UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI

FACULTATEA DE INGINERIE CHIMIC I PROTECIA MEDIULUI

Specializarea: Master CONTROLUL I PROCESAREA ALIMENTELOR

METODE DE CARACTERIZARE I
TESTARE A MATERIALELOR

2016

UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI

FACULTATEA DE INGINERIE CHIMIC I PROTECIA MEDIULUI
Specializarea: Master CONTROLUL I PROCESAREA ALIMENTELOR

DETERMINATREA PROTEINELOR DIN LAPTE

PRIN CROMATOGRAFIE N FAZ LICHID DE
NALT PERFORMAN (HPLC )I GAZCROMATOGRAFIE (GC).

2016

CUPRINS

INTRODUCERE.......................................................................................................................4
1.CROMATOGRAFIE N FAZ LICHID DE NALT PERFORMAN (HPLC )I
GAZ-CROMATOGRAFIE (GC)............................................................................................6
1.1.CROMATOGRAFIA LICHID DE PERFORMAN NALT CU FAZ
INVERS...............................................................................................................................6
1.2.CROMATOGRAFIA DE GAZE......................................................................................9
2.DETERMINAREA PROTEINELOR DIN LAPTE PRIN HPLC SI GC.......................10
2.1.PROTEINELE DIN LAPTE...........................................................................................10
2.2.ANALIZA PROTEINELOR DIN LAPTE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC.............11
2.2.1. Metode i materiale.................................................................................................11
2.2.2. Rezultate.................................................................................................................13
3.ANALIZA AMINOACIZILOR COMPONENI AI PROTEINELOR DIN LAPTE...15
3.1.CONINUTUL N AMINOACIZI AL PROTEINELOR LAPTELUI..........................16
3.2.REZULTATE...................................................................................................................17
CONCLUZII...........................................................................................................................21
BIBLIOGRAFIE.......................................................................................................................22

INTRODUCERE

n lucrarea de fa s-a realizat studiul unor tehnici de determinare al proteinelor din

lapte, reprezentate de analiza cromatografic: cromatografie n faz lichid de nalt
performan HPLC i gaz-cromatografie GC. De asemena s-a demonstat utilitatea tehnicilor
de chimie analitic n caracterizarea unui amestec biochimic complex cum este laptele.
Separarea i identificarea proteinelor prezente n lapte se poate realiza prin
cromatografie n faz invers HPLC. In studiu de fa s-a urmrit de asemenea si tehnica de
determinarea a aminoacizilor prezeni n proteinele din lapte, metoda utilizat fiind una gazcromatografic.
Cromatografia
complexe

reprezint

un ir de procedee prin care un amestec de substane

n faz gazoas sau lichid , cu compoziii asemntoare,

este separat

pe

componente. La folosirea cromatografiei n scop analitic imediat dup separarea

componentelor amestecului acestea

sunt

analizate cu aparatur spectrometric, termoc-

onductometric, ion - conductometric, polarimetric sau refractometric n scopul

determinrii compoziieie chimice i/sau a concentraiei. La toate separrile cromatografice
proba de analizat se solv ntr-o faz mobil care este fie un gaz fie un lichid fie un fluid
supracritic.
Fenomenul separrii componentelor amestecului fazei mobile ntr-un cromatograf se
datoreaz frnrii difereniate a deplasrii acestora de ctre o faz staionar ce se gsete
fixat pe o coloan sau pe o suprafa plan. La cromatografie toate componentele
amestecului de substane analizate pleac concomitent i ajung la detector pe rnd.
Natura fazei mobil i a fazei staionar se alege n aa fel nct separarea
componentelor n timp s fie ct mai avansat. Componentele frnate mai puternic de faza
staionar se deplaseaz cu vitez mai mic iar cele frnate mai puin se deplaseaz cu vitez
mai mare i corespunztor ultimele sosec primele la captul sistemului cromatografic de
separare unde se gsete i detectorul.
Pe baza acestor mobiliti diferite componentele amestecului lichid sau gazos se separ
n eantioane de substane pure ce ocup fiecare un interval bine definit de timp de ieire din
coloan. Sistemul de detecie cromatografic plasat la ieirea coloanei cromatografice
trebuie s prezinte o vitez de rspuns suficient de mare pentru a nu exista pericolul ca
anumite fraciuni de concentraie mic (interval scurt de sosire la captul coloanei) s rmn
nedectate. La ora actual cromatografia ocup un loc important n chimia organic, chimia

anorganic,

n biochimie, n

chimia alimentar,

n chimia mediului, n expertiza

criminalogic .a. n figura de mai jos este redat schema de principiu a cromatografiei.
Rezultatul cromatografiei unui amestec de substane este o cromatogram, ca cea din
figura de mai jos, ce este compus dintr-o succesiune de peak-uri n timp.

Fig.1 Elementele unei cromatograme

1.CROMATOGRAFIE N FAZ LICHID DE NALT

PERFORMAN (HPLC )I GAZ-CROMATOGRAFIE (GC).
1.1.CROMATOGRAFIA LICHID DE PERFORMAN NALT CU FAZ
INVERS.
n anii 70-80 ai secolului XX s-a accelerat dezvoltarea unei noi direcii a
cromatografiei HPLC cu faz invers.
Sensibilitatea nalt, precizia i selectivitatea metodei i-a dat o prioritate considerabil
n studiu farmacocinetic pentru un numr mare de substane medicamentoase, iar rapiditatea
analizei permite efectuarea n instituiile medicale att a investigrilor clinice imense ct i a
analizelor expres i eficace n cazul diagnosticrii urgente sau dozrii preparatului.
O alt cauz este i preponderena metodei HPLC fa de alte metode fizicochimice,
inclusiv i fa de unele metode cromatografice, i anume: domeniul de aplicare s-a majorat
cu dozarea compuilor volatili, uor oxidabili, termolabili fr aplicarea metodelor speciale;
metoda HPLC cu faz invers permite analiza mostrelor apoase, simplificnd prepararea
probelor de material biologic i reducnd timpul unei analize; majoritatea variantelor de
detecie n metoda HPLC nu distrug probele.
Astfel, n caz de necesitate, permite cooperarea cromatografiei cu scop analitic
(separarea, detecia, determinarea cantitativ) i cea cu scop preparativ, totodat este posibil
colectarea fraciilor separate a substanelor analizate pentru identificarea ulterioar i/sau
utilizarea altor metode fizico-chimice de analiz;
n majoritatea cazurilor se exclude necesitatea de a efectua derivatizarea;
metoda HPLC poate fi automatizat complet;
solvenii organici (acetonitrilul, metanolul, parial tetrahidrofuranul) i apa utilizai n
faza mobil permit detecia n UV-VIS ntr-un diapazon larg. Totodat aceti solveni sau
amestecurile lor dizolv practic toate grupele de compui aflai n organismul uman, n
materialul biologic i utilizai ca preparate medicamentoase . a.;
sorbenii utilizai n HPLC cu faz invers se echilibreaz foarte repede cu noii
solveni, ce permit de a realiza uor cromatografia n gradient i a trece de la o metod la alta;
sorbenii le acord posibilitatea de a utiliza solveni cu proprieti ntr-un interval
mai larg, la fel de a aduga diferite tipuri de modificatori (sruri, acizi, baze, reactivi perechi
de ioni, . a.).
Metoda dat ca i orice metod analitic posed i unele dezavantaje:

 metodele de detecie existente, uneori, nu posed o suficient sensibilitate necesar

pentru determinarea concentraiile joase a analiilor, ndeosebi n analiza farmacocinetic;
metoda HPLC necesit utilizarea cantitilor mari de solveni organici de o puritate
nalt, care n majoritate sunt destul de costisitori i toxici, n plus regenerarea acestora este
dificil;
utilajul cromatografic, piesele de schimb, coloanele cromatografice, accesorii,
aparatura specific pentru umplerea coloanelor cu sorbeni sunt destul de costisitori, totodat
complicai n deservire;
caracteristica reteniei i selectivitii sorbenilor cu faze inverse se schimb nu
numai trecnd de la o firm la alta, dar i de la serie la serie a unui productor.
Metoda HPLC presupune separarea componenilor de analizat n fluxul fazei mobile
(eluent, ce-i caracterizat de compoziie, fora ionic, pH i ali parametri) n baza diferitor
interaciuni cu sorbenii.
Complicarea mecanismului de separare i majorarea numrului de parametri variabili
ai procesului n mbinare cu eficacitatea mai redus a coloanei cromatografice, dect n GC,
duc la ideea c alegerea i optimizarea condiiilor de separare n metoda HPLC este mult mai
dificil, iar rolul experienei i intuiiei specialistului, n cazul dat, este mai important.
Optimizarea - este cutarea condiiilor optime la efectuarea analizelor. n dependen
de situaie, optimizarea poate fi ndreptat la mbuntirea selectivitii, sensibilitii i altor
parametri, ce determin veridicitatea rezultatelor, precum i mbuntirea raportului
cost/beneficiu, reducerea timpului de analiz, micorarea numrului de operaii manuale, dar
fr pierderi de informaie. Ea se refer la toate etapele de analiz.
Optim este mai bine zis o categorie filozofic. n cromatografie, precum i n alte
domenii persist un permanent compromis ntre calitatea rezultatului finit i cheltuielile la
realizarea lor (de materiale, de timp, de resurse umane). n ce privete cheltuielile pentru o
analiz trebuie adunate neaprat i cele la elaborare. n procesul optimizrii ele cresc
monoton, atunci cnd eficacitatea metodei se apropie asimptotic de o oarecare valoare
maxim limita fizic, determinat printr-un nivel modern de dezvoltare a tehnologiei
analitice, i ntr-un moment oarecare datorit optimizrii excesive metoda devine
nerentabil.
Astfel, n rezolvarea sarcinii concrete este destul de important determinarea preventiv
a cheltuielilor posibile la elaborare i aprecierea profunzimii n cercetare.

ETAPELE ANALIZEI CROMATOGRAFICE

Analiza HPLC este un proces complicat, cu multe etape, rezultatul depinde de
corectitudinea efecturii fiecrei etape n parte.
Se pot evidenia 3 etape de baz ale acestui proces:
Prepararea probelor toate operaiile de preparare a mostrelor de analizat, care se
finiseaz cu obinerea probelor, injectate direct n coloana cromatografic, inclusiv i
derivatizarea precoloan, n caz de utilizare.
Analiza cromatografic propriu zis din momentul injectrii probei pn la
nregistrarea semnalului electric la ieirea din detector, inclusiv i derivatizarea pe coloan sau
postcoloan, unde ea este prezent.
Prelucrarea informaiei cromatografice primare, rezultatul creia const n obinerea
mrimilor ce caracterizeaz componena calitativ i cantitativ a probelor de analizat.
Oricare din etapele enumerate are specificul su de realizare i cere o tratare
individual de optimizare.

Fig.2:Schema unui cromatograf de lichide de nalt performan (HPLC)

Principalele componente ale cromatografului de lichide sunt: sistemul de alimentare cu
faz mobile, dispozitivul pentru introducerea probei, una sau dou pompe, coloana,detectorul,
sistemul de prelucrare a datelor.

1.2.CROMATOGRAFIA DE GAZE
Cromatografia de gaze reprezint acea tehnic cromatografic ce utilizeaz o faz
mobil gazoas i o faz staionar lichid sau solid. Este cea mai utilizat tehnic
cromatografic, deoarece prezint o serie de avantaje care i confer o adaptabilitate deosebit
la problemele care pot aparea n timpul analizei amestecurilor complexe de componente.
Astfel, prin utilizarea unui gaz drept faza mobil se realizeaz un transfer de mas rapid ntre
faza mobil i faza staionar, ceea ce permite stabilirea echilibrelor de distribuie de multe ori
ntr-un interval scurt de timp i obinerea unor separri eficiente corelate cu timp de analiza
redus. Vscozitatea sczut a gazelor permite utilizarea unor coloane lungi i nguste i n
consecin creterea numrului de talere teoretice. Faza mobil fiind un gaz inert, dup
separare componentele pot fi usor detectate deoarece faza mobil nu interfer la detecie.
Singurele limitri ale cromatografiei de gaze sunt determinate de volatilitatea prea
sczuta sau instabilitatea termic a componentelor analizate i aceste dezavantaje pot fi ns
limitate, de exemplu prin transformarea compuilor respectivi n derivai care s aib
volatilitate mai mare. Tehnica se numete derivatizare si este larg utilizat n cromatografia de
gaze.
Un sistem GC are trei componente principale: injectorul, camera de termostatare a
coloanei cromatografice i sistemul de detecie (unul sau mai muli detectori). Acestora li se
altur sursa de gaz purttor pentru realizarea fazei mobile a separrii prin GC. Injectorul
permite plasarea probei n captul coloanei, ntr-o zon ct mai ngust cu putin. Proba n
GC poate fi gazoas sau lichid; atunci cnd proba este lichid, componenii probei trebuie s
fie volatili i stabili termic la temperatura injectorului, precum i pe intervalul de temperatur
n care se face separarea cromatografic.
O reprezentare schematic a unui sistem GC este redat n Figura 3.

Fig.3:Reprezentarea schematic a structurii unui cromatograf de gaze

2.DETERMINAREA PROTEINELOR DIN LAPTE PRIN HPLC SI GC

2.1.PROTEINELE DIN LAPTE
Proteinele din lapte au o valoare biologic superioar, deoarece au un coninut n
aminoacizi eseniali, n cantitai aproximativ egale cu cele necesare organismului uman. Cele
mai importante proteine din lapte sunt: cazeina cu o valoare de 2,75%, lactoalbumina cu
0,36%, respectiv lactoglobulina cu 0,12%.
Cazeina reprezint principalul component din punct de vedere proteic al laptelui.
Aceasta coaguleaz n urma aciunii enzimelor proteolitice sau prin acidifiere. Procedeul de
coagulare al laptelui st la baza producerii de brnzeturi i produse lactate acide.
Cazeina este alctuit din mai multe fraciuni: , , . Primele dou se coaguleaz sub
aciunea cheagului, iar - cazeina nu se coaguleaz, ea ramnnd n zer. mbinarea acestor
fraciuni ale cazeinei n laptele materie prim are o importan deosebit n procesul de
fabricare a derivatelor din lapte.
Cazeina d culoarea de alb laptelui, n momentul n care este obinut cu ajutorul unui
acid i deshidratat cu alcool. Atunci ea devine insolubil n alcool, foarte puin solubil n
ap, dar solubil n soluiile unor sruri. Cazeina se prezint sub forma unei pulbere amorf,
far arom i gust.
Proprietatea cazeinei de a precipita sub aciunea unor enzime coagulante, n mediul
acid, n prezena unor metale grele i a alcoolului, se afl la baza unor procese tehnologice de
obinere a diferitelor produse din lapte.
Laptele conine diferite tipuri de proteine, majoritatea dintre care sunt prezente n
cantiti mici. Proteinele pot fi clasificate funcie de proprietile sale fizice sau chimice i
funciile biologice. Metoda clasic de clasificare a proteinelor n cazeine, albumine i
globuline este cea mai des ntlnit. Tabelul de mai jos prezint conform sistemului modern
de clasificare lista proteinelor din lapte. Grupurile minore de proteine au fost neglijate pentru
simplificare. Aa numitele proteinele din zer constituie sinonimul pentru proteinele serice
din lapte, dar termenul este n special folosit n procesul de fabricare a cacavalului.
Proteinele din zer conin fragmente de molecule cazeinice. Sunt cunoscute trei grupuri
principale de proteine din lapte functie de comportamentul su diferit i forma de existen.
Cazeinele uor precipit din lapte, pe cnd proteinele serice rmn n soluie. Proteinele din

structura lipo-proteic a membranei ader pe suprafaa granulelor de grsime i pot fi separate

numai prin procedee mecanice.
Tabelul 1
Concentraia proteinelor n laptele de vac
(Sursa : Dairy Processing Handbook, TetraPak, Sweden)

2.2.ANALIZA PROTEINELOR DIN LAPTE PRIN CROMATOGRAFIE HPLC

2.2.1. Metode i materiale
n analiza proteinelor cea mai utilizat tehnic cromatografic este cromatografia n
faz lichid de nalt performan (HPLC). n funcie de mecanismul separrii cromatografie
prin excluziune steric, schimb de ioni sau cromatografie n faz invers (HPLC).
Pentru o mai bun separare i caracterizare a proteinelor din lapte, la ora actual pe
plan mondial este utilizat tehnica HPLC bidimensional (2D-HPLC), ce permite separarea
proteinelor pe baza a dou principii diferite: hidrofobicitatea i pH-ul izoelectric.

Pentru realizarea unor separri eficiente, n timp scuri de analiz se impune n ultimul
timp tehnica numit cromatografie n faz lichid de nalt performan (HPLC High
performance pressure liquid chromatography).
Printre avantajele acestei metode amintim: cantitate redus de prob necesar pentru
analiz; substanele de analizat nu trebuie s fie volatile; timpi scuri de analiz; condiii de
lucru simple pentru pregtirea probelor; efectuarea analizei i prelucrarea datelor; polaritatea fazei
mobile i fazei staionare poate fi variat, ceea ce conduce la posibilitatea unei separri
eficiente a amestecurilor de analizat; separrile se pot efectua de regul la temperatura
obinuit.
Pentru analizarea proteinelor din lapte se utilizeaz o separare n gradient, separare
care i modific faza mobil pe parcursul analizei. Aceasta modificare presupune utilizarea a
cel puin 2 solveni, aflai n rezervoare diferite, a cror debit este reglat cu ajutorul a dou
pompe. nainte de intrarea pe coloan, exist o camer de mixare unde sunt amestecai
solvenii, n proporii bine definite.
Introducerea probelor pe coloane se realizeaz n volume de 20l cu ajutorul unor
microseringi, prin dispozitive speciale prevzute n capul coloanei. Detectorii pot indica
modificarea unei mrimi fizice sub forma unui semnal, a crui nlime este proporional cu
concentraia compusului rspunztor de aceast modificare. Detectorii au abilitatea de a sesiza
i semnala prezena compuilor separai la ieirea din coloan. Exist diferite tipuri de
detectori n funcie de proprietatea caracteristic a compuilor separai: detectori UV-Vis, de
fluorescen, etc. Detectorii sunt cei care transmit apoi informai unui nregistrator care
nregistreaz cromatograma. n cazul analizei proteinelor se utilizeaz detecia n UV.
Analiza proteinelor laptelui se realizeaz utiliznd cromatografia n faz invers (RPHPLC - reverse phase HPLC). Se utilizeaz o coloan de tip Vydac C8. Este o faz staionar
nepolar, derivai ai silicailor la care se ataeaz grupri C 8 (de exemplu C8H17). Faza mobil
are un caracter polar, fiind un amestec de ap cu acetonitril i n prezen de acid trifluoacetic
(TFA). Compuii polari sunt eluai mai nti iar compuii omologi sunt reinui cu att mai
puternic cu ct este mai mare lungimea catenei lor.
Pentru separare se utilizeaz un sistem n gradient n care solventul A (solventul de
fixare) este o soluie apoas de TFA 0,01% iar solventul B (solventul de eluie) este acetonitril
90% (v/v) i TFA 0,01% n ap.
Separarea proteinelor din probele de lapte se efectuatueaz n gradient, n urmatoarele
conditii:
-

31% solvent B timp de 5 minute;

crestere liniara de la 31% la 46% solvent B timp de 40 minute

100% solvent B timp de 5 minute

100% solvent A timp de 10 minute

un debit de 1ml/minut.

Detecia se realizeaz la dou lungimi de und diferite: 220 nm (lungimea de und

specific absorbiei legturilor peptidice) i la 280 nm (lungimea de und specific absorbiei
nucleelor din aminoacizii aromatici).
Pentru separare s-au injectat 20ml lapte degresat pentru a optimiza separarea coloana a
fost meninut la o temperatur de 40C.

2.2.2. Rezultate
Se poate observa, comparnd cromatograma 1 cu cromatogramele 2 i 3, ordinea n
care sunt separate proteinele din lapte. Astfel, n prima parte a seprrii, ntre minutele 0 - 25
sunt separate cazeinele n timp ce proteinele din lactoser sunt separate mult mai trziu, dup
minutul 50.

1. lapte oaie

Fig.4: Cromatograma obinut n separarea proteinelor din lapte intregral de oaie

2. lapte vac

Fig.5: Cromatograma obinut n separarea proteinelor din lapte intregral de vac

3. lapte bivoli

Fig.6: Cromatograma obinut n separarea proteinelor din lapte intregral de bivoli

3.ANALIZA AMINOACIZILOR COMPONENI AI PROTEINELOR DIN

LAPTE

Proteinele din lapte sunt considerate de o valoare biologic superioar datorit

coninutului n aminoacizi eseniali nu numai n cantiti suficiente, dar i ntr-un raport optim
pentru activitatea vital a organismului. Laptele i produsele lactate reprezint sursele de
bogate proteine i importante din punct de vedere calitativ n dieta uman. Din punct de
vedere tehnologic este foarte important descrierea cantitii de proteine din aceste surse i de
asemenea caracterizarea acestor proteine din punct de vedere al coninutului n aminoacizi, n
special a aminoacizilor eseniali.
Coninutul i tipul de aminoacizi utilizai de ctre esutul mamar n biosinteza
proteinelor specifice laptelui pot fi influenate de diveri factori printre care se numr:
concentraia aminoacizilor n snge; mecanismele de preluare a aminoacizilor de ctre
celulele mamare precum i metabolismul intracelular al acestor aminoacizi. Fiecare dintre
aceste nivele de control sunt la rndul lor influenate de diveri factori . De exemplu, nivelul
aminoacizilor din snge este dependent de nutriie i starea fiziologic a animalului. Preluarea
i metabolismul intracelular al aminoacizilor, la nivelul glandei mamare, este un mecanism
extrem de complex. Anumii aminoacizi eseniali (lizina, metionina, fenilalanina, tirozina,
triptofanul) sunt preluai ntr-un raport stoichiometric n timp ce ali aminoacizi (de exemplu
arginina) sunt preluai ntr-o cantitate mai mare dect cea necesar biosintezei proteinelor
laptelui. De asemenea, anumii aminoacizi pot fi utilizai de glanda mamar att n scop de
biosintez a proteinelor ct i ca surs potenial de energie respectiv ca surse de atomi de
carbon i azot necesari sintezei aminoacizilor neeseniali.
Numeroase metode analitice de laborator pot fi utilizate pentru identificarea i cuantificarea
aminoacizilor componeni ai proteinelor cum ar fi: cromatografie pe strat subire,
cromatografia n faz lichid de nalt performan, ion-cromatografie respectiv cromatografia
n faz gazoas. n general, aceste determinri se efectueaz pe soluii obinute prin hidroliza
chimic a proteinelor, n mediu puternic.
Metodele de analiz HPLC s-au dovedit utile n analiza coninutului de aminoacizi a
laptelui praf pentru copii. Aminoacizii au fost derivatizai prin tratare cu 6-aminochinolin-Nhidroxisuccinimidil carbamate, produii obinui fiind apoi separai prin cromatografie HPLC
n faz invers i detecie cu fluorescen. n aceste condiii nu s-a putut ns determina
triptofanul, analiza acestuia necesitnd o nou separare HPLC utiliznd detecia n domeniul
UV .
Numeroase metode gaz-cromatografice au fost utilizate pentru identificarea
aminoacizilor din proteine. naintea analizei gaz-cromatografice, aminoacizi din hidrolizatul
de proteine trebuiesc transformai n derivai volatili, aceast transformare necesitnd

efectuarea unor reacii chimice la nivelul gruprilor funcionale specifice - gruparea carboxil
respectiv gruparea amino. Dup derivatizare i separare cromatografic, aminoacizii separai
trebuiesc identificai. Acest lucru este posibil prin utilizarea standardelor de aminoacizi.
Metodele gaz-cromatografice simple sau cuplate cu spectrometria de mas sunt
frecvent utilizate n laboratoare pentru a identifica prezena nedorit a unor derivai de
aminoacizi, n alimente respectiv lapte. Un astfel de derivat este lisinoalanina (LAL), un
produs nedorit ce se formeaz n timpul procesrii laptelui i ce poate fi ntlnit n diverse
produse lactate [Montilla i colab., 2007].
De asemenea, analiza GC poate fi util n identificarea D-aminoacizilor, izomeri
optici prezeni n laptele de vac proaspt (D-alanina, D-aspartat, D-glutamat) dar abseni n
laptele uman. S-a observat c n cazul D-alaninei coninutul crete n timpul pstrrii laptelui
la 4C, acest izomer optic fiind de altfel utilizat ca un indice (marker) a contaminrii
bacteriene a laptelui.

3.1.CONINUTUL N AMINOACIZI AL PROTEINELOR LAPTELUI

Analiza aminoacizilor componeni ai proteinelor laptelui s-a realizat pe doua tipuri de
lapte lapte de vaca i lapte de bivoli.
Pentru o analiz calitativ a cromatogramelor trebuie precizat faptul c pentru un
sistem cromatografic dat, fiecare substan se caracterizeaz printr-un timp de retenie (tR).
Injectarea prealabil, n aceleai condiii de analiz, a unui amestec de standarde de
aminoacizi (Sigma) a permis identificarea componentelor separate prin compararea t R. In
tabelul 2 sunt redai timpii de retenie pentru fiecare standard de aminoacid.
Tabelul 2
Timpii de retenie pentru fiecare aminoacid standard separat prin GC

Aminoacizi
Alanina
Glicocol
Treonina
Serina
Valina
Leucina
15N-Izoleucina
Izoleucina
Prolina
Acid aspartic

Timp de retentie (minute)

12.44
13.06
14.5
14.95
15.42
17.47
17.57
17.76
21.11
27.03

Fenil-alanina
Acid glutamic
Lizina
Tirozina

27.32
30.53
30.62
34.93

3.2.REZULTATE
In figura 7 sunt prezentate cromatogramele obinute n cazul separrii aminoacizilor
din laptele de vac (dou extracii diferite), pe cromatograma fiind prezentat, pentru fiecare
aminoacid separat, timpul de retenie. Rezultatele analizei cantitative sunt prezentate n
tabelul 2, ele reprezentnd media a trei determinri paralele.
RT: 6.97 - 27.63
NL:
6.23E7

15.61

100
90

TIC F: MS
lb1

12.51

Relative Abundance

80
70

24.68

8.39

60
50

21.39

40

21.27

8.90
9.83 10.70

30

18.05

20
10

12.68
7.57

13.64
14.16

11.60

0
100

24.92

17.58

19.66
18.73
20.84

25.12 27.58

23.10

NL:
3.17E7

15.54

90

TIC F: MS
s1a

12.46

80

24.63

70
60
50
8.36

40

20

21.26

10.48
10.70
10.08

30

10

21.38

7.05
8

12.66

11.40
10

24.87

12

24.29

14.13 14.82
14

15.69
16

18.04 18.75

18
Time (min)

20

21.71 23.67
22

24

Fig.7: Cromatogramele comparative de separare a aminoacizilor

din dou probe de lapte de vac

25.80 27.58
26

n cazul laptelui de bivoli s-a observat un profil al aminoacizilor apropiat cu cel al

laptelui de vac, rezultatele analizei cantitative fiind prezentate n tabelul 3.
Tabelul 3
Coninutul n aminoacizi al laptelui de vac i bivoli

AMINOACIZI
Alanina
Glicocol
Serina
Valina
Leucina
Izoleucina
Cisteina
Prolina
Metionina
Acid aspartic
Fenilalanina
Tirozina
Acid glutamic
Lizina
Arginina
Histidina
Orn

Coninutul exprimat n g/100g

lapte de vac
lapte de bivoli
7,58
14, 84
2,05
7, 34
3,84
3, 00
5,11
5, 99
20,29
23, 68
2,20
1, 83
6,81
25,55
47, 86
1,13
0,56
3,39
5,65
12, 52
5,32
0,56
19,88
51, 64
9,59
23, 79
7,62
4,45
25, 99

n figura 8 este redat una din cromatogramele obinute n separarea gazcromatografic a aminoacizilor din lapte de bivoli.

RT: 11.70 - 35.51

NL:
4.60E5
TIC F: MS
MirelaAdel
aLBiv

170
160
150
140
130

R e la tive Ab u n d a n ce

120
110
21.25

100
90
80

30.66

70
60

17.60

27.40

50
40

34.97

12.47

30.81

27.15

30

33.88
13.09

20
10

15.40

18.77

14.48
15.93

0
12

14

16

32.86

19.08
18

20

22.82 24.46 25.71

22

24
Tim e (m in)

26

30.17
28

30

32

34

Fig.8: Cromatograma de separare a aminoacizilor din lapte de bivoli

Pentru o mai bun interpretare a rezultatelor obinute, n figura 9 este reprezentat
grafic modul n care variaz coninutul aminoacizilor la speciile luate n lucru n aceast
analiz - vac i bivoli. Se observ variaii mari n profilul aminoacizilor la cele dou
specii. Anumii aminoacizi, cum sunt cisteina, acidul aspartic, arginina i histidina au fost
evideniai doar n laptele de vac, ei nefiind prezeni n laptele de bivoli analizat n timp ce
ornitina a fost prezent la bivoli dar nu a fost evideniat la vac.
Diferene sunt observate i n ceea ce privete cantitatea n care sunt prezeni
aminoacizii. Astfel n cazul alaninei, acidului glutamic, glicocolului i prolinei, cantitile de
aminoacizi prezeni n laptele de bivoli sunt de 2-3 ori mai mari comparativ cu cele prezente
n laptele de vac.

Orn0

26

His 4.450
Arg

7.62 0

Lis

9.5

23.8

Glu

19.8

51.64

Tir 5.320.56
Phe 5.65

12.52

Asp 3.390
Met1.13
0.56
Pro

25.5

Cis

47.8

6.81 0

Ile 2.2
1.83
Leu

20.2

Val

5.1

23.6

5.9

Ser 3.8 3
Gli2.05 7.3
Ala

7.58
0

14.84
10

20

30

40
vac

50

60

70

bivoli

Fig.9: Analiza comparativ a profilului aminoacizilor n lapte de vac i bivoli

CONCLUZII
In urma studiului lecturii de specialitate privind proteinele din lapte, cele mai
utilizate tehnici de analiza sunt cele cromatografice respectiv cele spectrometrice.
Una din tehnicile de analiza a proteinelor din lapte este cea care presupune separarea
i identificarea proteinelor prezente n lapte realizate prin cromatografie n faz invers RPHPLC. Cromatogramele ce se pot obtine la toate probele de lapte provenite de la specii
diferite pot avea acelasi profil proteic, ce pot diferii la nivelul proporiei relative dintre
diversele cazeine, fapt ce poate fi explicat de polimorfismul genetic.

80

Pentru determinarea aminoacizilor prezeni n proteinele din lapte se poate utiliza o alt
tehnic respectiv, tehnica cromatografic - gaz cromatografia (GC). Analiza aminoacizilor
componeni ai proteinelor laptelui se poate realiza pe doua tipuri de lapte lapte de vaca i
lapte de bivoli,asa putand fi observate diferene de ordin calitativ i cantitativ. Anumii
aminoacizi, cum sunt cisteina, acidul aspartic, arginina i histidina se pot identifica doar n
laptele de vac, ei nefiind prezeni n laptele de bivoli, n timp ce ornitina poate fi prezent
la bivoli dar nu si in laptele de vac. n cazul alaninei, acidului glutamic, glicocolului i
prolinei, cantitile de aminoacizi prezeni n laptele de bivoli pot fi de 2-3 ori mai mari
comparativ cu cele prezente n laptele de vac.

BIBLIOGRAFIE

1. Casian Ana,2008. Contributii la optimizarea metodei cromatografice de lichide

sub presiune pentru aplicarea in analiza farmacocinetica, Chiinu.

2. Guzun A. Valentina., 1996. Tehnologia laptelui i a produselor lactate. Editura

Universitas, Chiinu.
3. http://www.scritub.com/stiinta/chimie/Cromatografia-de-lichide54483.php
4. http://cachescan.bcub.ro/2008_05_28/cap_10_1_pagini_148_159
5. http://www.food-info.net/ro/qa/qa-fp1.html