DETERMINACIN DE NITRGENO

MTODO DE KJELDAHL (PRONUNCIAR KIELDAL)

Muchas muestras de importancia contienen nitrgeno en distintas formas. Interviene en la
constitucin de las protenas, por lo cual su determinacin es importante en el anlisis de muestras de
origen biolgico, como son los alimentos de diversos tipos.
Tambin existen compuestos de nitrgeno en suelos, fertilizantes y una gama muy variada de
productos de la industria.
El mtodo ms comn para determinar nitrgeno es el mtodo de Kjeldahl. Es el mtodo estndar
para determinar el contenido de protenas en granos, carnes, cereales y otros materiales biolgicos;
como la mayora de las protenas de un origen dado tienen aproximadamente el mismo porcentaje de
nitrgeno (6.25% para carnes, 6.38% para leche y derivados, 5.7% para cereales), conociendo el
% de nitrgeno es sencillo calcular el % de protena en la muestra.
En el mtodo de Kjeldahl la muestra se descompone por calentamiento en cido sulfrico
concentrado para convertir el nitrgeno orgnico en amonio; luego la solucin resultante se enfra, se
diluye y se alcaliniza por adicin de solucin de NaOH.
El amonaco liberado se destila, recogiendo los vapores en un exceso de una solucin estandarizada
de HCl.
Finalmente se titula el exceso de HCl con una solucin estandarizada de NaOH, y por diferencia se
calcula cuanto amonaco destil.
En otra variante se recoge el destilado en un exceso desconocido de cido brico y luego se titula
con HCl.
El paso crtico en el mtodo es la mineralizacin con cido sulfrico concentrado. Suele adicionarse
sulfato de potasio para elevar la temperatura de ebullicin del sulfrico acelerando la descomposicin,
y a veces se adiciona un catalizador, por ejemplo un compuesto de Hg(II) como HgO; en este ltimo
caso el Hg(II) debe precipitarse como HgS antes de la destilacin para evitar la retencin de
amonaco como complejos aminados del Hg, muy estables.
Al calentar suelen formarse masas coloreadas que acaban transformndose en productos oscuros;
antes de alcalinizar la solucin debe ser lmpida, coloreada o no dependiendo de la muestra; el
proceso puede demorar horas, y por eso se emplean aparatos que permiten el anlisis simultneo de
varias muestras.
Durante la digestin cida el C e H de la muestra se desprenden como CO2 y H2O y el N de
+
funciones amina y amida (protenas) se transforma en NH4 .
En cambio no se transforma en amonio el N de nitratos y nitritos (ver punto siguiente) ni el de las
funciones orgnicas nitro ( - NO2) y azo ( -N=N- ). Algunos compuestos heterocclicos aromticos del
N (como piridina y derivados) son muy resistentes.

La mineralizacin y destilacin se llevan a cabo en un matraz de cuello largo (para evitar

proyecciones) llamado matraz Kjeldahl.

En la figura se muestran dos aparatos de los tantos que han sido propuestos para este anlisis.

EN EL APARATO (A) la solucin se adiciona en un sistema cerrado para minimizar la prdidas de

NH3, y ste es arrastrado por una corriente de vapor de agua desde el matraz a la izquierda.
EN EL APARATO (B) la solucin de NaOH se adiciona con cuidado por las paredes del matraz, sin
mezclar, de modo de formar una capa por encima de la solucin que se origin en la mineralizacin;
slo se agita luego de haber conectado el matraz al condensador; la trampa tiene por objetivo evitar
que gotitas de solucin alcalina, que pueden ser proyectadas durante la destilacin, lleguen al frasco
colector.
En cualquier caso para evitar prdidas de amonaco el extremo del refrigerante debe estar sumergido
en la solucin cida.
Antes de titular el extremo del condensador debe enjuagarse con chorro de pipeta arrastrando los
lquidos acuosos al frasco colector.
La reaccin que ocurre al alcalinizar y calentar la solucin obtenida en la mineralizacin es:
+

NH4

OH

NH3 + H2O

el NH3 es recogido en la solucin cida.

Si en el frasco colector se ha colocado Va mL de HCl de molaridad Ma, luego de la destilacin

tendremos una mezcla de HCl (exceso) y NH4Cl, con pH de cido fuerte. Titulamos el exceso de HCl
con NaOH de molaridad Mb, gastando Vb mL.
En el pe tendremos una mezcla de NH4Cl y NaCl, cuyo pH ser alrededor de 5.3; podemos usar Rojo
de Metilo (rojo 4.2 - 6.2 amarillo) como indicador. Se ha destilado (VaMa - Vb Mb) mmoles de NH3.

Si en el frasco colector se ha colocado un volumen cualquiera de H3BO3 de concentracin

desconocida la reaccin al recibir los vapores de NH3 ser
H3BO3 + NH3

NH4

y al titular con HCl de molaridad Ma

+ H2BO3
H2BO3

H3BO3

En el Erlenmeyer tendremos una solucin de cido brico e iones amonio, de pH cercano a 5: usar
Rojo de metilo. Se ha destilado VaMa mmoles de NH3.
Ejemplo: se mineralizan 4.1053 g de un producto fabricado a partir de harina de trigo.
Se mide con pipeta de doble aforo 25.00 mL de HCl 0.1987 M. Se destila y al titular con NaOH
0.1034 M se gastan 15.36 mL para producir el viraje del Rojo de Metilo. Calcular el % p/p de protena
en la muestra.
(25.00 x 0.1987) - (15.36 x 0.1034) = 3.3793 mmol de NH3
1 mmol de NH3 ------------------ 0.01401 g de N
3.3793 mmol de NH3------------x = 0.0473 g de N
5.7 g de N ---------------100 g de protena de cereal
0.0473 g de N ----------x = 0.8306 g de protena
(0.8306 g protena / 4.1053 g muestra)100 = 20.23% p/p de protena en la muestra.

Si el NH3 hubiera sido recogido en una solucin de cido brico, al titular con HCl 0.1987 M
hubiramos gastado:
--

3.3793 mmol NH3 = 3.3793 mmol de H2BO3 = Va (0.1987)

Va = 17.01 mL de HCl.
La ventaja de usar cido brico reside en que se necesita slo una solucin estandarizada; a la vez
que demanda menos trabajo de titulacin, se disminuyen los errores de titulacin y en la medicin del
cido que se coloca en el colector.

DETERMINACIN DE PROTENAS
El contenido promedio de protenas totales en la leche es de 3,4%. En esta fraccin se incluyen las
casenas, las cuales por si solas representan un 80% del contenido proteico total (2,7 %), el resto
est integrado por las protenas sricas, que incluyen la b-lactoglobulina (0,3%), la a-lactoalbmina
(0,15%), una albmina similar a la seralbmina de la sangre, inmunoglobulinas y una fraccin de
protenas menores, entre las cuales se incluyen la lactotransferrina, la lactolina y la protena de la
membrana del glbulo graso.
Algunas de estas fracciones proteicas son heterogneas, estando constituidas por varias protenas
muy relacionadas entre s, pero que son separables mediante el uso de tcnicas fsicas como la
ultracentrifugacin qumicas como el fraccionamiento con solventes y mas recientemente con
tcnicas mas especficas como la electroforesis, mediante la cual ha sido posible identificar muchas
fracciones dentro del grupo de las casenas, como lo son la as1 casena, la b-casena y la k-casena
(Alas, 1984).
Para la determinacin cuantitativa de protenas pueden emplearse diversos mtodos, los mismos
pueden clasificarse en los siguientes grupos;
Mtodos Qumicos: fundamentados en las tcnicas qumicas convencionales, entre las cuales se
incluyen la determinacin del nitrgeno total y los mtodos gravimtricos y volumtricos tradicionales.
Mtodos Fotomtricos: estn fundamentados en la medicin del color de soluciones, o de la
absorbancia en determinadas regiones del espectro de absorcin, aqu se incluyen las tcnicas
colorimtricas, las de medicin en el ultravioleta o en el infrarrojo, las de fijacin de colorantes y
algunas tcnicas turbidimtricas.
Mtodos Refractomtricos: estn basadas en el incremento en el ndice de refraccin de
aproximadamente 0,001 por cada gramo de protena en 100 mL de leche, de este modo utilizando un
refractmetro de inmersin o uno tipo Abbe, es posible determinar la concentracin proteica.
Electroforesis: las protenas pueden separarse por sus diferentes velocidades de migracin bajo la
influencia de un campo elctrico, esto se debe al hecho de que las protenas presentan cargas
elctricas diferentes dependiendo de la composicin aminoacdica de las mismas.
A nivel de plantas receptoras de leche se utilizan comnmente las tcnicas para determinacin de
protenas basados en los mtodos de fijacin de colorantes, como lo es el equipo Pro-Milk MK II,
(Foss Electric), e incluso en laboratorios grandes puede encontrarse equipos como el Milko Scan, el
cual est basado en la espectrofotometra con rayos infrarrojos, el cual es capaz de captar la
absorbancia del enlace peptdico de las protenas, sin embargo, estos mtodos rpidos, requieren de
una cuantiosa inversin inicial y adems deben ser sujetos a un proceso de calibracin que requiere
de los mtodos qumicos convencionales, por lo cual son dependientes de estos.
Tomando en cuenta que los mtodos qumicos son los mas precisos que se conocen y que los
mismos son requeridos en cualquier laboratorio lcteo, independientemente del equipamiento que
este posea, la determinacin de protenas en la leche se efectuar utilizando un mtodo qumico
basado en la medicin del nitrgeno total, en este caso se aplicara la versin micro de la prueba de
Kjeldahl, dado que la misma requiere menor cantidad de reactivos, de la misma forma se utilizar otro
mtodo qumico basado en la titulacin de Sorensen para la estimacin directa de la concentracin de
casenas en leche, la cual consigue especial utilidad para prever el rendimiento quesero a nivel de
fincas o plantas procesadoras.

DETERMINACIN DE PROTENAS EN LECHE. MTODO DE KJELDAHL.

En ambas versiones de este mtodo, la materia orgnica es digerida con cido sulfrico y el nitrgeno
obtenido en forma de una sal estable (sulfato de amonio) es valorada, previa destilacin en medio
alcalino para descomponer la sal y convertirla en amonaco, contra una solucin cida valorada (HCl).
Determinacin de nitrgeno total:
Existen varios mtodos fundamentados en el hecho de que las protenas contienen,
aproximadamente un 16% de nitrgeno, por lo tanto, si se determina el porcentaje total del mismo,
puede establecerse segn un factor de conversin apropiado (100/16 = 6,25), el porcentaje de
protenas totales presentes en la muestra, en el caso especfico de la leche, este factor de conversin
es de 6,38, debido a que las protenas de la leche presentan una menor relacin entre protenas y
nitrgeno total (100/15,65).
Es importante resaltar el hecho de que los resultados obtenidos por estos mtodos son ligeramente
elevados, ya que, no todo el nitrgeno contenido en las muestras forman parte de molculas
proteicas, existiendo entonces otras no proteicas cuyo nitrgeno afecta los resultados (rea, creatina,
creatinina, adenina, guanina, cido rico, etc.), no obstante, la determinacin qumica de nitrgeno
constituye el fundamento mas empleado, por su precisin, para la determinacin de protenas, entre
ellos encontramos los mtodos de Kjeldahl (macro y micro), Nessler y el mtodo gasomtrico de
Dumas.

MTODO KJELDAHL
La materia orgnica es digerida por la accin del H2SO4 concentrado, convirtindose en CO2 y H2O;
adems reduce el nitrgeno a amonio, el cual pasa a ser fijado por el cido como sulfato de amonio,
una sal de gran estabilidad.
La reduccin del material nitrogenado hasta amonio, se debe a que parte del H2SO4 es
simultneamente reducido a SO2, que se comporta como un fuerte reductor.
La digestin de la muestra es la parte mas difcil de la determinacin, esta se acelera mediante la
adicin de catalizadores como el mercurio metlico, el xido rojo de mercurio (HgO), el sulfato cprico
(CuSO4), el selenio, el permanganato de potasio (KMnO4) o una mezcla de estos.
El sulfato de sodio o de potasio se adicionan a la mezcla con la finalidad de aumentar el punto de
ebullicin y disminuir entonces el tiempo de digestin.
Cuando la totalidad de la materia orgnica ha sido digerida, se libera el amonaco por
descomposicin del sulfato de amonio con un lcali fuerte (NaOH) y luego se separa por destilacin y
recoleccin en un volumen de cido brico, como borato de amonio.

El amonio se determina por titulacin con solucin valorada de HCl 0,02 N en presencia de un
indicador mixto compuesto por una mezcla de rojo de metilo y azul de metileno, el cual en medio
cido se presenta de color morado y en medio alcalino de color verde.

Resumen de las reacciones qumicas en el mtodo Kjeldahl

Digestin: Materia Orgnica + H2SO4 CO2 + H2O + SO2 + (NH4)2SO4

Destilacin: (NH4) 2SO4 + NaOH Na2SO4 + 2NH3 + 2 H2O
Recoleccin : NH3 + H3BO3

NH4H2BO3

Titulacin: NH4H2BO3 + HCl

NH4Cl + H3BO3

Se acostumbra a hacer determinaciones en blanco para corregir cualquier impureza en los

reactivos. El contenido proteico de la muestra se calcula aplicando la siguiente frmula:
Luego de calculado el porcentaje de nitrgeno, es necesario calcular el porcentaje de
protenas basndose en este valor y utilizando entonces la siguiente ecuacin;
%N=

V * N * Pe
10 * A

%P = %N * 6.38

Donde: V = mL de HCl gastados en la titulacin.

N = normalidad de la solucin de HCl (0,02 N).
E = equivalente del nitrgeno (14).
a = gramos de muestra.
P = protena total.
Materiales y Aparatos
Balones Micro Kjeldahl de 30 mL; Digestor elctrico micro; Microdestilador al vapor por
calentamiento elctrico con restato; Microbureta automtica; Perlas de vidrio; Vaselina;
Balanza analtica; Equipo individual.
Reactivos
H2SO4 libre de nitrgeno
HgO libre de nitrgeno
Na2SO4 pulverizado
Solucin de NaOH-Na2S2O3 (60 g NaOH + 5 g Na2S2O3 * 5H O /100ml)
Solucin dev cido brico al 4%.
Solucin indicadora (2 partes de rojo de metilo al 0,2% + 1 parte de azul de metileno al 0,2%,
ambas en solucin alcohlica).
HCl 0,02 N.
Procedimiento
1. Medir con pipeta 0,5 mL de la muestra bien homogeneizada, Transferir a un baln de
Kjeldahl para microanlisis (30 mL). Agregar 1,9 g de K 2SO4, 40 mg de HgO y 2,5 mL
de H2SO4. La tcnica de la A.O.A.C. recomienda no pesar mas de 100 mg de materia
orgnica seca y el empleo de 2 mL de H2SO4 para 15 mg de muestra.

2. Si la misma pesa mas de 15 mg, se debe agregar 0,1 mL de H 2SO4 por cada exceso
de 10 mg de muestra. Adicionar adems, algunas perlas de vidrio.
3. Calentar la mezcla en el agitador hasta que el digerido adquiera un aspecto claro y
limpio. Enfriar a temperatura ambiente.
4. Disolver el contenido del baln en una pequea cantidad de agua destilada. Colocar
una fina pelcula de vaselina alrededor del borde del baln.
5. Para efectuar la destilacin, colocar un vaso de precipitado o erlenmeyer de 100 mL
de capacidad, conteniendo 5 mL de solucin de cido brico al 4% y 2-4 gotas del
indicador en el aparato, debajo del refrigerante de modo que la punta de este quede
sumergida en el lquido. Seguidamente, transferir el digerido, ya diluido, con agua
destilada, a la cmara interna de destilacin, haciendo 5 o 6 lavados sucesivos con
porciones de 1-2 mL de agua destilada. A continuacin adicionar 8-10 mL de la
solucin de NaOH-Na2S2O3, lavar ligeramente el embudo con agua destilada y cerrar
las llaves de vidrio del aparato. Finalmente, encender el generador de vapor y destilar
hasta recoger unos 15 mL.
6. Retirar el destilado y diluirlo con agua destilada hasta 50 mL. Titular directamente con
HCl 0,02 N, colocado en una microbureta automtica.
7. Calcular el porcentaje de nitrgeno y de protenas totales en la muestra de leche
aplicando la frmula correspondiente y empleando el factor 6,38.