- Biologie moléculaire re UR e2- 1a James Watson, Tania Baker, Stephen Bell, Alexander Gann, Michael Levine, Richard Losick i aa + site compagnon pour |'étudiant (enV.0}) « AY ae = ; a “~ yf ry is f BET ed iC We ee uu ducation par Michel Jacquet et Francis Le Gaillardpromiére position (extrémité 5°) Le code génétique seconde position od aWIQIS!01}, 8 z & Z & e * Codons de terminaison ou codons « non sens » t Utilisé aussi chez les bactéries pour spécifier le codon initiateur formyl-Met-ARNI™*Sommaire = - Partie une Chimie et Génétique 1 1 La vue mendélienne du monde = 5 2 Les acides nucléiques wansmetient "information génétique — 17 3 L’importance des interactions chimiques faibles 35 4 L’importance des liaisons a forte énergie 47 5 Les liaisons faibles et fortes déterminent la structure macromoléculaire 57 Partie deux Maintenancedugénome 77 6 Suuctures de FADNetde ARN 81 z Structure du génome, chromatine et nucléosome — 109 8 La réplication de !ADN 155 9 Altérations, réparations et mutations de VADN — 205 10 La recombinaison homologue au niveau moléculaire 225 11 Recombinaison spécifique de site et transposition 251 Partie trois Expression du génome 293 12 Mécanismes de la transcription 299 13 Epissage de !ARN 327 14 Traduction 359 15 Le code génétique 407 Partie quatre Régulation 421 16 La régulation transcriptionnelle chez les procaryotes 427 7 La régulation transcriptionnelle chez les eucaryotes 457 18 ARN régulateurs 491 19 Régulation des génes au cours du développement et de l’évolution 509 20 Analyse des génomes et biologie des systtmes 545. Partie cing Méthodes 569 21 Les techniques de la biologie moléculaire 575: 22 Les organisme modéles — 609 Bibliographie 637 Glossaire 649 Index 665a Table des matiéres Partie une Chimie et Génétique Archives photographiques du laboratoire de Cold Spring Harbor 1 41 12 13 14 15 16 La vue mendélienne du monde Les découvertes de Mendel ® Les lois de Mendel Le principe de la ségrégation indépendante Certains alléles ne sont ni dominants ni récessifs Le principe de l'assortiment indépendant La théorie chromosomique de I’hérédité ® Les genes soni liés aux chromosomes La liaison génétique et le crossing-over La cartographie des chromosomes L'origine de la variabilité génétique, les mutations Les premieres spéculations sur les genes et sur leur mode d'action 1.7 Les premiéres tentatives pour établir une relation entre génes et protéines Résumé 2 Les acides nucléiques 24 a2 23 24 transmettent l'information génétique La découverte inattendue d’Avery : 'ADN peut porter des spécificites génétiques Les génes viraux sont également des acides nucléiques La double hélice © Les rogles de Chargaff La découverte des polymérases qui synthétisent ! ADN Les preuves expérimentales en faveur de la séparation des brins d’ ADN lors de la réplication information génétique contenue dans I'ADN est comprise dans la séquence des quatre nucléotides L’ADN ne peut pas étre la matrice qui ordonne directement les acides aminés durant la synthése protéique L°ARN est chimiquement tres similaire 41’ ADN ® Prewve que les genes contrélent les séquences Hacides aminés dans les protéines Le « dogme central » L’hypothése de |’adaptateur de Crick La découverte des ARN de transfert 14 15: 7 17 18 20 21 a) pp on 25 2.6 Le paradoxe de la non-spécificité des ribosomes La découverte des ARN messagers (ARNm) La synthése enzymatique de |’ ARN 4 partir d'une matrice ADN L blissement du code génétique L'établissement de la direction de la synthése protéique Les signaux de démarrage et d’ arrét de la traduction sont également codés dans I’ ADN L’ére de la genomique Résumé 3 34 3.2 33 L'importance des interactions chimiques faibles Les caractéristiques des liaisons chimiques Les liaisons chimiques sont explicables en termes de mécanique quantique La formation des liaisons chimiques implique un changement de la forme d’énergic Equilibre entre formations et rupture de liaisons Le concept de I’énergie libre Keq varie de facon exponenti¢lle avec DG Les liaisons covalentes sont ues fortes Les liaisons faibles dans les systemes biologiques Les liaisons faibles ont des énergies comprises entre | et 7 keal/mole Les liaisons faibles sont constamment formées et rompues aux températures physiologiques Distinction entre molécules polaires et non polaires Les forces de van der Waals Les liaisons hydrogténe Quelques liaisons ioniques sont des liaisons hydrogéne Les interactions faibles nécessitent des surfaces moléculaires complémentaires Les molécules d'eau forment des liaisons hydrogéne Les liaisons faibles entre les molécules en solution aqueuse Les molécules organiques qui ont tendance a former des liaisons hydrogéne sont solubles dans l'eau Les « liaisons » hydrophobes stabilisent Jes macromolecules © La singularité des formes moléculaires et le concept de Uadhérence sélective Lavantage d'un DG entre 2 et 5 kcal/mole Les liaisons faibles attachent les enzymes a leurs substrats Les liaisons faibles sont responsables de la plupa des interactions protéine-ADN et protéine-protéine Résumé 28 28 29 30 31 33 35 35 36 36 36 37 37 37 37 37 37 38 38 39 40 4) 41 41 4 44 4441 4.2 43 44 4S Résumé 5 5.1 5.2 5.3 54 Table des matiéres L'importance des liaisons a forte énergie 47 Les molécules qui donnent de |’énergie sont thermodynamiquement instables 47 Les enzymes abaissent les énergies d'activation des réactions biochimiques 48 Energie libre des biomolécules 49 Les liaisons a forte énergie s‘hydrolysent avec un important AG négatif 49 Les liaisons a forte énergie dans les reactions de biosynthese 50 Les liaisons peptidiques s’hydrolysent spontanément of Couplage de AG négatifs et positifs Sl Activation de précurseurs dans les réactions de transfert de groupements 51 Versatilité de ! ATP dans les transferts de groupements 52 Activation des acides aminés par attachement de TAMP 53 Les précurseurs d’acides nucléiques sont activés par la présence de @-@ 53 L'intérat de la libération de @~@ dans la synthése des acides nucléiques 53 Une coupure de @~@ des réactions de biosynthé: térise la plupart Les liaisons faibles et fortes déterminent la structure macromoléculaire 57 Les structures évoluées sont déterminées Par des interactions intra- et intermoléculaires 57 L’ADN forme une hélice réguliére 57 Les ARN ont une grande variété de structures. 59 Caractéristiques chimiques des briques constitutives des protéines 50 La liaison peptidique Ily a quatre niveaux de structure dans les protéines 59 Les hélices oct les feuillets B sont les formes courantes de la structure secondaire 61 @ Détermination de la structure d'une protéine 62 La conformation spécifique d'une protéine résulte de la distribution de ses liaisons hydrogéne 63 Les hélices @ se rapprochent les unes des autres pour former des structures bispiralées 66 La plupart des protéines sont modulaires, contenant deux ou trois domaines 66 = Les grosses protéines sont souvent construites 4 partir de plusieurs chaines polypeptidiques plus petites o7 Les prot¢ines sont compos¢es d'un nombre étonnamment petit de motifs structuraux de domaines 67 Des fonctions protéiques différentes résultcnt de la combinaison de différents domaines 67 Des liaisons faibles positionnent correctement les protéines le long des molécules d‘ADNet d'ARN 68 Les protéines scannent les chaines ‘d’ADN pour localiser un site de liaison spécifique Diverses stratégies de reconnaissance entre ARN ct protéines Régulation de la fonction des protéines par modification de leurs conformations La base structurale de la régulation par modification conformationnelle est connue pour des exemples impliquant de petits ligands, des interactions protéine-protéine et des modifications provéiques La régulation des protéines n'est pas toujours conduite par une modification de conforma 5.5 Résumé Partie deux Maintenance du génome Archives photographiques du laboraicire de Cold Spring Harbor aD. 79 6 Structures de l’ADN etdel’ARN 81 6.1 Structure de 'ADN L’ADN est composé de chaines polynucléotidiques Chaque base adopte une forme tautomérique préférentielle Les deux brins de Ja double hélice sont appariés Tun a autre de fagon complémentaire dans une orientation antiparalléle Les deux brins de la double hélice ont des séquences complémentaires Les liaisons hydrogéne sont essentielles pour la spécificité d’appariement des bases Les bases peuvent pivoter en dehors de la double hélice Le pas de la double hélice de ? ADN est en général & droite La double hélice présente un petit et un grand sillons Le grand sillon est riche en information chimique @ L’ADNa 10.5 paires de bases par tour d'hélice en solution : Vexpérience sur Mica [existe plusieurs conformations de la double hélice L’ADN adopte parfois une conformation en hélice gauche ® Comment des taches sur un film radiographique ont révelé la structure de VADN Les deux brins de ' ADN peuvent se séparer (dénaturation) et se réassocier Certaines molécules d’ADN sont circulaires 6.2 Topologie de l'ADN Le nombre d’enlacements est un invariant topologique des ADN circulaires fermés covalemment Le nombre d’enlacements intégre la torsion et les supertours Lk° est le nombre d’enlacements dun ADNece totalement relaché dans des conditions physiologiques L’ADN cellulaire présente un surenroulement négatif 81 81 83 83 Rd 85 85 9) 9% 3) 94 sDLes nucléosomes introduisent un surenroulement négatif chez les cucaryotes 97 Les topoisomerases peuvent reldcher |’ ADN surenroulé 97 Les procaryotes ont des topoisomerases particuligres qui introduisent des surenroulements dans !ADN 98 Les topoisomérases peuvent aussi défaire les nceuds et déméler ! ADN 98 Les topoisomerases forment un intermédiaire covalent entre la protéine et LADN pour couper et refermer les brins d’ADN 99 Les topoisomerases forment un pont enzymatique pour passer les segments d’ADN l'un travers l'autre 100 Les topoisomeres de ADN peuvent étre séparés par une électrophorése 101 Les ions éthidium déroulent VADN 101 © Une prewe expérimentale de la périodicité hélicotdale de 10,5 paires de bases & partir des propriétés topologiques des ADN circulaives 102 6.3 Structure de ‘ARN 102 L’ARN contient du ribose et de luracile, il est généralement monocaténaire 102 La chaine d° ARN se replie en partie sur elle-méme pour former localement des doubles hélic dont l’enroulement est similaire & celui de PADN-A 102 L’ARN peut se replier et former des structures tertiaires complexes 103 Certains ARN sont des enzymes 104 Le ribozyme a téte de marteau clive FARN en formant un groupement 2°,3’-phosphate cyclique 105 La vie a-t-elle évolué a partir d’un monde a ARN ? 106 Résumé 106 7 Structure du génome, chromatine et nucléosome 109 7.1 Séquence des génomes et diversité des chromosomes 110 Les chromosomes peuvent étre circulaires ou linéaires 110 Chaque cellule maintient un nombre constant de chromosomes 110 La taille du génome est corrélée & la complexité de organisme 11 Le génome d’£. coli est composé presque exclusivement de genes 112 Les organismes les plus complexes ont une densité génique plus faible 113 Les génes ne représentent qu'une petite proportion de I’ ADN du chromosome cucaryote 113 La majorité des séquences intergéniques humaines Se compose de séquences d’ADN répétées 14 7.2 Duplication et ségrégation des chromosomes 116 Les centromeres, les télomeres ct les origines de réplication sont nécessaires a la transmi fidele des chromosomes cucaryotes durant la division cellulaire 116 La duplication et la ségrégation des chromosomes cucaryotes ont lieu 4 des phases distinctes du cycle cellulaire Ay 73 74 1s Table des matiéres XI La structure des chromosomes change lorsque les cellules cucaryotes se divisent 119 La cohésion des chromatides sezurs et la condensation des chromosomes impliquent les protéines SMC 119 La mitose conserve le nombre de chromosomes parentaux dans les cellules filles 120 intre la réplication et la ségrégation, en G1 et en G2, les cellules se préparent a ]’étape suivante et la complétude de I’ étape précédente La méiose réduit le nombre de chromosomes parentaux 123 Les différents niveaux de structure du chromosome peuvent étre observes par microscopie 123 Le nucléosome 125 Les nucléosomes sont les pierres de I’édifice du chromosome 125 @ La nucléase micrococcale et VADN associé au nucléosome 126 Les histones sont de petites protéines chargées positivement 126 Structure atomique du nucléosome 128 Les histones se lient a des régions particulitres de ' ADN a l'intérieur du nucléosome 128 De nombreux contacts indépendants de la séquence «ADN sont impliqués dans l’interaction entre les histones de l’octamére et TADN 130 Les queues amino-terminales maintiennent l'ADN enroulé autour de Poctamére d’ histones: 130 L’enroulement de I’ ADN autour de I’ octamére histones génére de la superhélicité négative 130 B® Nucléosomes et densité de superhélicité 133 ‘Structure chromatinienne d’ordre supérieur 135 Hétérochromatine ct cuchromatine 135 Lrhistone H] se fixe Al’ ADN internucléosomique 136 Les séries de nucléosomes forment des structures plus complexes : la fibre de 30 nm 136 Les queues amino-terminales des histones sont nécessaires pour la formation de la fibre de 30 nm 137 Une compaction plus importante de |’ ADN implique de grandes boucles dans |’ ADN nucléosomal 138 Des variants d’histones altérent la fonction du nucléosome 138 Régulation de la structure de la chromatine 140 L’interaction entre l’ADN et l'octamére d’ histones: est dynamique 140 Les complexes de remodelage des nucléosomes facilitent leurs mouvements 140 Certains nucléosomes se trouvent 2 des positions spécifiques : le positionnement du nucleosome: 141 Les modifications des queues amino-terminales des histones altérent l"accessibilité de Ia chromatine 143 B® Détermination du positionnement des nucléosomes dans une cellule 144 ® Les histones modifiées sont reconnues par des domaines protéiques situ des complexes de remodelage et de modifi des nucléosomes 147 Des enzymes spécifiques sont responsables de la modification des histones 149XII Table des matiéres La modification des uel Faso iae) et le remodelage pour augmenter l’accessibi 7.6 Assemblage du nucléosome Les nucléosomes sont assembles immédiatement apres la réplication de ' ADN L’assembluge des nucléosomes nécessite laction des « chaperons » d’histones Résumé 8 Laréplication de 'ADN 1 8.1 Approche chimique de la synthése de I'ADN La synthése de I’ ADN nécessite des désoxynucléosides triphosphates et une jonction amorce:matrice L’ADN est synthétisé par extension de Pextrémité 3° de l'amorce L’ hydrolyse du pyrophosphate est la force motrice de Ja synthése de !ADN 8.2 Le fonctionnement de l’ADN polymérase Les ADN polymérases utilisent un site actif unique pour catulyser la synthése de ! ADN Bl Les dosages d' incorporation peuvent etre utilisés pour mesurer la synthese des acides nucléiques et des protéines Les ADN polymerases ressemblent & une main qui serre la jonction amorce:matrice @ Les agents aniicancéreux et antiviraux ont pour cible la réplication de VADN Les ADN polymerases sont des enzymes processives Des exonucléases corrigent VADN nouvellement synthétisé 8.3 La fourche de réplication Les deux brins de !ADN sont synthétisés simultanément dans la fourche de réplication L initiation dun nouveau brin d’ADN nécessite une amorce ARN Les amorces ARN doivent étre climinées pour terminer la réplication de TADN Les ADN hélicases déroulent la double hélice devant la fourche de réplication ® Recherche de la polarité d'une ADN helicase Une ADN hélicase tire |) ADN monocaténaire & travers son pore central Des protéines se liant AlADN monocaténaire Ie stabilisent avant la réplication Les topoisomerases suppriment le surenroulement produit par la séparation des brins de l‘ADN dans la fourche de réplication Les enzymes de la fourche de réplication élargissent la gamme des substrats des ADN polymérases 8.4 La spécialisation des ADN polymérases Les ADN polymérases sont spécialisées dans différents rdles dans les cellules Des anneaux coulissants augmentent spectaculairement la processivité de ' ADN polymérase Les anneaux coulissants sont ouverts et placés sur I’ ADN par des poseurs d’anneaux coulissants © Controle par VATP de fonctionnement d'une protéine : chargement d'un anneau coulissant 149 149 149 151 153 55 156 156 156 156 157 157 159 161 162 164 166 167 167 168 168 169 169 171 172 173 174 174 176 178 178 8.5 La synthése de I’ADN dans la fourche de réplication 180 L’ensemble des protéines intervenant dans une fourche de réplication dE. codi constitue le réplisome 182 8.6 Initiation de la réplication de l‘ADN 183 Des séquences spécifiques dirigent le début de la réplication 183 Le modéle du réplicon 183 Le réplicateur inclut les séquences de fixation de la protéine initiatrice et des séquences facilement déroulées 184 8.7 Liaison et séparation : sélection et activation dune origine de réplication par une protéine initiatrice 184 ®@ L identification des origines de réplication et des réplicateurs 185 Des interactions protéine-protéine et protéine-ADN dirigent le processus d'initiation igs Les chromosomes eucaryotes sont répliqués précisément une seule fois par cycle cellulaire 188. © L’hypothése de l'usine de réplication 190 La formation des complexes préréplicatifs est la premiére étape de “initiation de Ja réplication chez les eucaryotes 192, Formation des pré-RC et activation sont régulées pour permettre la tenue d’un seul cycle de réplication par cycle cellulaire 194 [initiation de la réplication chez les procaryotes et les eucaryotes : comparaison 194 © La réplication de VADN chez E. coli est régulée par la quantité de DnaA.ATP et par SegA 195 8.8 Finir la réplication 197 Des ADN topoisomérases de type II séparent les molécules filles d’ ADN 197 La synthése du brin discontinu ne permet pas de copier les extrémités des chromosomes lingaires 198 La télomérase est une ADN polymérase qui ne nécessite pas de matrice exogéne 199 La télomérase résout le probléme de la réplication des extrémités en allongeant les iets 3° ; des chromosomes 199 Des protéines liant les téloméres régulent I activité de la télomeérase et la longueur des tclomeres x ®@ Vicillissement, cancer et hypothese des telomeres 20) Les protéines liant les téloméres protégent les extrémités des chromosomes 201 Résumé 20. 9 9.1 Altérations, reparations j et mutations de l’ADN 20 Les erreurs de réplication et leur réparation 2 La nature des mutations @ L‘expansion des répétitions de triplets provoque des pathologies 26 Quelques erreurs de réplication échappent a la fonction correctrice La réparation des mésappariements enléve des erreurs qui ont échappé a la fonction correctrice9.2 Les altérations de I'ADN 210 L’ADN subit des altérations spontanées, par hydrolyse et désamination 210 B Le test de Ames 21 L’ADN est altéré par des alkylations, des oxydations ou des rayonnements 211 Les mutations sont également causées par des analogues de bases et des agents intercalants 212 9,3 La réparation des altérations de l'ADN 213 Inversion directe des altérations. 214 Les enzymes de la voie de réparation par excision de base (BER) enlévent les bases altérées en utilisant un mécanisme de pivotement des bases 214 Les enzymes de la voie de réparation par excision de nucléotides (NER) coupent |’ ADN altéré de part et d'auue de la lésion 217 La recombinaison répare les cassures de ! ADN en récupérant les informations a partir d’ADN non altéré 218 sures bicaténaires de l"ADN sont également es par ligature directe des extrémités cassées 218 B La ligature d'extrémités non homologues 219 nthése d°ADN translésionnelle permet a la réplication de traverser les lésions de !ADN 220 © La famille ¥ des ADN polymérases 222 Résumé 223 10 La recombinaison homologue au niveau moléculaire 225 10.1 Les cassures de I'ADN sont courantes et initient la recombinaison 225 10.2 Les modéles de la recombinaison homologue 227 L’invasion de brin est une étape clé précoce de la recombinaison homologue 227 La résolution des jonctions de Holliday est une étape clé pour terminer les échanges génétiques 229 Le modéle de réparation des cassures bicaténaires décrit de nombreux cas de recombinaison 229 10.3 Les machineries protéiques de la recombinaison homologue 231 © Comment résoudre un intermédiaire de recombinaison présentant deux jonctions de Holliday 232 L*hélicase/nucléase RecBCD aménage les molécules @ADN cassées pour la recombinaison Les sites chi controlent RecBCD La protéine RecA t assembleée sur TP ADN monocaténaire ct déclenche Vinvasion de brin De nouveaux appariements de partenaires sont établis dans le filament RecA Des homologues de RecA sont présents dans tous les organismes Le complexe RuvAB reconnait spécifiquement les jonctions de Holliday et dirige la migration @embranchement RuvC termine la fecombinaison en coupant des brins 7" Spécifiques d? DN dans la jonction de Holliday 4. La recombinaison homologue chez les eucaryotes 238 238 239 Table des matiéres XIII La recombinaison homologue a des fonctions supplémentaires chez les eucaryotes 239 La recombinaison homologue est indispensable ala ségrégation des chromosomes pendant la méiose 240 Une création programmeée de res de !ADN bicaténaire a lieu pendant la méiosc 241 La protéine MRX aménage les extrémités coupées de ’ ADN 241 Dmcl est une protéine de type RecA qui participe spécificiquement & la recombinaison méiotique 242 De nombreuses protéines fonctionnent ensemble pour effectuer la recombinaison méiotique 243 @ Ze produit du géne suppresseur de tumeur BRCA2 interagit avee la protéine Rad51 et contréle la stabilité du génome 244 140.5 Commutation de type sexuel chez la levure 244 La commutation de type sexuel est initiée par une cassure bicaténaire spécifique de site 245 La commutation de type sexuel est un événement de conversion génique ct n‘est pas associ 4 un crossing-over 246 10.6 Les conséquences génétiques du mécanisme de recombinaison homologue 247 Une cause de conversion génique est la réparation de l"ADN pendant la recombinaison 247 Résumé 249 11 Recombinaison spécifique de site et transposition 251 11.1 La recombinaison conservative spécifique de site 251 La recombinaison spécifique de site a lieu au niveau de séquences spécifiques dans ' ADN cible 251 Des recombinases spécifiques de site coupent et ligaturent | ADN en utilisant un intermédiaire covalent ADN-protéine 253 Les recombinases a sérine introduisent des cassures bicaténaires dans 'ADN, puis échangent les brins pour effectuer la recombinaison 254 La structure du complexe ADN-recombinase A. sérine indique que les sous-unités pivotent pour effectuer ’échange des brins Les recombinases 4 tyrosine coupent et li seulement une paire de brins d ADN 255 Les structures de recombinases a tyrosine liges ATADN révélent le mécanisme des échanges de brins 256 11.2 Les réles biologiques de la recombinaison spécifique de site 256 @ Uiilisation de la recambinaison spécifique de site comme outil en génie génétique L’intégrase de | catalyse l'intégration du génome viral dans le chromosome de la cellule hate, ainsi que son excision Lvexeision du génome du bactériophage 4 nécessite une nouvelle protéine courbant |’'ADN La recombinase Hin inverse un segment d°ADN, ce qui permet l’expression de genes d nls La recombinaison catalysée par Hin nécessite une séquence activatrice dans |’ ADNXIV 113 11.4 11.5 Table des matieres Les recombinases convertissent les molécules W@ADN circulaires multimériques en monomeéres — 262 L existe d'autres mécanismes pour dirige: la recombinaison vers des segments spé de TADN 262 Transposition 262 Certains éléments génétiques se déplacent vers de nouvelles localisations chromosomiques par transposition 262 © La recombinase Xer catalyse la monomérisation des chromosomes bactériens et de nombreux plasmides bactériens 264 I existe trois classes principales éléments transposables 267 Les transposons ADN contiennent un géne codant une transposase, flanqué par des sites de recombinaison 267 Les transposons existent a la fois comme des éléments autonomes et des éléments non autonomes 267 Les rétrotransposons de type viral et les rétrovirus contiennent des séquences terminales répétées et deux génes importants pour la recombinaison 268 Les rétrotransposons poly-A ressemblent a des genes 268 La transposition d’ ADN par mécanisme « coupé-collé »» 268 Lintermédiaire de transposition par « coupé-collé » est termine par réparation de bréche 269 Lors de la transposition, il existe de nombreux mecanismes de coupure du brin non transféré 269 La transposition d’ ADN par un mécanisme réplicatif: 271 Les rétrotransposons de type viral et les rétrovirus se déplacent en utilisant un ARN intermédi 273 Les transposases d”ADN et es intégrases rétrovirales sont membres d’une superfamille de protéines 273 Les rétrotransposons poly-A se déplacent par un mécanisme d” « épissage inverse » 274 La voie de formation de VADNe rétroviral 275 Exemples d’éléments transposables et de leur régulation 279 Les transposons de la famille IS4 sont des éléments Compacts possédant de multiples mécanismes de contrdle du nombre de copies 279 ® Les éléments du mais et la découverte des transposons 280 La transposition de Tn/0 est couplée a la réplication de l'ADN cellulaire 281 Le bactériophage Mu est un transposon extrémement robuste 282 Mu utilise 'immunité de twansposition ciblée pour Ne pas se transposer dans son propre ADN 282 Les éléments Te //mariner sont des transposons ADN urs répandus chez les eucaryotes 283 Les éléments Ty de la levure se ‘transposent dans des « havres de sécurité » du génome 284 © Mécanisme de Vimmunité de transposition ciblée 285 Les LINE dirigent leur propre transposition ct peuvent également transposer des ARN cellulaires 286 La recombinaison v(D)) 287 Réstané Les événements précoces de la recombinaison V(D)J se déroulent selon un mécanisme similaire a celui de Pexcision des transposons 289 291 Partie trois Expression du génome Archives photographigues du laboratoire de Cold Spring Harbor 12 12.4 12.2 12.3 293 295 Mécanismes de la transcription 299 Les ARN polymérases et le cycle de transcription 300 Les ARN polymérases se présentent sous différentes formes mais partagent plusieurs caractéristiques 300 La transcription par ARN polymérase se déroule en une série d’étapes 301 L initiation de la transcription implique trois Gtapes 303 Le cycle de transcription chez les bactéries 303 Les promoteurs bactériens different en efficacité et en séquence, mais possédent des proprictés caractéristiques 303 Le facteur contrdle la liaison de la polymérase au promoteur 304 La transition en complexe ouvert implique des modifications structurales dans P ARN polymérase et dans le promoteur 305 L’ initiation de la transcription par ARN polymérase ne nécessite pas une amorce 306 Au début de la transcription, ARN polymérase reste immobile et tire l'ADN en son sein 306 @ Séquences consensus 307 La libération du promoteur implique de briser des interactions polymérase-promoteur et noyau de la poly mérase-facteur 6 307 En phase d’élongation, la polymeérase est une machine processive qui synthélise et corrige l' ARN 308 © Les ARN polymérases d chaine polypeptidique unique 309 L’ARN polymérase peut étre bloguée et doit alors Gtre enlevée de la matrice 309 La terminaison de la transcription dépend de signaux dans la séquence de l’ ARN 311 Transcription chez les eucaryotes 313 Le promoteur minimum reconnu par ' ARN polymérase I] est constitué d’une combinaison de quatre éléments de séquence différents. 313 L°ARN polymeérase I forme sur le promoteur un complexe de préinitiation avec les facteurs généraux de transcription 313 La libération du promoteur ite la phosphorylation de la « queue » de la polymérase 314 La TBP lie et déforme I’ ADN grace & un feuillet B inséré dans le petit sillon 315 Les autres facteurs généraux de transcription ont aussi des roles spécifiques dans initiation 315 in vivo, la transcription requiert des protéines supplémentaires, notamment le complexe Médiateur 31612.4 Le Mediateur est constitué de nombreuses sous-unités, Résumé 13 13.1 13.2 13.3 13.4 certaines conservées de la levure a "humain 317 Un nouvel ensemble de facteurs stimule |’élongation par Pol [fet la correction de ' ARN 317 Durant |’élongation, l' ARN polymérase doit faire ‘ace aux histones sur sa route 319 Durant I’élongati polymérase est associée 4 un nouvel ensemble de facteurs protéiques requis pour différents types de modification de VARN 319 La terminaison de la transcription est liée & la dégradation de l’ARN par une RNase trds processive 321 Transcription par les ARN polymerases | et III 322 Les ARN polymérases I et III reconnaissent des promoteurs distinets, utilisant un groupe de facteurs de transcription spécifiques, mais nécessitant toujours la TBP 322 Les promoteurs Pol III sont situés en aval du site d’initiation de la transeription 323 324 Epissage de l’ARN 327 © Les adénovirus et la découverte de l’épissage 329 La chimie de I’épissage des ARN 331 Des séquences de ! ARN déterminent les positions oll lépissage doit se dérouler 331 L’intron est enlevé sous la forme d’une structure en lasso tandis que les exons de part et d’autre sont joints 331 Des exons de molécules d’ARN distinctes peuvent Gtre fusionnés par épissage en trans 331 La machinerie d’épissage 332 L’épissage de I'ARN est réalisé par un grand complexe appelé le spliceosome 332 Les mécanismes d’épissage 333 Assemblage, réarrangements et catalyse au sein du spliceasome : les étapes de épissage 333 Les introns auto-¢pissants révélent que VP ARN peut catalyser P’épissage de 7 ARN 335 Les introns du groupe I libérent un intron linéaire plutét qu’un las: 335 ® Convertir des introns du groupe Len ribozymes 337 Comment le spliccosome reconnait-il les sites d’épissage de manitre fiable ? 337 Quelques introns sont épissés par un spliceosome constitué d'une série différente de snRNP 339 Epissage alternatif 340 Un gene peut s*exprimer en de nombreux produits par l’épissage alternatif 340, Il existe plusieurs mécanismes assurant Vépissage mutuellement exclusif 342 Le cas particulier du g&ne Dscam de la drosophile : épissage mutuellement exclusif A grande échelle 343 L’gpissage mutuellement exclusif de exon 6 de Dscam utilise une stratégie originale pluto qu'un mécanisme standard 344 © Identification du site d’arrimage et des séquences de sélection 345 13.5 13.6 Table des matiéres XV Lépi: Hernatif est régulé par des activateurs ct des répresseurs 347 La régulation de I'épissage alternatif est impliquée dans la détermination du sexe de la drosophile La redistribution d'exons Des exons sont redistribués pa 348 349 recombinaison pour produire des génes codant de nouvelles protéines 349 @ Des défauts dans l'épissage de pré-ARNm sont responsables de maladies chez Vhomme 35] Edition de I'ARN 351 L’édition de 1’ ARN est une autre manitre de modifier la séquence d'un ARNm @ Les désaminases et le VIH Des ARN guides dirigent |’insertion et la délétion d'uridines 354 13.7 Transport de l‘ARNm 355 Aprés maturation, I’ ARNm est empaqueté ct exporté «lu noyau vers le cytoplasme pour y ire traduit 355 Résumé 3356 14 Traduction 359 14.1 ARN messager 360 Les chatnes polypeptidiques sont spécifiges par des cadres de lecture ouverts 360 Les ARNm procaryotes pos: du ribosome qui recrute la machinerie de traduction 360. Les ARNm cucuaryotes sont modific¢s au niveau de leurs extrémités 5’ ct 3° pour faciliter la traduction 361 14.2 ARN de transfert 361 Les ARNt sont des adaptateurs entre les codons et les acides aminés 361 B® Enzymes d'addition de CCA ; synthése d’ARN Sans mairice 362 Les ARNt partagent la méme structure secondaire cn forme de feuille de trefle 362 Les ARNE ont une structure tertiaire en forme de L_ 363 14.3 Attachement des acides aminés aux ARNt 364 Les ARNI sont chargés par l’attachement d’un acide aminé a P'adénosine de extrémité 3° par une liaison acyle riche en énergie 364 Les arninoacyl-ARNt synthétases chargent les ARNt en deux étupes 364 Chaque aminoa RNt synthétase attache un seul acide aminé 4 un ou plusieurs ARNt 364 Les ARN synthétases reconnaissent des caractéristiques structurales de I’ ARNtapproprié 364 La formation de Faminoacyl-ARNt est ues précise 366 Certaines aminoacy1-ARNt synthétases utilisent une poche dition pour charger les ARNt avec grande précision 306 Le ribosome est incapable de faire la différence entre des ARNt correctement et incorrectement chargés 367 14.4 Le ribosome 367 © Sélénocystéine 368 Le some est composé d’une grande et Pune petite sous-unité 368 La grande et la petite sous-unité s"associent et se dissocient 4 chaque cycle de traduction 369XVI 14.5 14.1 a 14.7 Table des matiéres De nouveaux acides aminés sont attachés 4 ’extrémité carboxyle de la chaine polypeptidique en croissance 370 Des liaisons peptidiques sont formées par transfert de la chaine polypeptidique en croissance d'un ARNL a l'autre 370 Les ARN ribosomiques sont des déterminants structuraux et catalytiques du ribosome 371 Le ribosome posséde trois sites de liaison pour les ARNL 372 Des canaux traversant le ribosome permettent al ARNmet au polypeptide naissant d’entrer dans le ribosome et/ou d’en sortir 372 Initiation de la traduction 374 Les ARNm procaryotes sont recrutés sur la petite sous-unité par appariement de bases avec ARNr 374 Un ARNt particulier chargé avec une méthionine modifiée se lie directement a la petite sous-unité procaryote 374 Trois facteurs d’initiation dirigent |’assemblage dun complexe d’initiation contenant l’ ARNm. et PARNT initiateur 375 Les ribosomes eucaryotes sont recrutés sur |’ ARNm par sa coiffe 5° 376 © WORF et IRES ; exceptions prouvant la régle 378 codon d’ initiation est trouvé en scannant T’ARNm & partir de son extrémité 5” 379 Des facteurs d’initiation de la traduction maintiennent les ARNm eucaryotes dans une configuration circulaire 380 Elongation de la traduction 380 Les aminoacyl-ARNt sont convoyés vers le site A par le facteur d’élongation EF-Tu 381 Le ribosome utilise plusieurs mécanismes pour contre-sélectionner les aminoacyl-ARNt incorrects 381 Le ribosome est un ribozyme 384 La formation de la liaison peptidique et le facteur d’élongation EF-G provoquent la translocation des ARNt et del’ ARNm 385 EF-G entraine la translocation en déplagant 7 ARNt lié au site A 386 EF-Tu-GDP et EF-G-GDP doivent échanger le GDP pour du GTP avant de participer & un nouveau cycle d’élongation 387 Un cycle de formation d’une liaison peptidique consomme deux molécules de GTP et une d’ATP 388 Terminaison de la traduction 388 Des facteurs de terminaison arrétent la traduction en réponse aux codons stop 388 De courtes régions des facteurs de terminaison de classe I reconnaissent les codons stop et stimulent la libération de la chaine peptidique = 388 @ Protéines liant le GTP, changement de conformation, et ta fidélité et Vordre ‘s événements de la traduction 389 ange GDP/GTP et hydrolyse du GTP. contrélent la fonction du facteur de terminaison de classe IT 391 Le facteur de recyclage du ribosome imite un ARNt 14.8 Régulation de la traduction @ Des antibiotiques bloquent la division cellulaire en inhibant des étapes spécifiques de la traduction ion de protéines ou d° ARN prés du site on du ribosome régule négutivement V initiation de la traduction bactérienne Régulation de la traduction procaryote des protéines ribosomiques sont des répresseurs de leur propre traduction Des régulateurs globaux de la traduction eucaryote ciblent des facteurs clés requis pour la reconnaissance de I’ARNm ct la liaison de I" ARNt initiateur au ribosome Le contréle spatial de la traduction par des 4E-BP spécifiques d’un ARNm Une protéine liant PARN 391 392 393 395 395 398 398 eulée par le fer controle la traduction ferritine 399 La traduction de l’activateur transcriptionnel Gen4d chez la levure est contrdlée par des courts ORF en amont et l’abondance d'un complexe ternaire 400 14,9 Régulation de la stabilité des ARNm et des protéines dépendante de la traduction 401 L’ARN SsrA assure le sauvetage des ribosomes qui traduisent des ARNim brisés 401 Les cellules eucaryotes dégradent les ARNm incomplets ou contenant des codons stop prématurés 403 Résumé 405 15 Le code génétique 407 15.1 Le code est dégénéré 407 Logique de la conception du code 407 Appariement bancal dans I’anticodon 409 Trois codons entrainent l’arrét de la traduction 409 Comment le code a été décrypté 409 Incorporation d’acides aminés stimulée par des ARNm synthétiques 410 Poly-U code pour la polyphénylalanine aul Les copolyméres mixtes ont permis I’ identification de codons supplémentaires 412 Liaison de I’ ARNt a des triplets de nucléotides bien définis (codons) 412 Identification des codons a partir de copolyméres répétitifs 413 15.2 Trois régies gouvernent le code génétique 414 Trois types de mutations ponctuelles altérent le code génétique 414 Preuve génétique que le code est lu par triplet 415 15.3 Les mutations suppressives peuvent se situer dans un méme géne ou dans un géne different 415 Les suppressions intergéniques impliquent des ARNI mutants 41s Les suppresseurs non-sens lisent également les signaux de terminaison normaux 416 Validation du code génétique 416 15.4 Le code est presque universel 47 Résumé 449Partie quatre Régulation 421 Archives photographiques du laboratoire de Cald Spriag Harbor 16 16.1 423 La régulation transcriptionnelle chez les procaryotes 427 Les principes de la régulation transcriptionnelle 427 L’expression d'un géne est controlée par des protéines régulatrices La plupart des activateurs et des répresseurs agi au niveau de “initiation de la wanseription De nombreux promoteurs sont régulés par des activateurs qui aident I ARN polymérase ase lier sur 'ADN et par des répresseurs gui bloquent cette liaison Certains activateurs et répresseurs fonctionnent par allostérie et régulent des étapes de Vinitiation de la traduction aprés la liaison de PT ARN polymérase 429 Action & distance et boucle d°ADN 429 La liaison coopérative et I’allostérie jouent de multiples réles dans la régulation des génes L’antiterminaison et au-dela ; V initiation de la transcription n’est pas la seule cible de la régulation des genes La régulation de initiation de la transcription : exemples chez les procaryotes Un activateur agit de concert avec un répresseur pour contr6ler les génes lac CAP et le répresseur Lac ont des effets opposes sur Ja liaison de l’ARN polymerase au promoteur lac CAP posséde des domaines d’activation et de liaison a ! ADN séparés CAP et le répresseur Lac se lient sur |’ ADN en utilisant des motifs structuraux communs © Expérience de détournement d'activateur Les activités du répresseur Lac et de CAP sont contrélées de fagon allostérique par leurs signaux Le contréle combinatoire ; CAP contrile ai d’autres génes Jacob, Monod et les idées sur la régulation des génes Des facteurs s alternatifs dirigent ' ARN polymérase vers d'autres ensembles de promoteurs NtrC et Mer : des activateurs transcriptionnels qui fonctionnent par allostérie plut6t que par recrutement NtrC posséde une activité ATPase et fonctionne A partir de sites éloignés du gene cible MerR active la transcription en provoquant une torsion de ’ ADN au niveau du promoteur Certains répresseurs retiennent l' ARN polymeérase au niveau du promoteur plutét que de I'en exclure AraC et le contréle de l’opéron araBAD par antiactivation Le cas du bactériophage } : différents niveaux de régulation 428 429 430 430 430 432 439 439 440 Table des matiéres XVII Des schémas alternatifs d’expression des genes controlent la croissance lytique et lysogene 442 Les protéines régulatrices et leurs sites de liaison 442 Le répresseur | se lie de fagon coopérative sur les sites opérateurs 443 Les combinaisons de liaisons du répresseur et de Cro contrdlent la croissance lytique ou lysogene 444 L’ induction lysog ne nécessite le clivage protéolytique du répresseur | 4 © Concentration, affinité et liaison coopérative 445 L’autorégulation négative du répresseur nécessite des interactions longues distances et une grande boucle d’ADN 446 Un autre activateur, CH de A, contréle le choix de la croissance lytique ou lysogéne lors de infection d'un nouvel héte 447 ® Evolution du commutateur t 448 Le nombre de particules de phages qui infectent une cellule oriente le choix d'une croissance lytique ou lysogéne. 451 Les conditions de croissance d’E. cofi contrélent la stabilité de la protéine CII et ainsi, le choix lytique ow lysogéne 451 L’antiterminaison transcriptionnelle lors du développement de | 451 © Les approches génétiques qui ont identifié les genes impliqués dans le choix lytique ou tysogene 452 La rétrorégulation : une combinaison de contréles. de la synthése et de la stabilité de |’ ARN détermine Vexpression du gene int 453 Résumé 454 17 La régulation transcriptionnelle 17.1 chez les eucaryotes457 Les mécanismes de régulation transcriptionnelle qui ont été conservés de la levure aux mammiféres 458 Les activateurs posstdent des fonctions de liaison Aal’ADN et d’activation distinctes 459 Les régulateurs eucaryotes utilisent une gamme de domaines de liaison a 1’ ADN, mais la reconnaissance de I"ADN implique des principes identiques & ceux décrits chez les bactéries 459 @ Méthode du double hybride 461 Les régions activatrices ne sont pas des structures bien définies 463 Le recrutement des complexes protéiques sur les génes par les activateurs eucaryotes 463 Les activateurs recrutent la machinerie transcriptionnelle sur les genes 463 Les activateurs recrutent également des modificateurs qui aident la liaison de la machinerie transcriptionnelle sur le promoteur ou [initiation de la transcription Les activateurs recrutent un facteur supplémentaire nécessaire a une initiation ou a une clongation efficace sur certains promoteur Action & distance : boucles et isolants, La régulation appropriée de certains groupes de génes nécessite des régions de contréle d'un locus 467 465 466XVIII 17.3 Table des matiéres ® Interactions longue distance sur le méme chromosome et sur des chromosomes différents 468 L'intégration du signal et le contrdle combinatoire 469 Action synergique des activateurs pour intégrer des signaux 469 Intégration du signal : le gtne HO est contrélé par deux régulateurs — l'un recrutant des modificateurs de nucléosome Vautre recrutant le Medi 471 Intégration du signal : liaison coopé: des tive activateurs sur le gene humain de Vinterféron BS 471 Le contréle combinatoire est au cocur de la complexité et de la diversité des eucaryotes 472 Le controle combinatoire des genes de type sexuel chez S. cerevisiae 473 17.4 Les répresseurs transcriptionnels 474 ® Lvolutivité des circuits de régulation 475 17.5 La transduction du signal et le contréle des régulateurs transcriptionnels 476 Les signaux sont souvent communiqués aux régulateurs transcriptionnels via des voies de transduction du signal 476 Les signaux contrélent les activités des régulateurs transcriptionnels de diverses fagons 478 Les activateurs et répresscurs sont recrutés par fragments 478 17.6 L'« extinction » d'un géne par modification des histones et de 'ADN 430 L’extinction chez la levure est induite par désacetylation et méthylation des histones 480 Chez la drosophile, HPI reconnait les histones méthylées et condense la chromatine 481 La méthylation d’ADN est associée a des e@nes éteints dans les cellules de mammiféres 482 @ Ya-t-il un code histone ? 483 17.7 La régulation épigénétique 484 Certains statuts d’expression génique sont hérités au cours des divisions cellulaires méme lorsque le signal initiateur n'est plus présent 484 Bi Répression transcriptionnelle et pathologie humaine 485 @ Uiilisation des facteurs de transcription pour reprogrammer des cellules somatiques en cellules souches embryonnaires 487 Résumé 488 18 ARN régulateurs 491 18.1 Regulation par les ARN chez les bactéries 491 Les ribocommutateurs sont localisés dans les transcrits des génes qu’ils contrélent par des changements de structure secondaire de 1ARN 492 18.2 © Les opérons de biosynihése des acides aminés sont contralés pur aviénuation 495 interference a |'ARN est un mécanisme régulateur majeur chez les eucaryotes 497 Les ARN courts sont générés a partir de différentes sources et engendrent |’extinction de l’expression des génes de trois fagons différentes 497 18.3 18.4 18.5 Résumé 19 19.1 192 Synthése et fonction des miARN 498 La formation d’un miARN nécessite deux tapes de clivage nucléolytique 408 Dicer est la deuxiéme enzyme de clivage de ! ARN. impliquée dans la production d'un miARN 499 L’incorporation de I ARN guide dans le complexe RISC est la derniére étape dans la formation du complexe mature capable d’éieindre lexpression d’un géne 500 Les siARN sont des ARN régulateurs générés a partir de longs ARN double brin SOL Les siARN peuvent réprimer l’expression des gones au niveau de la transcription par des modifications de la chromatine 501 B® Histoire des miARN et de VARNi 502 L'évolution et l’exploitation de I’ARNi 504 Le mécanisme d’interférence ARN a til évolué comme un systéme immun ? S04 1” ARNi constitue un outil puissant pour manipuler Vexpression génique 505 @ ARNi et pathologie humaine S506 ARN régulateurs et inactivation du chromosome X 507 L’inactivation du chromosome X crée des individus mosaiques 507 Xist est un ARN régulateur qui inactive un seul chromosome X chez les femelles de mammiferes 507 S08 Régulation des génes au cours du développement et de I’évolution 509 Trois stratégies pour conduire les cellules 4 exprimer des jeux spécifiques de genes au cours du developpement 509 B Technique de « puce @ADN » : théorie et pratique 510 La polarité intrinstque du cytosquelette est responsable de la localisation particuliére d’ ARNm dans les ceufs et les embryons Sil Les contacts cellule-d-cellule et les molecules de signalisation cellulaire sécrétées déclenchent tous deux des changements d’expression génétique dans les cellules voisines 511 Les gradients de molécules sécrétées peuvent conduire | Jules @ suivre différentes voies de différenciation 512 Exemples des trois stratégies d’établissement de l’expression différentielle de genes 513 La localisation cellulaire du répresseur Ash1 contréle le type sexuel de la levure en rendant silencieux le gine HO S13 Un ARNm localisé amorce la différenciation musculaire de l'embryon d’ascidies solitaires 514 Le contact cellule-&-cellule déclenche I’ expression différentielle des genes de la bactérie sporulante : Bacillus subtilis 51S © Généralités sur le cytosquetette : usymiirie et croissance 316 © Présentation du développement de Ciona (la cione) 518Table des matiéres XIX alisation Notch régule Les séquences d’ ADN régulatrices peuvent étre i i jisant des outils La voie de sig é la commutation de destin cellulaire entre la peau et le nerf dans le systéme nerveux d'alignement spécifiques 547 central des insectes 519 L’approche ChIP-chip : la meilleure Le gradient du morphogéne Sonic hedgehog pour identifier des enhancers $49 controle la formation de différents neurones B Méthodes bio-informatiques pour Videniification dans le tube neural des vertébrés 520 d’enhancers complexes 549 19.3 La biologie moléculaire de 'embryogenése Des animaux différents possédent des ensembles de la drosophile 521 de génes remarquablement similaires $52 L’embryogenése de la drosophile. vue d’ensemble 521 De nombreux animaux contiennent Un gradient de morphogéne contréle la régionalisation des genes anormaux 553 dorso-ventrale de l’embryon de drosophile 522 Au plan évolutif, la synténie est ancienne 553 Présentation du développement de la drosophile 524 Exploration des origines humaines par séquencage La segmentation est amoreée par des ARN localisés de fossiles 554 aux poles antéricur et postérieur de l'ceuf non fécondé 526 20.2 Biologie des systemes 555 Bicoid et Nanos régulent hunchback 526 Formalisation des circuits de transcription Le gradient de répresscur Hunchback établit par des graphes 555 les limites d’expression des génes de delétion (gap) 527 L’autorégulation négative amortit le bruit © Role de la synergie d’activation el permet un temps de réponse rapide 556 dans le développement 528 L’expression des génes est bruitée 557 M Cellules souches 530 L’autorégu lation positive retarde Pexpression Hunchback et les protéines de délétion produisent des genes 557 les bandes de segmentation de l’expression des genes 53] Cermains circuits régulateurs sont verrouillés Les gradients de répresseurs de genes de délétion dans des états stables alternatifs 558 produisent.de-nombreuses bandes Les boucles ouvertes (Feed-Forward Loop) sont d’expression génique 533 des réseaux comportant trois nceuds et possédent Des répresseurs tanscriptionnels a courte portée des propriétés interessante: 559 permettent a des enhancers différents . © Bistabilité et hystérésie 560 de fonctionner indépendamment Pun de l'autre - Les boucles ouvertes sont utilisées en phase dans la région MEUaaiee des complexes eve 533 de développement 562 © Sequences régulatrices en cis des genes Certains circuits géndrent des configurations dans le développement animal et l'évolution 534 scillanies . 19.4 Les genes homéotiques, une classe importante de régulateurs du développement 535 Les changements de l’expression des génes ynthétique: des caractéristiques des réseaux de régulation naturels 565 : eg Prospectives 565 homéotiques sont responsables de la diversité ee P . 566 des arthropodes 537 Résumé - Les arthropodes sont remarquablement divers 537 " * Les genes homéotiques de la drosophile sont Partie ci nq organisés de fagon particuliére sur les chromosomes 538 ; Les changements de l’expression de Uhx expliquent Meéthodes 569 les modifications des appendices parmi les crustacés 540 sececeieams i. a Archives photographiques du laboratoire Pourquoi les insectes n’ont pas d'appendices de Cold Spring Harhor s7I sur labdomen ? 540 La modification des appendices de val pourrait 21 tes techniques de la biologie résulter de I’évolution de séquences z . a ADN régulatrices 41 moléculaire 575 Rebuke 42 21.1 Les acides nucléiques 576 L’électrophorése sur gel sépare les molécules 20 Analyse des génomes ee d al a oes n s7 a . x es endonucleases de restriction coupe: a st biologie des systemes 545 les mokécules dADN a des sites speécitique 517 }1 Génomique espera so cieem creemscene nde oa L’hybridation peut étre utilisée pour identifier La bio-informatique facilite identification & grande des molécules d’ ADN spécifiques 578 Echelle des pénes codant des protéines ae Les sondes ehybridation peuvent identifier Les puces & recouvrement tuilé (tiling arrays) des ADN ou des ARN séparés par électrophorése 579 de eénomes complets sont utilisées g La purification dun segment précis d°ADN 580 pour visualiser le transcriptome 546 2 Le clonage 580 Le clonage de l'ADN dans un vecteur plasmidique 580XX 21.2 213 21.4 Table des matiéres Le vecteur est introduit dans I’ organisme héte par transformation 582 Les banques d’ADN sont produites par clonage 582 Lhybridation peut servir 4 identifier un clone spécifique dans une banque d’ ADN 584 La synthése chimique @’oligonucléotides 584 La PCR amplifie un ADN par di cles répétés de réplication in vitro 585 @ Police scientifique et PCR 585 Des series ordonnées de fragments d’ ADN permettent de déterminer les séquences nucléotidiques 587 Séquengage au hasard d’un génome baetérien 588 ® Les séquenceurs permettent le séquencage @ haut débit 590 La stratégie de séquencage au hasard permet un assemblage partie! des grands génomes 590 La stratégie de séquencage des deux extrémités des inserts permet la compilation des super-contigs des grands génomes 591 Un génome humain bient6t séquencé pour 1 000 S 593 Les protéines 595 Des protéines spécifiques peuvent tre purifiées a partir d’extraits cellulaires 595 La purification d’une protéine demande un test d activité spécifique 595 Préparation d’extraits cellulaires contenant des protéines fonctionnelles 595 Les protéines sont séparées les unes des autres par chromatographie sur colonne 595 La chromatographie d’affinité peut faciliter une purification rapide des protéines 597 Séparation des protéines sur gel de polyacrylamide 597 Visualisation des protéines séparées sur gel par des anticorps 598 Séquengage des protéines 598 La protéomique 599 La combinaison de la chromatographie liquide et de la spectromeétrie de masse identitie chaque protéine dans un extrait cellulaire complexe 601 Les comparaisons de protéomes rév@lent des différences importantes entre les cellules 602 La spectrométrie de masse permet aussi de suivre les modifications des protéines 602 Les interactions protéiques apportent une information sur la fonction des protéines 602 Les interactions entre protéines et acides nucléiques 603 La mobilité électrophorétique d'un ADN est changée quand il fixe une protéine 603 La protéine fixée 4 ADN le protége des nucléases ct des modifications chimiques 604 L'immuno-précipitation de 1a chromatine permet de détecter l’association des protéines avec l’ADN dans la cellule 605 La sélection in vitro permet de caractériser le site de fixation d’une protéine sur’ ADN ou sur!’ ARN 606 22 22.1 22.2 223 224 22.5 22.6 Les organisme modéles 609 Les bactériophages 610 Test de la croissance des phages 610, Courbe de croissance & une élape 612 Croisement et test de complémentation avec des phages. 612 Transduction et ADN recombinant 612 Les bactéries 613 Test de la croissance bactérienne 613 Les bactéries échangent de I’ ADN par conjugaison sexuelle, transduction phagique et transformation 614 Les plasmides bactériens peuvent étre utilisés. comme des vecteurs de clonage 615 Les transposons peuvent servir 4 introduire des mutations d’insertion et des fusions de génes et d’ operons. 615 Les études de biologie moléculaire sur les bactéries ont été valorisées par la technologie des ADN recombinants, du séquengage des génomes et du profil transcriptionnel L’analyse biochimique est particuligrement fructueuse chez les organismes simples pour lesqucls on dispose d’outils de génétique traditionnels et moléculaires Les bactéries sont aussi accessibles aux méthodes de visualisation cellulaire Les phages et les bact nous ont apporté la plupart des concepts fondamentaux surles genes 617 La levure de boulangerie Saccharomyces cerevisiae 617 L’existence de cellules haploides et diplotdes 616 616 616 faci analyse génétique chez S. cerevisiae 617 Engendrer des mutations précises s’ effectue facilement chez la levure 618 Le génome de S. cerevisiae est petit et bien caractérisé 618 Les cellules de levure changent de forme pendant leur développement 619 Uarabette Arabidopsis thaliana 619 Le cycle biologique d’Arabidopsis est rapide avec une alternance de phases haploide et diploide 620 Arabidopsis est facilement tansformé génétiquement 620 Le génome d’Arabidopsts est petit et facilement manipulable 621 L’épigénetique 622 Les plantes répondent a leur environnement 622 Développement et plan d’organisation de la plante 623 Le ver nématode Caenorhabditis elegans 623 Le cycle biologique de C. elegans est fugace 623 C. elegans est composé d'un nombre relativement faible de lignages cellulaire 624 Le phénoméne de mort cellulaire programmée a été découvert chez C. elegans 624 Les ARNi ont été découverts chez C. elegans 624 La mouche du vinaigre Drosophila melanogaster 625 Le cycle biologique de la drosophile est rapide 625 Les premires cartes génétiques furent celles de la drosophile 62622.7 Les drosophiles mosaiques permettent d’analyser des génes Iétaux chez l’adulte 627 La recombinase PLP de levure facilite la production des mosaiques génétiques 628 La production de mouches transgéniques portant un ADN étranger est facile 629 La souris domestique Mus musculus 630 Le développement embryonnaire chez la souris depend de ccllules souches 631 L'introduction dun ADN étranger dans un embryon de souris est facile 632 Table des matiéres XXI La recombinaison homologue permet Vinvalidation sélective de genes spécifiques 6 Les souris présentent une hérédité épigénétique 634 Bibliographie 637 Glossaire 649 Index 665 Les différents types d’encadrés : @ Techniques © Pour aller plus loin @ Applications en clinique hunaine @ Expériences clésChimie et Génétique “)opttre 1 La vue mendélienne du monde Chapitre 4 Ltimportance des liaisons a forte énergie © opitre 2 Les acides nucléiques transmettent l'information Chapitee 5 Les liaisons faibles et fortes génétique déterminent la structure . . macromoléculaire © opitre 3. L'importance des interactions chimiques faibles2 Partie 1 “\ LA DIFFERENCE DU RESTE DE CE MA LES CINQ PRE- MIERS itres présentent des notions largement sem- blables & celles qui sont présentées dans les éditions antérieures. Ces notions sont toujours aussi importantes quauparavant, méme &|"époque du séquengage des génomes. Les chapitres 1 et 2 présentent un compte-rendu historique de la maniére dont furent établies la génétique et les bases molé- culaires de hérédité. Les notions et les expériences clés y sont décrites. Les chapitres 3 & 5 présentent la chimie opérant au caur de la biologie moléculaire. Nous y discutons les prin- cipes chimiques fondamentaux qui expliquent les structures des macromolécules traitées si abondamment dans le reste du manuel (l’ADN, ARN et les protéines) et leurs interactions. Bien que la plupart des notions présentées soient identiques & celles des éditions antérieures, certaines parties ont été réo} nisées et des exemples plus récents y ont été introduits. Dans le premier chapiure, nous rappelons les grands événe- ments fondateurs de Vhistoire de la génétique, depuis les fameuses experiences de Mendel sur les pois, expériences dont les résultats ont permis d’établir les lois de I'hérédité, jusqu’a Phypothése de Garrod qu'un géne code une enzyme. Le deuxiéme chapitre décrit le développement spectaculaire de la biologie moléculaire qui a démarré avee la découverte d’Avery que I'ADN constituait le matériel génétique, suivie de Ia proposition de James D, Watson et Francis H. Crick que Ja structure de 'ADN est en double hélice, et puis |’élucida- tion du code génétique et du « dogme central » de I"hérédité (ADN «produit» ARN qui « produit » la protéine). Ce deuxit¢me chapitre sc termine par une discussion des récents développements issus du séquengage des génomes entiers de nombreux organismes vivants et de l'impact du séquencage sur la biologie modeme. La chimie de base présentée dans les chapitres 3 4 5 se foca- lise sur la nature des liaisons chimiques — les faibles et les for- tes — et décrit leurs réles en biologie. Cette présentation s’ouvre avec les interactions chimiqu faibles (liaisons hydrogéne, de van der Waals et interactions hydrophobes) dans le chapitre 3. Ces forces sont celles qui interviennent dans la plupart des interactions entre macromo- Igcules, par exemple de protéine a protéine ou entre une pro- téine et !'ADN. Ces liaisons faibles jouent un réle fondamental dans I’ activité et dans la régulation de la majorité des processus cellulaires. Ainsi les enzymes fixent leur subs- trat_ principalement au moyen interactions chimiques faibles ; les régulateurs transcriptionnels se fixent a leur site sur lamolécule d’ ADN au moyen des mémes types de liaisons faibles pour déclencher ou arréter expression de tel ou tel gene. Les interactions chimiques individuelles de faible énergit sont réellement faibles et, par conséquent, disparaissent ausst vite qu’elles apparaissent. Cette réversibilité des liaisons fai: bles est essentielle pour leur rdle en biologie. A l'intérieur la cellule, les molécules doivent interagir de mani¢re dynami que (d’od la réversibilité association) du systéme qui se bloquerait. Et, en méme temps, certaine; interactions doivent étre stables au moins & court terme. Pout concilier ces impératifs apparemment contradictoires, les sys: (mes biologiques jouent sur le nombre des interactions fai bles. Les liaisons chimiques fortes tiennent ensemble les compo sants dont les macromolécules sont construites. Les uncer non c’est l'ensembl sont composées ‘ides aminés reliés entre eux selon un cer= tain ordre par des liaisons fortes : de méme, |’ ADN est com-, posé de nucléotides. Les atomes dont sont constitués les acides at set les nucléotides sont également reliés entre), eux par des liaisons fortes. Ces liaisons chimiques fortes sont détaillées au chapitre 4. Le chapitre 5 expose comment ces liaisons chimiques faibles, et fortes agissent ensemble pour donner aux macromolécules, leur forme tridimensionnelle spécifique (et par conséquent leurs fonctions propres). De méme que les liaisons faibles sont au coeur des interactions entre macromolécules, de méme, elles peuvent s’établir entre des acides aminés non adjacents dune méme protéine par exemple, et imposer ainsi primaire de cette protéine un repliement tridimensionnel pré- cis. Ce sont également des liaisons chimiques faibles qui tien- nent ensemble les deux brins de la molécule d’ ADN. Dans ce cinquiéme chapitre, nous considérons aussi com- ment l’activité d'une protéine est régulée. L’ une de ces régu- lations est le changement de sa forme tridimensionnelle appelé « transconformation ». Dans une premiére conforma- tion, la protéine peut assurer une fonction enzymatique don- née ou bien fixer une molécule-cible spécifique. Dans l’autre conformation, cette méme protéine peut avoir perdu cette capacité. Un tel basculement de la forme d’une protéine peut étre déclenché par son interaction avec une autre protéine ou a la suite de la fixation d’une petite molécule organique comme un ose, Dans d’ autres cas, une transconformation peut étre déclenchée par une modification covalente. Par exemple, V'addition de un ou de plusieurs groupements phosphate sur une protéine peut lui imposer un changement conformation- nel. Une autre fagon de réguler l’activité d'une protéine est de contrdler le moment et I’ endroit ott elle est mise en présence de sa molécule-cible au sein de Ia cellule. Ainsi, une méme protcine peut étre recrutée pour agir sur différentes molécules- cibles en réponse a des signaux différents. \ lachaineLa vue Menuciueme du monde / Les découvertes de Mendel - > La théorie chromosomique de I’hérédité \ > Laliaison génétique et le crossing-over / © Lacartographie des chromosomes Jest courant de considérer que, parmi tous les orzanis- mes vivants, ]'@tre humain est & part. Nous sonumes les sculs A avoir élaboré des langages compliqués qui nous permeitent d’exprimer des quantités d’ idées et d’ motions: Les grandes civilisations se sont développées et ont mocli- fig notre environnement d’une fagon totalement inconceva- ble pour d'autres formes de vie. De ce fait, nous avons toujours eu tendance & penser que quelque chose de spécial difiéenciait "homme des autres especes. Cette pensée a trouvé plus particuligrement son expression dans les nom- breuses religions par lesquelles "humanité donne un sens & sa destinée, en proposant une explication de ses origines. De cette facon, "homme se dote de régles de conduite qui lui permettent de mener sa vie. TI y a un peu plus d’un sid- cle, il était normal de considérer que, si une vie humaine commence et se termine & des moments précis, espace humaine et les autres formes de vie avaient dé voir le jour aussi 4 un moment préci Cette croyance a été séricusement écornée il y a presque cent cinquante ans quand Charles Darwin ct Allred R. Wallace proposérent leur théorie de l’évolution fondée sur la sélection des individus les plus adaptés. Leur théo- ric expliquait que les différentes formes de vic ne sont pas constantes mais qu’elles donnent continuellement nais- sance a des animaux et Ades végétaux tres légerement dif- férents, dont certains, mieux adaptés, survivent et croissent plus efficucement, A I'époque, ils ne connais- saient pas l’origine de cette variation continuelle, mais ils comprirent correctement que ces nouvelles caractéristi- gues devaient persister dans la descendance pour que ces Variations puissent constituer la base de I’évolution. Au début, les passions se déchaintrent contre Darwin, la plupart venant de ceux qui ne voulaicnt pas croire que les hommes puissent avoir un ancétre commun avec les chim- panzés, ces @tres si ridiculement obsctnes a regarder, méme si cet ancétre avait vécu 10 millions d’années aupa- rav . Ly eut aussi, dans les premiers temps, une assez forte opposition de la part de plusieurs biologistes qui ne 1.5 Lorigine de la variabilité génétique, les mutations 1.6 Les premiéres spéculations sur les génes et sur leur mode d'action 1.7 Les premiéres tentatives pour établir une relation entre génes et protéines trouvaient pas les arguments de Darwin bien convain- cants. Parmi cux se trouvait le fameux naturaliste suisse Jean L. Agassiz, alors professeur 4 Harvard, qui passa de nombreuses années réfuter les propos de Darwin et de son disciple le plus connu, Thomas H. Huxley, qui fut le plus efficace 4 vulgariser les idées de la théorie de 'évolu- tion. Malgré cela, vers la fin du xix* sidcle, Ia bataille scientifique était presque terminée. La répartition géogra- phique des végétaux et des animaux et les apparitions éta gées des fossiles dans les couches géologiques du passé ne pouvaient s‘expliquer rationnellement qu’en émettant le postulat d’une constante évolution des organismes qui se diversifieraient progressivement 4 partir d'un lointain ancétre commun. Aujourd’hui tout le monde accepte la théorie de |’évolution comme une réalité, mis & part un petit groupe de fondamentalistes dont Les objections sont plus du ressort d'une adhésion doctrinaire & des principes religieux que de Ia raison. Une conséquence immediate de la théoric darwinienne est la prise de conscience que la vie a d’abord existé sur notre Terre il y a plus de 4 milliards: d’années sous une forme ts simple, probablement une bactérie — la plus simple forme vivante actuellement connue. L’existence de telles bactéries nous dit que V'essence de la vie peut étre trouvée chez les plus petits organismes. La théorie de I évolution suggere en plus que les principes de base dela vie s’appliquent nécessairement a tous les étres vivants, 1.1) Les découvertes de Mendel Les expériences de Gregor Mendel reposent sur des croise- ments entre des varietés de pois ne différant entre elles que pour des caractéristiques tr’s bien définies, telles que la forme de la graine (lisse ou ridge) et sa couleur Gaune ou verte), la forme de la cosse (pleine ou étroite) et la longueur dela tige (courte ou longue). Son choix de différences bien6 Chapitre 1 La vue mendélienne du monde définies a été d’une grande importance : beaucoup d’ autres avaient tenté auparavant de suivre I'hérédité de caractéres plus comme le poids de lorganisme, mais n’avaient pu rir de régles simples pour leur transmission des parents aux descendants (voir encadré page 6). Le principe de la ségrégation indépendante Aprés s'Gtre assuré que chaque souche parentale était une lignée pure — c’est-i-dire que les descendants d'une souche parentale présentaient toujours les mémes qualités que leurs parents —, Mendel effectua des croisements entre deux parents (P) de lignées différentes qui ne différaient que par une seule caractéristique (comme la forme de la graine ou sa couleur). Tous Icurs descendants (premiere generation filiale = F)) ne Présentaient alors qu’w seul des deux caractéres parentaux. Par exemple, dans un croisement entre une lignée de pois ayant des graines jaunes et une lignée a graines vertes, tous les descendants sont des pois 4 graines jaunes. Le caractére qui apparait dans la descendance en F, est le caractére dominant, alors que le caractére qui n’apparait pas en F, est dit récessif. La signification de ces résultats s’éclaircit quand Mendel effectua un second type de croisements, entre les descendants F, cette fois. Les résultats de ces croisements montrent que le caractére récessif réapparait dans environ 25 % des descendants F,, alors que le caractére dominant s’exprime toujours dans environ 75 % de ces descendants. Pour chacun des sept caracté- res qu'il suivait, le rapport & la génération FP, des individus exprimant le caractére dominant par rapport 4 ceux exprimant le caractére récessif était systématiquement d’ peu pris 3:1. Quand on croise les individus F, qui expriment le caractére récessif entre eux, on obtient des individus F qui expriment tous le caractére récessif. On réobtient ainsi une lignée pure. Les croisements entre individus F, qui expriment le caractére domi- nant donnent deux types de descendants 3 la génération Fy. Un tiers des descendants F; forment une lignée pure pour le carac- tére dominant, les deux autres tiers produisent des descendants F; qui, & nouveau, expriment le caractére dominant ou le Mendel interpréta correctement ses résultats (voir figure 1.1). Les différents caractéres sont chacun contrélés par une paire de facteurs (que nous appelons maintenant génes), un facteur provient du plant male, l'autre du plant femelle. Par exemple, chaque plant de la lignée pure a pois lisses porte deux copies (ou alléles) du gtne de Ja rondeur du pois (RA), alors qu'un plant de la lignée pure a pois ridés portent deux copies de Valléle ridé (77). Les gamétes de la lignée a pois lisses portent tous allele de la rondeur (R) : les gamétes de la lignée a pois ridés portent tous l’alléle ridé (7). Dans un craisement entre des parents RR et des parents rv, la [éeondation produit des plants F, qui portent tous nécessairement deux alléles (Rv). Les graines sont rondes et lisses parce que R est dominant sur r, Quand on se référe 4 P'apparence ou une donnée physique un individu, on parle de phénotype ; quand on se réfere a sa composition génétique, on parle de génotype. Des individus de phénotype identique peuvent présenter des génotypes dif- férents, et la détermination du génotype d'un organisme La propriété la plus étonnante d'une cel- Jule vivante est sa capacité de transmettre se5 proprietés héréditaires d’une généra- tion cellulaire @ la suivante. L'existence de Vhéredite a dO etre remarquée trés tot par Vhumanité, le passage d'une caracteristi- que des parents aux enfants, comme la couleur des yeux ou des cheveux, étant assez évidente. Cependant ses bases phy- siques n’ont été comprises qu’au début du x siécle quand la théorie chromosomi- que de I'hérédité a été établie au cours d'une période de créativité particuliere- ment fertile. La transmission héréditaire par des cellu- les particuliéres, les spermatozoides et les ovules, a été découverte en 1860, et, des 1868, Ernst Haeckel remarqua que les spermatozoides consistent _essentielle- ment en un matériel nucléaire et il postula que le noyau était responsable de I'héré- dité. Vingt ans passérent avant qu'on ne découvre le réle prépondérant joué par les chromosomes dans ce processus, il fallut Les lois de Mendel d’abord identifier les détails de la mitose, de la méiose et dela fécondation. Une fois ces connaissances accumulées, il devint évident que les chromosomes sont les seuls constituants cellulaires qui se divisent et se répartissent en deux lots identiques, entre les deux cellules filles. De plus, les changements chromosomiques compli- qués qui interviennent pendant la méiase, pour obtenir le nombre haploide, furent assez vite compris comme nécessaires pour maintenir constant le nombre des chromasomes des cellules d'une espéce, génération apres génération. Ces faits n’étaient pas tout a fait suffisants encore pour démontrer que les chromosomes Portent l'information héréditaire. La preuve vint a l'aube du »€ siécie avec la découverte des lois de I’hérédité. Les concepts de base furent exposés la toute premiere fois par Gregor Mendel en 1865 dans son article : « Expériences sur I'hybri- dation des plantes » qu'il communiqua a la société des sciences naturelles de Brno. Dans cet article, Mendel décrivait minutieu- sement les profils de transmission de cer- tains caractéres héréditaires chez le pois, il exposait ses conclusions sur les principes de V'hérédité et leur rapport avec la théorie tres controversée de Iévolution. Cependant, a Vépoque, le dimat de l’opinion scientifique n‘était pas favorable a cette approche expérimentale trop innavante, et ses idées furent completement ignorees en depit des efforts qu'il déploya pour intéresser les principaux biologistes de son temps. En 1900, seize ans aprés la mort de Mendel, trois botanistes, qui travaillaient chacun de leur cété sur leur propre organisme vegetal, retrowverent et confirmérent l'importance du travail oublié de Mendel. Hugo de Vries, Karl Correns, et Erich von Tschermak- Seysenegg, tous travaillant sur des expé- riences du méme type que celles de Men- del, obtinrent des résultats concordants entre eux et identiques a ceux de Mendel, sans connaitre les travaux de ce dernier réa- lisés quarante ans auparavant.Parents Gametes Hybride de generation Fy Gamétes fi [ q J Gametes femelles Génération F, FIGURE 1.1 Comment la premiere loi de Mendel (la ségrégation indépendante) explique le rapport 3:1 des phenotypes dominant et récessif dans la descendance F. R représente l'alléle dominant et r, l'alléle récessif. Le phénotype dominant est représente par la graine lisse et le phenotype récessif, par la graine ridée, nécessite souvent des croisements sur plusieurs géné Le terme homozygote caractérise une paire d’alléles pour laquelle l’alléle paternel et l’alléle maternel sont identiques (par exemple, les cas RR et rr). En revanche, lorsque les deux alléles sont différents (le cas Rr) on parle d'hetérozygotic (ow d individu hétérozygote). Un ou plusieurs symboles ou lettres peuvent étre utilisés pour nommer un géne particulier. L’alléle dominant du géne s’écrit en majuscules (R) ou en ajoutant le symbole + en exposant au nom du gene (r*) ou, enfin, & Paide du symbole + sans autre indication (+). L’alléle récessif est toujours écrit en minuscules (7). Il est primordial de bien comprendre qu'un gamete ne con- tiendra qu’un seul des deux all@les de chaque géne présent dans ’organisme duquel il provient (parexemple, l’alléle R ou Valléle r mais jamais les deux) et que les deux types de game- tes (les R et les r) sont produits en quantités identiques. Il y a done une équiprobabilité pour qu'un gamete donne d”un indi- vidu de génération F, contienne un allele précis (R ou r). Cet événement est purement da au hasard. On ne s‘attend pas & mesurer un rapport 3:1 exact dans la descendance F quand on observe un nombre limité d’individus, Certaines fois, le rap- Port sera un peu supérieur, et, d’autres fois, il sera un peu infé- rieur. Mais si lon observe des populations d’individus F, de plus en plus grandes, alors on peut s’attendre que le rapport entre les pois présentant le caractére dominant et ceux qui pré- sentent le caractére récessif "approche de plus en plus exac- tement de la valeur théorique de 3:1 1.1 Les découvertes de Mendel 7 La réapparition du caractére récessif dans la génération F; prouve que l’alléle récessif n’est ni modifié, ni perdu dans les individus (RP) de la génération F,, mais que les alleles domi- nants et récessifs sont transmis indépendamment et done qu ils ségrégent indépendamment lors de la formation des cel- lules sexuelles. Ce principe de la ségrégation indépendante des alléles est souvent appelé Ia premiere loi de Mendel. Certains alléles ne sont ni dominants ni récessifs Dans les croisements étudiés par Mendel, chaque alléle était soit clairement dominant, soit clarrement récessif. Mais cette situation n’est pas systématique. Quelquefois, le phénotype hétérozygote est intermédiaire entre les deux phénotypes homozygotes. Par exemple, le croisement d'une lignée pure de mufliers & fleurs rouges (plante du genre Antirrhinum) avec une lignée pure a flours blanches donne une descendance F, & fleurs roses, Sil’ on croise ces descendants F, entre eux, alors les descendants F, portent des fleurs rouges, roses ou blanches dang la proportion 1:2:1 (voir figure 1.2). Dans ce cas précis, on peut done distinguer les hétérozygotes des homozygotes par leur phénotype. On constate du méme coup que les lois de Mendel s’appliquent aussi dans le cas of Ja dominance d'un alléle n°est pas totale, Le principe de |’assortiment independant “nsuite, Mendel croisa des lignées parentales différant par plus d'un caractére, Comme toujours, il prit le soin de croiser des variétés de pois dont il s‘était assuré au préalable qu’elles Giaient des lignées pures (en croisant entre eux des individus de la m&me lignée). L’une des lignées produisait des graines lisses et jaunes, la seconde des graines ridges et vertes. Comme les caractéres lisse et jaune sont dorninunts sur les caractéres ridé et Vert, tous les plants de la génération F, produisirent des graines lisses et jaunes. Les plants Fy furent cro entre eux et les des- cemlants F; furent alors examinés pour I’ aspect de leurs graines (le phénotype). En plus des deux phénotypes parentaux (lisse ne, ridé vert), deux nouveaux types apparurent (on parle de phénotypes recombinants) : ridé jaune et lisse vert Une fois encore, Mendel parvint a interpréter de fagon cohérente ce nouveau résultat a I’ aide du postulat du géne, en faisant hypothése que les alléles des deux génes sont trans- mis & la descendance de fagon indépendante l'un de l'autre lors de la formation des gametes (voir figure 1.3). Chacun des gamétes ne contient qu'un seul des deux alléles de cha- que géne. Par conséquent, les gametes produits par un plant F, de génotype (Rr ¥y) auront la composition RY, Ry, rY ou ry mais jamais les compositions Rr, Yy, YY ow RR. De plus, les quatre compositions d’alléles possibles sont produites chacune avec la méme probabilité. Les alléles d'un parent n’ont aucune tendance a rester ensemble. De ce fait, les phe- notypes des descendants F, se distribuent dans le rapport de 9 plants & graines lisses et jaunes, pour 3 plants 4 graines lis- ses et vertes, 3 plants & graines ridées ct jaunes, et | plant a graines ridées et vertes. C’est ce que montre le carré du bas de la figure que l’on nomme le carré de Punnett, du nom du généticien britannique qui I’introduisit en génétique Ce principe de l’assortiment indépendant est fréquemment annelé la seconde loi de Mendel.8 Chapitre 1 La vue mendelienne du monde Parents, Gametes ( Génération Fy Gamétes oo Génération Fy, Gametes femelles FIGURE 1.2 Hérédité de la couleur des fleurs chez le muflier. Un parent est homozygote pour des fleurs rouges (AA) et l'autre est homozygote pour des fleurs blanches (aa). II n’y a pas de dominance et les hybrides hétérozygotes F , portent des fleurs roses, Le rapport 1:2:1 des plantes a fleurs rouges, roses ou blanches a la génération F, est expliqué par cette figure. La théorie chromosomique de I’hérédité L’une des raisons principales pour lesquelles les travaux de Mendel furent totalement ignorés de son vivant et longtemps aprés sa mort était, & |’époque, "absence de connaissance sur le comportement des chromosomes 4 la méiose et & la mitose. En. revanche, cette connaissance était acquise quand, en 1900, les travaux de Mendel furent redécouverts. Ce mérite revient au biologiste américain Walter S. Sutton. Dans son article de 1903 désormais classique « Les chromosomes dans I’hérédité », Sut- ton met laccent sur le fait que chaque caryotype diploide con- siste en plusieurs paires de chromosomes homologues, et que Parents es ® RRYY yy ' ' @) Gamétes @ Génération F, @ Rriy © ® om @O @ Late eae Génération F, » 2 @) a @) Gametes (yy) @ RAY // L@\-@ ee Ret, oe ey an . Fy ) Gametes FIGURE 1.3 Comment agit la seconde loi de Mendel ('assortiment indépendant). Dans cet exemple, |’héréedité de la couleur de la graine, jaune (¥) ou verte (y), est suivie en méme temps que I'hérédité de l’aspect de la graine, lisse (A) ou ridé (7). Les alléles R et Y sont dominants sur ret y. Les génotypes des parents et de leurs descendants sont indiqués par des combinaisons de lettres et les quatre phénotypes correspondants sont schématisés par le dessin de la graine. chaque gaméte ne regoit qu'un seul des deux homologues & Vissue de la méiose. II utilisa alors cette information cytologi- que pour expliquer les résultats de Mendel, en proposant que chaque paire d’alléles d'un géne soit portée par une paire de chromosomes homologues. I] émit le postulat que les alléles ¥ et y des graines vertes ou jaunes étaient portés par une paire de chromosomes homologues, et que les alléles R et r des graines lisses et ridées étaient portés par une autre paire d"homologues. Cette hypothése permit d’expliquer immeédiatement le rapport observé de 9:3:3:1 et la ségrégation indépendante. Bien qu’en toute rigueur cet article ne prouve pas la validité de la théorie i chromosomique de Mhérédité, il futexuémement important en mettant ensemble pour la premiere fois deux disciplines jus- que-la indépendantes ; la génétique (avec I’étude d’expérien- ces de croisement) et la cytologie (avec I’étude des structures. cellulaires).1.2 La théorie chromosomique de I'hérédité 9 Les génes sont liés aux chromosomes A Vorigine, toutes les expériences de croise- ment utilisaient des differences génétiques naturelles. C'est ainsi que Mendel utilisait des graines de pois qu'il obtenait chez le graine- tier local, qui devait centainement les obtenir des fermiers des environs. L’existence de multiples formes du méme gane pose le pro- bléme de savoir comment elles surviennent. Une hypothese immédiate est de postuler que les genes peuvent changer (muter) pour donner des variants nouveaux (des génes mutés). Cette hypothése a été canfrontée a l'expérience pour la premiare fois en 1908 par le grand biologiste américain Thomas Hunt Morgan et ses jeunes collaborateurs, les généticiens Calvin B. Bridges, Hemann J a Génération parentale levee 2 phénotype ane) ww W) gametes @) ® [rt Génération F, [Rouge] 2 [Rouge] ¢ 4 ne oe wy = Génération F, [Rouge] 2 [Rouge] 2 [Rouge] é [Blanc]o Na \ ae, 5 ww Ww wy w¥ Muller et Alfred H. Sturtevant. Ils utilisérent comme matériel vivant pour ces etudes la petite mouche du vinaigre, Drosophila mela- nogaster. Le tout premier mutant quills isole- rent était une drosophile male avec des yeux tout blancs, alors que les drosophiles ont des yeux normalement rouges. Le variant a yeux blancs était aopparu spontanément dans une fiole de culture de mouches a yeux rouges. Comme toutes les drosophiles trouvées dans la nature ont des yeux rouges, l'allele don- nant les yeux rouges a été baptisé alléle sauvage ; |‘allale qui donne les yeux blancs 2 été baptisé alléle mutant. La drosophile mutante aux yeux blancs, aalors été immédiatement utilisée dans de Génération parentale Bung phénotype [Rouge]o @ ames @ a Génération Fy [Rouge] 9 ww genotype [Blanc] o rn Génération Fy + [Rouge]? [Blanc] [Rougeld [Blanc] d nombreux croisements (voir figure 1) avec un résultat tres surprenant : le comporte- ment (I'espression) de cet alléle mutant suivait la distribution du chromosome X dans la descendance (c‘est-a-dire que ce géne était lie au sexe). Cette découverte conduisit Morgan et ses collaborateurs 4 suggérer que le géne de pigmentation de l'cail pourrait étre localisé sur le chromo- some X avec les autres genes controlant les caractéres sexuels. Cette hypothése fut tres vite amplement confirmée par les résultats d'autres croisements avec d'autres genes. Beaucoup d'autres génes. mutants trouvés par Morgan sont aussi lids au sexe. lM Figure 1 L’hérédité des génes liés au sexe chez la drosophile. Lesgénes liés aux chromosomes sexuels s'expriment différemment s‘ils sont dans un organisme male ou femelle. Ainsi, un alléle récessif lié au chromosome X s'exprimera chez les males. Cette figure présente deux croisements de drosophiles. Chaque croisement implique un alléle récessif w (pour yeux blancs, white en anglais) d'un géne porté par le chromosome X. (a) Le parent male a des yeux blancs (wy) et le parent femelle a des yeux rouges et est homozygote (WW). (b) Le parent male a des yeux rouges (WY) et le parent femelle a des yeux blancs (ww). La lettre Y ne correspond pas, ici, a un allele mais représente le chromosome sexuel Y présent chez toutes les drosophiles males. II n'y a aucun géne sur le chromosome Y correspondant aux alleles w ou W du chromosome X.10 Chapitre 1 La vue mendélienne du monde ua aison génétique et le crossing-over Le principe de l'assortiment indépendant est basé sur Ie fait que des genes portés par des chromosomes différents se com= portent indépendamment lors de la méiose. Cependant, il arrive souvent que deux génes ne ségrégent pas indépendam- ment l'un de autre parce qu’ils sont localisés sur le méme chromosome (génes liés, voir encadré page 9). Beaucoup de cas de ségrégations non-aléatoires ont été obser- vés dds qu'un grand nombre de mutants étaient accessibles pour les analyses de croisement. Dans tous les cas bien étudiés, le nombre de groupes de liaison est identique au nombre de paires de chromosomes. Par exemple, che la drosophile, ily a quatre groupes de liaison génétique pour les mutants et quatre paires de chromosomes morphologiquement distincts dans les cellules, La liaison n’est jamais compl&te. La probabilité que deux génes d'un méme chromosome restent ensemble durant la méiose est comprise entre presque $0 % et un peu moins de 100 %. Cette variation de la liaison a suggéré qu’un mécanisme d’échange de genes devait exister au sein d'une paire d’homologues. Ce mécanisme est appelé crossing-over, Sa réalité cytologique a été montrée pour la premiére fois par le cytologiste belge F.A. Janssens. Au début de la méiose, les deux chromosomes homolo- gues de chaque paire se rapprochent et s’accolent Fun a Vautre dans le sens de la longueur par un processus d’appariement, 1a synapse. A ce stade, chaque chromosome est dupliqué et porte donc deux chromatides. La synapse place les chromatides céte a céte pour former une tétrade (encore appelée un bivalent), Jans- sens émit I"hypothése que, sous l’effet des tensions qui résultaient de cet accolement, deux des chromatides non-sceurs accolées pouvaient parfois se rompre au méme endroit. Cet événement aboutirait alors 2: des chromosomes cassés dont les segments dis- joints se réassocieraient, mais donc de fagon croisée avec un change de matériel génétique entre chromatides non-sceurs de telle sorte que le segment d’une chromatide se trouverait réasso- cié A Pautre chromatic, et réciproquement (voir figure | 4) De cette maniére, des chromatides recombinantes seraient forméces qui contiendraient un segment dérivé de chacun des chromosomes homologues. La preuye formelle de la réalité de cette hypothése sur l’échange de matériel génétique entre chromosomes homologues lors d°un crossing-over fut appor+ tée vingt ans plus tard. En 1931, Barbara McClintock et Har- rict B. Creighton, qui travaillaient sur le m Vuniversité Cornell, congurent une élégante démonstration cytologique de la cassure lors dun crossing-over (voir figure 1.5). (EE) La cartographic des ch romosom es Thomas Hunt Morgan et ses tudiants n’attendirent pas la preuve cytologique du crossing-over pour exploiter -hypo- thése de Janssen, Leur raisonnement de départ était que des genes localisés 4 proximité l'un de l'autre devaient ségréger ensemble plus fréquemment que des génes éloignés. De 1a, ils passérent trés vite & hypothase que ¢’était un bon moyen de localiser (cartographier) les positions relatives des genes sur les chromosomes pour produire des cartes génétiques. Appariement des chromosomes dupliqués pour former une tétrade Deux chromatides non-sceurs: forment un enjambement au niveau d‘un chiasma Chaque chromatide se casse au niveau du point de contact et fusionne avec le fragment de l'autre classes de recombinaison est particulitrement astucicuse. IIs considérérent d’abord la ségrégation de trois génes localisés sur le méme chromosome, L’arrangement de ces trois genes pouvait Gue déterminé au moyen de trois croisements dans lesquels ils suivaient la répartition de chaque paire de genes possible dans Ia descendance. Un croisement entre AB et ab donnera dans la descendance les deux génotypes parentaux (AB ct ah) et les deux génotypes recombinés (Ab et aB). Un croisement entre AC ct ac donnera les deux combinaison: parentales ainsi que les recombinants Ac et aC, et un croise- ment entre BC ct be donnera les types parentaux et les deux types recombinés Bc et bC, Chaque croisement produit des types recombinés avec une fréquence spécifique. Prenons comme exemple le fait que le premier croisement produise 30 % de recombinants, le second 10 % et le troisitme 25 %. Ce résultat montre que les génes a et ¢ sont plus prés Pun de T’autre que les génes a et b ou b et ¢, et que la distance généti que entre a ct b est proche de celle entre 5 etc. L’arrangement des génes qui correspond le mieux a ces valeurs de fréquence est a-c-b (voir figure 1.6). Lrexactitude de |’ordre des genes suggéré par ces croise- ments & deux facteurs peut étre confirmée de facon non ambi- g2ué par un seul croisement & trois facteurs. Lorsqu’on suit le devenir des trois genes précédents dans le croisement ABC x abc, on observe six génotypes recombings (voir figure 1.7). Ces six génotypes correspondent a trois groupes de paires réciproques. Le plus rare de ces groupes provient d’un double événement de crossing-over. Les génotypes des cla: s les moins fréquentes suffisent alors immédiatement & confirmer ou non I’arrangement postulé. Les résultats de la figure 1.7Génotypes parentaux Matériel extrachromosomique ¢ ¢ Wx We =a =D Si els C wx C wx Bouton Descendance Descendance avec crossing-over c we sans crossing-over e Wx 1.4 Lacartographie des chromosomes 11 FIGURE 1.5 Démonstration des échanges physiques entre chromosomes homologues. Chez la plupart des organismes, les paires de chromosomes homologues ont la meme forme. ‘Cependant, de temps a autre, les deux chromosomes homologues sont différents. L’un d’eux est alors caractérisé par la présence de matériel extrachromosomique a |’une de ses extremités et d'une boule compacte formant un bouton télomérique 4 l'autre extrémité. Mc Clintock et Creighton ont découvert une telle paire d‘homologues dissymétriques et lont utiliseée pour montrer que le crossing-over implique un change réel physique de materiel entre chromosomes. Dans Vexpérience qui est schématisée sur cette figure, la descendance homozygote (c,wx) ne peut apparaitre qu’a la suite d'un crossing-over entre les loci C et wx. Lors de l’examen cytologique des descendants de génotype (c,wx), des chromosomes a boutons télomériques furent observés, ce qui démontre que la région Wx, sans bouton a l’origine, a été remplacée physiquement par la région wx, avec un bouton télomérique. Le chromosome remanié dans le descendant homozygote (c, wx) est identifié par la case colorée. FIGURE 1.6 Arrangement le plus probable de trois genes surla base de trois croisements a deux facteurs. FIGURE 1.7 Utilisation des croisements a trois facteurs pour déterminer |’ordre des genes. La paire la moins fréquente de recombinants réciproques ne peut etre : . | a produite que par un double crossing-over. Les pourcentages donnés pour les { { q } différentes classes sont les valeurs AC BoA OC @ Ae (a oS 8 théoriques attendues pour une ———) a ene SS population de taille infinie. Les valeurs ———=) observées sont soumises a des fluctuations os bo aic b aie b @ é 6 statistiques autour de la valeur théorique | { J { car les populations analysées sont finies. AC B A @ b ALE b Ac 8 Seep deep ep ee ee Woe bog © Boaic Boa b 67,5% 75% 22,5 % 25% Cette classe résulte Cette classe résulte d'un crossing-over entre etc. entre cet b. Cette classe résulte d'un crossing-over d'un double crossing-over entre get ¢, et entre cet b.12 Chapitre 1 La vue mendélienne du monde confirment I’ordre suspecté a lissue des croisements a deux facteurs. Seul l’arrangement a-c-b des génes explique que les types recombings AcB et aCb soient les plus rares. L’existence de crossing-over multiples explique que le taux de recombinaison entre deux génes trés sloignés (a et b dans notre exemple) est habituellement plus petit que la somme des taux de recombinaison entre a etc et entre ¢ et b. Afin d’obte- nir une approximation plus précise de la distance des mar- ign¢s, on calcule la probabilité queurs génétiques les plus (ae x cl) qu'un crossing-over ayant lieu entre les marqueurs c et b, un second crossing-over ait simultanément lieu entre a et ¢ (et vice-versa pour la probabilité ch x ac). Cette probabilité soustraite de la somme des taux de recombinaison précédents. donne alors une valeur plus exacte du taux de recombinaison rée] entre les deux marqueurs les plus éloignés. La formule ab = ac + ch— Xac\cb) est applicable dans tous les cas ot un premier crossing-over naffecte pas la probabilité d’occurrence du second cros over. Malheureusement, une cartographie exacte est perturbée par des phénoménes di interférence qui soit augmen- tent soit diminuent la probabilité de crossing-over simultanés. Sur la base de ce raisonnement, le groupe dirigé par Morgan a l'université Columbia avait, en 1915, localisé plus de 85 genes mutants chez la drosophile (voir tableau 1.1) plagant chacun & un emplacement précis sur l'un des quatre groupes de liaison, & savoir l'un des quatre chromosomes de la droso- phile. Un des résultats les plus remarquables est que les génes dun méme chromosome sont alignés sur ce chromosome. L’arrangement des génes est done linéaire sans jamais présen- ter d’embranchements. La carte génétique de l'un des chromosomes de la drosophile est représentée sur la figure 1.8. Les distances entre les génes sur une telle carte sont mesurées en unités de distance génét que (encore appelées centimorgan [¢M]) qui sont les taux de recombinaison observés entre chaque paire de genes. Ainsi, si le taux de recombinaison entre deux genes est de 5 %, ces deux sont séparés par 5 cM. Les doubles événements de cros+ sing-over étant plus probables entre deux génes tres séparé une mesure en unité de distance génétique n’est exacte que lors. que la recombinaison est mesurée pour des genes proches Méme lorsque les deux génes sont localisés chacun & l'une des extrémités du m&me chromosome, on observe qu ils séeré= gent néanmoins ensemble dans au moins 50 % des cas du fait des crossing-over multiples. Les deux alléles seront séparés si un nombre impair de crossing-over a lieu, et ils ségrégeront ensemble pour un nombre pair de crossing-over. Cela explique pourquoi, aur débuts de analyse génétique de la drosophile, il Gtait souvent impossible de discerner le cas ott les deux genes sont sur des chromosomes différents du cas ot les deux génes sont aux deux extrémités du méme chromosome. Ce n'est qu’avec un grand nombre de génes cartographiés qu’il devint possible de démontrer de fagon convaincante que le nombre, des groupes de liaison entre gtnes mutants est égal au nombre de chromosomes visibles en cytologie, En 1915, Morgan et ses éléves, Alfred H, Sturtevant, Hermann J. Muller et Calvin B, Bridges, publiérent leur travail dans le célébre livre Le Méca nisme de Vhévédité mendélienne, qui le premier présentait Vidée générale selon laquelle les chromosomes constituent |i support matériel de I'hérédité. Aujourd*hui ce concept, avec) ceux de la théorie cellulaire et de la théorie de l’évolution, est Tun des résultats majeurs de notre quéte dans la compréhen- sion de la nature ct du monde vivant. L’origine de la variabilité génétique, les mutations ‘Ces découvertes permirent aussi de comprendre la nature des variations héréditaires que l'on trouve dans le monde biologi- que et qui forment la base de la théorie de 1’ évolution. Les. genes sont copiés 81’ identique pendant la duplication chromo- somique, Cependant, des changements (les mutations) sur- viennent trés rarement, les mutations donnent alors une forme) Normal [Yeux [Alles [Ailes [Ailes (Yeux {Corps _[Pattes longues [Ailes [Antennes rouges] droites] droites] longues]_rouges] (5 tarses)] longus} longues) gris] tin 48,5 31 13 0 cma — = f b d dp al e ; ye eC a de x 2 , \) [Yeux [Ailes [Ailes [Ailes [Yeux [Corps [Dachs] [Ailes [Aristales marron] arquées] courbes] vestigiales] violets] noir] (pattes courtes trapues] (antennes a4 Larses) courtes) Mutant FIGURE 1.8 La carte génétique du chromosome 2 de Drosophila melanogaster.Les 85 GENES MUTANTS CONNUS EN 1915 CHEZ DROSOPHILA MELANOGASTER Nom du géne mutant Groupe 1 Abnormal Bar Bifid Bow Cherry Chrome Cleft Club Depressed Dotted Eosin Facet Forked Furrowed Fused Green Jaunty Lemon Groupe 2 Antlered Apterous Arc Balloon Black Blistered Comma Confivent Cream II Curved Dachs Extra Vein Fringed Groupe 3 Band Beaded Cream ill Deformed Dwarf Ebony Giant Kidney Low crossing over Maroon Peach Groupe 4 Bent Région du corps affectée Abdomen Yeux Vascularisation des ailes Ailes Couleur des yeux Couleur du corps Vascularisation des ailes Ailes Ailes Thorax Couleur des yeux Facettes oculaires Soies Yeux Vascularisation des ailes Couleur du corps Ailes Couleur du corps Ailes Ailes Ailes Vascularisation des ailes Couleur du corps Ailes Marques thoraciques Vascularisation des ailes Couleur des yeux Ailes Pattes Vascularisation des ailes Ailes Aspect général Ailes Couleur des yeux Yeux Taille du corps Couleur du corps Taille du corps Yeux Chromosome 3 Couleur des yeux Couleur des yeux Ailes 41.5 L'origine de la variabilité génétique, les mutations 13 Nom du géne mutant Lethal, 13 Miniature Notch Reduplicated Ruby Rudimentary Sable Shifted Short Skee Spoon Spot Tan Truncate Vermilion White Yellow Jauntry Limited Little crossover Morula Olive Plexus Purple Speck Strap Streak Trefoil Truncate Vestigial Pink Rough Safranin Sepia Sooty Spineless Spread Trident Truncate Whitehead White ocelli Eyeless Région du corps affectée Corps, non viable Alles Vascularisation des ailes Couleur des yeux Pattes Ailes Couleur du corps Vascularisation des ailes Ailes Ailes Ailes Couleur du corps Antennes Ailes Couleur des yeux Couleur des yeux Couleur du corps Ailes Bandes abdominales Chromosome 2 Facettes oculaires Couleur du corps Vascularisation des ailes Couleur des yeux Marques thoraciques Ailes Aspect général Aspect général Ailes Ailes Couleur des yeux Yeux Couleur des yeux Couleur des yeux Couleur du corps Epine dorsale Ailes Aspect général Ailes Aspect général Gil simple (ocelle) Yeux Les mutations se ragroupent en quatre groupes de liaison. Comme la cytologie montre quatre chramosomes, an en conclut que les génes sont lacalisés sur les chromosomes. il est @ noter que des genes différents peuvent agir sur le méme caractére, comme par exemple la couleur du corps.14 Chapitre 1 La vue mendélienne du monde altérée du géne. La plupart de ces formes mutantes — mais pas toutes — fonctionnent moins bien que I’alléle sauvage. Ce pro- cessus est rare par nécessité, autrement beaucoup de génes changeraient & chaque cycle cellulaire et les descendants seraient trés différents de leurs parents. I] y a néanmoins un avantage important & ce que le taux de mutations ne soit pas nul, mais trés petit : c’est une source constante de nouveauté, nécessaire aux plantes et aux animaux pour s’adapter cons- tamment a un environnement physique et biologique chan- geant. De fagon plutét inattendue, les mendéliens ne furent pas reconnus tout de suite par les bio- logistes classiques qui, a cette Epoque, faisaient autorité sur les relations d’évolution entre les diverses formes de vie. ultats des généticiens Les principales critiques portaient sur le fait que les changements génétiques observés par Morgan et ses étudiants étaient de trop petite portée pour permettre |’évo- lution de structures anatomiques radicalement nouvelles, comme I'aile ou l'ail. Ces biologistes pensaient que des « macromutations » beaucoup plus puissantes dans leurs effets, devaient avoir lieu, autorisant ainsi les grandes avancées de |’évolution. Petit & petit, ces doutes s’estompérent pour disparaitre tota- lement, grace aux efforts en génétique de mathématiciens tels que Sewall Wright, Ronald A. Fisher et John Burden Sander- son Haldane. Ces hommes démontiérent que si l'on prend en compte le grand age de la Terre, alors le faible taux de muta- tions mesuré sur la drosophile peut expliquer l’accumulation graduelle de nouveaux attributs favorables, pourvu que ces mutations présentent isolément un avantage sélectif, meme petit. Dans les années 1930. les biologistes étaient de plus en plus nombreux a réévaluer leur syst¢me de connaissance sur Vorigine des espéces et, du méme coup, a s’intéresser aux tra- vaux des généticiens. Parmi ces néo-darwiniens, il y avait le biologiste Julian Huxley (l'un des petits-fils de Thomas Huxley, le vulgarisateur bien connu des travaux de Darwin), le généticien Theodosius Dobzhansky, le paléontologue George Gaylord Simpson et l’ornithologue Ernst Mayr, Dans les années 1940, chacun de ces quatre scientifiques publia une étude majeure démontrant, avec leur propre point de vue, la véritable compatibilité qui existe entre la génétique de Mendel et la théoric de I’ évolution de Darwin. Les premiéres spéculations sur les génes et sur leur mode d’action Presque aussit6t aprés la redécouverte des lois de Mendel, les généticiens commenctrent & spéculer sur la nature chimique des génes et leur mode d'action, Aucun progres récl ne fut possible au début, parce que I"identité chimique du matériel génétique restait totalement inconnue, Méme si l’on savait déja que les chromosomes sont constitués de protéines et dacides nuclciques, la structure de ces diverses macromolé- cules restait encore un mystére. La réflexion la plus fruc- tueuse se foc it sur le fait que les genes devaient, d'une maniére ou d'une autre, se dupliquer eux-mémes. Chaque fois qu'un chromosome se duplique, la structure des g&nes doit &tre exactement recopiée. Cela ouvrait une nouvelle prog blématique chimique de savoir comment une molécule néces- ‘irement complexe pouvait étre tres exactement recopiée. Certains physiciens furent aussi intrigués par le géne, et lors- que la mécanique quantique apparut sur la scéne scientifique, ala fin des années 1920, lidée se fit jour que. pour compren- dre les génes, il faudrait peut-étre leur appliquer les subtilités de la physique la plus récente. Malheureusement, ces idées ne purent s*appliquer car méme les meillcurs physiciens ou les meilleurs chimistes ne pouvaient pas travailler sur une subs tance dont on ne connaissait méme pas la structure. Un seul travail expérimental permit n réflexion : celui de Muller et L.J vert, indépendamment en 1927, que les rayons X pouvaient induire des mutations chez les organismes vivants. Or plus un gene est grand et plus un rayon X ade chances de l'atteindre ; la fréquence des mutations induites par une dose donnée de rayons X est donc une estimation de la taille des genes. Mais, méme dans cette approche, il y avait tant hypotheses a for- muler sur la nature des genes que personne, pas méme Muller ou Stadler, ne prit réellement au sérieux ectte maniére de mesurer les genes. anmoins d°avancer dan Les premiéres tentatives pour établir une relation entre génes et protéines Les premitres tentatives fructueuses pour trouver une relation entre les genes et les protéines ont consisté a examiner quelles protéines seraient affectées par le changement d’un gene. Au début, ces recherches s’avérérent difficiles, notamment parce que personne ne savait vraiment quelles protéines particuliéres formaient Jes structures cellulaires ou anatomiques comme leeil ou laile d'une mouche. Trés rapidement, i] devint clair que l'étude de fonctions métaboliques simples serait beaucoup plus facile que Iétude des génes controlant la forme des struc- (ures anatomiques. Le tout premier exemple fut donné par l'étude d’ une maladie héréditaire qui affecte le métabolisme des acides aminés chez |'homme. Des mutations spontanées ont comme effet de diminuer la capacité de métaboliser la phényla- lanine. Quand des individus homozygotes pour le caractére mutant mangent une nourriture contenant de la phénylalanine, leur impossibilité & la convertir en tyrosine se traduit par 'accu- mulation dans leur sang a un niveau toxique d’acide phénylpy- ruvique. Cette maladie, typique des « erreurs congénitales du métabolisme », suggéra dés 1909 au médecin anglais Archibald E. Garrod que I’alléle sauvage est directement responsable de la présence de l’enzyme nécessaire a la conversion de la phényla- lanine en tyrosine et que, en revanche chez homozygote pour Valléle mutant, cette enzyme est absente de fagon héréditaire. L’hypothise de la relation directe g¢ne-enzyme formulée par Garrod fut relancée dans les années 1930 par plusieurs travaux, sur les pigments de fleurs par Haldane et Rose Scott-Moncrieff en Angleterre, sur la pigmentation des poils du cochon dInde par Wright aux Etats-Unis, sur les pigments des yeux d’insectes par A. Kuhn en Allemagne et par Boris Ephrussi et George W. Beadle, travaillant d’abord en France puis en Californie. Dans tous les cas, les résultats obtenus démontraient qu'un géneparticulier affectait une ctape précise de la formation du pig- ment. Son absence, chez le mutant, change la couleur de Vorgane étudig, comme la coulcur de Pceil de la drosophile qui ermillon. Cependant, l’absence de connais- passe de rouge a sance fondamentale sur a structure des enzymes correspondan- tes empéchait toute analyse plus poussée de la relation entre gene et protéine. De méme, il n’était pas certain que la plupart des genes contrdlaient la synthése des protéines ni méme que toutes les protéines étaient sous contdle génétique. Des 1936, les généticiens mendeélicns s’apergurent qu’ils arrivaient a une sorte de cul-de-sac conceptucl pour com- la mani@re dont les génes fonctionnaient. Hs prendre RESUME Résumé 15 devraient plutét trouver des objets biologiques plus accessi- bles a analyse chimique. Ils étaient conscients que les connaissances de I’époque sur les acides nucléiques et les protéines étaient complétement inadéquates pour une approche de chimie fondamentale méme avec le meilleur systéme biologique. Fort heureusement, les limites de la chimie ne les ont pas découragés d’apprendre a faire des experiences de génétique avec des moisissures, des bacté- ries et des virus. Et, comme nous allons le voir, les faits chi- miques nécessaires pour comprendre la relation entre géne et protéine devinrent disponibles au moment ot ils étaient préts a les utiliser. @ L’hérédité est assurée par les chromosomes qui sont les porteurs cellulaires des genes. Les facteurs hérédi- taires ont été découverts et décrits en 1865 par Mendel. mais leur importance n’a été comprise qu’au début du siecle. Chaque gene peut exister sous une diversité de formes dénommées « allales », Mendel émit ’hypothése que le facteur héréditaire (ce qu'on nomme aujourd'hui le gne) de chaque caractére est domné par chaque parent & chacun de ses descendants. @ La base de ce comportement est la ribution des deux chromosomes homologues & la méiase. Un seul de ces deux homologues (choisi au hasard) est distribué dans chaque cellule sexuelle (gamete) haploide. @ Quand deux génes sont localisés sur le méme chromo- some, ils ont tendance a ¢tre hérités ensemble (genes liés), Des rentes peuvent Gtre hérités indépendamment parce qu’ils sont localisés sur des chromosomes différents. I est cependant rare que la liaison soit totale parce que les chro- mosomes homologues s’accolent Fun 4 autre pendant la méiose. Une cassure peut alors survenir qui conduit a un échange de segment de chromatides (par crossing-over). Le crossing-over, par exemple, peut transférer certains alléles initialement portés par le chromosome paterne! sur le chromosome maternel. énes qui contrdlent des © Les différents alléles d’un gene proviennent de chan- gements héréditaires (les mutations) qui touchent le gene lui-méme. Habituellement, les genes sont exuCme- ment stables et sont recopiés trés exactement lors de la duplication des chromosomes. Les mutations ne survien- nent que rarement et sont le plus souvent nocives. En revanche, I'effet d'une mutation est quelquefois bénéti- que. C’est accumulation de mutations rares et favorables qui fournit la diversité génétique qui est présupposée par la théorie de |’ évolution. @ Pendant longtemps. la structure des genes et la chimie par laquelle ils contrélent les fonctions cellulaires sont restées un mystére. Dés qu'un grand nombre de génes mutants furent décrits, il apparut clairement qu'une rela~ tion « un géne-un caractére » n’existe pas ct que tous les caractéres complexes d’un organisme sont sous le contréle de plusieurs genes. H L'idée la plus sensée, proposée par Garrod dés 1909, est que les génes agissent sur Ia symthése des enzymes. Malheureusement, les outils des généti- ciens de l’époque — des organismes comme le mais, la souris et la drosophile — n’étaient pas adaptés a Tétude chimique détaillée des relations entre génes et protéines. Cette étude, qui devenait indispensable, allait prendre son essor avec des organismes beau- coup plus simples.Les acides nucléiques transmettent l’information vénétique > La découverte inattendue d‘Avery : I'ADN peut porter des spe as génétiques 22 Ladouble hélice 2 L'information génétique contenue dans ‘ADN est comprise dans la s@quence des quatre nucléotides es généticiens ont enyisagé que des molécules spé- l cifiques étaient porteuses d’informations généti- ques bien avant que les chimistes ne s’intéressent a cette question. Dés les années 1930, les généticiens ont commence a réfléchir aux types de molécules qui pour- raient avoir les propriétés de stabilité inhérentes aux genes tout en Eiant susceptibles d’étre modifices de fagon perma- nente ct de muter, afin de servir de base a I’évolution Jusqu’au milieu des années 1940, aucune approche ne sem- blait possible pour déterminer Ia structure chimique du gene. On savait que les chromosomes contenaient de Vacide désoxyribonucléique (ADN). En dépit de cela, il n'y avait aucune preuve que I ADN soit porteur de Vinfor- mation génétique ; il pouvait, simplement, servir de sup- port moléculaire pour une classe, encore 4 découvrir, de protéines spécifiquement concues pour porter !"informa- tion génétique. On supposait que les génes devaient Cire composes d’acides amines parce que, a I'époque. elles semblaient étre les seules molécules biologiques suffisam- ment complexes pour porter cette information. Par conséquent, approcher la nature du géne en se demandant comment les génes fonctionnent dans des cel- lules prenait tout son sens. Au début des années 1940, des recherches sur le champignon Neurospora, menées par Georges W. Beadle et Edward Tatum, accumulérent des prewves de plus en plus fortes pour soutenir Mhypothése Vieille de trente ans @’ Archibald E. Garrod, selon laquelle les génes fonctionnent en contrélant la synthése d"enzy- mes spécifiques (hypothése un géne-une enzyme). Ainsi, Stant donné que toutes les enzymes connues étaient des proicines, le probleme principal était de déterminer com- Ment l'information génétique contenue dans les genes permet la synthése des protéines. Depuis le début, V hypo- thése la plus simple était que l'information génétique pré- 24 Le «dogme central » 2.5 L'établissement de la direction de la synthése protéique 26 Uére de la génomique sente dans les génes détermine lordre dans lequel se suecédent les 20 acides aminés différents dans les chaines polypepticiques des protéines. Pour tester cette proposition, les meilleurs biochimistes eurent besoin de beaucoup d'intuition et d'imagination, parce qu'il n’y avait aucune facgon logique utiliser des enzymes pour determiner |’ordre de chaque acide aminé ajouté & une chaine polypeptidique. Un tel schéma exi- geait, pour la synthése d'une protéine, autant d’enzymes agissant séquentiellement qu'il y a d’acides aminés dans la protéine en question. Comme toutes les enzymes con- nues A cette époque étaient elles-mémes des protéines (nous savons maintenant que l’ARN peut également agir en tant qu’enzyme), cela impliquait que d'autres enzy- mes, elles-mémes agissant séquentiellement, Claicnt nécessaires pour la synthése des enzymes précédemment citées, Cetic situation posait un paradoxe, 4 moins de sup- poser une extraordinaire série de synthéses intercorrélées dans lesquelles une protéine donnée aurait eu différentes spécificités enzymatiques, Avec une telle hypothése, il eut été possible (bien que trés difficile) de concevoir une cellule pouvant fonctionner. On n’a pas pensé, cependant, que la plupart des protéines puissent réaliser de multiples fonctions. En fait, les connaissances du moment favori- saient 'hypothése une protéine-une fonction. Bl La découverte inattendue d Avery : I'ADN peut porter des spécificités génétiques Lidée que F ADN puisse étre la molecule génétique cle. émergea de facon inattendue, a partir d'études sur les bactéries responsables de pneumonies. En 1928, un18 Chapitre 2 microbiologiste anglais Prederick Griffith fit observation surprenante que les souches bactériennes non virulentes deviennent virulentes lorsqu’elles sont mélangées avec des souches virulentes tuées par la chaleur, C’est en utilisant les descendants des souchces devenues récemment pathogtnes pour transformer de nouveau d'autres souches non pathogé- nes qu'il acté montré qu’unc transformation de la non-virw lence vers 1a repose sur des changements héréditaires. Cela aboutit & la possibilité que lorsque des cel lules pathogénes sont tuées & Ja chaleur, leurs composants éliques ne sont pas cudgrmmages. De plus, unc fois libéré de la cellule wée a Ja chaleur, ce com- posant peut passer A travers la paroi de la cellule réceptrice vivante et ensuite subir des recombinaisons génétiques avec le matériel pénétique de la cellule réceptrice (voir figure 2.1). Des recherches ultériewres ont confirmé cette inlerprétation. La pathogénicité est chte a un géne qui code une enzyme clé impli- quée dans la synthése de la capsule, composée d' hydrates de carbone, et qui entoure la plupart des bactéries responsables de pneumonies. Quand l'alléle $ (Smooth, « lisse ») de la capsule une capsule est formée autour de la cellule, ce qui ire & Ta pathogénicité (Ja formation d*une capsule est également responsable de l’aspect lisse des colonies formées & partir de ces cellules). Quand Valléle R (Rough, « ragueux ») de ce wbne est présent, il n’y a pas de capsule formée, les cellule. en question ne sont pas pathogancs et les colonies issues de ces cellules sont rugueuses sur les bards. Dans les années qui suivirent les observations originales de Griffith, 1a été monn que autres cxtraits de bactéries wées étaient capables Winduire des transformations héréditaires ct des recherches furent engagées afin de déterminer Videntité chimique de l'agent transformant, A cette époque. la grande majorité des biochimistes pensaient encore que les génes staient des protéines. Ce fut donc une grande surprise quand virulence cap! (gene Fle APSO) creerosome 3 Capsule ‘ S as Y : i » Tuée la chalour _{/ ~ : \ ‘ ‘ Fragment | = caps libéré Cellule § lisse (smavdt) pathogene Cellule & rugueuse (rough) non pathogéne Les acides nucléiques transmettent l'information génétique en 1944, apres dix ans de recherches. le microbiologiste amé- ricain Oswald T. Avery et ses collégues de Rockefeller Insti- tute & New York, Colin Mae? cod ct Maclyn McCarty, firent Vannonce capitale que le prin is tait dy VADN (voir figure 2.2). Les experiences clés entérinant leurs conclusions montraient que l'aclivilé de transformation de leur Jraction active purifiée pouvail éwe detruite par la désoxy- ribonucléase, une enzyme récemment purifiée qui dégradait spécifiquement les molécules d’ADN en nucléotides mais qui mavail aucun effet sur l"intégrité des molécules protéiques ou sur TARN. A Lopposé. laddition de ribonucléase (qui dégrade ARN) ou de différentes enzymes protéolytiques (qui dégradent les protéines) n’avail pas d’influence sur I acti- vité de transformation. Les génes viraux sont également des acides nucléiques Des confirmations toutes aussi importantes vinrent des études chimiques sur les virus et les cellules infectées par les virus, En 1950, i] était possible d*obtenir pour un certain nombre de virus des préparations quasiment pures et de détcrminer quels types de molécules étaient présents dans ces virus. Ce travail a conduit dla généralisation trés importante que tous les virus conticnnent des acides nueléiques. Commie & cette époque on commengait A réaliser que les virus contenaicnt du matériel génétique, la question qui s'est posée immediatement fut de savoir si acide nucléique était le porteur des gnes viranx. Un test crucial vint de l'étude isotopique de la multiplication de ‘L2, un virus baciérien (appelé baetériophage ou phage) com- pose d'un cieur @ADN ct d'une enyeluppe protectrice consti- tuée de l'agreé'gation de différentes molécules protéiques. Dans ces eapsriences, réalisées en 1952 par Alfred D. Hershey et Martha Chase qui travaillaient au laboratoire de Cold Spring Harbor 8 Long Island. New York, les protéines de |"enveloppe Recombinaison } et division cellulaire + Entrée dun fragment de chromosome provenant d'une cellule cap§ dans une cellule R Cellule § FIGURE 2.1 Transformation des caractéristiques génétiques d'une bactérie (Streptococcus pneumoniae) par addition de cellules ‘tuées par la chaleur provenant d’une souche génétiquement différente. Ici nous observons une cellule & recevant un fragment chromosemique contenant le géne de la capsule d’une cellule S traitee a la chaleur. Bien que la plupart des cellules R recgoivent des fragments chromosomiques, I'efficacité de transformation pour un gene donné est généralement inférieure a 1%.2.4 La découverte inattendue d‘Avery : 'ADN peut porter das spécificités génétiques 19 cap ee Cellule 5 (lisse) pathogene Cellule ® (rugueuse) nor pathogéne Recombinaison et division cellulaire FIGURE 2.2 Isolement d’un agent transformant chimiquement pur. (Adapté, avec permission, de Stahl F.W. 1964. The mechanics of inheritance, Fig. 2.3 © Pearson Education, Inc.) Elaient margquges avec Misotope radioaetif *°$ et Te cceur @ADN, avec Visotope radioactif 2P, Le Ctaien| alors utilisés pour suivre le devenir des protéin Dhage et de virus tarqués du ide nuckéique lors de la multiplication virale, afin de savoir quels atomes marqués du phage parental Protéine de l'enveloppe marquée au “35 ~ADN marqué au 32? Mélange des particules | virales et des cellules hétes vive agilaton — Protéine « fantome » marquée au 55. ADN marque au 22P Multiplication du chromosome )| viral et production de nouveaux phages Liberation: des nouvelles particules virales FIGURE 2.3. Démonstration montrant que seul TADN du bactériophage T2 porte l'information génétique et que la protéine de envelappe sert uniquement de coque protectrice. entraient dans la cellule héte et apparaissaient par la suite dans Ja descendance des phages. Des résultats sans amb nergdrent de ces expériences rande partic de acide nucléique parental fut détectée uni dans la descendance, sans aucune protéine parentale (voir figure 2,3). ll fut méme possible de voir que ues peu de pro- dines parentales entraient dans la bactérie mais restaient plu- tot attachées @ lextérieur de la bactérie, ne jouant plus aucun role une fois que 1 ADN avait péneiré dans la cellule, Ce point fut clairement montré cn agitant violemmeat les bactéries apres l’entrée de | ADN dans Tes cellules ; les protéines de lcnveloppe furent enlevécs des cellules sans que cela n’aflecte la capacité des bactéries a former de nouvelles parti- cules phagiques, Avec certains virus. i] est maintenant possible de réaliser une expérience encore plus convaineante. Par exemple, [ADN purifié & partir du virus du polyome murin peut entrer dans les20 Chapitre 2 cellules de souris et initicr un cycle de multiplication virale aboutissant & la production de plusieurs milliers de nouvelles particulcs virales. I. fonelion principale des protéines virales est de protéger et transporter Pacide nucléique d’ une cellule héte 4 une autre cellule héte. La double helice Pendant que le travail progressait sur analyse aux rayons X de la structure des protéines, un petit nombre de scientifiques: essayail de résoudre Le profil de diffraction aux rayons X de TADN. Les premiers profils de diffraction furent obtenus en 1938 par William Asthury en ulilisant de PADI qui lui avait été fourni par Ola Hammarsten ct Torbjéra Caspersson. TI fal- jut attendre le début des années 1950 pour que des photogra- phies de diffraction aux tayons X de bonne qualité soient obtenues par Maurice Wilkins ef Rosalind Franklin (voir figure 2.4). Ces photographies suggéraient non seulement que Ja strneture de |"ADN était hélicoidale mais également que cet ADN it composé de deux ou trois chaines polynuctéotidi- ques. A la méme époque, la présence de liaisons covalentes au nivean de TAD! En 195; chimistes organic der Todd montra que des liaisons phosphodiester 3°-5° nt ensemble les nucléotides de ? ADN (v ison de [in suscité par la structure de hélice &, motif prowique découvert par Linus Pauling (voir chapitre 5), une séduisante théorie de diffraction des molécu- les hélicotdales fut développée par William Cochran, Mrancis un groupe de FIGURE 2.4 La photographie aux rayons X quia permis Pélucidation de la structure de I'ADN. Cette photographie, prise par Rosalind Franklin au King’s College 4 Londres, durant V’hiver 1952-1953, a permis de proposer que 'ADN était hélicoidal. La forme d'hélice est indiquée par le dessin de la croix issue de la réflexion des rayons X au centre de la photographie (mesurée par impression d’un film autorediographique). Les zones trés sombres, en haul et en bas, révélent l'empilement régulier des bases puriques et pyrimidiques, d'une épaisseur de 0,3-0,4 nm, les unes au- dessus des autres, perpendiculairement a l’axe de I'hélice. (Imprimé, avec permission, de Franklin R.E. and Gosling RG. 1953. Nature 171: 740-741. @ Macmillan.) Les acides nucléiques transmettent ‘information génétique IL Crick et Vladimir Vand. Cette théorie permit de tester dif- férentes structures possibles del’ ADN sur la base essai/erreur. La bonne solution, unc double hélice complémentaire (voir chapitre 6) fut trouvée par Crick et Watson en | 953 lorsquils travaillaiemt dans le laboratoire de Max Perutz. et John Ken- drew a Cambridge au Royaume-Uni. La découverte de la bonne solution fut le résultat de la recherche d'une configuras tion stéréochimique compatible avec Tes données de ditfrac- tion aux rayons X de Wilkins et Franklin. Dans la double hélice, les deux brins d’ADN sont retenus ensemble par des liaisons hydrogéne (voir chapitre 3) entre les paires de bases de brins opposds (voir figure 2.6). Cet appariement de bases est trés spécifique : ka base purique adé- nine (A) forme une paire de bases uniquement avec la base pyrimidique thymine (T). alors que la base purique guanine (G) ne forme une paire de bases qu’avee la base pyrimidique cytosine (C). Dans Ja double hélice d°ADN, le nombre de résidus A doit éwe égal au nombre de résidus T, il en ext de méme pour les 1ésidus G ct € (voir encadré page 21). IL en résulte que les séquences en bases des deux brins d'une dou- ble hélice d’ADN sont complémentaires et done que la séquence d'un brin dP? ADN permet de définir exactement la séquence du brin complémentaire, La découverte de la dou- ble hélice a profondément révolutionné la fagon dont les généticiens analysérent par la suite leurs données. Le gene n’était plus 4 présent une mystérieuse entité avec laquelle 1 UK ae N l Extrérnité 5° OT q Adénine WH el H | | hy o 2 ” mM, | s ° eos 1 5 | ° ° H : i Guanine | aM ° N N NO liaison] t ‘ | phesphodiester ea) ay H L 3 ye | Thymine oo Extrémité 3° FIGURE 2.5 Portion d'une chaine polynucléotidique d’ADN montrant les liaisons phosphodiester 3’ — 5‘ qui relient les nucléotides. Les groupes phosphates connectentle carbone en 3’ d‘un nucléotide au carbone en 5‘ du nucléotide suivant.2.2 Ladouble hélice 21 2 biochimiste Erwin Chargef? a utilsé la echnique agvelée « chrornatographie sur pour analyser a compasilior an 3 de !ARN. En 1949 ses con- Les régles de Chargaff permis de considérer l'eventualité d‘un agencerent précis des ruciéalides dans la molécule d’ADN lui confé-ant sa spécili- che génétique. fés.dus Quanine (G) était égal 4 calui de rési- dus cytosine (C). En olus, indépendamment de la source d’ADN, le report de purines nées ont montré que nen seulement ‘es quatre nucléolides ne sont pas présents cn yuantilé gale, mais dgalemen: que les fapp xacts We CCS Quatre nuclectides varient c’une espéce a l'autre (tableau 1 de cet encadé). Ces aécouvertes ont Lenonbre de rési Les expsriences de Chery ment moncré que les rapports rclati*s des quale bases n‘étaient pas dus au “esard. adénine (A) cars tous les échantilions d°ADN état égal au nom- bre ce résidus thymine (Tj, et celui de sur pyrimidines est toujours approxin meni égal 4 1 (purines = pyrimidines). la ignification fondamentale des relations AsTetG=C (ragles ce Chargaff) ne pou- vait Das apuaraltre, avant cu'une attention particuliére ne soit donnée a la structure vi- dimensiannelle de ABN. ff ont égale- DONNEES PERMETTANT LA FORMULATION DES REGLES DE CHARGAFF scutes Adénine Thymine | Adénine Guanine Purines sur Guanine sur Cytesine sur Thymine sur Cytosine sur Pyrimidines boeuf 1,29 1,43 1,04 1,00 1 Homme 1,56 1,75 1,00 1,00 1,0 Poule 1,45 1,29 1,06 0.91 0,99 Saumon 1,43 1,43 1.02 1,02 1,02 Ble 1,22 1,18 1,00 0,97 0,99 levure 1,67 1,92 1,03 1,20 1,0 Hemophilus influenza 1,74 1,54 1,07 0,91 1,0 Escherichia colf KZ 1,05 O95 1,09 0,99 1,0 Bacille dela tuberculose 0,4 0,4 1,09 1,08 WwW aviaire Serratia marcescens 0,7 07 0,95 0,86 0,9 Bacillus schatz 0,7 06 1,12 0,89 1,0 Diaprés Chargaff E. et al, 1949, J, Bol, Chem, 177:405, seules des approches d'expériences de génétique étaient envi- Sageables. Au contraire ADIN devenait une molécule en tant que telle sur laquelle les biuchimistes pouvaient se pencher objectivoment comme ils le faisaient auparavant avec des molécules comme le pyruvate ou PATP. Le plus interessant Gependant ne vint pas simplement du fait que Ta structure Giait Fesolue, mais vint aussi de Ja nature méme de la structure. Avant qu'elle ne soit connue, les chercheurs craignaient que la découverte de la structure de TADN ne soit décevante, en Ce sens yu'elle ne permettrait pas de comprendre comment les génes fonctionnaient et comment ils étaient répligu Heureusement, cette découverte fut A Vinverse extrémement Promettcuse. Les deux brins entrelacés de structure complé- Mentaire sug; ent @emblée qu'un des brins servait de Matrice “partir de laquelle le deuxieme brin était synthétisé (voir figure 2.6). Si cette hypothese se 1évélait éire la bonne, alors le probléme fondamental que représentait la réplication des genes qui déconcertait les géncticiens depuis si long- temps, serait convepructiement résalu, La découverte des polymérases qui synthétisent ‘ADN Tl fallut attendre le développement des tests de syntlitse W@ADN tn vilro pour démontrer formellement qu'un simple brin d"ADN pouvail servir de matrice permettant la synthése @un brin d7ADN complémentaire, Cola ariva plus rapide ment que ne limaginaicnt les généticiens moléculaires, tant le Monde dans lequel ils Cvoluaient était éloignd de celui des bio chimistes habitués aux procédures requises pour isoler des enzymes, Fn 1956, le biochimiste américain Arthur Komberg fat Pun des premiers & s’attaquer a La forteresse que représen- tait la question de Ja réplication de PADN. en réussissart 2. synthétiser de ’ADN a partir d’extraits acellulaires de bacté- vie. Dans les années qui suivirent, Kornberg parvint & monire qu'une enzyme de polymerisation spécifique ctait nécessaire pour catalyser la liaison entre les unités Glémentaires de struc- tures, éléments précurscurs de !’ADN, Les travaux de Komn- berg révélérent que les précurseurs de YADN étaicnt des22 Chapitre 2 Les acides nucléiques transmettent l'information génétique Ancien Ancien Sy = Ancien Nouveau Nouveau Ancien FIGURE 2.6 La réplication de l'ADN. Le brin nouvellement synthétisé est indiqué en orange. eu COMPARAISON DE LA COMPOSITION EN BASES D'ADN sYNTHETISES PAR UNE ENZYME nuclcotides riches en énergie (GATP, dGTP, dCTP et dTTE voir figure 2.7). Les études ultéricures ont permis de acai qu’un simple polypeptide, l’ADN polymérase I (ADN Pol Dj lait capable de catalyser la synthése d'un nouveau brin @ADN en associant les précurscurs nucléotidiques par deg liaisons phosphodiester 3°-5' (voir figure 2.8). De plus, cela fonctionnait uniquement en présence d’ADN, qui est néces. saire pour ordonner tes quatre nucléotides dans le produit polynucléotidique final. 1." ADN Pol 1 est tributaire de la matrice d’ ADN pour déterminer la séquence d’ ADN qui doit tre synthélisée. Cela a été démontré pour la premiére fois e! faisant fonctionner enzyme cn présence de molécule: WADN qui contenaient des quantités variables de paires d bases A:T et G:C. Dans chaque cas, le produit de cette syn. thése enzymatique avait le méme rapport de bases que I matrice ADN (tableau 2.1). Lors de cette synthase acellulaire, il ny avait aucune synthése de protéines ou de toules autres Classes de molécules, éliminant sans ambiguité la possibilité de composés non-ADN comme étant des intermeédiaires por; teurs dle spécificités genétiques.. Les preuves expérimentales en faveur dela séparation des brins d’ADN lors de la réplication| En 1958, en méme temps que les travaux de Komberg, Mat: thew Meselson et Franklin W, Stahl du California Institute of Technology mirent én place une expérience intéressante dang laquelle ils s¢parérent les molécules d’ADN aprés synthése et démontrérent que les deux brins de la double hélice initial étaient séparés de fagon definitive l'un de l'autre lors de | réplication (voir figure 2.9), Leur succts était dé en partie Vutilisation de l'azote radivactif SN, isotope lourd, comme éti quette pour marquer de fagon dillérenticlle les brins d’ADN parentaux des brins d’ADN néosynthétisés. Les bactéries en croissance dans un milicu contenant de l’azote radioactif ) ont un ADN plus dense que celui des bactéries en er dans des conditions mormales avec de Vazote non) radioactif |'N. Ce qui contribua Egalement a la réussite d lexpéricuce fut Pélaboration de protocoles permettant dé séparer PADN lourd de l’ADN Iéger sur un gradient de den= sité, en présence de sels lourds tels que le chlorure de césium. Lors de La centrifugation, la solution devenait plus dense en bas: AVEC LA COMPOSITION EN BASES DE LEURS MATRICES D‘'ADN Composition en bases du produit synthétisé Source de la matrice ADN Adénine Micrococcus lysodeikticus 0,15 (bactérie) Aerobacter aerogenes 0,22 (bactérie) Escherichia coli 0,25 Thymus de veau 0,29 Phage 72 0,32 Thymine 0,15 0,22 0.25 0,28 0,32 A+T A+T Gsc Gee Guanine Cytosine Dans le produit Dans la matrice 0,35 0,35 0,41 0,39 0,28 0,28 0,80 0,B2 0,25 0,25 1,00 0,97 0,21 0,22 1,32 1,35 0,18 0,18 1,78 1,842.2 Ladoublehélice 23 Nucléoside : Désoxyeytidine Désoxythymidine aaa aaa ne Base pyrimidique cytosine (ADN) thymine (ADN) HO NZ N OH Sucre : désoxyribose désoxyribose es — Nucléotide + décexyey’ -phosphate désoxythymidine 5'-phosphate Nucléoside : désoxyaclénosine désoxyguanosine f 7 r Base purique : adénine (ADN) guanine (ADN) i lll TH N' N* | H Suere : désoxyribose désoxyribose ! fe i J Nucléotide: _désoxyaciénosine 5'=phosphate désoxyguanosine 5’-phosphate FIGURE 2.7 Les nucléotides de I'ADN. Les structures des différents composants de chacun des quatre nucléotides sont indiquées. 5 Adénine-désoxyribose triphosphate sf A i oH oH ADN polymérase Pyrophosphate eo Pyrophosphatase Phosphate @ Be ZS la synthase enzymatique d'une chaine dADN catalysée par 'ADN polymérase | Cette illustration mentre |'aditon dun ie ide = un brin @’ADN en synthése, catalysee par ADN polymerase. Bien que I'ADN polymerase puisse catalyser la synthese de 4 Par elle-méme, dans la cellule la molécule de pyrophosphate relarquée est rapidement convertie en deux phosphates par une zyme appelée pyrophosphatase, empéchant la réaction inverse de se produire et favorisant ainsi la réaction d’addition de nucléotides.24 Chapitre 2 du tube de centrifugation (qui, durant la rotation, est Pextré mité La plus éloignée de l'axe de rotation). Si la solution choi Gait dla bonne densité, les molécules d’ ADN migraient vers la région du tube de centrifugation ot leur densité était fyale a celle de la solution saline. Dans cette situation, les molécules @ADN dont les deux brins étaient composcs entigrement de précurseurs !°N (ourd-lonrd ou ADN LL) formaient une bande dans une zone correspondant & une densité plus clevée (proche du fond du tube) que des molécules d’ADN dont les se brins étaient composes entigrement de précurseurs ''N éger léger ou ADN 11}. Si des bactéries contenant de 'ADN a étaient transférées dans un milieu « léger » (contenant du TN) et mises en croissance, les précursenrs nucléotidiques dis- ponibles pour la synthése d’ ADN seraient dits des précurseurs ers : PADN synthctisé apres le wanslert serait différenciable de l ADN synthétisé avant Ic transfert. Si la réplication de | ADN implique la séparation des deux i il est possible de prédire la densité des molécules ADN obtenues aprés différents temps de croissance dans un milicu « léger ». Aprés une génération, toutes les molécules ie Bactéries en croissance Transfert dans un milieu contenant du '?N; louL ADIN est laurd contenant du 'N \‘ADN isolé 4 partir des cellules est mélangé 3 unc solution Croissance bactérienne dans un milieu dans le milieu contenant du '!N Les acides nucléiques transmettent l'information génétique @ADN devraient contenir un brin lourd et un brin léger et devraient avoir une densité intermédiaire (lourd-I ADN LI). C'est exactement le résultat expérimental observe par Meselson et Stahl. De plus, aprés deux générations. la moitié des molécules WADN étaient Iégeres et la moitié hybride, un résultat prédit exactement par la proposition de séparation des brins durant la réplication. Il est important de noter que pendant lisolement a partir des bactéries, ’ ADN etait cassé en petits fragments, ce qui permettait a la majorité de ces petits fragments d'étre svil complétement répliqués soit jen avait &é pas répliqués du tout. En effet, si le génome bact maintenu intact, beaucoup de molécules d°ADN a de densité intermediaire (LL. HL ou M1). Ainsi, il ressort des expériences de Meselson et Stahl que la réplication del’ ADN est un processus semi-conservatif dans Jequel les deux simples brins de la double hélice d’ ADN res- tent inlucts (sont conserves) Jors de la réplication qui abautit 4 la distribution d'un brin parental dans chacune des deux molécules filles (lot le terme « semi-conservatif »). Ces expériences ont permis d’exclure les deux autres modéles : le FIGURE 2.9 Utilisation d’un gradient de densité de chlorure de césium (CsCl) qui démontre la separation des brins complémentaires durant la réplication de I'ADN. de CsCl (6M, p (densité) -- 1,7 g/ml) et déposé dans un tube de centrifugation. p= 1,65 zs < Ai ie : ADN ADN léger — hybride si Ming 12 centrifugée 4 140.000 4 pendant 48 heures ADN léger Mn aN ADN st ie hyoricle ya ae ty Nn st loud al aes Avant transfert Apres Apres dans le milieu une genération contenant du!'N dans ce milieu Les molécules d’ADN daris les tubes p=1,80 AON lourd p= 1,80 ceux générations dans ce milieu de centrifugation sont visualisées en lumigre ultraviolette2.3 Vinformation génétique contenue dans I’ADN est comprise dans la sequence des quatre nucléotides 25 Distributif Semi conservatif Conservatif FIGURE 2.10 Trois mécanismes possibles pourla réplication de 'ADN. Quand la structure de |'ADN fut découverte, plusieurs modéles furent proposés pour expliquer la réplication. Trois de ces modéles sont illustrés ici. Les expériences proposées par Meselson et Stah! permirent de trancher clairement entre ces modéles, démontrant que I‘ADN est répliqué de fagon semi- conservative. modble de réplication distributive et le modéle de replication (voir figure 2.10). Dans Je modéle de réplication 2s deux brins parentaux restent ensemble et les conser vativ conservalive deux nouveaux brins d'ADN forment une nouvelle molécule WADN, Dans ce cas, des molécules d'ADN Iéger (ADN 1) devraient Gre obtenues apres unc génération. Dans le moddle de réplication distributive, dont beaucoup de chercheurs pen- saient aI’ époque que ¢’ était le bon modéle, les brins d’ ADN. sont coupes en petits fragments (jusqu’a LO paires de bases) clutilisés pour amorcer la synthése de [ragments équivalents. Ces petits fragments d’ADN seraient par Ia suite réassociés pour former les brins entiers d’ ADN. Dans ce modéle com- plexe, les brins d°'ADN seraient compo: @ADN parental etd? ADN néosynthetisé (non conservatif) ct de!"ADN Iéger ne pourrait étre observe qu’ala suite de nom- breuses générations. s Pune mosaique Uinformation génétique contenue dans l’ADN est comprise dans la séquence des quatre nucléotides La découverte de la double hélice d’ADN a mis fin a la Sontroverse consistant & savoir si ADN était effectivement lit Substance génétique de base. Méme avant qu’ il fit démontré entalement que la réplication entrafnait la séparation neti brins, le probltme inajcur des ens molécula de déterminer comment J"information génétique de ADN contrdiait Nordre dans lequel étaient ajoutés les acides amines lors de la synthése protéique (voir encadré page 26), Toul! ADN étant capable de former une double hélice. F'ori- ine de la spécificité devait résider dans la séquence linéaire des quatre briques constitutives. les nucléotides. Ainsi. les molécules d'ADN. qui sont les entités contenant |"informa- tion, étaient considérées comme de wes longs mots (comme nous le verrors plus tard, on parle maintenant de longs messa- ges construits & partir de quatre letues de Valphabet [A, G.C et T]). Méme avec quatre lettres, le nombre de séquences potentielles d"ADN (4%, avec N = nombie de lettres dans la séquence) est trés grand, mine pour les plus petites molécules @ADN ; un nombre virtuellkiment infini de séquences peut donc exister. Nous savons maintenant que pour un géne clas- sique de hactérie, la taille est environ de 1 000 paires de bases Le nombre de génes polentiels de cette taille est 4!) un nombre qui représente un ordre de grandeur supérieur au nom- bre de génes connus dans tous les organismes. L’ADN ne peut pas étre la matrice qui ordonne directement les acides aminés durant la synthése protéique Bien que PADN doive porter l'information qui ordonne les acides aminds, i] apparaissait clairement que la double hélice elle-méme ne pouvail tre la matrice lors de la synthése pro- tique. Des expériences, montrant que I ADN est absent de la zone on s’effectue la synthése protéique. exchuaient un rdle direct de ! ADN. En effet, 1a synthése protéique dans les cel- lules eucaryotes se déroule dans le cytoplasrne qui est séparé de TADN chromosomique par Ja membrane nucléaire. Ainsi, pour les cellules eucaryotes au moins, une deuxiéme molécule portant une information devait intervenir lors de Ta synthése protéique. Cetre molécule, une fois synthétisée dans le noyau devrait migrer dans le cytoplasme pour servir de matrice a la synthése protdique. Les scientifiques se focalist- rent dés Je début, sur la seconde classe d’acide nucléique. TARN, dont le réle était obseur. 'lorbjdrn Caspersson et Jean Brachet démontrérent que I’ ARN était largement présent dans le cytoplasme. Il était alors facile @’imaginer que les simples brins de T'ADN lorsque qu’ils ne servaicnt pas de matrices pour la synthase des brins d’ ADDN complémentaires pouvaient servir de matrice pour des chatnes complémentaires d’ ARN. L’'ARN est chimiquement trés similaire a 'ADN Une analyse précise de Ja structure de V ADN permet de montrer comment il peut tre synthétisé & partir d'une matrice d’ ADN. Chimiquement parlant, l’ ARN est ies similaire a ADN. C'est une longue molecule linéaire contenant quaire types de nueléo- tides reliés entre cnx par des liaisons phosphodiester 37-5" (voir figure 2.11). Deux spécificités dans Icurs groupes chimiques différencient FARN de ! ADN. La premitre est une modifica- tion mineure sur Ie sucre (voir figure 2.12). Le suere de! ADN est un désoxyribose alors que celui contenu dans ARN est un ribose identique a un désoxyribose si ce n'est la présence du groupe hydroxyle (OH) supplémentaire sur le carbone 2°. La seconde différence est que l'ARN ne contient pas de thymine mais une base pyrimidique proche : l'uracile. Bn dépit de ces differences, les polyribonucléotides pourraicnt ues bien former des hélices complémentaires comme |’ ADN. Ni Ie groupement hydroxyle supplémentaire ni le groupement méthyle, présent26 Chapitre 2 Les acides nucléiques transmettent information génétique Preuve que les génes contrdlent les sequences d’acides aminés dans les protéines la premitre areuve expérimensele cue les geres (ADN} contrdlent les sécuences d’aci- des amings provient de letude ce "hémo- globin c'ind vidus sou‘frant ¢* une maladie génét que : lanémie a hémalies falcitormes fapnelée aussi drépanocycose). Si un indi- vdu posséde allele 5 du géne de la gio- dine-B {qui code un des deux polypeptides qui forment ensemble 'hémoglobine) sur ses deux chromosomes homolagues (55), il seva atleitt d'une arémie sévere, caractéri- sée par dcs globules rouges en forme de faucille. Si seul un des deux all#les cle la qlo- bine- est de la forme 5 45), lancinie es moins savére ot las globules rouges présen- ton. majoritairement une forme normale, Le type d'hémoglobine dans os globules rou- ges est corréle avon le profil génétique. Dansle ¢as 55, hémoglobine est enormale, caractér sée par une solublité différante de celle de "hemoglobine normale alors que dans le cas 45, la moitié de hémoglobine est normale ct autre moitié, anormale. Les molécules c'hémoglotine de type Jage sont consiituées de deux types de ines polypeptidiques : les cheines & et les chaines B (voir figure 1}, La masse moléculaire de chaque chaine est d’envi- ron 16 100dakons (Dal. La molécue cthémaglosine est consituée de deux nespsauvage glohinec sauvage ee La) Cs ¢ ‘aigiitine Hémoglobire clharraties sauivagie fale“armes Globule rouge Gllobule remige. deforme normale en ferme de faucille @ Figure 1 Formation d’hémoglobine de type sauvage et de sujets atteints d'anémie a hématies falciformes, (Source de la structure de I’hémoglobine : Illustration, Inving Geis. Droits agpartenant au Howard Hughes Medical Institute. Ne pas reproduire sans autorisation. ) globine.f s goo ee Chaine oc Acide aminé Val Leu Lys* Glu Gly His* AEE Hbl Hb G Honolulu Hb Norfolk HbM Boston HbG Philadalphia variant Hb Asp Cor Ds) je aminé = Val His* Leu Glu Hb S Hb C Hb G San José Hb E Hb M Seskatcon Hb Zurich Hb M Milwaukee-1 HbD B Punjab Variant Hb Lys Glu- Glu- His* Val Glu Val Gly Lys' Tyr Ag Giu- GluN BH Figure 2 Résumé de substitutions d’acides aminés identifiées dans différents variants d’hémoglobine humaine. chatnes «at de deux chaines B. soit une masse moléculaire de 64 400 daltons, Les chaines o et les chatnes B sort con- Urd'ees par des génes différels de telle sorle qu'une simple mutation afectara l'une ou autre chaine mais pas les deux. Cr 1957, Vernon M. Ingram de l'universté de Cambridge montra que Vhémaglooine falciforme dilférait de I'némogiooine normale o'un acide aminé dans la chaire B : 4 la position 6, le rSsidu acide glutamique trouve dars le type sauvage a’hémaglobine est rempiacé par une valine. C’est l'unicue chungemert de a sécuence en acides amires trouvé dens |‘hémoglodine mutée par repport 4 I'némogiobine nor- male, Comme ce changement cans la séquence était observé uniquement cre7 les patients possécan: 'alléle Sdu géne de la globine-B, I hyoothése fa plus simple fut de concure que I'alitle § du géne porte information oe ce changement dans le géne de la glabine-f. Des étuces ultérieu- res des séquences des acces amines d'hémoglobine isolée é partir a’autres ier- mes d’anémie ont par‘aiternen! cortirmé Cette o”oposition ; I'analyse des sequences montre que chaque enémie particuliée ast caractérisée par le emplacement dun seul acide amine sur un site unique e long, de la chainé polypept cigua (F gure 2).K Ji Sy N extrémilé 5° ia (oy Adénine I = as ° oe oe 5 o=F—0- CH,» nH o ey 4 teks. | on Ce o HONE ato in oot Ro, Q fos ° et Guanine Kagel oor H L 4 on ea?” | Uracile $ Hy 80. o=p—0—cn, i on 9 32 ou 9 I Extrémité 3” FIGURE 2.11 Portion dune chaine de polyribonucléotides (ARN). Les éléments en rouge sont distincts de ceux de "ADN. Désoxythymidine Uridine f a 1 :r ¥ Thymine (ADN) Uracile (ARN) oO isabel ~ 6 Sy Pl ae H N =o) OH OH Ribose Le Uridine-5’-phosphate FIGURE 2.42. Différences entre les nucléotides de I'ARN et de TADN. Un nucleotide d'ADN et un nucléotide d/ARN sont Teprésentés ici. Le suera des nucléotides d’ARN ast le ribose (2 la place dun désoxyribose pour I"ADN), qui porte un groupe hydroxyle sur le carbone 2’ (indiqué en rouge). L'ARN Posséde, de plus, comme base pyrimidique l'uracile a la place de la thymine. L'uracile posséde un hydrogane (indiqué en Touge) © position 5 dans le noyau pyrimidique a la place d'un groupe methyle trouvé a cette position dans la thymine. les trois autres bases présentes dans I‘ADN et I'ARN sont identiques. 2.4 Le«dogme central » 27 sur la thymine mais pas sur l'uracile, n’affectent La capacité de YARN A former des structures doubles hélices résultant de Vapparicment des hases. Cependant, 2 Ja difference de |’ ADN. lARN est en général trouvé sous forme de molécule simple brin dans Ja cellule. Si des hélices d° ARN double brin sont for- mécs, elles sont composées Je plus souvent de deux brins appar- tenant a Ja méme molécule d’ ARN sirople brin. Le « dogme central » En automne 1953, hypothése de travail adoptée fut celle dans laquell2 V ADN chromosomique fonctionnait comme une matrice pour les molécules d’ARN qui migraient ensuite dans le cytoplasme on elles déterminaient l’ ordre des acides amings dans les protéines. En 1956, Francis Crick fit référence a cette yoie pour le flux oricnté de Pinformation génétique en employant Ic terme de « degme central » : ‘Traduction — 7% Transcription Replication { ADN > ARN Protéine, ‘o Tei, Ies fMéches indiquent les directions proposées pour Ie transfert de Vinformation génétique. La fléche entourant UADN signifie que / ADN est sa propre matrice pour sa répli- cation. La fléche entre ' ADN et ARN indique que la syn- thése de l'ARN (transcription) s‘effectue 4 partir d'une matrice ADN. De la méme fagon, la synthése des protéines: (traduetion) s'etfectue & partir d'une matrice ARN. Tl est important Gralement de noter que les deux derniéres fléches sont unidirectionnelles ; c'est-a-dire que des séquences d’ ARN ne sont jamais obrenues & partir dune matrice protéi- que ou que 'ADN ne peut étre synthclisé A partir dune matrice d* ARN. |." idée que les protéines ne servent jamais de matrice pour |’ ARN a résisté A épreuye du temps. En revan- che, comme nous le verrons au chapitre 11, 1’ ARIN peut par- fois servix de matrice pour la synthése dun brin d7ADN complémentaire. De telles inversions du sens normal du pas- suge de l'information sont des événements tres rares en com- paraison de la quantité énorme de molécules d’ARN synthétisées & partir de matrices ADN. Ainsi, le dogme central propos¢ il y a plus de cinquante ans reste encore parliculiére- ment dactualité, L’hypothése de I‘adaptateur de Crick L’hypothése de départ la plus simple stait que, pour permettre la synthése des protéines, les mairices d’ARN étaient repliées de fagon & former des cavités spécifiques pour chaque acide uminé sur leurs surfaces cxtérieures. Tes cavités seraient fagonnées de telle sorte qu’un seul acide aminé puisse s’y loger, FARN fournissant ainsi l'information permettant ordonner les acides amines lors de la synthése protéique. En 1955, Crick ne croyait plus a cette hypothese, pensant que ce modéle top simple ne pouvait pas fonctionner, En premicr lieu, les groupements chimiques spécifiques des quatre bases de ARN (AUGC) doivent interagir avec les groupements hydrophiles. Or les groupements spécifiques de nombreux aci- des amings (par exemple leucine, valine et phénylalanine) ont28 Chapitre 2 des interactions prsférentielles avec des groupements hydro phobes. Ensuite. méme sil’ ARN pouvait d'une certaine fagon former des s| ‘es hydrophobes. il semblait difficile d’imagi- ner comment une matrice d ARN pourrail discriminer avec précision des acides amings aussi proches que la glycine ct Palanine ou La valine et Visoleucine qui ne different dans cos deux cas gue par la presence d°un groupement méthyle (CHS). Crick émit Phypothése que, avant leur incorporation dans les protéines, les acides aminés sont préalablement ligs & unc molécule adaptairice particuligre possédant des surfaces pou- quement aux bases sur la matrice d? ARN. vant se lier spéc La découverte des ARN de transfert La découverte de la manidre dont les protéines sont synthéti- sées agcessitait la mise au point d'une technique én vitro per- mettant de fabriquer des protéines & partir d'acides amings par ajout de molécules d°ARN. En 1953, Paul C. Zamecnik et ses collaborateurs ont, les premiers, élaboré un tel syst@me. La dis ponibilité récente dacides amines marques radioactivement, qu’ ils utiliserent pour marquer des quantités infiimes de protéi- nes néosynthetisées, ainsi que Varrivés d’ultracentrifugeuses: permettant d’effectuer des fractionnements cellulaires furent les clés de leur succés. On savait déja précisément que les ribo- somes, particules contenant de TARN ct présentes dans le cyloplasme de toute cellule synthétisant des protéines. étaient les sites cellulaires de la synthésc protéique (voir figure 2.13). Plusieurs années plus tard, Zamecnik, cn collaboration avec Mahlon B. Hoagland, découvrit quavant d’Gtre incorporés dans les protéines, les acides aminds se lient & des molécules. que nous appelons maintenant ARN de transfert (ARNt). L’ARNIt représente environ 10 @ des ARN dans la cellule (voir figure 2.14). Pour la plupart des sei Crick, fiques de Pépoque, sauf pour cette découverte était totalement inattendue. LH avait bien entendu spéculé sur le fail que ses « molécules adaptatrices » pouvaient Gtre de courtes chaines d’ ARN, car leurs bases pouvaient étre capables de s’apparier et de lire les Srourernents appropriés sur la molécule dARN qui sert de mati nthese proigique, Comme nous le détaillerons plus tard (chapitre 14), les molécules d' ARN de transfert de Zamecnik et Hoagland sont en fait les molécules adaptavices proposces par C haque molécule @ARN de transfert contient une séquence de bases adjacentes (anticoden) qui se lie spécifiquement lors de la synthése protéique dun groupe de bases (codon) sur Ja matrice ARN. Le paradoxe de la non-spécificité des ribosomes Environ 85 % de VARN cellulaire se trouve dans les riboso mes et comme Ia quuntité absolue de cet ARN augmente de facon spectaculaire dans les cellules ayant une synthése pro- téique wes importante (cellule paneréatique, bactéries en croissance exponentielle), ARN ribosomique (ARNr) avait &t¢ initialement proposé comme la matrice pour la synthése protéique. Cependant une fois que les ribosomes d“Eseheri- chia coli furent soigncusement anulysés, plusieurs caractéris tiques surprenantes apparurent. Premiérement, tous les ribosomes d’ Escherichia coli, ainsi que ceux de tous les autres organismes, sont composés de deux sous-unités de taille Les acides nueléiques transmettent l‘information génétique Ribosome FIGURE 2.13 Photogra| a en ad électronique de ribosomes attachés au réticulum endoplasmique. Cette photographie en microscopie électronique (105 000 X) montre une portion de cellule pancreatique. La partie supericure droite montre une fraction de la mitochondrie et la partic inférieure gauche montre un grand nombre de ribosomes (petits cercles denses aux électrons) attachés au réticulum endoplasmique. Certains ribosomes existent sous forme libre dans le oytoplasme ; les autres sont attachés ala membrane du réticulum endoplasmique. (Avec l'aimable autorisation de K.R. Porter.) différente, chacune contenant de ARN, qui restent assem: blées ou Sparent de maniére réyersible en fonction de Ja! concentration ionique environnante. Deuxidmement, (utes dARN sont de tailles similaires dans les petites (environ | 500 bases chez &. cofi) et dans les gran- des sous-unités (environ 3 000 buses). Troisigmement, la composition cn bases dans les deux sous-unités est & peu pres la méme (élevée en G et en C) chez toutes les bactérics. plan- tes el animaux connus, guelles que soient leurs variations dans Te rapport AT/GC de leur ADN. Ces résultats n'étaient pas ceux que l'on attendait si les brins d’ARN, présents dans les ribosomes, correspondaicnt aux différentes matrices d’ARN obtcnucs & partir d'un grand nombre de genes différents. Les. ARNrne sont done pas les matrices porteuses de l'information génétique. La découverte des ARN messagers (ARNm) Les cellules infectées avec le phage T4 fournirent le systtme) idéal pour rechercher la véritable matrice. Apres I infeetion par: Je virus, les cellules arrétent Ia synthése de leurs ARN pour ne transcrire que des ARN a partir de TADN du phage T4. Les ARN du phage T4, qui ont une composition en bases tres proche. de celle de VADN, ne se lent pas aux protéines ribosomiques normalement associées aux ARNe pour former les ribosomes. Au ficu de cela, les ARN du phage T4, aprés s’éue accrochés aux ribosomes préexistamls, migrent vers la surface de ees= Anticodon poG zz Codon FIGURE 2.14 Structure de ’ARNt de l’alanine de la levure, déterminée par Robert W. Holley et ses collaborateurs. Vanticodan de cet ARNt reconnait le codon pour Ialanine au niveau de |'ARNm. Plusieurs nucléosides modifiés de cette structure existent : u= pseudauridine, T= ribothymidine, DHU 5,6-dihydrouridine, | = inosine, m'G= 1-méthyl guanosine, m'I= 1-méthylinosine et m?G = N,N-diméthylguanosine. ARNm 3 demiers pour amener leurs bases dans une pos vent interagir ave les précurseurs ARNtacid tiser les prot ion od ils peu- mine et synthé- nes (voir figure 2.15), En agissant ainsi, les ARN du phage T+ ordonnent les acides aminés : ils correspondent done a la matrice permettant la synthase protsique recherchée depuis longtemps. Comme ils portent l'information de ' ADN jusqu’aux sites de synthése Pratéique que sont les ribosomes ces ARN ont cté nommés ARN messagers (ARNm). Lobser- vation démontrant que les ARN du phage T4 se liaient aux ribo- somes dE. col eut lieu la premiére fois au printemps 1960. De nouvelles démonstrations permirent de démontrer Ta présence @une classe d' ARN messagers dans des cellules non infectées, excluant ainsi un réte de matrice pour les ARNr. Ainsi, comme hous en discuterons plus abondamment au chapitre 14, les ARNT, et les 30 protéines avec lesquelles ils s‘associent pour former les ribosomes, constituent des usines pour la synthése Protéique eu positionnant les précurseurs ARNt-acides amings au bon endroil, afin que ces derniers puissent lire l'information portée par les matrices ARNm. Les ARNm ne représentent que quelques pour cent de "ARN cellulaire toral, Comme attendu, ces ARNM montrent une grande variabiliié en taille et en composition nucléotidi- que nécessaire pour coder la grande variété de protéines pré- Sentes dans une cellule donnée. Aujourd"hui, il est facile de comprendre pourquoi ARNm fur tout dabord ignoré. one i un petit segment de PARNm est attaché a un onné & un tihosome, une molécule d’ARNm peut Simultanément Gtre lue par plusieurs ribosomes. La plupart 2.4 Le «dogme central » 29 vanetneet wel MMM: 3 Transcription | _ ARN, | ARNM i Codon Traduction | Acide~. GR aminé ARNE suivant en formation FIGURE 2.15 Transcription et traduction. Les nucléotides de ARNm sont assembles pour former une copie complémentaire d‘un brin d’ADN. Chaque groupe de trois nucleotides est un codon complementaire d’un groupe de trois nucléotides de la région anticodon d’une molécule d’ARNt spécifique. Si |'appariement des bases a lieu, un acide aminé, porté a l'autre extrémite de la molecule d‘ARNt, est ajouté a la chaine protéi que en formation. des ribosomes forment des polyribosomes (groupe de riboso- mes uaduisant la méme molécule d'ARNm) pouvant inclure jusqu’a 50 unités (voir figure 2.16). La synthése enzymatique de |’ARN a partir d’une matrice ADN Apres la découverte des ARNm, la premiére des enzymes qui synth¢tisent (ou transcrivent) l’ARN & partir d'une matrice ADN fut isolée de maniére indépendante dans les Laboratoires des biochimistes Jerard Hurwilz et Samuel B. Weiss. Appelées ARN polymérases. ces envymes ne fonctionnent qu’en pré- sence d’ADN qui sect de matrice a partir de laquelle la chaine d' ARN simple brin est synthélisée en utilisant les précursenrs mucléotidiques ATP, GTP. CTP et UTP (voir figure 2.17). Ces enzymes fabriquent I" ARN en utilisant des segments appropriés de ! ADN chromosomique comme matrice, L’observation que Ja composition en bases de 1 ARN varie en fonction du rappor AVGE de différentes molécules @ ADN a fourni une preuy directe que ! ADN est responsable de lordre des nucléotide dans la molécule d’ ARN. Dans chaque synthése enzymutiqu Je rapport AUYGC de ARN €tait globalement identique a celt de’ ADN (tableau 2.2).30 Chapitre 2 Les acides nucléiques transmettent |’informalion génétique Relargage FIGURE 2.16 Représentation schématique du polypeptide d‘un polyribosome. Chaque ribosome complet, saccroche, 4 un signal de démarrage, 3 Vextrémilé 5’ d'une chatne d'ARNm et synthétise un polypeptide au fur et & mesure de sa progression le long de la molécule d'ARN. Plusieurs ribosomes peuvent s'accrocher sur une molécule d’ARNm en méme temps ; I'assemblage entier est appelé polyribosome. Palypeptide en formation Ribosome S = Démarrage sous-unité 4 ribosomique relarquée arn COMPARAISON DE La COMPOSITION EN BASES D'ARN SYNTHETISES PAR UNE ENZYME AVEC LA COMPOSITION EN BASES DE LEUR MATRICE, L’ADN DOUBLE HELICE a . A+u AGT Composition en bases de I'ARN Gac Git Source de la matrice ADN Adénine — Uracile Guanine Cytosine Observé Dans la matrice Phage T2 0.31 0,34 0,18 0,17 1,85 1.34 ok Thymus de veau 0,31 0,29 0,19 0,21 150 135 Escherichia coli 0,24 0,24 0,26 0,26 0,92 097 Micrococcus lysodeikticus (bactérie) 0,17 0,16 0,33 0,34 0,49 0,39 Pendant la transcription, un seul des deux bring d'ADN est Site d’addition d’un nucléotide util me matrice pour synthétiser PARN. Cela semble sur le brin a!ARN en cours de synthése les messages portés par les deux britis sont com. 7 ys ‘S Mais pas identiques et portent potentiellement Vinformation pour deux polypeptides complétement diffé- rents, La synthése d°ARN a toujours licu dans la in@me direc tion, débutant par une exirémilé et finissant avec Textrémité 3° d'un nucléotide (voir figure 2.17), A cette Epoque, il y avait un bon argument pour postuler la migration des ARN du noyau contenant |’ ADN vers Je eyto- plasme contenant les ribosomes chez les eucaryotes. En expo- sunt britvement les cellules a des précurseurs radivactifs, puis en ajontant ensuite des ribonucléotides non marqués en exces Cexpétience dite de murquage bref ou pulse labeling, voir plus Join), on pouvait marquer les ARNm pendant une couzte période de temps. Ces expériences permettaient de voir que PARN était synihetisé dans le neyau et dans Vheure qui sui L, la quasi-totalité des ARNm avait quitté le noyau et était visible dans le cytwoplasme (voir figure 2.18). FIGURE 2.17 Synthése enzymatique d’ARN sur une matrice d'ADN, catalysée par IARN polymérase. groupes de deux ne permettraient de coder que 16 (4 x 4) aci- —— Bie see des aminés. En 1954 débuta une grande réflexion afin de L’établissement du code génétique déerminer comment le code génétique fonetionnait et com- L’existence de 20 acides aminés avee quatre bases unique- ment des triplets (groupe de trois) pouvaient remplir cette ment implique qu'un groupe de nucléotides doit Pune cer fonction, en considérant que chaque acide aminé était codé par twine maniére comespondre & un acide aming donné, et des un seul triplet, méme si un groupe de trois nucléutides fournit2.5 L'établissement de la direction de la synthése protéique 31 Le CODE GENETIQUE Seconde position a) sot Cytoplasme- FIGURE 2.18 Démonstration que l'ARN est synthétisé dans le noyau et migre ensuite dans le cytoplasme. (a) Autoraciographie d'une cellule (Tetrahymena) marquée par de la cytidine radioactive pendant 15 minutes. Une photographic d'une émulsion exposée 4 l’argent est superposée sur la photographie d’une fine section de la cellule. Chaque point noir correspand a I’emplacement d’un électron émis & partir d'un atome de tritium 3H) qui a été incorporé dans de |/ARN. Pratiquement tout ‘ARN néosynthétisé est observé dans le noyau. (b) Autoradiagraphie d'une cellule similaire marquée par de la cytidine radioactive pendant 12 minutes et ensuite mise en culture pendant 88 minutes en présence de cytidine non radioactive. Tout le marquage incorporé dans I'ARN au cours des 12 premiéres minutes a pratiquement quitté le noyau pour aller dans le cytoplasme. (Avec laimable autorisation de D.M. Prescott, University of Colorade Medical School; reproduit, avec permission, de Prescott D.M. 1964, Progr. Alucleic Acid Res. Mol. Biol. 3: 35. © Elsevier.) plus de possibilites (4 x 4x 4) qu'il n'y a d’acides aminés. Vhypothise de colingarité était alors ues importante. Cela tenait au fait que des groupes de nucléotides suecessifs le long de PADN codaient pour des acides aminds successifs Ie long, de la chatne polypeptidique. Une analyse mutationnelle perti- mente réalisée sur des protéines bactériennes au début des années 1960 par Charles Yanofsky ot Sydney Brenner montra que la colingarité existe de fait. En 1961, Brenner et Crick au yses génétiques établirent les premiers que des 8 nueléotides sont utilisés pour coder Ies acides AUU ACU AAU AUC Ile Ace AAC AUA ACA AAA AUG Met) ACG AAG Premiére position woyqsod ouays1o4L, cuu ccu GAU : cuc Gee. | tan P| cua “| cca “| caw cus ceq, | qu’ partir d’analyses biochimiques. L'avaneée majeure arriva en 1961 quand Marshall Nirenberg et Heinrich Mat- thaei, qui wavaillaient ensemble, observérent que addition d'un polynucléotide synthétique poly U (UUUUU...) a un systéme in vitre permeitant de fabriquer des protéines aboutis- sait a la synthése d'une chaine polypepticique contenant uni- quement Vacide aminé phénylalanine. Le groupe de nucléotides UUU devait dene coder spécifiquement la phény- Jalanine. L*utilisation de polynueléotides de plus en plus com- plexes comme I'ARN messager synthétique a abouti a Videntitication d'un grand nombre de codons. Afin de com- pléter le code génétique. l'utilisation de polynucléotides par le chimste organicien Har Gobind Khorana ful capitale. Ces polynucléotides furent délcrminants pour tester un plus grand nombre de groupes particuliers de codons. La determination compléte du code génétique cn 1966 révéla que sur les 64 wi- plets possibles, 61 correspondent 4 des acides aminés et que la plupart des acides aminés sont codés par plusieurs triplets de nucléotides (tableau 2.3). _- Létablissement de la direction de la synthése protéique La nafure du code génétique, une fois déterminée. améne a Ia question suivante qui est de savoir comment une chaine de polynucléotides dirige la synu d'un polypeptide. Comme nous Tavons yu ici, et en discuterons plus cn detail aw chapitre 8, les chaines de polynueléotides (ADN ct ARN) sont