O ttulo deve ser o mais curto possvel, mas que reflete o contedo do

trabalho. Deve ser com Times New Roman tamanho 14 (TNR 14) em
negrito e centralizado.
Grisolia M.E.1,
1

Resumo

Palavras-chave:
Introduo
Os dermatfitos so fungos com a capacidade de invadir os tecidos queratinizados,
principalmente de mamferos, causando uma infeco cutnea chamada dermatofitose, que
comum por todo o mundo, e com grande importncia para a sade pblica e veterinria
(Cafarchia et al., 2013; De Baere et al., 2010).
Dentre os parmetros de diagnstico aplicados aos dermatfitos, os principais
foram caractersticas clnicas, de culturas e morfologia de condios, parmetros ainda
utilizados, apesar das variaes conhecidas e pleomorfismo (culturas podem mudar
drasticamente aps algumas transferncias em meio artificial), no entanto a identificao
atravs de tcnicas moleculares (tcnicas de fingerprinting e tecnologias de
sequenciamento) mostraram-se essenciais para o diagnstico, alm de contriburem
significativamente para a compreenso da biodiversidade de dermatfitos (Cafarchia et
al., 2013; . Grser et al., 1999).
Um mtodo eficiente de extrao de DNA genmico necessrio para dar
prosseguimento s tcnicas moleculares a serem empregadas. A extrao de DNA em
mtodos convencionais consiste nas etapas de lise celular , purificao e precipitao, os
kits comerciais se baseiam nessa etapas, mas com diferenas nas etapas de purificao e
precipitao do DNA, utilizando em sua maioria colunas de slica (Caldart et al., 2011).
Os objetivos do presente estudo foram padronizar e anlisar o melhor protocolo de
extrao de DNA de fungos Dermatfitos.

Material e Mtodos (TNR 12, centralizado, negrito)

Foram utilizadas nove amostras de dermatfitos, trs da espcie Microsporum canis,
um Microsporum gypseum e cinco Trichophyton rubrum, para a nlise de trs protocolos
de extrao, Ferreira&Grattapaglia (1998) Modificado, Blood&Tissue ki Qiagen e Plan
Mini

kit

Qiagen.

Ferreira&Grattapaglia (1998) Modificado

Na etapa de triturao do miclio foram utilizadas nove culturas puras de dermatfitos com
tempo de crescimento entre sete e 14 dias, as culturas foram removidas do meio de cultura
e acondicionadas em papel filtro -80C/30min. Aps o congelamento, o miclio
congelado foi transferido para um microtubo de 2mL junto de beads de ao inox, e
congelado em Nitrognio lquido (N 2) por um tempo de exposio de 15 segundos, em
seguida foi mantido sob agitao vigorosa em Tissuelyser programado com 50
oscilaes/min durante cinco minutos. Ao se obter um p fino do miclio, segui-se para a
etapa de obteno e purificao do DNA. Na etapa de obteno e purificao do DNA, foi
utilizado 200mg do miclio em p e 800l de Tampo de lise (NaCl 1,4M; Tris-HCl
100mM, pH8,0; CTAB 4%; -mercaptoetanol 1,5%), aps a homogeneizao em vrtex
adicionou-se 20l de Proteinase K, e incubado 56C/overnight. Aps o tempo de
incubao foi adicionado CIA (Clorofmio-lcool isoamlico, 24:1) e misturado por
inverso 20 vezes, seguindo com uma centrifugao 12000 rpm por cinco minutos. A fase
aquosa foi transferida para um microtubo de 1,5mL, onde adicionou-se Isopropanol gelado
que se mistura a amostra por inverses suaves, e o DNA precipitado durante a incubao
-20C/1h. Aps a precipitao do DNA, centrifuga-se 14000rpm por cinco minutos,
descarta-se o sobrenadante e o pellet lavado com 500l de Etanol 70% gelado. Aps uma
centrifugao 14000 rpm por cinco minutos, o sobranadante descartado e o pellet seco
temperatura ambiente, quando seco adicionado 100l de Tampo de eluio (Tris-HCl
10mM,

pH

8,0;

EDTA 1mM,

pH

8,0)

incuba-se

37C

por

30min.

Blood&Tissue kit Qiagen e Dneasy Plant Mini Kit

Foi utilizado os Protocolos descritos nos respectivos Manuais de cada kit de. No entanto,
foi feita uma modificao no incio do protocolo, utilizando os mesmos passos de quebra e
lise celular do miclio utilizado no protocolo de modificado de Ferreira & Grattapaglia
(1998), onde foi utilizado 200l do miclio em soluo com tampo de lise (NaCl 1,4M;
Tris-HCl 100mM, pH8,0; CTAB 4%; -mercaptoetanol 1,5%) e proteinase K. Seguiu-se
com as instrues encontradas nos Manuais Qiagen do kit Blood&Tissue, para cultura de

clulas, e Dneasy Plant Mini Kit de Abril de 2012, partindo da adio de 200l de Etanol
(96%-100%) e da adio do Tampo P3 (130l) respectivamente.
Para a Anlise eatatstica comparativa dos resultados obtidos foi feito o teste t
studant.
Resultados e Discusso

Espcie
Microsporum gypseum
(107 M)

Microsporum canis
(1080 M)

Microsporum canis
(1409)

Trichophyton rubrum
(1197 S)

Trichophyton rubrum
(1523 M)

Trichophyton rubrum
(1714 M)

Trichophyton rubrum
(179 S)

Trichophyton rubrum
(325 S)

Mtodo de extrao
Ferreira & Grattapaglia (1998)
Modificado
Blood &Tissue kit Qiagen
Dneasy Plant Mini Kit
Ferreira&Grattapaglia (1998)
Modificado
Blood & Tissue kit Qiagen
Dneasy Plant Mini Kit
Ferreira&Grattapaglia (1998)
Modificado
Blood & Tissue kit Qiagen
Dneasy Plant Mini Kit
Ferreira&Grattapaglia (1998)
Modificado
Blood &Tissue kit Qiagen
Dneasy Plant Mini Kit
Ferreira&Grattapaglia (1998)
Modificado
Blood &Tissue kit Qiagen
Dneasy Plant Mini Kit
Ferreira&Grattapaglia (1998)
Modificado
Blood&Tissue kit Qiagen
Dneasy Plant Mini Kit
Ferreira&Grattapaglia (1998)
Modificado
Blood&Tissue kit Qiagen
Dneasy Plant Mini Kit
Ferreira&Grattapaglia (1998)
Modificado
Blood&Tissue kit Qiagen
Dneasy Plant Mini Kit

Pureza
(A260/A280)

[DNA]

1,5

ng/l
149,6

1,8
2,0
2,0

41,39
8,65
28,03

2,1

37,5
7,2
16,0

1,9
2,0
2,0

1,9
2,0

23,5
6,8
46,0

2,0
1,9
2,0

15,0
6,8
93,7

2,0

17,0
5,2
5,5

1,8
1,8
2,0

1,9
1,7
2,0

15,9
6,6
4,4

1,6
1,8

15,0
1,5
4,4

2,0
1,8

8,0
1,2

Concluses

Referncias