Seminrios de GM

1. Cintica de Hibridao de DNA

A hibridao a renaturao de cadeias simples de DNA atravs

da complementaridade de bases originando uma dupla-hlice
Apresenta duas fases:
1. Nucleao emparelhamento num dado local (ncleo)
2. Zippering
A nucleao lenta, enquanto que o zippering mais rpido
consistente com cintica de 2 ordem

Factores que influenciam a velocidade de hibridao:

Temperatura Promove a desnaturao e uma maior energia cintica

o Se a temperatura for a ptima verifica-se a cintica da reaco normal d [H]/dt=
k [S1] [S2]
o Se a temperatura for acima da ptima verifica-se a cintica d [H]/dt= k [S1] [S2]
k [H]
Quanto mais alta for a energia cintica das molculas, menos estveis elas
esto e menor a cintica de hibridao Promove a desnaturao e uma
maior energia cintica
o Se temperatura for mais baixa faz com que se formem molculas com mais locais
desemparelhados

Complementariedade entre cadeias formao de hlices de DNA estveis (com

alguns locais no emparelhados ou no) ou no existir complementariedade

Fora inica a contante de hibridao (k) dependente da concentrao de sais a

presena de sais monovalentes (NaCl) leva a que exista menos repulso e mais
hibridao
o Fora inica tem de ser menor para temperaturas maiores

Viscosidade a constante de hibridao (k) inversamente proporcional com a

viscosidade
o Afecta a estabiliadade da dupla-hlice
o Compostos viscognicos a diferentes temperaturas
o Escolha apropriada de solventes

Agentes qumicos afectam a estabilidade das pontes de hidrognio diminuindo a

cintica de hibridao (formamida)

Estrutura secundria Ainda estudos em que a estrutura secundria mostrou

constituir uma barreira energtica hibridao e por isso diminuiu a cintica

pH o pH mais baixo permite a menor repulso entre cadeias

As experincias de hibridao mais feitas so com elevadas temperaturas e grandes

concentraes de sais monovalentes (caties) e essas condies standard
chamam-se thermal hybridization condition e so condies ptimas que permitem o
emparelhamento at de cadeias muito compridas e no-homlogas (de diferentes duplashlices iniciais).
A clula tem formas de evitar que as molculas em cadeia simples estabeleam ligaes
intramoleculares atravs das protenas SSB. In vitro, so utilizados reagentes qumicos
como o solvente orgnico formamida ou condies fisiolgicas como elevada TC ou pH
(alberts)
Aplicaes em biologia molecular: southern blot, northen blot, PCR, micro arrays (chips)
Participao em eventos biolgicos: recombinao, interferncia de RNA

2. Southern Blot

Inventado Edwin Southern

O mtodo de blotting consiste em utilizar a propriedade permevel do gel de agarose
(electroforese) de forma a transferir o DNA para uma membrana

Etapas:
1. Tratamento do DNA genmico com enzimas de restrio (endonucleases do tipo II)
2. Separao dos fragmentos de DNA por electroforese em gel de agarose
3. Tratamento do gel e transferncia dos fragmentos de DNA do gel para um filtro de
membrana de nitrocelulose atravs de difuso capilar (regio de maior potencial hdrico
para uma regio de menor potencial hdrico)- blotting
a. Depurinao tratamento cido reduz o tamanho dos fragmentos do gel
para mais facilmente serem transferidos para a membrana
b. Desnaturao tratamento alcalino para desnaturao do DNA obteno
de ssDNA para posterior hibridao
c. Neutralizao O DNA no retido no filtro de nitrocelulose a pH=9.0
Estabilizao da Molcula
d. O gel, no final, deve ser pulverizado com brometo de etdeo de forma a
confirmar que a maioria do DNA foi transferido para o filtro.
e. Depois do filtro secar ao ar, coloca-se entre duas folhas de papel de 3mm e
aquece-se a 80C, num forno de vcuo, durante 2h ou expem-se a radiao UV
para a imobilizao do DNA no filtro
4. Hibridao entre os fragmentos de DNA e a sonda de DNA marcada com istopos
radioactivos
a. Lavagens com SSC para a remoo de sonda mal hibridada
5. Revelao do sinal que observado por uma radiografia e comparao com a fotografia
tirada ao gel de electroforese
Aplicaes:
Identificao de Polimorfismos alterao do padro de restrio do genoma
DNA fingerprinting baseados em regies repetitivas do genoma
Mapeamento gnico

Diagnsticos Pr natais: Identificao de mutaes genmicas especficas para doenas

hereditrias

3. Mtodos de obteno de sondas para hibrdao

Sonda de hibridao - uma molcula de oligonucletidos (DNA ou RNA) marcada para
deteco, a qual se liga por complementaridade a sequncias alvo de cidos nucleicos em
cadeia simples.
Tipos de sondas de hibridao:
1. DNA - Sonda em cadeia dupla obtida atravs de
clonagem ou PCR.
2. RNA - Sonda em cadeia simples obtida atravs de
transcrio de DNA clonado.
O seu tamanho pode ir at aos pouco milhares de
nucletidos.
3. Oligonucletidos - Sonda em cadeia simples
sintetizada quimicamente.
Possui um tamanho entre 20-50 nucletidos.
Mtodos para a obteno de sondas:
Clonagem em vectores ou PCR
Degradao de Edman

Sntese de oligonucletidos:
Recorre-se a uma degradao de
Edman
Adquire-se uma sonda degenerada
a partir da sequncia peptdica

Mtodo da fase slida

Fase slida (resina) em que existe a adio de monmeros activados e
protegidos por DMT cadeia nascente

 Oxidao
Eliminao de DMT por aco de cido dicloroactico
Libertao do oligopptido da resina (ligao tiol) por aco do pH (tem que se
ter cuidado com a estabilidade da sequncia) ou por aco de DDT ou mercaptoetanol

Depois de sintetizadas as sondas, estas deviam ser caracterizadas (por exemplo, atravs
da sequenciao, no entanto no fcil sequenciar este tamanho de sequncias)
Marcao das sondas Mtodos:
1. Radioactivos marcao com 32P
2. No-radioactivos
Colorignicos atravs de sistemas enzimticos
Fosfatase alcalina
Peroxidase
3. Fluorognicos
Fluorforos
4. Quimioluminescncia
Marcao da extremidade 5 T4 nucletido cinase (marcao do fosfato )

Marcao da extremidade 3- Transferase terminal (marcao do fosfato )

Nick Translation mtodo mais utilizado

1. DNase 1 promove nicks aleatrios em ambas as cadeias.

2. E.coli DNA Pol I com actividade exonucleotdica 5-3 (remove nucletidos)

3. De seguida a actividade de polimerase 5-3 da DNA pol I (adiciona novos nucletidos
marcados)

Random Priming
Desnaturao da cadeia dupla de DNA.
So adicionados primers de oligonucletidos aleatrios.
Por fim, o fragmento Klenow pertencente DNA pol I adiciona novos nucletidos
marcados

4. Single-strand conformation polymorphism (SSCP)

Deteco de variaes (mutaes ou polimorfismos) nas sequncias nucleotdicas de DNA
em cadeia simples, devido s diferentes conformaes secundrias que estas adoptam.
Baseia-se nos seguintes princpios:

Fragmentos de DNA em cadeia simples podem formar estruturas secundrias devido ao

estabelecimento de ligaes intramoleculares fracas ou seja pontes de hidrognio entre
bases complementares presentes na cadeia simples
Fragmentos com conformaes diferentes tm mobilidades electroforeticas diferentes,
podendo ser separados por electroforese
Como a conformao tridimensional do fragmento de ssDNA est dependente da
sequncia primria de nucletidos, a alterao na sequncia do fragmento leva a uma
alterao da conformao tridimensional shift da mobilidade electrofortica
Mtodo
1. PCR (para criar fragmentos com tamanho e quantidade adequado para analise SSCP)
2. Produtos double stranded de PCR so desnaturados por calor a 94C + agente
desnaturante (soluo alcalina)
3. Arrefecimento rpido em gelo (as molculas single strand no tm tempo para
annealing com outras mas formam uma estrutura secundaria estvel por reassociao ao

nvel de zonas com sequencias complementares previne a formao de dsDNA e

permite higher-order structures para formar fragmentos em cadeia simples)
4. Fragmentos separados por electroforese em gel de poliacrilamida no desnaturante.

Em homozigtico 2 bandas- uma por cada single strand

Em heterozigtico com 1 mutao 4 bandas - cada strand adopta uma conformao
diferente
Em heterozigotico com 2 mutao 2 bandas - distintas das originais

A presena de diferente padro de bandas indica variaes na sequencia existentes no DNA band shift ou nmero adicional de bandas
Sensibilidade (= probabilidade de detectar mutaes) depende de:
Tipo de mutao presente
Pequenas inseres/deleces e single base substitutions geralmente melhor analisadas em
SSCP do que padres de mutao por grandes delecces
Presena de outros produtos de PCR
Tamanho do fragmento e contedo CG
Sensibilidade varia dramasticamente com o tamanho do fragmento a analisar
tamanho ptimo entre 150 bp e declnio de sensibilidade para fragmentos com mais
de 300 bp (mas ateno que sensibilidade multifactorial! Pode-se equilibrar com
outros factores) Porque uma single base subtitution contribui menos para a
estrutura terciria de um fragmento maior do que num mais pequeno
Melhor em templates com elevado contedo CG, resultante de mais pontes de
hidrognio
Temperatura do gel e pH durante a electrofores
Razo C/A relacionado com a temperatura ptima de electroforese
Temperatura de 15-25c pode favorecer transies conformacionais em amostras mutadas e
aumenta a taxa de deteco. (muito calor pode provocar um desaparecimento do shift de
mobilidade) (ateno voltagem que pode conduzir a um aquecimento do gel)
Composio da matriz do gel

Concentrao de poliacrilamida optimizada (1,3%-2.6%). Adicionar glicerol ao gel parece

melhorar a sensibilidade provavelmente por reduzir o pH do tris-borate buffer (reaco do
glicerol e o io borato ou por enfraquecer repulses electrostticas entre os fosfatos
carregados negativamente, levando a uma melhor estabilizao da estrutura terciria

Vantagens / desvantagens:
- Rpido, simples, cost-effective mtodo para deteco de mutaes
- Diferenas subtis podem ser difceis de detectar
- No revela o tipo ou posio da alterao da sequncia (Implica a utilizao de mtodos
complementares, tais como a sequenciao directa) para definir a sequncia que
responsvel pelo padro de mobilidade electrofortica alterado
Aplicaes:
Screening de mutaes pontuais e polimorfismos
Diagnstico de doenas hereditrias
Deteco de alteraes genmicas em clulas cancergenas
Filogenia (anlise de genes conservados)
Estudo da variao das sequncias de DNA mitocondrial numa determinada populao

5. dHPLC
6. Footprinting

Tcnica proposta por Galas e Schmitz em 1978.

Permite identificar as zonas onde uma protena reconhece e se liga a uma determinada
regio do DNA
o Utiliza-se este mtodo para analisar as funes de uma determinada protena (por
exemplo, factor de transcrio), ao se identificar as sequncias especficas a que
esta se liga.
o A ligao da protena ao fragmento de DNA protege essa zona da sequncia contra
a clivagem, impedindo a produo de fragmentos correspondentes.
Ocorrem duas reaces em paralelo: uma amostra de DNA sem protena ligada (controlo)
e uma amostra de DNA com uma protena ligada

Existem outros agentes de clivagem que podem ser usados alm da DNase:

Radicais hidroxilo :
Reagente qumico que
quebra a cadeia de DNA sem
estar dependente da
sequncia de base, isto ,
cliva todas as ligaes
fosfodister.
VANTAGENS: Uma vez que
to pequeno, ao
contrrio da DNase,
possvel clivar a molcula
de DNA mais prximo da
zona onde a protena est
ligada, sendo por isso,
uma tcnica mais precisa.
DESVANTAGENS: demora
mais tempo devido ao
tempo de reaco e de digesto.

No se utilizam enzimas de restrio porque estas clivam sequncias especficas. Usa-se

concentraes baixas de DNase I para que cada fragmento seja clivado uma nica vez
(optimizao prvia).

O mtodo de sequenciao de Maxam-Gilbert usado ao mesmo

tempo para se determinar a localizao exacta da protena ligada
ao fragmento de DNA clivagem de DNA por agentes qumicos
em bases especficas numa amostra, a sequncia clivada em G,
noutra em A e parcialmente em G, noutra em C e parcialmente em T
noutra em C.

7. Electrophoretic Mobility Shift Assay - EMSA

EMSA (electrophoretic mobility shift assay) uma tcnica de electroforese utilizada para
estudar a ligao de uma protena ou complexo de protenas a uma sequncia de DNA/RNA
especfica.

Complexo protena-DNA/RNA possui uma mobilidade alterada em relao a DNA/RNA

livre numa electroforese
Numa electroforese em gel de poliacrilamida ou agarose no-desnaturante, um
complexo de protena-cido nucleico vai possuir uma mobilidade reduzida, em
comparao com molculas de cido nucleico simples, devido ao seu maior
peso molecular e estabilizao da sua carga. Assim, nestas condies vo-se
formar duas bandas.

1. O DNA marcado adicionado a um extracto contendo a protena, como extracto nuclear,

ou protena purificada.
2. Podem ser adicionadas sequncias de DNA competidor no-marcado, inespecifico
(sequncia nucletidica sem relao, como DNA de esperma de salmo) ou especifico
(sequncia semelhante), servindo como controlo e como maneira de determinar a
especificidade da interaco entre a protena e o DNA:
a. A adio de DNA competidor inespecfico no afecta negativamente a formao do
complexo e da banda especifica DNA competidor inespecifico usado tambm
quando so usados extractos de protena no purificados, para evitar a formao
de complexos de DNA marcado com protenas de ligao inespecifica.
b. A adio de DNA competidor especifico pode impedir a formao do complexo
entre a protena e o DNA marcado.
3. EMSA simples no permite reconhecer a identidade da protena que se liga ao DNA. No
entanto, pode-se adicionar um anti-corpo contra a protena, formando complexo com
mobilidade ainda mais reduzida que um complexo protena-cido nucleico,
formando uma banda que migra menos que as duas anteriores. Este mtodo
denominado supershift assay e permite ento confirmar a identidade da protena.
Caractersticas da tcnica:
simples e rpida
permite identificar a presena de zonas de interaco de DNA com protenas
permite determinar a afinidade da ligao da protena com a sequncia de DNA e os seus
parmetros cinticos.
no permite identificar a sequncia especifica no DNA (tem de ser usado Dnase I
footprinting)

8. cDNA e RT-PCR (Transcriptase Reversa)

Tcnica que permite a converso de

molculas de RNA em DNA complementar a
partir da aco de uma transcriptase
reversa (converso enzimtica) na sntese
da primeira molcula de DNA, seguindo-se a
sua amplificao por PCR.
uma tcnica sensvel e verstil usada para clonar mRNA, gerando bibliotecas de cDNA.
Trabalhar com RNA tem dificuldades associadas, sendo que uma molcula

naturalmente frgil, e no se amplifica directamente converso para DNA

Os Primers para a Transcrio Reversa podero ser:

Primers para sequncias de genes especficas

Oligo(dT) primer que faz o annealing com a terminao poly(A) dos mRNAs
Poder ter associado na sua extremidade 5 uma sequncia extra (sequncia de
restrio)

Primer aleatrios - origina cpias fragmentadas de uma populao inteira de RNA

Transcriptases Reversas (Funes normais DNA polimerase dependente de RNA e DNA,

RNase H e Helicase):
AMV e MMLV (RNaseH-MMVL)
rTth (enzima termosestvel)

Na maior parte dos casos quer-se a primeira cadeia de cDNA o maior possvel e que
contenha a maior proporo de complementaridade com o RNA
Amplificao do cDNA atravs da reaco de PCR

A transcriptase reversa inactivada antes da fase de amplificao por calor

A amplificao levada a cabo por uma DNA polimerase dependente de DNA (Taq)
Purificao da primeira cpia de cDNA por extraco clorofrmio:fenol e precipitao
com etanol
Utilizao de primers forward e reverse especficos para uma dada sequncia

Aplicaes:
Identificao de mutaes e polimorfismos em sequncias transcritas
Caracterizao da estrutura de genes ou da sua expresso
Desenvolvimento de sondas
Expresso de protenas
Propagao de vectores do cDNA, criando biblioteca de cDNA

9. Rapid amplification of cDNA Ends - RACE (3 e 5)

Em geral, amplificao por PCR de relativamente poucas molculas-alvo em misturas

complexas requer duas sequncias especificas de primers que flanqueiam a regio da

sequencia a ser amplificada. No entanto, para amplificar e caracterizar regies de

sequncia desconhecida, impe-se uma severa limitao.
Mtodo para amplificar cDNAs contendo sequncias conhecidas e desconhecidas, sem
ter de recorrer clonagem da sequncia.
Amplificao cDNAs, a partir de mRNA, entre regies internas definidas e sequncias
desconhecidas na extremidade 3 ou 5 do mRNA.
Em adio, identificao de genes, RACE tambem til para examinar a utilidade de
promotores de iniciao alternativos e locais de sinal de poliadenilao.

Toma proveito da cauda poli-A natural do mRNA como primer para amplificao de PCR
Para gerar a extremidade parcial 3dos clones de cDNA, h transcrio reversa do mRNA,
usando o primer ncora QT, Q1-Q0 (oligonucletidos) que posteriormente fica integrado
no transcrito de cDNA
Amplificao realizada usando um primer contendo parte da sequncia Q0 que se liga
ao cDNA na extremidade 3 e um primer derivado do gene de interesse (GSP1).
Um segundo ciclo de amplificao utiliza primers nested (Q1 e GSP2). Diminuem a
possibilidade de formao de produtos inespecficos.

Para gerar a extremidade parcial 5 dos clones de cDNA:

 Transcrio reversa utilizando o primer especfico GSP-RT 1 cadeia de cDNA

Poliadenilao: adio de cauda poli-A usando terminal transferase e
desoxiribonucletidos Adenina .
Amplificao realizada usando o (1) primer ncora QT para formar uma segunda cadeia
de cDNA; (2) o primer QO e (3) GSP a montante do anterior utilizado na transcrio
reversa.

Finalmente, o segundo ciclo de amplificaes utiliza primers especficos da sequncia

O passo determinante para executar qualquer RACE a reaco de transcrio reversa. A

obteno de cadeias de cDNA imcompletas impossibilita partida a obteno das
extremidades desejadas.
Quer na 3-RACE ou na 5-RACE s necessrio conhecer uma pequena sequncia do
gene/ mRNA inicial para construir o primer especfico.
New RACE um mtodo baseado no Classical RACE Distingue-se pela adio em 5
do mRNA de uma sequncia conhecida universal (oligonucletido de RNA) e s depois a
obteno dos cDNAs. Assim, diminui a percentagem de cDNA fragmentado/incompleto.

10.
al

Re
-

time PCR
Tcnica baseada na reaco de PCR (amplificao enzimtica em cadeia) monitorizada em
tempo real
Permite amplificar exponencialmente sequncias especficas de um pequeno fragmento
de DNA.

Real Time PCR Capacidade de:

Monitorizar o progresso da amplificao do DNA em tempo real;

Quantificar os produtos resultantes da amplificao

Real Time PCR Necessidade de:

Mtodos de marcao dos produtos de PCR para a respectiva monitorizao e

quantificao:
1)Fluorforos
2)Sondas fluorescentes

Suporte informtico capaz de:

1)Detectar o sinal fluorescente e quantific-lo;
2)Registar o progresso da reaco de PCR

Vantagens do Real-Time PCR:

Enorme sensibilidade;
Maior preciso;
Relativamente rpido;
Maior resoluo;
No requer manipulao ps-PCR, enquanto que o PCR tradicional requer electroforese
em gel de agarose;
Minimiza os riscos de contaminao no PCR os produtos amplificados so analisados e
dispostos sem abertura dos tubos de reaco.

Limitaes do Real-Time PCR:

Susceptvel inibio por compostos presentes em determinadas amostras biolgicas;

Erro humano associado:
Desenvolvimento de ensaios imprprios;
Anlise de dados incorrecta;
Concluses injustificveis.

Aplicaes do Real-Time PCR

Quantificao relativa e absoluta da expresso genica permite comparar a expresso

da nossa sequncia com a expresso de um gene que constitutivamente expresso
Deteco de agentes patognicos e respectiva quantificao
Identificao de mutaes
Genotipagem
Avaliao de danos no DNA
DNA fingerprinting (amplificao de sequncias repetitivas)

11. Determinao do estado de

metilao do DNA

A metilao ocorre por adio de um grupo

metil (-CH3) ao C5 da Citosina na forma de CpG

A metilao poder ocorrer de novo ou como

reaco de manuteno do estado de metilao

Para qu estudar o estado de metilao do DNA?

Estudo da supresso genica
Estudo da regulao de imprinted genes marcas epigenticas
Estudo do silenciamento de genes supressores de tumores
Desenvolvimento de terapias para doenas provocadas por metilao aberrante do
DNA.
Os ensaios para determinar a metilao do DNA assentam num de 2 princpios:
1. Enriquecimento, em que se parte de uma amostra de gDNA fragmentado e uma
primeira aproximao aumenta ou separa fragmentos metilados ao invs dos no
metilados.
2. Converso por bissulfito de sdio, que provoca a converso de citosina no
metilada em uracilo e recorre utilizao de sondas que discriminam sequncias alvo
que contm CpGs metilados.

Tcnicas
Mtodos
utilizadas:

Endonucleases
de restrio
cortam a dupla cadeia de DNA pelo reconhecimento de
sequncias especficas (exemplo: enzima HpaII que
sensvel metilao do DNA mas a MspI no e cliva em
regies metiladas).
o O resultado da digesto pode ser analisado
recorrendo a electroforese, PCR ou microarrays.
o Este mtodo limitado pois est dependente das sequncias de reconhecimento
das enzimas.

Imunoprecipitao - recorre a um anticorpo anti-metilcitosina que forma um

imunocomplexo com o CpGs metilados e sequncias com este complexo vo precipitar
enquanto que as ilhas CpG no metiladas permanecem no sobrenadante.
o A amostra purificada hibridao por microarray
o Esta tcnica requer grandes quantidades de gDNA e de anticorpo.

A pirosequenciao requer converso do DNA por bissulfito de sdio, amplificao do

produto e alterao deste para ssDNA
o De seguida, um primer hibridado com a sequncia passando a servir de template
e incubado com vrias enzimas como DNA polimerase, ATP sulfurilase, luciferase
e apirase assim como os seus respectivos substratos luciferina e APS;
o Cada vez que um nucletido incorporado na sequncia, um pirofosfato
libertado e essa energia utilizada para a converso da luciferina oxiluciferina
que gera luz proporcionalmente libertao de PPi libertado;
PCR sensvel metilao (MSP) aps converso por bissulfito efectuado o PCR
recorrendo a primers especficos para DNA metilado
o Altamente sensvel e a amostra no necessita de ter elevada qualidade e/ou
quantidade

12. Pirosequenciao
Desenvolvida por Nyrn em 1987 para colmatar as falhas existentes na sequenciao
pelo mtodo clssico de Sanger
A pirosequenciao um tipo de sequenciao single-tube, no electrofortica,
baseada nas reaces acopladas de vrias enzimas, 3 na pirosequenciao de fase slida
ou 4 na pirosequenciao de fase lquida, para monitorizar a sntese de DNA.
A pirosequenciao mede a libertao de fosfato inorgnico (PP i) atravs da reaco
acoplada da luciferase. A luciferase cataliza a reao de oxidao da luciferina a
oxiluciferina com a libertao de luz que pode ser medida.

DNA template+ primer hibridao [ template primer ]

[ template primer ] +dNTPs DNA polimerase exteno+dMTP + PPi

PPi+ APS ATP sulfurilase ATP

ATP+ luciferina+O2 luciferase oxiluciferina+ AMP+ PP i+ CO2 +luz

 Na pirosequeciao de fase liquida existe mais uma reaco adicionar afirase que
degrada os dNTPs e ATP em excesso na soluo, devido no existncia do passo de
lavagem.
Limitaes da tcnica:
Sequncias com vrias repeties
(seguidas) de um nucletido
As enzimas tm de ser estveis

A taxa de incorporao errada de

nucletidos deve ser pequena
A extenso deve ser sincronizada
Diluio na fase liquida

13. Imunoprecipitao da cromatina (ChIP)

Permite identificar as protenas associadas com regies especficas do genoma.
Estas associaes so cruciais para as vrias funes celulares vitais como a
transcrio de genes, replicao e recombinao do DNA, reparaes, segregao,
estabilidade dos cromossomas, progresso do ciclo celular e silenciamento
epigentico.
Recorre ao uso de anticorpos que se ligam s protenas que queremos estudar.
Podemos querer localizar histonas com modificaes covalentes especficas como
acetilao, fosforilao ou metilao.

Etapas do mtodo:
1. Tratamento com formaldedo Estabilizao de crosslinking
entre protenas e DNA (interaco do formaldedo com os
grupos amina de protenas e aminocidos)
2. Lise celular (vortex com o uso de esferas de vidro)
3. Fragmentao da cromatina por sonicao (uso de energia
de ondas sonoras) uma parte desse DNA usado como
controlo
4. Imunoprecipitao ligao dos anticorpos especficos s
protenas
a) Protena A/G que se liga ao anticorpo e faz com que
este precipite

5. Desse precipitado faz-se a reverso do cross-linking

incubao a altas temperaturas para permitir o isolamento
do DNA, adicionando-se tambm proteinase K que inactiva
as nucleases
6. Purificao do DNA
7. Amplificao por PCR, seguida de anlise:
a) Microarray (ChIP on chip) - microarray contendo
DNA genmico do organismo em estudo, sendo
possvel ver quais os genes que se encontram activos
ou inactivos
b) Dot Blot - anlise do enriquecimento de fragmentos
de DNA especficos (detecta molculas de DNA
especficas imobilizadas em membranas sem electroforese em gel de agarose) com
sondas, que podem representar supostos locais alvo das protenas em estudo.
c) DNA amplificado por PCR marcado radioactivamente e usado como
sonda em Southern blot (DNA isolado sujeito a digesto com endonucleases
de restrio, seguido de electroforese em gel de agarose. Aps a incubao com a
sonda marcada feita uma lavagem para remover molculas da sonda no ligadas
ao alvo) para detectar a regio genmica de interesse.

A metodologia descrita denomina-se XChIP e usa cromatina fixada com formaldedo e

fragmentada por sonicao. Existe uma outra NChIP que usa cromatina nativa preparada
por digesto por nucleases. A escolha de uma ou outra vai depender do objectivo da
experincia

 Pontos Crticos da tcnica:

Crosslinking
Imunoprecipitao
Fragmentao do DNA (tanto por sonicao (X-ChIP) como por nucleases (MNase) no
caso do N-ChIP)

Desvantagens da Imunoprecipitao da Cromatina:

-

Precipitao ineficiente (X-ChIP)

Cross-linking inespecfico (X-ChIP)
Quantidade de DNA insuficiente obtido de uma nica reaco ChIP, existe necessidade de
realizar e este um procedimento caro
Tamanho dos fragmentos
Anticorpos especficos e a sua disponibilidade reduzida

Aplicaes da Imunoprecipitao da Cromatina:

- Deteco de genes transcripcionalmente activos
- Identificao do local de ligao de factores de transcrio
- Alteraes da cromatina
- Anlise de protenas

14.

Amplification Refractory Mutation System (ARMS)

Outros nomes:
Allele-specific PCR(ASP)
PCR amplification of specific alleles (PASA)
Allele-specific amplification (ASA)

Mtodo baseado em PCR:

Sistema simples (construo de primers e anlise por electroforese)
Detecta mutaes pontuais, polimorfismos de tamanhos de fragmentos de restrio,
deleces, inseres ou substituies na sequncia de DNA;
Permite distinguir heterozigticos de homozigticos num dado alelo

A tcnica envolve:
1. Construo de primers: um normal e outro mutante, ambos sense, complementares
aos alelos respectivos; e outro primer anti-sense complementar aos dois alelos.

A forma mutante refractria a PCR em DNA normal

A forma normal refractria a PCR em DNA mutante

No funcionam como primers caso haja uma mutao na extremidade 3 da sequncia

de DNA-alvo devido falta de actividade de proofreading 3-5 da Taq Polimerase

2. Depois de PCR, faz-se observao directa com electroforese em gel de agarose

Diagrama do extremidade 5 do
gene da globina mostrando as
quatro primers requeridos para a
reaco de ARMS. Electroforese
em gel de agarose de cinco
reaces de ARMS.[3]

Aplicaes Mtodo bastante til para deteco de mutaes/doenas, como:

- beta-talassmia (tipo de anemia hereditria causada por reduo ou ausncia de sntese
de cadeias beta de hemoglobina)
- surdez congnita (doena de causa hereditria ou embrionria)
- deficincia de 1-antitripsina (AAT) (deficincia de enzima proteica inibidora da elastase
neutroflica, que tem capacidade de destruir parnquima pulmonar, quando activa;
doena autossmica co-dominante)
- fibrose qustica (doena gentica, autossmica recessiva)

15. Transfeco em clulas eucariontes

Transfeco o processo no qual se procede introduo de cidos
nucleicos em clulas eucariticas
Sendo um termo tipicamente utilizado quando a tcnica realizada
em clulas de mamfero, esta tcnica tambm
realizada em plantas, fungos e algas. Nestes casos,
como os tipos de clulas so diferentes, tero de existir
diferentes mtodos devido, por exemplo, existncia de parede em bactrias e
clulas vegetais e alguns fungos.
Transfeco diferente de transformao a transformao resulta da
introduo de plasmdeos

Existem 2 tipos de transfeco:

Estvel (stable): O material gentico fica integrado no

genoma e mantm-se mesmo aps a replicao;

o Apenas com DNA
Transitria (trasient): No fica integrado no genoma e
apenas

expresso

temporariamente

forma

extracromossonal
Em ambos os casos, o DNA transfectado expresso.

Baixa eficincia
Ao longo do processo de evoluo, as clulas eucariticas tenderam a ter menores
taxas de eficincia de transfeco com o objectivo de proteger os seus
genomas de material exgeno.
As baixas frequncias de transfeco tornam necessrio o uso de marcadores, cuja
presena nas clulas ser um factor de seleco (fentipo). Na maioria das experincias
tm sido usados marcadores com funes enzimticas conhecida, tal como a timidina
cinase ou o gene da GFP. A realizao de In situ hybridization pode ser utilizada para
mostrar que as clulas transfectadas possuem o material integrado no genoma.

Mtodos para a tranfeco:

Mtodos no virais
Qumicos (mediada por lipossomas, lpidos no lipossomais, poliaminas e
dendrmeros)
Fsicos (electroporao, microinjeco e choque trmico)
Mtodos virais (mediados por retrovrus, vrus adeno-associado (VAA) e lentivrus).

Tcnicas mais utilizadas (aumento da eficincia):

O uso de lipossomas (anlogos sintticos da bicamada fosfolipidica) catinicos

(carregados positivamente) facilita esta aco pois interage directamente com o DNA
(carregado

negativamente),

formando

um

complexo

estvel.

Devido

suas

caractersticas fsicas (molculas anfipticas) geram-se estruturas esferides em soluo

aquosa. Assim, o DNA encapsulado. O complexo tem a capacidade de interactuar com a

membrana o que permite a sua entrada por endocitose.

Electroporao (muito eficiente e fcil de realizar). Como o prprio nome indica,
utilizado um campo elctrico para aumentar a permeabilidade da membrana. Quando as
clulas receptoras so expostas a intervalos adequados de actividade elctrica, existem
certos locais da membrana onde se geram disrupes de curta durao, denominados

poros. atravs destes poros que o DNA consegue entrar nas clulas.
Precipitao do DNA com Fosfato de Clcio (CaPO 4) - Esta tcnica consiste na
utilizao de um precipitado contendo CaCl e DNA, que se formou numa soluo tampo
HEPES (fosfato Na2HPO4 e NaH2PO4) Os complexos de clcio-fosfato resultantes,

juntamente com o DNA aderem membrana e entram para o espao intracelular por
endocitose (no se percebe muito bem o procedimento).

16. Comet assay

Tcnica que permite fazer a deteco de danos presentes no DNA devido quebra das
ligaes na sua estrutura
O DNA intacto mantm uma associao altamente
organizada com protenas da matriz no ncleo. Quando danificado, esta organizao
interrompida e os fragmentos iro migrar em direco ao nodo durante a electroforese,
formando uma cauda (semelhante cauda de um cometa).
Necessidade de poucas clulas por amostra
Baixo custo em relao a outros mtodos
Fcil aplicao
Reduzido dispndio de tempo

Resumo do procedimento:
Clulas embebidas em agarose numa lmina microscpica so lisadas com detergente, a
pH alto, para formar nucleides contendo loops de DNA superenrolados ligados matriz
celular.
De seguida, aplica-se electroforese (pH ajustvel) e obtm-se estruturas semelhantes a
cometas, em que o tamanho da cauda em relao cabea reflecte o nmero de quebras
de DNA- os loops que contm uma quebra perdem o seu superenrolamento e tornam-se
livres para migrarem para o nodo.

Variantes da tcnica
Comet Assay Alcalino - facilita a deteco de quebras na cadeia simples, uma vez
que a pH alcalino o DNA desnatura
Comet Assay Neutro - facilita predominantemente a deteco de quebras na dupla
cadeia Em condies de lise alcalina e electroforese neutra, as caudas dos cometas
consistem em loops relaxados de DNA.
FISH Comet Assay O comet assay associado com o FISH extremamente
informativo para localizar cromossomas especficos ou regies dos cromossomas.
Comet assay com enzimas de reparao do DNA (mais especfico)
Marcao com BUdR (marcao de danos no DNA durante a replicao e deteco
com o anticorpo anti-BUdR marcao identificada nas caudas)

Aplicaes

 Biomonitorizao ecolgica Organismos adequados podem ser utilizados em

combinao com o comet assay como biosensores para a avaliao da contaminao
do ambiente com compostos genotxicos
Testes de genotoxicidade avaliar a segurana de novos medicamentos ou outros
produtos qumicos
Nutrio avaliar o efeito de nutrientes ou micronutrientes ao nvel de dano do DNA
em humanos
Reproduo assistida determinar o grau de fragmentao do DNA em clulas
reprodutoras masculinas e prever resultados na fertilizao in vitro

17. Iplex Mass Array genotipagem de SNPs

Tcnica concebida para a deteco de diferenas numa

sequncia ao nvel de um polimorfismo (alterao de um
nucletido)
As condies da reaco para todos os SNPs so as mesmas
Existe amplificao a partir do primer (single base extension
primers), e dependendo da sequncia molde, resultar um
fragmento especfico de cada alelo, ou seja, obtm-se produtos
de extenso com diferentes massas. Esta diferena de massa
permite que o software de anlise de dados diferencie os
alelos.

Aplicaes:

Anlise quantitativa da metilao

Genotipagem de SNPs
Mutaes Somticas
Quantificao da expresso gnica
Anlise comparativa de sequncias

18. High Resolution Melting (HRM)

Baseia-se na anlise de curvas de desnaturao de amostras de dsDNA
Permite a deteco de mutaes, polimorfismos e diferenas epigenticas
Simples e rpida, com elevado custo-benefcio

1. Tcnica precedida por PCR, na presena de

um corante intercalar de dsDNA (LCGreen)

Amostra PCR HRM

2. Aumento gradual da temperatura da

amostra
3. Monitorizao do processo em tempo real,
atravs da fluorescncia emitida pelo corante, formando uma curva
de desnaturao medida que o dsDNA se vai desnaturando, o corante vai sendo
libertado e a fluorescncia diminui

4. A temperatura de desnaturao de dsDNA depende do tamanho da sequncia e do seu

contedo (por exemplo, contudo em CG) Deteco de mutaes

19. Two-hybrid Assay

w Mtodo desenvolvimento por Fields e Song em 1989;
w Detecta interaces entre protenas, tendo em conta o factor de transcrio Gal4 da
levedura Saccharomyces cerevisiae.
w O Gal4-TF est relacionado com a regulao do gene codificador da -Galactosidase.

Construo de hbridos

Insero do segmento de DNA que codifica

a protena X e do segmento de DNA-BD
Gal4 num plasmdio.
Aquando a transcrio do plasmdio formase a protena hbrida X-DBD, com
o
domnio de ligao (DBD) anexado ao seu
terminal.
O mesmo procedimento usado para
construir a protena Y-AD (Activation
Domain).
Presena de genes de seleco, ex: TRP1 e LEU2.
Tem de se retirar o codogene de terminao para a sntese da protena de fuso

NOTA: Tranfeco: introduo de plasmdeos em clulas procariotas (bactrias) e

Transformao: introduo de plasmdeos em clulas eucariotas unicelulares (ex:
Saccharomyces Cerevisiae)

Aplicaes:

Testar interaces entre protenas conhecidas e/ou identificar protenas que interagem
com uma protena de interesse (in vivo).
Mapear interaces entre domnios especficos de protenas (Y-AD e X-DBD) que formam
um dado complexo.
Identificar aminocidos ou domnios intervenientes na interaco.
Determinar a funcionalidade da protena: manipulao de interaces numa tentativa de
entender a sua relevncia biolgica. Ex: Mutagnese in vitro e avaliao do efeito das
mutaes na interaco entre protenas.
Descoberta de agentes teraputicos: a identificao de um hbrido alvo e a
caracterizao das suas propriedades poder levar ao desenho de ligandos susceptveis
de interagirem com a protena de interesse.

20. siRNA
O dogma central uma pequena pea do puzzle na compreenso da expresso gnica

 Ao longo dos ltimos anos foi descoberta uma lista de RNAs funcionais no-codificantes
(siRNAs e miRNAs)
A sua investigao dificultada por serem de pequeno tamanho, instveis
fisiologicamente e em muitos casos s se expressam em situaes de stress.
RNA uma molcula verstil, no s intermedirio como actua em processos
de silenciamento:
O dsRNA actua como agente desencadeador de silenciamento gnico. Pode ser produzido
por polimerizao do RNA a partir de um RNA molde ou por hibridao de transcritos que
se intersectam transposes).
RNAi um processo de clivagem de RNA desencadeado por
dsRNA que so clivados pela enzima Dicer Formando-se os
siRNA (21 a 25 nucletidos) que tm extremidades 3
protuberantes de 2 nucletidos.
Dicer uma endonucleose da famlia RNAse III e
especfica de RNA de cadeia dupla;
siRNAs so incorporados num complexo silenciador
induzido por RNA que medeia a degradao de
mRNAs que tenham sequncias complementares a
uma das cadeias do siRNA
O siRNA previamente desenrolado num processo
dependente de ATP (apenas a cadeia anti-sense
entra
no
complexo
RISC)
COMPLEXO
RIBONUCLEOPROTEICO ACTIVO
O RISC cliva o mRNA a meio da regio complementar (+10 e +11 do siRNA
guia)
A clivagem no requer ATP;
siRNA mantm-se associado permitindo varias reaces de clivagem.
necessria energia para libertar os mRNAs clivados e a reorganizao
do complexo-endonuclease
Protenas Argonautas Interactuam directamente com as Dicer; bsicas; 2
domnios: PAZ e PIWI(~Rnase H cliva o RNA nos hbridos RNA/siRNA - slicer)

Mecanismo de amplificao da resposta de silenciamento:

NOTA: Nas clulas existem sensores que medeiam mecanismos de silenciamento sem
envolver um dsRNA desencadeador

RNA polimerases dependentes de RNA (RDRs) enzimas que transcrevem a cadeia

complementar do ssRNA convertendo-o num dsRNA.
o Famlia chave de protenas necessrias ao silenciamento de RNA citoplasmtico e
da cromatina em plantas, C. elegans e fungos.
o Alm de iniciarem, amplificam e sustem o silenciamento
o As protenas RDR dirigem mecanismos de silenciamento dependentes e
independentes de primer.


A- RDR acede ao RNA devido a aberraes da
prpria molcula produzindo diversos siRNA via
de novo

B- os siRNAs decorrentes de vrus, transposes

ou RNA celulares servem de molde de siRNAs. A
cadeia anti-sense hbrida com o mRNA-alvo
proporcionando um primer para as RDR. Os dsRNA so clivados pela Dicer originando
novos siRNAs.

siRNAs podem ser simultaneamente moldes e alvos, sendo um dos desafios das
pesquisas actuais compreender a regulao dos conjuntos de genes. Como resultado, um
nico RNA aberrante ou siRNA pode gerar vrios dsRNA que iro silenciar ainda mais
molculas alvo
Defesa eficiente contra invasores que replicam rapidamente como os vrus Na
defesa do genoma os processos de amplificao asseguram que molculas de RNA
derivadas de um transposo possam activar a via de silenciamento da cromatina
para suprimir as cpias de um elemento transponvel

Aplicaes Teraputicas:
A compreenso do mecanismo de RNAi levou a possibilidade de direccionar vias de
defesa independentes da sequncia para a via RNAi que dirigida a sequncias
especficas siRNAs so introduzidos em clulas de mamferos por vectores de DNA e
introduzidos nas cellas por transfeco ou infeco viral.
Os alvos possveis vo desde oncogenes a factores de crescimento. Vectores virais
a cellas do crebro da possibilidade para tratar doenas degenerativas e
neurolgicas.
HIV e Hepatite C
RNAi distingue-se de outras tecnologias por usar a maquinaria celular para dirigir o
silenciamento especfico

21. Array de expresso

Arrays Tcnica de hibridao entre amostras de RNA provenientes de clulas do
organismo em estudo (target) com amostras de cidos nucleicos cuja sequncia
conhecida (probe) a fim de se proceder ao estudo do trasncriptoma.

Transcriptoma

- o conjunto de todos os transcritos obtidos a partir do genoma

duma dada clula, num dado tempo e sob condies especficas

As sequncias conhecidas ("probes) esto fixadas a uma superfcie slida (spot),

pretendendo-se averiguar se dada sequncia codificada quando o organismo em estudo
submetido a diferentes condies experimentais

Caractersticas dos macroarrays:

- Meados da dcada de 80

Suporte: membrana de Nylon

Tamanho do spot: >300 mm
Densidade de spots: 10-50 spots/cm2
Nmero mdio de spots por array: >15000
Tecnologia de construo do chip: deposio manual.

Caractersticas dos microarrays:

Anos 90
Baixa densidade suporte de vidro
Elevada Densidade Chip de slica
Tamanho do spot: <200 micromilimetros
Densidade de spots: >400 spots/cm2
Nmero mdio de spots por array: >15000
Tecnologia construo do chip: spot printing

Princpios da tcnica de Microarrays:

Construo do chip (Fotolitografia utilizao de mscara e de grupo protector fotolbil

nos nucletidos que eliminado pela radiao UV onde a mscara no recobre)
Colheita e Tratamento de amostras
Hibridao ( necessria fazer lavagens com estrigncia elevada para eliminar
hibridaes inespecficas)
Aquisio de dados
Processamento dos dados

Processamento dos dados:

Primeira abordagem sobre o estudo da resposta celular em relao a dadas condies

experimentais;
Anlise do Transcriptoma apenas pode sugerir hipteses, necessidade de testar e
comprovar os dados obtidos atravs de outras tcnicas

Tipos de Microarrays:
A) Oligonucletidos
B) cDNA


Aplicao dos Microarrays:
1) Expresso gnica - identificao e anlise de padres associados expresso de
genes em dadas condies de doena
2) Identificao de genes - identificao e descrio de genes envolvidos em processos
fisiolgicos, patolgicos
3) Deteco de mutaes / polimorfismos
4) Comparao genmica
5) Microarrays utilizando protenas

A tcnica de microarrays desenvolve-se em muitos passos, passveis de originar mltiplos

erros (recolha da amostra, variabilidade de cada tipo de microarray, marcao da
amostra, anlise dos dados, erro humano, etc), de forma que conveniente tentar reduzir
a margem de erro, atravs de:
Realizar mltiplos duplicados (para uma dada amostra nas mesmas condies)
Utilizar amostras de clulas/tecidos diferentes (da mesma espcie) para analisar a
parecena (ou no) dos resultados.
Aplicar as mesmas condies experimentais para vrias amostras diferentes.
mRNA is only an intermediate between DNA and protein. Post-transcriptional and posttranslational control play a major role in modulating protein expression.

22. Sequenciao de transcriptomas (RNA-seq)

Mtodo de alto rendimento que permite determinar directamente sequncias de cDNA a
partir de mRNA.
Baseia-se na sequenciao de DNA complementar (cDNA) ao mRNA, atravs de
tecnologias de sequenciao de DNA.
Mtodo desenvolvido para mapear e quantificar transcriptomas.

Processo:
1. Obteno da amostra de RNA (RNA
total)
2. Isolamento de RNA poliadenilado
3. Sntese de cDNA Transcrio Reversa
4. Fragmentao do cDNA (aco de
DNase)
5. Reparao das extremidades dos
fragmentos de cDNA A fragmentao
do cDNA pode produzir extremidades
coesivas que tm de ser convertidas em
extremidades abruptas
6. Ligao dos adaptadores aos
fragmentos de cDNA Os adaptadores
so oligonucletidos com sequncias especficas que vo permitir a posterior associao
dos primers de sequenciao.

7. Amplificao por PCR

8. Electroforese em gel de agarose Este passo
vai permitir a seleco das bandas
correspondentes aos fragmentos de cDNA de
tamanho desejado para posterior sequenciao.
9. Purificao dos fragmentos de cDNA
10. Sequenciao de DNA e anlise de dados

Aplicaes:

Identificar, caracterizar e catalogar transcritos expressos numa clula/tecido

especfico;

Determinar padres de splicing e estrutura dos genes;

Quantificar os nveis de expresso gnica de cada transcrito durante o desenvolvimento
e em condies fisiolgicas/patolgicas

processing (Fig. 1). Only on

rest is spliced out post-trans
in red below. MiRNAs are
may participate in regulation

23. miRNAs: mtodos de deteco

Pequenas molculas de RNA (18~25 nucleotidos) que apresentam uma

funo reguladora da expresso gnica
Regulao ps-transcritional, atravs de hibridao com mRNA por
complementaridade de bases na regio 3 UTR
Pri-miRNA processado em pr-miRNA atravs da enzima Drosha
Depois de exportado para o citoplasma, o pr-miRNA sofre splicing,
sendo o loop de cima excisado endonuclease Dicer
A cadeia dupla de RNA resultante separada e uma das cadeias
incorporada numa protena RISC (RNA induced silencing complex)
Fig. 1. MicroRNA structure(Source: Paper 1)
As protenas RISC marcam o mRNA para degradao

Fig. 1. MicroRNA structure(Sou

Fig. 2. MicroRNA processing(Source: Addl. Reference1)

Mtodos de
deteco:
Hibridao
Before
it can participate
in regulation, the miRNA needs to have some processing per

formed.
After the
it issonda
exported
to theLocked
cytoplasm,
the upper
Hibridao in
situ usando
uma
de LNA:
nucleic
acid loop is spliced off. The reFig.incorporated
2. Micro
RNA pro
cessing
sulting
double-stranded
RNA
is
separated,
and
one
strand
is then
into
a (So
Um anlogo bi-cclico de RNA em que o oxignio 2 est ligado
ao
carbono

Before it can
participate
4 atravs de
ponte de
metileno
foruma
degradation,
both
by guiding cleavage of the mRNA and by promoting
transport
to a in
formed. After the it is expo
Possui uma grande afinidade para RNA e DNA e confere aos dmeros

protein complex called RNA induced silencing complex, or RISC. RISC target mRNA

(LNA-RNA)

uma

elevada

estabilidade

trmica,

permitindo

temperaturas de melting (>70C)

sulting double-stranded RN

altas
protein complex called RNA

for degradation, both by gui

Usa-se um marcador ligado cadeia de LNA (ex.: DIG), para podermos posteriormente
detectar os locais de hibridao e vermos onde se encontram os miRNAs

Apresenta vantagem sobre PCR

Deteco atravs de nanoporos com auxlio da protena viral p19

Mtodos de Anlise

Podemos quantificar miRNAs atravs de processos como os

microarrays ou qRT-PCR (quantitive real time-PCR)
No entanto em ambos os processos torna-se necessrio um
inicial de trancrio reversa, em que convertemos o miRNA
em DNA para procedermos aos mtodos de anlise

passo

24. Protemica
Protemica um metodo directo que permite identificar, quantificar e estudar as
modificaes ps-traducionais das proteinas de uma celula, tecido ou mesmo
organismos.

Principios Fundamentais da protemica:

Bioquimcos
Biofiscos
Bioinformticos

Interdisciplinaridade cientfica contribui para documentar a distribuio geral de

protenas da clula, indentificar e caracterizar protenas individuais de interesse.

Proteoma:

Conjunto de protenas expressas a nvel celular, em determinadas condies

especficas;
Depende do tipo de linhagem celular, etapa de desenvolvimento, estmulo ambiental,
nutricional, metablico, entre outros;
Um gene pode originar mltiplas protenas:

Alternative splicing;

Processamento e modifio proteca ps-traduo (clivagem peptidica,

acetilao, glicolisao, etc) ;
Genoma Fixo, esttico, constante;
Proteoma Dinmico, varivel:

Maior complexidade;

20 aminacidos diferentes;

Interaces electrostticas,hidrofbicas, pontes hidrognio, disulfureto;

Estrutura primria, secundria e terciria;

Mtodos de Separao/Purificao e Anlise:

Solubilidade (sais, solventes, pH, temperatura)

Cromatografia de permuta inica
Filtrao em gel
Electroforese SDS-PAGE
Electroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE)
Ultracentrifugao
Focalizao Isoelctrica
Cromatografia lquida em fase reversa
Espectrometria de Massa
Degradao de Edman
Sequenciamento Quimco
Processo Imunolgico

1. Electroforese em gel de policrilamida

- A separao e anlise de molculas d-se de acordo com a sua massa molar atravs
electroforese;
Protenas so aquecidas numa soluo de SDS (sodium dodecyl sulfate);
O SDS liga-se protena desnaturada numa proporo exacta (molculas de SDS /
resduos de aminocidos;
Subunidades Proteicas so dissociadas

2. Focalizao Isoelctrica (IEF)

Protenas apresentam-se electricamente carregadas de acordo
com o pH;
Gera-se um campo com diferencial de pH;
A migrao d-se at se atingir o ponto isoelctrico (pH=pI)

3. Electroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D PAGE)

Combina duas tcnicas de separao:
Primeira Dimenso focalizaao isoelctrica (IEF)
Separao atravs da uma alta tenso, num gradiente de pH
Segunda Dimenso electroforese em gel de poliacrilamida, SDS-PAGE
Separao atravs do peso molecular (MW)

Colorao de Protenas:
Azul de coomassie
Nitrato de Prata
Marcao radioactiva

4. Espectrometria de Massa
baseia no movimento de ies em campos elctricos e magnticos para classific-los
de acordo com a sua relao massa/carga, produzindo um espectro e massas
Ferramenta analtica de medio do peso molecular (MW);
Concentraes picomolar
Preciso de 0,01% do peso total da amostra num polipptido de 40 kDa, h um erro
de 4 Da pode assim detectar substituies de aminocidos e modificaes pstraduo;

Informaao Recolhida:
Informaes estruturais
Amostra de fragmento e analisar os produtos
til para o sequenciamento de oligonucleotidos e pptidos
Identificao de componentes individuais em misturas complexas

Protemica Diferencial
-

Compara diferentes perfis de protenas em situaes de interesse. Tem como objectivo

melhorar o contedo de informaes do estudo do proteoma;
Electroforese diferencial em gel (DIGE) Rotulao fluorescente para trs
populaes complexas de protenas antes de mistur-las e resolv-las
simultaneamente no mesmo gel
Usa steres de succinil de corantes de cianina (CY2, CY3 e CY5)

Multplex Proteome (MP) - determinao dos nveis de expresso de

protenas, sensveis a glicolisaes, com capacidade de ligao a drogas, ou
metabolizao das mesmas. Melhor que a DIGE porque d uma faixa de
informao muito superior
Utiliza fluorforos
Isotope-Coded Affinity Tags ICAT - reagente formado por 3 componentes
funcionais
Constituido por: Tiis , etileno-glicol, biotina