<10> Evaluacin de parmetros de Validacin para procedimientos de referencia y

aceptables Directrices para donantes / instrucciones para el personal

PROPSITO
Este documento (Documento 5) provee informacin para determinar si los procedimientos de
referencia o los procedimientos aceptables para las pruebas de ensayo e impurezas en el
compendio de medicinas de la USP (MC) son aceptables. El enfoque se basa sobre una
serie definida de Procedimientos de desempeo de medicin (PPMs, por Procedure
Performance Measures) y asociado a Procedimientos de desempeo de criterios de
aceptacin (PPACs, por Procedure Performance Acceptance Criteria) y experimentos. Se
provee ms informacin en el Apndice. Mientras que los conceptos en la Gua son
generales, esta se dirige a mtodos cromatogrficos para ingredientes qumicos y productos.
Pueden ser necesarios ajustes para la separacin en mtodos e ingredientes / productos.
Procedimientos de desempeo de medicin PPMs.
Procedimientos de desempeo de criterios de aceptacin PPACs.
Parmetros crticos de la validacin CVP
ENSAYO
Precisin y exactitud
Muestras: Seis rplicas de las soluciones estndar.
Anlisis: Determine la precisin y exactitud.
Precisin: Determine el coeficiente de variacin de las soluciones estndar.
Exactitud: La media del contenido en porcentaje de las soluciones estndar corregidas
por el contenido declarado del material de referencia.
Analice el resultado usando MS Excel:
Result = NORMDIST(Upper Cert, Mean, SD, TRUE) NORMDIST(Lower + Cert, Mean,
SD, TRUE)
Upper =Lmite superior del rango de aceptacin (por ejemplo, 102% en el caso de
default).
Cert = Medida de incertidumbre del estndar de referencia usado (=0 o menos si se
usa CRM o SRM).
Mean = Valor de exactitud.
SD = Valor de precisin
TRUE = operador lgico.
Lower = Lmite inferior del rango de aceptacin (por ejemplo, 98% en el caso de

default).
PPAC: NLT 0.95
Especificidad
Soluciones estndar adicionadas: Conteniendo los mesurandos a las mismas
concentraciones como la solucin estndar en cada impureza especificada a 10x del valor
especificado e impurezas no especificadas a 1.0% [Nota: Excluya todas las impurezas que
contribuyan un nivel aceptable de sesgo asignable].
Muestras: Solucin estndar y soluciones estndar adicionadas.
Anlisis: Analice los resultados y determine la resolucin de cada impureza del pico
principal.
PPAC
Resolucin: NLT 1.5 para cada impureza.
Linealidad y rango
Muestras: No menos de seis rplicas independientes de soluciones estndar sobre el rango
del procedimiento a utilizar, pero no menos de 80%, 90%, 100%, 110% y 120%.
Anlisis: Analice los resultados de cada serie de datos de las soluciones como se describe
en Precisin y Exactitud.
PPAC: No menos de 0.95 para cada concentracin.

PROCEDIMIENTO DE LMITE DE IMPUREZA ORGNICA

Precisin (Repetibilidad)
Muestras de prueba: Seis muestras independientes del material bajo prueba, adicionadas
con materiales de referencia para las impurezas especificadas en el lmite indicada.
PPAC
Desviacin estndar relativa: NMT 2C 0.1505%. C es la fraccin de la concentracin de la
impureza [y est calculada dividiendo la concentracin de la impureza entre la concentracin
del componente principal.
Una impureza adicionada presenta a 0.1%
del pico principal tendr una fraccin de la
concentracin, C, de (0.1%/100%) = 10 -3, lo cual llevara a un coeficiente de variacin

aceptable de 5.7%
Por lo tanto, un procedimiento alternativo de impureza presentara una precisin aceptable si
esta diera una Repetibilidad de < 5.7%].
[NOTA: La ecuacin de Horwitz se basa en la comparacin de un procedimiento de
reproducibilidad en comparacin al factor de concentracin. La Repetibilidad ha sido
reportada ser de la reproducibilidad. Por lo tanto, la ecuacin
basada en el anlisis de
Repetibilidad dara lugar a la ecuacin: %RSD aceptable = C 0.1505. Sin embargo para la
evaluacin de una prueba lmite, se usa la ecuacin basada en una reproducibilidad ms
amplia debido a que la precisin es menos importante en este tipo de prueba].

Lmite de deteccin
Muestra control: Una preparacin de materiales de referencia para las impurezas de
inters en la concentracin indicada.
Muestra prueba 1: Una muestra de material bajo prueba, adicionada con materiales de
referencia para las impurezas especificadas a la concentracin indicada, preparada por
triplicado.
Muestra prueba 2: Una muestra de material bajo prueba,
adicionada con materiales de
referencia para las impurezas especificadas 100 - (2C 0.1505)% de la concentracin indicada
para las impurezas especificadas, preparadas por triplicado.
PPAC: Cada muestra prueba 1 proveer una respuesta de pico equivalente a o ms grande
que la muestra control. La muestra prueba 2 debe proveer una respuesta de pico que es
menor que la de la muestra control. (NOTA: La seal de cada muestra obtenida debe
mostrar un cambio del valor obtenido comparado contra un blanco].
Especificidad: El procedimiento debe tener la habilidad de evaluar sin equivocarse, con
exactitud y precisin aceptable (ver las secciones previas) cada impureza especificada en la
presencia de componentes que pueda esperarse estn presentes, incluyendo otras
impurezas especificadas, contraiones del compuesto principal, frentes de solvente y
componentes de la matriz.

Donde las impurezas especificadas sean separadas por una resolucin ms grande
de 1.5, entonces el procedimiento tiene una especificidad aceptable.
Donde las impurezas especificadas no estn bien resueltas, entonces se
completa un estudio de adicionado y recuperado de los picos eluyendo
cercanamente. Si las impurezas especificadas de inters cumplen los
requerimientos de precisin previos con la presencia del pico interfiriendo,
entonces el procedimiento es aceptable.

Procedimientos cuantitativos de impurezas orgnicas

EXACTITUD
Soluciones estndar: Prepare soluciones de las impurezas especificadas en el rango de
concentracion desde 50% hasta 150% del valor lmite para cada impureza, usando
materiales de referencia apropiados u otras fuentes confiables de impurezas.
Soluciones muestra: Prepare soluciones del material bajo prueba adicionados con
materiales de referencia apropiados en el rango de concentracin desde 50% hasta 150%
del valor lmite indicado para cada impureza especificada
PPAC
Recobro de adicionado = C0.1505% para la media de tres rplicas a cada concentracin.
[NOTA: Los datos obtenidos para este parmetro de validacin se usa para Lmite de
Cuantificacin (LOQ), Rango, y Linealidad en la siguiente seccin].

PRECISIN
Repetibilidad
Muestras de prueba: Seis muestras independientes de material bajo prueba,
adicionadas con materiales de referencia apropiados para las impurezas especificadas a
los niveles indicados.
PPAC
Desviacin estndar relativa: No ms de C0.1505%; donde C es la fraccin de concentracin
de la impureza.
ROBUSTEZ
Debe establecerse el efecto de eventos aleatorios sobre la precisin analtica del mtodo.
Los experimentos aceptables para establecer la precisin intermedia incluyen el desempeo
de la Repetibilidad de los anlisis.

Sobre diferentes das

Con diferente instrumentacin.
Con diferentes analistas.

Observe que se requiere la ejecucin de slo uno de los tres experimentos enlistados
para demostrar la precisin intermedia.

PPAC
Desviacin estndar relativa: No ms de 2C0.1505%; donde C es la fraccin de
concentracin de la impureza.
ESPECIFICIDAD
El procedimiento debe tener la habilidad de evaluar sin equivocarse cada impureza
especificada en la presencia de componentes que se espera estn presentes, incluyendo
otras impurezas especificadas, contraiones del compuesto principal, frentes de solvente y
componentes de la matriz.
Donde las impurezas especificadas sean separadas por una resolucin ms grande de 1.5,
entonces el procedimiento tiene una especificidad aceptable.
Donde las impurezas especificadas no estn bien resueltas, entonces se completa un
estudio de adicionado y recuperado de los picos eluyendo cercanamente. Si las impurezas
especificadas de inters cumplen los requerimientos de precisin previos con la presencia
del pico interfiriendo, entonces el procedimiento es aceptable.
Lmite de Cuantificacin, Rango y Linealidad
Demostrado por el cumplimiento de los requerimientos de Exactitud.

APNDICE: CONSIDERACIONES TERICAS

Introduccin
Los principios de Validacin son provistos en el captulo general de Validacin de Mtodos
Compendiales <1225> en la Farmacopea de los Estados Unidos Formulario Nacional
(USP-NF). Los principios de equivalencia se presentan en la siguiente publicacin;
Aceptable, Equivalente o Mejor: Enfoques para procedimientos alternativos a los
procedimientos compendiales oficiales. Una forma
de equivalencia involucra la
demostracin de que un procedimiento cumple con una serie de criterios pre-establecidos
que indican la aceptabilidad de un procedimiento de referencia o un procedimiento aceptable
en el Compendio de Medicinas de la USP (MC). Los criterios pre-establecidos consisten del
procedimiento del desempeo de medicin (PPM) y el Procedimiento de desempeo de
criterio de aceptacin (PPAC) para aplicacin especfica. Frecuentemente la PPM y la PPAC
se presentan juntas en una monografa o captulo general de mtodo especfico (ver
Impurezas elementales Procedimientos <233>). El PPAC tambin puede encontrase en
captulos generales de mtodos especficos (tal como Cromatografa <621>). Este Apndice
provee una discusin general de los PPMs en la determinacin si los procedimientos de
referencia o procedimientos aceptables cumplen con criterios predeterminados para PPACs
aceptables.
Procedimiento de desempeo de mediciones
El captulo general Validacin de mtodos compendiales <1225> define los parmetros
crticos de la validacin (CVP, por critical validation parameters) necesarios para validar un
procedimiento. Los CVPs pueden tambin ser considerados como los PPMs para la
determinacin de la aceptabilidad de los procedimientos. Los mtodos (cromatogrficos,
espectrofotomtricos, gravimtricos, etc.) usados en los procedimientos de prueba de una
monografa tiene cada uno sus trminos, medidas y los supuestos que se usan para
describir la informacin crtica acerca de la aceptabilidad del mismo procedimiento. Estos
trminos y medidas especficas del mtodo pueden no alinearse bien con los PPMs
necesarios para definir un procedimiento aceptable. Por lo tanto, son necesarios enfoques
adicionales para determinar la aceptabilidad del procedimiento de una monografa. Estos
enfoques son llamados PPMs.
Ensayo cromatogrfico
Los parmetros de Validacin para ensayo cromatogrfico se definen como: exactitud,
precisin, especificidad, linealidad y rango. Hay miles de expertos practicando cromatografa
a travs de la industria farmacutica y estos individuos han llegado a un acuerdo no escrito
en cuanto a lo que conllevara un procedimiento adecuado. La mayora de estos individuos
describira la resolucin, la forma del pico, co-elucin, deriva de la lnea base, el volumen
muerto y otros trminos relevantes cromatogrficamente. Sin embargo, todos estos trminos
son medidas especficas que describen las caractersticas de una separacin, pero no son
paralelos a los CVP definidas anteriormente. Por ejemplo, la especificidad de un
procedimiento puede ser descrito, en parte, por la resolucin de pares crticos de los picos, y

en parte por la probabilidad de co-elucin y tambin por el nmero y la altura de platos

tericos, y varios otros. Cada una de estas medidas ayuda a un analista a describir la
"bondad" de su procedimiento. Sin embargo, estas medidas no pueden adecuadamente
describir un procedimiento aceptable en forma aislada. Lo que se necesita es un enfoque
que permite a un analista para determinar con rapidez y decisin que su procedimiento es
aceptable. Los valores aceptables se han incluido en el captulo Cromatografa General
621 usando la lgica que sigue.
PRECISIN Y EXACTITUD
La precisin de un procedimiento afecta la aceptabilidad de todos los CVPs. Como la
precisin de un procedimiento incrementa, cualquier sesgo inherente en el sistema llega a
ser ms aparente, la linealidad y rango llega a ser mejor definido, la habilidad para
determinar un error causado por falta de especificidad llega a ser ms aparente y la
probabilidad de que un material cumpla el criterio de aceptacin del ensayo recibiendo un
resultado que pase se mejora. De estas relaciones, la Precisin y Exactitud son los ms
estrechamente relacionados.
Exactitud: La exactitud de un procedimiento de cromatografa de lquidos est ligada a la
exactitud del detector, velocidad de muestreo del detector, y la consistencia y calidad de la
separacin. Debido a que la cromatografa es una tcnica relativa, los resultados de un
desconocido deben compararse contra un estndar conocido para obtener un resultado
cuantitativo. El valor o concentracin verdadero de la solucin del estndar conocido debe
determinarse usando un procedimiento ortogonal o a travs del uso de un material
estandarizado. Para determinar empricamente la exactitud de un CVP, se deben usar
mltiples pesadas (6) de un material estndar para producir soluciones independientes
teniendo la misma concentracin. Cada una de las soluciones deben ser cromatografiadas y
corregidas por las diferencias en la pesada. La diferencia entre el promedio del contenido
calculado de las soluciones Estndar (obtenidos mediante el uso de la curva de calibracin
desarrollada durante la validacin del procedimiento) y el contenido conocido de la solucin
Estndar debe representar el sesgo del procedimiento (exactitud).
Precisin: Como la exactitud, la precisin de un procedimiento cromatogrfico cuantitativo
est directamente ligada a la precisin del detector usado. La precisin de una medida
tambin depende sobre la calidad de la separacin. La precisin puede determinarse
empricamente usando los datos obtenidos para la evaluacin de la Exactitud. Los datos
obtenidos y corregidos son usados para calcular la desviacin estndar relativa o %CV.

RELACIN ENTRE EXACTITUD Y PRECISIN

Cuando tomamos decisiones acerca del mejor mtodo para un anlisis en particular, hay un
nmero de factores aparte de las CVPs. Estos factores incluyen: Longitud del anlisis, costo
del solvente usado y disposicin vida de la columna, compatibilidad solvente-columna,
longitud del gradiente, tiempos de equilibrio, capacidad de la bomba, etc. Por lo tanto,
frecuentemente es necesario sopesar los requerimientos de Precisin y Exactitud con estas
preocupaciones externas. Obviamente un mtodo con 0 RSD y sesgo sera la mejor tcnica

disponible, pero donde se requiere que el solvente y la columna se mantenga a 50C o que
se requiera 2 horas para equilibrar entre cada anlisis, es poco probable que sea
seleccionado. Por lo tanto, la definicin de un procedimiento aceptable debe proveer
flexibilidad al usuario, mientras se define claramente la condicin lmite entre cromatografa
aceptable e inaceptable. Este lmite se define estadsticamente como una simple distribucin
normal que describe la probabilidad (a un nivel de confianza de 95%) de un valor pasable
para demostrar el cumplimiento de un criterio de aceptacin de 98% - 102% (vea la figura 1).

Figure 1. Bias%CV Tradeoff, 98%102% Limits, True Value = 100, Probability Passing 0.95.

Para el caso de 98% -102%, un usuario puede simplemente imprimir los valores del sesgo
y %CV. Si el punto descrito por un procedimiento de exactitud y precisin cae en el rea
sombreada de la figura 1, entonces el procedimiento proveer un valor pasable (con un 95%
de probabilidad) cuando el valor verdadero pase. Debido a que esto es una evaluacin
estadstica y no una determinacin qumica, el resultado es conclusivo.
Aunque el criterio de aceptacin del ensayo es de 985 102% es que ms prevalece en la
USP-NF, hay muchos otros criterios en uso. Para el enfoque CVP para determinar la
aceptabilidad de la exactitud y precisin de un procedimiento a ser aplicados a otros casos
diferentes al de default, es necesario calcular un nuevo lmite para cada caso. El desarrollo
de un nuevo lmite no es difcil, pero consume tiempo. Sin embargo, hay otro enfoque.
Debido a que el lmite se basa en la evaluacin estadstica de una distribucin normal, es
posible resolver para la probabilidad del valor de precisin y exactitud proporcionado la
respuesta correcta. Cuando la probabilidad calculada es menor que 0.95, entonces la
precisin y exactitud son aceptables. Una manera rpida de calcular es usar un programa
como Microsoft Excel. Al utilizar Excel, la probabilidad se calcula usando las siguientes
ecuaciones:
1. Donde el criterio de aceptacin est simtricamente alrededor de 100%, entonces
calcule:

Result = NORMDIST(Upper Cert, Mean, SD, TRUE) NORMDIST(Lower + Cert, Mean,

SD, TRUE)
Upper = upper limit of the Acceptance Range
Cert
= measurement uncertainty of the Standard used (= 0 for Standards with
unknown measurement uncertainty)
Mean = accuracy value (e.g., 100% in the default case)
SD
= standard deviation
TRUE = logical operator
Lower
= lower limit of the Acceptance Range

Figure 2. Guard Band for a CRM Labeled as 100% 0.06% Applied to Figure 1.

2. Donde los criterios de aceptacin son asimtricas alrededor de 100%, pero la totalidad
del rango es de entre 97% y 103% (incluye aproximadamente el 85%* de las monografas
de USP-NF) entonces:
Se utiliza la misma ecuacin, pero el valor inferior y / o superior sera cambiado para
describir el rango simtrica ms pequeo que tiene una media de 100%.
3. Si los criterios de aceptacin son asimtricos otra media que 100%, y el valor del 100%
no est incluido en el rango, entonces calcule:
Result = NORMDIST(Upper - Cert, Mean, SD, TRUE) - NORMDIST(Lower + Cert, Mean,
SD, TRUE)

Upper = upper limit of the Acceptance Range

Cert
= measurement uncertainty of the Standard used (= 0 for Standards with
unknown measurement uncertainty)
Mean = target content = (Upper + Lower)/2
SD
= standard deviation
TRUE = logical operator
Lower
= lower limit of the Acceptance Range
4. Donde el rango es ms grande que 97% - 103% y no est centrado en 100%, la
determinacin se necesita considerar la determinacin de la media y el rango previsto
antes de calcular el valor aceptable. Todava se estn estudiando los detalles de estos
casos muy raros. El problema de la intencin se puede ilustrar usando un ejemplo los
criterios de aceptacin de 85% - 103%. Este criterio puede ser considerado de dos
maneras diferentes:
Un rango simtrico alrededor de 94% o un rango asimtrico alrededor de 100%.
Asumiendo una SD de 4, el caso 1 podra dar una probabilidad de 0.97 y podra
considerarse aceptable, mientras que el caso 2 podra dar una probabilidad de 0.54 el
cual no sera aceptable. Se est considerando ms discusin para este tpico.
GUARDA BANDAS
Cuando se utiliza un estndar de referencia que incluye un valor de medida de
incertidumbre, tal como los encontrados en CRMs o SRMs, los resultados de la
determinacin de Exactitud y Precisin necesitarn ajustarse. Estos ajustes toman la
forma de una guarda banda en la distribucin.
La guarda banda
tensa de manera efectiva los criterios de aceptacin por la
incertidumbre declarada del estndar. Un ejemplo de una guarda banda para un material
de referencia certificado etiquetado como 100% + 0.06% se ilustra en la figura 2. Este
desplazamiento se realiza mediante un pequeo cambio en la ecuacin utilizada para
calcular la probabilidad de aceptacin. Este cambio se realiza mediante el ajuste de las
condiciones del lmite del criterio de aceptacin usando la medida de incertidumbre (Cert)
en los casos 1 3 de la seccin previa.
ESPECIFICIDAD
La habilidad para describir una separacin adecuada de un analito crtico de las
interferencias es actualmente medido usando varios enfoques incluyendo: resolucin,
factores de separacin, factores de capacidad, forma del pico (coleo y fronteo), altura y
nmero de platos tericos, tiempos de retencin y varios otros. Todas estas medidas de
separacin asumen que el sistema de deteccin que est siendo empleado es capaz de
medir el analito y otros materiales comnmente presentes. La resolucin es la medida ms
efectiva de una separacin. Generalmente hablando, una resolucin de 2 podra describirse

como siendo separada en la lnea base y una resolucin de 0 indicara que no hay
separacin. Se prefiere la separacin completa (lnea base) pero puede representar corridas
cromatogrficas mucho ms largas condiciones cromatogrficas difciles, o no se puede
obtener. Por lo tanto, es necesario determinar qu resolucin es necesaria para proveer una
separacin adecuada de dos picos eluyendo muy cerca. Una forma de cuantificar el efecto
de resolucin sobre un procedimiento cromatogrfico es mediante la evaluacin del error
causado por un pico coeluyendo o traslapado.
ERROR DE ESPECIFICIDAD
La seal (altura o rea del pico) usada para medir la respuesta cromatogrfica es
susceptible de error debido a los cambios de rea o altura causada por coelucin de
analitos. Muchos detectores no permiten la diferenciacin de entidades qumicas
presentes en un pico medido. Las excepciones son los detectores multidimensionales con
algoritmos de deconvolucin. Donde los picos se traslapan, hay muchas maneras de
estimar la concentracin aproximada del componente individual y cada uno tiene un error
relacionado.

Figure 3. Relationship Between Error and Resolution.

Desde una perspectiva puramente terica, es posible calcular el error de porcentaje causado
por el traslape de picos mediante la evaluacin del efecto del pico secundario Gaussiano con
diferentes tamaos sobre un pico primario. El error es directamente relacionado al tamao
del pico secundario, el ancho de los picos, y la distancia entre sus valores de picos (tiempo
de retencin). Debido a que el ancho de pico y tiempo de retencin son las variables crticas
en el clculo de la resolucin, entonces la resolucin el error tambin est directamente
ligadas. La relacin se describe en la Figura 3. Los valores en la Figura 3 son el conteo de
reas obtenidas por el tradicional enfoque de extendiendo los lados del pico a la lnea base
descrito en el captulo general de Cromatografa <621> con y sin picos traslapados. El
tamao de los picos traslapados van desde 0.1% hasta 5% del pico principal.
La regla de oro generalmente aceptada para cromatgrafos es que una resolucin de 1.25
es suficiente para cuantificar adecuadamente los picos traslapados, pero se prefiere 1.5.
Basado en la figura 3, la regla de oro parece ser correcta. Una resolucin de 1.25 contribuye
significativamente ms error para una determinacin que una resolucin de 1.5, pero con
anlisis ms sofisticados (es decir, mejores aproximaciones de rea de los picos) es posible
reducir an ms el error. Tambin es claro que debajo de cierto nivel la presencia de una
impureza insignificante contribuir con un error insignificante en la cuantificacin del
componente primario. El tamao de una impureza insignificante est ligada directamente a la
evaluacin de la Precisin y Exactitud discutida en la seccin anterior. Por favor observe que
la presencia de impurezas en un frmaco no es deseable, pero para los propsitos de
ensayo del contenido del ingrediente activo, las pequeas impurezas o impurezas no
detectables pueden no ser consideradas. La determinacin de estas impurezas se considera
aparte.

SESGO ASIGNABLE
1. Si una impureza que coeluye con el pico principal se considera un componente del sesgo
(sesgo asignable) en el anlisis, entonces la probabilidad de que la presencia de esta
impureza impida la cuantificacin del componente principal puede calcularse. El sesgo
asignable es la concentracin conocida de la impureza presentada como un porcentaje de la
concentracin total del componente principal. El clculo es el mismo que se dio
anteriormente, pero con el sesgo asignable adicionado al valor de exactitud.
Result = NORMDIST(Upper - Cert, Mean, SD, TRUE) NORMDIST(Lower + Cert, Mean,
SD, TRUE)
Upper = upper limit of the Acceptance Range
Cert
= measurement uncertainty of the Standard used (= 0 for Standards with
unknown measurement uncertainty)
Mean = accuracy value + assignable bias (%)
SD
= standard deviation
TRUE = logical operator
Lower = lower limit of the Acceptance Range
2. Si el resultado es menor que 0.95, entonces la impureza es intrascendente para el
anlisis. Donde el resultado es menor que 0.95, entonces es necesaria una separacin
adicional para asegurar la habilidad del procedimiento para ensayo del componente

principal.
La Figura 3 tambin proporciona la percepcin en la fuente de variabilidad en el anlisis y el
nivel de separacin necesaria para lograr un procedimiento aceptable. Si un analista conoce
el nivel de error (valor de precisin + sesgo asignable), sera posible aproximar la resolucin
necesaria usando la Figura 2. Sin embargo, debido a la convergencia significativa de las
curvas, es seguro decir que una resolucin de 1,5 se proporcionar una separacin
suficiente para todas las impurezas muy grandes.

Figure 4. Effect of Random Error on CVP Linearity.

LINEALIDAD Y RANGO
La linealidad y rango de un procedimiento de cromatografa de lquidos es controlada
grandemente por la sensibilidad del detector y por la capacidad de la columna y el tiempo de
retencin. La linealidad y el rango pueden determinarse empricamente mediante la
evaluacin de soluciones estndar entre el rango de concentracin de 80% a 120% de la
concentracin indicada del analito. Debe haber cinco concentraciones por separado con
cada una de las soluciones preparadas por triplicado. Los resultados son evaluados para
precisin y exactitud adecuadas as como la funcin de una regresin lineal de la
concentracin calculada contra concentracin conocida
La medicin de la linealidad y rango estn acoplados para esta discusin porque, al igual
que precisin y exactitud, los experimentos y resultados estn directamente relacionados.
Hasta este punto todos los CVPs han sido enfocados en la habilidad del procedimiento para
determinar el valor verdadero de la muestra cuando est presente a una concentracin
determinada. Sin embargo, no todas las muestras estarn presentes en un 100.0%. Por lo
tanto, es necesario garantizar que un procedimiento dado producir resultados aceptables
en un intervalo de concentraciones posibles. Este rango se describe como 80% - 120% de
la concentracin objetivo en la seccin previa de CVP.
Rango: La aceptabilidad de un rango se evala calculando los valores de precisin y

exactitud para cada una de las concentraciones preparadas descritas anteriormente.

Aunque esas soluciones son preparadas por triplicada y los valores de aceptacin
calculados en la seccin de Precisin y exactitud se basan en las seis mediciones, los
clculos proveen un adecuado nivel de confianza en la aceptabilidad de las mediciones. Si
las cinco mediciones por triplicado dan un valor de 0.95 o ms grande, entonces el rango de
los instrumentos es adecuado para la medicin.
Linealidad: Tpicamente la linealidad se evala comparando la seal contra la
concentracin. Sin embargo, la pendiente y el intercepto de la regresin lineal de esta lnea
es de poca importancia, siempre y cuando no sea demasiada vertical ni demasiada
horizontal. Adems, hay un nmero de sistemas de deteccin en desarrollo y uso que
proveen capacidades nicas que requieren relaciones no lineales entre la seal y la
concentracin que puedan ser modelados. Por lo tanto, la mejor manera de evaluar la
linealidad de un sistema no es evaluar la curva de seal respuesta, sino evaluar la curva
de concentracin calculada contra la concentracin conocida. Este enfoque provee un medio
para evaluar el sistema entero, incluyendo la preparacin de la muestra, inyeccin,
separacin, deteccin, y post procesamiento. La curva de la concentracin calculada contra
la concentracin conocida debe ser lineal, y pasar a travs del origen. Sin embargo, como se
introduce error aleatorio dentro del sistema, hay un efecto directo sobre el valor de la R de
la regresin lineal. Este efecto se ilustra en la figura 4. Esta grfica representa los resultados
de una regresin lineal sobre los datos que van desde 80% a 120% en los valores conocidos
con un ruido aleatorio de un porcentaje conocido adicionado. A medida que aumenta la
cantidad de ruido, la variabilidad de los valores de R aumenta y los centros de los rangos
disminuyen.
Visto de otra manera, el error capturado como el RSD% de los datos en comparacin con el
cuadrado de los residuos indica una relacin fuerte (vase la figura 5). Este grfico sugiere
que un valor R2 mayor que 0.994 y 0.990 describiran un procedimiento aceptable para
rangos de aceptacin de 98% -102% y 97% -103%, respectivamente.
En resumen, est claro que la precisin y exactitud de un procedimiento analtico son
fundamentales para definir la aceptabilidad de un procedimiento. La especificidad, linealidad,
y rango tambin son necesarios para asegurar los resultados de un procedimiento teniendo
una precisin y exactitud aceptables proporcionar una aproximacin significativa del valor
verdadero de una muestra desconocida. Cuando se toman juntos, es posible describir un
procedimiento aceptable usando mediciones que son independientes de figuras
cromatogrficas de mrito usadas tpicamente para describir un procedimiento.
Anlisis cromatogrfico de impurezas
Las impurezas orgnicas en frmacos son especies qumicas que no deberan estar
presentes. Su presencia puede suponer un riesgo para la salud o puede simplemente indicar
una falta de calidad. Los criterios de aceptacin para las impurezas individuales son
evaluados por las agencias regulatorias antes de aceptar un producto farmacutico para su
uso en seres humanos. Las impurezas son evaluadas por seguridad y las que presenten
toxicidad o tienen el potencial de ser un riesgo para la salud se denominan impurezas
txicas y son especficamente limitadas a niveles bajos por las agencias regulatorias. Las
impurezas que no son txicas en los niveles esperados solo representan problemas de

calidad. Estndares internacionales establecidos por grupos han determinado que las
impurezas no txicas presentes a menos de 0.10% necesitan ser cuantificadas y las de
menos de 0.05% pueden ignorarse. Las agencias regulatorias individuales pueden reducir
estos lmites para representar mejor el frmaco que est siendo aprobada, pero para un
pblico estndar, los niveles seleccionados por el cuerpo internacional forman un nivel de
impureza aceptable. La aceptabilidad de un procedimiento para evaluar las impurezas no
txicas en un frmaco est directamente relacionado a las CVPs definidas por el captulo
general de Validacin de mtodos compendiales <1225>. El captulo de validacin se
subdivide en procedimientos para impureza en las que se utilizan pruebas lmite semicuantitativas y los destinados a ser cuantitativos. Los requerimientos para cada uno son
significativamente diferentes; sin embargo, los requerimientos descritos para una prueba
lmite son insuficientes para la determinacin de pruebas lmites aceptables. Los medios
para demostrar la prueba lmite aceptable estn incluidos en la siguiente subseccin de
Pruebas Lmites Cromatogrficas. Afortunadamente, la cromatografa se utiliza tpicamente
en un modo cuantitativo y los parmetros de validacin descritos en el captulo de validacin
son un buen indicador de lo necesario para determinar un procedimiento cuantitativo de
impureza aceptable. Los parmetros y las caractersticas de desempeo necesarias para
demostrar la aceptabilidad tambin estn incluidas en la siguiente subseccin.

Figure 5. Relationship Between % RSD and R2.

PRUEBAS LMITES CROMATOGRFICAS

El CVP necesario para validar un procedimiento de prueba lmite incluye precisin,
especificidad, y lmite de deteccin (LOD). El PPM para LOD tambin provee informacin
acerca de la aceptabilidad de la exactitud del procedimiento para una prueba lmite. El CVP

para una prueba lmite debe contestar las siguientes preguntas: (1) Este procedimiento
proveer consistentemente la decisin correcta de pasa/falla para la impureza que est
siendo evaluada? Y (2) Cul es el cambio ms pequeo en la concentracin entre un
resultado que pasa y uno que falla? La respuesta a la primera pregunta requiere
conocimiento la precisin y especificidad. La respuesta a la segunda pregunta requiere
conocimiento del LOD y exactitud de la medida. Sin embargo, la exactitud de una prueba
lmite y el LOD pueden determinarse usando el mismo PPM y por lo tanto slo se describe
como el LOD para los propsitos de esta discusin.
Precisin: A diferencia del anlisis de un analito que es un constituyente principal en un
frmaco, la evaluacin de los componentes menores de concentracin indeterminada crea
complicaciones para determinar la aceptabilidad de un procedimiento. La principal
complicacin se refiere a la capacidad de los sistemas de deteccin para diferenciar un
mesurando del ruido de fondo. La capacidad de diferenciarse se determina mediante la
medicin de la LOD, pero la conclusin de que un procedimiento con suficiente LOD tiene el
poder diferenciador capaz de presentar un resultado verdadero es infundada. En cambio, es
importante examinar la precisin de la medicin. La relacin entre la concentracin analtica
y el nivel aceptable de variabilidad fue ampliamente explorada por William Horwitz en la
dcada de 1980. Se encontr que a medida que el contenido de la magnitud a medir
disminuye, la cantidad de variabilidad de medicin a medicin aumenta, independientemente
del procedimiento utilizado. A travs del examen de una gran cantidad de datos, desarroll
una relacin emprica para la reproducibilidad entre laboratorios. La forma ms comn de
esa relacin es:
Predicted % RSD = 2 (1 0.5 log C)
Donde C es la concentracin como una fraccin adimensional (ver Tabla 1).
Cuando la ecuacin se extiende a concentraciones de 100 ppb (100 ng/g) o ms bajas, la
relacin llega a ser constante. Esta observacin fue publicada por Thompson, et al. dejando
la ecuacin Horwitz-Thompson usada por la Asociacin de Qumicos Analticos Oficiales
(AOAC, por Association of Official Analytical Chemists) y por el Codex Alimentarius para
describir procedimientos aceptables. Esta relacin es llamada tpicamente la relacin Horwitz
o HORRAT, en estas publicaciones. Subsecuentemente, Massart mostr que la relacin
Horwitz parece ser aproximadamente dos veces que la encontrada en la evaluacin de
Repetibilidad. La relacin Horwitz est graficada en la figura 6 para reproducibilidad y
Repetibilidad.
El procedimiento recomendado para la especificidad es la evaluacin de rplicas de
estndares adicionados. Este se considera un estudio de Repetibilidad, pero para el
propsito de definicin de PPAC para una prueba lmite, el uso del factor de reproducibilidad
Horwitz-Thompson es ms apropiado ya que permite un mayor grado de variabilidad. Para
facilitar su uso, la tabla incluye las concentraciones ms comunes, fracciones asociadas, el
valor de Repetibilidad de Horwitz-Massart, y el valor de reproducibilidad de HorwitzThompson.
Especificidad: La especificidad de un procedimiento lmite est bien declarado en el
captulo general de Validacin de Mtodos Compendiales <1225> como la habilidad de
evaluar inequvocamente el analito en presencia de componentes que se espera puedan
estar presentes, incluyendo otras impurezas especificadas, el compuesto principal,

contraiones, frentes de solventes, y componentes de la matriz. Para procedimientos

cromatogrficos, tal como para ensayos, la resolucin provee el mejor enfoque para
especificidad PPM. La razn de la especificidad PPAC se describe en la seccin de Ensayo.
Sin embargo, las bases para el PPAC se ilustran en la figura 3, pero la figura presenta el
error en el clculo del componente principal causado por la coelucin de un componente
menor. En el caso de pruebas de impurezas, las especies coeluyentes frecuentemente sern
de concentraciones iguales o ms grandes que la impureza de inters (mesurando), por lo
tanto, causando un pico sin resolver a estar sobre estimado. Sin embargo, desde una
perspectiva de aceptabilidad, un resultado falso-positivo es preferible a un falso negativo.
Por lo tanto, la PPAC de una resolucin de 1.5 es aceptable. Sin embargo, algunas veces no
se pude conseguir una resolucin de 1.5. En estos casos, un estudio completo de adicin y
recobro o un procedimiento ortogonal tendrn que ser completados o usados,
respectivamente. El PPAC para estos estudios es el requisito de cumplir los requerimientos
previamente descritos de precisin de cada una de las impurezas especificadas.

Figure 6.

Table 1. Horowitz-Thompson Values

Concentration of Concentration of
Analyte
Analyte
(%)
(ppm)
100%

1%
10,000 ppm
0.1%
1000 ppm
0.05%
500 ppm
0.01%
100 ppm

Concentration
with w/w Units
1000 g/g
10 mg/g
1 mg/g
500 g/g
100 g/g

HorowitzHorowitz-Massart
Thompson
Repeatability
Reproducibility
Concentration
Value
Value
Fraction
(RSD)
(RSD)
1.0
1%
2%
0.01
2%
4%
0.001
2.8%
5.7%
0.0005
3%
6%
0.0001
4%
8%

0.001%
0.0001%
0.00001%
<0.00001%

10 ppm
1 ppm
100 ppb
<100 ppb

10 g/g
1 g/g
0.1 g/g
<0.1 g/g

0.00001
0.000001
0.0000001
<0.0000001

5.7%
8%
11%
11%

11%
16%
22%
22%

Lmite de deteccin: El LOD es un PPM que est destinado a asegurar que un

procedimiento es capaz de detectar si una impureza est presente. Hay un acuerdo en la
literatura que el mejor camino para determinar el LOD es a travs de la evaluacin de una
serie de diluciones hasta que el pico ya no sea detectado. Este frecuentemente es un
proceso largo y tedioso que dar una respuesta definitiva.
Sin embargo, frecuentemente los analistas recurren a la regla de tres veces el ruido que a
menudo obtiene resultados similares al enfoque de dilucin en serie. En cambio, es
importante saber que un procedimiento puede diferenciar entre un resultado que pasa y uno
que falla. El intervalo entre pasa y falla debe estar vinculada a la capacidad del
procedimiento. La mejor medida de la capacidades la precisin de la medida. El PPAC para
la precisin ha sido definido por la ecuacin Horwitz. Para determinar si el procedimiento
tiene suficiente poder de resolver para determinar si un procedimiento pasa o falla, es
necesario primero demostrar que el pico obtenido de una serie de mesurandos adicionados
produce un rea de pico igual o ms grande que la solucin estndar en el lmite. Entonces
se mide una solucin que tiene una x% ms baja que el lmite. La x% se define por la
ecuacin de Horwitz. Esta solucin debe dar un resultado de pasa demostrando un nivel
aceptable de deteccin y exactitud de esta determinacin.
PRUEBAS CROMATOGRFICAS CUANTITATIVAS
Muchas de las consideraciones para el CVP descritas en la seccin de Pruebas Lmites
Cromatogrficas tambin aplican para las pruebas cuantitativas. Sin embargo, debido a la
necesidad de proveer un contenido especfico numrico de la impureza (mesurando) e un
artculo (frmaco o medicamento), es necesaria una evaluacin ms exhaustiva de
exactitud, precisin y linealidad.
Exactitud: La Exactitud de un procedimiento se define por la habilididad de obtener el valor
verdadero para una medida conocida. En el caso de una impureza medida, como la de un
ensayo de contenido, la precisin y exactitud estn cercanamente relacionadas. Como la
concentracin del mesurando decrece en relacin a la concentracin del componente
principal, la habilidad de medir exacta y precisamente la impureza tambin decrece como se
describe en la ecuacin de Horwitz. Generalmente hablando, la exactitud de un
procedimiento est ligado a errores sistemticos de una medicin. El error sistemtico es
independiente del nmero de anlisis y est generalmente establecido o vara de una
manera predecible. El error sistemtico as descrito es tambin llamado sesgo sistemtico.
La evaluacin del sesgo es mejor completado usando estudios de recobro adicionado sobre
el rango de valores que se espera est presente el mesurando. La exactitud o sesgo de
una medida no debe ser descrita por la precisin de esta medida, pero debe ser

insignificante. Sin embargo, el trmino insignificante tiene poco sentido sin un marco de
referencia. Para la determinacin de un procedimiento aceptable, insignificante puede
definirse como que tiene un sesgo que es ms pequeo que la precisin aceptable de una
medida. Una vez ms, el valor de Repetibilidad Horwitz/Massart describe la precisin
aceptable relativa a la concentracin relativa del mesurando.
Precisin: La precisin de la medicin se puede dividir en tres tipos diferentes: repetibilidad,
precisin intermedia y reproducibilidad. La primera evala fuentes de variabilidad de
preparacin de la muestra e instrumentales, el segundo examina la variabilidad causada por
cambios deliberados en el entorno de medicin, y de la tercera examina la variabilidad
normalmente encontrado a travs de estudios entre laboratorios. En la determinacin de un
procedimiento aceptable no necesita determinarse individualmente la comprensin de todas
las fuentes de variabilidad. En cambio, es posible modelar los tipos de variabilidad que es
probable encontrar en la reproducibilidad a travs de los cambios deliberados de los
estudios de precisin intermedia.
Repetibilidad- La parte de repeticin de un procedimiento de validacin
cuantitativa se lleva a cabo mediante la preparacin de seis soluciones de
muestra adicionadas, cada uno con una o ms de las impurezas de inters en la
concentracin significativa analtica. La desviacin estndar relativa de estas
mediciones se compara entonces con el valor apropiado Horowitz-Massart para la
concentracin del mesurando.
Donde no sea posible adicionar el analito con un estndar para el mesurando,
entonces se puede usar el tiempo de retencin y el factor de respuesta relativa.
Aunque este enfoque no es el ptimo, puede ser la nica manera de evaluar
productos de degradacin inestables o transitorios. Alternativamente, se puede
usar un estndar de referencia con las impurezas crticas presentes o
desarrolladas in situ.
El conocimiento de la concentracin actual de estas impurezas se ve afectada,
pero los materiales se podran utilizar para completar la validacin del
procedimiento. Siempre que sea posible, se prefiere un estndar puro del
producto de degradacin o impureza del proceso.
Precisin Intermedia La evaluacin de la precisin intermedia se puede
determinar mediante la repeticin de las mediciones de Repetibilidad descritas
anteriormente despus de un cambio deliberado controlado en el entorno de
pruebas. Los tipos de cambio que son ms tiles para la determinacin de un
procedimiento aceptable incluye diferentes das, diferentes instrumentos,
diferentes analistas y usando diferentes condiciones del instrumento. Las
primeras tres son particularmente tiles debido a que estn vinculadas a la
ecuacin de variabilidad Horwitz-Thompson. La evaluacin de la variabilidad
causada por las cuatro condiciones especificadas no es necesario debido a que la
informacin proporcionada por ms de una condicin generalmente no
proporciona ninguna informacin adicional. Por lo tanto, el analista debe
determinara cuales condiciones debe de perseguir. El resultado de las dos series
de datos (estas deben ser 12 mediciones individuales) se deben de comparar con
la relacin Horwitz apropiada para la concentracin de la(s) medida(s)

Especificidad: Los requerimientos de la especificidad en un procedimiento cuantitativo son

las mismas descritas para una prueba lmite.

Linealidad: La linealidad de un procedimiento est destinado para asegurar al analista que

el procedimiento que est siendo validado es capaz de determinar una cantidad exacta y
precisa para el mesurando sobre el rango que se realizar en una medicin desconocida
tpica. Los requerimientos de exactitud y precisin descritos para una prueba de impureza
cuantitativa tambin provee esta seguridad. Mediante la determinacin de la precisin en
varios puntos a travs del rango de la concentracin analtica apropiada para el mesurando,
se elimina la necesidad de un requerimiento separado de linealidad.
Lmite de cuantificacin y rango: El lmite de cuantificacin y el rango son los valores que
se evalan para asegurar que el procedimiento de anlisis es adecuado para la evaluacin
de una magnitud a medir en un valor desconocido. En el caso de un procedimiento
compendial, el valor de la magnitud a medir se conoce antes de validar un procedimiento.
Tpicamente, un procedimiento de impureza definir la concentracin mxima que una
impureza puede estar presente en una muestra. Al completar el requisito de precisin, el
analista sabe que el procedimiento es capaz de cuantificar la magnitud a medir a la mitad del
valor mximo aceptable para la impureza. El requisito de exactitud tambin se asegurar de
que un procedimiento proveer resultados aceptables al doble de la concentracin mxima
aceptable de la impureza. Completar con xito los requisitos de precisin proporcionar
suficiente confianza en la adecuacin del procedimiento, y por lo tanto no se requiere una
evaluacin adicional de estas caractersticas para definir un procedimiento aceptable

El significado de la aceptabilidad
Hasta este punto, este documento se ha centrado en la descripcin de un procedimiento
aceptable de una manera puramente emprica y accesible. A tal fin, los CVP han sido
definidos y han sido descritos los criterios de desempeo para cada uno de estos CVP. Sin
embargo, la cuestin fundamental de la adecuacin del CDP an no se ha discutido.
Descripciones completas de los tipos de equivalencia deben ser consideradas cuando se
compara un procedimiento analtico con un procedimiento compendial. El primer enfoque, y
en muchos aspectos el ms apropiado, es el de un "procedimiento aceptable". Este es un
procedimiento que con criterios de desempeo pre-definidos que describen un
procedimiento adecuado para lograr una aproximacin del valor real de un desconocido sin
definir previamente el procedimiento en s.
En cuanto a los criterios descritos anteriormente, debe quedar claro a un cromatografista
de que cualquier procedimiento que cumpla el PC descrito en este documento permite
garantizar que el procedimiento previsto en cuestin es apropiado. Por lo tanto, cualquier
procedimiento que cumpla con estos criterios debe ser considerado para ser equivalente o
mejor que el procedimiento estndar. Cuando un procedimiento es equivalente al
procedimiento estndar (o aceptable), entonces, de acuerdo con los avisos generales de
USP-NF, este procedimiento se puede usar como un procedimiento alternativo sin la
necesidad de comparar activamente estos procedimientos.