARNm dat, ar fi posibil generarea unor
72

molecule de ARNm diferite, pornind de la aceeai seciune a ADN genomic.

Splicing-ul alternativ apare frecvent.
Un exemplu este acela de generare a dou imunoglobuline diferite.
Limfocitul B poart un monomer de IgM pe suprafaa sa. Cnd un astfel de
limfocit este recunoscut de un imunogen, acesta este stimulat s formeze o
clon de plasmocite care sintetizeaz i secret IgM pentamer.

Fig. Monomerul de IgM de pe suprafaa limfocitului B.

Regiunea C-terminal a lanului greu H st la baza diferenei ntre
monomerul IgM o protein membranar i pentamerul IgM protein
secretat. Lanul greu H al monomerului posed o peptid hidrofob de 26
resturi de aminoacizi care are afinitate pentru membrana plasmatic, n timp ce
lanurile grele ale pentamerului au o peptid hidrofil de 20 aminoacizi.

73

Fig. Pentamerul IgM protein secretat.

Un animal poate sintetiza multe milioane de anticorpi diferii, fiecare cu
potenial de interaciune cu un antigen specific. Exist 3 surse ale acestei
diversiti:
-o diversitate de gene cu regiuni variabile;
-recombinarea somatic: de exemplu fiecare din cele cteva sute de
gene V pot s se lege de oricare din cele 5 gene J;
-mutaia somatic (de exemplu formarea lanurilor uoare).
Genomul celulei stem conine multiple variante ale genelor V i J
pentru lanul uor (L) i ale genelor V, J, D (diversitate) pentru lanul greu (H).
Genele V sunt precedate de un segment mic S ce codific o peptid semnal.
Cnd limfocitele se maturizeaz, fiecare celul n difereniere i construiete
anumite gene L i H cu o structur virtual unic printr-un proces de
recombinare care selecteaz ntmpltor unul din setul de segmente de gene i
le asambleaz mpreun cu gena C. PreARNm este prelucrat pentru a da un
ARNm matur care este tradus i peptida semnal este eliminat. Se formeaz
apoi prin oxidare punile S-S.

74

Fig. Genomul celulei stem cu multiple variante ale genelor V, J, pentru

lanul uor (L) i ale genelor V, J D pentru lanul greu (H).
Un alt exemplu de splicing alternativ este al troponinei.
Datorit prezenei proteinelor reglatoare pe transcrisul primar legarea
poate fi de mai multe feluri, se face difereniat de la o celul la alta. Este
posibil s se lege alternativ fie la exonul 3 fie la exonul 4 din gena troponina T.
Dac exonul 3 este pstrat se obine -troponina, iar dac exonul 4 este pstrat
se obine -troponina T. Aceast matisare alternativ st la originea
numeroaselor proteine izomorfe (Fig.38).
Este de asemenea posibil s se determine dependena expresiei genei a
2 promotori diferii, responsabili de reglarea difereniat. Fiecare din aceti
promotori este legat de un exon 1 sau 1bis care vor fi matisai alternativ cu
secvena transcrisului.
Se poate ntmpla s existe mai muli exoni la sfritul genei care
conin codoni STOP. n acest caz matisarea alternativ va da proteine cu
lungimi diferite.

75

Fig. 38. Matisare sau episaj alternativ.

Fig. Formarea proteinelor n urma splicig-ului alternativ.

Maturarea ARN ribozomal
Pentru transcrierea ARN ribozomal, ARN polimeraza I sintetizeaz un
transcris primar de 13000 nucleotide din 3 fragmente: ARNr 28S de 4518 nt,
18S de 1874 nt i 5, 8 S de 160 nt. ARN r 28S, 5, 8S i 5S se vor asocia cu 50
proteine pentru a forma subunitatea mare a ribozomilor. ARNr 18S va forma
76

subunitatea mic cu 33 proteine i ARN polimeraza III sintetizeaz mici ARN

5S de 120 nt.
ARN polimeraza I sintetizeaz un transcris primar al ARNr.
Stabilitatea mesagerului (Fig. 39)
ARNm este o copie de lucru a genelor, destinat dirijrii transduciei i
catalizrii prin ribozomi. Extremitatea 5 fosfat este protejat prin coif (boneta)
fr ca ARN s fie degradat n cursul transcrierii de 5 exonucleaze. La
extremitatea sa 3OH, fr coad polyA, mesagerul este inapt pentru
transducie i va fi distrus de endonucleaze.
Mesagerii care poart puini ribozomi pentru c iniierea transduciei
este ncetinit sau inhibat sunt distrui direct de ctre endonucleaze. Anumii
mesageri au durata de via scurt; muli dintre acetia care apar postprandial
(dup mas) au durat de via de 2 ore i sunt resintetizai n ntregime dup
fiecare mas. Ali mesageri din sistemul nervos de exemplu, sunt complet
stabili pe parcursul anilor.
ARNm cuprinde mai multe secvene:
- o secven 5 necodant care nu va fi tradus care corespunde exonului
1 i unei pri a exonului 2 din gena apoAII;
- primul codon AUG, fixeaz ARNt la metionin iniial;
- secvene de codoni pentru a ncorpora aminoacizi, ca peptide semnal i
polipeptide;
- secvena codonilor a cror aminoacizi vor forma secvena primar a
proteinelor;
- codonul de terminare (aici UGA);
- secvena 3 netradus care se va termina prin coada polyA.
Pe secvena 5 netradus se va constitui complex de iniiere a
transduciei unde ribozomii se vor asambla succesiv, pentru continuarea
transduciei.

77

Fig. 39. Stabilitatea ARNm.

Transducia
Expresia genomului, conduce la sinteza n celul a macromoleculelor
de aminoacizi i a proteinelor a cror structur primar este determinat de cea
a ADN. Transducia const n citirea ARNm de ctre ribozomi care sintetizeaz
proteinele a cror structur primar este determinat de acest ARNm. Aceast
expresie se face prin dou mecanisme principale:
- structura primar a ADN se exprim prin sinteza ARNm aceasta fiind
transcripia;
- structura transcris pe unii ARNm este exprimat prin sinteza de
proteine a cror structur primar se traduce prin aminoacizi (este
transducia).

78

Fig. Transcripia i transducia.

Transducia se face:
-n citoplasma celulelor fie prin eliberarea de proteine citoplasmatice;
-n organitele celulei n RE, apoi proteinele sunt transferate la AG,
-pentru a structura membrana celular, lizozomal, mitocondrial,
nuclear etc.),
-fie pentru a excreta aceste proteine prin exocitoz.
Codul genetic
ADN este situat compact n nucleu i se asambleaz n cromozomi.
Sunt 23 perechi de cromozomi n celulele umane, fiecare avnd o secven cu
caracteristici unice. Structura primar a ADN (succesiunea bazelor din lungul
catenei helixului, numit nc secven de ADN) poart informaia genetic i
constituie genomul. Informaia genetic specific, codant este decriptat, apoi
tradus n secvena primar a unei proteine. 20 aminoaicizi pot fi integrai sub
form de proteine.
Tripletul de baze (numit codon) codific un aminoacid, molecul de
baz care intr n structura proteinelor.
Relaia triplet/aminoacid poart numele de cod genetic. Limbajul
nucleic se scrie cu 4 litere (A,G,C,T). Dac o liter nucleic s-ar traduce printrun aminoacid nu am putea avea dect 4 aminoacizi. Grupnd literele nucleice
n cuvinte de cte 2 litere vom putea avea 16 cuvinte dar acestea nu vor permite
dect codificarea a 16 aminoacizi. Grupnd literele cte 3 n cuvinte putem
79

avea 64 cuvinte ceea ce permite exprimarea celor 20 de aminoacizi i a

semnelor de punctuaie.
Numrul de codoni posibili permit codului genetic interpretarea
corespondenei ntre un triplet i un aminoacid. Totui mai muli codoni
codific acelai aminoacid. Alturi de tripleii care codific aminoacizii, exist:
- un codon de iniiere ATG care sosete la nceputul traducerii i care
este codonul pentru un aminoacid metionin (este aminoacidul
corespunztor semnalului de debut al transduciei);
- 3 codoni specifici, codonul STOP (TAA, TAG, TGA) semanele de
sfrit de traducere;
O succesiune de mai muli codoni de ADN definesc o zon codant a
unei gene. Codonii vor fi tradui n aminoacizi care vor fi asociai pentru a
forma scheletul unei proteine.

Fig. Semnificaia.

Exist mai muli codoni n codul genetic dect aminoacizi i semne de

punctuaie. Vor exista mai muli codoni tradui prin aminoacizi omonimi.
Aceti omonimi reprezint o pierdere de informaie ntre limbaj nucleic (64
semnificativi) i limbajul proteinic (21 semnificativ) face s se spun c acel
cod genetic este degenerat.
Legarea ARNt la ARNm purttor al informaiei se face prin
complementaritatea ntre 3 nucleotide a fiecruia din cele dou molecule de
80

ARN. Cele 3 nucleotide ale ARNm constituie un codon i cele 3 nucleotide ale
ARNt un anticodon. n cursul transduciei anticodonul i codonul se leag de
maniera antiparalel i aminoacidul purtat prin ARNt este ncorporat n
protein n procesul de sintez.
O nucleotid a ARN se poate gsi n poziiile 1, 2 i 3 n codon dac
numrul de nucletotide care le separ de codonul de iniiere AUG este sau nu
este un multiplu de 3. Aceast poziie poart numele de codon de lectur.
Secvena codant este o secven de codoni, care permite ncorporarea
specific a unui aminoacid n sinteza unei proteine. Codul genetic este acelai
pentru toate vieuitoarele biosferei (universal). Exist cteva variaii (codoni
responsabili de biosinteza proteinelor din mitocondrii).
Codul genetic este compus de 61 codoni pentru codificarea celor 20 de
aminoacizi ce particip la sinteza proteinelor; fiecare aminoacid poate fi
codificat prin mai muli codoni (de la 1-6) care difer n general prin a III-a
nucleotid motiv pentru care se spune c este degenerat.
Codul genetic este rezultatul unei lungi evoluii i dispoziia sa nu este
la ntmplare. Corespondenele ntre codoni i aminoacizi au fost selecionate
pentru ca schimbrile de baze s aibe efectele minime posibile asupra
proteinelor exprimate. Toi codonii n care a II-a liter este U corespund
aminoacizilor hidrofili, deci au proprieti fizice apropiate. La fel aminoacizii
care corespund codonilor ncepnd cu GA fac ca schimbrile de la a III-a baz
s nu dispar ncrctura anionic a radicalului.
Cel mai apropiat codon STOP este cel al triptofanului. O schimbare a
oricruia sau a celor 2 guanine determin formarea codonului STOP i deci se
oprete transducia. Dar acest codon corespunde unui aminoacid foarte rar
ntnlit n proteinele obinuite.

81

Fig. 41 Codul genetic.

Codul genetic degenerat (Fig 42)
Scriind codul genetic n alt sens, s-a artat c sunt mai muli aminoacizi
cu codoni omonimi. Pentru unii sunt 6 codoni diferii, pentru alii 4, 3 sau 2.
Aceti codoni omonimi nu sunt nlocuii la ntmplare pentru c ARN
corespunztor nu exist n toate celulele n aceiai concentraie. O parte din
aceti codoni vor avea mai puine anse de a se exprima n esuturile n care
ARNt corespunztor este rar. Exist numeroi ARNt a cror anticodoni nu se
leag specific cu a 3-a baz a codonului. Aceste baze sunt mai puin
recunoscute mai puin specifice sau de loc, ceea ce explic degenerarea
obinuit a celei de-a III-a litere.

82

. Fig. 42 Codul genetic degenerat

Ribozomii la eucariote
Ribozomii din citoplasma celulelor eucariote sunt complexe
multienzimatice care asociaz 83 de proteine i 4 tipuri de acizi ribonucleici.
Aceste molecule sunt asociate ntre ele pentru a forma 2 particule
distincte subunitatea mare 60S (2800000 daltoni) i subunitatea mic 40S
(1400000 daltoni) care pot disocia uor.

Acizii ribonucleici ribozomali i proteinele formeaz situsuri de fixare

pentru:
-secvenele de ARNm
-ARNt (care transport aminoacidul de ncorporat n situsul A) i
-ARNt care transport peptida n cursul sintezei n situsul P,
-un situs catalitic pentru a forma legturi peptidice,
-situsuri de fixare pentru cofactorii proteici ai iniierii elongaiei (eIF2,
eIF3),
83

-de terminare i situs de reglare (proteina S6).

Fig. 43. Ribozomul la eucariote

Poliribozomii
Pe acelai mesager mai muli ribozomi efectueaz transducia acelorai
proteine unul dup altul, totul constituind un poliribozom.

Fig. 44. Sinteza proteinelor de ctre poliribozomi.

Iniierea permite extremitii 5 a unui ARNm s ataeze ribozomii
succesiv cte unul la 100 nucleotide. Primul aminoacid ncorporat constituie
extremitatea NH2 terminal a proteinei.

84

Fig. Formarea proteinelor.

La extremitatea 3 sosete codonul de terminare, subunitile
ribozomului se separ i elibereaz proteina sintetizat. Ultimul aminoacid
ncorporat constituie extremitatea COOH terminal a proteinelor.
Poliribozomii prezint un aspect diferit n funcie de reglarea etapelor
de transducie. Iniierea este activat pe ARN de numeroi ribozomi. Dac
elongaia este lent ribozomii vor necesita mai mult timp pentru a citi secvena
codant. O activare brusc a terminrii transduciei disociaz toi ribozomii de
ARNm. Numeroase antibiotice sunt capabile s interfereze cu fiecare din
etapele sintezei proteinelor: streptomicina, cyclohexamide, puromicine.
ARN de transport sau ARNt (trefl)
ARNm constituie legtura chimic necesar ntre structura codon
recunoscut de anticodon i aminoacidul specific purtat prin ARNt. Acesta este
pe scurt dicionarul transduciei.
Anticodonul este o secven de 3 nucleotide situate la extremitatea
buclei inferioare din ARNt, complementare i antiparalele secvenei din
codonul ARNm, a aminoacidului corespunztor.

85

Fiecare aminoacid este legat specific (cod genetic) de un amino-acylARNt-sintetaza la extremitatea 3 din ARNt a crui anticodon i este
corespunztor (tARN ncrcat). Ribozomii leag ARNt ncrcai pe situsul A
de elongaie dac anticodonii lor se potrivesc codonilor ARNm la acest nivel.
n urma elongaiei are loc transferul peptidului pe un aminoacid nou, el nsui
purtat de un ARNt.

Fig.45 ARN de transfer, ARNm.

ARN de transfer (panglic)
Analiza cristalografic a ARN de transfer a artat c extremitatile
celor dou brae buclate de dihidroxiuracil i buclele de GT, CG se renchid
una cu alta prin schimbul legturilor de H. Astfel, modelul ARNt ia o form n
L unde braele anticodon i braele acceptor de aminoacid sunt la extremitile
moleculelor.

.
Fig.46 ARN de transfer.

86

Sinteza proteinelor. Activarea unui aminoacid

Aminoacizii liberi din citoplasm sunt substraturi pentru sinteza
proteinelor. Pentru a participa ei vor fi activai. Activarea aminoacizilor este
catalizat prin enzime specifice: aminoacyl-ARNt sintetaza. Exist cel puin
una pentru fiecare din cei 20 aminoacizi. Aceste enzime au o dubl specifictate:
-ele recunosc specific un aminoacid i
-un ARNt specific, nencrcat corespondent aminoacidului.

Fig. Activarea aminoacizilor

Aminoacil ARNt-sintetaza hidrolizeaz un ATP n AMP (legtura
bogat n energie) apoi activeaz aminoacidul legnd fraciunea acid la
fosfatul AMPc (legtur anhidrid bogat n energie). Pirofosfatul este imediat
distrus n totalitate de o pirofosfataz. Aminoacidul astfel activat este transferat
cu legtura sa bogat n energie, pe una din funciunile alcool secundare ale
ribozei AMP3 terminal al ARNt ncrcat. Acesta se leag, apoi de ribozomi
pentru a sintetiza proteinele (Fig.47).

87

Fig.47 Activarea unui aminoacid.

Serina ARNt sintetaza
Serina-ARNt sintetaza are dubl specificitate pentru dou substraturi:
aminoacidul recunoscut aici serina i ARNt a cror anticodoni sunt
complementari cu codoni corespunztori a acestor aminoacizi din codul
genetic. Exactitatea transduciei este dat n ntregime de aceasta dubl
specifictate: Recunoaterea ARNt se face de ctre anticodon n anumite cazuri
(enzimele in cont totdeauna de prima baz a anticodonului, ceea ce explic
degenerescena codului genetic) sau de alte servicii de ARNt comune, ARNt
sinonime.

Fig.48. Serina ARNt sintetaza.

Cisteina ARNt sintetaza
Aminoacyl ARNt sintetazele au dubl specifictate pentru cele dou
substraturi: aminoacidul recunoscut aici cisteina i ARNt a crui anticodon este
88

complementar codonilor corespondeni acestui aminoacid din codul genetic.

Exactitatea transduciei se bazeaz pe dubla specificitate. n dicionarele de
transducie sunt cteva tipuri diferite de Aminoacid-ARNt-sintetaze.

Fig.49. Cisteina ARNt sintetaza.

Iniierea transduciei
Iniierea este etapa limitant a transduciei. Subunitile ribozomilor
sunt disociate n citoplasm. O cascad de evenimente vor forma un complex
de iniiere, ca rspuns la factorul eIF2 (eucariotic initiation factor 2), purttor a
unui GDP, coenzim care a hidrolizat n cursul ciclului de iniiere precedent.
n prezena factorului eIF2B un nou GTP este substituit cu un GDP.

Fig. Rolul factorului eIF2 n siteza proteinelor.

Factorul eIF2 astfel activat, poate s lege ARNt ncrcat cu
metionina a crui anticodon este complementar cu codonul de iniiere (AUG)
89

a mesagerului. n prezena cofactorului eIF4C; subunitatea mic va fixa

factorul eIF3 i factorul eIF2 activat care poart ARNt ncrcat cu
metionina iniial. Energia de formare a acestui complex a fost furnizat prin
hidroliza legturii bogate n energie a GTP purtat prin factorul eIF2 (Fig. 50).

Fig. 50. Iniierea transduciei

90

Secvena 5 netradus de ARNm este recunoscut de cofactorul eIF4A,

eIF4B i eIF4F pe care se fixeaz ca urmare a hidrolizei unui ATP pentru
furnizarea energiei, mesagerul este transferat pe subunitatea mic fa n fa
cu situsul P, pentru a hibrida nucleotidele codonului de iniiere cu cele ale
anticodonului ARNt a metioninei iniiale.
n prezena ultimului cofactor eIF5, complexul se va lega cu
subunitatea mare pentru a construi ribozomul funcional. Cofactorii de iniiere
sunt eliberai i ncepe transducia n totalitate. Cofactorul eIF2 totdeauna
purtat de GDP-ul su, este eliberat pentru a ncepe un nou ciclu de iniiere.
Cadrul de citire
Poziionarea mesagerului n raport cu ARNt de la metionina iniial
determin cadrul de citire a transduciei. ARNt a metioninei ocup unul din
cele dou situsuri de fixaie a ARNt pe ribozom: situsul P (el conine peptide n
curs de sintez).
Codonul AUG a mesagerului se hibrideaz n sistusul P cu anticodonul
CAU din ARNt al metioninei plasnd mesagerului codonii urmtori (N1, N2,
N3) s apar n celelalte situsuri de fixare (situsul A sau aminoacizi) ntruct
va servi la fixarea noilor aminoacizi ncorporai, Nucleotidul N1 va fi tot
timpul primul al fiecrui codon (Fig. 51).

Fig. 51. Cadru de citire.

Elongaia transduciei
Ribozomii iniiali au situsul A vacant. Factorul de elongaie eEF1B
catalizeaz schimbul GTP cu un GDP pe factorul eEF1A. Acesta activat, va
91

primi un ARNt ncrcat care se va fixa pe acest situs A, hidroliznd GTP n

GDP (Fig 52).

Fig. 52 Elongaia transduciei.

Din moment ce codonul mesagerului din situsul A a putut s se lege
complementar cu anticodonul din ARNt adus, factorul eEF1A este eliberat cu
GDP-ul su.
Ribozomul catalizeaz atunci transferul peptidelor situate pe ARNt din
situsul P pe funciunea amino a aminoacidului ARNt din situsul A. Pentru
92

aceasta utilizeaz energia de hidroliz a legturii ester bogat n energie

dintre peptid i ARNt din situsul P.
n sfrit datorit factorului eEF2 i a hidrolizei altui GTP, ARNt din
situsul P este eliberat de pe ARNm, ARNt rmas i peptidele n cursul sintezei
sunt deci deplasate (translocate) de la situsul A la situsul P, fr ca s aib loc
separarea ntre codon i anticodon.
Situsul A este din nou eliberat pentru a primi ARNt a aminoacidului
urmtor.
ncorporarea unui aminoacid
Un ARNt ncrcat se va fixa pe situsul A liber. Codonul ARNm, situat
la baza situsului A se va lega complementar cu situsul anticodonului ARNt al
noului aminoacid ceea ce va permite ncorporarea acestuia n peptida n curs de
sintez.

Fig.53 Incorporarea unui aminoacid.

Transferul peptidelor
Ribozomul catalazeaz transferul peptidelor situate pe ARNt din situsul
P pe funcia amino a aminoacidului pe ARNt din situsul A. El utilizeaz energia
de hidroliz a legturii ester (bogat n energie) dintre peptid i ARNt din
situsul P. Legtura peptidic este format prin reacia a doi aminoacizi, cu
eliminarea apei ntre dou grupri vecine NH2 i COOH. Legtura peptidic
este o structur rigid i acest fapt are implicaii importante pentru structura
proteinelor.

93

Fig. 54 Transferul peptidelor.

ARNt eliberat din situsul peptidic prsete ribozomul. Mesagerul,
ARNt rmas i peptidele n curs de sintez sunt deci deplasate (translocate) din
situsul A n situsul P fr s se fac hibridarea ntre codon i anticodon.
Bilanul energetic al transduciei depinde de numrul aminoacizilor
proteinei sintetizate.
Pentru fiecare aminoacid se utilizeaz un ATPAMP pentru sinteza
ARNt ncrcat (aminoacyl-tARN-sintetaza). AMP produs este reactivat n ADP
de ctre un alt ATP (nucleozide P2-kinaza). Ansamblul necesit consumul a
dou legturi bogate n energie ATPADP. Pentru ncorporarea acestui ARNt
ncrcat n situsul pentru aminoacizi al ribozomului factorul eEF1B utilizeaz
un GTPGDP.
Pentru translocaia peptidil ARNt din situsul aminoacizi (A) n situsul
peptidic (P), factorul eEF2 utilizeaz nc un GTPGDP. n total fiecare
aminoacid ncrcat ncorporat n proteine consum celulei 4 legturi bogate n
energie.
Terminarea transduciei
Dac situsul A gsete n fa un codon nonsens care anun finalul
transduciei, complexul va disocia de mesager n prezena unui ultim cofactor
eRF.
Cele dou subuniti ale ribozomului disciaz, proteina sintetizat este
eliberat la fel ca i ultimul ARNt.

94

Fig. 56 Terminarea transduciei.

Peptide semnal
Peptidele semnal sunt lanuri formate din civa aminoacizi (15-20)
situai la extremitatea NH2 terminal a proteinelor traduse, semnalnd unde
trebuie s fie excretat proteina din celul. Atunci cnd o protein este
sintetizat, structura sa secundar sau teriar se construiete din nou i pe
msura transduciei este eliberat n citoplasm.

Dac aceast protein este destinat pentru a fi n membrane sau

organite celulare, partea codant a ARNm ncepe printr-o secven de civa
aminoacizi ca adres pentru ncorporarea acestei proteine n membrane.
Aceste peptide orienteaz destinaia proteinelor; ncorporarea n
membran (RE, AG, plasmalem, lizozomi) intr n mitocondrii sau sunt
exocitate n afara celulelor prin aparatul Golgi. Pentru c funcia sa este de a

95

penetra prin membrana RE structura sa este bogat n aminoacizi hidrofobi

(Phe, Leu, Ile, Met, Val).
Fiecare organit prezint un mecanism de recunoatere i ncorporare
numai a proteinelor necesare i specifice lui. Aceast recunoatere se realizeaz
datorit unei secvene de aminoacizi pe care o conine proteina respectiv,
secvena semnal, i a unui receptor specific care recunoate proteina i o
internalizeaz. Dup ce proteina a ajuns la destinaie, secvena semnal este
eliminat prin digestie proteolitic, iar n cazul receptorului, acesta este eliberat
i reciclat.
Poliribozomii i peptidele semnal
Poliribozomii care se formeaz pe un mesager coninnd o peptid
semnal, au o evoluie uor diferit. Transducia se oprete cu puin dup sinteza
peptidei semnal. Se tie c peptida semnal interacioneaz direct cu membrana
reticulului endoplasmatic. Acest lucru este posibil datorit particulei de
recunoatere a semnalului SRP.
SRP este constituit din diferite proteine i un ARN 7S.

Fig. Structura particulei de recunoatere a semnalului.

Imediat ce interaciunea peptidei semnal cu SRP are loc n afara
structurii ribozomilor, i se leag acesta inhib elongaia (Fig. 57)
Traducerea se oprete pn cnd SRP este recunoscut de un receptor al
membranei RE. Imediat ce aceast legtur este stabilit ribozomul este legat
de ribozomii din membrana RE lng un complex proteic. Acesta contribuie la
formarea unui canal apos de transport al proteinelor cunoscut sub numele de
translocon, prin care proteina nou format trece n lumenul, apoi n cisternele
RE. Deci canalul se deschide i elongaia se reia.
La faa intern a membranei RE o endopeptidaz specific sau
peptidaza semnal va seciona peptida semnal i sinteza se va desfura pn la
terminare. SRP se elibereaz n citosol i traducerea este ncheiat.
96

Fig. Sinteza proteinelor la nivelul RER.

Proteina n final poate fi ncorporat ntr-o membran datorit secvenei
semnal de ancorare (fig. ) sau exportat pentru traversarea AG ctre exteriorul
celulei.

Fig. Proteine sintetizate i ncorporate n membrane datorit secvenei semnal

de ancorare.
Adresarea proteinelor ctre mitocondrii face apel la un alt tip de peptid
de adresare care conduce peptidele prin traversul membranei mitocondriale n
matrice sau n endomembrane.
Produii primari de traducere coninnd peptide semnale sunt denumii
preproteine, de exemplu preproinsulina, hormonul preproparotidian, etc.
97

Modificri posttransducionale
Numeroase modificri chimice se produc dup ncorporarea
aminoacizilor n structura primar a proteinei (transducia); ele se numesc
modificri posttransducionale. Se disting i modificri cotransducionale care
se produc atunci cnd transducia se desfoar i cnd peptidele formate sunt
nc ataate la ribozom n celul, n organite sau n afara celulei. Astfel de
modificri sunt:
1. Proteoliza: fragmentarea peptidei semnal;
2. Glicozilare: SerO, AsnN
3. Acilare: Fornesil, Miristil, Palmityl;
4. Hidroxilare (OH-Pro; OH-Lys; OH-Asp. Metilare (CH3-His)
carboxilare CO2-Glu;
5. Dezaminarea citozinei
6. Fosforilare: P-Sev, P-Thr, P-Tyr, P-His
7. Legarea unui cofactor: Metal, Flavine, Hem
8. Blocajul extremitilor pyroGlu; carboxihemide.
Se numete protein matur, forma chimic definitiv pe care proteina
n momentul n care i ndeplinete funcia n organism.
Organizarea structural a proteinelor
Lanurile polipeptidice ale proteinelor se pliaz n diferite moduri att
n cadrul propriului lan dar i ntre lanurile vecine adic intracatenar i
intercatenar. n funcie de plierea lanurilor se disting proteine cu structur
secundar, teriar i cuaternar (fig.).

98

Fig. Proteine cu structur primar, secundar, teriar i cuaternar.

Acest mod de pliere este esenial pentru activitatea biologic a
proteinelor i aceast organizare complicat este cea care trebuie conservat pe
parcursul procedurilor implicate n purificarea proteinelor. Mult timp s-a
considerat c modurile de pliere ale lanurilor polipeptidice sunt determinate
nmai de secvena aminoacizilor din lan. Astzi s-a stabilit c proteinele avnd
aceeai secven a aminoacizilor pot exista n forme diferite de mpachetare i
c astfel de plieri pot fi influenate de prezena altor proteine cunoscute sub
numele de molecule supraveghetoare tip scufi chaperones.

99

Fig. Proteine supraveghetoare tip scufi chaperones.

Denaturarea i renaturarea proteinelor
O protein care posed o proprietate biologic proprie, unic, se
numete protein nativ i ea se deosebete de proteina ce i-a pierdut aceast
proprietate i pe care o numim de aceea denaturat. O protein denaturat i-a
pierdut structura tridimensional sau n ali termeni conformaia sa.

Fig. Denaturarea reversibil a proteinelor.

Denaturarea poate fi reversibil sau ireversibil. Un exemplu de
denaturare ireversibil este cea termic aplicat la fierberea unui ou; albuul
100

oului (albumina) se coaguleaz astfel ireversibil. De fapt acesta este un

eveniment obinuit n timpul gtitului care face ca proteinele s fie mult mai
uor atacabile de ctre enzimele proteolitice dup ingestia mncrurilor.
Denaturarea reversibil se poate realiza prin folosirea atent a unor
reactivi ca ureea i mercaptoetalonul. Ureea distruge structura apei i de aceea
limiteaz interaciunile hidrofobe ale catenelor laterale R i a resturile de
aminoacizi, ceea ce duce la deplierea i la disocierea moleculelor proteice.
Mercaptoetanolul reduce legturile S-S. De aceea la ndeprtarea ureei i a
mercatoetanolului, proteina s-ar putea renatura.

Fig. Denaturarea reversibil sub aciunea mercatoetanolului reduce

legturile S-S.
Renaturarea este interpretat ca o dovad n sprijinul ipotezei c o
protein avnd o structur primar corect se va plia n mod spontan
conducnd la structura unic responsabil pentru activitatea sa biologic. Acest
fenomen este denumit autoansamblare a proteinei.
Astzi se tie c renaturarea proteinelor poate fi produs pe dou ci.
Una implic proteina disulfid izomeraza o enzim care are rolul de a corecta
legturile S-S greit formate. A doua cale implic structurile tip chaperone
moleculare la care s- a mai fcut deja referire. Ele se pot defini ca o familie de
proteine din clase nenrudite care mediaz asamblarea corect a altor
polipeptide dar care nu sunt componente ale structurilor funcionale asamblate.
Degradarea proteinelor
Degradarea intracelular a proteinelor se realizeaz prin dou sisteme
generale: sistemul lizozomal i sistemul ubiquitinei.
Sistemul ubiquitinei. Ubiquitina este o polipeptid acid de 76
aminoacizi care este prezent efectiv n toate tipurile celulare, de unde i
numele su. Ubiquitina este activat prin interaciunea ATP cu 2 enzime.
Complexul rezultat se ataeaz de proteina int ce urmeaz a fi degradat. Nu
se tie n totalitate modul cum sunt selectate proteinele-int pentru degradare,
101

dar s-a constatat o corelaie strns ntre natura aminoacidului N-terminal i a

acelora care l urmeaz, cu timpul de supravieuire a unei proteine ntr-o celul.
Figura. arat distrugerea programat a proteinelor citosolice prin
sistemul de reperare al ubiquitinei. Aceste evenimente au loc ntr-un complex
multiproteic numit proteazom (proteasome), a crui structur este acum
cunoscut.

Fig. Degradarea proteinelor de ctre ubiquitinei.

Ciclul celular
Toate celulele vii urmeaz fie un un program de diviziune, fie o moarte
programat, numit apoptoza.
La celulele eucariote se pot distinge dou faze n timpul diviziunii
celulare, interfaza perioad n care celulele cresc i mitoza, perioada n care
102

nucleul i restul celulei se divide. n termeni temporali, mitoza ocup cam 40%
din timpul total al celulelor embrionare timpurii i mai puin de 10% din timpul
de via al altor celule.
Viaa celulei se deruleaz ntre 2 mitoze. La mamifere aceast perioad
este variabil (dureaz mai puin de 30 de ore); sunt celule a cror via este
foarte scurt sau foarte lung.
Pe aceast durata, celulele traverseaz 4 faze (Fig.):
- faza G1 unde genomul fiind diploid, fiecare gen este reprezentat n 2
exemplare. Cromatina este accesibil ARN polimerazelor care realizeaz
transcripia genelor n ARNm care vor fi tradui.
- la jumtatea ciclului ncepe replicarea ADN; ADN polimeraza va aciona
n jur de 8 ore (faza S) pentru a recopia n dublur ADN fiecrui
cromozom. n timpul acestei faze transcripia este inhibat. Masa celular
crete continuu n timp ce coninutul de ADN crete n faza S i scade brusc
dup faza S, astfel c ADN din celulele care nu se divid este constant.
- celula intr n faza G2 unde fiecare gen este reprezentat n 4 exemplare.
Cromatina este din nou accesibil ARN polimerazei care rencepe
transcripia;
- survine mitoza care d natere la dou celule fiice. Fiecare va primi una din
copiile identice din ADN fiecrui cromozom i fiecare gen va fi
reprezentat n dou exemplare.

Fig. 59. Ciclu celular.

103

Ciclul celular are trei puncte de decizie sau restricie. Proteina CDK a
fost identificat ca principalul reglator al trecerii prin aceste trei puncte. Se
cunosc 3 puncte de control al ciclului celular la eukariote
Celulele eukariote sunt controlate prin cicline dependente de
proteikinaze. Aceste secvene sunt specifice etapei G1 (Ciclina D-CDK4,
Ciclina D-CDK6, Ciclina E-CDK2 ) fazei S (Ciclina A-CDK2) i fazei G2 i
mitozei (Ciclina A-CDK1, Ciclina B-XDK1).

Fig. Punctele de restricie n cadrul ciclului celular.

n G1 complexul de prereplicare al ADN este defosforilat i acesta se
asambleaz n originea de replicare a cromozomului. Mai trziu n G1, G1CDK
este sintetizat. Aceste kinaze fosforilate activeaz anumii factori de
transcripie. O int a acestor factori de transcripie sunt genele care codific
componente ale fazei S a complexului CDK. n acest punct din faza S funcia
CDK este blocat prin inhibitori specifici. Pentru startul fazei S, G1CDK
fosforileaz inhibitorii care degradeaz SCDK . Acesta eliberat de inhibitori
este activat i fosforileaz complexul de prereplicare inducnd iniierea
replicrii.

104

Fiecare cromozom replicat este format din dou cromatide surori legate
prin cohesine. Complexul M CDK se formeaz n timpul fazei S i G2 dar
activitatea acestora este inhibat pn cnd sinteza ADN este complet.
Activitatea MCDK ncepe n faza M i este implicat n fosforilarea unor
substraturi multiple (Sic1). Primul este complexul promotor al anfazei APC
care este activat. Acesta are ca int cohesinele reglatoare care degradate permit
segregarea cromatidelor surori. APC degradeaz complezul MCDK rezultat n
finalul mitozei.
Rolul factorilor de cretere n diviziunea celular
Creterea celular este determinat de legarea proteinelor reglatoare numite
factori de cretere care stimuleaz diviziunea celular.
Celula prezint la suprafa receptori specifici care recunosc factorii de
cretere.Factorul de cretere d startul sistemelor semnal intracelulare.
Legtura factorului de cretere provoac o micare n cascad a semnalelor
intracelulare, determinnd fosforilarea proteinelor care activeaz
proteinele reglatoare nucleare i se declaneaz diviziunea celular.
De exemplu proteina retinoblastoma Rb este o protein care
interacionez cu multe proteine reglatoare cheie ale ciclului celular,
dependente de fosforilare. Cnd Rb este defosforilat, ea se leag de
proteinele reglatoare cum ar fi myc, care sunt proteine necesare proliferrii
celulelor. Dup fosforilare, proteinele Rb activate, elibereaz proteinele
reglatoare myc care pot aciona ca promotor pentru diviziunea celular.
Rb libere sunt inhibate, celulele ncep s produc proteinkinaze dependente
de cicline care preced diviziunea celulei.
Cromatina i ADN
n cursul fazelor ciclului celular, cromozomii evolueaz pentru a pregti
mitoza. n timpul G1 cromatina este descompactat i genele se pot exprima.
Fiecare cromozom nu conine dect o cromatid. n timpul S buclele de
replicare se deschid i ncepe replicarea. n timpul fazei G2 cele 2 cromatide
rezultate din replicri sunt legate prin centromerii lor. Sunt dou cromatide
pentru un cromozom. n timpul mitozei centromerul se leag de fusul
105

acromatidic i pregtete separarea. Cromatina este compact la maxim; dup

mitoz, cromatina este decompactat i genele se pot exprima n fiecare din
celulele fiice.

Fig. 60 Cromozomi.
REPLICAREA
Replicare semiconservativ in vivo
ADN se replic n celul printr-un proces care asigur ca una din catenele
parentale s fie prezent n moleculele fiice, aa numita replicare
semiconservativ.
Replicarea reprezint sinteza ADN care reproduce exact genomul unei
celule n cursul ciclului celular, cu scopul de a pregti diviziunea acestei
celule. n cursul vieii celulei ADN trebuie s fie dedublat pentru c fiecare
celul fiic s capete un genom complet n nucleul su.
Aceast sintez se produce n faza S (n mijlocul ciclului celular) ca
urmare a activitii ADN polimeraza i . Alte ADN polimeraza particip la
repararea ADN lizat (ADN polimeraza ) sau a replicrii ADN mitocondrial
(ADN polimeraza ).

Replicarea semiconservativ
Cele 2 lanuri de ADN parental n curs de replicare servesc fiecare ca
model pentru sinteza noului lan. n acest mod 2 catene n loc s rmnn
ansamblate la fiecare sintez (replicarea conservativ) se separ totdeauna la
fiecare ciclu (replicare semiconservativ, Fig. 61). La prima generaie o caten
106

a fiecrui dublu helix provine din celula mam. La a II-a generaie nu exist
mai mult de dou catene ADN a celulei mame, 4 dublu helixuri.

Fig. 61. Replicarea semi-conservativ.

Enzimele implicate n replicare
ADN este sintetizat de enzime numite ADNpolimeraze, fiecare dintre
acestea utiliznd dezoxinucleozid trifosfai ca substraturi; polinucleotidul este
sintetizat n direcia 5'-3'. Matria de ADN este utilizat pentru a direciona
ordinea bazelor azotate n polinucleotidul nou sintetizat care devine
complementar cu ADN parental.
Se cunosc trei tipuri de ADN polimeraze la E. coli.
-ADN polimeraza III ,
-ADN polimeraza I
- ADN ligaza
. Fragmentele de ADN sunt legate prin aciunea enzimei ADN ligaza.
Aceast enzim joac un rol att n sinteza in vivo a ADN, ct i n repararea
107

unor rupturi monocatenare ale ADN. n celulele animale, se formeaz ca

intermediar un complex covalent enzim-AMP. n bacterii, ATP este nlocuit de
NAD+.
Replicarea ADN dublu catenar
Pentru a explica creterea aparent a ambelor catene a ADN n aceeai
direcie n timp ce enzimele sintetizeaz noi catene numai ntr-o direcie 5'-3',
s-a postulat c una dintre catene a fost nti sintetizat n fragmente. Cnd ADN
a fost examinat la scurt timp dup startul sitezei, au fost gsite mici fragmente
numite Okazaki dup numele celui care le-a descoperit.

Rolul ARN n biosinteza ADN

Sinteza oricrei molecule de ADN este iniiat prin sinteza unui lan
scurt de ARN, din nou n direcia 5'-3', folosind nucleozid trifosfai (NTPs) ca
substrat, prin intermediul unei enzime numit ARN primaza. Enzima este
selectiv privind situsul de iniiere a sintezei. n catena conductoare numai
o amors este sintetizat. n catena ntrziat, sunt implicate multe locuri
de iniiere pe msur ce catenele de ADN parental se separ. Amorsa ARN
este eliminat de ARN polimeraza I i spaiile lips sunt completate prin
aciunea acestei enzime. Fragmentele sunt unite de ADN ligaz. Acest
mecanism duce la probleme legate de replicarea capetelor cromozomiale,
numite telomere. Telomeraza rezolv aceast problem.
Sistemul multienzimatic pentru sinteza ADN la procariote
Replicarea este iniiat n zona numit originea replicrii i debuteaz
prin formarea furcii de replicare.
Cel puin 15 enzime i proteine acioneaz n furca de replicare
bidirecional a ADN la E.coli corespunznd la peste 30 de polipeptide.
Proteina dnaA se leag la ADN dup care se ataeaz la complex proteinele
dnaB i dnaC.
DnaB este o helicaz care catalizeaz dezrsucirea lanului dublu
catenar, dependent de energia ATP. Poriunea monocatenar liber a ADN
este apoi stabilizat de proteinele de legare SSB (Single Stranded Binding
protein). O amors ARN este sintetizat de ctre ARN primaz ntr-un
ansamblu multisubunitar numit primozom. La terminarea replicrii amorsa
va fi eliminat de ctre ADN prin polimeraza I. Un nou ADN este sintetizat
de ctre polimerazaIII, holoenzim format din opt lanuri polipeptidice. ADN
aflat n faa polimerazei pe catena conductoare nu este afectat de helicaz
108

(proteina Rep). Pe lanul ntrziat, spaiile lips dintre fragmentele de ADN

sunt umplute de ADNpolimeraza I i fragmentele sunt unite de ADNligaze.
Dac genomul unui virus este format din ADN, replicarea are loc n
mod similar cu cel descris la o celul normal. Virusurile au capacitatea de a
dirija i utiliza metabolismul normal al unei celule astfel nct n cazul fagilor
de liz, de exemplu, infecia cauzeaz nlocuirea replicrii ADN cu replicarea
ADN fagic.
Bucla de replicare la eukariote
Cel puin 4 ADN polimeraze au fost identificate la eucariote.
Acestea sunt denumite prin litere greceti i sunt implicate n sinteza ADN
nuclear, n reparare i n replicarea ADN mitocondrial.
ADN polimerazele ncep sinteza n numeroase puncte de iniiere.
n urma legrii proteinelor specifice, dublul helix se deschide pentru a
permite demarajul. Sinteza ADN ncepe pe amorsa ADN/ARN constituit de
ARNprimaz i ADN polimeraza. Replicarea se desfoar ntr-o direcie n
acest sens unul din cele 2 lanuri de ADN (lanul sens) este parcurs de enzim
n sensul 3-5 (pe catena antisens), ceea ce permite sinteza unui alt lan n
direcia 5-3. ADN ligazele asigur apoi legarea ntre diferitele fragmente ale
ADN nou.

Fig. 65. Furca de replicare

.
Sinteza celeilalte catene (lanul ntrziat) este mult mai complex
deoarece enzima parcurge acest lan de la 5-3. Primaza i ADN polimeraza
sintetizeaz o amors de 30 nucletoide nainte de zona de replicare i ADN
polimeraza construiete secvene mici de fragmente de ADN n sensul 5-3 (n
109

jur de 200 nucleotide- fragmentele Okazaki). Ribonucleazele distrug amorsele

ARN (fragmentele Okazaki sunt unite ntre ele prin ADN ligaze).
Furca de replicare
Replicarea ncepe prin separarea celor dou catene ale ADN prin
helicaze. Fiecare din cele dou lanuri sunt stabilizate prin SSB (single strand
baund).
Pe catena direct, urcnd de la 3 la 5, o ADN polimeraza i ARN
primaza sintetizeaz un lan complementar adugnd dezoxiribonucleotide
trifosfat la extremitatea 3OH liber. Un nou dublu helix se formeaz ntre
lanul matri direct i noua caten sintetizat.
Pe lanul ntrziat o polimeraz, ADN polimeraza i ARNprimaza
progreseaz de la 53. Pentru a putea sintetiza un lan complementar, trebuie
ca ARNprimaza i ADN polimerazei , s fabrice amorse destul de apropiate
(amorsa 3 n fig. 65) la cteva sute de nucleotide distana pe lanul matri.
ncepnd de la 3OH a unei amorse ADN polimeraza sintetizeaz un
fragment Okazaki pn cnd ntlnete extremitatea 5 trifosfat a amorsei
precedente.

Fig.67. Enzimele implicate n replicare.

Amorsa este hidrolizat de o nucleaz ceea ce permite ADN
polimerazei s realizeze sinteza unui fragment Okazaki, pe care ADN ligaza
l va lega definitiv pe ADN n fragmentul definitiv. Un nou dublu helix se
formeaz ntre catena matri direct i noul lan sintetizat. Toate aceste
110

proteine sunt asociate ntr-o structur a nucleului (uzina de replicare) care

traverseaz moleculele de ADN. Aceast uzin de replicare conine enzime de
preparare a substratului, nucleotid kinaze, ribonucleaze, reductaze etc.
Topoizomeraza I i helicaza
Replicarea ADN necesit o fuziune parial n dublu helix care modific
nrularea celor 2 catene. Pentru a permite aceast reacie, topoizomeraza este
capabil s modifice rularea hidroliznd o caten de ADN i reconstituind-o
dup ce a fost dersucit local, pasul helixului ajunge la 10 perechi de
nucleotide pe tur. n cursul replicrii i al transduciei pasul helixului
diminueaz. Polimeraz i helicaza (topoizomeraza) lucreaz pentru creterea
pasului. napoia polimerazelor i topoizomerazelor, are loc reconstituirea
dublului helix (mpachetarea).

Fig. Helicaza i topoizomeraza I.

Primaza. Demararea aciunii sale are loc la extremitatea 3OH
terminal a lanului ADN Ultima ribonucleotid a amorsei, legat de catena
ADN care servete ca model, va constitui punctul de iniiere a activitii ADN
polimeraza .
Dac aceast nucleotid nu este mperecheat ea se va hidroliza
mpiedicnd sinteza ADN.
Amorsa este creat pornind de la o polimeraz ARN paticular (fr
legtur cu cele de transcripie), care poate ncepe prin a sintetiza 10 nucleotide
a unui ARN hibrid, folosind un ADN model. Prima nucleotid a acestei amorse
se pstreaz, cei 3 fosfai se prind la captul celei de-a10-a ribonucleotide a
ADN polimeraza i ncepe condensarea a 20 dezoxiribonucleotide.
Amorsa va fi construit deci dintr-o caten mixt ARN ADN, din
circa 30 nucleotide.
111

Fig.68 Primaza.
ADN ligazele
ADN ligazele sunt enzime care sunt capabile de reconstituirea
legturilor fosfodiester ntre 3OH i fosfatul 5 a dou nucleotide vecine dintrun lan de ADN.
Ele intervin n replicare pentru a lega ansamblul lanului ADN sau
fragmentelor Okazaki sintetizate de ADN polimeraze.
Intervin de asemenea n numeroase procese de repararea a ADN
genomic.

Fig. Ligaza.

112

Telomerazele
Sinteza lanului ntrziat a ADN, nu se poate face dac ADN polimeraza
atinge extremitatea 3 a catenei matrice. Dac n-ar avea mecanisme particulare,
la fiecare replicare ADN cromozomial ar fi scurtat.
Telomerul sau secvena de ADN a extremitilor cromozomilor, este o
secven 5TTAGGG-3 repetat de sute de ori nainte de 3OH final.

Fig. 69. Telomerazele

Teleomeraza este o ADN polimeraz care poate continua sinteza unui
ADN monocatenar. Aceast enzim conine un ARN a crei extremitate 5
terminal este 5 CUAAGCCUAAC 3. Aceast extremitate servete ca model
pentru enzim n vederea sintezei ctorva uniti de repetiie TTAGGG. Dup
aceast sintez enzima gliseaz n lungul lanului ADN i rencep noi uniti.
Extremitatea 3 a catenei matri astfel alungit poate servi pentru ataarea unei
amorse noi; extremitatea 3OH a acestei amorse servete deci ca punct de
pornire pentru ADN polimeraza pentru sinteza acestui lan.
Reparaiile ADN

113

Corectarea unei mperecheri greite, sau a lipsei de complementaritate

ntre nucleotidele celor dou catene, ale unui fragment de ADN, sunt denumite
reparaii ADN.
Replicarea sau conservarea structurii primare ADN poate s nu fie
perfect. Dac ADN este lezat, sau replicat incorect rezult c nuclotidele
situate pe cele 2 catene nu mai sunt complementare (AT sau CG).
Se spune c are loc o mperechere greit ntre nucleotide. Repararea
vizeaz nlocuirea unei baze azotate, sau a unei nucleotide, sau a unui fragment
de acid nucleic, de ctre nucleotide complementare secvenei celeilalte catene.
Replicarea fiind semiconservativ una din cele dou catene este
independent ca matrice i cealalt caten va fi reparat. Mai multe mecanisme
de reparaie permit nlocuirea unei baze, unei nucleotide sau a unui fragment
mai puin lung de ADN.
Bazele greite, lezate
Natura chimic a bazelor azotate este esenial pentru mesajul genetic.
Numeroase modificri ale acestor baze pot antrena mutaii.
Modificrile chimice sunt reprezentate de:
- dezaminarea adeninei i hipoxantinei, n care hipoxantina este preferenial
complementar cu C mai mult dect cu timina;
metilarea citozinei, n 5 metil citozin, o face mai complementar pe A
dect G.
Mutaia, rezult din legturi anormale ntre baze nucleotidice vecine
precum dimerii timinei. Cldur angajat n reacia de hidroliz a bazelor
adesea a purinelor, conduce la situsuri apurinice (fr purine). Agenii chimici
din mediu pot fi mutageni. Astfel, exist analogi ai structurii bazelor, care dau
nucleotide anormale, precum 5-bromuracilul care se hibrideaz preferenial cu
guanina, sau dou aminopurine care se leag de citozin. Unii ageni mutageni
ca 2 metilnitrosamin reacioneaz ntre baze, sau n interiorul dublului helix ca
bromura de etidiu.
Excizia bazelor lezate
naintea unei baze deteriorate reparaia se poate face prin simpla excizie
a bazei urmat de nlocuirea cu o baz a nucleotidei normale.
Excizia se face printr-o ADN glicozilaza care deschide dublul helix,
apoi hidrolizeaz legtura N glicozidic a bazei lezate i las o nucleotid
apurinic (lipsit de baze- Fig. 70).

114

Fig.70 Excizia de baze.

Reparaia se va face printr-o ADN polimeraza de reparare, sau ADN
polimeraza , care hidrolizeaz nucleotida apurinic, apoi nlocuiete
nucleotida ataat la extremitatea 3OH liber i brea va fi nchis de ADN
ligaza. Aceasta reconstituie legtura fosfodiester n poziia 3 a nucleotidei
adugate.
Repararea, corectarea mperecherilor greite
Unele baze azotate din ADN existent, sub mai multe forme tautomere,
rezult prin deplasarea inconstant a hidrolizei i trecerea fraciunii amino n
enol. Aceste forme sunt mai rare ntr-un ADN matri n curs de replicare;
unele baze pot fi momentan sub form tautomer.
Forma tautomer a adeninei este imino-adenina, care nu se hibrideaz
cu timina ci cu citozina. La fel enol timina se hibrideaza mai bine cu guanina,
dect cu adenina i enol guanina se leag cu timina mai bine dect cu citozina.
Astfel ADN polimeraza, va condensa pe ADN-ul pe care-l construiete,
baze azotate diferite fa de cele normale (ateptate). Dac bazele azotate ale
catenei model vor lua forma obinuit, ele nu se vor putea hibrida cu bazele
catenei noi i vor rezulta mperecheri greite (Fig 71).

115

Fig.71 Imperecheri greite.

Transmiterea mperecherilor greite
O mperechere greit face s apar 2 nucleotide necomplementare n
aceeai poziie a catenelor de ADN. Fiecare din cele 2 catene n cursul mitozei
urmtoare se vor replica producnd o nucleotid complementar. Nucleotida
anormal, va angaja o tranziie permanent ntr-una din cele 2 celule fiice. In
fig. 72, se afl pe lanurile parentale o pereche de nucleotide A=T. La generaia
urmtoare, lanul care posed A, n urma unei iminizri, produce o caten
complementar cu citozina, n loc de timina ateptat (C=A). n alt celul
secvena este normal T=A. ncepnd de aici toate celulele n care ADN a fost
replicat de la catena purttoare de substituie, vor avea la acest nivel o pereche
G=C. Substituia a devenit permanent. Dac ea este situat ntr-o gen poate
determina o mutaie (Fig 72).

116

Fig 72.Transmiterea mperecherilor greite

Excizia unui fragment lung de ADN
Dac un fragment de ADN este lezat, simpla excizie a unei baze nu este
suficient pentru reparaie (n special mperecherile greite de transcriere care
nu vor fi reparate de ADN polimeraza gama) i n cursul replicrii sunt imediat
repetate, deoarece dublul helix nu se formeaz normal.

Fig. 73. Excizia unui fragment lung.

117

O endonucleaz secioneaz catena purttoare a leziunii, la o distan de

5 nucleotide. Apoi sub efectul unei topoizomeraze i a unei helicaze (sau
factorul TFIIH), catena lezat este separat de catenele normale. ncepnd de la
extremitatea 3OH a breei astfel creat, o ADN polimeraza reconstituie
fragmentul complementar i ultima legtur va fi inclus prin ADN ligaza.
Modelul Holliday
Deschiderea unei bree ntr-o caten ADN i derularea dublului helix,
permit unor fragmente de ADN monocatenar s se hibrideze cu secvenele
complementare ale cromozomului omolog. n cazul unor greeli capetele celor
2 catene schimbate, vor putea fi renchise prin ADN ligaza. O asemenea
structur cu intercreterea celor dou catene ADN omoloage se numete
structur Holliday de la numele cercettorului (1964). Aceast structur este
mobil i schimbul se poate propaga prin glisarea structurii de-a lungul celor
dou helixuri mergnd n acelai sens (Fig 74).

Fig.74 Model Holliday.

Se poate reprezenta structura Holliday separnd helixurile n form de
cruce. Aceasta permite s se observe c exist dou moduri de separare a celor
dou helixuri, fie secionnd orizontal i obinnd o schimbare a fragmentelor
de ADN ntre 2 cromozomi, fie secionnd vertical i ajungnd la un schimb
complet de ADN ntre cei doi cromozomi, deasupra punctului de ncruciare.

118

Crossing-over
Schimburile ntre cromozomii omologi pot duce la schimbul de
fragmente, sau de catene ntregi de ADN. n meioz, n special, aceste
schimburi se produc frecvent ntre cromozomul de origine matern i patern,
astfel nct genele cromozomilor din celulele fiice (gamei), sunt recombinri
heterogene ale fragmentelor (Fig. 75).
Rezultatul implic un amestec de caractere ereditare ale celor doi
prini i constituie patrimoniul noului individ. Schimburile garanteaz
meninerea fiecrei gene, a fiecui locus sub form de alel homozigot, sau
heterozigot.

Fig. 75. Crossing over

Mutaii cromozomiale macroleziuni
Cile de producere cunoscute sunt prin: mutaie, inversie, translocaie
n interiorul cromozomului.
119

Mutaia, rezult din legturi anormale ntre baze nucleotidice vecine

precum dimerii timinei. Prin mutaii cromozomiale se produc modificri
substaniale n structura acestora.
Dac o regiune a cromozomului sufer deleie, aceasta determin
scderea materialului genetic n cromozomul mutant.
n duplicaie are loc copierea unei regiuni existent a cromozomului.
Ambele, duplicaiile i deleiile pot fi create printr-un crossing-over
anormal n timpul meiozei.
Cldur degajat n reacia de hidroliz a bazelor adesea a purinelor,
conduce la situsuri apurinice (fr purine).
Agenii chimici din mediu pot fi mutageni. Astfel, exist analogi ai
bazelor, care dau nucleotide anormale, precum 5-bromuracilul care se
hibrideaz preferenial cu guanina, sau dou aminopurine care se leag de
citozin.
Unii ageni mutageni ca 2 metilnitrosamina reacioneaz ntre baze, sau
n interiorul dublului helix similar bromurii de etidiu.
Inversia
Inversia reprezint schimbarea orientrii unei secvene ADN.
Se desfoar cnd cromozomul este fragmentat i reconectat n dou
regiuni. Regiunea desprins sufer o bucl intern, o ntoarcere invers,
pierde succesiunea normal, apoi este reconectat.
In inversie nu se schimb cantitatea de material genetic din cromozom.
Inversia nu altereaz expresia genelor numai dac captul inversiei se afl
n interiorul genei.
Translocaia implic 2 cromozomi. ntr-o translocaie simpl o singur
regiune a unui cromozom se desprinde i se ataeaz la alt cromozom.
Translocaia poate fi i reciproc. Inversia i translocaia pot conduce la
deficiene totale i la duplicarea materialului genetic dup meioz.

Fig. Translocatia cromozomilor.

120

Modificri structurale ale genelor sau microleziuni

Cile de producere cunoscute sunt prin: duplicaie, amplificarea,
fuziunea genelor deleie, inseria, mutaii punctuale n interiorul
cromozomului.
Duplicaia, multiplicarea, repetiia unui fragment de ADN poate
cuprinde o gen n ntregime sau un fragment, se poate realiza n acelai sens
sau n sens invers fa de gena duplicat.
Amplificarea este multiplicarea n tandem a secvenelor obinuit unice
(mrimea tandemului fiind considerabil).
Fuziunea genelor este rezultatul unui rearanjament cu dubl rupere a
dou gene diferite i transpoziia de la una la alta.
Inseria reprezint introducerea unei secvene de transpozoni sau
secvene virale ntr-o gen. Se face prin mecanisme complexe: recombinare
inegal, translocaie, conversie genic, bucle cromatidice.
Substituia
Reamplasarea, sau nlocuirea unei nucleotide prin alta, n structura
primar a unui acid nucleic poart denumirea de substituie.
O substituie poate conduce la rezultate foarte diferite dup transducie.
Aceasta depinde de poziie n raport cu cadrul lecturii. ntr-un codon, se poate
traduce prin acelai aminoacid se spune c substituia este sinonim sau
silenioas. Nu va avea loc modificarea aminoacidului tradus, deci nici a
proteinei rezultate prin transducie.
Substituie missens, tip de mutaie prin substituia nucleotidelor care
determin modificarea unui anumit codon astfel nct el codific alt aminoacid
dect acela pe care-l codifica normal. n cadrul substituiei pot avea loc tranziii
i transversii ale nucleotidelor.
Tranziia sau mutaia punctual n care o baz purinic este
transformat n alta purinic G-A sau pirimidinic n alta pirimidinic C-T.
Transversia este mutaia punctual n care o baz purinic este
transformat n pirimidinic G-T sau pirimidinic n purinic C-A.
Substituia non sens se produce n molecula de ADN, i determin
nlocuirea ntr-un ARNm al unui codon sens, cu unul non-sens, care
codific un aminoacid diferit.
Prin traducerea acestui ARNm rezult un polipeptid trunchiat.
O substituie ntr-un codon poate fi tradus printr-un codon de terminare: se
spune c este non-sens. Proteina tradus va fi ntrerupt n acest loc.

121

Polimorfismul Xba al lipoproteinei apoB

Polimorfismul de restricie Xba I a apolipoproteinei B rezult dintr-o
substituie T-C sinonim, care face s dispar un situs de restricie Xba I
(TCTAGA) de pe ADN-ul unor subieci. Aceast substituie nu antreneaz
mutaii apoB i nu are deci, nici o consecin direct asupra sntii
subiectului. Totui subiecii purttori ai genomului X2 pe cele 2 gene apoB
(homozigote) au o concentraie mai mare de apoB. Lipidele sanguine sunt mai
sczute dect la subiecii genotipului X1 i n consecin au un risc mai redus
de a suferi formarea de ateroame i boli cardiovasculare. Legtura ntre acest
polimorfism i lipidele sanguine este nc necunoscut.

Fig. 77 Polimorfismul Xba al lipoproteinei apo B

Schimbarea permanent a structurii ADN conduce la o structur
primar diferit i devenit permanent n proteina exprimat.
Mutaia
Mutaii punctuale constau n substituie, supresie (lips) sau adiia de
baze. Se realizeaz prin:
- depurinare (pierderea purinelor)
- dezaminare (citozina metilat trece n timin pe catena sens i G-A
pe catena antisens)
- erori de replicare sau de reparaie.
Mutaii n regiunile codante determin schimbarea unui aminoacid
din protein i a funciei proteinei.
Mutaiile silenioase linitite modific codonul dar nu i aminoacidul.
Foarte rar determin eliminarea exonului (episajul).
122

Mutaiile non-sens duc la formarea unui codon STOP, UAA, UAG,

UGA i proteina este astfel ntrerupt adesea nefuncional sau cu activitate
rezidual redus. Uneori determin i episajul exonilor.
Atunci cnd o substituie nesinonim se produce n ADN -ul unui
subiect (genotip) i conduce la ncorporarea unui aminoacid diferit n structura
primar a unei proteine are ca rezultat apariia unor caractere diferite (mutaie),
n fenotipul individului.

Fig. Tipuri de mutaii.

Orice alt modificare antrennd o protein tradus mai lung, sau foarte
scurt, sau un decalaj n citirea codonilor se traduce printr-o secven primar
diferit i deci n majoritatea cazurilor o mutaie n fenotipul individului.

123

Fig. Mutaia
Mutaia Arg 3500 Gln apoB
Mutaia 3500 a apolipoproteinei B-100 rezult dintr-o substituie
nesinonim G-A. Astfel prin transducie se nlocuiete n poziia 3500
aminoacidul; arginina va fi glutamina din proteina apoB-100.
Astfel n locul argininei va fi glutamina (Fig. 78).
Prezena acestei mutaii nu antreneaz modificri ale situsului de
restricie i ele nu pot fi detectate direct printr-un polimorfism a lungimii
fragmentelor de restricie (RFLP). Prezena acestei mutaii regsit n Frana la
o persoan din 500, este un factor de risc vis-a-vis de ateroame i boli
cardiovasculare, deoarece ea perturb legtura apolipoproteinei B-100 cu
receptori celulari ai lipoproteinelor cu densitate mic (LDL).

Fig 78. Mutaia Arg 3500 Gln apoB

Mutaii prin adiie i deleie
124

Segmente mari sunt inserate sau pierdute de ctre genom. Cauzeaz

achiziionarea sau pierderea uneea sau mai multor gene.
Proporia erorilor dat de ADN polimeraza este de 1 pn la 5 mutaii per
replicare. ADN polimeraza ar trebui s fie capabil s gseasc mutaia uor.
Mutagenii
Ageni care induc mutaii. Multe survin natural.
Pot fi utilizate n laborator pentru a crete rata mutaiilor i ansele izolrii
mutantelor de interes
Mutaiile care perturb citirea
Inseria sau deleia unei baze n regiunea codant decaleaz cadrul de
citire i determin apariia unui codon stop dup mai multe baze (10-100 de la
mutaie).
Mutaii care controleaz expresia unei gene
Sunt situate n zona reglatoare a genei de exemplu:
- n promotor la nivelul codonului de iniiere a transcripiei sau la
nivelul situsului de poliadenilare. Pot fi situate pe gene codante pentru proteine
care intervin n reglarea expresiei, exemplu gene codante pentru factori de
transcripie.
Mutaii de replicare sau dinamice
Sunt erori ale replicrii mitotice sau premeiotice care determin o
alunecare a unor zone presupuse instabile ale genomului. Ele determin o
amplificare (mutaie dinamic) sau o reducere a zonelor repetate. Persist mai
multe generaii i cresc n cursul generaiilor. Se regsesc n anumite maladii
genetice pentru care s-au observat fenomenul de anticipare i rezultatul
instabilitii repetiiei di sau trinucleotidice. Exemplu, numrul de repetiii de
trinucleotide este foarte variabil n genom de la un subiect la altul (polimorfism
multialelic). Aceste repetiii de trinucleotide sunt utilizate ca markeri genetici.
Totui cnd se depete un anumit numr de repetiii pe locus au efect
patologic.
Mutaiile genetice sunt responsabile de expansiunea secvenelor scurte
(CGG) n boala X fragil (cu numr de repetiii peste 50). ntr-o prim generaie
se observ o premutaie care conine un numr de repetiii peste normal. n
generaia urmtoare crete numrul premutaia devine mutaie i apare boala la
o vrst precoce. Aceste expansiuni i schimb talia mrimea n timpul
transmiterii bolii de la prini la copii (cromozomul X).
Aceste mutaii sunt dinamice i explic variabilitatea fenotipului,
penetrana i variabilitatea bolilor genetice n care apar.
Mutaiile prin inseria de elemente mobile
Inseria de transpozoni secvene LINE sau Alu se poate produce ntr-o
gen prin retrotranspoziie.
125

Amprenta parental
Se poate determina originea matern sau patern a unei gene prin
markeri polimorfi. Expresia fenotipic a unor mutaii difer dac afecteaz
un cromozom de origine matern sau patern fenomen numit amprent
parental. S-a studiat unul dintre mecanisme, metilarea unor gene, care se face
diferit pe cromozomii materni i paterni n timpul gametogenezei.
Mutaii n mitocondrie
Sunt transmise de mam i se pot observa toate tipurile ntlnite i la
ADN nuclear.
Mutagenii chimici
Ei determin citirea greit a ADN n timpul replicrii determinnd
-mutaie- principiul care st la baza aciunii unor citostace
-baze analoage
Radiaiile ca factori mutageni
Razele UV (260 nm) i radiaiile solare cu lungime de und mic
determin formarea de dimeri de pirimidin prin legturi
C=C; T=T. ADN pol citete greit rezultnd mutaii
Radiaii Ionizante
Se caracterizeaz prin: energie mare, fragmenteaz ADN, avnd efect letal.
5-Bromouracil seamn cu T din ADN i se mperecheaz cu G-intercalat.
Bromura de Ethidium - distorsioneaz topografia DNA.
Ageni Alkilani- introduc grupri alkil (metil, etil) n bazele
componente ale ADN i perturb citirea.
Testul Ames pentru Carcinogenez
Folosete Salmonella enterica: o tulpin care nu sintetizeaz histidina. Se
cultiv pe mediu fr histidin. Substana chimic de testat (medicament) se
introduce n mediu n microcomprimat (ca pentru antibiogram).
Dac substana este mutagen n jurul microcomprimatului se dezvolt un
nr. mare de colonii (mutante, revertante). Dac substana nu este mutagen n
mediu se dezvolt un nr. mic de colonii (mutante, revertante). Pentru a testa
dac substana devine cancerigen dup metabolizare n ficat se pretrateaz
mediul de cultur cu extract de ficat

126

Fig. Test Ames . a.Negative nemutagen; b. pozitiv- mutagen

Mediile conin substane carcinogene
Mutaii somatice i germinative
Efectul unei mutaii este diferit atunci cnd aceast mutaie afecteaz
ADN unei celule somatice sau a unei celule din linia germinal (Fig. 79).

127

Fig. 79. Mutaii somatice i germinative.

Atunci cnd ADN-ul unei celule somatice este modificat i cnd rezult
o mutaie, celulele care iau natere din aceste celule mutante formeaz o clon
celular, care prezint caractere difereniate de cele ale esutului de origine.
Astfel, de clone structureaz adesea tumorile canceroase. Mutaiile somatice
nu sunt transmise la descendeni.
Dac ADN unor celule germinative este modificat i rezult o mutaie
aceasta se va transmite la gamei i va apare la descendeni: mutaia este deci
ereditar.
Mutaia unui situs de matisare
Activitatea unui situs criptic de episaj
n afara zonelor de episaj normal exist situsuri criptice care pot fi
active. Pot fi situate n exon producndu-se episaj anormal al exonului sau n
intron, o poriune din intron, regsindu-se n paralel, n produsul transcris
matur. Cel mai adesea apare un codon STOP n aval.
O substituie, poate altera un situs de legare. Astfel, situsul donator a
intronului 3 a apoAII este transformat din GT n AT ntr-o familie de bolnavi,
ceea ce-l face inactiv pentru excizia acestui intron.
Exist n mijlocul exonului 3, o secven care poate servi ca situs
donator alternativ dar, care este normal inactiv (situs donor criptic). n absena
situsului donator normal, acest situs criptic va servi la excizia intronului 3. Dar
cum acest situs criptic este situat la 65 nucleotide n amonte de acest situs
normal, vor exista 22 aminoacizi ai exonului 3 care nu vor fi tradui. Pe de alt
128

parte numrul de nucleotide pierdute nefiind un nultimplu de 3, va avea loc un

decalaj al cadrului de citire, cel care antreneaz o traducere fals a primilor 10
aminoacizi ai exonului 4 i ntlnirea unui codon STOP prematur (Fig. 80).
Proteinele ntrerupte nu se exprim i apolipoproteinemia AII este
absent din plasma acestor bolnavi.

Fig 80. Mutaia unui situs de episaj sau matisare.

129

Deleia
Deleia este excizia unui segment ADN. Acesta poate avea de la cteva
nucleotide n secvena primar a unui acid nucleic. la mai multe milioane de
baze (2-5 MB) sau chiar un cromozom.
n cursul evoluiei, transmiterea mesajului genetic de la o celul la alta,
de la un individ la altul i de la o specie la alta se face cu modificri punctuale
ale structurii primare a ADN care sunt transmise ereditar dac ele sunt
compatibile cu reproducia.
Deleia are importan variabil n funcie de lungimea lor:
- de la 1 la 2 nucleotide ele decaleaz cadrul lecturii;
- a 3 nucletotide, duce la absena unui codon i deci supresia (lipsa)
aminoacizilor n proteinele exprimate;
- mai mari, ele pot suprima expresia uneia sau mai multor exoni sau a genei
n ntregime.
Decalajul din cadrul de lectur
Cadrul de citire determinat odat pentru toate transduciile, este esenial
pentru sinteza unei proteine format din 77 aminoacizi (apoAII).
O deleie implicnd prima nucleotid din codonul 59 ndeprteaz
(decaleaz) o liter din cadrul de citire i rezult o sintez de 5 aminoacizi
diferii (greii), urmai de codonul STOP (fig. 81). Proteina produs este
inexact i ntrerupt (are doar 66 aminoacizi).

Fig. 81.Decalaj din cadru de lectur.

n acelai fel dac se ndeprteaz primele dou nucleotide din codonul
59 rezult nc o protein fals i ntrerupt (60 aminoacizi). n ambele cazuri
se spune i este un decalaj de cadru de lectur.
130

Dac se ndeprteaz 3 nucleotide, vor rezulta unul sau doi aminoacizi

inexaci, dar cadrul de lectur rmne acelai i transducia se produce normal
cu un aminoacid mai puin (76 aminoacizi) (CUU).
Deleia Phe 508 a CFTR
Gena CFTR codific un transport de anioni care regleaz transducia
prin traversul epiteliului i pielii.
Deleia nu antreneaz decalajul cadrului de lectur i schimbarea celei
de-a 3-a nucleotide din codonul 507, nu schimb aminoaicizii (izoleucina), dar
singura consecin este absena aminoacidului 508 (fenilalanina). Aceast
absen este suficient pentru a inhiba activitatea transportului (fig. 82).
Prezena acestei deleii ntnit n Frana la una din 500 persoane, este o
cauz foarte frecvent a mucoviscidozei (fibroza cistic).

Fig. 82. Deleia Phe 508

Fibroza chistic boal genetic care se manifest printr-o disfuncie
metabolic, localizat la nivel membranar care duce la transformarea chistic
fibroas a unor esuturi.
Secreiile glandelor conin concentraii crescute de Na, Cl, Ca i nucleotide.
Deleia exonului 9 a lipoproteinlipazei
O deleie mai mare (de exemplu aici 2136 nucleotide), antreneaz
adesea inactivarea genei. n cazul prezent, deleia se ntinde de la intronului 8
131

pn la 9 din gena lipoproteinlipazei i n consecin suprim n totalitate

exonul 9 al acestei gene (fig83).

Fig. 83. Deleia exonului 9 al lipoprotein lipazei.

Este probabil ca excizia (episajul) intronului secionat s nu se poat
matisa cu situsul receptor al intronului 9 i prin urmare maturarea transcriptului
nu este posibil.
La un subiect purttor a acestei deleii se constat pe cei 2 cromozomi 8
(homozigoi), o absen a expresiei genei i n consecin absena
lipoproteinlipazei i deci absena activitii ei enzimatice n plasma sanguin.
Lipoprotein lipaza enzim plasmatic funcional, localizat la nivelul
suprafeei luminale a endoteliului vascular al capilarelor sanguine din cord,
esut adipos, splin, plmni, medulara renal, aort, diafragm i glanda
mamar n lactaie.
Aciunea ei enzimatic se exercit asupra triacilglicerolilor din compoziia
chilomicronilor i a lipoproteinelor cu densitate foarte joas (VLDL) pe care i
hidrolizeaz la diacil, monoacil gliceroli i acizi grai. Sngele normal conine
o cantitate redus de lipoprotein lipaz, ea fiind eliberat n circulaie sub
aciunea heparinei.
Inseria
Inseria const n adiia uneia sau mai multor nucleotide n secvena
primar a unui ADN.
Inseriile sunt de importan variabil n funcie de lungimea lor:
-de la 1-2 nucleotide, ele decaleaz cadrul de legtur (codon);
-de 3 nucleotide, conduc la adiia unui aminoacid n proteina exprimat;
-cele de lungime mare pot modifica complet transducia exonilor.
132

n intronii sau n exonii netradui se ntlnesc adesea inserii lungi, de

structur variabil, care sunt fr efect aparent asupra expresiei genei.
Transpoziia
Transpoziia reprezint ncorporarea unei secvene de ADN nou ntr-o
reciune de ADN genomic a unei celule.

Fig. Elemente transpozabile inserate.

n cursul evoluiei speciilor, genomul crete continuu, printr-o suit de
duplicaii de gene i transpoziii.

Fig. Transpoziii la nivelul genelor.

Duplicrile se produc n tandem; o secven se gsete repetat de 2-3
ori ntr-un genom, n urma duplicrii.
Aceast duplicaie permite fiecarei copii de secvene s evolueze pe
cont propriu ceea ce crete ansa de producere a unor caractere noi.
Transpoziiile rezult prin ncorporarea aminoacizilor sintetizai din
afara genomului:
-fie prin ncorporarea unui virus;
133

-fie prin transcripia invers a unui ARN celular, sau a unui virus prin
intermediul unei reverstrancriptaze care produce un ADN complementar
(ADNc) i o transpozaz care-l va ncorporaz n genomul celulei.

Fig. Transpozonul
Transpozazele sunt grupuri de enzime codificate de elemente genetice
mobile, cum ar fi transpozonii sau secvenele de inserie, care excizeaz i
inser aceste elemente mobile. Transpozazele sunt proteine formate din 340380 aminoacizi. Sunt implicate n recombinarea ADN n locuri specifice
bacteriilor i altor organisme.
Secvenele Alu
La o mic distan n aval de gena apoAII se ntlnete o secven
transpozat a familiei Alu. Aceasta este o pseudogen delimitat de dou
secvene repetate (GAAATGAGGTACCCT) care sunt caracteristice
134

secvenelor transpozate. ntre aceste dou secvene se gsesc alte dou secvene
omoloage
separate
de
o
scurt
secven
de
legtur
(TACTAAAATACAAAATTA). Mai multe situsuri caracterizeaz aceast
secven Alu:
- situsul de iniiere al ARN polimerazei II;
- situs de restricie a enzimei Alu I (de unde numele de secven Alu);
- coada polyA.
Secvena Alu rezult din transpoziia secvenei ARN 7S, care intr n
structura SRP (Signal Recognation Particle).
Exist aproape 1 milion de secvene Alu din ADN uman adic una la 4
Kb. Ele exist la majoritatea primatelor. Sunt cunoscute i alte secvene
transpozate la om.
Polimorfismul
Sunt secvene de ADN intra sau extragenici considerate nepatogenice.
Aplicaii:
- studiul localizrii genelor (mapping)
- identificarea genelor
- evidenierea pierderii unui cromozom n cancerologie i genetic
- predispoziia la o boal genetic
- anchete familiale.
Polimorfismele pot fi bialelice (exist dou versiuni alternative ale
secvenei ntr-o poziie dat) multialelice sau microsatelii. Acetia sunt
markeri foarte utili pentru localizarea genelor sau STR (short tandem repeats).
Sunt informaionali, foarte abundeni n genomul uman 50-100000/genom la
om. Sunt spaii destul de regulate n genom la fiecare 10 kb majoritatea
microsateliilor sunt secvene dinucleotidice CAn sau GTn. Alii sunt secvene
de 3-5 pb repetate ntre 100-300. Aceti markeri sunt utilizate n medicina
legal
Minisateliii precum VNTRs (repetri n tandem cu numr variabil)
sunt constituii din 15-70 pb repetate n tandem utilizai n medicina legat
nlocuind progresiv STRs.
Reverstranscripia la virusuri
ARN din HIV atunci cnd ptrunde n snge este recunoscut de
receptorul CD4 al limfocitului T4. Formarea complexului receptor-virus
antreneaz fuziunea anvelopei virusului i a membranei limfocitului i prin
urmare virusul ptrunde n citoplasm.
Virusul conine o enzim reverstranscriptaz i un ARN viral purttor al
informaiei genetice. Enzima catalizeaz retrotranscripia ARN viral n ADN i
ncorporeaz acest ADN (provirus) n ADN limfocitului.
135

Provirusurile produc noi particule virale prin transcripie i se traduc

prin moartea celulei i distrugerea ADN-ului su.
Particulele virale noi sunt eliberate pentru a transmite semnalul altor
LT4. Numrul LT4 diminueaz pn cnd rspunsul imun al subiecilor devine
insuficient (SIDA), ceea ce antreneaz infecii oportuniste i se termin cu
moartea indivizilor afectai.
Ciclul unui retovirus
Particula de retrovius este compus dintr-un nveli proteic nconjurnd
o capsul proteic care conine patrimoniul genetic al retrovirusului sub form
de ARN monocatenar ce conine gena transcripiei reverstranscriptazei i gene
ale proteinelor de nveli (anvelopa) (fig.84).

Fig. 84. Ciclu unui retrovirus.

Cnd infesteaz o celul numai capsida penetreaz i traverseaz
membrana i elibereaz ARN n citoplasma, unde ele se exprim ca un
mesager. Astfel reverstranscriptaza sintetizat este o enzim capabil de:
transcripie invers a ARN din virus n ADN complementar
(hibrid ARN, ADN);
distrugerea ARN pentru a-l nlocui cu o a II-a caten ADN.
ADN dublu catenar se transpune n ADN nuclear al celulei gazd, de
unde el poate fi transcris n multiple copii de ARN viral.

136

Fig. Cclul unor virusuri (ARN, ADN) n celula eukariot.

Transducia acestui ARN conduce la sinteza de proteine, care se
asambleaz n jurul ARN, pentru a constitui o nou particul viral n numr
foarte mare (amplificarea virusului).
n final celula gazd moare i pune n libertate particule virale i ciclu
rencepe.
Duplicarea genei
Numeroase situaii pot conduce la duplicarea fragmentelor de ADN.
Aceste duplicri sunt facilitate de existena unei secvene repetitive directe
(secvena identic n acelai sens, la mic distan pe aceeai caten ADN).
ntr-o bucl de replicare, secvenele repetitive directe, pot conduce la
apariia a dou lanuri inegale de ADN replicate i dup schimburile dintre cele
dou catene la o repetiie a fragmentelor de ADN (fig. 85).
Atunci cnd schimburile dintre catene se fac n aceeai cromatid dup
replicare, repetiia n tandem a aceluiai fragment, se regsete pe unul singur
din cele dou catene.

137

Fig. 85 Duplicarea unei gene.

n cursul meiozei, schimburile se pot produce ntre cromatide ca ntr-un
crossing-over normal, dar cu repartizare inegal pe catene a secvenelor
repetitive. n acest caz secvena de origine patern i matern se regsete la o
serie pe acelai lan ADN, conducnd la dou gene identice (numite paraloage).
n fiecare din aceste cazuri ADN purttor de repetiii beneficiaz adesea
de dou gene identice, codante pentru aceeai protein. Aceast dispoziie
confer indivizilor care primesc acest patrimoniu genetic o mai bun rezisten
la mutaii care pot surveni pe o gen, deci un avantaj selectiv n favoarea
genelor duplicate.
Pseudogena
Pseudogenele sunt:
-gene care n urma modificrii structurii lor nu pot fi transcrise i sau
traduse n proteine i se numesc gene neexprimate.
-gene care apar prin multiplicare n cursul evoluiei i au suferit
evenimente genetice (substituie, inserie, deleie) care, mpiedic transcripia
sau transducia.
La o duplicare a genei apolipotroteina CI se formeaz o gen apoCI,
care are 40 miloane de ani n genomul primatelor. Prin mutaie recent, se
transform ultimul aminoacid din peptida semnal a proteinei exprimate prin
acea gen n codon STOP. Transcripia conduce la un ARNm dar acesta nu
138

poate fi tradus dect printr-o peptid semnal fr a fi urmat de proteine n

serie.
Conversia genelor
Transcripia unei secvene de ADN din gen care reprezint o copie a
aceleiai gene vechi, duplicaia (copie homoloag) are ca rezultat reconstituirea
omologiei genelor duplicate.
Secvenele genelor pot fi transformate prin schimbarea exonilor
complei printr-o transpoziie pornind de la alte gene.
Transpoziia unui exon poate aduga un domeniu nou n structura unei
proteine sau restaurarea unui domeniu, devenind multifuncional n cursul
evoluiei.

139

TEHNICI UTILIZATE N BIOLOGIA MOLECULAR

Parametrii folosii pentru descrierea genomului
Lungimea total a ADN este exprimat n perechi de baze pb, Kpb=10 3
i Mega pb-106.
Genomurile cu dimensiuni diferite:
- virusurile fie cu ADN sau ARN au de la 103-105 pb sau 1-100 m
atunci cnd fibra este ntins;
- bacteriile au 106-107 pb i 1 mm derulat;
- levurile sau drojdiile 1,2x107 pb;
- mitocondriile au ADN de 1,8-6x105 pb, lungimea difer;
- cloroplastele 1,5x105 pb sau 50 mm;
- omul are nucleul de 3x109 pb sau 1 m derulat, iar mitocondriile 1620x103 pb.
Secvenele genomului nuclear sunt de 3 tipuri:
1) secvene unice, o copie sau cteva copii pe genom haploid exemplu,
genele care codific proteinele de rezerv la graminee sau gene ale unor
proteine i a transaaminazelor.
2) secvene mediu repetate de 1000-100000 copii/gen genom.
Acestea conin genele pentru ARN ribozomal, ARN de transfer i uneori gene
ale unor proteine.
3) Secvene nalt repetitive de 100 000 1 milion copii/gen. Rolul lor
este puin cunoscut. Nu sunt considerate gene i frecvent nu sunt transcrise.
Enzimele utilizate n biologia molecular
Enzimele de restricie fac posibil manipularea de tip recopiere, tiere,
lipire a secvenelor acizilor nucleici. Noi enzime de restricie au fost
identificate, purificate i clonate. Acestea particip la fenomenul de restricie,
adic un sistem de aprare al bacteriilor fa de bacteriofagi. Unele tulpini sau
sue bacteriene conin enzime din familia endonucleaze i decupeaz ADN la
nivelul secvenei recunoscut specific. Dac o colonie bacterian infectat de
un bacteriofag sintetizeaz aceast enzim, i dac acesta posed n genom,
secvena recunoscut de enzimele de restricie a bacteriilor, fagul va fi
incapabil s se multiplice i s lizeze bacteria. Ca urmare ADN-ul su va fi
secionat n fragmente n care exist situsuri specifice genomului fagic.
De ce ADN bacterian nu este distrus de aceste enzime?

140

Exist 2 posibiliti: fie ADN bacterian nu conine secvene recunoscute

de enzim, fie acesta este metilat la nivelul resturilor de A sau C de ctre
metilaza bacterian ceea ce determin nerecunoaterea acestor secvene
metilate de ctre enzimele de restricie. Numele de restricie vine de la faptul c
exist o restricie a infeciei fagilor fa de anumite sue bacteriene care
sintetizeaz endonucleaze, altele fiind lizate. Numele enzimei de restricie
provine de la numele genului i speciei de la care au fost izolate. Se disting 3
grupe de enzime de restricie: I, II i III.
Polimerazele sunt enzime care realizeaz copierea acizilor nucleici
ADN i ARN. Sinteza se realizeaz complementar i paralel n sens 5' fosfat
3'OH prin adugarea de nucelotide la extremitatea 3'OH.
ADN polimeraza are rol de a realiza copii ale ADN unei celule pe
durata unei faze S a ciclului celular care precede mitoza. Are loc duplicarea
genomului celulei.
Expresia genelor este tradus sub form de proteine. Informaia
necesar sintezei lor este vehiculat de ARNm, n urma transcripiei realizat
de ARN polimeraze i care conin o copie a informaiei genei.
Exist al II-lea grup al ADN polimeraze a cror componente,
reverstranscriptazele, cu aceeai funcie, sintetizeaz numai ADNc cu secven
complementar celei a ARNm. Aceasta corespunde unei reorientri a fluxului
de informaii genetice ale unei enzime de reverstranscripie. Reverstranscripia
nu exist n celulele sntoase.
ADN polimerazele alturi de sinteza catenelor de ADN au rol i n
reparaia ADN. Ele necesit o matrice fa de care se sintetizeaz secvena
complementar. Este necesar iniierea reaciei de ctre o amors, prin
intermediul creia ADN polimeraza realizeaz elongaia prin adiia de
precursori trinucleotidici dNTP. ADN polimeraza are afinitate fa de matricea
de ADN dar este capabil s copie lanuri de ADN cu o eficacitate mai slab .
Enzimele particulare utilizate sunt: ADN pol I specific E. coli i
fragmentul Klenow, ADN polimeraza fagilor T7 i T4 i ADN pol.
termostabile. Transferaza terminal poate fi considerat o ADN pol.
particular. Aceast enzim nu copie matricea dar adiioneaz nucleotide la
extremitatea 3' a lanului de ADN.
ADN polimeraza catalizeaz 3 tipuri de reacii:
-activitatea de ADNpol propriu-zis necesit matrice ADN care este
copiat prin extensie unei amorse. Polimeraza ncorporeaz nucleotide
ncepnd la nivelul 3'OH a amorsei.
-activitate exonucleazei 3'-5' in vitro este o activitate de reacie care are
ca scop eliminarea tuturor bazelor adugate eronat n cursul sintezei lanului de
ADN. Eliminarea bazelor eronate este urmat de ncorporarea bazei corecte cu
141

ajutorul ADN polimerazei. Aceast activitate se exercit pe ADN simplu sau

dublu catenar.
- activitatea exonucleazei 5'-3', enzimele elimin nucleotidele de la 5' a
ADN dublu catenar. Aceast activitate este utilizat n tehnica de marcaj prin
translaia seciunii.
ADN polimeraza I
Aceast enzim a fost purificat la nceput din culturi bacteriene ale E.
coli, exercit o activitate de ADN polimeraz, astfel c are dou activiti de
exonucleaze. Activitatea exonucleazic 5'-3' a ADN pol I poate fi exercitat pe
un hibrid ARN/ADN, ea este rezultatul deci a unei activiti de RNaz H
intrinsec care const n eliminarea unui lan de ARN prin activitatea
exonucleazei 5'-3'.
Aceast proprietate a fost exploatat n reacia de revertranscripie
pentru eliberarea primului lan de ADN sintetizat i va permite sinteza unuia
secundar. El va avea rol de amors necesar i la sinteza celui de-al doilea lan
complementar. La ora actual sunt i alte enzime utilizate pentru efectuarea de
reacii de reverstranscripie. n activitatea exonucleazei 5'-3' a ADN pol are loc
eliminarea unui grup fosfat n 5', care duce la imposibilitatea reaciei de
elongaie. n consecin domeniul de aplicaie al acestei enzime este de a
efectua marcajul sondei prin translaia seciunii, aplicaie n care ea este
utilizat n strns legtur cu DNaza I.
Fragmentul Klenow se realizeaz printr-o proteoliz limitat
(localizat) a ADNpol I de la E.coli, enzim monomeric care genereaz dou
fragmente foarte mari. Ele au pierdut activitatea exonucleazic 5'-3' dar
conserv activitatea exonucleazic 3'-5' i cea de ADNpolimeraz.
Fragmentul Klenow clasic, la origine este generat prin proteoliza
parial a enzimei native i produs apoi prin operaiuni genetice. Fragmentul
Klenow corespunde unui produs de transducie a 2/3 a prii codante din gena
de polimerizat care interacioneaz la partea C terminal.
Aplicaiile fragmentului Klenow:
- secvenierea dup metoda Sanger
- sinteza unui lan de ADN complementar
- marcare izotopic (32PdNTP) a extremitii 3' a ADN prin reacia
de schimbare a nucleotidelor reci cu nucleotide marcate, catalizat
prin activitate exonucleazic.
Acest marcaj se efectueaz pe moleculele de ADN la captul drept a
extremitii protuberante n 3'OH, creat de DN-aza I. Aici reacia comport 2
etape care se produc cvasisimultan. Prima pune n joc activitatea exonucleazei
care are ca efect eliminarea nucleotidelor pornind de la extremitatea 3'OH
provocnd o micare a situsului tiat (translaia tieturii n lungul ADN) i n
consecin producerea extremitii protuberante n 5'. Activitatea ADN
142

polimerazei contrabalanseaz activitatea exonucleazei n prezena unei

concentraii ridicate a precursorilor de NTP marcate.
Rezultatul final al acestei reacii este obinerea unui ADN marcat n 3'.
Acoperirea extremitii protuberante a ADN dublu catenar creat de exemplu
prin incizia ADN de enzime de restricie, nu genereaz capete drepte. Aceast
utilizare a fragmentului Klenow a fost suplimentat prin T4ADN pol., foarte
eficace n acest domeniu.
ADN polimeraza bacteriofagului T4 i T7 catalizeaz transferul
fosforului radioactiv 32P pe ATP. Astfel ATP este marcat cu 32P pe a treia
grupare a fosfatului de pe extremitatea 5 a fragmentului de ADN. Tehnica este
aplicat pentru obinerea oligonucleotidelor marcate care vor fi utilizate ca
sonde pentru criblajul bncilor (fig. 101).
T4 ADN polimeraza
Aceast enzim a fost izolat la nceput din bacterioagul T4. ADN pol
T4 i are o activitate exonucleazic 3'-5' foarte eficace pe ADN monocatenar.
Ca rspuns ea nu are activitate exonucleazic 5'-3' i este de 200 de ori mai
activ dect fragmentului Klenow de la E.coli, cu urmtoarele aplicaii:
-marcarea ADN la extremitatea protuberant 5' prin reacia de
polimerizare (completare), ncepnd cu 3'OH, cu ajutorul precursorilor care
sunt marcai;
-producerea de ADN pe catena cu margini drepte ncepnd de la
extremitatea protuberant (5'-3') ceea ce permite adiia de linkeri la
extremitatea moleculelor de ADN obinute.
- secvenierea prin metoda Sanger (activarea ADN polimerazei)
- mutagenez dirijat.
T7 ADN polimeraza
Aceast enzim a fost obinut prin izolarea ei de la bacteriofagul T7,
dup infecia bacteriei E.coli cu fagul. Este caracterizat prin eficacitate de
sintez, replicarea rapid a fagului n cursul ciclului de infecie. Ea posed n
acelai timp o activitate exonucleazic 3'-5' puternic exprimat de aproximativ
de 1000 de ori mai mare dect a fragmentului Klenow. Aceast activitate
important exonucleazic explic fidelitatea mare a T7 ADN pol.
Aplicaii principale:
- marcarea ADN n 3'
- mutageneza dirijat
Transferaza terminal este capabil s adauge didezoxinucleotid
(derivat din nucletotide) marcat pe 3OH al fragmentului ADN. Secvena
moleculei marcate astfel obinut este deci alungit cu o nucleotid analoag
fiecrei extremiti.

143

T7 ADN pol modificat: secvenoza

Tratamentul chimic al T7 ADNpol modific enzima diminund
considerabil activitatea lor exonucleazic. Enzimele obinute secvenoza 1.0 i
2.0 sunt utilizate n reaciile de secvenializare de bun calitate. Prin genie
genetic o versiune 2.0 a fost produs 100%, lipsit de activitate exonucleazic
dotat cu o mare activitate specific mai puin sensibil la structura secundar
ea fiind folosit la tehnica de secvenializare.
a) Taq ADNpol i enzimele operante au fost izolate din Thermus
aquaticus. Prezint particularitatea de a se dezvolta n izvoare calde la 80C.
Posed de asemenea activitate exonucleazic 5'-3' dar este lipsit de funcii
corectoare. Temperatura optim de funcionare de 70-75C. Originea sa i
confer o stabilitate remarcabil la temperaturi nalte. Timpul de njumtire
este mai mare de dou ore la 92C i de 40 minute la 95C. Aceast
termorezisten st la baza utilizrii sale n metode de amplificare genic
precum PCR n timpul crora se efectueaz numeroase cicluri termice care
presupun temperaturi de 90-95C. Alt avantaj hibridarea amorselor cu matricea
se face la o temperatur mai mare ceea ce determin hibirdarea nespecific.
Sensibilitate tehnicii este mare. Aceast enzim a fost clonat. Un anumit
numr de ADN pol termostabile au fost extrase din alte bacterii Archebacterii i
Eubacterii. Fiecare are o particularitate i o utilizare specific.
Enzimele hipertermostabile, sunt enzime cu activitate corectoare etc..
Se dau 2 exemple de ADN pol extrase din arhibacterii Tli pol izolate din
Thermococus litoralis a crui temperatur de cretere este de 98C replic ADN
la 75 i suport temperaturi de 100C. Posed activitate exonuclear 3'-5' de
recitire i corectare a erorilor.
b) Pwo ADNpol este extras apoi clonat din Pyrococus Woesey. Are
activitate corectoare a erorilor i este foarte rezistent. Timpul de .utilizare la
100C fiind de mai puin de 2 ore n comparaie cu Taq pol rezist mai mult de
5 minute la aceast temperatur. Aplicaiile Pwo ADN pol sunt n PCR,
clonajul produilor PCR i caracterizarea mutaiilor.
De la eubacterii se citeaz Ampl.TaqGold activ la 70C i inactiv la
temperatura ambiant. Este inactiv la temepraturi joase evitnd extensia
amorselor care au fost hibridate nespecific la temperaturi foarte diferite fa de
timpul de njumtire, ceea ce afecteaz sensibilitatea metodei. Ea recapt
activitatea sa enzimatic rapid dac este supus la temperaturi nalte de cteva
zeci de minute ntr-un ciclu prePCR (star cald PCR= apoi progresiv pe firul
ciclurilor termice paralele cu formarea produsului.
Fragmentul Staffel este o enzim recombinant care are la origine o
deleie de 289 aminoacizi NH2 terminali ai Taq polimerazei ceea ce confer o
rezisten termic mai bun. Timpul de njumtire (T1/2) fiind de 80 minute
144

la 95C. Aceast enzim nu are activitate exonucleazic 5'-3'. Este eficace n

aplicaii tip RTPCR.
c) UIT ADNpol extras din Thermothaga maritima are timpul de
njumtire de 40 minute, superior la 97,5C. Are activitate corectoare fiind
lipsit de activitate exonucleazic 5'-3'. Corecteaz mperecherile greite n 3'.
Se utilizeaz cnd se cere o mare fidelitate n cursul PCR. Majoritatea acestor
ADN polimeraze au o slab activitate terminal transferazic care const n
adugarea unui rest adenin la extremitatea 3' a catenelor sintetizate. Acizii fr
matrice, fr complementaritate cu alt caten n prezena ADN polimerazei
extrase din Arhebacterii au activitate exonucleazic 3'-5'. Ele elimin acest rest,
produc, deci ADN cu capete drepte spre deosebire de regula general ADN pol
extras din Eubacterii nu poate elimina aceste resturi de adenin care rmn la
extremitatea 3'.
Lipsa de activitate exonucleazic 5'-3' a unor ADN polimeraze stabile
Bca-exo izolat din Bacillus caldotonat a fost utilizat ntr-o tehnic de
amplificare SDA.
Aplicaii: PCR, secvenare ADN, SDA
d) Tth ADNpol izolat din Th. Thermophylus eucobacterie, aceasta are
activitate de revertranscriptaz. Enzima poate cataliza dou tipuri de activiti
polimerazic ADN i ARN, ceea ce permite transformarea unui ARN n ADNc,
apoi realizeaz amplificarea acestui ADNc (activitate echivalent cu a Taq pol),
fr a modifica mediul reacionnd (fr deschiderea tubului). Manganul (Mn)
este indispensabil activitii reverstranscriptazei.
La o cantitate ideal de Mn enzima catalizeaz succesiv reacii de
revertranscripie i de polimerizare. Aceast activitate de revertranscripie este
exprimat i de Taq polimeraza n prezena Mn dar este de 1000 ori mai slab.
Incubaia are loc la temperaturi nalte ceea ce rezolv probelma. ARN cu
structur secundar bogat n GC care are inconvenientul de a mpiedica
linearizarea ARN, reprezint un obstacol pentru RT dar, temperatura mai mare
elimin aceast structur secundar. Enzimele fiind termorezistente la
temperaturi mari ale ciclurilor de PCR i ale fazei revertranscripie.
Se comercializeaz o Rt Th ADN polimeraza XL care este capabil
de a sintetiza fragmente mari care pot atinge circa 40 kb.
Aplicaii revertranscripiei: RT-PCR, sinteza fragemntelor lungi PCR i
secvenare.
Revertranscriptaza (RT)
Aceast enzim retrotranscrie ARNm n ADNc. RT permite remontarea
fluxului gen, ARN, proteine i sinteza secvenei complementare unui ARN
numit ADNc efectund aciune invers a transcripiei.
Exist trei posibiliti:
145

ncepnd de la amors sau primer specific

ncepnd de la oligo dT care permite activarea RT de la coada poliA
a unui ARNm
- ncepnd de la amorse aleatorii numite hexanucelotide. RT este o
ADN polimeraz ARN dependent.
Aceast enzim transform ARN n ADN-ul su complementar i poate
sintetiza lan compelmentar ADN nou sintetizat (se obine un ADN dublu
catenar).
Sunt utilizate 2 RT.
1. AMV extras din celule infectate cu virusul mieloblastozei aviare
2. MMLV extras din celule infectate cu virusulul leucemiei murine
Molleney (MMLV sau MULV).
Aceste dou enzime pot sintetiza ADNc a crui lungime poate ajunge la
10 Kb. Activitatea acestor dou enzime este de tip polimeraz 5'-3'. Ele
prezint activitate de ARN az H mai mult sau mai puin important. Distruge
ARN din hibrizii ADN-ARN.
MMLV are activitate ARNazic H mai puin intens. Exist o variant
de mare eficacitate care este lipsit de activitate RNaz H - RT superscript Tm
IIRNaz H.
Matricea ARN nefiind distrus de activitatea RN-azei H enzima
acioneaz cu randament mai bun. Reacia are loc la 37C.
Spre exemplu, exist enzim capabil particular s efectueze consecutiv
funcia RT i ARN polimeraza RT H.
Deoxinucleotidiltransferaza terminal izolat din timus de viel
catalizeaz adiia repetitiv a dNTP la extremitatea 3'OH a ADN fie simplu, fie
dublu catenar, indiferent de secvena matricei. Este utilizat la sfritul
marcajului sondei (ncorporat n 3' a nucleotidului precusor marcat) sau cu
scopul de a obine un ADN cu coad monopolimeric (ncorporat la
extremitatea 3' a nucleotidelor identice).
ARN polimeraza
T7 ARNpol este produs de bacteriofagul T7, are o specificitate
crescut pentru situsul promotor al fagului T7 de iniiere a transcripiei. Este
foarte utilizat pentru sinteza 5'-3' in vitro a ARN obinut de sonda ARN i
poate fi utilizat pentru secvenarea ADN clonat ntr-un vector care conine
secvena promotoare T7.
Aplicaii: sinteza ARN pornind de la ADN pentru obinerea de sonde
moleculare.
SP6 ARNpolimeraza
146

Spre deosebire de cealalt enzim aceasta este produs de SP6 , cu

afinitate foarte mare pentru secvena situsului promotor SP6. Este utilizat
pentru sinteza sondelor ARN.
T3 ARNpolimeraza
Este ADN dependent avnd o mare afinitate pentru secvena
promotorului bacteriofag T3, transcrie ADN n ARN de la 5' la 3'. Aplicaii
identice cu T7 ARNpolimeraza.
QB replicaza este ARN dependent in vitro avnd funcia de replicare
a ADN genomic al fagului QB. Ea identific ADN de replicat pe baza structurii
secundare. Unele structuri ARN precum MDV1 tolereaz inseria unei secvene
nucleice fr ca aceasta s altereze capacitatea enzimei de a se replica.
MDV1 poate fi utilizat ntr-o prim etap ca o sond raportoare pentru
a detecta acizii nucleici int apoi n etapa a II-a ca un puternic generator de
semnal.
Enzime de modificare
Fosfataza alcalin catalizeaz hidroliza gruprii 5' PO4 a ADN i ARN
elibernd un rest fosfat i crend o extremitate 5'OH.
Aplicaii: prevenirea legrii vectorilor de clonaj pe ei nsi eliminnd
posibilitatea de formare a legturilor fosfodiester; eliminarea gruprii 5'PO4
nainte de marcajul acizilor nucleici prin T4 polinucleotid kinaza. Aceast
enzim este foarte des utilizat ca generator de semnal de unde natura
dependent de substratul utilizat n sistemede detecie a acizilor nucleici.
Polinucleotidkinaza catalizeaz transferul unei grupe gama fosfat de la
un ATP la extremitatea 5'PO4 a unui ADN sau a ARN. ADN nativ fosfatat n 5'
este adesea necesar s fie tratat n prealabil cu fosfataz. n unele condiii
experimentale reacia permite un schimb de fosfai ntre fosfatul poziiei
gamma a unui ATP i fosfatul din 5' a unui ADN. Aceasta permite evitarea
etapei de tratament al ADN cu fosfataza.
Aplicaii: marcarea unei sonde ADN sau ARN n 5' terminal; marcarea
unei amorse utilizate pentru secvena markerilor radoactivi utilznd gamma
32P, gamma 33P i gamma 35S.
ADN ligaza asigur formarea legturilor fosfodiesterice ntre
deoxiriboz 3'OH i 5'PO4 a dou nucleotide adiacente. Permite legarea sau
lipirea a dou catene ADN dublu catenare. Are ntr-un fel activitate invers
enzimelor de restricie.
Aplicaii: subclonarea produilor de amplificare n vectori.
Exist T4 ADN ligaz care leag extremitatea 5'PO4 a unui ADN sau
ARN monocatenar cu extremitatea 3'OH.
Nucleazele sunt enzime care ataca acizii nucleici fie de la extremitatea
5' sau 3' numite i exonucleaze, fie din interior sau endonucleaze.
147

ARNazele sau RNazele sunt endonucleaze care hidrolizeaz puntea

fosfodiesteric.Tipuri de RNaze: A, T1 i H.
- RNaza A extras din pancreasul de bovine distruge ARN monocatenar
ndeosebi dup resturile C i U. Hibrizii ADN-ARN i ADN dublu catenar sunt
rezisteni.
- RNaza T1 distruge ARN monocatenar dup resturile G. La fel hibrizii
ADN-ARN sunt rezisteni. RNazele cliveaz la nivelul celor 4 nucleotide.
- RNaza H izolat din E.coli distruge ARN din hibrizii ADN/ARN.
ADN rmne intact. ARN marcat i dublu catenar nu este distrus.
Aplicaii: test de protecie a RNazei; distrugerea ARN dup
revertranscripie pentru sinteza celui de al doilea lan ADN; detectarea
mperecherilor greite; NASBA.
Nucleaza S1 lizeaz ADN i ARN monocatenar. Hibrizii ADN-ARN,
ADN i ARN dublu catenar sunt rezisteni.
Aplicaii: supresia extremitii protruzive simplu catenare din ADN
dublu catenar; distrugerea ADN monocatenar; cartografia ARN transcris.
Mung Sean nucleaza
Extras din fasole soiul Mung aciunea fiind identic cu a nucleazei S1.
Acioneaz asupra ADN i ARN monocatenar, hibrizii ADN-ARN i ARN
dublu catenari sunt rezisteni.
Aplicaii: supresia extremitii protruzive; cartografierea ARN transcris.
Exonucleaza III, este o nucleaz care atac acizii nucleici de la 3'-5'
spcific. ADN dublu catenar posed extremitatea 5' protruziv sau cu capete
drepte.
Are activiti de: ribonucleaza H, 3' fosfataza i endonucleaza specific
situsurilor purinice A i G.
Aplicaii: mutagenez dirijat; generarea de deleii n interiorul ADN
dublu catenar; prepararea ADN simplu catenar pentru reacia de
secvenializare.
Exonucleaza T7 este extras din bacteriofagul T7 hidrolizeaz ADN
dublu catenar de la 3'OH la 5'PO4. Enzima progreseaz de la 5' la 3' pn la
ADN monocatenar corespondent i contribuie la degradarea a 50% din ADN
iniial.
Aplicaii: generarea matricii de ADN monocatenar pentru
secvenializare prin metoda Sanger; sterilizare pre PCR.
Lambda exonucleaz care degradeaz extremitatea 5'fosforilat a
ADN dublu catenar. Are proprietatea de utilizare pentru a obine lanuri simple
dup PCR. Pentru realizarea PCR se utilizeaz dou amorse, una fosforilant n
5' i alta nefosforilant n 5'. Dup PCR i tratament cu lambda exonucleaz
unul din dou lanuri este distrus permind obinerea de ADN monocatenar.
148

Aplicaii: obinerea ADN monocatenar pornind de la dublucatenar

pentru secvenializarea lanului simplu.
DNaza sau deoxiribonucleaza I
Aceast endonucleaz este extras din pancreasul bovin, secionnd
ADN att cel monocatenar ct i cel dublu catenar.
Aplicaii: secioneaz aleatoriu ADN dublu catenar, etap prealabil a
unui marcaj prin translaia seciunii; degradarea ADN n prezena ARN; studiul
interaciunii ADN/proteine prin tehnica DNaz I prin amprentarea ADN. n
aceast tehnic secvenarea ADN care interacioneaz cu o protein este
protejat de liz prin DNaza I.
Uracil N-DNA glicozilaza (UNG sau UDG) enzim rspndit la
bacterii, face parte din sistemul de reparaii al ADN. n vivo rolul este de
retragere, ndeprtare a reziduurilor de uracil care sunt generate prin
dezaminarea spontan a reziduurilor de citozin n interiorul moleculelor de
ADN. UNG repereaz resturile de U n interiorul lanului de ADN i le
excizeaz. Altele intervin n sistemul de reparaii nsernd bazele corecte,
timina, n lanul de ADN la nivelul situsului abazic.
n vitro aceast enzim st la baza unui sistem eficace care poate fi pus
n valoare pentru a steriliza produii generai de PCR i pentru a limita riscul de
contaminare inerent n reacia de amplificare genic. Aceast enzim care nu
este termorezistent funcioneaz corect la 50C i i pierde activitatea la
temperaturi nalte. Este vorba de o proteina monomeric care acioneaz la
temperatura ambiant. Renaturarea ei parial i confer o activitate remanent
n sistem de anticontaminare. Este necesar activarea definitiv prin adiia OH
0,1M sau de cloroform.
Recent a fost propus UNG modificat care este relativ termostabil. n
acest caz nu este necesar adugarea unui agent chimic pentru inactivare. Ea
distruge ampliconii contaminai la 20 i o simpl nclzire la o temperatur de
peste 70C poate fi suficient.
Aplicaii: sistem anticontaminare n cursul reaciei de amplificare.
Alte enzime
Inhibitorii de RNaz
Inhib activitatea RNazelor i mpiedic distrugerea ARN de ctre
acestea.
Aplicaii: protejeaz ARNm n cursul RT; crete randamentul sintezei
sondelor de ARN cu ajutorul ARN polimerazelor; toate aplicaiile n care exist
riscul de degradare a ARN de ctre RNaz
Proteinaza K, enzim utilizat de extracia acizilor nucleici. Diger
celule ntregi, nucleul chiar esuturi fcnd astfel accesibil ADN i ARN.
149

Enzima este stabil la 40-60Ci eficace n prezena detergenilor, dintre care

cel mai bun este SDS anionic.
Ali detergeni neionici pot fi utilizai Non I, P40 i TWIN20.
Ea i pierde activitatea proteazic la temperatua de 90C.
Aplicaii: extracia acizilor nucleici.
Agaraza permite eliberarea acizilor nucleici dintr-un gel de agaroz.
Diger agaroza, dar nu distruge acizii nucleici. Este un mijloc de extragere a
ADN din agaroz.

Extracie i purificarea ADN

Extracia ADN
Comport: recoltarea, pstrarea probelor i extracia propriu-zis
Probele ADN trebuie potejate de: inhibitori ai enzimelor utilizate (inhibitori
ai Taq polimerazei), nucleaze care pot degrada acizii nucleici (ARN este n
special sensibil).
Principalele condiii de conservare a probelor pentru biologie
molecular
Pentru studiul ADN

Temperatura
Temperatura
ambiental
2-8C

-20C

Prob
1-8 zile chiar pentru snge
total. Probele prin tergere
sunt stabile 24 ore
3-8 zile
Evitarea conservrii sngelui
total la frig (se lizeaz
globulele roii)
Prin tergere sunt stabile 10
zile
Urina- probele sunt stabile 4
zile
Da
150

esut
Nu

ADN
Nu

A se evita 14 Stabil 6 luni

maxim

2 sptmni

1 an sau mai

-80C

Nu congelat din snge total

puin
Dup liza globulelor roii
(prin clorur de amoniu exp.)
este posibil conservarea
Da
S ani sau mai Mai puin de
Nu se coaguleaz din sngele puin
7 ani
total
Dup liza globulelor roii
(prin
clorur
amoniu)
conservare posibil
Stabil de la o lun la 1 an

Frecvent sunt probe totale de snge ele pot fi separate n plasma, ser i
leucocite. Alte medii curent folosite sunt din:culturi (fagi, bacterii), urin,
lichid cefalorahidian, expectoraii, probe rezultate prin puncionare, biopsie,
etc.
Condiii de prelevare
Probele trebuiesc recoltate steril.
O prob de snge poate fi colectat n tub uscat dac cercetrile obinute se
realizeaz din ser pe EDTA sau ACD dac se lucreaz pe plasm. Este
recomandat lizarea globulelor roii nainte de extracia ADN (de exemplu liza
cu clorur de amoniu) apoi purificarea globulelor albe. Dac se utilizeaz un
anticoagulant trebuie s inem cont de natura sa. Heparina este un inhibitor
pentru Taq polimeraz mai mult sau mai puin dificil de eliminat dup procesul
de extracie utilizat. Probele de snge total destinat unei analize genetice ADN
pot fi trimis prin pot. Acesta poate fi conservat la 4C cteva sptmni
esuturile sunt bogate n nucleaze (proteaze, DNaze i RNaze).
n cazul LCR este recomandat pstrarea la frigider, imediat dup recoltare.
Este cunoscut faptul c LCR i urina sunt medii bogate n inhibitori.
Principalele condiii de conservare a probelor pentru biologie
molecular. Pentru studiul ARN

151

Temperatura
Temperatura
ambiental

2-8C

-20C

-70C

Prob
De evitat
Punerea n ghea imediat
ARN trebuie extras n
decurs de 3 ore
ARNr este stabil mai
multe luni, conservat n
soluii coninnd ageni
hautropici
Se extrage ARN imediat
Nu se congeleaz snge
total
Dup liza globulelor roii
(prin clorur de amoniu
exp.)
este
posibil
conservarea
se evit 14 maxim
Nu congelat din snge
total
Dup liza globulelor roii
(prin clorur de amoniu
exp.)
este
posibil
conservarea la -20C
Bacterii i ciuperci sunt
stabile n mai puin de 2
luni

esut
ARN
De evitat
De evitat
Tratarea esutului
imediat

A se evita
maxim

14 De evitat

De evitat
Dac
nu
este
disponibil
un
congelator
la
-70C
Conservarea
n
tuburi tratate cu
diethylpyocarbonat
(DEPC)
este
recomandat
Nu se coaguleaz din Mai puin de 2 ori
sngele total
Dup liza globulelor roii
(prin clorur amoniu)
conservare posibil
la
-70C
Bacteriile i ciupercile
sunt stabile mai puin de
un an

De evitat
Stocarea n
etanol

Da
Se conserv
n mediu de
etanol
Stabil
la
infinit

ARN este o molecul fragil, foarte sensibil la RN azele care sunt

frecvente n mediu pn i pe degete. n cazul studiilor de ARN probele sau
fraciunile lor trebuiesc congelate la -80C n primele 3 ore dup recoltare.
152

Probele pot fi expediate n ghea carbonic. n timpul manipulrii este

indispensabil s evitm contaminarea probei i ARN s fie conservat (este
fragil). Se recomand: purtarea mnuilor, autoclavarea materialelor, utilizarea
pipetelor speciale prevzute cu filtre sterile la capete.
n funcie de tipul ADN-ului se cunosc 2 tehnici de extracie pentru
tipul genomic i pentru cel plasmidic.
Extracia ADN cromozomial sau genomic
Metoda fenol cloroform
Extracia ADN din snge total este cea mai utilizat. Parcurge 3 etape:
-liza celulelor i denaturarea complexelor nucleoproteice pentru eliberarea
ADN din mediul intracelular
-extracia propriu-zis pentru eliminarea proteinelor
-precipitarea i purificarea ADN
Obinerea fraciunii de extras
n practic ADN situat n celulele nucleate se recupereaz centrifugnd
leucocitele pe baza gradientului de densitate. Se pot centrifuga tuburile la
vitez joas i se recolteaz de la interfa dintre plasm i coagulul de globule
roii. Dup splare cu soluie tampon proba este gata de extracie.
n cazul mycobateriilor eliberarea acizilor nucleici necesit un tratament
mai drastic pe baz de ultrasunete i sau asociate cu sod caustic i nclzire,
sau adugnd detergeni SDS i proteinaza K. Este indispensabil spargerea
peretelui mycobacterian care este foarte rezistent.
Liza celulelor i denaturarea complexelor nucleoproteice pentru
eliberarea ADN din mediul intracelular
Un sistem utilizat curent adaptat la toate tipurile de probe este amestecul
detergent/proteinaz K care disociaz esuturile, celulele, capsida virusurilor i
eliberaaz acizii nucleici.
Proteinaza K, enzim utilizat pentru extracia acizilor nucleici.
Diger celule ntregi, nucleul chiar esuturi, fcnd astfel accesibil ADN i
ARN. Este stabil la 40-60C i eficace n prezena detergenilor, dintre care cel
mai bun este SDS (dodecylsulfat de sodiu) anionic. Ea i pierde activitatea
proteazic la temperatua de 90C.
Ali detergeni neionici pot fi utilizai P40 i TWIN20.
Detergenii cei mai utilizai: SDS care este agent de liz celular dar i
activator al proteinazei K, Sarcosyl Tween 20 i Non/dct P40.
153

Extracia propriu-zis
ADN coninut n lizat este separat de proteine prin tehnica fenol/cloroform.
Fenolul este un agent deproteinizant puternic. Adiia sa la faza apoas are ca
efect denaturarea proteinelor din mediu.Dup centrifugare ele se depoziteaz,
n timp ce acizii nucleici sunt situai n faza apoas.
Dup transferul fazei apose n alt tub, acizii nucleici sunt tratai cu un
amestec cloroform/alcool izoamilic pentru a elimina urmele de fenol (care
este un produs toxic i inhibitor al anumitor enzime inclusiv Taq polimeraza).
n acest stadiu dup centrifugarea i eliminarea fazei organice acizii nucleici se
gsesc solubilizai n faza apoas.
Precipitarea ADN
Permite obinerea ADN pur, concentrat i se face fie cu etanol 100% la
-80C, fie cu izopropanol (fr sruri i la +4C) mai ales pentru probele cu
volum mai mare. Este indispensabil o splare cu etanol 70% pentru eliminarea
srurilor. Precipitatul este transferat ntr-o soluie tampon cu for ionic slab
n general utiliznd tampon TE (Tris 10 mM i EDTA 1 mM).
Metode alternative de extracie a acizilor nucleici
Tehnica fenol/cloroform este de referin. Fenolul fiind toxic i necesitnd
multe manipulri n ultimii ani s-au dezvoltat alte metode de extracie.
ADN poate fi extras din snge total fr separarea prealabil a leucocitelor.
Se realizeaz prin hemoliz cu soluie de clorur de amoniu n ap steril
urmat de tratament cu proteinaz K n prezena de Tween 20 detergent care
lizeaz celule. Proteinele sunt apoi eliminate prin precipitare selectiv iar acizii
nucleici sunt purificai prin precipitare n prezena de izopropanol.
Utilizarea agenilor haotropici ca iodura de sodiu sau tiocianat de
guanidin urmat de precipitare cu alcool (etanol sau izopropanol) produce
acizi nucleici compatibili cu tehnicile de amplificare genic.
Metoda poate fi combinat cu utilizarea de bile sticl sau silice (cuar).
Captarea pe bile magnetice
ADN eliberat prin simpla liz a celulelor cu ultrasunete poate fi de calitate
suficient pentru a fi amplificat. n unele cazuri o simpl eluie este suficient
pentru eliberarea acizilor nucleici i pentru a-i face disponibili pentru PCR. Are
aplicaii n microbiologie. Dac se dorete obinerea unui ADN de mare
puritate trebuie fcut extracie cu fenol cloroform sau rini anionice.
Astzi exist numeroase kituri de extracie.
Extracia ADN plasmidic
154

n cercetare plasmidele sunt utilizate pentru inserarea unor secvene care

sunt multiplicate concomitent n celule gazd (E.coli). Extracia are ca scop
separarea ADN plasmidic de cel al celulei gazd. Tehnica cea mai frecvent
include o etap de liz alcalin n prezena de SDS n care cele dou tipuri de
acizi nucleici sunt denaturai. pH neutralizat rapid face ca ADN plasmidic s
fie solubil iar cel cromozomial se transform n agregat insolubil incluznd i
proteine denaturate i SDS precipitat.
Cantitatea ADN obinut din diferite materiale biologice
Material biologic
ADN g
106 celule
5-10
Celule bucale dup splarea gurii
0,1-1
Biopsia vilozitii coriale cantitate 1-3
mic biopsie
Sperm 30 l
5-10
Rdcin pr
10-20 mg
50 g esut
0,1-10
Dup centrifugare ADN plasmidic coninut n supernatant, este precipitat
cu etanol i depozitul dup centrifugare este eluat cu TE sau ap steril. Exist
numeroase variante. Utilizarea de cuar, rini, ageni haotropici i kituri pe
baza acestor procedee. Tehnica fenol/cloroform este adaptat extrciei ADN
plasmidelor.
Extracia ARN
Eliberarea ribonucleazelor
RNazele sunt ubicvitare i dificil de inactivat, deoarece spre deosebire de
ADNaze funcionarea lor nu necesit cofactori. Unele esuturi ca pancreasul,
sunt foarte bogate n RNaze. Dei nu este posibil s le eliminm, ele sunt
capabile s se renatureze dup supunerea la oc termic. Totui dup nclzire
adaosul de mercaptoetanol agent reductor, ajut la pstrarea RNazelor n
stare denaturat mpiedicnd reformarea punilor disulfidice. Este
indispensabil neutralizarea aciunii lor n lizatul celular tratnd proba cu
detergeni i ageni ca mercaptoetanol i tiocianat de guanidin.
n laborator sunt dou surse de contaminare cu RNaze: minile operatorului
i germenii n suspensie din aer care se depun pe sticlrie i consumabile. Deci
este esenial s se lucreze permanent cu mnui, s se utilizeze materiale de
unic folosin, sticlria s fie tratat cu dietilpirocarbonat (DEPC 0,1%)
inhibitor puternic de RNaz - apoi autoclavat (DEPC intr n reacie cu bazele
155

purinice), fie s fie supus la temperaturi foarte mari (200C) la autoclav fr

tratament cu DEPC.
Materialul plastic este decontaminat cu sod caustic 0,1 N i EDTA 1 mM
apoi splat cu DEPC. Reactivii i tampoanele trebuie tratate cu DEPC apoi
autoclavate. Pentru tamponul TRIS nu se face autoclavare dar se utilzeaz ap
tratat cu DEPC pentru prepararea tamponului. Apa deionizat este n principiu
lipsit de ARNaz.
Sunt necesare trei etape succesive pentru obinerea ARN purificat.
1. Liza celular. Se folosesc dou grupe de detergeni puternici care inhib
RNazele. n prima grup agentul disociant utilizat este tiocianatul de
guanidin (GTC) iar n a doua se asociaz cu mercaptoetanol. Ambii sunt
inhibitori de RNaz. Utilizarea combinat permite disocierea proteinelor, liza
celulelor, inactivarea RNazelor i denaturarea ARN. Uneori adugarea de
ARNt amelioreaz extracia unor cantiti mici de ARN.
Dac se dorete eliminarea riscului de contaminare ARN cu ADN este
necesar tratarea cu DNaz. Tehnica unete metode care necesit utilizarea
fenolului i a detergentului. Adesea se adaug un inhibitor de RNaze /RNasin)
izolat din pancreas de bovine. RNazele sunt de asemenea inactivate cu SDS,
proteinaza K.
2. Extracia propriu zis a ARN
ARN este extras cu fenol/cloroform. Separarea se face pe baza precipitrii
diferite a ARN i ADN n funcie de pH. n condiii de pH acid ARN rmne n
soluie apoas.
n mediu alcalin ADN rmne n soluie apoas.
3.Precipitarea ARN. Se efectueaz similar cu ADN cu izopropanol sau
etanol de asemenea se face splare cu etanol 70%.
ARN se mai poate obine cu bile magnetice.
Exist numeroase kituri de extracie rapid.
Dozarea ARN. Poate fi necesar n Northern blot, RNazin Protein Assey.
Spectrofotometria. Este cea mai utilizat i msoar densitatea optim la 260280 nm a unei diluii de ARN.

Sinteza unui ADNc in vitro

Manipularea i studiul ARN este diferit din cauza marii sensibiliti la
ribonucleaze, care-l distrug. Este necesar recopierea secvenei de ARN pentru
a crea o structur stabil i care va fi amplificat n funcie de necesiti.
ARNm purificat, utilizd cromatografia prin afinitatea pe o coloan de
oligodezoxitimidina este legat n prima etap cu oligonucleotide poliT care se
156

ataeaz la coada polyA. Pornind de la extremitatea 3 a acestei amorse poly

T, transcriptaza invers, care este o ADN polimeraz, sintetizeaz un lan de
ADN complementar al mesagerului de pornire (fig. 87).
Odat ce s-a realizat aceast sintez se degradeaz ARN printr-o baz
tare sau o ribonucleaz H specific. Lanurile de ADN constituite formeaz
spontan o bucl la extremitatea 3, sub forma de agraf, care se hibrideaz pe
ea nsi. Extremitatea 3 a acestei bucle va servi ca situs de demaraj pentru
ADN polimeraza, care va sintetiza un lan de ADN complementar primei. O
ribonucleaz specific ADN-ului monocatenar va suprima bucla la extremitate.
ADNc dublu catenar este sintetizat. Se poate astfel constitui att ADNc ci
ARNm exist ntr-o celul; ansamblul acestor ADNc formeaz o banc de
ADNc.

Fig. 87 Sinteza unui ADNc.

Electroforeza
Electroforeza este o metoda de separare a particulelor incrcate electric prin
migrare diferenial sub actiunea unui cmp electric. Ne permite cuantificarea
de manier precis a ADN i ARN, iar n anumite cazuri, aprecierea cantitii
de acizi nucleici prezeni (prin raportarea la un marker de talie cunoscut).
Se poate utiliza hrtie, acetat de celuloza, gel de poliacrilamid, gel de
agaroz, gel de amidon, gel de siliciu. Exist dou tipuri de gel utilizate mai
frecvent agaroz i poliacrilamid care permit o separare mai bun.
Agaroza, polizaharid extras dintr-o varietate de alg roie, este un
polimer al unei uniti dizaharidice; la nclzire n soluii apoase formeaz
hidrosoli, care la rcire se transform n hidrogel.
157

Electroforeza n gel poliacrilamid

Gelul de poliacrilamid se formeaz prin polimerizarea vinilic a
monomerilor de acrilamid CH2=CH-CO-NH2 n lanuri lungi de
poliacrilamid i prin reticularea lanurilor n urma includerii unui comonomer
bifuncional adecvat de obicei N, N metilen bisacrilamid (Bis).
CH2=CH-CO-NH-CH2- NH-CO-CH=CH2
Reacia de polimerizare d natere n mod aleatoriu unor asemenea
lanuri de poliacrilamid ce ncorporeaz o mic cantitate de molecule Bis,
acestea putnd reacioana cu alte grupuri ale altor lanuri determinnd
reticularea i formnd o reea.
Concentraia poliacrilic utilizat determin lungimea medie a lanului
de polimer, n timp ce concentraia de Bis determin gradul de reticulare.
Ambele concentraii decid proprietile fizice ale gelului precum densitatea,
elasticitatea , rezistena mecanic i dimensiunile porilor.
Ali ageni de reticulare sunt DHEBAEDIABACDATB. Viteza
reaciei de polimerizare depinde de proporia de agent de reticulare folosit (C
%).
n trecerea prin mediul de agaroz sau acrilamid, moleculele se separ
n funcie de dimensiune. Cele mai mari sunt reinute, iar cele mai mici
migreaz. Acrilamida are putere mai mare separatoare dect agaroza ns este
mai toxic.
Tehnica electroforezei
Dup formarea, turnarea gelului, trasarea godeurilor i solidificarea
acestuia se vor introduce probele de ADN.
n primul godeu se introduce un marker cunoscut, care permite
estimarea mrimii fragmentelor de ADN. Se utilizeaz frecvent ADN de fag
restrictat cu o anumit enzim. Fragmentele rezultate au o mrime cunoscut,
ceea ce permite folosirea lor ca etalon (fig. 88).
n godeurile rmase se introduc pe rnd probele care urmeaz s fie
analizate.
Se adaug doi colorani: unul bine vizibil pe gel care va migra foarte
rapid, albastru de bromfenol, pus naintea fragmentelor de ADN pentru a
delimita distana parcurs pn la anod. Al doilea, bromura de etidiu, care se se
intercaleaz ntre bazele de acizi nucleici i imprim o culoare oranj cnd
acestea sunt expuse la lumina UV. Astfel, moleculele de ADN complexate cu
bromur de etidiu devin vizibile.
Aparatul de electroforez se cupleaz la o surs de curent . Polul pozitiv
este opus godeurilor.Cnd frontul de migrare ajunge n apropierea captului
opus al gelului, se ntrerupe sursa de curent. Se scoate tvia cu gel i se
158

vizualizeaz n UV la 254 nm, se vor fotografia fragmentele de ADN digerate

n gel (fig. 89).

Fig. Electroforeza. Aparat de electroforez.

-

Distana de migraie este proporional masa molecular: exist o

proporionalitate invers ntre mobilitatea i logaritmul masei, dar
relaia este valabil pentru moleculele liniare avnd sub 20 kb. Se
determin astfel mrimea fragmentelor de restricie obnute i se
compar cu a celor de mrime cunoscut.
migrarea moleculelor mari de 20kb este aproape independent de
mrime i nu mai apare o relaie de linearitate (fig);

Fig. Tipuri de electroforeza n funcie de mrimea moleculelor.

159

conformaia cerc deschis CD/OC - open circle, cerc covalent nchis

CCI/CCC covalenty closed cirle. La aceeai mas molecular,
CCI au cea mai mare mobilitate pe cnd conformaia CD este mai
lent. Moleculele liniare au o mobilitate intermediar.
tamponul de electroforez folosit este Tris Acetat (TAE).

Dup migrare probele se citesc la UV.

n unele cazuri moleculele care trebuiesc separate sunt marcate
ncorporarea unui izotop radioacitv care permite detectarea
autoradiografie. Particulele energetice emise de radioizotop imprim un
fotografic pe gel. Se developeaz pentru a se vedea benzile negre
corespund moleculelor marcate radioactiv.

prin
prin
film
care

Efectele dimensiunii porilor

n mediile gelificate, trecerea oricrei particule este ntrziat de
structura matricei i depinde de mrimea relativ a particulelor i a porilor din
reeaua gelului. Att dimensiunile ct i sarcina moleculelor, au un rol
important n procesul de separare.
n gelurile de agar dimensiunea porilor este mare.

Fig. Variaia concentraia agarozei i acrilamidei n funcie de lungimea

acizilor nucleici.
Poliacrilamida are avantajul uurinei cu care mrimea porilor poate fi
modificat prin i a proporiei de agent de reticulare. Pe msura creterii
proporiei de agent de reticulare cinetica de reacie este ncetinit i matricea de
gel devine mai puin omogen.
concentraia acrilamidei

160

Fig. Migrarea diferit a moleculelor n gel n funcie de mrimea

moleculelor.
Alegerea gelului i a sistemului tampon adecvat
De exemplu un amestec de proteine virale sau acizi nucleici cu greuti
moleculare mari ar putea impune alegerea unui gel cu pori mari avnd o
concentraie de poliacrilamid T sub 5% pentru a evita efectul excesiv de sit
molecular. T=15-20% sau mai mult se preteaz pentru polipeptide ori histone
cu greutate molecular mic, aceste concentraii accentund diferenele minore
de dimensiuni n cadrul aceluiai nivel de greutate molecular.
Compoziia gelurilor standard cu SDS avnd proporii diferite
Compusul
T=5
T = 7,5
T = 10
T = 15
Acrilamid (g)
4,85
7,28
9,7
14,5
Bis (g)
0,15
0,22
0,30
0,45
Tampon pentru gel, fosfat de
50
50
50
50
sodiu 0,2M, pH = 7,2 ml
SDS (g)
1,0
1,0
1,0
1,0
H2O (ml) ad 95 ml apoi
0,15
0,15
0,15
0,15
TEMED
Persulfat de amoniu 1,5%
5
5
5
5
(ml)
La separarea unui amestec de proteine este puin probabil alegerea
acelui set de condiii s poat garanta cel mai bun grad de separare a fiecrei
componente de celelalte.
Dac ntr-un gel se obine o singur band aceasta nu conine n sine
dovada prezenei unei singure componente omogene.
Rolul pH
161

Proteinele bazice, histonele, se separ optim la pH acid unde au

mobilitatea maxim, n vreme ce marea majoritate, cu punctele izoelectrice la
pH 4 i 7,5, deci slab acide, tind s se separe optim n gelurile alcaline cu pH
cuprins ntre 8 i 9.
n majoritatea sistemelor tampon, tria ionic are valori tipice ntre
0,05-0,1M dar se pot folosi i concentraii sczute pn la 0,025 M sau crescute
pn la 0,5M.
Gelurile plate verticale
Grosimea gelurilor 0,5-1,5 mm. Cu ct sunt mai subiri cu att sunt mai
rapide i eficiente pentru colorare, decolorare, iar rcirea din timpul
electroforezei este mai rapid i mai uniform. Acesta permite aplicarea unei
tensiuni mai mari i a unor timpi de aciune mai redui.
Gelurile sunt obinute n forme separate care ulterior sunt inserate n
aparat cu ajutorul unor garnituri de cauciuc i introduse n tamponul ce
reprezint mediul de rcire (rcire realizat prin mijlocirea tuburilor de ap).
Un colorant trasor este albastru de bromfenol. Acesta migreaz cu o
vitez mai mare dect oricare dintre componententele macromoleculare ale
probei i indic momentul stoprii electroforezei.
Gelurile se introduc n baie de colorant cu bromur de etidiu 3 minute,
apoi se examineaz la o lamp cu ultraviolete.
Lipoproteinele, au caracter parial proteic pot fi colorate naintea
electroforezei pentru a le deosebi de proteine. Se folosete Sudan Black B.
Dup electroforez localizarea lipoproteinelor electroforetice este posibil cu
ajutorul unui colorant preparat prin dizolvarea a 500 mg Sudan Black B n 20
ml aceton i adugare a unui amestec de 150 ml acid acetic i 80 ml ap.
Amestecul se agit 30 minute, apoi se centrifugheaz.
Exist densiometre laser care scaneaz gelurile la nivele de rezoluie
extrem de ridicat. Rspunsul scanner-ului poate fi computerizat ceea ce
perimite nregistrarea, redarea, evaluarea i stocarea datelor pe disc sau
imprimarea lor, precum i compunerea a dou geluri diferite.
Semnalul densiometric iese pe un nregistrator i este cuantificat prin
msurarea suprafeelor de sub peak-urile individuale.
Se poate recurge la integrarea electric sau prin achiziionarea de date
pentru calcul computerizat al suprafeelor de sub peak, metod folosit pentru
scanarea unui numr mai mare de geluri. nlimea peak-ului depinde de
distana materialului parcurs prin gel.
Electroforeza proteinelor
162

Proteinele se pot separa prin electroforez ca i acizii nucleici. Suportul

poate fi acetat de celuloz, pentru proteinele din serul uman, sau hrtie ntr-un
tamponde pH de 8,6. Benzile corespunztoare proteinelor separate, sunt
vizualizate prin colorare cu un colorant specific i printr-o scanare
densiometric se obin indicaii despre cantitatea relativ a proteinelor din
fiecare band separat. Dei mobilitatea proteinelor depinde n special de
sarcina electric relativ a acestora, dimensiunea proteinelor joac de asemenea
un rol important i aceasta contribuie desigur la poziia benzii corespunztoare
moleculei de globulin.
Electroforeza proteinelor n gel de poliacrilamid
Gelul de poliacrilamid se poate folosi n locul acetatului de celuloz
sau al hrtiei pentru separarea proteinelor native. Un astfel de gel este folosit n
mod obinuit n prezena dodecil sulfatului de sodiu (SDS). n acest caz
proteinele oligomerice (alctuite din cteva uniti polipeptidice) se pot separa
n subunitile lor individuale.Proteinele se separ ntr-o soluie SDS 1%. Acest
detergent desface majoritatea legturilor dintre proteine i dintre acestea i
lipide. Pentru a desface i punile disulfurice, se adaug foarte des i 2mercaptoetanol. Mobilitatea electroforetic a majoritii proteinelor (dar nu i a
glicoproteinelor), depinde de dimensiunea lor, deoarece sarcina negativ adus
de moleculele SDS legat de protein este mult mai mare dect sarcina net a
proteinei nsi.

O distribuie specific (pattern) de benzi se obine la colorarea gelului

cu Albastru Comassie.
Gelul de agaroz poate fi folosit n locul celui de poliacrilamid n cazul
proteinelor mai mari sau pentru a obine o separare diferit n absena SDS.
Se poate aplica metoda PAGE bidimensional, folosind condiii de
lucru diferite de cele dou direcii de migrare: de exemplu un gradient constant
de pH (pH 4-7%) pe o direcie i un pH 11-14%poliacrilamid n cealalt
direcie.
163

Tipuri de electroforeze utilizate n patologia molecular

Polimorfismul conformaional monocatenar SSCP single straind
Polimorfismul conformaiei monocatenare sau tehnica SSCP se bazeaz
pe comportamentul electroforetic al ADN monocatenar. Asfel vor putea fi
difereniate dou alele ale aceleai gene, pe gelul de poliacrilamid
nedenaturant.
Exist programe informatice care au mrit fezabilitatea DGGE ns nu
i pentru SSCP.
Electroforeza ADN monocatenar sau tehnica SSCP
Metoda se aplic produilor PCR. Dup denaturare acetia vor migra
sub form monocatenar pe gel nedenaturant. Se observ diferena de
mobilitate pe gel ntre ADN mutant i normal (fig..). Detectarea mutaiei se
face fie prin marcaj radioactiv a amorsei fie prin revelarea gelului prin coloraie
cu sruri de argint.
Se pot studia fragmentele de 300-400 pb, detecia fiind de 90% i
diminua proporional cu mrimea fragmentului analizat. n migraia pe gel de
poliacrilamid banda anormal poate fi excizat pentru a fi analizat. Dup
eluie se poate efectua PCR, purificarea fragmentelor sau reacia de
secvenializare.
Aceasta permite de exemplu detectarea unei alele mutante (eventual
responsabil de o boal genetic) la un individ. Aceast tehnic este simplu de
realizat dar comport dou incoveniente majore:
-comportamentul electroforetic al fragmentelor monocatenare este
imprevizibil (foarte dependent de temperatur i de condiiile de electroforez),
- pentru fragmentele destul de mari de 400 pb nu pot fi detectabile toate
mutaiile (metoda permite detectarea n special a variaiilor de tip
microinseria, deleia).
n practic produsul amplificrii PCR dublu catenar corespunztor
secvenei de studiat este denaturat prin nclzire la 95C apoi rapid rcit la
ghea; moleculele monocatenare nu au timp s se reasocieze la nivelul zonelor
cu secvene complementare. Fragmentele de amplificare neasociate sunt apoi
separate prin electroforez. La un individ homozigot se observ n general n 2
benzi, adic dou molecule de ADN monocatenare care au conformaie
secundar, uor diferit. La un individ heterozigot se observ n general patru
benzi. n unele cazuri benzile supranumerare pot aprea ca urmare a existenei
mai multor conformaii semistabile pentru acelai lan.
SSCP este adaptat i la electroforeza capilar. Migrarea se poate realiza
de asemenea ntr-un secvenializator automat cu amors sau didezoxinucleotid
marcat cu fluorocrom.
Tehnica heteroduplex
164

ADN dublu catenar n prezena unei mperecheri greite sufer o

modificare a conformaiei spaiale care se va putea vizualiza pe gel de
acrilamid nedenaturant. ADN hibridat prin complementaritate cu o mutaie
(mperechere greit) este numit heteroduplex. ADN hibridat normal se
numete homoduplex. mperecherea greit este responsabil de formarea unui
heteroduplex care modific conformaia spaial a ADN dublu catenar.
Obinuit se produce reducerea mobilitii heteroduplexului fa de homoduplex
n gel de acrilamid nedenaturat i favorizeaz identificarea mutaiilor
punctuale.
Exist un gel adaptat acestei tehnici Hydrolink MDE din
poliacrilamid.
Prin PCR se multiplic ADN de studiat n 30-40 cicluri. Se termin la
72C printr-o extensie final de 5 minute. Apoi se face o denaturare; urmeaz o
renaturare prin scderea temperaturii sub cea de denaturare fie 72 5 minute
sau 40C 5 minute sau la temperatura mediului 30-60 minute. n tubul de
reacie se va gsi un amestec de hetero i homoduplex. Heteroduplexul va
migra mai lent pe gel MDE. Cele dou benzi de heteroduplex i cele dou de
homoduplex nu sunt difereniabile. Pentru ameliorarea puterii de separare se
adaug un agent denaturant (uree 10-15% sau glicerol 10%). Ureea evit
difuziunea benzilor. Produii amplificai de 100-400 pb dau rezultatele cele mai
bune.
Tehnica este diferit de DGGE dar profilul de migraie al homo i
heteroduplexului este asemntor.
Dimensiunile gelurilor
Exist dup autori grosimea de 0,4 mm. Migraia depinde de
dimensiunile fragmentelor studiate. Relevarea se face cu bromur de etidiu sub
UV sau dup coloraie cu argint.
Migraia se mai poate face pe un automat de secvenializare dup
amplificare cu amors fluorescent sau cu marcare radioactiv.
Deleiile i inseriile de peste 3 pb se detecteaz uor fiind foarte
stabile. Mutaiile punctuale necesit determinarea condiiilor experimentale
optime datorit influenei factorilor ca temperatura, fora ionic a tamponului,
natura gelului, natura substratului bazelor vecine.
Unii autori au propus adugarea unui mutant cunoscut care optimizeaz
formarea heteroduplexurilor. Orice nou mutaie va da un aspect diferit al
profilului de migraie. Acelai mutant poate fi utilizat pentru un locus dat
generator universal de heteroduplex i s detecteze toate mutaiile.
SSCP-ARN
Dup PCR ADN multiplicat este transformat n ARNc prin activarea
T7 ARN polimerazei de ctre un promotor prezent pe unul din cele dou
165

amorse. ARNc va fi depus pentru migraie n gel PAG nedenaturant ca i ADN

aceasta este SSCP pentru ARN. Metoda este mai sensibil dar mai dificil
pentru c necesit transformarea ADN n ARN cu amors care conine un
promotor nainte de migrarea acestuia pe gel.
Electroforeza ADN n gradient de gel denaturant- DGGE
Aceast tehnic se bazeaz pe fuziunea ADN plasat n condiii
denaturante i permite detectarea unei mutaii ntr-un fragment de ADN.
Principiu: moleculele de ADN supuse electroforezei n gel de
concentraie crescnd de ageni denaturani trece progresiv sub form
monocatenar pe msur migraiei n gel. Fenomenul nu se produce continuu ci
prin fuziunea succesiv a segmentelor de ADN numite domenii.
Fiecare domeniu are o temperatura de fuziune determinat de secvena
sa. Pentru un fragment de ADN dat domeniul corespunde regiunii n care Tm
este cea mai mic i denaturarea se face prima.
Structura deschis astfel format frneaz migrarea ADN care este mult
diminuat fa de acelai fragment n forma nedenaturat. Dac un fragment de
ADN care poate conine o secven normal sau mutant prezint o mutaie
punctual mic, deleie sau inserie, aceasta afecteaz Tm al domeniului
corespunztor. Denaturarea domeniului mutant se face mai devreme sau mai
trziu deci migraia difer fa de ADN nemutant, fenomen vizibil pe gel.
Dac mutaia afecteaz un domeniu cu Tm crescut ea nu poate fi
detectat ntruct fuziunea acestui domeniu este urmat de trecerea sub form
monocatenar; fenomenul poate fi evitat prin adugarea unui domeniu
suplimentar extrem de stabil la o extremitate a ADN de studiat.
n practic PCR se realizeaz cu poriunea secvenei pentru care se
suspecteaz mutaia. Una din cele dou amorse are o coad compus dintr-o
succesiune CG de 30-50 baze la extremitatea 5'. O baz timin se adaug din
timp n timp pentru a deschide un domeniu n timpul denaturrii. Adugarea
acestei cozi GC va crea un domeniu artificial de mare stabilitate datorat
legturii GC. Acest domeniu GC nu se va deschide i nu se va denatura n
gelul denaturant dect foarte trziu cnd concentraia denaturanilor este
crescut. Adugarea domeniului GC crete sensibilitatea metodei. Se poate
nlocui domeniul GC printr-un domeniu chimic derivat de psoralen n 5' a
amorsei. Dup PCR proba este supus la UV de 365 nm crend ntre cele dou
catene o legtur covalent echivalent cu domeniul.
Mobilitatea ADN pe gel de acrilamid a fost modelat de Lernan i
Silversten. Se poate prevedea comportamentul ADN mutant n gelul denaturant
comparativ cu ADN normal pe baza unui model matematic informatizat. Exist
un soft DGGE.
166

Aplicaii ale DGGE este o tehnic rapid de screening a unei poriuni

de genom dup amplificare genic. Are sensibilitate foarte mare detectnd 95%
din mutaii.
Are un rol important n detectarea mutaiilor necunoscute.
Se poate aplica n epidemiologia molecular n anchete familiale. Poate
detecta mutaii punctuale inserii sau deleii. Deleiile mari de 1 sau mai muli
exoni sau o gen nu se detecteaz.
Studiul polimorfismului virusului hipatitei C.
O tehnic derivat din DGGE este electroforez n gel denaturant
constant sau CDGE. Dup DGGE de tatonare a fragmentelor de studiat se
selecteaz concentraia optim de ageni denaturani, iar electroforeza se
efectueaz pe gel de acrilamid cu denaturant constant la 60C . Una din dou
amorse conine domeniul GC.
Aceast tehnic este la fel de sensibil ca i DGGE dar presupune
efectuarea n prealabil a unui DGGE de tatonare pentru stabilirea concentraiei
agenilor denaturani necesari pentru detectarea ADN i a polimorfismului,
chiar dac o singur pereche de baze este substituit ntr-un fragment de ADN.
Aceast metod se bazeaz n acelai timp pe proprietatea de renaturare
a diferitelor lanuri de ADN. Totui spre deosebire de SSCP denaturarea ADN
nu se realizeaz nainte de electroforez ci n cursul electroforezei (fig. 90).
Pentru aceasta, produii de amplificare sunt depui pe un gel, care conine fie o
concentraie crescut de agent chimic denaturant al ADN (uree-formamid n
cazul DGGE), fie o temperatura din ce n ce mai crescut n cursul
electroforezei (gradientul de agent denaturant este convertibil n gradient de
temperatur. La 100% denaturant corespunde la o concentraie de 40%
formamid i 7M uree)

167

Fig. 90. Electroforeza ADN n gradient de gel denaturat

TGGE electroforeza ADN n gel denaturant n gradient de

temperatur
Identic cu DGGE dar gradientul chimic este nlocuit cu gradient de
temperatur utiliznd i un agent chimic (uree, 6M). Se comercializeaz de
Biorad. Sunt tehnici de TGGE pentru determinarea cantitativ a produilor
degenerai.
n cursul electroforezei ADN migreaz la nceput n stare dublu
catenar, apoi ntlnete condiii care denatureaz domeniile de fuziune mai
puin stabile ale moleculei, formnd o structur parial monocatenar numit
ramificat. Aceast denaturare parial antreneaz o reducere a mobilitii sale
electroforetice, fragmentul nu mai migreaz deoarece poziia sa final n gel
depinde exclusiv de temperatura de fuziune (Tm) a domeniului mai puin stabil
a secvenelor nucleotidice. Se estimeaz c n jur de 95% din secvenele
mutante, chiar punctuale din domeniul de fuziune mai puin stabile, pot fi
detectate prin diferene de migrare electroforetic.
Pot fi distini indivizii heterozigoi i homozigoi. Este suficient s se
fac o etap de denaturare/renaturare, dup ultimul ciclu PCR. Se vor forma
atunci prin reasociere a matricei lor alelice monoduplex (2 catene ADN perfect
complementare) i heteroduplex (dou catene de ADN parial complementare).
Prezena de mperecheri greite n heteroduplex va da natere la benzi puternic
reinute pe gel (denaturare rapid i hibrid) care migreaz foarte puin (91).

Fig. 91. Electroforeza ADN n gradient de gel denaturant de

temperatur TGGE.
168

Electroforeza n cmp pulsatoriu

Electroforeza n cmp pulsatoriu a fost inventat de Carle i Olson
(1985), prin studiul cromozomilor la levura Saccharomyces cerevisiae.
Puterea rezolutiv a gelului pe de o parte i modificarea mobilitii
ADN pe de alt parte nu permite o separare bun a moleculelor de ADN mai
mari de 50 kb n gel de agaroz clasic. Aceast tehnic permite observarea
fragmentelor de ADN a cror mrime variaz de la 50Kb la peste 1000 Kb.
Standardele de mrime cele mai utilizate sunt fie multimeri ai genomului
bacteriofagului lamda (50 i 1000 Kb) fie cromozomi de Saccharomiyces
cerevisiae (ntre 250 i 2500 Kb). Fragmentele de ADN sunt supuse la cmpuri
electrice alternative a cror orientare relativ poate varia n funcie de sistem,
de la 90 la 180.
Principiul metodei. Modificnd direcia unui cmp electric n gel de
agaroz se modific conformaia spaial a ADN (elasticitatea sa) i indirect
mobilitatea. Ca efect elasticitatea ADN care poate fi asimilat unei perne de
ln dependent de mrime. Cu ct molecula este mai mic cu att elasticitatea
va fi mai mare. Ea se alungete ca o minge de rugby i mobilitatea va fi mai
mare ntr-un cmp electroforetic dat. Modificnd direcia cmpului electric
timpul petrecut de molecul pentru a-i relua starea de repaus (pern de ln)
i apoi pentru a se alungi (minge rugby) n noua direcie este cu att mai mare
cu ct mrimea moleculei ADN este mai mare. Mobilitatea va fi deci mai puin
important. Se vor putea separa astfel, moleculele mari peste 50 kb pn la 15
Mb. Curentul schimb alternativ direcia i fragmentele sunt reorientate
constant n cursul migraiei. Viteza de reorientare este proporional cu
mrimea moleculei.
Configuraia actual cea mai utilizat este cea n care (CHEF Contour
Clamped Homogeneous Electric Fields) unde unghiul ntre cele dou cmpuri
electrice este de 120. Astfel, moleculele mari vor necesita mai mult timp
pentru a se orienta pe direcia cmpului electric secundar dect cele mici.
Acumularea ntrzierii la fiecare cmp electric duce la separarea moleculelor la
sfritul migrrii. Diferii parametri precum procentul de agaroz, tensiunea
electric aplicat sau temperatura mediului va permite optimizarea rezoluiei
dar parametrul principal este timpul de pulsaie, adic timpii de aplicare a
cmpului electric la fiecare orientare. Aceasta permite favorizarea separaiei
fragmentelor ntr-o gam de mrime aleas.
Electroforeza n cmp pulsatoriu necesit un procedeu specific de
purificare a ADN. Astfel, fragmentele de ADN sunt generate de ctre
endonucleaze de restricie cu frecvena mic de tiere i va permite
vizualizarea genomului n ansamblu, deci a unui ADN cu greutatea molecular
mare. Prepararea probelor impiedic purificarea clasic prin extracie
fenol/cloroform a ADN (fig. 92). Celulele sunt mpachetate ntr-o matrice de
169

agaroz i lizate in situ (prin aciunea lizozimului pentru bacterii, sau a altor
enzime cum ar fi liticazele pentru levuri) cu scopul de a degrada nveliul
celular extern. Apoi aciunea conjugat a unui detergent i a proteinazei K va
elibera coninutul celular i va degrada proteinele celulare (inclusiv proteinele
legate de ADN), care vor difuza la exteriorul matricei de agaroz. ADN rmne
fixat pe agaroz. n acelai mod secionarea prin endonucleazele de restricie
(alese n funcie de frecvena tieturilor de ADN studiat) va fi realizat n
interiorul blocului de agaroz care protejeaz ADN.

Fig. 92. Electroforeza n cmp pulsatil.

Aplicaiile electroforezei n cmp pulsaroriu sunt multiple: identificarea
i urmrirea microorganismelor (aplicaii n epidermiologie, domeniul
agroalimentar), cartagrafia fragmentelor de cromozomi umani, cartografia i
clonajul genelor, studiul structurii i evoluiei cromozomilor bacterieni. n acest
ultim domeniu s-au realizat hri fizice cromozomiale (peste 100 hri
constituite prin PEGE) i s-a deschis calea pentru secvenializarea sistematic a
genoamelor.
170

Enzime de restricie
Enzimele de restricie fac posibil manipularea de tip recopiere, tiere,
lipire a secvenelor acizilor nucleici. Noi enzime de restricie au fost
identificate, purificate i clonate. Acestea particip la fenomenul de restricie,
adic un sistem de aprare al bacteriilor fa de bacteriofagi. Unele tulpini sau
sue bacteriene conin enzime din familia endonucleaze i decupeaz ADN la
nivelul secvenei recunoscut specific. Dac o colonie infectat de un
bacteriofag sintetizeaz aceast enzim, i dac colonia bacterian o posed n
genom, fagul va fi incapabil s se multiplice i s lizeze bacteria. Ca urmare
ADN-ul su va fi secionat n fragmente n care exist situsuri specifice
genomului fagic.
De ce ADN bacterian nu este distrus de aceste enzime?
Exist 2 posibiliti: fie ADN bacterian nu conine secvene recunoscute
de enzim, fie acesta este metilat la nivelul resturilor de A sau C de ctre
metilaza bacterian ceea ce determin nerecunoaterea acestor secvene
metilate de ctre enzimele de restricie. Numele de restricie vine de la faptul c
exist o restricie a infeciei fagilor fa de anumite sue bacteriene care
sintetizeaz endonucleaze, altele fiind lizate. Numele enzimei de restricie
provine de la numele genului i speciei de la care au fost izolate. Se disting 3
grupe de enzime de restricie: I, II i III.
Enzime tip II. Sunt endonucleaze bacteriene care cliveaz specific cele
dou lanuri de ADN la nivelul unei secvene definite de 4-8 nucleotide. Ele au
particularitatea de a recunoate secvenele palindromice (citite n sensul 5'-3' i
n 3'-5' sunt identice).

Fig. 93. Enzime de restricie.

Secvenele recunoscute sau situsul de restricie este apoi secionat de
enzimele de restricie. Dou enzime de restricie pot recunoate acelai situs
numite i izochizomere.
171

Foarte multe enzime de restricie sunt disponibile n comer, nsoite de

mediu sau tampon de reacie i temperatura optim de funcionare. Datele
referitoare la enzime sunt redate ntr-un catalog. Este posibil digerarea
aceluiai fragment de ADN de ctre 2 enzime de restricie diferite. Dac ele
funcioneaz n condiii analoage (concentraia n sruri, pH, temperatur) cele
dou digestii se pot desfura simultan. Dac un fragment de ADN trebuie
digerat de 2 enzime care funcioneaz n condiii diferite, se folosesc succesiv
i se schimb mediul pentru fiecare reacie enzimatic.
Tieturile realizate de enzimele de restricie sunt de dou feluri:
- tietura dreapt n urma creia se obin extremiti drepte n acelai
loc la ambele catene (fig) ;
- tietur decalat a celor dou catene genernd extremiti
monocatenare cu secvene complementare, numite extremiti
coezive sau colante.

Fig. Enzime de restricie care dau capete drepte i colante.

Un exemplu de enzim de restricie este Hind III.
Hind III sunt enzime de restricie produse de Haemophilus influenzae,
serotipul Rd. Situsul de legare a ADN este format din 6 perechi de nucleotide
5 AAGCTT 3. Situsurile de restricie sunt adesea palindroame. Dac se
hidrolizeaz legturile fosfodiester, se face departe de centru de simetrie a
palindromului, unele perechi de nucleotide rmn nemperecheate; fragmentele
care rezult sunt aa zise capete colante (fig. 94).

172

Fig. 94. Enzime de restricie .Hind III.

Metilarea primei adenine sau a citozinei de la locul hidrolizei inhib
recunoaterea situsului de ctre Hind III. ADN bacteriei astfel metilat, nu este
hidrolizat n timp ce ADN parazit care nu este metilat, va fi hidrolizat.
Enzimele de restricie sunt foarte utilizate. Ele stau la originea tehnicii
polimorfismului fragmentelor de restricie RFLP i reprezint mijloacele
majore n tehnica de clonare. Unele enzime sunt sensibile la metilare. Ele nu
vor seciona un ADN de eucariot pe o citozin metilat, dar vor seciona
aceeai secven nemetilat. Exemplu: dou izochizomere MspI i HpaII.
Aceste dou enzime recunosc secvena CCGG dac C este metilat HpaII nu va
seciona n situsul respectiv, n timp ce MspI o va face.
Expresia unor gene este n funcie de starea de metilare a domeniilor
GC prezente pe promotor sau n unele regiuni ale genelor. Cele dou enzime
deschise vor permite diferenierea strii de metilare i precizarea dac gena se
exprim sau nu. Enzimele de restricie termofile - Bso BI izolat de la B.
stereotermophilus au activitate optim la 65C i sunt utilizate n metodele de
amplificare prin metode de deplasare a catenei.
Enzimele de restricie tip I i III
Enzima tip I. Odat secvena specific recunoscut de enzim, aceasta
va seciona aleatoriu la 1000-5000 pb mai departe. Sunt rar utilizate.
Enzimele tip III recunosc o secven i secioneaz la 10-20 pb de baze
mai departe.
RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphism) (polimosfismul
lungimii fragmentelor de restricie)
Variaiile individuale ale unor secvene de ADN sunt relevate prin
modificrile lungimii fragmentelor de restricie (fig). n urma electroforezei
exist un polimorfism a fragmentelor de restricie de lungimi diferite (RFLP).
Profilul electroforetic obinut cu o enzim de restricie dat, arat diferene
173

individuale de talie a fragmentelor de restricie RFLP. Fiecare sistem alelic de

restricie definete un locus polimorf.
n fig s-a realizat RFPL la 3 cromozomi folosind aceeai enzim de
restriie.Cromozomul homozigot AA este secionat n dou fragmente de 3kb i
7kb, homozigotul BB are un singur fragment de 10kb, iar heterozigotul A/B are
3 fragmente de 3kb, 7kb i 10kb.

Fig. Polimosfismul lungimii fragmentelor de restricie.

Polimorfismul ADN este utilizat ca marker genetic de identificare a
indivizilor n numerose domenii. ntr-o populaie, polimorfismul ADN se
traduce fie prin apariia diferitelor fenotipuri, fie prin modificri ale profilelor
de restricie (fig. 95).
n interiorul genomului sunt responsabile de fenomene de polimorfism
mai mult sau mai puin complexe:
mutaia, care duce la nlocuirea uneia sau mai multor baze fr
schimbarea lungimii ADN;

174

inseria sau deleia corespunztoare inseriei, sau deleiei

bazelor din secvena de ADN;
rearanjarea cromozomilor datorit recombinrilor genetice sau
inseriei de transpozoni.
Recombinrile genetice sunt consecina unei mperecheri a
ADN, n urma schimburilor de material ntre doi cromozomi.
Acest fenomen este numit i crossing-over ntruct schimbul
de material are loc n timpul meiozei.
Tranpozonii sunt secvene de ADN capabile de a se replica i
de a se insera una din copii ntr-un nou loc n genom.

Fig. 95 Polimorfismul fragmentelor de restricie.

Principiul RFLP const n compararea profilelor de secionare prin
enzime de restricie, ca urmare a existenei unui polimorfism n secvena unei
molecule de ADN n raport cu o alta (de exemplu, ADN-ul fiului, fa de cel al
tatlui).
175

Mutaii care apar pe o secven de ADN recunoscut de o enzim de

restricie vor provoca lungimi diferite ale fragmentelor de restricie. ADN
indivizilor este comparat i digerat prin mai multe enzime de restricie.
Produii de restricie sunt apoi separai pe gel de acrilamid sau de agaroz n
prezena unui marker cu greutate molecular cunoscut. Polimorfismul
lungimii fragmentelor de restricie observat este utilizat ca i criteriu de
identificare. Prin aceast metod 2 indivizi vor prezenta profil de restricie
diferit.
Sunt utilizate numeroase metodologii pentru detectarea polimorfismului
ca de exemplu:
1. tehnica Southern fragmentele de restricie sunt hibridate cu o sond
constituit dintr-un fragment de ADN markat, complementar cu o secven
specific de ADN.
2. reacia PCRo regiune specific de ADN este amplficat, ceea ce
permite vizualizarea fragmentelor de restricie ale acestei regiuni prezent n
cantitate mare, urmat de electroforez pe gel i colorat cu bromur de etidiu.
3. tehnica RAPD fragmentele sunt amplificate la ntmplare i
detectate dup electroforez pe gel de agaroz i colorate cu bromur de etidiu.
4. toate celelalte tehnici PCR care utilizeaz n special secvene de
ADN repetate (transpozoni, microsatelii).

Polymorfismul MspI al apoA II

Southern Blot permite detectarea polimorfismului de lungime a
fragmentelor de restricie. Exist un polimorfism a genei apolipoproteina A II.
Acest polimorfism vizeaz secvena situsului recunoscut de enzima de
restricie MspI situat n aval de gen, astfel c doar 19% prezint situsul de
restricie n acest loc (fig. 96).

176

Fig. 96. Polimorfismul MspI al apoA II.

Atunci cnd se diger ADN genomic de la mai muli indivizi alei la
ntmplare, se obin fragmente de talie diferit la fiecare punct de secionare cu
enzima. Dup electroforez, pentru separarea acestor fragmente n funcie de
talia lor, se transfer pe o membran, se hibrideaz fragmentele de pe
membran cu o sond complementar exonilor apo AII. Se face o
autoradiografie a membranelor pentru relevarea acestor fragmente. Majoritatea
subiecilor (81%) care posed 3 situsuri de seciune n cadrul genei, au un
fragment de 3000 perechi de nucleotide (2 kb). Ali subieci mai rari 19% care
nu posed situsuri de restricie, au un fragment mai mare de 3700 perechi de
nucleotide (3,7 Kb).
Rezult c un subiect poart o alel pe un cromozom i o alel pe alt
cromozom. El este deci heterozigot prin polimorfism i la electroforez se
observ cele dou fragmente care au fost puse n eviden prin sonde
moleculare.
Hri de restricie
Markerii genetici pot caracteriza ADN-urile responsabile de bolile
ereditare pe baza hrilor de restricie. ADN bolnav este digerat printr-un
numr de enzime de restricie izolate sau asociate ntre ele. Fragmentele de
restricie sunt recunoscute de sonda specific genei responsabil de boal (fig.
97). n urma restriciei rezult un numr mare de fragmente posibile a cror
lungime (n Kb) este msurat prin electroforez fa de un marker de mas
molecular cunoscut (fig.).
177

Fig. ADN bolnav

restricie

digerat printr-un numr variabil de enzime de

Astfel, ADN provenit de la un bolnav de dislipoproteinemie i al unuia

sntos poate fi digerat prin BamH1: subiectul sntos prezint un singur
fragment lung de 11,6 Kb recunoscut printr-o sond a genei apoAI, n timp ce
ADN-ul bolnavului are 2 fragmente de 7,5 i 10,25 Kb. Fragmentul BamH1 a
subiectului martor poate fi digerat de alte enzime, care dau de fiecare dat 2
fragmente (DdeI), sau trei (Hind III), sau 4 (PstI).

Fig. 97 Hart de restricie.

Fragmentele pot fi comparate cu buci de puzzle pentru a obine o
hart de amplasamente ale situsurilor de restricie din ADN. Aceeai hart la
subiectul bolnav prezint aceleai situsuri de restricie ale celor dou
extremiti ale fragmentului BamHI; apare o inserie de 6Kb la mijlocul genei
178

apoAI cu noi situsuri Bam H1, EcoRI, PstI care nu se regsesc la martor.
Aceast inserie este responsabil de absena expresiei apoAI care se traduce
printr-o dislipoproteinemie.
Hibridarea unei sonde
Fragmentul de ADN dublu catenar prezint normal o structur
secundar n dublul helix. Ridicnd temperatura pn la temperatura de topire
se desfac diferit aprox. 50% din legturile de H care unesc lanurile de ADN
ceea ce denatureaz parial dublul helix (fig. 98).
Atunci cnd temperatura atinge 95 toate legturile de H sunt rupte i
denaturarea ADN este complet. ADN monocatenar este numit denaturat. n
cursul denaturrii coeficientul de extincie a ADN de la 260 nm crete
(hipercromie).

Fig. 98. Hibridarea unei sonde.

Prin rcirea brusc (cu ghea) structura secundar nu este refcut i
ADN rmne denaturat. Dac rcirea se face lent, dublul helix se reface
progresiv. O oligonucleotid (sond) adugat n acest moment se poate hibrida
cu un fragment complementar de ADN, pe msur ce temperatura scade sub
Tm (de topire).
Hibridarea unei sonde marcate cu atomi radioactivi, radicali
fosforesceni sau liganzi specifici, se face cu un ADN a crui secven este
complementar sondei.

179

Fig. Sond marcat radioactiv.

Calculul Tm
Oligonucleotide sub 20 nt
(A+T)x2 + (G+C)x4 = Tm n C
Oligonucleotide mai mari de 20 nt
(A+T)x2 + (G+C)x4 x (1+(N-20)/20 = Tm n C
Marcarea sondelor
Sonda este o secven nucleotidic complementar unei secvene
nucleotidice: foarte adesea aceasta poate fi o gen sau un fragment de gen.
Aceast sond poate fi de ADN sau ARN. Pentru a fi vizualizat mai uor este
indispensabil marcarea. Exist mai multe metode de marcare pentru ADN i
ARN:
Marcarea ADN se face prin 3 tehnici:
a) o tehnic de nlocuire a nucleotidelor nemarcate prin nucleotide
marcate (tehnica de renlocuire) translaia seciunii
b) dou tehnici de sintez a ADN marcat:
- randomizat sau ntmpltor
- sinteza sondelor prin PCR
c) marcarea oligonucleotidelor.
Translaia seciunii
Sunt utilizate 2 enzime:
-DNaza I endonucleaza specific ADN dublu catenar care hidrolizeaz
legturile fosfodiesterice ale lanurilor ADN. Aceast aciune antreneaz
formarea de scurte oligonucleotide caracterizate prin prezena gruprilor fosfat.
n prezena ionilor de Mg 2+ scade aciunea DNazei I. Are loc
secionarea (nick) unei singure catene, DNaza I exercit deci o aciune
independent pe fiecare lan.
180

Cantitatea (numrul) de seciuni pe ADN depinde de concentraia

DNazei I utilizate. Cu ct scade cantitatea acestei enzime, ea nu realizeaz
dect cteva seciuni pe fiecare lan care sunt repartizate toate n lungul
genomului.
- ADN polimeraza I posed 3 activiti
- o activitate 5'-3' polimerazic
- o activitate 3'-5 'exonucleazic (o activitate de corectare a
erorilor)
- o activitate 5'-3' exonucleazic.

181

Fig. 99. Translaia unei seciuni.

Prezena grupului 5' fosfat la nivelul fiecrei seciuni efectuate prin
DNaza I declaneaz aciunea celei de-a II-a enzime. Activitatea 5'-3'
exonucleazic ndeprteaz progresiv deoxinucleotidele. Ele sunt deci
deplasate progresiv de la seciune din 5' ctre 3' de unde denumirea de
translaia seciunii.
182

Activitatea 5'-3' polimerazic, va completa adugnd la extremitatea

3'OH de deoxinucleotide marcate prin anumii markeri fie cu izotopi 32P, fie
prin haptene de exemplu digoxigenin. Prin sinergia celor 2 activiti se
produce o alungire a ADN de la 5'-3' i se termin cu 3'.
Cele dou lanuri sunt atacate prin DNaza I, n acelai fel, deci sunt
total marcate n cursul reaciei. Sonda obinut va fi dublu catenar i va fi
denaturat nainte de utilizare.
Exist totui un parametru critic n aceast reacie: este vorba de
raportul DNaz I/polimeraza I. Acest raport este variabil i depinde de
cantitatea, lungimea i configuraia ADN marcat. Este necesar s se determine
raportul optim a celor dou enzime fiecare cu un tip de ADN utilizat pentru
marcarea unei sonde. Raportul ADN/markerii de NTP trebuie s fie determinat
empiric (markerii pot fi molecule cu digoxigenin).
Marcajul optim este ntre 1 i 24 de ore i descrete odat cu trecerea
timpului.
Imprimare ntmpltoare (random priting)
Klenow polimeraza este utilizat pentru aceast tehnic. Enzima, este o
ADN polimeraz modificat (fragmentul Klenow rezult prin clivarea
proteolitic a ADN polimeraza I de E. coli prin subtilizin). Ea posed 2
proprieti:
- activitate de ADN polimeraz 5'-3'
- activitate de corectare a erorilor exonucleazic 3'-5'.
Principiul acestei tehnici este urmtorul: ADN dublu catenar este
denaturat prin cldur, apoi monocatenele sunt puse n ghea (pentru
stabilizarea acestora).
Un amestec de hexanucleotide coninnd toate combinaiile posibile
(ntmpltoare, random) sunt adugate (ceeea ce reprezint un amestec de 4 6
hexanucleotide diferite). Hexanucleotidele se vor hibrida cu secvene
complementare care sunt recunoscute pe ADN. Statistic numrul de
hexanucleotide care se gsesc pe un fragment de ADN markeaz o secven
complementar. Aceste nucleotide vor servi ca amorse pentru aciunea ADN
polimerazei (Klenow polimeraza).

183

Fig. 100.Amorsare aleatorie.

Se adaug deci n amestec enzima i nucleotidele necesare care sunt
modificate (fie prin marcaj radioactiv fie cu ajutorul unor haptene de exemplu
digoxigenina sau biotina). n cazul biotinei sau digoxigeninei se nlocuiesc
nucleotidele dNTP prin dUTP.
Markerii se vor fixa pe faa covalent prin intermediul unui bra care va
permite ncorporarea nucleotidelor i reacii de hibridare subsecvente produse
fr alterarea markerilor: exemplu DIG-dUTP). Toate combinaiile de
hexanucleotide prezentate, sunt statistic posibile prin hibridare pe toate
secvenele int. Klenow polimeraza ncorporeaz nucleotidele ntre amorsele
hexanucleotidice. Sondele astfel fabricate vor fi intens marcate.
n cursul acestei tehnici, cele dou lanuri ADN servesc ca substrat
pentru aciunea enzimei. Pentru a mpiedica reasocierea celor dou catene
ADN reacie se face la o temperatur corespunztoare utiliznd amorsele ntr-o
concentraie important.
Raportul ADN/amorse int controleaz numrul sondelor sintetizate.
Sondele marcate rezultate sunt complexe de lanuri complementare ADN-ului
int (densitatea sondelor marcate depinde de raportul haptene-dUTP/dNTPs).
De exemplu n cazul utilizrii digoxigeninei raportul optim este de 355 DigdUTP/65% dTTP. Sondele obinute sunt foarte scurte ca i ADN int utilizat.
Cele dou lanuri de ADN care au servit ca substrat pentru sinteza
sondelor, sunt denaturate nainte de utilizare.
184

ncorporarea se menine n platou 30-60 minute.

Aceast tehnic este foarte util, pentru marcarea ADN n vederea
electroforezei, i a unor microorganisme cu genom format din ADN.
Marcarea prin reacia de nlocuire
ADNpolimeraza I provenit de la E. coli sau fragmentul Klenow poate,
prin activitatea exonucleazic 3'-5' s degradeze un ADN dublu catenar
ncepnd de la extremitatea 3'. Dac un singur precursor deoxitrinucleotidic
este prezent i el este de exemplu dTTP va fi marcat cu 32P de ctre
ADNpolimeraza fragmentul Klenow. Aceasta recunoate o baz
complementar a acestui precursor respectiv dATP 32P i o va ncorpora
(fig).

Fig. Marcarea ADN la capete.

Va avea loc n aceast poziie o nlocuire a nucleotidei reci contra
uneea markate. Fragmentul ADN nu poart deci, dect o singur molecul
markat pe fiecare lan ADN.
Hibridarea acizilor nucleici este o metod fundamental pentru biologia
molecular cu scopul detectrii unei secvene de ADN de cercetat.

185

Fig. Hibridarea unei sonde ADN marcat radioactiv cu un fragment de

ARNm complementar.
Ea este foarte frecvent utilizat fie la criblajul bncilor de ADN
complementar sau pentru studiul organizrii regiunilor specifice ale genomului
(prin Southern blot), fie prin analiza acumulrii transcripiilor (Nourthern blot).
Aceste metode permit obinerea sondelor de ADN marcate radioactiv sau
chimic, uniform sau la extremitile lor.

186

Fig. Sonde marcate radioactiv uniform

Markarea sondelor prin PCR
Dou lanuri de ADN sunt markate prin activitatea Taq polimerazei care
este o ADN polimeraz, fie prin ncorporarea de deoxinucleotide radioactive,
fie deoxinucleotide modificate prin fixarea unor haptene (digoxigenina-DIGdUTP raportul optim dTTP/DIG-dUTP este 2/1).

Fig. Marcarea sondelor cu digoxigenin prin PCR.

Ele pot utiliza de asemenea amorse marcate pe extremitatea 5' (cel mai
adesea se utilizeaz biotina sau markeri fluoresceni n aceeai direcie cu
enzimele fosfataza alcalin sau peroxidaza). Se poate utiliza i ARN care a
suferit n prealabil o etap de transcripie invers obinndu-se n final ADNc.
Aceast tehnic este foarte sensibil i permite n acelai timp obinerea
unei sonde ncepnd cu un produs subclonat, deci el nu poate cunoate dect
187

parial secvena. Sonda este marcat pe cele dou lanuri, este deci necesar
denaturarea nainte de utilizare.
Marcarea oligonucleotidelor
Oligonucleotidele (20-30 pb i mai puin) sunt marcate prin transferaza
terminal. Aceste enzime catalizeaz adaosul a mai multor dezoxinucleotide la
extremitatea 3'OH a ADN.
Dezoxinucleotidele vor forma o coad care nu se va hibrida cu
secvena studiat. Lungimea cozii variaz n funcie de raportul
deoxinucleotide/haptine ataate deoxinucleotidelor. n consecin, singura
extremitate 3' a sondei este marcat. De exemplu dac un raport 1/10 este
utilizat pentru DIG-dUTP/dTTP el va fi un mijloc de ncorporare a 10-12 DIGdUTP pe o coad cu lungime n jur de 40-50 nucleotide. Utiliznd
dideoxinucleotide (de exemplu DIG-ddUTP) transferaza terminal nu va
aduga dect o singur dideoxinucleotid la extremitatea 3'OH.
Aceast tehnic nu modific Tm a oligonucleotidelor rmase. Ele pot fi
de asemenea utilizate pentru marcarea fragmentelor scurte de ADN (pn la
200 pb), dar sensibilitatea lor va fi deci mai puin important dect a altor
tehnici.

Marcarea sondelor ARN

Sondele ARN sunt sintetizate cu ajutorul ARN polimerazei provenit
din bacteriofagul SP6, T7 sau T3 prin transcripia in vitro a ADN apoi urmeaz
subclonarea n vectorul coninnd promotori specifici SP6, T7 sau T3.

188

Fig. Obinerea sondelor ARN.

Nucleotidele markate sunt adugate n amestecul reacional
(deoxinucleotidele radioactive sau neradioactive, haptene UTP) i sunt
ncorporate n cursul reaciei. Reacia de polimerizare a ARN este realizat pe
un vector linearizat. Ele debuteaz n aval de promotor pe o secven definit
ca situs de iniiere a transcripiei i se termin la sfritul vectorului linearizat.
Aceti promotori sunt scuri (17 pb). Atunci cnd promotorul difer de un altul
prin puine nucleotide, polimerazele sunt foarte specifice, secvenei
promotorului utilizat SP6, T7 sau T3.
n medie, aceste reacii sunt realizate n 1 sau 2 ore. ADN este ulterior
eliminat prin tratarea cu o DNaz. n cazul a doi promotori diferii pe fiecare
lan ADN se poate obine o sond pentru fiecare lan (sens antisens).
Sondele de ARN prezint numeroase avantaje:
-sunt monocatenare,
-au o relativ absen de autocomplementaritate;
-lungime definit,
-confer stabilitatea hibrizilor ADN/ARN.

Autoradiografia
O tehnic de mare sensibilitate pentru localizarea substanelor marcate
cu izotopi radioactivi ca: 14C, 32P, 35S, 59Fe, 125I sau 131I.
Printr-o metod de cartare ce d natere n gel unor spoturi foarte
compacte, OFarell (1975) a artat c a folosit o coloraie cu Coomassie Blue R
250 prin care pot fi evideniate chiar de 0,01 g de protein.
Autoradiografia este de 100 de ori mai sensibil, iar n cazurile fericite
de 1000 ori.
Pentru autoradiografie cu izotopi nalt energizani 32P, 59Fe, 59C, feliile
de gel ar trebui acoperite cu folie subire de polietilen i puse n contact cu un
film sensibil la radiaii X.
Izotopii sunt elemente chimice cu mase atomice diferite (difereniere
realizat prin numere ale neutronilor).
Unii izotopi au tendina de a se rearanja sau dezintegra. Dezintegrarea
implic eliberarea particulelor subatomice sau a radiaiilor electromagnetice.
Emisia radioactiv genereaz un flux de lumin. Intensitatea luminoas este
proporional cu energia emis. Expunerea unui film sau a unei emulsii

189

fotografice peste un gel care conine molecule marcate cu izotopi radioactivi l

marcheaz.
Pentru autoradiografie gelurile trebuiesc uscate. Dup decolorarea final
gelurile se retract pn la dimensiunea iniial, chiar mai mult, n metenol
65% cu glicerol 0,5%. Peste o plac ptrat de sticl (25x25 cm), se aeaz
gelul n centru evitndu-se prinderea bulelor de aer ntre gel i celofan i
deasupra se aeaz o alt folie de celofan. Marginile celofanului se introduc sub
placa de sticl i se prind cu clame Sandwich-ul de gel este uscat apoi n
etuv la 70C timp de 30-120 minute sau un timp mai lung la o temperatur
mai mic. Dac gelurile uscate urmeaz a fi folosite pentru autoradiografierea
zonelor marcate cu 3H sau 14C este indicat siliconarea plcii de sticl i
plasarea direct a gelului fr folie de celofan cu faa orientat direct spre
filmul fotografic

Vectorii folosii n biologia molecular

n biologia molecular se folosesc diferii vectori care inser fragmente
de ADN de diferite dimensiuni n funcie natura acestuia.

Fig. Dimensiunea fragmentelor inserate de diferii vectori utilizai n

biologie molecular.
Descrierea unui plasmid i a unui fagemid
Plasmidele i fagemidele se dezvolt n bacterii i sunt foarte frecvent
utilizate pentru manipularea fragmentelor de gene indiferent de organism ca
urmare a utilizrii enzimelor de restricie, PCR i a clonrii moleculare.

190

Un plasmid este o molecul de ADN dublu catenar circular,

extracromozomial, capabil de a se replica, independent de cromozomul
bacterian, ntr-o celul i de a fi transferat la o alt celul la alta.
Aceste plasmide sunt molecule mici de 3-10 Kb. Plasmidele utilizate n
ingineria genetic au fost modificate. Conin o regiune de replicare (regiunea
principal), una sau mai multe gene de rezisten (la antibiotice de exp. care
permit selectarea bacteriilor care au integrat acest plasmid) i un situs de
policlonaj.

191

Fig. Selectarea bacteriilor care au integrat acest plasmid ce conine gene

de rezisten la antibiotice.
Situsul de policlonaj este o secven de ADN constituit dintr-o
succesiune de secvene recunoscute i secionate de diferite enzime de
restricie. Aceste situsuri sunt unice (nu apar dect n acelai loc n toat
secvena plasmidului) i sunt utilizate n tehnicile de clonaj.
Moleculele de ADN exogene de ordinul a 4 Kb pot fi uor integrate n
aceti vectori plasmidici, dar nu i moleculele mai mari (fig. 102).

Fig. 102. Plasmid

Fagemidele sunt molecule hibride dintre un plasmid i un fag. Sunt
molecule de ADN bicatenar circulare care pot fi obinute sub form
monocatenar n anumite condiii. Ele posed origine a replicrii, cel puin o
gen de rezisten la antibiotice, un sit de policlonaj i o secven provenit de
la fagul M13 care permite obinerea formei monocanare.
n general, promotorii de ARN polimeraz au fost introdui n amonte
sau n aval de situsul de policlonaj pentru a produce ARNm prin transcrpie in
vitro.
Fragmentele de ADN de cteva Kb pn la 10 Kb pot fi introduse n
aceti vectori.
Descrierea unui bacteriofag i a unui cosmid
Bacteriofagii i cosmidele sunt utilizai la fel ca i plasmidele ca vectori
de clonaj ndeosebi pentru a realiza bnci. Ei pot integra fragmente de ADN
mai mari dect plasmidele.

192

Bacteriofagul este un virus cu tropism bacterian. Cel mai utilizat

este bacteriofagul care are 50 Kb ADN bicatenar, dar liniar, prezint
extremiti coezive (secvene cos) care-i permit s se circularizeze n caz de
infecie.
Cosmidele sunt vectori hibrizi de talie mic avnd caracteristicile
plasmidului (originile replicrii, gena de selecie) i a unui bacteriofag
(secvena cos necesar ncapsidrii ADN-ului n particulele fagice).
Fragmentele de ADN exogen introduse n cosmid ntre dou situsuri cos
trebuie s aib dimensiunea de 35-45 Kb.

Fig. Organizarea cosmidului

Astfel dup legarea unui cosmid n prealabil linearizat i a unui
fragment de ADN, strin de mrime convenabil, ADN recombinant poate fi
ncapsidat i apoi utilizat pentru a infecta bacterii.
Odat ptruns n bacterie cosmidul se replic ca un plasmid deoarece nu
posed genele fagului pentru producerea de noi particule fagice.
Cosmidele sunt vectori utilizai pentru construirea bncilor de ADN
genomic. Aceste bnci sunt mai greu de construit i de meninut dect cele de
bacteriofagi. Bncile de cosmide sunt utilizate cnd mrimea genei de cercetat
este foarte mare peste 20 Kb.

193

Fig. Construirea unei bnci de cosmide.

ADN-ul fagic este nvelit ntr-un strat proteic. n cazul infectrii unei
bacterii, particula fagic se fixeaz la exteriorul acesteea i elibereaz molecula
de ADN n interiorul celulei bacteriene. Echipamentul enzimatic al bacteriei
194

este folosit pentru transcripia i transducia proteinelor codificate de ADN ,

ndeosebi a proteinelor care constituie nveliul proteic sau capsida.
ADN fagic se va replica totodat de un numr mare de ori. Moleculele
de ADN nou sintetizate vor fi ncapsulate n noi nveliuri de capside fagice
sintetizate n interiorul celulei bacteriene. n acest caz se numesc virioni.
Celula bacterian se va liza i va elibera mii de particule fagice identice
cu fagul care a infectat bacteria.

Fig. Infectarea unei bacterii de particule fagice.

Aceti noi fagi la rndul lor vor infecta bacteriile vecine. Avantajul unui
vector fagic fa de unul plasmidic este c ADN-ul su accept un fragment
mai mare de ADN exogen (n medie 20 Kb fa de 4 Kb pentru un plasmid).
Totui din cauza mrimii, este mai grea manipularea in vitro a vectorilor fagici
n practic fagii sunt utilizai ca vectori pentru construirea bncilor de
ADN complementar sau genomice.
Dac genele de cercetat de ADN exogen au fost reperate ele vor fi
decupate de enzimele de restricie i fragmentele obinute sunt integrate ntr-un
vector plasmidic i fenomenul se numete subclonaj.
Descrierea unui Yac
Cercetrile care vizeaz caracterizarea structurii genomului n
ntregime, necesit utilizarea vectorilor de clonaj care s permit inseria unor
195

fragmente mari de ADN. Aceasta determin manipularea unui numr restrns

de vectori recombinai pentru descoperirea genomului ntreg.
Yac i BAC sunt vectori care accept fragmente mari de ADN.
Cuvntul Yac provine de la Yeast Artificial Cromozom sau cromozomul
artificial de drojdie. Yac-urile sunt vectori construii din secvene de ADN
cromozomial al levurilor (drojdiilor). Ei posed o origine de replicare (ARS),
un sit centromeric (CEN) i secvene telomerice (TEL), care le permit ca s se
comporte ca un cromozom atunci cnd sunt introduse sub form liniar ntr-o
levur (fig. 103).

Fig. 103. Sructura unui YAC.

De asemenea prezint:
-mai multe gene de selecie care codific enzimele ce permit selectarea
levurilor care au ncorporat un vector viabil (TRP1, URA3);
-un sit de clonaj unic, situat pe gena SUP4, care permite introducerea
ADN strin. Aceasta permite detectarea unui vector recombinat. Aceti vectori
sunt introdui n levur.
196

Fragmentele foarte mari de ADN exogen 150-1000 Kb pot fi introduse

n Yac. La ora actual cele mai mari inserii clonate au mrimea de 2900 Kb.
Aceti vectori sunt instrumente de alegere pentru analiza genomurilor
complexe n particular a celui uman, dar i pentru cartagrafierea genelor.

Fig. YAC cu ADN uman inserat.

Pentru clonajul fragmentelor mari de ADN se mai folosesc Bac

(Bacterial Artificial Cromozome) sau fagul P1.
Aceti vectori sunt capabili ca i Yac s ncorporeze fragmente mari de
ADN. Ei se comport ca i plasmidele de mrime foarte mare, dar se
manipuleaz ca bacteriofagi de tip I.
BAC sunt frecvent utilizate. n clonajul ADN sunt cele mai sigure i
eficace n E.coli dect n levuri. Mrimea fragmentelor integrate nu depete
300 Kb.
197

Clonajul molecular
Clonajul const n inseria unui fragment de ADN exogen ntr-un vector
(plasmid, fagemid, bacteriofag, cosmid, YAC, BAC).
Principiul metodei

Fig. 104. Clonarea n cazul folosirii unei singure enzime de restricie.

198

Vectorii de clonaj (de exemplu plasmidele) sunt decupai prin enzime

de restricie recunoscute de un situs unic (n general situat n situsul de
policlonaj) (fig. 104). Vectorul dup secionare este liniarizat i posed la
fiecare extremitate o parte din secvena de ADN recunoscut de enzima de
restricie.
ADN exogen organismului donator, este digerat de aceeai enzim de
restricie ca i cea utilizat pentru liniarizarea vectorului; diferitele fragmente
obinute posed deci la cele dou extremiti n mod egal o parte din secvena
de ADN recunoscut de enzima de restricie. Atunci cnd plasmidul linearizat
i fragmentele de ADN donator sunt confruntate, se realizeaz hibridizarea
extremitilor coezive complementare (formndu-se legturi de H), urmtoarele
fiind adugate pe baz de complementaritate (AT, GC). Se adaug o enzim
care permite formarea unor legturi covalente ntre aceste fragmente de ADN
hibridizat (fig. 105). Aceasta este o ADN ligaz, care realizeaz legturi
fosfodiesterice ntre extremitile coezive ale fragmentului ADN exogen i ale
plasmidului (5P i 3OH) devenite adiacente.

199

Fig. 105. Clonarea n cazul folosirii a dou enzime de restricie.

Plasmidul obinut este din nou circular, este recombinant pentru c a
integrat o inserie.
Dac ADN plasmidic i inseria sunt digerate printr-o singur enzim de
restricie, inseria poate s se integreze cu dou orientri ntmpltoare, fie cu
3 fie cu 5. Va trebui determinat sensul de inserie.
Inseria se poate integra n dou sensuri ntmpltoare, fie 3 fie cu 5.
Va trebui determinat sensul de inserie a fragmentului secvenializnd
plasmidul recombinant.
n clonajul realizat dup secionarea cu o singur enzim de restricie se
pot produce dou tipuri de legri: legarea la plasmid a moleculei de inserat sau
recircularizarea plasmidului pe el nsi fr inserie. Aceast ultim
posibilitate este frecvent de aceea se urmrete dirijarea legrii inseriei.
n scopul favorizrii inseriei fragmentului de ADN strin i deci de
mbogire a populaiei cu plasmidele recombinate, recircularizarea vectorului
pe el nsi este mpiedicat prin tratamentul cu fosfataza alcalin. Grupurile
fosfat prezente la extremitata 5P din vectorul liniarizat sunt eliminate. Ligaza
nu poate s catalizeze formarea de legturi fosfodiesterice ntre dou
extremiti defosforilate ale plasmidului. Ea poate s catalizeze legtura ntre o
extremitate defosforilat a plasmidului i o extremitate fosforilat a inseriei.

200

Fig. Prevenirea legrii vectorului pe el insui prin tratare cu fosfataza

alcalin.
Cazurile mai puin favorabile se pot ntlni atunci cnd plasmidul i
fragmentul de ADN strin sunt secionate prin enzime de restricie, genernd
capete drepte. Principiul este acelai, dar eficacitatea legturii este redus.
Totui avantajul acestei metode este de a permite legarea oricrei extremiti
chiar dac ea nu posed secvene complementare. Acesta este cazul pentru
clonarea n plasmide a fragmentelor de ADN obinute prin PCR.
n cazul unui clonaj realizat prin capete drepte, inseria unui fragment
de ADN exogen poate avea loc cu dou orientri la ntmplare. Va trebui
determinat sensul inseriei fragmentului n secvenializare, de exemplu a
plasmidelor recombinante.
Dac vectorul, n situsul de policlonaj i ADN-ul exogen, nu a fost
digerat de aceeai enzim de restricie i nu posed extremitile drepte sau
compatibile, este indispensabil de a se crea extremitile drepte pentru a insera
ADN exogen n vector. Acest lucru se realizeaz prin aciunea unei ADN
polimeraze care completeaz, prin adugarea nucleotidelor la extremitile 5P
a protuberanei. Prin activitatea enzimei 3-5 exonucleaz se realizeaz
ajustarea extremitii 3 protuberante (fig. 106).

Fig. 106. Crearea extremitilor drepte.

n unele cazuri fragmentul ADN de digerat i plasmidul sunt digerate
fiecare prin 2 enzime de restricie diferite. n acest caz, clonajul este direcionat
deoarece integrarea inseriei se realizeaz ntr-un singur sens.
Hibridarea molecular
n studiul ADN poate fi necesar confirmarea specificitii secvenei
ADN detectate dup PCR. Pentru aceasta cel mai adesea se utilizeaz
hibridarea molecular. Tehnica de hibridare se bazeaz pe proprietile fizicochimice ale acizilor nucleici de: complementaritate a bazelor constitutive ale
201

ADN (ATGC), ARN (AUGC), de reversibilitatea procesului de separare ale

cele dou catene, ale moleculelor de ADN (denaturate) i de reasociere a celor
dou catene (renaturate).
Principiu. Hibridarea molecular este determinat de caracteristicile
unui fragment de ADN monocatenar de a se asocia cu alt caten respectnd
regula complementaritii. Este un principiu absolut, cu condiia ca hibridarea
s fie perfect controlat. Aceast particularitate st la originea utilizrii
sondelor.
Sonda este un fragment ADN monocatenar a crui mrime variaz de la
cteva zeci de pb, oligosonda, de cteva kb i care se vor asocia cu toate
secvenele complementare prezente ntr-o soluie de acizi nucleici la care este
adugat. Sonda este deci un instrument care permite reperarea unei secvene
specifice dintr-un amestec complex de acizi nucleici.
Sonda poate fi marcat radioactiv sau chimic. Moleculele int sunt
lanuri simple de acizi nucleici denaturai care sunt n prealabil fixai pe o
membran de hibridare de naylon sau nitroceluloz. Sonda monocatenar i
inta denaturat sunt puse n contact (membrana este incubat ntr-o soluie
coninnd sonde) n condiii care s permit renaturarea.

Fig. Hibridarea sondelor marcate radioactiv cu ADN monocatenar al

fagilor legat de membrana de nitroceluloz.
202

Dac molecula sond i recunoate omoloaga ntr-o populaie de

molecule simple ele se hibrideaz i hibridul devine marcat prin prezena
sondei. Splarea adecvat a membranei permite atunci eliminarea tuturor
hibridrilor nespecifice i nu reine dect hibrizii sond-int cercetai.
n cazul unui marcaj radioactiv hibrizii sunt identificai punnd
membrana n contact cu un film autoradiofotografic care este developat ca un
film foto. n caz de marcaj chimic hibridul molecular se evideniaz adesea
printr-un test colorimetric pe membran. Membrana de nitroceluloz, creaz un
semnal de fond mai puin important dect cea de naylon i este mai fragil. De
aceea se prefer membranele de nylon.
Pentru ca tehnica s funcioneze necesit obinerea ADN monocatenar.
Acesta se obine prin denaturare.
Temperatura de fuziune
ADN dublu catenar supus nclzirii progresive devine monocatenar prin
desfacerea legturile de H. Dac mediul se rcete catenele se asociaz
complementar. Temperatura la care se produce fuziunea se numete Tm
(temperatur de topire). Tm este temperatura la care 50% din ADN trece n
forma monocatenar i 50% dublu catenar.
Factorii de care depind Tm:
1. Compoziia n baze azotate situate n mediu salin NaCl mperecherile AT cu 2 legturi H sunt mai puin stabile dect CG cu 3 legturi
H. Cu ct un fragment ADN va fi mai bogat n GCcu att Tm va fi mai mare.
Totui n prezena clorurii tetrametilamoniu (TMACl), aceast diferen
dispare. Hibridarea devine independent de cantitatea CG. Aceast proprietate
este utilizat n cursul exploatrii sondelor specifice alelelor (ASO) i dot blot
invers.
2. Compoziie n sruri a mediului scderea concentraia de sruri a
mediului , reduce fora ionic n Tm. Convenional se vorbete de condiii
stringente cnd concentrarea n sruri este slab. n condiii foarte stringente
mperecherile greite sunt imposibile asocierea catenelor respectnd strict
regulile de complementaritate. Astfel cele dou catene renatureaz i prezint
exact aceleai secvene (100% omologie), deci hibridarea va fi stabil n
condiii nefavorabile importante.
mperecherile greite sunt posibile n condiii mai puin stringente. De
exemplu, dac se prepar la temperatura camerei un amestec reacional
coninnd toi reactivii i compuii necesari unei amplificri genice prin PCR.
Hibridrile nespecifice se produc ntre oligonucleotidele amorsei i acizii
nucleici din proba de adugat. Aceasta afecteaz sensibilitatea i specificitatea
203

testului. Pentru a evita acest fenomen s-au dezvoltat proceduri speciale care
evit hibridri la temepraturi joase folosind Hot Start:
- proporia mperecherilor greite - se consider c Tm dimnu cu
1C pentru 1% mperecheri greite de ADN
- lungimea fragmentului acest efect destabilizant este minim cnd
mrimea fragmentului hibrid este de peste 500pb
- prezena agenilor destabilizatori se utilizeaz cel mai frecvent
formamida i ureea. Adugarea de 1% formamid reduce Tm cu
0,6C i ureea 6 molar (M) reduce Tm cu 30C.
Factorii ce influeneaz hibdridarea
Temperatura optim de hibridare este n medie evaluat cu 20C mai
mic dect Tm pentru fragmentele mari. Pentru fragmentele mici (hibridarea
amorselor prin PCR de exploatare) Tm -20 este reglabil.
Fora ionic, n mare concentraia srurilor (NaCl 1M) hibridarea este
accelerat
Sunt posibile mai multe tipuri de hibridare: ADN/ADN; ADN/ARN;
ARN/ARN. Hibrizii ADN/ARN i ARN/ARN sunt mult mai stabili dect
hibrizii ADN/ADN; Tm a lor va fi mult crescut. De fapt n prezena unui grup
OH n 2' al ribozei crete stabilitatea lanurilor duble i crete fora
electrostatic prezent ntre gruprile fosfat a acizilor nucleici.
Tehnici de tranfer
Se refer la tehnicile de transpunere a unor zone de proteine, ADN sau
ARN separate, de pe gel pe folii subiri de hrtie derivat sau matrice
membranare, de pild ntr-o celuloz, de care se leag i se imobilizeaz.
Avantaje: cele mai multe sunt legate de accesibilitatea superioar a
macromoleculelor absorbite sau legate pe suprafaa unei folii subiri
comparativ cu cele ngropate n matricea de gel. Aceasta are o mare importan
pentru experimentele n care se recurge la gelurile n gradient cci pri diferite
manifest o sensibilitate difereniat fa de reactivi. Atunci cnd sunt
transferate pe membranele de transfer toate macromoleculele imobilizate sunt
egal accesibile, fiind de obicei, necesare cantiti de reactivi mult mai mici
dect n cazul gelurilor relativ voluminoase. Membranele de transfer umede
sunt pliable pretinzndu-se la manipulri mai uor dect gelurile. Timpii sunt
mai scuri dect la geluri.
Matricea de imobilizare

204

Cea mai utilizat nitroceluloza (NC). cu porii de 0,45 m (0,22 m ar

fi optim pentru proteinele cu greutate molecular mic i afinitate sczut de
legare la NC. pH-ul pentru tranfer este 8.
NC este potrivit att pentru transferul proteinelor, ct i acizilor
nucleici (ADN, ARN) de pe gelurile de poliacrilamid sau agaroz. Pentru a
evita anumite pierderi se aleg membrane cu porozitate mai mic. Exist hrtie
diazobenziloximetil (DBM).
Pe lng matricele celulozice descrise mai sus, au fost introduse i dou
tipuri de membrane de naylon pentru electrotransfer, ce posed unele avantaje:
ele sunt la fel de subiri i fin granulate ca i NC, dar mai rezistente i au o
capacitate de legare de 6 ori mai mare dect a NC. Rezistena mecanic NC
fragil fixare necovalent; Naylon rezistent, fixare covalent. Aceasta
nseamn c pot fi analizate cantiti mai mari de proteine, iar ncrcarea
cationic superioar a matricei ZB (zetabind) are drept urmare, comparativ cu
NC, transferuri mai bune de pe glurile PAGE-SDS, n care proteinele sunt
prezente sub forma complexurilor cu moleculele detergentului anionic. Este
adecvat i tranferurilor de acizi nucleici.
Metode de transfer
Exist trei modaliti prin care proteinele sau acizii nucleici sunt
transportai din gel pe matricea de imobilizare: prin difuziune simpl, flux de
solvent i sub influena unui cmp, ultima a fost introdus de Southern (1975).
Tranferul prin difuziune simpl este mai simplu, dar cea mai lent
metod de transfer. Gelul se plaseaz ntre dou coli ale membranei de
imobilizare sau de hrtie umezite, cu grij de a evita prinderea bulelor de aer.
Se adaug apoi 2 buci de burete de plas de naylon sau inox. Sandwich-ul
rezultat se cufund 24-48 de ore n tampon, producndu-se dou transferuri,
cte unul pe fiecare parte. Dac se folosete hrtie DBM sau DPT
(diazofenildieter) trebuie evitat prezena aminelor n tampon, altminteri
putndu-se folosi orice tampon.
Trasferul cu ajutorul fluxului de solvent numit uneori transfer capilar,
se poate realiza prin amplasarea gelului peste 2-3 coli de Nhatman 3MM sau
vreo alt hrtie absorbant impregnat de transfer i sprijinit pe un blat sau un
burete umezit cu tampon deasupra gelului se aaz un fragment de membran
de transfer, iar cteva foi de hrtie absorbant sau erveele se pun peste hrtie
de transfer, totul fixndu-se cu ajutorul unei greuti. n felul acesta tamponul
trece i este absorbit de eveele. Transferul este lsat s continue i peste
noapte. Metoda este mai rapid i mai eficient dect transferul difuzional,
putnd deveni i mai rapid prin aplicarea unui vid slab.
205

Fig. Tehnica de electrotransfer.

Metoda Southern blot
Metoda de transfer cea mai rspndit a proteinelor sau a acizilor
nucleici, fiind de aceea cunoscut drept electrotransfer sau Southern.
Se umezete o membran de transfer care se aaz peste gelul ce
urmeaz a fi transferat i care, la rndul su, este plasat pe un suport poros
(burei sau hrtie de transfer umed) i apoi un suport rigid de plastic. Este
important s fie evitat prinderea bulelor de aer ntre membran i gel,
deoarece acestea micoreaz sensibil eficiena de transfer i distorsioneaz
configuraia de benzi. Se poate adauga un al doilea strat poros i unul rigid
peste membrana de transfer, ntreg sandwichi-ul fiind strns cu ajutorul a dou
benzi de cauciuc care menin un contact strns ntre gel i membran i
mpiedic mprtierea benzilor n cursul transferului. Sandwici-ul este
amplasat ntr-un tanc cu tampon de transfer ntre 2 electrozi . Electrozii pot fi
ataai pe laturile tancului trebuind s acopere o suprafa mare i s genereze
un cmp electric omogen peste toat suprafaa gelului. Unele sisteme utilizez
electrozi din plas de inox ns abordarea comun recurge la electrozi n zigzag
n srm de platin. Tampoanele de transfer folosite au pH = 3 sunt optime
pentru transferul acizilor nucleici pe NC.
Majoritatea generatoarelor de curent folosite pentru electroforez se
limiteaz la 200-500 mA, tensiunea crescnd progresiv n cursul transferului
pe msur ce compuii tamponului din gel sunt elaui i contribuie la
conductivitatea tamponului de transfer. Transferul se realizeaz n 1-3 ore.
Tehnica Souther blot este nc utilizat n diagnostic.
206

Prima dat s-a folosit n studiul polimorfismului de restricie. RFLP

sunt variaii ale secvenelor de ADN relevate prin modificri ale hrii de
restricie. ADN este supus unei digestii cu una sau mai multe enzime de
restricie urmat separare n gel de agaroz.
Vizualizarea este posibil prin adiia de bromur de etidiu i
examinarea la UV d un aspect de frotiu. Acest aspect evideniaz buna
digestie a ADN studiat. Foarte rar sub 1% din cazuri hidroliza este incomplet;
pentru ameliorarea digestiei se adaug alt enzim spermidina i se verific din
nou digestia. n cazuri rare se produce o supradigestie. Odat ce calitatea
digestiei a fost verificat se pot pune toate probele de analizat. Tratamentul
gelului permite ruperea ADN n fragmente mici i denaturarea cu sod caustic
pentru obinerea ADN monocatenar. Transferul pe membrane este astfel mai
eficace. Tratamentul gelului se face n trei etape: depurinare, denaturara,
hibridare.
ADN este apoi transferat (blot) printr-un fenomen de capilaritate pe
membran de NC, sau Naylon, Hrtia Watman 3mM i hrtia absorbant, care
atrag ADN prin caplaritate. ADN este astfel absorbit de membrana NC sau
Naylon. Apoi este fixat pe membran covalent prin cldur 80C 2 ore. Se
poate pstra membrana uscat n pung mai multe sptmni, sau se pune n
contact cu sonde.

Localizarea benzilor de ADN de cercetat pe membran

207

Membrana va suferi un prim tratament de prehibridare pentru saturarea

situsurilor de fixare nespecifice poteniale ale sondei pe membran. Aceast
etap este esenial pentru limitarea erorilor n timpul revelrii. Apoi se face
hibridarea. Este indispensabil denaturarea sondei 5 minute la 95C (n ap
fierbinte). Teoretic sonda nu se hibrideaz dect la ADN int complementar.
Splrile se realizeaz cu scopul de a lsa sonda s se fixeze numai pe ADN
int i nu pe situsuri nespecifice. Splrile se fac cu soluii mai mult sau mai
puin bogate n sruri (stringente). O soluie stringent este destabilizant
pentru hibrizi. Se ncepe splarea cu soluii mai concentrate (puin stringent)
i apoi se scade concentraia, crete stringena pn cnd numai sonda
complementar va rmne fixat pe membran.
Este posibil hibridarea membranei, ndeprtarea sondei fixate pe ADN
i rehibridarea cu o nou sond. Se pot face pn la 10 rehibridri succesive.
Revelarea se face prin autoradiografie, colorimetric sau prin
chimiluminiscent.

Fig. Hibridarea ADN n funcie de stringena soluiilor utilizate.

208

Fig Evidenierea fragmentelor hibridate prin autoradiografie.

Southern blot metoda este calitativ pentru identificarea modificrii
situsurilor de restricie, care necesit cunoaterea hrii de restricie. Se aplic
pentru studiul remanierii genelor, identificarea secvenelor repetate n tandem,
diagnosticul mutaiilor dinamice, maladia X fragil.
Fig

209

F
Fig. Identificarea modificrii situsurilor de restricie.

210

Fig. Modificarea situsurilor de restricie n cazul secvenelor repetate n

tandem.
Dezavantaje: este de durat. Necesit cantiti mari de ADN.
Sensibilitatea este redus. D erori. Un ADN anormal ntr-un mediu de ADN
normal, n tumori este depistat dac reprezint cel puin 5% din ADN de
studiat.
Identificarea proteinelor pe membrana de transfer.
Membranele NC pot fi colorate n vederea identificrii proteinelor cu
ajutorul coloranilor proteici uzuali ntre care Amido Black este cel mai des
ntlnit. n cazul proteinelor imobilizate pe suprafaa unor membrane subiri,
timpii de colorare decolorare sunt mult mai redui fa de gelurile plac, ceea
ce face potrivit colorarea timp de cteva minute n Amino Black 0,1% sau
Comassie Brilliant Blue R 250 0,2% n metanol 45% care conine acid acetic
urmat de o decolorare de 5 minute n metanol 90%, ce conine i acid acetic
2%. Mai mult de 5 minute membrana NC se dezintegraz. Membranele
decolorate sunt splate cu ap 1-2 ore, apoi uscate ntre coli de hrtie de filtru.
Proteinele i acizii nucleici radiomarcai cu 32P, 35S, 125I, sunt detectai
prin autoradiografie.

Fig. Identificarea proteinelor prin autoradiografie.

Acizii nucleici pot fi identificai prin colorarea cu bromur de etidiu,
dar comparativ cu gelurile, timpii de colorare necesari sunt mult mai scuri.
211

Identificarea imunologic a proteinelor este ncadrat pentru toate

tipurile de membran de transfer prin imobilizare. Dup etapa de transfer, toate
situsurile de legare suplimentar de pe matrice trebuie blocate cu protein n
exces, apoi se leag un anticorp specific, apoi un al doilea anticorp, antispecific
primului anticorp. Acest al doilea anticorp poate fi marcat fluorescent (cu
izotiocianat de fluorescein), radiomarcat sau conjugat cu o enzim precum
peroxidaza de hrean sau fosfataza alcalin. Dup Towbin i col., 1979 prin
procedeul enzimatic pot fi identificai pn la 100 pg de protein.

Fig. Imunobloting
Hibridarea in situ a ARNm
Un esut este format din mai multe tipuri de celule fiecare exprimnd un
lot de gene. Astfel, dou celule adiacente din acelai esut, pot s nu exprime
aceleai gene. Este uneori nevoie s se cunoasc localizarea transcrisului genei
studiate cu scopul de a aprofunda cunoaterea modului de expresie a lor.
Principiul hibridrii in situ a ARNm const n determinarea pe seciuni
a celulelor dintr-un esut care acumuleaz o populaie de ARNm cunoscut.
Aceast tehnic se bazeaz pe hibridarea molecular. Moleculele int
sunt reprezentate de ARNm prezent n celule. esutul sau organul de cecetat
este fixat chimic, inclus n parafin secionat la 5-10 m grosime, apoi pus n
contact cu sonda. Sondele utilizate sunt n principal de ADN marcat
(ribosonde). Ribosondele sunt realizate prin transcripia n vitro a catenei
complementare a ARNm int n prezena UTP marcat. Acest UTP este fie
marcat radioactiv (n general de 35S) UTP i mai recent 33P sau chimic.

212

n cazul unei sonde radioactive, o emulsie fotografic lichid i

tanslucid este turnat pe seciune dup hibridare i splare. Aceast emulsie se
va solidifica urmnd conturul seciunii. Radiodioactivitatea poate imprima
local filmul i seciunea este examinat la MO. Exist o suprapunere a
structurii celulare i a precipitatului de granule argint. Marcajul chimic a
ribosondelor se face n general cu ajutorul UTP cuplat cu o digoxigenin
(extract digital) o hapten steroid.
Dup hibridare i splare hibridul ARN/ARN este detectat cu
ajutorul antidigoxigenin cuplai cu o fosfataza alcalin. Activitatea
enzimatic purtat de anticorpi este detectat prin adiia unui substrat care
formeaz un precipitat colorat. Observaia lamelor la microscop permite
vizualizarea acestui precipitat la nivel celular i se deduce localizarea
transcriptului (fig. 109).

Fig,
Ca i n cazul hibridrii moleculare pe filtre, splrile adecvate permit
eliminarea tuturor hibridrilor nespecifice. Hibrizii sunt evideniai i seciunile
sunt examinate la microscopul optic. Coloraiile adecvate permit delimitarea
structurilor celulare i celule care au acumulat.

213

Fig. 109. Utilizarea unei sonde reci.

ARNm cercetat este identificat. Exemplul dat se refer la seciunea
printr-o rdcin. Hibridarea in situ a ARNm a dovedit prezena genelor
reglatoare n cursul embriogenezei Drosophillei i a permis delimitarea
sectoarelor unde acumularea difereniat a ARNm creeaz diferenierea ntre
diferite tipuri de esuturi n cadrul embrionului.
Northern Blot
Sonda este constituit din ADN dar inta este un ARN.
Principiu: derivat din Southern blot permite transferul ARN de pe gel
de electroforez pe membran de naylon sau nitroceluloz. Moleculele de ARN
sunt izolate i purificate dintr-un esut apoi separate prin electroforez ARN
total sau poliA migreaz n gel de agaroz denaturant pentru a aboli structurile
secundare de ARN care inhib migrarea. Agentul denaturant este formamid.
Dup migrare, ARN este transferat pe membran de NC sau naylon dup care o
sond marcat specific se hibrideaz cu ARN int. ARN complementar sondei
este astfel identificat.

214

Fig. Hibridizarea acizilor nucleici.

Se poate determina dac genele Gal sunt transcrise n cazul creterii
unor levuri n mediu cu glucoz i nu de galactoz cum ar fi normal. Dou
culturi de drojdii slbatice se cultiv n dou medii mbogite: unul cu
glucoz, unul cu galactoz. Se extrage ARNm din fiecare cultur, se plaseaz
n spaii separate pe agar. Acesta migraz n funcie de dimensiune. sARNm
fracionat este transferat pe o membran de transfer prin capilaritate.
Membrana de transfer este introdus ntr-un amestec de soluie care conine
sonde ADN Gal radioactive, obinute din clone Gal. Sondele hibridizeaz
cu ARNm pe membrane. Excesul de sonde nelegate este splat.
Un film de raze X este aezat pe membran care detecteaz ARNm
hibridizat cu sonde radioactive. Autoradiograma releveaz prezena
GalARNm n celulele crescute cu mediu de galactoz dar nu i la celulele
crescute n mediu de glucoz. Se poate concluziona c genele Gal nu sunt
transcrise n levurile care cresc cu glucoz.
Dezavantaje: sunt necesare cantiti mari de ARN 10-20 g. pentru ARNm
prezent n cantiti mici este necesar 0,5-3 g ARN poli A.

215

ARN este foarte sensibil la RNaz se lucreaz n condiii foarte stricte.

Toate soluiile trebuie tratate cu dietilpirocarbonat (DEPC), inhibitor puternic
de RNaz i cu ap deionizat steril. n ciuda precauilor ARN se degradeaz
parial provoac un frotiu i scade sensibilitatea metodei.
Aplicaii: dozarea ARN i msurarea mrimii, evidenierea ARN pentru
studiul expresiei genei, evidenierea intermediarilor ARNm, cercetarea ARNm
diferii codificai de aceeai gen.

Variante Northern blot: slot blooting i dot blooting

Sonda este constituit din ADN dar inta poate fi ADN monocatenar
sau ARN.
Principiul este acelai dar ARN nu migreaz n gel ci se depoziteaz
direct pe o membran de hibridare la o concentraie cunoscut, ntr-o fant blot
sau ntr-un orificiu rotund dot. Dup hibridare ntre sond i int intensitatea
petei radioactive obinut reflect concentraia acidului nucleic studiat (sonda
fiind situat pe acizii nucleici int). Aceast tehnic este mai rapid de
manevrat dect Southern i Nouthern blot. Totui trebuie ca sonda de ADN s
fie sigur, adic foarte specific secvenei int cercetate, deoarece este absent
separarea moleculelor int n funcie de talie (prin electroforez). Metoda
mpiedic decelarea hibridrilor nespecifice.
216

Avantaj: permite dozarea a numeroase probe.

Acest tip de hibridare ADN-ARN permite evaluarea mrimii ARNm studiat i a
proporiei de acumulare a unei populaii de ARNm ntr-un esut dat.
De asemenea, poate fi determinat ARNm la un anumit moment din
timpul dezvoltrii sale, n diferite faze ale embriogenezei sau sub efectul unui
stres.

Fig. Slot blooting.

O variant a acestei tehnici este utilizat i n diagnosticul afeciunilor
tumorale. Oligonucleotidele pot fi utilizate ca sonde de ARNm din celule i se
determin dac genele sunt expresate sub influena unor factori. n acest
experiment reeaua conine 65 000 oligonucleotide diferite, secvene care
corespund la 1500 de gene umane. Scopul acestui experiment este de a
analiza expresia genelor n dou tipuri de celule canceroase umane. ARNm
este izolat din fiecare tip celular. sARNm este convertit ntr-un sADNc marcat
fluorescent. Pentru melanom sADNc int este legat de un fluorofor verde,
iar pentru carcinom mamar sADNc int este marcat cu fluoroforul rou.
Amestecul celor dou tipuri de nucleotide cADNs sunt incubate cu
oligonucleotidele cu rol de sond i sunt supuse unor condiii de
hibridizare. n momentul detectrii prin scanner zonele
hibridizate
sensibilizeaz datorit semnalelor fluorescente. Oligonucleotidele care
hibrideaz cu sADNc melanom sunt colorate n verde iar cel pentru carcinom
n rou. Oligonucleotidele care hibridizeaz cu ambele tipuri de celule sADNc
sunt galbene. ntruct poziia fiecrei oligonucleotide este cunoscut,
identitatea ADNc se identific pe baz de complementaritate. Cunoatem care
gene sunt activate de cancere.

217

Fig. Tehnic utilizat n diagnosticul afeciunilor tumorale.

Dot blat invers derivat

Sondele sunt fixate pe membrana de nitroceluloz sau microplac.
Sondele sunt specifice alelelor ASO. Produii PCR sunt adugai n a doua
etap i se vor hibrida numai pe sonda specific. Metoda este utilizat n
diagnosticul bolilor genetice, mucoviscidoz, thalazemie, tipizarea bacteriilor.
Mutaiile sunt detectate cu sonde specifice.
Sondele sunt fixate pe membran sau microplac. Produsul PCR studiat
este depus n fiecare godeu din microplac care conine fie sonda specific
mutaiei pentru 5 mutaii 5 sonde, fie sonda normal. Principiul este numit
hibridare invers. Produsul PCR se va hibrida doar prin complementaritate
strict. Dac produsul PCR este biotinilat (una din amorse) relevarea n godeuri
se face colorimetric dup adugarea conjugatului streptavidin fosfataza
alcalin i a unui substrat cromogen.
Citirea vizualizarea prezenei sau absenei benzii.
Indicaii: tehnica este utilizabil cnd o mutaie sau grup de mutaii sau
polimorfism sunt frecvente i caracterizate. Se poate realiza screeningul rapid
al acestor mutaii.
218

Kituri comerciale pentru Dot blot invers

Se utilizeaz mai multe sonde specifice pentru genotipizarea virusului
hepatitei C.
Tehnica este asemntoare cu Westhern Blot. Dup hibridare pe
membrane de nitroceluloz acoperite cu sonde specifice genotipului,
membranele sunt splate i citite prin colorimetrie direct se observ genotipul
virusului.
Se cunosc kituri care detecteaz:
- mutaia de la bolnavii care prezint risc crescut de tromboz venoas;
- betaglobina care detecteaz mutaiile pentru betatalezemie;
-gena hemocromatozei permite diagnosticul la 85% din bolnavi;
-pentru muscoviscidoz, pentru detectarea rezistenei la rifampicin al
M. tuberculosis;
-identificarea apolipoproteinei E n boala Alzeimer i pentru
diagnosticul HIV.
Tehnica RPA (protecia RNazei)
Tehnica este de 10 ori mai sensibil dect Northern blot utilizat
frecvent pentru studiu ARN. O sond ARN antisens monocatenar, parial
complementar cu ARN de studiat, marcat radioactiv sau nu, este pus n
contact cu ARN int cu care se hibrideaz.
ARN int astfel hibridat este protejat de aciunea RNazelor T1 i A
adugate n mediu, care vor distruge tot ARN nehibridat. Dup inactivarea
RNazelor i precipitarea hibrizilor ARN int-ARN sond acetia migreaz pe
gel de poliacrilamid i sunt revelai prin autoradiografie.
Este o tehnic cantitativ.

219

Fig. Tehnica protecia RNazei.

220

Tehnica permite obinerea sondei ARN antisens.

ADN int cel mai frecvent, este introdus ntr-un plasmid care conine
un promotor bacterian T7, T3 sau SP6. ADN plasmidului este linearizat cu o
enzim de restricie care secioneaz n aval de sond la captul 5' (a ADN
int) i nu se utilizeaz enzime care secioneaz n 3'.
Dup adugarea ADN polimerazei adecvate se va sintetiza ARNc care
servete ca sond pentru testul RPA. Sonda va fi marcat radioactiv sau nu, iar
ADN care rmne dup sinteza sondei este distrus cu DNaz. Nu este totodat
necesar examinarea sondei pe poliacrilamid, dar trebuie verificat calitatea
acesteia.
Hibridarea este realizat n general la 42-45C, ntr-un mediu care
conine sub 80% formamid. Aceast tehnic poate fi realizat pe ARN total
sau pe ARN polyA. Aceeai cantitatea de ARN trebuie s fie prezent, dac
este posibil, n fiecare eantion pentru a facilita digestia prin RNaz adesea
ARNt este adugat pentru corectarea diferenelor. Metoda are avantaje c poate
fi utilizat iar o parte de ARN este degradat. Dozarea ARN se realizeaz mai
bine dect Northern-blot. Tehnica are un rol important pentru cartarea
situsurilor de iniiere ale transcripiei.
Studiul mutaiilor punctuale
Tehnica are sensibilitate slab 30-60%. Pentru mbuntirea acesteia se
folosete RNaz I n loc de RNaz A i T.
Metoda permite localizarea grosier a mutaiilor. Poate detecta o
mutaie ntr-un fragment mare (pn la 1 kb).
Avantajul RPA fa de Northern-blot.
- volumul reacional este mai mic. Se poate folosi ARN polyA n RPA
fiind suficient o cantitate de 10g pentru detectarea a 5
copii/celul. RPA are o putere de selectare important care permite
diferenierea precis a ARNm cu secvene omoloage ntr-o aceeai
specie.
RPA este adaptat pentru determinarea ARN potenial degradat de la
bolnavi, spre deosebire de Northern-blot care necesit ARN integru.
Este o metod mai uoar i rapid dect Northern-blot.

Construcia unei bnci de ADN genomic

Obinerea unei bnci genomice este necesar atunci cnd se dorete
caracterizarea unei secvene genomice particulare, stabilirea hrii fizice a unui
221

genom, sau secvenializarea la scar mare a poriunilor sau n totalitate a unui

genom.
O banc de ADN genomic este un ansamblu de vectori recombinani
coninnd fiecare o bucat diferit din genomul speciei studiate. Principiul
const n izolarea ADN genomic a speciei de interes, digerarea acestui ADN
prin enzim de restricie care permite elibrarea fragmentelor de restricie de
mrime compatibil cu vectorul ales, cu scopul clonrii acestor fragmente n
vectori de clonaj i apoi integrarea acestor vectori recombinani n
microorganisme n vederea multiplicrii.
Vectorii fagici sunt cel mai bine adaptai pentru clonarea unei secvene
genomice, n special atunci cnd cosmidele i Yac-urile vor fi alese cu scopul
caracterizrii unui genom. Banca obinut este constituit din milioane de clone
recombinante.
ADN genomic fiind considerat identic n toate celulele aceluiai
individ, proveniena tisular a ARNm, nu are importan. De exemplu, o banc
genomic fcut din ADN rdcinii unei plante, este identic cu a bncii
genetice fabricat din ADN -ul frunzelor aceluiai plante (fig. 110).

222

Fig. 110. Construcia unui ADN genomic.

Construcia unei bnci de ADN complementar
Populaiile de ARNm acumulate ntr-un esut dat sunt reprezentative
pentru acesta. Ele sunt importante n primul rnd pentru a putea caracteriza
genele exprimate ntr-un organ determinat (fig. 111).

223

Fig. 111Construcia unei bnci de ADNc.

Dar manipularea ARNm este delicat (trebuie folosit o cantitate mic,
fiind foarte sensibil la nucleaze) i de aceea este necesar transformarea acestui
ARNm n ADN dublu catenar uor de manipulat i adaptat la clonaj n vectori
bacterieni. O banc de ADN complementar este deci reprezentat de populaiile
de ARNm prezente ntr-un esut dat, la un stadiu determinat din dezvoltarea lui.
224

Spre deosebire de banca genomic o banc de ADN complementar va fi

specific unui esut. O banc de ADNc poate fi considerat o fotografie
instantanee a populaiilor de ARNm reprezentate ntr-un organ.
Construcia unei bnci de ADNc necesit numeroase etape.
Principiul const n purificarea ARNm poliadenilat al organului prin
cromatografie cu afinitate pe o clon poliT.
Copierea acestui ARNm n ADN monocatenar complementar prin aciunea
unei transcriptaze inverse.
Eliminarea specific a ARNm prin ARN-aza H sau folosind o soluie
bazic.
Sinteza catenei complementare ADN de ctre o ADN polimeraz.
Legarea oligonucleotidelor (adaptatoare) pentru crearea situsurilor de
restricie.
Legarea ntr-un vector de clonaj (plasmid sau fag).
Integrarea vectorilor recombinai ntr-o bacterie. Vectorii de clonaj utilizai
pentru construirea bncii de ADNc sunt fie plasmide fie fagi.
Sinteza catenelor de ADNc este amorsat n general prin fixarea unei
secvene scurte poli T pe extremitatea poliA a ARNm.
O alt metod o constituie utilizarea ca amors pentru sinteza catenelor
de ADNc prin intermediul transcriptazei inverse, a unui amestec de
hexanucleotide sintetice care corespund la numeroase secvene diferite i
hibridate la ntmplare pe ARNm. Totui cum prin definiie amorsarea sintezei
de ADNc se face pe partea intern a ARNm, ADNc obinut nu corespunde
dect fragmentelor de ARNm.
Sonda hibridizat
Pentru a putea recunoate specific o secven de ADN, se utilizeaz n
laborator un mic fragment de ADN sintetizat (sond), a crui secven
corespunde parial unuia din lanul de ADN. Pentru c acesta este ADN
complementar sondei, este capabil s se fixeze specific pe un lan unde se leag
de secvena complementar (fig. 112). Marcnd sonda cu un atom radioactiv
sau cu o molecul fluorescent legat covalent la una din nucleotidele sondei,
se poate detecta sonda i fragmentul de ADN complementar cu care este
hibridat.

225

Fig. 112. Sond hibridizat marcat radioactiv.

Sonde specifice alele
n anemia falciform, o boal a globulelor roii, acestea sunt deformate
printr-o cristalizare anormal a hemoglobinei. Aceast cristalizare se datoreaz
substituirii A-T n al 6-lea codon. Substituia se exprim printr-o mutaie acid
glutamic (Glu) 6 cu valina (Val) al lanului beta al globinei (fig. 113).
Electroforeza ADN a genei HbB, care codific lanul beta a globinelor este
relevat prin dou sonde una specific secvenei normale i cealalt sond
proteinei specific mutaiei (ASO-Allele Specific Oligonucleotide).

226

Fig. 113. Sonde specifice alele.

ADN subiectului poate fi evideniat:
-printr-o singura sond normal, dac posed dou gene HbB normale
(homozigote normale),
- printr-o singur sond a proteinei mutante dac posed 2 gene HbB
responsabile de mutaie (homozigote mutante) i
- prin dou sonde dac ele posed o gen normal i o gen a proteinei
mutante (heterozigote). Subiecii homozigoi mutani sunt bolnavi de anemie
falciform i fac crize grave. Subiecii heterozigoi sunt purttori ai trsturilor
bolii de anemie falciform, ei nu manifest dect puin boala i o transmit la
descendei.
Hibridarea specific a alelelor sau tehnica oligonucleotidelor
specific alelelor ASO
Este utilizat cnd mutaia punctual este cunoscut . Se folosesc dou
sonde fiecare specific unei alele. Dup imobilizarea ADN pe o membran de
nitroceluloz o sond se va hibrida specific cu alela normal i cealalt cu alela
mutant.
Condiiile de hibridare sunt specifice fiecrei hibridri. Se realizeaz
PCR al fragmentelor de studiat. Produsul PCR este depus pe membrana de
nitroceluloz printr-o fant (sau orificiu rotund) apoi membrana se taie n dou
(rezult dou semimembrane ).
Cnd depozitul de pe membrana are form de fant este numit slot blot,
iar cnd e rotund- dot blot. Dup fixarea ADN de studiat pe fiecare
semimembran sondele se supun hibridrii n condiii stricte: cea normal pe
prima semimembran , iar cea mutant pe a doua. Dup hibridare, relevarea se
face prin autoradiografie, colorimetrie sau prin chimiluminiscen. Se pot

227

studia mai multe mutaii folosind mai multe semimebrane pe are se depune
acelai produs amplificat.
Inconveniente.
Sunt necesare numeroase ncercri obinute de sonde bune. Utilizarea
de clorur de tetrametilamoniu TMACl 3M care mbuntete specificitatea
sondei. n prezna TCMCl se pot folosi 1-2 sau mau multe sonde de aceeai
lungime, fiecare specific unei alele.

Criblajul unei bnci

Criblajul unei bnci genomice sau de ADNc const n selecionarea
specific a clonelor care conin secvena genei de cercetat.
Cu scopul de a identifica clonele care intereseaz, este indispensabil o
etap prealabil de replicare a bncii. Coloniile bacteriene sau plajele de liz
sunt transferate pe o membran de hibridare de nitroceluloz sau naylon (fig.
114).
ADN-ul lor este denaturat prin scufundare ntr-o baie de sod, fixat
covalent pe o membran i hibridat cu diferite tipuri de sonde nucleotidice
marcate radioactiv. Se detecteaz sondele pozitive care rspund la hibridizare i
care pun n eviden secvena de cercetat.

228

Fig.114. Criblajul unei bnci cu ajutorul unui fragment de ADN.

229

Utilizarea unui fragment de ADN ca sond

Fragmente de ADN (ADNc, fragmente rezultate n urma PCR,
oligonucleotide) cunoscute ca posednd o omologie cu ADNc sau a genei de
cercetat, pot servi ca sonde n vederea criblajului bncii. Fragmentul de ADN
sond este marcat prin amorsaj aleatoriu sau prin translaia seciunii.
Membranele de hibridare consinnd vectori ai bncii sunt incubate cu aceste
sonde i clonele pozitive (hibridat cu sond) sunt reperate i prelevate.

Fig. Utilizarea unui fragment de ADN ca sonda

Utilizarea unui oligonucelotid de sintez ca sond
Cunoaterea secvenelor de proteine din care se dorete izolarea genei,
face posibil desemnarea unei secvene de nucleotide corespondente urmrind
regulile codului genetic. Datorit degenerrii codului genetic sunt obinute mai
multe secvene nucleotidice. Un aminoacid este codificat prin mai muli codoni
diferii atunci cnd codul genetic este degenerat. Exemplu, alanina, este
codificat de 4 codoni: GCU, GCC, GCA, GCG. Amestecul de nucleotide (2030 baze pentru fiecare oligonucleotid), este sintetizat , marcat radioactiv i
hibridat cu clone fixate pe filtru.
Criblaj prin anticorpi
Uneori nu se cunoate secvena proteinei i a genei de clonat. O metod
biochimic poate duce la purificarea unui polipeptid i obinerea anticorpilor
specifici ai acestei proteine. Aceti anticorpi pot fi utilizai pentru a izola
230

ADNc, pornind de la o banc de ADNc corespondent. Aceasta presupune c

banca ADNc s fie construit ntr-un vector de expresie. Situsul de inserie a
ADNc n vector se gsete n aval sau dup promotorul bacterian.
Astfel, bacteriile din banc coninnd aceti vectori recombinani sunt
capabili de sinteza proteinelor corespunztoare secvenei de ADNc.
Membranele de hibridare coninnd banca de ADNc sunt incubate cu anticorpi
mpotriva proteinelor din care se vrea clonarea ADNc. Bacteriile care posed
ADNc corespondente vor putea sintetiza proteina care va fi recunoscut de
anticorpi. Pentru aceasta trebuie ca ADNc s fie n bun stare de citire, pentru
ca aceti codoni s fie citii corect. Complexele stabile antigen-anticorp sunt
puse n eviden prin reacii colorimetrice cu ajutorul unor anticorpi primari,
cuplai cu alii secundari specifici primilor, care au ataat fosfataza alcalin.
Clonele care rspund de aceste hibridri sunt reperate pe plcile Petri i
prelevate (fig. 115).

Fig. 115. Criblajul unei bnci cu ajutorul anticorpilor.

Metode de amplificare

231

Diagnosticul prin sonde moleculare este o metod de identificare care la

ora actual are o eficacitate remarcabil.
Metodele de amplificare genetic in vitro permit mbuntirea i
reproducerea accelerat a unui numr mare de copii a unei secvene de ADN
identice. Pentru amplificarea semnalului obinut prin hibridarea molecular
ntre int i sonda marcat este necesar multiplicarea numrului de sisteme
generatoare de semnal. Pentru aceasta se poate aciona la 3 nivele:
- Amplificarea numrului de secvene ADN int, metode ca PCR
genereaz un numr considerabil de copii identice. Se pot obine
copii 109 (de ordinul milioanelor)
- Amplificarea numrului de sonde. Se multiplic numrul de
sonde formate din acizi nucleici ajungnd la un numr de copii de
acelai ordin ca i pentru amplificarea intei.
- Amplificarea semnalului. Const n creterea capacitii sistemului
de amplificare de a crea un semnal prin hibridarea cu un numr
crescut de sonde marcate fr a modifica cantitatea de molecule
int prezente iniial.
Acesta nu este un sistem de amplificare genic dar exploateaz un
sistem original de sonde nucleice, care confer o sensibilitate superioar
sondelor tradiionale. Are aplicaii n amplificarea genic.
Amplificarea intei prin reacia de polimerizare n lan
PCR (polimeraze chain reaction)
Reacia de polimerizare n lan permite amplificarea specific a unei
regiuni de ADN dublu catenare, de cteva sute de perechi de baze.
Descoperitrea unei bacterii termofile care triete n izvoare calde la 7075C n parcul Naional Yelloustane bacteria Thermus aquaticus i utilizarea
polimerazei sale stabile pn la temperatura de 100C au stat la baza dezvoltrii
acestei tehnici.
Principiu: PCR se bazeaz pe capacitatea ADNpolimerazei, respectiv
Taq polimeraza, de a sintetiza catena complementar unui ADN matrice. Pentru
iniierea procesului se asociaz un segment ADN care servete ca amors.
Amorsa sau primerul este o secvena complementar lanului de
amplificare, este oligonucleotid sintetic de 17-30 baze.
Asocierea sa la ADN int este urmat de elongaie prin aciunea ADN
polimerazei rezultnd sinteza unui ADN dublu catenar.
Mediul tampon reacional conine toate elementele indispensabile
polimerizrii: precursorii sau trinucletidelor dATP, dTTP, dGTP, dCTP, cation
Mg indispensabil bunei funcionri a enzimelor i ncorporrii corecte a
232

precursorilor, ADN polimeraza respectiv Taq polimeraza i amose sau primeri.

Se adaug ADN extras din mediul biologic de studiat.
PCR const n succesiunea ciclic de 3 etape:

Fig. Derularea PCR. Curba PCR.

-denaturarea termic (90-95C) const n separarea prin cldur a
lanului de ADN.
-hibridarea amorsei sau a primerilor: mediul conine 2 amorse
fiecare complementar unui lan care determin capetele secvenei de
amplificat. Mediul este adus la o temperatur inferioar Tm a amorsei. Tm n
funcie de secven este 45-70C. Amorsele n exces se hbrideaz cu ADN
monocatenar care conine secvene complementare.
-extensia amorselor. ADN polimeraza respectiv Taq polimeraza
alungete amorsele ncorpornd dNTP complementare matricei. Sinteza se
233

efectueaz n sensul 5'-3' la temperatura de 72C. La sfritul ciclului se obin

dou secvene de ADN int. ntr-un nou ciclu de denaturare, hibridare i
extensia amorsei, se dubleaz numrul de copii.

Fig. Tehnica PCR.

Iniial fiecare etap dureaz 1 minut. Actualmente n funcie de aparat
dureaz 15-20 secunde. n general se efectueaz 25-40 cicluri n 1,5-4 ore
genernd un numr foarte mare de copii. La 30 cicluri se obin 2 30 copii (peste
1 miliard). Randamentul fiecrui ciclu nu este totdeauna de 100%. Secvenele
de amplificare trebuiesc cunoscute dinainte.
Optimizarea PCR
Principiul alegerii amorsei. Exist aparate care permit definirea rapid a
amorsei dintr-o secven dat.
Principii generale pentru desemnarea PCR:
- Mrimea amorsei 20-30 pb;
- Secvena de nucleotide s fie exact complementar segmentului de
amplificat i cu 50% G,C. n ambele cazuri clonare/subclonare
complementaritatea bazelor nu trebuie s fie absolut.
234

Amorsele s nu prezinte fenomene de hibridare ntre ele sau s nu

fie autocomplementare, mai ales a-3-a parte a amorsei, deoarece
risc s amplifice amorsele benzii parazite.
- Amorsele nu trebuie s se bucleze pe ele nsele, s nu aib structur
secundar.
- Tm a amorsei s fie suficient de mare, minim 50C. Cu ct Tm este
mai mare riscul de hibridare nespecific este mai mic.
- Tm a celor dou amorse s nu fie foarte diferit. Diferena ntre ele
s fie mai mic de 5C.
Numeroase aparate permit calcularea Tm a amorsei. n general
temperatura de hibridare se calculeaz n funcie de Tm a amorsei, adic Tm
-5C. O temperatur prea mic d hibridri nespecifice.
Parametrii de optimizare ai PCR
- Nu se pune o cantitate prea mare de ADN. n acest cazul unei cantiti
mai mari, se observ un aspect de frotiu pe gelul de electroforez (nu migreaz
normal).
- Se vor evita variaii de temperatur ale termociclorului.
- Nu se efectueaz prea multe cicluri, nu mai mult de 40, pentru c apar
benzi parazite.
Soluia clorur de magneziu are concentraie de 1-4 mM (optim ntre
1,5-2). Este o relaie invers ntre concentraia dNTP i concentraia MgCl.
dNTP chelateaz parial magneziu. Cu ct concentraia dNTP crete scade Mg
liber. n general se utilizeaz NTP 200 M. Concentraia fiecrui dNTP trebuie
s fie identic pentru a evita ncorporrile eronate.
-Concentraia Taq polimerazei nu trebuie s fie prea mare, pentru 50 l
reacie se pun 0,2-0,5 uniti. Concentraia prea mare d benzi parazite sau
inhib reacia.
-Secvena de amplificat trebuie s fie bogat n GC. Secvenele bogate
n GC pun probleme legate de temperatura de denaturare care trebuie s fie
ridicat. n cazul unui randament redus al PCR exist mai multe soluii de
evitare acestea fiind:
- utilizarea de dimetilsulfoxid n concentraie de 5-10%, care este
inhibitor al Taq polimerazei, nu trebuie s depeasc 10% pentru
c ar diminua Tm a amorsei;
- utilizarea de dITP (deoxiinozintrifosfat) n loc de dGTP sau dCTA,
care favorizeaz mperecherea cu oricare din cele patru nucleotide
prin legturi duble;
- utilizarea formamidei 2-5% reduce Tm a amorsei;

235

glicerol 2-5%. polietilenglicol 5-15% i clorura de tetraetilamoniu

(TEMACl) detecteaz mutaiile n tehnica ASO. Concentraia 3M
de TEMACl, inhib Taq polimeraza.
- n caz de benzi parazite nespecifice sunt posibile soluii n
realizarea unui PCR cu temperaturi diferite redate mai jos .
Principiul PCR prin metoda Hot Start. Hot Start Taq ADN
polimeraza este unul din compuii amestecului reactiv care nu este adugat n
timpul etapei de preparare PCR. Tubul reactiv este nclzit la temperatura
optim de aciune a Taq polimerazei la 80C, cnd se adaug compusul Hot
Start Taq ADN polimeraza i PCR demareaz la cald.
- exist i o alt variant cu parafin, n care Taq polimeraza este
ncorporat n bila de parafin i enzima se elibereaz la temepraturi
crescute.
- Taq polimeraza este activ la 72C i inactiv la temperatur mai
mic.
- O alt enzim ampli Taq Gold polimeraza pentru a fi activat,
amestecul se nclzete 10 minute la 94C.
- utilizarea Taq Start Taq polimerazei n prezena anticorpilor.
Anticorpii blocheaz Taq Start polimeraza la temperaturi ambiante i permit
intrarea ei n aciune la peste 70C.
Realizarea unui PCR la temperaturi mai joase prin scderea progresiv
dup un numr de cicluri ajungnd sub Tm a amorsei. Metoda este util atunci
cnd ADN int este puin cunoscut.
Inhibitorii Taq polimerazei
HEMul, dimetilsulfoxid (DMSO) peste 10%, heparin, dodecilsulfat
(SDS) i Sarcosyl, unii colorani sau indicatori pH albastru bromfenol sau
xilencianol, DNaze, fenol, poliamine, unele medii biologice recunoscute prin
coninutul mare de inhibitori urina i LCR. Exist mai multe soluii care pot
elimina progresiv substanele inhibitoare.
nclzirea probei 10 minute la 95 C.
Purificarea din nou a ADN, acesta putnd fi contaminat cu proteine n
urma extraciei rapide. O simpl extracie cu cloroform, alcool izoamilic (24/1)
este suficient.
Schimbarea ADN polimeraza. Unele polimeraze sunt rezistente la
inhibitorii Taq polimerazei. Acestea sunt ADN pol Tth i ADN pol Tfl.
PCR i martorii
PCR este o tehnic foarte sensibil. Dac o pictur de produs PCR
dintr-o reacie precedent contamineaz tubul care nu conine ADN int,
rezult PCR pozitiv datorit contaminrii.
Precauii pentru evitarea contaminrii:
236

-tuburile pentru fiecare serie PCR conin un martor pozitiv i mai muli
martori negativi. Martorul pozitiv este un ADN cunoscut care permite
verificarea condiiilor bune de preparare a amestecului reacional, amplificare
i detecie. Este necesar un numr rezonabil de copii.
n cazul unui rezultat de amplificare negativ al martorului, n boli
infecioase, se poate suspecta prezena de inhibitori ai Taq polimerazei. Se
caut inhibitorul fcnd o coamplificare adic amplificarea adugnd n acelai
tub un martor pozitiv cu concentraie cunoscut, la proba care a dat rezultat
negativ.
Dac dup coamplificare rezultatul este negativ nseamn c este
prezent inhibitorul. Deci se reia reacia dilund proba cu ap distilat steril de
ordinul 1/10E .
Dac i dup diluie proba este negativ nseamn c exist un inhibitor
imposibil de ndeprtat. Dac rezultatul este pozitiv nu mai exist inhibitor al
Taq polimerazei, deci rezultatul a fost cu adevrat negativ.
Martorii negativi sunt doi:
- primul tub, conine toi reactivii i enzima Taq pol. dar fr ADN,
pentru a ne asigura c nici reactivii nici enzima nu sunt contaminai.
- al doilea tub conine reactivi, enzima Taq pol i ADN martor, cu
amorse specifice. Verific specificitatea reaciei.
Precauii la nivelul reactivilor:
- toi reactivii se folosesc n volume mici. Se arunc reactivii
suspeci. Se sterilizeaz tampoanele, tuburile, pipetele i vrfurile.
Se decontamineaz pipetele.
- Se iradiaz zona de lucru cu UV 15 minute odat ce lucrul este
terminat.
- Se utilizeaz pipeta cu capete cu filtru. Se poate utiliza un sistem
chimic anticontaminant.
Studiul ARN prin PCR
RT-PCR Pentru studiul ARN prin PCR este necesar transcripia
invers care transform ARNm n ADNc i apoi se utilizeaz PCR.
Principiu: o enzim, trancriptaza invers, transform ARNm n ADNc
care va fi amplificat prin PCR. Tehnica PCR are nevoie de ADN polimeraza i
amors.
Se utilizeaz trei tipuri de amorse pentru sinteza ADNc:
- Oligo dezoxitimine (oligo dT), compui ai dezoxitimidinei trifosfat
12-18 dTTP care sunt utilizai pentru RT PCR a ARNm. ARNm,
fiind poliadenilat n 3' (coada poliA) oligonucleotidul dTTP se va
hibrida n 3' a ARNm i permite reverstrancripia i apoi
amplificarea.
237

Amorsele randomizate sunt hexanucleotide, sub forma unui

amestec de mai multe amorse foarte scurte de 6 perechi de baze
coninnd toate secvenele perechi de baze ale celor 6 nucleotide (3
purinice i 3 pirimidinice n ADN, ARN, 4 6). Aceast mare
diversitate permite unor oligonucleotide s se hibrideze cu ARNm
pentru a servi ca amorse. Cnd ARN este bogat n GC, adic are
structur puternic, unii autori recomandat acest tip de amors.
Amors specific, cu secven complementar ARN de studiat.

Fig. Primerii utilizai n RT-PCR

Amorsele funcioneaz similar. Metoda cu hexanucletide d
randamentul cel mai bun.
Transcriptaza invers sau reverstranscriptaza este o ADN polimeraz,
ARN dependent, capabil de o transformare ARN n ADNc. Poate copia
complementaritatea lanului resintetizat realiznd ADN dublu catenar.
Se utilizeaz des dou RT:
- AMV-RT extras din celule infectate cu virusul mieloblastozei aviare.
Are n plus o activitate important de RNaz H.
- MMLV (extras din virusul leucemiei oarecelui transformat de
Molony). Activitatea de RNaz H este mult mai slab dect la tipul AMV.
Ambele enzime au activitate ADN polimerazic 5'- 3'. ADN obinut ajunge la
10 kb. Exist o variant AMLV mai eficace numit Superscript RNaz H- care
nu are activitate de RNaz H. Matricea ARN nefiind distrus enzima va aciona
cu randament mai bun.
238

ARN. Pentru a obine o reacie RT optim este necesar obinerea unui

ADNc de calitate care s fie nedegradat de ARN az. Pentru acesta, n reacie
se adaug sistematic un inhibitor de RNaz numit Reneazin. Exist mai multe
tehnici de extracie a ARN. Se recomand extracie ntr-o singur etap. Uneori
este necesar obinerea ARNm pentru determinarea extremitii 5' sau 3' a
ADNc. Atunci se recomand s se elimine ARN care nu este poliadenilat, pe
care oligo dT nu se poate fixa.
n timpul extraciei ARN se poate produce contaminarea cu ADN. Se
trateaz ARN cu DNaz naintea transcripiei inverse pentru a distruge resturile
de ADN. Distrugerea ADN este necesar pentru c acesta conine pseudogene.
Bogia n GC a ARNm
Structurile secundare sunt mai greu denaturate i mpiedic aciunea
RT. Pentru a limita acest risc i a nu se obine ADNc incomplet este
indispensabil denaturarea ARN naintea nceperii RT la 70C. Se mai
recomand creterea temperaturii de reacie la 42C n loc de 37C.
Transcriptazele inverse acioneaz pn la 50C.
O alt posibilitate este utilizare a unei ADN polimeraze termostabil
care are activitate de transcriptaz invers. Exemplu, ADN pol Tth.
ADN pol Tth are dou activiti:
- activitate ADN polimerazic ca i Taq polimeraza; are activitate
nucleazic 5'-3' dar nu are activitate exonucleazic 3'-5'.
Activitatea ADN polimeraz Tth necesit MgCl. Temperatura optim de
aqciune este de 70C .
- activitate ADN polimerazic ARN dependent, deci de transcriptaz
invers. Aceasta necesit Mg sub form de sulfat; poate demara la 60C nainte
de a ncepe aciunea ADN polimerazei n faza PCR. Este necesar optimizarea
reaciei RT PCR fcnd o gam de soluii MgSO4 n care concentraia MgCl
este de dou ori mai mare dect a sulfatului. n general se ncepe cu 1,5 mM
MgCl i 0,75 mM MgSO4.
Risc de contaminare mic. Poate utiliza un decontaminant.
Inconveniente: are activitate optim la 70C i dac exist contaminare
cu ADN se amplific preferenial acesta. Pentru a-l elimina se adaug ADNaz.
Dureaz 60 minute n RT clasic. Dac se folosete Tth ADNpol nu trebuie
depit 15-30 minute deoarece poate determina ADNc trunchiat.
PCR ni (nested)
Metoda de amplificare n cursul creia produsul obinut ntr-o prim
etap prin PCR este din nou amplificat, cu ajutorul unei noi cuple de amorse
239

care se hibrideaz la partea intern a secvenei amplificate de aici denumirea de

nested (cuib).

Fig. PCR nested

Avantaje:
-sensibilitate i specificitate mai mare
Dezavantaje:
-risc de contaminare pentru c se deschide din nou tubul pentru a
aduga al doilea cuplu de amorse.
Seminested PCR. Produsul din primul PCR se amplific. Un primer
este nou, iar al doilea este unul din PCR precedent.
PCR pentru fragmente lungi este utilizat pentru amplificarea
fragmentelor de 100-1500 pb. n PCR obinuit fragmentele au 5 kb- 30 kb sau
mai mari.
Pentru amplificarea fragmentelor mari se respect:
- ADN de bun calitate, purificat
- ADN int s fie complet denaturat pentru a permite hibridarea
amorselor i extensia
- Timp de extensie suficient de lung pentru a permite ADN
polimerazei s efectueze sinteza complet a lanului complementar
- Erorile de ncorporare a nucleotidelor trebuiesc corectate
- ADN trebuie protejat de o degradare parial
- Amorsele trebuie s fie strict specifice genei de amplificat.
Condiii de lucru pentru ADN
- se utilizeaz PCR Hot Start; temperatura de hibridare crescut 6870C ; tampoane optimizate; un cosolvent DMSO sau glicerol, amorse
240

optimizate cu un numr minim de structuri secundare i cu aproximativ 30

baze.
Pentru programarea ciclurilor denaturate trebuie s fie scurt 5-300
secunde (optim 10 secunde). Numr de cicluri s nu fie mai mare de 25-30.
Temperatura de hibridare crescut. Aceast tehnic se utilizeaz n genetic
pentru secvenializare.
PCR specific alelelor
n unele domenii este necesar distingerea a dou alele care difer prin
una sau cteva nucleotide. Exemplu pentru cercetarea unei mutaii sau a
polimorfismului dialelic. Studiul duplexurilor amors ADN int a evideniat
dou caracteristici majore:
- n caz de mperechere greit a duplexului n 3' extinderea este
ncetinit foarte mult n raport cu un duplex fr mperecheri greite
dac se utilizeaz o Taq polimeraz inactiv de corectere a
greelilor (proof reading); o mperechere greit n 3' destabilizeaz
foarte mult duplexul. Exemplu, pentru dou alele ale unei gene unde
se studiaz mutaia se folosesc dou amorse specifice.
n caz de mperecheri greite nu are loc amplificarea alelei int.
- n caz de mperechere corect amplificarea este a alelei fr mutaie.
Metoda este puin utilizat.
PCR multiplex
Amplificarea simultan a mai multor secvene int, provenite de la
genoame diferite, 2-3 n acelai tub de amplificare. Fiecare trebuie s fie
independent de celelalte, rezultatul trebuie s fie identic dintr-un tub cu o
singur cupl de amorse.
Fiecare produs de amplificare trebuie s aib mrime definit pentru a
le putea distinge pe gel de agaroz.
Avantaje:
- mai multe inte se pot detecta n acelai tub. Exist o grup pentru
detectarea concomitent a Clamydia trachomatis i Neisseria gonorheea. De
asemenea, se pot analiza unele grupe mari,
gena pentru distrofie.
Chambenhain a realizat PCR cu 9 cuple de amorse diferite, pentru cercetarea
deleiilor la nivelul genei implicat n miopatii.
Inconveniente:
-tehnica este mai dificil dect PCR clasic. Problema major este
contaminarea i apariia de benzi parazite.
Remedii Hot Start.

241

Fig. PCR multiplex.

PCR microsateliilor. Microsatelitul este o secven repetat de ADN

care are polimorfism de lungime. Microsateliii pot fi utilizai pentru studierea
legturilor genetice, pierderea de alele sau diagnosticul unei boli genetice
(Hunghtinton). Printre microsatelii sunt secvene repetate de ADN de 2-5 pb.
Aceti microsatelii sunt cei mai utilizai.
Realizare. Se face n dou moduri: cu ncorporarea unui izotop
radioacitv care migreaz pe gel i se releveaz prin autoradiografie n paralel
migreaz un marker de greutate molecular.
PCR cu nucleotide fluorescente i migrarea pe un gel apoi citirea prin
programe informatice.
Extensia amorsei
Derivat din principiul secvenializrii Sanger. Un produs PCR dup
amplificare cu amors biotinilat este denaturat formndu-se ADN
monocatenar. Acesta este recuperat i dup hibridarea cu amors foarte
apropiat polimorfismului n general de cteva baze, sufer o extensie n
prezena T7 ADN polimeraza.
Se adaug o dideoxinucleotid complementar uneia dintre cele dou
baze polimorfe de exemplu ddGTP pentru polimorfismul CT. n acest caz
particular ddGTP nu ntlnete complementara sa dect o singur dat pentru
alela C. La fel pentru alela T situat cu 3 baze mai departe. Astfel cele dou
fragmente polimorfe vor avea o diferen de mrime de 3 pb. Dup reacia de
extensie, produsul este depus pe gel de secvenializare denaturant n automat.
Amorsa fiind marcat fluorescent se msoar intensitatea fluorescenei.
nlimea picurilor este proporional cu cantitatea de produs, iar raportul ntre
242

dou picuri d cantitatea relativ a fiecreia din alele. Dac una din cele dou
alele este suprimat, nlimea picurilor va fi diferit.
La heterozigoi CT raportul ntre cele dou alele este 0,5. Alela C este
mai puin reprezentat dect T.
Aplicaii: determinarea relativ a alelelor este sensibil i precis.
Detectarea mutaiilor sau polimorfismelor cunoscute; localizarea extremitii 5
a unui ARN (mapping).

Fig. Determinarea relativ a alelelor prin extensia amorsei.

Principiul ARN mapping prin tehnica de extensie a amorsei
ARN studiat este hibridat cu o amors ADN monocatenar marcat n
5', de 20-40 pb, situat cu 50-100 pb n aval de situsul presupus de iniiere a
transcripiei.
Amorsa este aleas aproape de situsul de iniiere pentru limitarea
formrii de structuri secundare i teriare care dau artefacte (pauze n
funcionarea enzimei). Se adaug o transcriptaz invers pentru realizarea
reaciei de extensie i sinteza ADNc. Produsul format este depus pentru
migrare pe gel de poliacrilamid denaturant. n paralel se depune un marker
de mrime. Poziia situsului de iniiere a transcripiei este determinat fcnd
s migreze n paralel o secven de ADN genomic studiat, utiliznd aceeai
secven de amors ca i pentru extensia amorsei. n timpul 2 se poate
secvenializa ANDc obinut.
Minisecvenializarea
243

Pentru detectarea polimorfismului sau a mutaiilor cunoscute se

utilizeaz o tehnic derivat constnd n completarea dezoxinuleotidei
corespunztoare razei normale sau mutante de evideniat metoda numit
minisecvenializare.
Principiu: ADN este amplificat cu dou amorse, doar una marcat cu
biotin catena sens (+). Catena antisens nu este marcat. Produsul amplificat
biotinilat este captat de bila magnetic cu streptavidin. Se obine produs PCR
monocatenar.

Apoi se poate detecta produsul de amplificare prin microplci fiind

depus n godeuri, revelarea fiind colorimetric. n fiecare godeu se adaug
amorsa de extensie P1 adiacent mutaiei studiat, o ADN polimeraz i n
godeul A dGTP-DIG n loc de dGTP. Coloraia ntre ambele godeuri,
evideniaz polimorfismul sau o mutaie.
Aplicaii: n boli infecioase i genetice (trepanocitoz).
Transcripia, transducia n proteine PTT
Tehnica evideniaz mutaiile genelor pe baza formrii de proteine
trunchiate ca urmare a apariiei unui codon STOP prematur. Fragmentul ADN
codant care conine mutaia este amplificat, transcris n ARNm i tradus n
proteine prin ncorporarea aminoacizilor adugai n mediu marcai sau nu
radioacitv.

244

Fig. Tehnica PTT.

Migraia pe gel a unor proteine sintetizate n paralel cu proteine
normale va evidenia proteine trunchiate. Mrimea fragmentului trunchiat
permite localizarea aproximativ a mutaiei, natura exact fiind determinat
prin secvenializare.
O gen conine 4 exoni i d un ADNc de 1 kb cu o mutaie n exonul 3.
Schimbarea C-T d codon STOP. ARNm este transformat n ADNc
prin RT. Amorsa sens (+) utilizat pentru PCR prezint cteva particulariti;
-posed n 5' un promotor pentru T7 ARN polimeraz, un sit Kozak i
unul de iniiere a transduciei. Acest ansamblu este indispensabil pentru
transcripie i transducie. Produii PCR sunt pui n mediu n prezena T7
AND polimeraza pentru transcripie, lizat de reticulocite coninnd aminoacizi,
ARNr, proteine pentru transducie;
-metionina marcat cu 35S radioactive. Proteina corespunztoare ADNc
mutant i cea corespunztoare AND normal sunt despuse n paralel pe gel de
poliacrilamid, SDS i supuse electroforezei. Prin autoradiografie se observ
diferena de mrime i se deduce prezena proteinei trunchiate (deci a mutaiei
care a determinat prezena ei). Caracterizarea mutaiei se face prin
secvenializare.
245

Fig. Tehnica PTT.

La o mutaie nonsens (exemplu CGA-TGA) un codon se transform n
codon STOP. Proteina mutant i normal sunt depuse pe gel n paralel cea
normal 46 kD cea mutant 30 kD. Sistemul se poate aplica i la fragmentul
ADNc de mrime mare prin tehnica PTT pe o gen mare. Dac ADN este mare
PTT nu se poate efectua pe ADNc ntreg fragmentul fiind reprezentat n 4 etape
de analiz.
Exonul 6 este de mrime mare. Dup amplificarea ADN genomic n
dou pri PTT este realizat pe fiecare din cele dou fragmente. Se efectueaz
alte PTT pentru exonii 1, 5 i 7, 9.
Aplicaii PTT
-n screening sau criblaj rapid al mutaiilor responsabile de sinteza unei
proteine trunchiate, adic mutaiile nonsens, deleii care modific cadrul de
lectur, inserii, mutaii de episaj responsabile de deleia unui exon.
Metoda este aplicat n special pentru studiul genelor la care se observ
frecvent mutaiile Exemple:
246

-gena P53 antioncogen mutant n numeroase cancere;

- gena BRCA1 antineogen n cancer de sn;
- gena NFI n neurofibrimatoz.
Limitele metodei PTT
Se utilizeaz pentru produi PCR mai mici de 2 kb datorit dificultii
de obinere a transduciei unei proteine mari.
Cnd mutaia d un codon STOP n captul 5' a ADNc n apropierea
situsului de iniiere a transduciei proteina sintetizat este mic i poate s nu
fie observat dnd rezultate fals negative.
Tehnica este grea pentru detecie mutaiilor.
Clivajul chimic al mperecherilor greite se bazeaz pe capacitatea
hidroxilaminei i a tetraoxidului de osmium de a cliva ADN dublu catenar la
nivelul unei mperecheri greite AND/AND sau AND/ADNc n prezena de
piperidin. mperecherile greite fiind mai reactive chimic dect bazele
mperecheate normal i adiacente.
Hidroxilamina recunoate mperecherile greite ale bazelor C iar
tetraoxidul ale bazelor T. Teoretic tehnica poate detecta toate mutaiile ns s-a
demonstrat c exist mperecheri greite T-G mai stabile pentru care se
folosete alt tehnic.
Aplicaii
Tehnica se aplic dup amplificarea ADN genomic sau ADNc. Dup
PCR pentru a permite formarea heteroduplexurilor (o mperechere greit) se
face denaturarea la 95C urmat de renaturarea lui.
Produsul PCR este separat n 2 tuburi n fiecare adugndu-se
hidroxilamin i tetraoxidul de osmiu.
Piperidin se introduce n aII-a etap. Proba este supus migraiei n gel
de acrilamid denaturant.
De exemplu pentru o mutaie G-C, PCR este efectuat pe o zon
coninnd mutaia. Se presupune c acest produs PCR este format din 300 pb.
Produsul PCR dup etapa de denaturare, renaturare va prezenta dou
mperecheri greite CC i GG. Una din cele dou amorse (sens sau antisens)
este marcat (radioactiv sau fluorescent). Prezena mperecherilor greite CC i
GG permite clivajul prin hidroxilamin. n al doilea timp se completeaz
seciunea.
n acest caz particular greeala CC este modificat prin hidroxilamin.
Pe un gel denaturant de acrilamid se va obine dup tratarea prin
hidroxilamin, tetraoxid de osmiu apoi piperidin.
Dup msurarea taliei produilor clivai, se poate estima cu aproximaie
localizarea mutaiei (a 10-15 pb). Pentru cunoaterea mutaiei se face
secvenierea produsului amplificat.
247

Aceast tehnic poate analiza fragmentele de talie pn la 2 kb.

Ea prezint dou inconveniente:
-produii utilizai sunt foarte toxici; pentru remedierea acestei toxiciti,
pot fi utilizate carbodiimidele care recunosc i atac mperecherile greite ale
bazelor C i T, pot fi utilizate n locul tetraoxidului osmiu i de hidroxilamin.
- este o tehnic greu de realizat.
Deleia mutaiilor prin proteina mut S (mismatch binding protein)
Proteina mut S recunoate specific greelile care intervin n cursul
replicrii sau reparaiilor. Proteina mut S provine din E.coli i face parte dintrun complex proteic care joac rol n corectarea erorilor de replicare i de
reparaia ADN.

248

Fig. Proteina MutS.

Aceast protein poate recunoate toate mperecherile greite specifice
celor 4 baze prezente pe ADN cu excepia mperecherilor greite CC care sunt
refractare la sistemul de reparaii ale E.coli.
Practic proteina mut S este fixat pe un suport (membran de
nitroceluloz, Naylon sau microplci.
ADN de studiat este amplificat apoi urmeaz denaturarea renaturarea
pentru a permite formarea mperecherilor greite a AND i apoi sunt depuse pe
suport.
ADN care prezent o mperechere greit se fixeaz pe proteina mut S.
Una din cele dou amorse este biotinilat. Se adaug un complex streptavidin249

fosfataz alcalin i adiia de substrat, o reacie de chimiluminiscen de

exemplu, care va permite revelarea acestei fixaii.
ADN fr mperecheri greite nu se poate fixa. Reacia de
chimiluminiscen va fi negativ.
Aplicaii
Screeningul mutaiilor sau polimorfismul la heterozigoi (pentru mutaii
punctuale scurte deleii i inserri inferioare sau egale cu 4 pb). Aceast
metod permite detectarea mutaiilor pe fragmente PCR de 400 pb sau 2,5 kb.
Pentru detectarea mutaiilor la homozigoi este suficient s se adauge un AND
homozigot normal de la secvena cunoscut.
Inconveneine
Aceast tehnic nu este eficace pentru mperecherile greite CC. Ea
detecteaz inseria i deleia a fragmentelor de talia inferioar sau egal cu 4
pb.
Amplificarea prin deplasarea catenei SDA
Este o metod de amplificare izoterm care pune n aciune simultan
dou enzime termorezistente. Una din restricie BsoP sau BsrI i ADN
polimeraza lipsit de activitate exonucleazic (Exo-PcaBca ADN polimeraza).
Principiulmetodei const n secionarea parial a situsului de restricie
BsoI sau BsrI, ncorporarea de dATP S precursor care nu exist n stare
natural nucleozid fosforotiazic de ctre ADN polimeraza genereaz o
legtur tioester n loc de fosfoester.

250

Fig. Tehnica SDA.

251

Enzimele de restricie BsoI sau BsrI sunt incapabile s scindeze aceast

legtur.
ADN dublu catenar conine situsul de recunoatere modificat care va fi
tiat la nivelul unei singure catene n loc de dou (fig...) produce o extremitate
5' i una 3'.
Deplasarea ADN polimerazei pe lanul de ADN realizeaz elongaia
lanului tiat ncepnd de la extremitatea 3' care joac rol de amors. Lipsa
activitii exonucleazice se traduce prin deplasare ncepnd de la extremitatea
5' a lanului adiacent. Aceast deplasare este cheia sistemului SDA.
Mediul de reacie conine n plus fa de sistemul clasic dATP S. Se
folosesc dou cuple de amorse B1S1; B2S2. Fiecare pereche este specific unei
catene a secvenei de amplificat conine o amors B i una S. Cea intern
conine la extremitatea 5 o secven suplimentar necomplementar intei,
adic situsul de recunoatere pentru enzima de restricie BsoI sau BsrI. Aceasta
are scopul de a ncorpora la fiecare extremitatea a secvenei int situsul
corespunztor.
Amorsa n exces se va hibrida cu lanul eliberat i ADN polimeraza va
face extensia obinndu-se un nou fragment dublu catenar care va suferi din
nou secionare parial cu Bso BI apoi deplasare polimerazei. Procesul este
ciclic. Amplificarea exponenial rezult din cuplarea reaciei sens i antisens
n care fiecare lan deplasat n cursul unei reacii servete ca matrice pentru
reacia de deplasare a catenei opuse. Factorii de amplificare 107 n 2 ore.
Amplificarea sondei
LCR ligaz chain reaction sau OLA testul legrii oligonucleotidei
LCR folosete dou mijloace dou cuple de sonde specifice secvenei
nucleice de cercetat i o enzim terminabil ligaza. Sondele sunt alese n aa fel
ca poziionarea lor s fie vecin cnd ele se hibrideaz cu ADN int (fig..).
Atunci ligaza realizeaz o legtur covalent ntre cele dou sonde adiacente
legate la int. Sondele avnd de regul 20-30 nucleotide produsul procesului
de ligaie sau ampliconul va avea 40-60pb. Urmeaz denaturarea, hibridarea
sondelor cu int legtura sondelor.
Oligonucleotidele sondelor legate i ADN int vor servi ca substraturi
pentru o nou amplificare dup o nou etap de denaturare. Sistemul
funcioneaz n dou cicluri de temperatur: 95C denaturarea ADN int i 5565C n funcie de Tm a sondei pentru hibridare, legare. Pentru un randament
eficace se utilizeaz dou perechi de sonde fiecare complementar cte unui
lan. Astfel produii formai ntr-un ciclu pot servi ca matrice pentru o nou
reacie de legare dup denaturarea prin cldur. Produii se acumuleaz
exponenial, se efectueaz 30 de cicluri. Necesitatea celor dou cicluri termice
impun termocicloare pentru generare de ampliconi.
252

Randamentul este identic PCR. Dup PCR produii de amplificat sunt

detectai pe gel de poliacrilamid sau pe microplci.
Teoretic LCR nu se poate face ntre dou catene adiacente. n cazul n
care o singur mperechere greit apare n poziia 3 sau 5 a a unei
oligonucleotide adiacente legarea nu se mai face. LRC presupune o
complementaritate complet ntre oligonucleotide care se vor hibrida .
Gap LCR pune n eviden mutaiile punctuale. Principala
caracteristic a LCR este de fapt s disting secvenele nucleotidice
nedifereniate ca baze. Aceasta prezint importan n genetic atunci cnd
amorsele sunt alese n acelai fel ca locul mutaiei s fie situat la extremitatea 3'
a amorsei, n punctul de legtur.
Principiul gap LCR este de efectuare a unui LCR prin utilizarea a
dou sonde oligonucleotidice care, fixate pe inta lor vor fi adiacente i
separate prin cteva baze. Aceste spaii sau goluri (gap) vor putea fi unite de
ctre o ADN polimeraz adugat n prezena dNTP.
Spaiul este ales astfel nct unii precursori nu vor fi utilizai pentru a
umple vidul i deci nu se adaug n mediul reacional. Riscul de legare
independent de int este redus n msura n care perechile de amorse nu mai
sunt adiacente. Produsul lor nu se va putea hibrida corect la sonde
complementare. n paralel aceast metod amelioreaz LCR specific alelelor
permind evitarea riscurilor de legare a mperecherilor greite n 3.
Exist i combinaii PCR-LCR. Dup PCR amplificrile sunt analizate
prin LDR = LCR post PCR.
Metoda permite detectarea multor mutaii printr-un singur PCR,
detectarea fcndu-se prin LCR.
Detectarea mutaiilor punctuale i identificarea microorganismelor
prin gap LRC
identificarea Clamydia troachonatis, detectarea de boli genetice,
mutaii punctiforme n boli genetice.
LCR multiplex. Varianta LCR pentru dectarea mutaiilor punctuale
prin dou reacii:
- un LCR cu amors normal
- un LCR paralel cu amors mutant.
Se poate realiza LCR cu ambele amorse mutant i normal n acelai
tub.
CPR cicle probe reaction
Se bazeaz pe utilizarea unei sonde compozite ARN/ADN i a unei
RNaze H termorezistente. Sonda compozit se hibrideaz la int dac este
253

prezent n mediu RNaza H, care degradeaz partea central a sondei respectiv

hibrid ADN/ARN.
Cele dou fragmente rmase sunt destabilizate, lungimea lor fiind de
aa natur nct hibridarea nu este posibil n aceleai condiii de temperatur i
for ionic.
Reacia ciclic a sondei
Numai sonda compozit nedegradat poate hibrida n condiiile de
lucru. inta este monocatenar i hibrideaz din nou cu o sond intact
prezent n mediu. ncepe un al II-lea, apoi un al III-lea ciclu rezultnd
fragmente obinute din procesul de amplificare care reflect prezena intei n
mediul analizat. Metoda este simpl izoterm i rapid, amplificarea dureaz
35-65 minute. Necesit separarea fragmentelor prin electroforez i marcarea
lor radioactiv. Nu este un procedeu de amplificare cu obinerea fragmentele de
acizi nucleici specifici. Se pot realiza reacii de amplificare a semnalului i a
ADN ramificat.
PCR cantitativ permite detectarea unei cantiti mici de acizi nucleici,
prezena sau absena lor.
PCR cantitativ este mai complex. Exist mai multe tehnici pentru a
stabili cantitatea de acizi nucleici.
Principiu PCR cantitativ const n utilizarea cineticii reaciei PCR care
poate fi descompus n dou pri principale:
-o faz exponenial urmat de una de platou. Unele metode se pot
aplica n oricare din studiile de amplificare. Altele n numai prima faz;
Faza exponenial. Dintr-o molecul de ADN dup n cicluri se obin 2 n
copii identice (pentru randamentul de 100% ceea ce nu se ntmpl n practic).
Randamentul este elementul cheie care afecteaz numrul de copii. Astfel o
diferen de 5% a randamentului pe ciclu modific factorul G, numrul de copii
la sfritul reaciei adic 30/5 (230 adic 230-6= 224).
Efectul de platou
n realitate se obine o curb sinusoid urmat de un platou. Platoul
semnific reducerea randamentului exponenial a procesului de amplificare
care are mai multe cauze.
Capetele sintetizate care se acumuleaz n cursul ciclurilor devin
matrice pentru ciclurile urmtoare:
- cantitatea Taq polimeraz se poate termina devenind factor limitant
n raport cu numrul de cicluri
- temperaturile nalte atinse n timpul ciclurilor degradeaz dNTP i
inactiveaz progresiv Taq polimeraza a crei timp de njumtire la
95C este de 40 minute
254

acumularea ADN produs reduce eficacitatea denaturrii

cnd conversia de produi acumulai devine mare hibridarea are
tendina s se produc ntre catenele nou-sintetizate mai mult dect
ntre catene i amors
pirofosfatul produs n reacie la fiecare dNTP poate inhiba cataliza
enzimatic.

PCR cantitativ bazat pe angajarea unui standard extern

Standardul este o soluie titrat de ADN cu secven identic cu cea a
intei de cuantificat. O serie de 4 sau 5 diluii sunt utilizate (se pot realiza pn
la 10) din acea soluie titrat. Fiecare diluie este introdus n tubul coninnd
toate elementele necesare amplificrii.

Fig. Curba standard de diluii.

Reaciile sunt realizate pentru a determina numrul ideal de cicluri
supuse amplificrii eficace. Tot pentru a constata care din diluii demareaz n
faza exponenial, fiecare diluie de ADN standard i ADN extras din
eantionul de cuantificat, sunt supuse n paralel la amplificare prin PCR n
condiii determinate n prealabil. Dup PCR produii formai sunt cuantificai
relativ prin frecven, chimiluminiscen sau prin simpl colorimetrie. Aceasta
permite stabilirea unei curbe etalon prin care sunt raportate semnalele msurate
pentru fiecare diluie din standard i la concentraie corespondent. Cunoscnd
valoarea semnalului msurat pentru eantionul de cuantificat numrul copiilor
corespondente poate fi extrapolat la curb etalon.
Curba etalon este realizat pe o serie de 5 diluii din ADNstandard. Se
compar ADN de cuantificat cunoscnd intensitatea semanlului observat la
tuburile ADN standard care permit deducerea concentraiei ADN corespondent.
255

Avantaje:
- metoda este rapid, numeroase eantioane pot fi cuantificate n
paralele; gama de diluii nu este fcut pe eantionul de cuantificat
- standardul i inta sunt n acelai timp secveniate.
PCR amplific aceleai ADN n aceleai condiii.
Inconveniente:
- este indispensabil determinarea prealabil a numrului de cicluri n
timpul crora PCR este exponenial
- este necesar utilizarea unui termociclor de calitate pentru limitarea
diferenelor de temperatur care pot fi observate mai puin dect la
alte termocicloare.
- prezena unui inhibitor al Taq polimerazei din tubul unui pacient nu
poate fi detectat i poate sta la originea rezultatelor confuze.
PCR competitiv
Pentru prevenirea riscului de variaia randamentului prin trecere de la
un tub la altul s-a realizat PCR competitiv. Metoda preferat pentru
determinarea cantitii acizilor nucleici aplicabil att pentru ADN ct i ARN.
PCR competitiv const n coamplificarea realizat cu aceleai amorse,
n acelai tub a acidului nucleic ARN sau ADN din prob i a unui acid nucleic
titrat (de concentraie stabilit) de aceeai natur i cu secven asemntoare
probei care reprezint standardul (intern sau martor). n mod ideal inta fa de
standardul intern nu difer dect prin cteva baze. Aceast diferen este
suficient pentru ca probele s fie supuse la aceleai variaii de randament.
Cele dou matrie i produii formai pot fi detectai separat.
Dup amplificare produii standardului intern i ai probei de titrat sunt
detectai prin electroforez sau microplci i determinai cantitativ separat.
Factorii care pot influena cantitatea de produi formai afecteaz n aceeai
msur amplificarea standardului intern i a probei. Pentru determinare se
folosesc diluii seriate ale standardului intern. Fiecare diluie este introdus
ntr-un tub ntr-un amestec reacional la care se adaug aceeai cantitatea de
acid nucleic de determinat indiferent de tub. Dup cotranscripia invers ADNc
al standardelor i intei sunt coamplificate prin PCR.
n practic dozarea prin PCR competitiv necesit dou etape :
- transcripia invers pentru obinerea ADNc
- PCR.
Aceste dou reacii pot fi realizate succesiv prin dou enzime
transcriptaza invers RT i Taq polimerazei fie o singur enzim cu ambele
funcii (Tth) Thermophylus ADN polimeraza. Se utilizeaz obligatoriu un
standard ARN intern pentru a limita variabilitatea etapei de transcripie invers.
256

ARN va coreverstranscrie i coamplifica. Pentru aceasta se va utiliza o

amors specific o oligodT sau hexameric.
Natura standardului intern
Sunt mai multe tipuri de standarde.
1. Standardul universal sau heterolog, conine secvene complementare
la numeroaselor perechi de amorse, fiecare pereche corespunztoare unei inte
determinate. ARN standard nefiind identic cu ARN de dozat randament celor
dou PCR nu este acelai din cauza structurilor secundare. Este necesar s se
ajung n faza exponenial s nu se ajung la faza platou. Trebuie realizat o
curb etalon.
Plasmidul are integrate amorse pentru patru inte
Conine un promotor al fag T7 n 5 o secven poli A n 3 a zonei de
amplificat. ntre amorsele sens i cosens se afl un polilinker care este o
secven ADN ce conine o serie de situri de restricie permind inseria unor
fragmente de ADN. ARN obinut dup transcripie in vitro servete ca standard
intern i este amplificat cu amorse specifice de diferite inte.
Sunt notate perechile de amorse la mijlocul polikinkerilor. Standardul
specific unei anumite secvene poate fi identic cu ARN de dozat cu excepia a
10-20 baze. n general este vorba de ARN cu deleie sau inserie.
Nu este indispensabil de a fi n faza exponenial pentru a lucra cu acest
standard. Concentraia celor doi produi de amplificat rmne constant pe
toat durata amplificrii adic randamentul PCR este aproape identic pentru
standard i int.
Determinarea cantitativ se poate realiza pe automat de secvenializare,
PCR fiind fcut cu amors fluorescent. Suprafaa pick fluorescente este
proporional cu cantitatea produilor amplificai i cu concentraia iniial a
ARN de dozat (fig..)
PCR competitiv cu standard cunoscut (specific) are urmtoarele
avantaje :
- este independent de numrul de cicluri (se poate msura i n faza
de platou)
- este indipendent de variaia de la un tub de PCR la altul.
Dezavantaje :
- necesit diluii seriate pentru fiecare acid nucleic de dozat
- tehnica este dificil se dozeaz puine probe n acelai timp.
S-au devoltat metode care nu necesit diluii separate.
Standardele i cuple de amorse diferite de int
Standardele utilizate pot fi endogene i exogene.

257

Standardul endogen este un ARN prezent n aceeai celul i ARN de

dozat, de exemplu, ARNr. Amorsele nu vor fi aceleai pentru ARN standard i
cel de dozat.
Avantaje : standardul permite verificarea integritii ARN de dozat
(calitatea extraciei).
Dezavantaje : standardul intern ofer variaii de expresie n celul n
funcie de ciclul celular.
Se pot observa diferene de structuri secundare ntre cele dou ARN. Un
ARNc poate fi multiplicat preferenial i este necesar un ADN standard a crui
calitate s fie apropiat cu a ARN de dozat. Exemplu, provirusul Vitl-1 este
dozat n celule mononucleate utiliznd gena globulinei i standard endogen.
Exist dou copii ale genei globulinei i o copie a ADN proviral din celul.
Pentru a obine un echilibru corect ntre cele dou inte, amorsele globulinei
sunt adugate dup 15 cicluri de la debutul PCR i reacia se continu nc 15
cicluri fiind corectat dezechilibrul ntre ADN standard i ADN provirusului.
Dozarea trebuie fcut n faza exponenial este necesar etalonarea.
Metoda este limitat.
Standardele interne sunt ale ARN, diferite de cele de dozat i nu sunt
coninute de proba de analizat. Se adaug n mediul de reacie; nu sunt supui
varietii exprimrii celulare. n rest caracteristicile sunt similare standardului
intern.
PCR cinetic
Sistemul Taq Man. n tubul de reacie se afl dou amorse cu secvene
complementare intei, ADN int i sondele TaqMan, NTP. Sondele Taq Man
sunt formate din urmtoarele 3 elemente: un fluorofor (fluoresceina) cu
lungime scurt de und sau reporter (R), o secven specific ADN-ului int, i
un fluorofor cu lungime lung de und (Rhodamina) sau quencer (Q), cu capt
circular in fig.... Un grup fosforil adugat la extremitatea 3 (R) a sondei
mpiedic extinderea sa de ctre Taq polimeraz. De asemenea, derivatul
Rhodaminei situat n vecintatea fluoresceinei absoarbe energia emis de
fluoresceina, supus unei surse de excitaie luminoas, fenomenul numit
quenching.
Sonda TaqMan se hibrideaz cu inta la mijlocul secvenei de amplificat
dar nu poate fi amplificat ea nsi. n aceast etap cei doi fluorofori sunt
nchii, nu emit fluorescen.
Odat ce amorsele sunt hibridate cu inta n cursul reaciei de extensie
Taq ADN polimeraza atac sonda prin activarea 5 nucleazic i o secioneaz
n mononucleotide. n acest moment sunt eliberai doi fluorofori care
anihileaz aciunea quencerului. Fluoroforii cu lungime scurt de und au o
nou fluorescen i semnalul poate fi detectat. Acest semnal este proporional
258

cu numrul de catene nou sintetizate sau cu cantitatea produilor PCR formai

permind determinarea cantitativ.

Fig. PCR tip TaqMan.

Fluorecena este proporional cu numrul de molecule int amplificate.
Cinetica emiterii fluorescenei poate fi urmrit n timp real n cursul reaciei
de amplificare.
Tehnica este automatizat (aparatul ABI prism 7700) produs de Pernin
Elmer combin un termociclor cu un fluorimetru i permite detectarea
fluorescenei. Metoda Tag man cu fibr optic situat sub fiecare tub, conectat la
camera CCD. Un calculator traseaz curbele cinetice permind determinarea
cantitii. Tehnica este folosit pentru determinarea cantitativ a virusului
hepatitei C, dar poate fi aplicat i la altele.
Sistemul amplisensor; principiul se bazeaz pe transferul de energie
ntre 2 fluorofori. Poate detecta formarea de duplexuri ntre dou lanuri ADN.
Dac ADN este marcat cu un fluorofor un grup donor se fixeaz pe un lan i
un grup acceptor pe cellalt n timpul formrii ADN dublu catenar. Transferul
de energie ntre cei dou fluorofori emind fluorecena.
Cnd ADN marcat este monocatenar fluoroforii se separ i transferul
de enegie se oprete. Pierderea fluorecescenei este proporional cu cantitatea
de ADN care trece n forma monocatenar.
Practicarea metodei. Se realizeaz o etap preliminar de legare ntre
amplisensor i amorsa specific intei.
259

a) prima etap, PCR asimetric are scopul de a obine n exces lanul pe

care se va fixa antisensor. ADN int este amplificat cu dou inte, una fiind n
exces important. Una din catene va fi n cantitate mare dup PCR.
b) pentru determinarea cantitativ, se adaug amplisensor/amors. Se
face PCR semi-nested (semi-cuib). Produsul obinut din primul PCR este din
nou amplificat de o pereche de amorse din care una hibrideaz la partea intern
(nested sau ni) i alta este identic utilizat pentru primul PCR. n PCR
amplisensor lanul dublu va disocia prin deplasarea lanului sub aciunea
polimerazei i va deveni simplu catenar n msura n care este prezent inta
complementar amorsei antisensor. Disocierea este nsoit de pierderea
fluorescenei. Amplificarea se realizeaz n microplci. Scderea fluorescenei
se msoar cu un cititor de plci la 630 nm. Cantitatea PCR este proporional
cu scderea fluorescenei inut de detecie este 10 copii.
Pentru determinarea cantitativ se adaug standard intern.

PCR cu primer Scorpion

Primerul Scorpion este combinat cu o sond fluorescent i d natere
unei alte metode de detecie PCR produs prin fluorescen. Sondele Scorpion
au urmtoarea structur: o bucl stem care este legat de o molecul fluorofor,
care este proximal nchis de un quencer (circular). Bucla este secvena
complementar intei ADN, i este legat de un primer desemnat s amplifice
inta ADN. n timpul etapei de extensie PCR poriunea primer a sondei se
ataeaz la matri i Taq polimeraza creaz noul ADN. n etapa urmtoare de
denaturare, ntreaga sond mpreun cu noua caten ADN format devine o
singur caten. Bucla se ataeaz din nou la catena int a ADN elibernd
fluoroforii ctre quencer. Fluorescena emis nregistrat este msura direct a
cantitii de produi PCR rezultai.

260

Fig. PCR cu primer Sorpion

PCR cu SYBR green
Se realizeaz cu sonde fluorescente SYBR green. Acestea sunt legate n
timpul PCR de lanul dublu catenar n formare (inta i primerul). Produii PCR
formai emit lumin verde de 520nm. Culoarea verde fluorescent apare numai
261

cnd se leag de ADN. Cantitatea de fluorescen este corelat cu cantitatea

produilor PCR rezultai, acumulai n mai multe cicluri.

Fig. PCR cu SYBR green.

262

NASBA (metoda multisens HIV-1)

Este o tehnic de amplificare izotermic a acizilor nucleici utiliznd :
- transcriptaza invers - transformarea ARN n ADNc
- RNaza H distruge ARN din duplex ADN/ARN elibernd ADN
pentru sinteza de ADNc
- T7 RNaza polimeraza sintetizeaz ARN.
Principiul NASBA cantitativ. Se folosesc trei standarde interne de
cantitate cunoscut dar concentraia diferit care se adaug naintea lizei
acidului nucleic de dozat pentru a lua n calcul randamentul extraciei. Acidul
nucleic de dozat este coamplificat n prezen standardelor interne dup
princpiu cu PCR competitiv cu standard intern.
Standardele utilizate au aceeai compoziie n nucleotide i difer ca
secven prin circa 20 baze nafara zonelor de fixare a amorselor. Amplificarea
se face n aceleai condiii pentru standardele i pacient bolnav. Randamentul
NASBA este acelai pentru standarde i acidul nucleic de dozat de la pacient.
Detecia produilor amplificai se realizeaz printr-o reacie de
chimiluminiscen.
Metoda permite detectarea concentraiei ARN HIV ntre 4 x10 2 i 4
x107 molecule (standardele interne au concentraie de 104 ; 105 ; 106 . Recent s-a
dezvoltat un test ultrasensibil pentru 80 copii/ml.
PCR competitiv i sistemul monitorizat
Acidul nucleic de dozat este coamplificat n prezena unui standard
intern. Ca i pentru NASBA randamentul PCR este acelai pentru standard i
acizii nucleici de dozat. Detecia ampliconilor se realizeaz pe microplci.
Produii amplificai sunt diluai seriat cu rata 5 pentru a obine o zon de
msur cu densitatea optic linear. Produii sunt diluai seriat sunt hibridai n
godeuri cu sonde specifice, fie HIV, fie standard intern.
Revelarea se face colorimetric. Msurarea absorbanei produsului
colorat permite calculul numrului de copii n funcie de diluie i de standardul
intern. Pragul de detecie este 250 copii/ml dar exist i metoda ultrasensibil
care detecteaz 50 copii/ml.
Metoda este mai costisitoare necesit centrifugare de mare vitez la
rece i o prelucrare a precipitatului cu un nou volum de reactiv.
Etapele de amplificare i detecie sunt integral automatizate la kitul
Cobas Amplicor.
Sunt disponibile truse pentru virus HIV, hepatit B, C, citomegalovirus.
263

Fig. Numrul de copii ale genomului viral este proproional cu numr

de ampliconi obuni prin PCR ; la fel i pentru standardul intern adugat.
Cantitatea de produi obinui se msoar prin hibridarea ampliconilor
biotinilai n microplci cu sonde specifice dup adugarea unui conjugat
avidin/biotin i a unui substrat al enzimei. Ampliconii sunt supui unei diluii
seriate pentru obinerea zonei lineare de citire (curba etalon). Cantitatea de
standard intern adugat fiind cunoscut se calculeaz numrul de genomuri
virale n funcie de diluie (conform formulei)
Nr.copii HIV = (DO x factor de diluie pentru HIV/DO x factor de
diluie pentru standar) x numr iniial copii de standard
DO densitatea optic
Hibridarea n faza lichid (Hybrid Capture System)
Principiul const n kitul de hibridare n mediul lichid fr amplificare
prealabil. El utilizeaz indirect un sistem de amplificare dup extracia ADN
viral (utilizat pentru hepatita B i virusul citomegal) proba este hibridat cu un
ansamblu de sonde ARN specifice virusului. Complexul ARN viral/sond ARN
viral sunt capturai n microplci cu ajutorul anticorpilor policlonali antihibrizi
ADN/ARN. Un conjugat anticorpi monoclonali conjugat anticorp
monoclonali/antihibrid ADN/ARN recunoate complexul capturat pe
microplac.
Pe conjugat se fixeaz fosfataza alcalin. n paralel se utilizeaz
standardul. n al doilea timp, fosfataza alcalin reacioneaz cu un substrat
chimiluminiscent. Intensitatea luminoas obinut este proporional cu
cantitatea de ADN prezent i este comparat cu o curb de calibrare . Nu este o
hibridare molecular clasic cu sond. Se fixeaz pe conjugat circa 10 uniti
fosfataz alcalin per 100 perehi baze hibrid ADN/ARN. Sonda ARN specific
utilizat pentru msurarea genomului viral este complementar cu genomul
virusului hepatitei B n totalitate 3243 pb i cu genomul citomegalovirus n
proporie de 17%.
Aceasta confer o bun sensibilitate tehnicii rezultatul exprimndu-se n
numr de virui/ml sau pg/ml pentru virus hepatit B sau numr virui/numr
celule pentru citomegalovirui. Rezultatul se poate da n numr virui/ml
snge ; numr virui/prob ; numr virui/leucocite.
Programul de detecie pentru VHB 106 virui/ml sau 2,5 pg/ml, iar
pentru CMV 5 x103 virui/ml.
Tehnica de amprentare
(dideoxi.fingerprinting)
Principiu

prin

264

dideoxinucleotide

sau

ddF

Aceast tehnic se bazeaz pe principiul SSCP, pe de o parte i

secveniere pe de alt parte. Ea utilizeaz o singur dideoxinucleotid
terminator (i nu 4 ca la tehnica de secveniere). Dup reacia PCR se
efectueaz un ciclu de secveniere. Produii amplificai sunt apoi denaturai i
formaez lanuri monocatenare. n al doilea timp ansamblu este supus la o
migraie pe un gel nedenaturant.
Mutaia este detectat datorit urmtoarelor componente:
-compuii de secveniere, ctig sau pierd o band corespunztoare la
ncorporarea sau nu a terminatorului (component Sanger)
-component SSCP, alterarea mobilitii, mai puin o band unde se
ncorporeaz un terminator i conine mutaia. Aceasta din urm provoac o
modificare a conformaiei spaiale din fragmentul ADN .
n exemplu de mai sus componentele secvenierii (pierd o band) i
componentele SSCP (alterarea conformaiei spaiale a ADN) permite detectarea
n gel a mutaiei.
Tehnica de detectare prin peptidele acizilor nucleici
Este o tehnic nou, nc n studiu.
Principiu
Peptidele acizilor nucleici sau PNA (peptide nucleic acids) sunt acizi
nucleici modificai n care fosforiboza este nlocuit printr-o structur repetitiv
structur zis peptide-like compus din reziduuri (2-aminoetil glicin).
PNA prezint prorpieti particulare:
-hibridul ADN/PNA are stabilitate termic superioar fa de hibridul
ADN/ADN corespondent (n jur de 1C n plus per baz)
-hibrizii PNA/ADN sunt mai uor destabilizai prin mperecheri greite
dect hibrizii ADN/ADN corespunztori
-PNA nu sunt degradai nici prin proteaze, nici prin nucleaze
-PNA nu pot fi utilizate ca amorse n PCR.
Exemplu: PNA de 15 baze care se hibrideaz cu o secven de ADN
normal. Presupun c acest ADN a unui subiect prezint o mutaie de exemplu
heterozigot (C-A), PNA se hibrideaz preferenial pe ADN normal. Dac se
adaug o oligonucleotid care ncalec secvena hibrid prin PNA, PNA va fi
reinut, amorsa se hibrideaz pe o secven normal, nu pe o secven mutant
(hibridul PNA/AND va fi foarte instabil).
n cursul PCR care va urma, ADN normal nu va putea fi amplificat. n
contrast hibridul PNA/AND fiind mai puin stabil, PNA se va deplasa i va fi
nlocuit de amorsa utilizat prin PCR. n consecin produii vor fi amplificai
apoi detectai. Odat optimizate condiiile screeningul mutaiilor aceast
tehnic este simplu de realizat.
265

Tehnica CFLP (Cleavase fragment length polymorphism)

Aceast tehnic este bazat pe activitatea endonucleazei monocatenare,
termostabil Cleavase I. Ea reprezint o parte a principiului SSCP. Dup PCR
cu o amors marcat (fluorescent, radioactiv sau cu biotin), produsul
amplificat este denaturat pentru obinerea ADN monocatenar care ia o
conformaie secundo-teriar cu formarea de bucle. Cleavasa recunoate
buclele pe care le cliveaz n 5'.
Dup ncetarea reaciei printr-o soluie STOP, ADN este depozitat pe un
gel de poliacrilamid denaturant i se observ un profil al benzilor. Dac o
mutaie (mutaie punctual, deleie, inserie) sau polimorfism sunt prezente, sau
structuri secundo-teriar a ADN monocatenar care vor fi modificate
(modificarea conformaiei ca n SSCP), Cleavase nu poate seciona n aceeai
parte. Profilul benzilor observate vor fi deci difereniale. Prin msurarea taliei
produsului obinut se poate estima localizarea aproximativ a mutaiei (pn la
40 pb). Secvenierea regiunii de interes poate caracteriza prezena anomaliei
sau a polimorfismului.
PCR realizat cu o amors marcat (radioacitv sau nu) folosind un
ADN dublu catenar. Dup PCR o denaturare termic a ADN este realizat apoi
ADN este ngheat pentru a permite reconformarea sub form monocatenar.
Cleavase este adugat n captul 5' a buclei. Clivajul este limitat n cursul
digestiei (este necesar optimizarea temperaturii de digestie 40-45, 50-55 i
60C). n consecin 3 produi vor fi prezeni pentru ADN normal i 2 produi
pentru ADN mutant. Dup digestie produsul este denaturat. Apoi o migraie
dureaz de la 1 al 5 ore, n funcie de talia produsului de analizat, este efectuat
la 20W n gel de acrilamid denaturant. Concentraia gelului este 6%
acrilamid (19/1) i variaz de la 6-10% n funcie de talia fragmentului.
Denaturarea este asigurat prin uree (7M)
Revelaia se poate efectua prin argint, prin chimiluminiscen sau o
detecie pe secvenializator automat.
Studiile arat c tehnica ofer o sensibilitate mare i permite analizarea
ADN de la 100-2000 pb. Localizarea relativ a mutaiei n funcie de talia
fragmentului de ADN este posibil i permite secvenializarea numai a zonei de
interes.
ADN purici sau cips o tehnic n plin dezvoltare.
Strategii de detectare a mutaiilor n biologia molecular.
Tehnicile de biologie molecular au permis nelegerea mai bun a
mecanismelor celulare i a fiziopatologiei numeroaselor boli: genetice,
tumorale, microbiene (genotipare de virusuri, bacterii, epidimiologie
molecular).
Principiu
266

Spectrul mutaiilor se extinde de la rearanjamente cromozomiale

(detectabile prin citogenetic) la mutaii punctiforme. n unele boli sunt mai
frecvente deleiile (miopatia Duchenne), n altele ca mucoviscidoza, mutaiile
sunt foarte variate (reprezint un veritabil catalog). Un numr mare de
tehnici de detecie se bazeaz pe hibridare specific i electroforez. Unele sunt
utilizabile pe microplci i automatizabile.
Tab. 33
Detecia direct a mutaiilor (Screeningul mutat, punctele, mici inserii
sau deleii)
Tehnicile de screening
Sensibilitatea (%)
DGGE (electroforez n gradient de gel denaturant)
-95
SSCP
80-90
Clivaj chimic
85-95
Analiza heteroduplexurilor
80-90
Testul de protecie a RNazei (RN-ase protection 50-60
assay)
Secvenializarea direct
99
Southern blot (RFLP)
Slab
Tehnici mai rare descrise
CFLP
95
Didezoxi-amprenta
98
Mut S
EMC (Clivaj hiz. al mperecherilor greite)
Pentru frecvena mare a codonilor STOP: PTT
Confirmarea unei mutaii
Pentru confirmarea unei mutaii trebuie verificate mai multe proprieti:
-prezena mutaiei n familia pacientului (dac nu este o neomutaie)
-dac este o anomalie rar n populaie. Anomalia cosegreg cu o boal
i este absent la martorii sntoi, funcia proteinei mutante este
normal.
Aceast proprietate nu este totdeauna verificat. Expresia proteinei
mutante se studiaz introducnd ntr-un vector de expresie ADN de studiat.
Ansamblul vector ADN este introdus n organismul gazd. Celula gazd face
transcripia ADN anormal apoi transducia n proteina mutant.
Pentru a studia expresia proteinei mutante se utilizeaz mai multe
tehnici, mai multe organisme: bacterii mai frecvent E.coli, unele celule ale
mamiferelor, celulele COS din rinichi de maimu, celule de insecte n cazul
267

unor vectori particulari precum Baculovirus i levuri (Sacharomyces

cerevisiae).
Se realizeaz 3 etape:
- construcia martorilor normali (vectori-ADNc normal) i martor
negativ (vector singur, vector-ADNc antisens)
- mutanogeneza dirijat
- expresia ntr-un vector procariot mai rar eucariot
Expresia unei gene pentru confirmarea unei mutaii.
Mutanogeneza dirijat necesit 3 etape:
- subclonaj
- mutagenez dirijat
- expresia
Subclonajul este o tehnic de baz n numeroase laboroataore care
permite inseria unui ADN produs amplificat esenial ntr-un vector cel mai
adesea plasmid sau fag. Este un ADN monocatenar care poate primi pn la 22
kb de ADN strin. Vectorul cel mai utilizat este plasmidul construit din ADNc
extracromozomial care se replic independent de celula bacterian. Plasmidul
are anumite caracteristici: are marker de selecie (antibiotice) i un polilinker
(secven cu mai multe situsuri de restricie) care permite inseria genei de
studiat n orientarea corect. El poate primi pn la 8-9 kb ADN strin.
Penetrarea ansamblului vector gen de studiat se face prin
transformarea bacterian la E.coli. ADN este inserat n vectorul linearizat i
tratat cu fosfataz (plasmidul este tratat cu fosfataza alcalin care cliveaz
resturile fosfat de la extremitile 5' pentru a evita recircularizarea care ar
mpiedica ligaia), apoi legat prin T4 ADN ligaz Ligaia se poate face prin
digestie enzimatic:
- utilizarea vectoruluiT
- subclonajul cu uracil ADN glicoliz (UDG)
Digestia enzimatic
Produsul este amplificat (n amorse se adaug un sit de restricie cu 3
sau 4 baze adugate n 5' a situsului de restricie pentru a permite o tiere
eficace a situsurilor de ctre enzime). Produsul amplificat i plasmidul sunt
digerate cu enzime de restricie dnd seciuni cu capete coezive sau cu capete
drepte. Enzimele de restricie utilizate pot fi aceleai sau diferite. Este necesar
ca extremitile 5' i 3' ale vectorului i al ADNc s fie compatibile cu
seciunea enzimatic. Seciunile obinute permit legarea a doi produi cu T4
ADN ligaz. Plasmidul este tiat la nivelul situsului de policlonaj sau
polilinker. Plasmidul linearizat i defosforilat i produsul amplificat sunt lipite.
Ansamblul vector-produs amplificat este astfel pregtit pentru a fi inserat ntr-o
bacterie.
268

Dezavantajul: numeroase enzime de restricie secioneaz ru n

apropierea extremitilor 5' i 3' ale ADN. Alegerea enzimelor este limitat.
Utilizarea vectorului T
Unele polimeraze precum Taq polimeraza, TTh ADN polimeraza, Tge,
Tbr adaug preferenial un dATP unic n 3' n cursul reaciei de extensie n
cursul PCR. Majoritatea produilor PCR vor avea n 3' o singur A protuziv. Un
vector plasmidic T linearizat poate fi creat cu cele dou extremiti 5' i 3'. T
protruzive (un dTTP n 3' terminal). Plasmidul linearizat i produsul amplificat
sunt unite prin ligaie. Reacia este foarte eficace. Totui unele polimeraze nu
au aceast proprietate. Produii amplificai cu acestea din urm neavnd A
protuziv nu pot fi clonate prin aceast tehnic dar este posibil un subclonaj cu
capete drepte. Pentru remedierea acestor inconveniente se adaug dATP i Taq
polimeraza n ultimile cicluri ale PCR.
Sublonajul cu UDG
Se utilizeaz n PCR amorse coninnd U n loc de T. Dup PCR se
obine un produs cu extremiti U. Se adaug UDG i acesta lizeaz
fragmentele care conin nucleotide dUTP. Se obine un produs PCR cu
extremiti 3' protruzive. Produsul PCR poate fi apoi hibridat cu un vector
plasmidic care are extremiti 5' complementare. Nu este necesar utilizarea
unei ligaze. Se pare c metoda este mai eficace dect sublonajul cu vectori T.
Subclonajul se aplic n secvenializarea produilor PCR i expresia ADN
subclonat n protein n vector eucariot sau procariot.
Mutageneza dirijat
Studierea mutaiei se poate face prin subclonare direct a ADNc mutant
ntr-un vector procariot rar eucariot i apoi exprimarea ntr-un sistem de
expresie. Dar de asemenea pornind de la ADNc normal subclonat ntr-un
plasmid se poate efectua o mutaie prin mutagenez dirijat.
Metoda prezint subclonajul, care nu trebuie refcut pentru orice nou
mutaie. ADNc normal fiind ntr-o construcie este uor s se modifice voit i
s se studieze apariia fiecrei noi mutante prin proteina studiat. n plasmid
poate fi introdus pentru a fi modificat toat secvena ADN, alta dect ADNc,
promotorul, situl de fixare a unui factor de transcripie.
Principiu mutageneza dirijat se poate efectua pornind de la fag.
Marea majoritate a tehnicilor sunt realizate n plasmide.
Metoda megaprimerilor
Permite realizarea de substituii ale unei nucleotide, inserii sau deleii.
Necesit utilizarea a 3 amorse purificate. n prima etap se sintetizeaz prin
PCR megaprimer (amorsa de mrime mare). Una din 2 amorse conine mutaia
269

dorit. ADN normal reprezint ansamblul plasmid+ADN nemutant int. Se

obine un megaprimer cu mrime variabil de la 100 pb pn la cteva kb. Apoi
se realizeaz al doilea PCR pe ADN normal. Se utilizeaz cte 2 amorse:
monocatena FM a megaprimerului, o amors R2 de mrime normal i
megaprimerul RM i amorsa normal F2. Se obine un ADN mutant (plasmid
+ADN int mutant). n cazul substituiei unei baze realizarea amorsei mutante
este simpl. n general o amors de 20 pb este sintetizat cu o mutaie n
apropierea zonei centrale, la 10 pb de fiecare extremitaate i fr alte
mperecheri greite. Se pot introduce 2-3 mperecheri separate de cteva
nucleotide.

Fig. Metoda megaprimerilor

Mutaia poate fi o deleie. n acest caz se recomand o zon de minim
15-20 pb fr mpercheri greite de o parte i de alta a mutaiei. Se pot efectua
deleii de 500 pb chiar mai mult.
Mutaia poate fi o inserie. Inseria se face la mijlocul amorsei mutante.
n acest caz se recomand o zon de minim 15-20 pb fr mperecheri greite
de o parte i de alta a mutaiei.
Aplicaii ale megaprimerului
270

Se utilizeaz o tehnic de mutagenez derivat din aceasta: prima

numit amors de selecie se hibrideaz pe unul din dou catene ale
ansamblului plasmid-ADN int, n faa situsului de restricie unic al vectorului
de expresie. Aceast amors va anihila numai situsul de restricie. A doua
amors este de mutagenez. Ea introduce mutaia dorit (punctual insert sau
deleie) hibridndu-se cu alt caten. Se utilizeaz 2 amorse. Din cele dou
amorse cel puin una este fosforilat pentru a permite reacia de legare. Fiecare
amors se hibrideaz deci pe unul din cele dou lanuri de ansamblu plasmidADN int. Se efectueaz apoi PCR pentru obinerea megarpimerului. Produsul
este purificat megaprimerul servete ca amors pentru extensia cu polimeraz.
O prim digestie cu enzime de restricie permite linearizarea plasmid-ADN
int nemutant. Avem deci un ansamblu cu o caten fr mperecheri greite.
Ansamblul este apoi transferat ntr-o bacterie E.coli mut S bacterie care nu
repar mperecherile greite. ADN linearizat este transformat cu un randament
de 100 la 1000 ori mai mic dect ADN circular. Dup transformare se obin 2
populaii bacteriene unele coninnd ansamblul plasmid ADN int mutant i
altele plasmid ADN normal.
Aceste ansambluri sunt extrase i tratate din nou cu enzima de restricie.
Ansamblurile plasmid-ADN mutant nu sunt linearizate n timp ce plasmidul
ADN normal este linearizat ceea ce le face de 100-1000 ori mai puin eficace
pentru o nou transformare n bacterie pentru expresia sa. Sistemul permite
atingerea unei eficaciti de 70-90%. Dup mutageneza dirijat este necesar
secvenializarea ADN int mutant pentru a ne asigura de absen mutaiei n
restul secvenei ADN studiat
Caractere principale ale vectorului de expresie (plasmide)
Acestea conin:
-o origine de replicare (virusul Simian40- SV40) care permite o
amplificare ntr-un numr de copii a ansamblului vector-gen de interes n
celul. Numrul de copii ale plasmidului este diferit prin originea de replicare.
-un promotor puternic (unii vectori au un intron chimeric n aval de
promotor care crete expresia ADNc). Acest promotor este situat la 10-100 pb
n amonte de locul de fixare a ribozomilor (poate fi folosit promotorul virusului
citomegalic). El permite obinerea proteinei experimentate pn la 10-30% din
coninutul proteic al celulei. Acest promotor prezint o activitate bazat pe
transcripie, este inductibil prin temperatur sau produii chimici (IPTG
izopropil BD tip galactopiranozid).
Secvena Shine Dalgarna
n aval de promotor se gsete locul de fixare al ribozomilor. Aceast
regiune de circa 54 pb interacioneaz cu extremitatea 3' a ARNr 16S n cursul
271

iniierii transduciei. n aceast regiune se gsete secvena Shine Dalgarna la

distan de 15-30 pb de situsul de iniiere al transduciei, ATG (situs de iniiere
pentru E. Coli n 91% cazuri ). Aceast secven este important pentru o
transducie eficace, fiind format din:
-un semnal de procesare a ARNm care este un semnal de poliadenilare,
ce protejeaz ARN de ARNazelor bacteriene (mrete stabilitatea ARN);
- un polinker situs unic de restricie pentru inserarea ADN de interes;
- marker de selecie antibiotice, ampicilin, tetraciclin.

Particularitile vectorilor de expresie

Utilizarea proteinei de fuziune. n cazul proteinei de fuziune construcia
ansamblului vector-ADNc este diferit. Imediat, n amonte de ADNc inserat n
vectorul plasmidic, se gsete o secven codant pentru o protein care va fi
exprimat cu proteina int. Proteina de fuziune va fi rezultatul unei fuziuni a
dou proteine.
Exemplu de proteine de fuziune:
- glutation S transferaza;
- proteina de legare a calmodulinei.
Sistemul permite purificarea proteinei de fuziune int pe clone de
afinitate apoi secionarea proteinelor de fuziune cu trombina n cazul glutation
transferazei. Secionarea proteinelor de fuziune nu este totdeauna necesar.
Dezavantajul utilizrii bacteriilor ca mijloc de expresie. Multe
modificri transducionale nu au loc n bacterii (glicosilaze, fosforilare). Nu
exist sistem eficace de secreie a proteinelor n mediul de cultur. Capacitatea
de formare a punilor disulfurice este limitat.
Expresia proteinelor la eucariote
Este utilizat uneori pentru confirmarea unei mutaii dar tehnicile sunt
dificile i folosite rar.
Expresia n celulele de mamifere
Sunt utilizate numeroase celule COS (rinichi de mai multe celule
3T3(fibroblaste), celule CHO (de hamster), celule Jurkat (din leucemia acut T
de la om), celula Hela (epiteliu uman).
Tehnicile de introducere a vectorului n celule
Vectorii pot fi introdui n genom sau pot fi independeni de acesta
(apizom). Introducerea ADN strin n celul se face prin transfecia.
Metode de transfecie:
- chimice ADN este ataat celulei i penetreaz prin endocitoz fosfat
de calciu sau DEAE-dextran
272

Fig.Transfecia chimice.
- electric un cmp electric deschide porii celulei adic electroporare
- cu lipozomi (lipofecie) ADN formeaz un complex stabil cu un
complex lipidic cationic numit lipozom. Acesta ader la celula cu care
fuzioneaz iar ADN este eliberat n celul. Metoda este mai eficace dect cele
chimice n funcie de vectorul utilizat, exprsia poate fi provizorie sau stabil.
273

Provizorie (cteva zile sau sptmni). ADN transferat rmne liber n

citoplasm. Dezavantaje, cantitatea de protein sintetizat este mic
-stabil ADN se integreaz n celul i va fi replicat tradus i transcris
ca ADN celular. Stabilitatea depinde de cantitatea ADN integrat n genomul
celulei
-cu vectori virali de exemplu retrovirus SV40 virusul vaccinal,
adenovirus. Tehnica este dificil , necesit precauii (se manipuleaz virusuri
vii). Se utilizeaz pentru introducerea stabil a ADN n linii celulare. Util n
terapia genic.
Exemplu, sistemul Baculovirus este dificil, este utilizat pentru
integrarea genei de interes n celule de insecte. Virusul este nepatogen pentru
om. Proteinele sintetizate sunt apropiate de cele obinute n celule umane.
Secvenializarea ADN
Caracterizarea unei gene prin secvenializarea sa, const n compoziia
i ordinii nucleotidelor care o compun. Acest aranjament permite, cunoaterea
de exemplu a amplasrii diferitelor situsuri de restricie a genelor cu scopul
manipulrii lor. n sfrit, traducerea pe calculator a secvenelor nucleotidice
n secvene de aminoacizi permite eventual, s se confirme sau s se spun
funcia proteinei codat prin gen.
Exist mai multe tehnici de secvenializare a ADN dar se descriu ca
principiu de secvenialitate enzimatic prin ncorporare de didezoxinucleotide.

Principiu Sanger
Materialul de pornire este un produs PCR purificat. Tehnica normal
utilizat const n prelevarea radioactiv sau neradioactiv cu digoxigenin a
ADN sau n urma transferului pe membran. Pentru eliminarea nucleotidelor i
amorselor nencorporate exist mai multe tehnici dar se poate utiliza tehnica
clasic eter-cloroform. Se utilizeaz o amors de secven complementar cu
nceputul secvenei ADN de determinat. Poate fi marcat amorsa n 5' cu dATP
cu 32P, 33P, 35S prin intermediul T4 polinucleotidkinaz. Marcarea se mai
poate face n timpul reaciei de secvenializare caz n care amorsa nu este
marcat dar se utilizeaz un nucleotid marcat. Reacia de secvenializare se
face pe un ADN monocatenar care poate fi obinut prin separarea uneia din cele
2 catene amplificate amors biotinilat fixat pe bile magnetice. Pentru
secvenializare se pot utiliza dou enzime T7 ADN polimeraza i Taq ADN
polimeraza. Principiul de baz este asemntor pentru ambele enzime.
T7 ADN polimeraza
274

Amorsa de sevenializare se hibrideaz prin complementaritate.

Amestecul reacional este repartizat n 4 tuburi marcate GATC. n fiecare tub
se adaug T7 ADN polimeraza. Cele 4 deoxinucleotide (dATP ...) i cte un
dideoxinucleotid diferit (ddATP ...).
T7 ADN polimeraza va aduga nucleotidele complementare de la
extremitatea 3' a amorsei i va continua de la 5' la 3' (la 37C). n timpul acestei
polimerizri vor fi ncorporate uneori ddNTP n loc de dNTP. Cnd se
ncorporeaz un ddNTP polimeraza nu mai poate continua polimerizarea.
Didezoxinucleotidele (ddNTPs) sunt dezoxinucleotide (baze)
modificate capabile de a se integra ntr-un lan de ADN n sintez, care s
mpiedice ncorporarea nucleotidei urmtoare. Reacia se oprete pentru c
ddNTP nu posed grupul 3'OH necesar n reaciile de polimerizare cu enzime.
Reacia se va opri pentru cte un ddNTP diferit n fiecare tub. Se obin n tub
produi de mrime diferit. Reacia de secvenializare se face pornind de la
lanul antisens care servete ca matrice.

Se analizeaz, se depun rezultatele reaciilor de secvenializare pe un

gel de poliacrilamid de mari dimensiuni n condiii denaturante (uree sau
formaldehid). Fiecare tub de reacie A, G, T, C, va fi depus ntr-un godeu
diferit. Deci 4 godeuri pentru o reacie de sevenializare. Migrarea se face pe
gel vertical ntre 2-4 ore uneori mai mult dup lungimea fragmentelor. Apoi
gelul este uscat i expus pentru autoradiografie. Pentru eliminarea urmelor de
acrilamid nepolimerizat este necesar o premigrare de 15-30 minute.
275

Fragmentele mai scurte sunt cele mai apropiate de amors. Citirea se face de la
fragmentele scurte din partea de jos, ctre cele mai lungi.
Sensul de citire este al catenei sens.
Proprietile gelului influeneaz mrimea secvenei de secvenializat,
aceasta fiind de 400-500-800 pb. Pentru a limita aceste inconveniente reacia se
face cu amors complementar celuilalt lan sau cu amorse repartizate regulat
pe gen, nct secvena este cunoscut. Pentru confirmarea secvenei se
secvenializeaz ambele catene.

Variantele electroforetice
Obinuit se utilizeaz gel PAM 6,5%. Se utilizeaz un derivat de
poliacrilamid long -langer care separ mai bine cu 30% benzile dect gelul
clasic.
Pe un gel de grosime omogen separarea benzilor nu este uniform.
Fragmentele mici sunt foarte distanate, iar cele mari sunt mai slab separate
276

(apropiate). Pentru mbuntirea separrii fragmentelor mari se poate crea un

gradient de cmp electric care ncetinete migrarea benzilor din partea
inferioar a gelului. Se creaz un gradient de grosimea gelului cu grosime mai
mare la partea inferioar de la 0,2-0,6 mm n locul grosimii constante de 0,4.
Secvenializarea n ciclu
Acelai principiu dar
enzim folosit este diferit Taq ADN
polimeraza. Taq ADN polimeraza nu T7. Tehnica se bazeaz pe principiul PCR
asimetric. Se utilizeaz o singur amors n loc de dou, care poate fi intern
sau una din cele dou utilizate pentru PCR (n ultimul caz nu trebuie s avem
benzi parazite pentru evitarea hibridrilor nespecifice de amors cu banda
anormal). Reacia PCR nu este exponenial, PCR fiind asimetric.
Se pornete de la produsul PCR dublu catenar dar produsul
monocatenar devine repede majoritar.
Avantaje evit structurile secundare ale ADN de secvenializat.
Reacia ncepe cu denaturarea la 95C nainte de hibridarea amorsei la
temperaturi ridicate (40-70C). Reacia de secvenializare se face ca i pentru
PCR dar cu o singur amors n 30-40 cicluri care constau n denaturare,
hibridare, extensie. Este posibil secvenializarea produilor subclonai n
vectori (plasmide sau fagi). Produsul subclonat va fi secvenializat dup
principiul anterior. Amorsa de secven utilizat poate fi complementar
vectorului i orientat ctre produsul de secvenializat.
Dezavantajul necesit subclonaj care face tehnica mai dificil i n
plus exist posibilitatea unor mutaii n produsul subclonat.
Probleme ntlnite n secvenializare
- Intensitatea slab a marcajului. Poate fi cauzat de cantitatea
insuficient de ADN depus pe gel. Fiecare kit precizeaz cantitatea.
- Timpul de njumtire a produilor radioactivi este 87 zile la 35S,
15 zile la 32P, 25 zile la 33P. Produsul radioactiv utilizat trebuie s fie proaspt.
- cantitatea de amorse de secven utilizate prea mic sau amorsa
insuficient marcat
- hibridarea realizat la temperatur greit
- ADN nu a fost denaturat la 80C nainte de a fi depus pe gel.
Compresiunile
Sunt anomalii de migrare a benzilor adic benzile pot fi tasate cu spaii
neregulate sau situate la acelai nivel. Se datoreaz adesea zonelor bogate n
GC. Gelul de secven este totdeauna n condiii denaturante. Migraia se face
la 40-50C. Astfel, majoritatea zonelor bogate n GC sunt denaturate.
Produii uneori nu se denatureaz complet. Secvenializarea catenei
complementare poate rezolva problema (se face secvenializare pe ambele).
277

Modificarea condiiilor de secvenializarese pot utiliza 2 analogi structurali.

Cel mai adesea compromisuri implic dGTP este nlocuit cu C7 deozo dGTP
(analog structural) care are energie de hibridare mai mic adic mperecherea
GC este mai puin stabil cnd intervine C7 deozo dGTP, formnd dou
legturi de H n loc de 3.
Alt analog mai puin utilizat este dITP (deoxiinozontrifosfatul) care se
poate mperechea cu oricare din cele 4. dezavantajul este c poate determina
pauze (opriri de polimerizare) deci benzi parazite pe gel. Se mai utilizeaz
proteina SSB extras din E.coli care fragilizeaz structura secundar stabil i
crete viteza reaciei de polimerizare. Proteina trebuie inactivat cu proteinaz
K nainte de migrare (fig..).
Prezena de benzi paralele, benzi de oprire pe cele 4 piste
Se datoreaz problemelor de polimerizare. Enzima se disociaz de
lanul ADNr se oprete (fig..) Pauzele sunt determinate cel mai adesea de
structuri secundare n agraf de pr i sunt pariale adic reacia se continu pe
unul din ADN matrice putndu-se citi n aval de aceast zon. Rezolvarea
problemei se face ca i n cazul compresiunii. Exemplu Taq polimeraza
utilizat la temepratur ridicat la 70C rezolv problema n majoritatea
cazurilor.
Exist 3 mari tehnici de secvenializare.
Secvenializarea manual prezint numeroase inconveniente:
- riscurile radioactivitii, necesitatea depunerii probei n mai muli
timpi 2-4 ore ceea ce limiteaz locul pe gel, necesit depozitarea de noi probe.
Gelul nu permite depozitarea pentru analize dect a 200 pb. Pentru un fragment
de 400 pb este necesar a doua reacie.
- pentru autoradiografie este necesar ateptarea revelaiei n cazul
35P 48-72 ore.
- este necesar citirea gelului vizual care poate da erori. Aceste
inconveniente a fcut necesar automatizarea.
Un alt mijloc de migraie n plin dezvoltare este electroforeza capilar
Electroforeza capilar
Tehnica de secvenializare este aceeai dar se modific suportul de
migrare al produsului de secvenializat. Avantajul major este creterea
considerabil a vitezei de separaie electroforetic a fragmentului. Gelurile sunt
ultrafine i n cmp electric intens permit migraia n 2,5 ore pentru circa 500
pb n timp ce pe gel clasic necesit 4-6 ore. Se utilizeaz fie geluri de
poliacrilamid cu sau fr Bis, fie geluri cu ali polimeri: polivinilalcool,
alkilceluloz. n plus aceste geluri pot fi reutilizate de mai multe ori (unii autori
au utilizat acelai capilar de 19 ori).
278

Particularitile gelurilor non cross linked (fprp BIS) pentru

electroforeza capilar:
- naintea utilizrii trebuie fcut echilibrarea cteva zile;
- se prefer PCR asimetric, cantitatea probei fiind mai mic;
- ntre fiecare migrare cmpul electric este inversat timp de cteva
minute pentru a reduce depleia ionic dat de migrarea precedent i ar
permite omogenizarea cmpului electric n capilar;
- timpii de migrare pentru probe diferite sunt reproductibili
- sunt stabile timp ndelungat mai multe sptmni. Aceste geluri sunt
utilizate n unele automate de secvenializare ca Abi PrismTM 310.
Automatizarea
Tehnica descris anterior este manual. Se poate nlocui marcajul
radioactiv cu cel nereactiv folosind markeri ca rhodamina i derivaii si, care
emit semnal fluorescent (numii fluorofori). Se marcheaz fluorescent fie o
amors, fie un precursor nucleotidic adugat n amestecul reacional
polimeraza va introduce nucleotida fluorescent n reacia de secvenializare.
La sfritul reaciei amestecurile din fiecare tub sunt depuse n secvenializator
autormat fie n acelai godeu (dac markerul fluorescent este diferit pentru cele
4 tuburi, sistemul de detecie recunoscnd fluorescenele diferite), fie n 4
godeuri dac markerul este acelai. Gelul este acelai ca i la secvenializare
manual opus prii inferioare a gelului se gsesc diode sensibile la
fluorescena emis.
Fluorescena emis este nregistrat automat de calculator. n cazul
depunerii ntr-un godeu rezult semnale cu lungimi de und diferite. Secvena
d un aspect de succesiune de pic de culori diferite, fiecare corespunznd unei
nucleotide. Odat nceput reacia migrarea se poate derula pn a II-a zi.
Citirea se face imediat pe grafic i anomaliile se evideniaz rapid. Rezultatul
secvenializrii poate fi nregistrat ntr-un fiier de calculator i pstat sau
arhivat.
Secvenializatorul automat este foarte scump. Odat secvena cunoscut
se pot utiliza programe de calculator pentru compararea secvenelor, cercetarea
exonilor, a situsurilor de restricie i chiar pentru a prefigura structura proteic
cnd s-a secvenializat o gen.

279

Fig. 123.Principiul

Fig. 124. Principiul.

280

Tehnica Maxam Gilbert

Este rar utilizat. Secvenielizarea chimic cu reactivi care cliveaz
specific dup fiecare din baze ntre A-G i C-T. Reactivii modific bazele din
ADN. Reactivii sunt hidrozina, dimetilsulfat i acid formic. n timpul doi se
adaug piperidina care taie lanul ADN la nivelul bazelor modificate. Agenii
chimici sunt utilizai n condiii de aa natur nct reacioneaz cu un procent
mic de baze ale ADN studiat. Deci tieturile specifice unui tip de nucleotide se
repartizeaz pe toat matricea analizat n acelai mod ca n metoda Sanger.
Hidrozina acioneaz la nivelul C-T, DMS acioneaz la nivelul G, acid formic
la nivelul A-G. ADN de secvenilaizat este marcat la o extremitate.
Produsul de secvenializat este depus pe gel de acrilamid, iar secvena
citit prin autoradiografie. Profilul benzilor este similar metodei Sanger.
Metoda este de interes pentru secvenializarea oligonucleotidelor. S-au
dezvoltat vectori adaptai acestor metode.
Tehnica de viitor
Secvenierea pe ADN cips (purici)
Lund ca exemplu o serie de oligoelemente octomere reprezentnd
toate combinaiile posibile adic 48 = 655456 oligonucleotide diferite. Aceste 48
oligonucleotide sunt fixate ordonat pe o plac de siliciu. Secvena de cercetat
se hibrideaz pe acest filtru. Se lucreaz la mperecheri strict omoloage.
Analiza este informatic a rezultatelor pe calculator.
Suporii utilizai pentru fixarea oligonucleotidelor este o plac de
siliciu. Sinteza oligonucleotidelor se face in situ (pe plac) prin reacii specifice
pe plac de sticl, metoda fotografierii care este o monotehnologie. Aceti
purici sunt foarte mici 1,6 cm2 cu un spaiu ntre sonde (numit rezoluie) de 50
m (65000 sonde fixate la 1,6 cm2). Astfel puricii mpreun cu spaiile sondelor
de 20m permit fixarea a mai multor sute de mii de sonde. Pot fi studiate ADN
i ARN. Hibridarea se realizeaz n condiii stringente dar condiii ideale nu
sunt bine cunoscute. Lectura se poate face cu fluorocrom cu o camer digital
CCD sau microscop confocal. Un cititor poate distinge 400000 sonde pe un
singur purice cu rezoluia de 20 m.
Mrimea fragmentului secvenializabil depinde de mrimea
oligonucleotidelor fixate pe purici. Tehnica nu este perfect pus la punct dar
este n continu perfecionare i aplicat pentru descifrarea genomului uman
care are 3 miliarde de baze. S-a demonstrat c cu 40 sonde/gen se va putea
examina ntreg genomul uman cu numai 10 purici.
Recent s-a secvenializat prin aceast tehnic ADN mitocondrial. Se
comercializeaz un purice pentru virusul HIV (America) care conine sonde
281

pentru 1040 pb ale genelor proteazei i a transcriptazei virusului i rezistenei

la tratamente antivirale.
Aplicaii ale tehnicii puricilor
Secvenializarea ADNm. Detectarea mutaiilor i polimorfismelor. n
acest sistem este preferat ARN fa de ADN ntruct caracterul de hibridare i
al semnalului produs pentru detecie sunt superioare fa de ADN. ADN este
supus amplificrii cu o amors care are la extremitatea 3' un situs promotor al
T7 ARN polimerazei realizndu-se astfel o transcripie in vitro pentru sinteza
ARN de analizat. Metoda este util n cancerologie , gena P53. expresia
genelor este n curs de dezvoltare.
Aplicaii medicale
Dup descoperirea PCR aplicaiile biologiei moleculare n chimie au
cunoscut o dezvoltare spectaculoas n toate domeniile medicinei. Biologia
molecular permite stabilirea unui diagnostic, rezultatul poate fi calitativ:
- absolut, prezena sau absena ADN sau ARN a unui agent infecios
(gripa aviar, febra aftoas);
- prezena sau absena unei mutaii n stare homozigot sau
heterozigot;
- rezultat cu risc relativ n prezena sau absena unui polimorfism
asociat cu o boal.
Rezultatul cantitativ, cantitatea de ADN sau ARN n numr de copii sau
g/ml.
Domeniul de aplicaie este foarte vast:
- cercetarea unui genom strin n microbiologie
- analiza genomului uman
- anomalii genetice, genetica medical, cercetarea mutaiilor,
cancerologie
- n imunologie tipaj HLA
- medicina legal.
Cercetarea i analiza unui genom strin n microbiologie
Toate microorganismele au fost studiate prin tehnica de biologie
molecular, aplicaiile fiind numeroase.
Diagnosticul microbiologic: s-au dezvoltat numeroase aplicaii de
cercetare calitative ale agentului infecios M tuberculosis Ch. thracomatis,
virusl HC, HIV, gripei aviare.
Se utilizeaz diferite tehnici de amplificare: PCR, LCR, SDA, SDNA,
QB replicaza, NASBA.
Se comercializeaz kituri de identificare a bacteriei dintr-o cultur
utiliznd un sistem derivat din principiul hibridrii n faza lichid (HPA sau
testul de protecie a hibridizrii). Se pun n eviden numeroase
microorganisme Mycobecterium avium, tuberculosis, streptococcus B., str.
282

Pneumoniae, staphylococcus, chlamidia, thrachomatis i Neisseria gonoreia

(din prelevri genitale).
Sunt puse n practic amorse sau sonde specifice de diagnostic. De
asemenea se comercializeaz microplci , tuburi acoperite cu streptavidin care
permit fixarea sondelor biotinilate sau capturarea produilor PCR. Exist kituri
PCR Elisa adaptabil detectrii produilor PCR unui ADN de captur specific
ADN int pe o microplac i dup hibridare revelarea cu anticorpi antiADN
dublu catenar prin sistem Elisa sistem denumit DNA imunosey sau DEA).
Epidemiologia molecular
Are aplicaii numeroase. Exemplu evidenierea unui stafilococ sau a
altei bacterii rezistent la anumite antibiotice n infecii intraspitaliceti pentru
depistarea sursei de contaminare. Genotiparea unui virus n scop de diagnostic
i prognostic virus HC.
Se utilizeaz tehnici ca: RFLP, dot blot invers, ASO, RAPD, SSCP,
DGGE, PCR specific alelelor i secvenializare direct.
Taxonomia microorganismelor
n bacteriologia descoperit genelor ARNr i secvenializarea lor, apoi
dezvoltarea tehnicilor RAPD au determinat dezvoltarea considerabil n
taxonomie i stabilirea filogeniei agenilor infecioi. Tehnicile sunt apropiate
celor utilizate n epidemiologia molecular: RFLP, RAPD, secvenierea ARNr
i secvenierea direct a genelor bacteriene.
Studiul rezistenei la antibiotice sau antivirale pentru Myycobacterium
tuberculosis (rezistent la rifampicin) i virus HIV (rezistent la azothioprine).
Se folosesc dot blot invers, ASO, secvenializare direct, PCR specific
alelelor.
Determinarea cantitativ a ncrcturii virale utilizate pentru
supravegherea terapeutic a pacienilor cu SIDA, dar i n alte boli (pentru
precizarea diagnosticului de boal) pentru a diferenia starea de purttor
sntos fa de pacient bolnav.
Se folosesc metode: PCR, LCR, bADN, NASBA, hibirdarea n faz
lichid.
Analiza genomului uman
Are aplicaii n diagnosticul bolilor genetice i medicina predictiv. Se
consider c genomul uman conine circa 50000-100000 gene. Exist un
proiect mondial de secvenializare a genomului uman care va permite
detectarea rapid a bolilor genetice dar i a altor boli cancerigene.

283

Transcripia in vitro
Producerea moleculelor de ARN n cantitate mare este uneori util cu
scopul de a studia de exemplu mecanismul de matisare a ARN sau de utilizare
a acestui ARN ca sond de hibridare.
Secvena de ADN codat pentru ARN de studiat este clonat n
plasmid sau n fagemid n aval fa de promotorul utilizat, de ctre o ARN
polimeraza fagic a fagului T7, T3 sau SP6. ADN servete ca matrice i este
linearizat la extremitatea secvenei de transcriere prin tiere cu o enzim de
restricie (fig. 121). ARN polimeraza iniiaz transcripia la nivelul
promotorului i sintetizeaz catena de ARN complementar secvenei de ADN
clonate n prezena ribonucleotidelor. Dac una din ribinucleotide adugat este
marcat radioactiv, se va produce un ARN radioactiv. Transcripia in vitro se
oprete dac ARN polimeraza atinge extremitatea moleculei de plasmid
linearizat.

Fig. 121. Transcripia in vitro.

284

RACE reacia de amplificare rapid a extemitilor catenelor de

ADN (rapid amplification of cDNA ends)
n construcia unei bnci complementare, extremitatea 5 a secvenei
(nceputul ADNc) este uneori absent pornind de la extremitatea 3OH) nu
poate fi sintetizat de ADNc n ntregime. n plus n cazul obinerii ADNc prin
amorsaj de hexanucleotide una din extremitile ARNm 5P sau 3OH este
absent. Astfel informaiile prezente pe extremitatea moleculei sunt pierdute. O
tehnic bazat pe utlizarea PCR a fost pus la punct cu scopul de a identifica
rapid extremitatea ARNm. Secvenele de la extremitile 5P sau 3OH ale unui
ARNm pot fi obinute dup acelai principiu de baz (fig. 125).

Fig. 125. Reacia de amplificare rapid a extemitilor catenelor de

ADN
Amplificarea de tip PCR a ADNc corespondent ADNm ntr-o poziie
definit, n molecul poate fi realizat la extremitatea 5P sau 3OH. n cele 2
cazuri este necesar s se cunoasc n prealabil secvena paial sau trunchiat
ale ADNc.
5RACE - reacia de amplificare rapid a extremitii 5 de ADNc
Principiul const la nceput n sinteza lanului de ADNc prin transcripia
invers pornind de la o populaie de ARNm extras dintr-un esut cunoscut ca
acumulnd transcriptul care intereseaz.
Amorsa utilizat pentru funcionarea transcriptazei inverse este o
oligonucleotid care se hibrideaz specific pe secvena genei de clonat. Dup
eliminarea ARNm (sub influena ARN-azei acide sau bazice), ADNc
monocatenar obinut este modificat prin fixare la extremitatea 3OH a unei
oligonucleotide cu secven cunoscut. Aceast secven este adesea o
policitozin sau o poliguanin. ADNc monocatenar astfel modificat este
amplificat prin PCR cu ajutorul amorsei specifice genei i cu o amors
complementar cu polyC sau polyG. Fragmentul de ADN bicatenar obinut este
apoi caracteizat prin secvenializare (fig. 126).
285

Fig. 126. Reacia de amplificare rapida a extremitatii 5.

RACE 3
Principiul const n:
1. sinteza lanului de ADNc prin transcriptaz invers, utiliznd ca
amors o oligonucleotid polyT, coninnd la extremitatea 5P o secven
cunoscut suplimentar (oligonucleotid adaptator) i hibridndu-se la
extremitatea polyA a ARNm.
2. amplificarea prin PCR a unui fragment al ADNc cu ajutorul unei
amorse primare care se hibrideaz pe secvena suplimentar a oligonucleotidei
adaptator i a unei amorse secundare care se hibrideaz specific pe o gen.
3. secvenializarea fragmentului amplificat corespunztor extremitii
3OH al ARNm (fig. 127).

286

Fig. 127. Reacia de amplificare rapida a extremitatii 3

Polimorfism ADN prin amplificare aleatorie- RAPD
n cazul cercetrilor polimorfidmului unui genom, dac nici o secven
de ADN (precis) nu este inta, este posibil utilizarea de oligonucleotide de
mrime mic (6-9 baze) cu rol de amors cu secvene aleatorii. Aceste amorse
se vor fixa pe ADN int la ntmplare i natura produilor de amplificare
obinui este necunoscut (fig. 135). Aceast tehnic este numit RAPD
(Random Amplified Polymorphic ADN).

287

Fig. 135. Polimorfismul ADN prin amplificare aleatorie.

Ea permite obinerea rapid a fragmentelor variate de ADN genomic
care vor fi apoi analizate. Condiiile de preparare a probelor i ciclurilor PCR
date vor fi optimizate pentru fiecare aplicaie au scopul de a asigura
reproductibilitatea rezultatelor.
Fragmentele de amplificare care permit relevarea unui polimorfism, pot
fi subclonate cu scopul de a fi caracterizate prin secvenializare. ncepnd de la
aceast secven este posibil redefinirea amorsei care va avea o probabilitate
puternic de a fi specific probei analizate. Este vorba de SCAR (Sequenced
Characterized Amplified region sau regiune Amplificat Secvenializat
Caracterizat).

288

Polimorfismul lungimii fragmentelor amplificate AFLP

Tehnica AFLP a fost introdus n anul 1993 . Principiul su const la
amplificarea selectiv a fragmentelor de restricie generate ncepnd de la o
prob de ADN genomic. Aceast tehnic permite cercetarea polimorfismului de
lungime a fragmentului de restricie la nivelul ADN (fig. 136).

Fig. 136. Electroforeza ADN monocatenar.

289

Ea este utilizat de exemplu pentru identificarea speciei, analiza de

pedigree i cercetarea markerilor genetici legai de un caracter. Tehnica AFLP
este de asemenea, utilizat pentru identificarea genelor exprimate n mod
diferit. n acest caz analiza AFLP se bazeaz pe ADN complementar (ADNc)
sintetizat ncepnd de la ARNm. Aceast tehnic numit AFLP-ADNc permite
vizualizarea n mod indirect a subpopulaiei de ARNm i compararea ntre ele.
Polimorfismul de lungime a fragmentelor amplificate AFLP
Fragmentele de restricie sunt generate ncepnd de la ADN genomic.
Aceste fragmente sunt apoi separate n condiii denaturante pe gel de
polyacrilamid.
Digestia ADN sau ADNc poate fi realizat de 2 enzime de restricie care
secioneaz la nivelul unui situs rar i al unui situs frecvent.
Ligaturarea.Adaptatorii specifici ai situsurilor de restricie utilizai
sunt fixai la extremitile fragmentelor de restricie obinute.
Preamplificarea i amplificarea selectiv
Amplificarea este realizat cu ajutorul amorselor definite dup secvena
adaptatorilor. Aceste amorse poart pe extremitatea lor 3OH extensii aleatorii
de 1-3 baze care permit amplificarea selectiv a unei pri a populaiei
fragmentelor de restricie. Se realizeaz o amplificare cu ajutorul amorselor
care prezint o extensie a unei baze n general (amors +1). Produsele acestei
preamplificri vor servi ca matrice pentru amplificarea selectiv cu ajutorul
amorselor +3. Pentru o singur cupl de enzim, utilizarea amors +3 poart
4096 combinaii posibile (64x64). Produsele de amplificare selective sunt apoi
separate pe gel de poliacrilamid.
Detecia benzilor de AFLP este obinut prin:
- coloraia gelului cu argint
- autoradiografie sub emulsie fluorescent.
n aceste cazuri una din amorsele de AFLP (n general cea
corespunztoare situsului de restricie rar) este marcat fie radioactiv (-32P sau
-33P) fie printr-un cromofor fluorescent (n cazul unei analize cu ajutorul unui
secvenializator automat).
Alegerea ARN prin AFLP-ADNc
Tehnica AFLP este utilizat pentru identificarea secvenelor codante
exprimate n mod diferit n dou populaii de ARNm. Principiul tehnicii este
acelai. Diferena major n raport cu AFLP const n ADN genomic care va
face ca o populaie de ADNc, care prezint o variabilitate de secvene mai slab
(singurele sunt reprezentate numai de secvenele codante), s aibe un nivel de
reprezentare a acestor secvene foarte variabil (legat de expresia acestor gene).
290

De fapt amplificarea fragmentelor de restricie este realizat n general

n condiii mult mai puin selective. Adesea preamplificarea nu este selectiv
(amors fr extensie) i amplificarea nu este obinut cu ajutorul amorselor
care poart dou extensii (amorse +2).
Mutageneza dirijat
Mutageneza dirijat este o tehnic ce permite modificri in vitro a
secvenei de aminoacizi a unei proteine cu scopul de a verifica importana
acestor aminoacizi i funcia proteinei. Principiul este de a crea mutaia genei
in vitro i de a produce proteina. Pentru efectuarea acestora, este necesar s
posede ADNc sau gena codant pentru aceast protein. Secvena nucleotidic
modificat in vitro este reintrodus n microorganisme (o bacterie n general).
Microorganismul transformat va sintetiza proteina ncepnd de la gena mutant
pentru a produce un polipeptid corespunztor mutaiei.
Caracteristicile biochimice a acestor proteine mutante vor putea fi
analizate cu scopul de a determina importana aminoacizilor mutani n
funcionarea polipeptidelor. Se pot efectua trei tipuri de mutaii: deleia,
inseria, substituia bazelor.
Principiul
Mutaia prin deleie sau inserie poate fi obinut uor dac secvena
genei conine situsurile de restricie adecvate. Prin digestia enzimelor de
restricie adecvat se poate elimina o parte din secvena sau se introduce un
fragment de ADN exogen cu o poziie definit. Cu toate acestea, aceast
metod este limitat deoarece nu permite o mutaie int pe un numr mic de
aminoacizi. Pentru a evita aceste inconveniente s-a dezvoltat o tehnic de
mutagenez dirijat in vitro n prezena oligonucleotidelor mutagene cu
secven cunoscut. Aceast metod permite efectuarea tuturor modificrilor
dorite ntr-o poziie aleas dintr-un fragment de ADN de secven cunoscut.
De exemplu, schimbarea unui singur aminoacid a unei proteine n care
secvena genei corespunztoare este cunoscut.
Principiul de baz const n sinteza unui oligonucleotid cu secven
complementar regiunii genei de mutat.
Gena de mutat este introdus ntr-un vector fagic de tip M13 i ADN
este purificat sub form monocatenar. Oligonucleotida mutagen este apoi
hibridat cu ADN, inta monocatenar. Duplexul astfel format este utilizat ca
amors pentru ADN polimeraza care sintetizeaz catena complementar.
Moleculele obinute corespund unui plasmid dublu catenar din care una din
catene posed mutaia i alta nu. Bacteriile sunt transformate cu aceast
molecul. Unele vor poseda caten mutant altele catena slbatic. O
secvenializare a unui numr mic de clone este necesar pentru a identifica
291

fagii care posed secvena mutant. Proteinele mutante sunt apoi produse n
E.coli cu scopul de a analiza efectul modificrilor secvenei mutante.
Mutageneza dirijat prin PCR
Randamentul mutagenezei descris n paragraful precedent fiind relativ
mic s-au fcut modificri la principiul de baz. Introducerea unei mutaii prin
PCR permite crearea la 100% mutante n timp ce prin tehnica precedent nu
conduce dect la 80% mutante.
Prima metod de mutagenez prin PCR necesit utilizarea a 4 amorse
nucleotidice diferite. Primele dou oligonucleotide (1 i 2) sunt strict
complementare una celeilalte i posed mutaia. Celelalte dou (3 i 4) permit
amplificarea n totalitate a ADNc pentru care se dorete mutaia. Ele sunt deci
complementare extremitilor 5 i a a ADNc prezent n plasmid. Cu ajutorul
acestor dou cuple de amors se va realiza 3 reacii PCR succesive (fig. 138).

Fig. 138. Mutageneza dirijat prin PCR.

292

n prima PCR utiliznd amorse 1 i 4 se obine un fragment parial de

ADNc mutant pe regiunea dorit. n paralel este realizat o reacie PCR cu
ajutorul amorsei 2, 3 pentru a obine n acelai mod un fragment de ADNc
parial mutant. Aceste dou fragmente PCR sunt apoi purificate i amestecate
pentru a servi ca matrice la o ultim reacie PCR; amplificarea extremitilor se
face cu ajutorul amorselor 3 i 4. Aceste dou fragmente se hibrideaz prin
partea lor comun ceea ce permite obinerea unui fragment complet coninnd
mutaia pe 2 catene. Acest fragment poate fi apoi subclonat ntr-un vector
pentru producerea proteinei.
A doua metod de mutagenez prin PCR este numit megaprimer. Ea
necesita utilizarea a 3 oligonucleotide. Prima poart mutaia care dorim s-o
introducem i este complementar cu o caten de ADN int. Celelalte dou,
ca n precedenta, corespund extremitilor de ADNc. n prima reacie PCR,
utilizarea amorselor 1, 4 permite obinerea unui fragment PCR care poart
mutaia (purttor) i corespunde la o secven trunchiat a ADNc matri. n
acest mod se genereaz un fragment complet i mutant.
Taq polimeraza poate da erori de citire astfel c utilizarea sa prin
mutageneza PCR trebuie s fie controlat; se lucreaz utiliznd un numr redus
de cicluri (30). Se utilizeaz Taq polimeraza de ultim generaie cu reputaie
fidel, disponibil n comer.
Etichetaj molecular
Etichetajul molecular este o tehnic de clonaj a genelor. Ele permit
accesul la gene de care nu se mai cunoate nimic despre natura proteinelor pe
care le codific. Principiul const n ininerea de mutaii pe un fenotip dorit (de
exemplu, mutant n dezvoltarea plantelor) i n clonajul genei afectate de
mutaie, care va trebui s joace un anumit rol n fenotipul studiat. Sunt
prezentate aici exemple de aplicaii la plante.
Principiu
Scopul este de a obine mutaii la care genele mutante sunt etichetate
prin introducerea unei secvene de ADN strin. n prezena acestor secvene
supranumerare ntr-o gen care a distrus faza de citire, aceast gen a indus
astfel producia de proteine mutante inactive n funcia sa. Mutantele obinute
sunt criblate pe fenotipul dorit i gena afectat de mutaie este etichetat,
clonat i studiat. Astfel, pentru etichetarea genelor sunt posibile dou
protocoale.
Transformarea bacteriilor

293

n scopul facilitrii moleculelor de ADN s traverseze peretele

membranei celulare, bacteriile n faza exponenial de cretere sunt fragilizate
(de exemplu prin tratarea cu clorur de calciu la 4C).
Aceste bacterii astfel preparate, numite bacterii competente sunt puse n
contact cu o soluie cu plasmid de integrat. Apoi membrana bacteriei este
fcut permeabil (prin formarea microporilor) fie printr-un oc termic sau
prin oc electric (electroporare) cu un randament superior transformrii
bacteriene. Bacteriile sunt puse n cultur pe un mediu de geloz coninnd
antibiotic corespondent cu gena de rezisten purtat de plasmid. Prin aplicarea
acestui agent selectiv numai bacteriile care au integrat plasmidul se vor
multiplica. Plasmidele recombinate se multiplic n celule amplificnd astfel
secvenele de ADN clonate.
Atunci cnd bacteriile sunt transformate de un plasmid sau un fagemid
recomabinat ele se dezvolt pe un mediu de geloz cu formarea unei colonii.
Fiecare colonie corespunde la un ansamblu de bacterii identice, prevenite prin
diviziunea unei singure bacterii. Meninerea plasmidelor n bacterii
recombinate este asigurat printr-o presiune de selecie exercitat de prezena
antibioticelor n mediul de cultur.
Transformarea levurilor
Introducerea unei molecule de ADN hibrid ntr-o levur, Sacharomices
cerevisae se poate efectua n dou maniere. n primul rnd sferoplastele
(celulele libere de perete) pot fi preparate apoi incubate n prezena ADN
recombinat cu polietilenglican i clorur de calciu. n al II-lea rnd o parte din
celule pot fi tratate cu o soluie salin alcalin cum ar fi acetatul de litiu care are
efectul de fragilizare a membranelor. Acestea sunt incubate cu ADN i PEG.
Ptrunderea ADN n levuri, astfel tratate este stimulat printr-un oc termic
ADN strin poate fi meninut n celulele transformate sub o form integrat n
ADN cromozomial prin recombinare omoloag sau ca o form replicativ
independent a cromozomului. Aceast capacitate de replicare independent
este conferit prin secvena numita ARS (secvena autonom de replicare sau
Autonomous Replicating Sequence) care a fost identificat n plasmidele
endogene (de 2 m) ale levurii. Moleculele de ADN care nu posed aceast
secven ARS trebuie s se integreze n genom prin recombinri omoloage
pentru a se obine levurile transformate ntr-o form stabil.
Transformrile genetice ale celulelor animale
S-au dezvoltat tehnici pentru introducerea genelor n celulele animale.
Introducerea unei secvene de ADN n celula animal permite analiza in vivo a
294

rolului acestei secvene n determinarea funciei unei gene sau identificarea

secvenelor reglatoare care controleaz expresia acestor gene. Se va alege linia
celular cea mai adecvat pentru producerea unei proteine date sau pentru a
studia ce se dorete s se aduc, precum vectorul cel mai adaptat la linia
celular aleas. Toi vectorii utilizai trebuie s posede elemente eseniale:
1. o origine a replicrii bacteriene i un marker de rezisten la un
antibiotic care permite amplificarea plasmidului n bacterie;
2. secvene eucariote care controleaz iniierea transcripiei (promotori)
i maturarea transcriilor (semnale de poliadenilare) n general derivate dintrun virus ca virusul maimuei (SV 40) sau tumori mamare a oarecelui
(MMTY);
3. un marker de selecie care permite supravieuirea celulelor eucariote
recombinate dac ele sunt cultivate ntr-un mediu selectiv;
4. gene de exprimat sub form de ADN complementar sau ADN
genomic. Vectorii utilizai sunt adesea derivai din genomul unui virus natural
infecios sau transformat pentru linia celular aleas. De exemplu, promotorul
derivat din virusul SV 40 funcioneaz bine n celulele derivate de la maimu
(ca celulele cos) dar sunt mult mai puin efiace la oareci.
Dou metode experimentale s-au dezvoltat pentru a introduce ADN n
celulele eucariote: transfecia unui vector de expresie sub form de ADN-nu pe
de o parte i transferul ADN recombinat n cazul unui proces infecios viral pe
de alt parte. n acest caz tehnica de infecie depinde de tipul de virus i de
celula gazd. Se vor prezenta mai multe metode de transfecii. Transfecia este
termenul de transformare, este ambiguu n biologia animal deoarece el descrie
n acelai timp trecerea cancerului ntr-o celul gras sntoas, aa zis
activare anormal a diviziunii celulare. Termenul de transfecie este utilizat cu
mai mult uurin deoarece el descrie transferul unei molecule de ADN viral
sau neviral ntr-o celul animal prin ARNm. ADN strin poate fi integrat de
asemenea n genomul celulei gazd; expresia sa este modificat de la o linie la
alta n funcie de situsul de integrare. Numrul de copii de ADN strin integrat
n genomul celulei poate varia de la 1 la 20.
Totui eficacitatea penetraiei i expresiei ADN strin poate varia de la
1 la 100, dup tipul celulei utilizate, natura, cantitatea i starea ADN
recombinat i diferii parametri fizico-chimici introdui de ADN. Alegerea
uneia sau alteia din aceste tehnici depinde n special de natura celulelor
utilizate (de exemplu, metoda cu fosfat de calciu este ineficace pentru
limfocite) i de tipul de expresie dorit (un procent ridicat a concentraiei
expresiei stabile este obinut prin electroporaie).
Utilizarea fosfatului de calciu
Precipitatele sunt obinute prin aciunea ionilor de calciu coninui n
fosfat de calciu pe ADN. Precipitatul obinut este cu att mai important cu ct
295

cantitatea de ADN este mare. Tehnica const deci n creterea concentraiei de

ADN din precipitatul obinut i amestecul plasmidului recombinat cu ADN
anterior (de exemplu ADN-ul spermatozoizilor de somon. Aceast metod este
eficace pe un numr mare de celule animale).
Utilizarea polimerilor anionici DEAE-dextran
DEAE-dextran este un polication care faciliteaz absorbia ADN pe
membrana celular i favorizeaz intrarea lui n interiorul celulelor. n plus el
protejeaz ADN mpotriva aciunii nucleazelor i crete astfel, iniierea
expresiei n celul. DEAE-dextran este de asemenea utilizat pentru creterea
eficacitii infeciilor virale. Celulele care conin un numr mare de vectori n
nucleul lor, dar nici o copie nu este integrat n genomul celulei. Totui DEAEdextran poate fi toxic pentru celule. Optimizarea condiiilor de transfecie se va
face n funcie de sensibilitatea la aceti polimeri ai celulei gazd. Cu toate
acestea, eficacitatea transcripiei este crescut adic se pot obine pn la 25%
celule transfectate.
Utilizarea lipozomilor
Tehnica const n incorporarea ADN strin n vezicule cu membrane
artificiale. Veziculele penetreaz celula prin endocitoz. Puterea infecioas a
virusului ADN exp SV 40 poate fi crescut de peste 200 de ori. Totui aceast
tehnic nu are cea mai bun eficiacitate comparativ cu tehnica prin utilizarea
DEAE-dextran.
Furnizarea protoplastelor
Protoplastele sunt preparate din bacteriile coninnd plasmide
recombinate. Protoplastele i celulele animale sunt puse n contact. Fuziunea
membranelor celulare, favorizat de la adiia de polyetilenglicol, permite
ncorporarea plasmidei n celule.
Electroporaie
Transfecia prin electroporaie const ntr-un transfer direct de ADN n
citoplasma celulei gazd. Porii tranzitorii sunt creai n membrana celulei gazd
atunci cnd ele sunt supuse unui scurt impuls electric care permite trecerea
ADN. Aceast tehnic prezint avantajul de a putea fi utilizat la toate tipurile
de celule. Necesit o aparatur special, dar eficacitatea sa este net superioar
pentru ca n anumite cazuri, aproape 90% din celulele integreaz ADN
recombinat n citoplasma lor.
Biolistica
Miniaturizarea tunurilor de particule sub form de pistolet permite
transformarea celulelor sau a esuturilor animale vii.
Transpozonii

296

Acestea sunt elemente genetice capabile de inserare n genom la orice

situs. Ele posed o secven central, caracteristic tipului de tranpozon i
altele ale extremitilor, scurte secvene repetate i inversate (fig.142).

Fig. 142. Transpozonii.

Mutaia este obinut prin inseria unui transpozon din AND genomic,
care va ntrerupe secvena genei de cercetat. O banc genomic se face pornind
de la ADN nuclear al mutantei. Aceast banc este criblat cu ajutorul ADNului din transpozonul marcat. Clonele genomice care rspund la hibridare se
presupune c acestea conin transpozoni, astfel c secvenele adiacente
constituie teoretic gena mutant de cercetat (problema este c mai muli
transpozoni se pot integra n genom; trebuie reperat acela care este integrat
ntre genele dorite. Pentru aceasta se face analiza descendenilor plantelor i
reperarea fragmentelor genomice coninnd transpozoni care cosegreg cu
fenotipul mutant cercetat). Aceste secvene genomice aflate n continuitatea
transpozonului sunt izolate.
O banc genomic este constituit pornind de la ADN nuclear de la un
individ slbatic. Aceast banc este criblat cu secvene genomice izolate n
prealabil la mutant. Astfel, gena slbatic este clonat.
297

Markerii genetici moleculari

Modificarea structural a ADN statistic legat de un caracter ereditar
fr s fie cauza acestuia definete un marker genetic.
Cercetrile pentru diagnostic ai markerilor se realizeaz prin
urmtoarele metode: polimorfismul fragmentelor de restricie, amplificarea
unei secvene repetitive.
Diagnosticul prezenei unui marker genetic la un subiect nu are obinuit
o certitudine de 100% n supravegherea legat de acel marker; se vorbete deci
de factori de risc.
Cercetri polimorfismului unui genom sunt n plin dezvoltare. Fiecare
tehnic prezint avantaje i inconveniente iar alegerea lor depinde de problem
gentic.
Care sunt markerii genetici?
Un marker genetic este un caracter msurabil prin ereditatea
mendelian. Aceasta este opus markerilor morfologici (culoare, forme)
markerilor moleculari (la nivelul ADN) i markerilor biochimici (izoenzime,
proteine, metabolii secundari ca terpine).
Caracteristicile unui marker ideal pot fi rezumate dup cum urmeaz:
- polimorfism adic variabilitatea ntre indivizi;
- discriminarea care permite diferenierea ntre indivizii foarte apropiai;
- multialelism adic posedarea mai multor alele (secvene de ADN diferite)
pe acelai locus;
- codominana - un individ heterozigot prezint simultan caracterele a doi
prini homozigoi. Se distinge deci de fiecare din prini;
- nonepistatic- genotipul markerilor poate fi determinat pornind la fenotip
indiferent care este genotipul altor locusuri. Citirea markerului studiat este
independent de expresia altor markeri genomici;
- independent de mediu- genotipul markerului poate fi determinat pe baza
fenotipului indiferent de mediu;
- neutru- indiferent care sunt alele prezente n locus valoarea selectiv a
individului este aceeai;
- repartizat uniform n tot genomul cu scopul de a evalua polimorfismul n
multiple regiuni ale genomului;
- reproductibile de la o experien la alta;
- economic i manipulabil la scar larg.
Markerii morfologici sunt n majoritatea polimorfi.

298

299