EXTRACCION DE DNA GENOMICO DE BACTERIAS

Martha Rivera, David Cervantes, Jos Luis plata

1 estudiantes de biologa, facultad de ciencias bsicas,
universidad del Atlntico Km 7 antigua va puerto Colombia

PALABRAS CLAVES: espectrofotometra, amortiguador de lisis,

cmara de electroforesis.
OBJETIVOS:
Determinar la concentracin y pureza de DNA mediante
espectrofotometra
Comparar los diversos mtodos de extraccin de DNA
Identificar para que sirve y se usa el equipo de electroforesis
de DNA

INTRODUCCION
Para una extraccin correcta de DNA se deben conocer las
caractersticas de la muestra que con la que se trabajara durante
la prctica, se debe conocer si el DNA que se extraer es proviene
de una clula procariota o eucariota puesto que los componentes
que forman la pared y la membrana celular de estos dos
organismos es distinta. Existen varios tipos de extraccin de DNA
estos pueden ajustarse a cada tipo de muestra, estos
procedimientos o mtodos pueden ser enzimticos, fsicos,
qumicos o la combinacin de estos mismos. Hay tcnicas que
sirven para la extraccin de DNA que se basan en los mtodos
enzimticos, fsicos y qumicos; la tcnica de la preparacin de
amortiguador de lisis para una extraccin de DNA se basa en un
mtodo qumico, la tcnica de extraccin fsica del DNA en el que
se usan esferas de cristal o porcelana que se conocen como bead
beating. Cuando se logra extraer el DNA posterior a estos se debe
conocer la concentracin del mismo. Una de las tcnicas ms

comunes usadas en los laboratorios es la espectrofotometra.

MATERIALES Y METODOS
Los materiales requeridos para esta prctica fueron:
Cultivos de E. Coli
Amortiguador de lisis
Sln de NaCl con 5M de concentracin
Cloroformo
Etanol absoluto frio
ARNasa
Cmara de electroforesis
TE (tubos de eppendorf)
Vortex

1. Para la extraccin de ADN

a. Se verti 1.5ml del cultivo en un tubo eppendorf y se llev a la
centrifuga por 5 minutos a 13000 rpm (revoluciones por minuto)
b. Al sacar de la centrifuga, se retir el sobrenadante del tubo
dejando el pellet del fondo y se agreg 200l de amortiguador de
lisis para romper las clulas presentes.
c. se llev al electroforesis, despus se le agrego 100l de NaCl, se
mesclo con la ayuda de un Vortex y se llev nuevamente a la
centrifuga por 10 minutos a 13000 rpm.
d. A continuacin el nuevo sobrenadante se verti en un nuevo
tubo de eppendorf para seguir trabajando con l, mientras que el
tubo inicial donde est el pellet se marca con el cdigo CMF1 y se
guarda.
e. Al sobrenadante extrado se le agrega su mismo volumen en
cloroformo, es decir, a 350ml de sobrenadante se le agrega 350ml
de cloroformo. Se lleva a la centrifuga por 3 minutos a 13000 rpm
f. El resultante es una mescla heterognea de dos fases: una
acuosa y otra liquida, por lo tanto la liquida (superior) se extrae y

vierte en un tercer tubo de eppendorf con l, mientras que la fase

acuosa (inferior) se rotula con el cdigo CMF2 y se guarda.
g. Continuando con la fase liquida tenemos un volumen de 250l
al cual se le agrega el doble, es decir, se le agrega 500 l de etanol
absoluto frio, se deja reposar por 15 minutos y se marca como
CMF3.
h. Luego se centrifuga por 5 minutos a 13000 rpm, se extrae el
sobrenadante, se agrega 30l de agua y vuelve a centrifugarse por
10 segundos a 13000 rpm.
i. Por ltimo se extrae el sobrenadante dejando el pellet en el
fondo. Se extrae 5l de la muestra para el siguiente proceso que
es la electroforesis de ADN.
j. El resto de la muestra se lleva a la cuantificacin de ADN usando
espectrofotmetro.
2. cuantificacin de ADN mediante espectrofotometra.
a. Del tubo de ensayo rotulado como CMF3, se extrae una muestra
de 20l y se vierte en un cuarzo, para luego agregar 1980l y
completar los 2000l de volumen requerido.
b. Este procedimiento se realiz con todas las muestras de los
grupos de laboratorio.
C. Cada uno de estos cuarzos fue introducido uno por uno al
espectrofotmetro para que nos arrojara los valores de las
absorbancias 260 y 280.
d. Por ultimo con todos los cuarzos dentro, nos mostr la foto de
los geles donde muestra el contenido de la muestra: si tiene ADN,
ARN, suciedad, etc.
3. Electroforesis de ADN.
a. Teniendo limpia la cama de electroforesis con 30ml de agarosa
al 1%, se retir la peinilla para poder introducir las muestras (las
de todo el curso).

b. Para preparar las muestras se agreg 5l de muestra, 5l de

bofe TAT y 5l del marcador de carga, cada uno con una
micropipeta.
c. Luego, con una micropipeta se recoge los 15l resultantes y se
agrega cada volumen en un pocillo.
d. Se introdujo nuevamente el peine en su posicin inicial y
procedi a encender la maquina durante 45 minutos a 100 volteos.

RESULTADOS Y DISCUSION
2. Cuantificacin del ADN:
La
pureza
del
ADN
genmico,
se
determin
espectrofotomtricamente por la medida de absorbancia, ya que la
interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un
cociente. Teniendo en cuenta, que las protenas absorben a
280nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la pureza,
calidad y concentracin del ADN. Para que el ADN obtenido
presente suficiente pureza para ser amplificado, debe presentar
valores entre 1,7 y 2,0.
De acuerdo a las absorbancia anteriormente mencionadas se
obtuvieron los siguientes resultados donde incluimos la imagen del
espectofotometro y las absorbancias de 260nm y 280nm.

Imagen de espectofotometra de las muestras.

Absorbancias nm
260
280
0.188
0.137

260/280
1.372

Concentraci
n g/ml

Conclusin
Al realizar esta prctica,
aprendimos el uso debido de
la electroforesis, ya que es
un instrumento de bastante
cuidado debido que uno de sus componentes (gel de agarosa) es
radioactivo y puede causar cncer si se maneja de forma
incorrecta. Cabe destacar que al hallar la razn entre los valores de
la absorbancia de 260nm y 280nm el resultado es inferior a 1.5, lo
cual nos indica que no hay ADN, pero, segn la imagen de la
espectofotometra, el profesor nos indico que efectivamente hay
ADN, sin embargo no se presentaba en los niveles de absorbancia
indicados ya que la muestra esta contaminada.

APNDICES
TAE: Es una solucin electroltica ms comnmente empleado para
la separacin de fragmentos de DNA por electroforesis. Recibe este
nombre de las iniciales de sus componentes. Tris (Es el nombre
comn de tris (hidroximetil) aminometano. Se trata de un
compuesto muy utilizado en el laboratorio para preparar
disoluciones tampn; el grupo cido-base que ejerce el
tamponamiento es el amino) + Actico + EDTA (Acrnimo de
EthyleneDiamine TetraAcetic acid, cido etilendiamino tetraactico
(a veces AEDT en espaol). En sus formas desprotonadas (2 y
4), es un conocido agente quelante de cationes divalentes, en
especial Ca2+ y Mg2+).

La composicin habitual es Tris 40 mM, c. actico 19 mM, EDTA 1

mM, pH=7,5.
El pH es alcalino, para que todos los grupos fosfato del DNA estn
ionizados por completo y ste se mantenga cargado
negativamente .
Bromuro de Etidio: Se trata de un compuesto intercalante, es
decir, que tiene afinidad para unirse al DNA, pues se introduce
entre sus bases apiladas. Esto se debe a su geometra plana y su
estructura aromtica, que interacciona favorablemente con el
interior hidrfobo de la doble hlice. En menor medida,
interacciona tambin con DNA monocatenario.
Marcador De Carga (Azul De Bromofenol Y Glicerina): Es una
disolucin que se mezcla con la muestra antes de aplicarla al gel.
En electroforesis de DNA:
Glicerol para aportar densidad a la muestra y facilitar su
aplicacin a los pocillos.
Azul de bromofenol (u otro colorante como el xileno-cianol) como
marcador del frente de avance de la electroforesis. Asimismo, su
color es una ayuda visual durante la carga de muestra en los
pocillos.
cpADN : Genoma de cloroplastos (cpADN) ADN circular, double
cadena, no unido a histonas. A diferencia del ADN mitocondrial que
solo se trasmite via materna a la descendencia, el ADN de los
cloroplastos puede ser heredado via materna o paterna.
Tipos
extraccin
Mtodos
diferencias

de

Extraccin de ADN
cloroplatidico
de
bouteloua gracilis
1 Salino modificado con
CTAB.

Mejorar
rendimiento
para
obtencin

el
la
de

Extraccin de ADN de
fusarium
oxiporium
fc. Sp. dianthi
2 Garber C. R. y yoder O.
C. Manicom B. Q.

El fusarium es un
patgeno
que
ataca el clavel y
causa

cpADN
Su
segundo
objetivo
fue
recuperar
cpADN con una
pureza tal que
fuera
posible
realizar
un
patrn
de
digestin
y
mapa gentico
parcial de un
segmento
del
cpADN
de
Bouteloua
gracilis,
como
herramienta
molecular
Implementaron
etapas
de
separacin
de
organelos
basados en los
mtodos salinos
reportados por
triobush en 1998
y por bookjans
en
1984
utilizando NaCl
con la finalidad
de eliminar ADN
nuclear
que
pudiera
estar
adherido a las
membranas
cloroplatidicas.

marchitamiento
vascular.
Desarrollaron un
mtodo para la
extraccin
de
ADN a partir de
hongo
filamentosos
denominado GEM
(Gentle extraction
method)
que
utiliza un periodo
de
extraccin
entre 24 y 78
horas
para
la
climacion
de
polisacridos,
Intentaron
separar el ADN
obtenido
en
nuclear
y
mitocondrial por
medio de ultra
centrifugacin

El anterior cuadro comparativo se realiz con la ayuda de los dos

artculos conseguidos, en la bibliografa se encuentran anexadas
las direcciones de donde se obtuvieron.

BIBLIOGRAFIA
http://tecnociencia.uach.mx/numeros/v5n3/data/Metodo_para
_la_extraccion_de_ADN_cloroplastidico_de_Bouteloua_gracilis_
como_herramienta_para_aplicaciones_moleculares.pdf
http://www.bdigital.unal.edu.co/20104/1/16168-50080-1PB.pdf
https://antoniogomezmartin.wordpress.com/2012/03/08/prep
aracion-tbe-tae/
https://es.wikipedia.org/wiki/Bromuro_de_etidio
http://es.encydia.com/pt/Azul_de_bromofenol