MEDIOS DE CULTIVO

Como todos los organismos vivos, los microorganismos requieren ciertos

nutrientes bsicos y factores fsicos para el mantenimiento de su vida, estas
necesidades varan segn el tipo de microorganismo y es necesario conocerlas
para cultivarlos en el laboratorio.
Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de
microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que
crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de
cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio
de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son:
temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un
grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los
nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.
La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos
similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso,
la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y
Peptona a la que se aadirn otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de
medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua
hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no
tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas
que crecen en l.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que
bastantes bacterias provocan su licuacin.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc.
Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para
incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de
fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la
sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los
microorganismos menos resistentes. Tambin se aaden colorantes que actan
como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como
inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se
usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La
Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la
mayora de las bacterias Gram positivas).
Las necesidades nutricionales bsicas pueden suministrarse en el laboratorio,
mediante el uso de medios de cultivo artificiales, los cuales se encuentran
disponibles en una gran variedad y los cuales en general aportan a los
microorganismos:
1. disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de

contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales
inorgnicas.
En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otra sustancia
inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias
adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las
reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se
suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de
carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas
sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaba la prdida de
los factores nutritivos lbiles.
Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios
es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible
de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no
suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de
atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno
presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade
a muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc.
Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales
como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias
promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica.
Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como
indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de
ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.
a) Una fuente de carbono. El carbono es un componente esencial y central
para conformar la estructura celular y permitir a la clula realizar todas
sus funciones. Segn la fuente de carbono los microorganismos se
encuentran en dos grupo: Auttrofos y hetertrofos. Los organismos
auttrofos pueden cultivarse en medios que contengan nicamente
compuestos inorgnicos (utilizan principalmente dixido de carbono
como carbono inorgnico). Los organismos hetertrofos en su lugar
necesitan un suministro de carbono orgnico (por ejemplo glucosa u
otro carbohidrato).
b) Una fuente de Nitrgeno. Elemento esencial para que la clula
construya macromolculas como: protenas y cidos nucleicos. Algunos
microorganismos usan nitrgeno atmosfrico, otros emplean sales de
nitrato o de amonio como compuestos inorgnicos, as como, otros
requieren compuestos orgnicos que contengan nitrgeno como los
aminocidos.
c) Elementos no metlicos. Iones no metlicos como el azufre y el fsforo.
El azufre puede encontrarse en protenas, sulfatos o como azufre
elemental; mientras el que el fsforo puede encontrarse formando sales.
d) Elementos metlicos (Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, Fe+2 y Fe+3).
Llamados tambin micronutrientes, oligoelementos o elementos traza.
Encontrados en sales inorgnicas adicionadas a los medios y los cuales
son tomados en bajas concentraciones por los microorganismos. 5.
Vitaminas. Los microorganismos pueden tomarlas del medio ya
elaboradas o iniciar procesos de sntesis de las mismas. Algunos
microorganismos poseen una variedad de vas para sintetizar vitaminas;

mientras otros, sintetizan un nmero muy limitado de ellas a partir de

componentes del medio. Otros las requieren como suministro.
e) Agua.
f) Energa. Existen dos tipos bioenergticos de microorganismos, los
fottrofos y los quimitrofos. Los fottrofos emplean la energa radiante
(luz solar), como nica fuente de energa; y los quimitrofos que,
obtienen la energa por oxidacin de compuestos qumicos orgnicos o
inorgnicos.

2.Las necesidades fsicas involucran factores, como: Temperatura, pH y

gases, los cuales se encuentran en un rango ptimo especfico para cada
microorganismo; por lo tanto, su variacin puede acelerar o disminuir el
crecimiento.
a) consistencia adecuada del medio: Partiendo de un medio lquido
podemos modificar su consistencia aadiendo productos como
albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado
semislido o slido.
Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de
que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a
temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que
otros tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad
y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo
uso est ampliamente extendido en el laboratorio.
b)

presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases: Gran cantidad de

bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno
normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados
sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se
desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental.
En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen
mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de
oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un
metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas
condiciones.
c) condiciones adecuadas de humedad: Un nivel mnimo de humedad,
tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen
desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay
que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las
estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de
agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los
cultivos y evitar as que se deseque el medio.
d) Luz ambiental: La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor
en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones
evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos.
e) pH: La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el
crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan
mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren
medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de
cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano
pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos
normales.

f) Temperatura: Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a

temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y
los termfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores
(hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en
rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los
saprofitos tienen rangos ms amplios.
g) Esterilidad del medio: Todos los medios de cultivo han de estar
perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que
puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano
normal del o de los especmenes inoculados en dichos medios. El
sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave
(que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante)
El profesional que desarrolla trabajos con microorganismos o con un
microorganismo en particular, debe satisfacer sus necesidades nutricionales,
con el objetivo de recuperarlo y hacerlo crecer adecuadamente. De manera
general, estos medios pueden ser medios artificiales o medios qumicamente
definidos. Para los qumicamente definidos se conocen las cantidades exactas
de compuestos qumicos puros que los conforman ya sean de tipo orgnico
como inorgnico. Los medios artificiales estn compuestos de un nmero
limitado de sustancias complejas, como extractos de plantas o de animales
cuya composicin qumica exacta no se conoce. De acuerdo a lo anterior, los
microorganismos en general pueden tomar los requerimientos nutricionales de
los medios de cultivo, ya sean sustancias naturales o artificiales para
multiplicarse.
MEDIOS DE CULTIVO Y CLASIFICACIN.
El conocimiento de la nutricin microbiana permite el cultivo de los
microorganismos en el Laboratorio. Un medio de cultivo es una solucin
acuosa (bien como tal o, bien incorporada a un coloide en estado de gel), en
las que estn presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de
un(os) determinado(s) microorganismo(s) (Tabla 1).
Propiedades de los medios de cultivo.

Humedad. Indispensable para el crecimiento de microorganismos, su

carencia (desecacin) puede llevar a la muerte del microorganismo.
Fertilidad. Se refieren a los elementos o compuestos bsicos que
permiten el crecimiento bacteriano.
pH. Se refiere a los pH ptimos para el desarrollo bacteriano,
indispensable para su aislamiento; variaciones cidas o alcalinas,
pueden inhibir su crecimiento.
Transparencia. Permite la observacin bacteriolgica, evidenciar
morfolgica y fsicamente su crecimiento en medios de cultivo
adecuado.
La presentacin comercial de los medios sintticos y deshidratados
puede ser en polvo o granulados. En el mercado se pueden encontrar
medios listos para fundir o medios servidos en placas Petri o tubos.
Los medios de cultivo granulados, son medios de cultivo elaborados a
partir de materias primas sometidas a molienda, mezclado,
pulverizacin y granulacin (aglutinacin de la mezcla pulverulenta).

Este tipo de medios tienen algunas ventajas frente a los medios

tradicionales en polvo, como lo son:
Reduce alergizacin o respiracin de sustancias txicas por produccin
de polvo.
Menor adherencia a las paredes de los recipientes.
Mayor facilidad en el pesaje.
Mejor humectabilidad (grumos fcilmente solubles).
No se produce separacin de fases de los componentes del medio de
cultivo en almacenamiento prolongado.
Mejor conservacin.

ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIN DE MEDIOS DE CULTIVO.

Los medios de cultivo deshidratados deben ser conservados en lugares secos,
protegidos de la luz, a una temperatura entre 15 y 30C, en envases bien
cerrados y dispuestos preferiblemente de forma horizontal.
Despus de haber sido retirada una cantidad de medio de los envases, estos
deben cerrarse firmemente.
Los medios de cultivo preparados y esterilizados listos para su uso son
utilizables por tiempos cortos, mximo de una semana y lo ms conveniente
es almacenarlos a temperatura de refrigeracin (mximo 4C); aunque algunos
medios que contienen tioglicolato, se conservan mejor a temperatura
ambiente y protegidos de la luz por un tiempo mximo de 4 das. Bajo
condiciones ptimas de almacenamiento, los medios deshidratados conservan
sus cualidades durante el tiempo indicado y hasta la caducidad impresa en la
etiqueta del recipiente.
A los medio de cultivos se les realiza una prueba de esterilidad, ya sea cuando
estn deshidratados (Ecomtrico), o preparados. En el ltimo caso se toma del
lote una muestra no inferior al 5%, incubndose estas muestra a 37C/24h.
Finalizado el tiempo de incubacin se observa si presentan crecimiento
microbiano con el fin de descartar los lotes de medios contaminados.
PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
Es un proceso clave en el trabajo de rutina e investigacin microbiolgica. Para
obtener un producto final bien terminado (medio de cultivo), deber contarse
con la habilidad, destreza, conocimientos bsicos en fisicoqumica y
microbiologa. En trminos generales, un medio de cultivo puede ser
preparado correctamente siguiendo las indicaciones relacionadas a
continuacin:
1. Disolucin del medio de cultivo deshidratado. Se debe emplear agua
limpia, recin destilada o desmineralizada y con pH lo ms cercano
posible al neutro. Los recipientes a usar deben ser lo suficientemente
grandes para que el medio sea agitado con facilidad. Inicialmente se
aade la mitad de agua y se agita suficientemente para conseguir una
suspensin homognea; despus, se incorpora la cantidad de agua
restante. Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento,
pero no debe calentarse ms de lo estrictamente necesario. Leer
siempre la etiqueta del envase, en caso de que no deba ser sometido a

ulterior esterilizacin en autoclave, es imprescindible prestar atencin

en su disolucin completa, esto se confirma cuando al agitar no se
adhiere a la pared interna del recipiente ninguna partcula de agar o de
medio y la solucin fluye libremente. Si la preparacin es de ms de 2
litros, se recomienda desler el medio de cultivo en una dcima parte de
la cantidad total de agua y dejarla remojar durante 15 min.;
simultneamente, calentar a ebullicin el agua restante y agregar sta
agua con constante agitacin al medio remojado. Calentar hasta su
completa disolucin.
2. Esterilizacin. Antes de su esterilizacin y despus de su completa
disolucin se debe repartir el medio en los recipientes definitivos o en
los que se lleve a cabo el trabajo de investigacin, excepto si
corresponde a cajas de Petri. La esterilizacin, si as lo indica la etiqueta,
se lleva a cabo en autoclave a 121C/15 libra de presin/15min. Tras la
esterilizacin y despus de haber alcanzado el equilibrio de presiones
(vlvula abierta), y para evitar la sobrecarga trmica del medio de
cultivo, este debe sacarse enseguida del autoclave y enfriar los
recipientes rpidamente a temperatura de vertido entre 45 y 50 C, as
se evitar alterar el medio de cultivo.
3. Vertido en placa. Previamente, remover el medio de cultivo oscilando el
recipiente en sentido circular para entremezclarlo de manera uniforme;
verter el medio a las cajas Petri a la temperatura de vertido, evitando la
formacin de humedad en la tapa de la caja. Las burbujas de aire en la
superficie de la placa se eliminan abanicando brevemente con la llama
no luminosa de un mechero de Bunsen. Recuerde que el proceso de
servido de las cajas debe realizarse en un cuarto estril o en cmara de
flujo laminar.
4. Tubos de agar inclinado (bisel o pico de flauta), y sin inclinacin. Los
tubos llenos de medio de cultivo esterilizado, todava lquido, se colocan
en una posicin inclinada de tal forma que se forme una placa de
aproximadamente 3cm y una superficie inclinada de iguales
dimensiones (Agar inclinado, pico de flauta o bisel). En los casos en los
cuales se requiere el medio sin inclinar, estos deben dejarse solidificar
en posicin vertical sobre una gradilla.
Posibles defectos en la manipulacin y preparacin de medios de
cultivo.
Apelmazamiento de los medios de cultivo deshidratados. Se debe a una
conservacin del medio de cultivo en ambiente exclusivamente
hmedo; puede ser la causa de envases abiertos por tiempo prolongado
o dejar mal cerrado el envase despus de su uso o por ltimo que, el
medio de cultivo se encuentra vencido (ver fecha de vencimiento). Se
recomienda despus de usarlos, cerrarlos muy bien y almacenarlos en
posicin horizontal.
Desviacin del pH. Causado por utilizacin de agua no neutra, envases
mal cerrados, sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su
preparacin o medio pasado de fecha de vencimiento.
Turbidez. Precipitacin causada por uso de recipientes sucios,
sobrecalentamiento del medio, prdida de agua por evaporacin en el
medio o por no disolucin completa del agar-agar.

Escasa estabilidad del gel. Debido a la proporcin inadecuada del medio

de cultivo deshidratado, mala disolucin del agar-agar e ineficiencia en
la agitacin.
Medios de cultivo contaminados. Por esterilizacin deficiente o
contaminacin posterior a su preparacin (vidriera no estril y/o
contaminacin en etapa de servido de los medios).
Colonias inconcretas o desledas. Causada por superficies hmedas de
los medios y/o por demasiado inculo en la siembra.
CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO.

Tabla 1. Clasificacin de los medios de cultivo de acuerdo a su estado fsico, composicin y su propsito.

ATENDIENDO A SU ESTADO FSICO:

Medios de cultivo Slido y Lquido: Una forma muy til de poder

aislar, identificar y conservar los microorganismos es mediante el uso de
medios de cultivo, inicialmente ideados por Pasteur (que como ya
sabemos se considera el padre de la microbiologa), quien se dio cuenta
que los microorganismos podan crecer en soluciones que tuvieran
azcar y una fuente de nitrgeno.
De ese tiempo hasta ac, ha pasado mucha agua debajo del puente y
actualmente existen medios muy especializados para microorganismos
muy exigentes. La forma ms sencilla de clasificar los medios de cultivo
es por su consistenciaentonces aparecen los medios de cultivo slidos
y los medios de cultivo lquidos o tambin llamados caldos. En ambos
medios debe haber una buena cantidad de nutrientes que faciliten el
crecimiento bacteriano y entonces cul es la diferencia? pues la
diferencia radica en la presencia de una sustancia que se llama Agar o
Agar-Agar y que es la encargada de darle la solidez y consistencia al
medio. Esta sustancia proviene, principalmente, de un alga llamada
Gelidium, aunque muchos otros gneros pueden servir como fuente de
este polisacrido (es decir, un azcar grande formado por la unin de
azcares pequeos). Y cmo se obtiene del alga? Se toman sus
semillas, se lavan, se secan, se realizan procesos de extraccin,
filtracin, purificacin y desecacin para que queden hojuelas o polvo y
luego si adicionarla al medio de cultivo.
Fue, Robert Koch, mdico alemn dedicado al estudio de los
microorganismos y considerado uno de los autores de la teora
microbiana, quien empez a cultivar y aislar microorganismos. Koch,
buscando mejorar la tcnica utilizada hasta ese momento, decidi
solidificar los medios de cultivo aadindoles gelatina. Sin embargo, y a
sugerencia de una ayudante, introdujo el agar. Tiene alguna ventaja el
uno sobre el otro? Pues la ventaja fundamental de usar un medio de
cultivo lquido, es que permite que crezcan bacterias que se encuentran
en muy poca cantidad, es decir, cuya concentracin es muy baja en la
muestra que estemos analizando. Para el caso del medio de cultivo
slido, la ventaja radica en que permite detectar los diferentes tipos de
bacterias que puedan encontrarse en una sola muestra, entonces el
usar uno u otro medio de cultivo depender de lo que busquemos o
queramos: aislar una bacteria que se encuentre en cantidades muy
pequeas (medio lquido) o todas las bacterias que puedan haber en
una muestra (medio slido)
Medios semislidos: Se preparan a partir de los medios lquidos,
agregando a stos un agente solidificante en una proporcin menor que
para preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la
movilidad de las bacterias.
SEGN SU UTILIZACIN:
Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mnimos
para que pueda crecimiento de bacterias que no necesiten
requerimientos especiales. El medio ms conocido de agar nutritivo o
agar comn, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo. Otros

representantes grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia,

etc.
Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, adems de las
sustancias nutritivas normales, serie de factores indispensables para el
crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento hace
por adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero, leche,
huevo, bilis, dichos factores. En ocasiones es posible aadir
suplementos artificiales a los enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex,
Isovitalex, etc). El gonococo, por ejemplo, necesita para su crecimiento.
Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al
medio chocolate).
Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el
crecimiento de ciertas bacterias. Una poblacin polimicrobiana. El
fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente de
una poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de medio selectivo es
el caldo selenito, que favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el
del resto de enterobacterias.
Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia
caractersticas bioqumicas, diferenciar gneros o especies. La adicin
de un azcar fermentable o un sustrato metabolizable este fin. El medio
MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los
grmenes lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo son el
C.L.E.D. (lactosa +/lactosa hemlisis), el SS (que es doblemente
diferencial), etc.
Medios selectivos y diferenciales.

Agar MacConkey: Medio selectivo para el crecimiento de

enterobacterias. Contiene peptona, sales biliares, lactosa y rojo
neutro como indicador de pH (evidencia la fermentacin de la
lactosa por el cambio de color).
Agar SS (Salmonella-Shigella): Contiene peptona, lactosa, bilis de
buey desecada, citrato sdico, tiosulfato sdico, citrato de hierro
(III) y amonio, verde brillante y como indicador de pH Rojo neutro,
que evidencia la fermentacin o no de lactosa. Las colonias de
microorganismos lactosa-negativos son incoloras y las de
microorganismos lactosa-positivos son rosadas hasta rojas.
Tambin pueden determinarse microorganismos formadores de
H2S, por la formacin de un centro negro en la colonia.
Agar EMB (Eosina Azul de Metileno): Contiene colorantes que
impiden el crecimiento de bacterias Grampositivas. E. coli crece
formando colonias con brillo metlico caracterstico, por la
cristalizacin de la Eosina.
Medio de Telurito: Permite el crecimiento de Corynebacterias,
Staphylococcus y Listeria. El Telurito de potasio al 2%, es reducido
por las Corynebacterias reductoras, apareciendo colonias de color
gris-negro.

Medio de Sabouraud: Medio utilizado para el aislamiento de

mohos y levaduras. Contiene dextrosa, peptona o maltosa y con
pH entre 5,0 y 5,5, inhibiendo el desarrollo de otros
microorganismos por efectos de la acidez del medio.

Medios inhibidores: Cuando las sustancias aadidas a un medio

selectivo impiden totalmente a una poblacin microbiana, se denomina
inhibidor. Los medios inhibidores podran considerarse variante ms
restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen
habitualmente de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que
inhiba completamente el desarrollo de determinada. Un medio inhibidor
es el MacConkey que permite el crecimiento de los grmenes impide el
crecimiento de los Gram positivos.
Medios de identificacin: Son los destinados a comprobar alguna
cualidad especfica que para reconocer la identidad de un
microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos asegurar el
crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que vaya a
ser metabolizado que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio
de Simmons y en general, cualquier medio haya aadido un elemento
diferencial de un microorganismo, son medios utilizados Actualmente
estn apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios
especficos de identificacin ciertos microorganismos, con lo cual se
consigue simultneamente abaratar el costo y reducir identificacin.
Son ejemplos de esto ltimo los medios CPS ID3 o Uriline ID
(Biomerieux), identificar los grmenes urinarios ms importantes a
partir de la placa de cultivo gracias a sustratos cromognicos
especficos.
Medios de multiplicacin: Sirven para obtener una gran cantidad de
clulas a partir de un microorganismo aislado. Seemplean en la
obtencin de vacunas, en la investigacin y en la industria. Los medios
para la multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebrocorazn (BHI), es medios.
Medios de conservacin: Se utilizan para conservar una cepa que,
por diversas razones mantener. Fundamentalmente se utilizan como
controles de calidad de las pruebas y reactivos el Laboratorio de
Microbiologa. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres
formas:
a) haciendo pases peridicos de placa a placa,
b) mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y
c) congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%.
Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras
clnicas que no pueden inmediatamente. Su utilizacin debe hacerse
introduciendo la torunda con la que se obtuvo interior del medio
(generalmente en un tubo). Son ejemplos tpicos de este grupo los
medios Amies, Cary-Blair, etc.

ATENDIENDO A SU COMPOSICIN:
Segn las sustancias que entren a formar parte en su composicin, los
medios de cultivo pueden ser clasificados en:
Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los ms
empleados se preparan a partir de tejidos animales, y ms raramente
de vegetales. Su composicin no es exactamente definida, y por
consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos
inconvenientes
en
condiciones
experimentales,
donde
la
reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos
medios dan excelentes resultados y son los ms empleados.
Medios sintticos: Son aquellos que contienen en su composicin
exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua
destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de
composicin perfectamente definida.
Medios semisintticos: El gran nmero de factores de crecimiento
exigidos para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio
sinttico para estos grmenes sea imposible o demasiado cara. En este
caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto
orgnico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos,
etc.).Ciertos grmenes no crecen en ningn medio por muy enriquecido
que est ste, hacindolo exclusivamente en clulas vivas con unas
caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los
virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.
SEGN SU ORIGEN:
NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de
origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y
cuya composicin qumica no se conoce exactamente.
SINTTICOS: son los medios que contienen una composicin qumica
definida cualitativamente y cuantitativamente. Se utilizan para obtener
resultados reproducibles.
SEMISINTTICOS son los sintticos a los que se les aaden factores de
crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por
ejemplo extracto de levadura.
RECUENTO DE MICROORGANISMOS VIABLES TOTALES. (MUESTRAS
LQUIDAS U HOMOGENEIZADAS).
- Se trata de conocer el nmero total de microorganismos presentes en el
alimento. Este nmero no guarda relacin con el de microorganismos
patgenos por lo que no puede usarse como ndice de su presencia y slo
debe considerarse un indicador de las caractersticas higinicas generales del
alimento.

- Dependiendo de las caractersticas del medio utilizado (medio rico, medio

limitado en nutrientes para medida de la flora no lctica de alimentos
fermentados) y de las condiciones de incubacin (mesfilos, psicrfilos) los
microorganismos analizados sern miembros de poblaciones diferentes. En
general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o
aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas situaciones
(alimentos envasados al vaco), puede ser de inters hacer recuentos de
anaerobios totales.
- Se han desarrollado tcnicas que hacen posible la automatizacin del
proceso.
- Hay cuatro tcnicas biolgicas bsicas tcnicas de recuento de viables:
1.- Contaje en Placa Standard (Standard Plate Count).
2.- Determinacin del nmero ms probable.
3.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes por viables.
4.- Contaje microscpico directo.
1.- Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen
conocido del alimento que se analiza. El resultado es funcin de una serie de
factores como son el mtodo de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo
de alimento y las caractersticas del medio de cultivo. Los cultivos pueden
hacerse tanto en masa como en superficie, aunque hay que considerar que los
cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. Cada bacteria viable
formar una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por
medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones
progresivamente ms diluidas de la muestra.

2.- Filtros de membrana: utilizados cuando el nmero de bacterias es bajo. Son

filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen
dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La
muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo
que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de
acridina que tie especficamente los cidos nucleicos).
3.- Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en ingls de Direct
Epifluorescence Filter Technique (tcnica deepifluorescencia directa en filtro).
En esta tcnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana
apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la
naranja de acridina) para teir las clulas bacterianas (se somete el filtrado a
un tratamiento previo con detergentes para destruir las clulas somticas). La
deteccin de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopa de
fluorescencia o por cualquier otro mtodo de medida de la epifluorescencia. En
ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que son ms
fcilmente dtectables.
4. Contaje de microcolonias al microscopio: Se aade un pequeo volumen de
agar-cultivo a un porta y se incuba para seguir la formacin de microcolonias
al microscopio.

5.- Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solucin madre) y se

depositan gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se
examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubacin.
6.- Films secos (Petrifilm): Son pelculas deshidratadas de medios de cultivos
generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata
el medio. Tras la incubacin se hace el recuento.
7.- Mtodo del nmero ms probable: Basado en series de diluciones y clculo
estadstico del nmero de bacterias presentes en las diluciones ms altas. Se
puede hacer con 3 o 5 tubos. El mtodo es popular aunque poco exacto.
8.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes: Usando azul de metileno o
resazurina. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de
color y esto es medible. Usado en medios lquidos (lcteos).
9.- Tubos rodantes: son tubos hermticamente cerrados en los que hacindolos
girar se forma una fina capa de agua. tiles para recuento de anaerobios.
10.- Contaje microscpico directo: Usando cmaras de cuenta, se coloca un
volumen determinado y se recuentan las bacterias.
- Adems de las tcnicas de recuento basadas en la formacin de colonias
observable (tcnicas biolgicas) hay una serie de procedimientos de recuento
basado en tcnicas qumicas, fsicas e inmunolgicas.
MTODOS FSICOS PARA LA DETENCIN DE MICROORGANISMOS.
A) Impedancia: Es la resistencia aparente presentada a la corriente alterna. En
un cultivo los microorganismos alteran los substratos cambiando su
conductividad elctrica y esto vara la impedancia. El mtodo se basa en
detectar estos cambios y la cantidad de microorganismos se expresa como
funcin del tiempo que tarda el cultivo en alcanzar unos valores de impedancia
correspondientes a 106 - 107 clulas por ml-1. (IDT: Imdepedance Detection
Time). Es necesario que el medio de cultivo permite un crecimiento
homogneo sin escalones.

B) Microcalorimetria: Estudio de los pequeos cambios de calor producidos

como consecuencia del anabolismo de nutrientes. Los diferentes tipos de
microorganismos metabolizan los substratos de forma diferente y, por ello, se
ha usado la microcalorimetra para poder identificar las especies presentes en
un alimento: usando un medio de cultivo con una composicin definida de
azcares pueden llegar a identificarse diferentes tipos de bacterias lcticas
mediante los termogramas de su metabolizacin de los azcares presentes en
el medio.
C) Citometria de flujo: Mtodo basado en hacer pasar una a una las clulas de
una suspensin por un sistema de deteccin; este sistema puede contener un
detector capaz de medir diferentes parmetros (diferentes tipos de
fluorescencia, absorbancia, dispersin de luz, etc.) lo que permite identificar
las bacterias durante su paso por el detector.
MTODOS QUMICOS DE DETECCIN DE MICROORGANISMOS.

A) Nucleasa Termoestable: S. aureus produce una nucleasa termoestable con

mayor rapidez y en mayor cantidad que la enterotoxina responsable de la
intoxicacin. La endonucleasa puede detectarse experimentalmente como un
ndice de la presencia de S. aureus incluso en concentraciones demasiado
bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de enterotoxina.
B) Lisado de Limulus: Usado para deteccin de endotoxinas (derivadas del
lipopolisacrido LPS de las bacterias Gram negativas). Se basa en la
aglutinacin de extractos de amebocito de sangre de Limulus (cangrejo de
mar) producido por cantidades del orden de picogramos de LPS. Puede
detectar 300 clulas de E. coli. El mtodo detecta clulas viables y no-viables.
Es muy rpido.
C) Sondas de cidos nucleicos: Sirven para identificar microorganismo
desconocidos por medio de Southern.
D) PCR: Mtodo para detectar nmero extremadamente bajos de
microorganismos con una cierta rapidez basada de la produccin de copias de
genes especficos de un microorganismo en cuestin.
E) Medida de ATP-: Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa, aunque
hay algunos problemas experimentales que hacen que la tcnica sea
controvertida.
F) Radiometria: Medida de la transformacin de un substrato con 14C en
14CO2: el tiempo necesario para detectar el 14CO2 es inversamente
proporcional a la cantidad de microorganismos presente.
G) Substratos Fluoro y Cromognicos: Se aaden como aditivos a los medios
de cultivos para facilitar y acelerar la deteccin de los microorganismos.
MTODOS INMUNOLGICOS.
Normalmente se usan antisueros que detectan flagelos (responsables de las
formas mviles de Salmonella y otras bacterias)
A) Anticuerpo fluorescentes: Se utiliza anticuerpo marcado con una molcula
fluorescente o un segundo anticuerpo que reconozca el primero. Se pueden
usar antisueros complejos en el primer anticuerpo y de esta forma detectar
cualquier tipo de Salmonella sin necesidad de aislarlas. El mtodo tambin se
ha usado para Clostridios aunque su mayor aplicacin ha sido en Salmonella
donde es muy conveniente por la sensibilidad y rapidez.

B) Serologia de enriquecimiento: En este procedimiento especialmente

desarrollado para la deteccin de Salmonella, el antisuero no se aade al
alimento sino que se efecta un paso previo de enriquecimiento del cultivo y
de seleccin para evitar falsos positivos.
C) Test 1 - 2 de Salmonella: Sistema con dos cmaras de agar blando. Una de
las cmaras (la de siembra) contiene un medio selectivo para Salmonella, las
bacterias mviles de este gnero atraviesan la cmara selectiva y pasan a la
no selectiva pero portadora de un anticuerpo especfico por lo que se forma
una banda de aglutinacin cuando entre Salmonella.

D) Radioinmunoensayo: se basa en el marcaje con un radioistopo de un

antgeno determinado (toxina producida por una bactera patgena) y su
posterior deteccin por anticuerpos especficos fijados sobre un soporte slido.
E) ELISA: El mtodo es similar al radioinmunoensayo: el antgeno se fija en un
soporte slido, se trata con el antisuero correspondiente y la interaccin se
detecta mediante una actividad marcadora (peroxidesa) unida al anticuerpo en
cuestin o a un segundo anticuerpo de revelado.
El mtodo se ha usado para deteccin de Salmonellas. Toxinas de S aureus,
micotoxinas, toxinas de C. botulinum, enterotoxinas de E. coli.
F) Difusin en gel: Mtodo de Ouchterlony para deteccin de antgenos.
EXAMEN DE SUPERFICIES.
- Mtodos dirigidos a detectar y medir los nmeros de microorganismos
presentes en superficies contaminadas.
- Algunas veces es necesario aadir agentes neutralizantes para eliminar el
efecto de detergentes que han sido utilizados para limpiar la superficie.
- El mtodo ms clsico de obtencin de muestra es el uso de torundas de
algodn o de alginato clcico. Las muestras se recogen en seco o en hmedo y
se depositan sobre medios de cultivo lquido (generales o de enriquecimiento).
- En algunos casos se usan otros mtodos como el contacto con placa o la
jeringa de agar.
RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS.
Se realiza o bien directamente en el alimento humedecido e incubado a 22C o
bien mediante diluciones sucesivas y siembra en placa en superficie. Es
necesario aadir agentes antibacterianos al medio de cultivo para evitar el
crecimiento de las bacterias, que es ms rpido que el de los mohos.