Practica IV Cromatografa

Escuela Nacional
De Ciencias
Biolgicas

EQUIPO 3
HERNNDEZ BALDERAS JOSE LUIS, RAMREZ PREZ ANA BERTHA

CROMATOGRAFIA
La cromatografa puede definirse como una tcnica que separa una mezcla de solutos
basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al
ser arrastrados por una fase mvil (lquida o gaseosa) a travs de un lecho cromatogrfico
que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser lquida o slida. Las propiedades de los
componentes de una mezcla determinan su movilidad entre s y con respecto a la fase
mvil. La base de la separacin cromatogrfica ser, por tanto, la diferencia en la
migracin de los mismos.
El botnico ruso Mijail Tswett (Figura
1) estableci las ventajas de la
tcnica, adopto la terminologa y
defini
los
procedimientos
experimentales bsicos para esta
tcnica, se considera que es el Padre
de la Cromatografa. En los aos 30 y
40 empez su desarrollo y aplicacin
en diferentes procedimientos de
experimentacin.
La
palabra
Cromatografa
significa Escribir en Colores, porque cuando fue
desarrollada los componentes separados eran
colorantes. Se define como una tcnica o mtodo
fsico de separacin basado en las diferentes
velocidades con que se mueven los solutos
disueltos en un disolvente llamado eluente (fase
mvil) a travs de un medio estacionario o fijo.
Los componentes a separar se distribuyen entre la
fase estacionaria y la fase mvil o fluido que pasa
a travs o a lo largo de la fase estacionaria. Como
los componentes de la mezcla presentan diferente
tendencia a permanecer en cualquiera de las
fases, la separacin se da por el movimiento de la
fase mvil en relacin con la estacionaria y de la
distribucin de las sustancias entre las dos fases.
Las molculas que "prefieren disolverse" en la
fase mvil sern eludas ms rpido que las que
son preferencialmente solubles en la fase

estacionaria y que tienden a quedar

retenidas.
En
resumen
se
fundamenta en la separacin entre la
fase estacionaria slida o liquida y la
fase mvil liquida o gaseosa.
Los fenmenos rectores del proceso
de retencin y separacin son
la adsorcin y
la absorcin.
El
primero queda delimitado a la
superficie interfacial es decir se
refiere a la fijacin o retencin
de la sustancia entre la superficie de las
Fig. 1
dos fases; se relaciona con fuerzas
Mijail
qumicas y fsicas que dependen de la
Tswett
naturaleza
de
la
sustancia
absorbida,
temperatura, naturaleza del absorbente y
concentracin. El segundo fenmeno determina
la retencin de una especie qumica por parte

de una masa y depende de

la tendencia que tiene sta a
formar mezcla o reaccionar
qumicamente con la misma.

Fig. 2
Cromatografa
en capa fina

OBJETIVO GENERAL

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Conocer la tcnica de cromatografa y los factores experiementales que la afectan.

OBJETIVO PARTICULAR
Aplicar y comparar los mtodos cromatograficos de capa fina y colimna, para separar, identificar
y purificar compuestos organicos.
Observar el afecto de diferentes fases mviles y estacionarias en la separacin.
Determinar los valores de R f como un parmetro en la identificacin de los compuestos
separados.

HIPOTESIS
Experiencia. Separacin de licopenos.
Si desarrollamos los pasos de cromatografa en
papel en los licopenos obtenidos en la prctica
Extraccin liquido-liquido y la mezcla de HexanoAcetato,
obtendremos
el
desarrollo
de
cromatograma y con esto poder observar los
componentes del licopeno.
Experiencia. Cromatografa en capa fina
de una mezcla de colorantes.
Si efectuamos la cromatografa en varias
cromatoplacas desde puntos sealados, en
contacto a la mezcla de Acetato de Etilo-Etanol a
diferentes concentraciones y medimos las
distancias entre los puntos, obtendremos los
valores de Rf y observaremos cual es la
concentracin adecuada para esta cromatografa.
MATERIALES

REACTIVO
Silica-gel para columna
Hexano-Acetato de Etilo 1:1
Acetato de Etilo-Metanol 1:1
Acetato de Etilo-Metanol 7:3
Acetato de Etilo-Metanol 1:1
Mezcla de colorantes anaranjado de metiloazul de metileno 1:1
OBSERVACIONES

En la separacin de licopenos se preparo la

columna para cromatografa cuidando que el
pedazo de algodn que se debe colocar, fuera
de un tamao, por el cual no se filtrara, ni se
obstruyera la salida de los componentes de la
columna.
Se adiciono slica-gel, la cual es acida, se
opto por una slica gel con poro pequeo,
debido al fenmeno que se lleva acabo en
la columna, es decir la adsorcin.
Dependiendo del tamao del poro se eluye.
Para acelerar el tiempo en el que se
empacaba la columna, se omiti el circulo
de papel filtro, ya que con este tardara
mas en bajar nuestra slica-gel y el hexano,
se empaco con hexano debido a que era el
disolvente menos polar, siempre se debe
de empezar con el menos polar e ir
aumentado gradualmente la polaridad del
disolvente.Tambin se acelero el proceso
con la aplicacin de oxigeno, se opto por
este, debido a que el nitrgeno a pesar de
dar mejores resultados sin impurezas, es
muy caro.
Al agregar el extracto de licopenos, se
observo primero que dicho extracto no
estuviera turbio, si este era el caso, se le
agregaba un poco de hexano y se
eliminaba la turbidez, posteriormente se
agrego cuidadosamente a la columna.
Una vez que los pigmentos penetraron en la
slica-gel se lleno la columna con HexanoAcetato de etilo (1:9), debido a que los

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licopenos son poco polares. En este

procedimiento fue importante mantener el
goteo constante y no dejar que el nivel del
disolvente bajara ms all de la superficie
de la slica-gel
Se obtuvieron 3 tubos de ensayo con
diferente coloracin en tonos amarillos
disminuyendo gradualmente el tono, esto

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con el eluyente Hexano-Acetato de etilo, no

fue necesario cambiar de eluyente.
Se desarrollo el cromatograma con etanol,
sin embargo no fue en la concentracin
correcta, porque la mancha se corri hasta
la parte superior, por lo que hay que hacer
ensayos para encontrar el disolvente
correcto.

En la cromatografa de columna dependiendo de

las caractersticas de cada compuesto algunos
tendern a quedarse ms retenidos en el slido,
mientras que otros avanzarn con el paso del
disolvente. En este caso la polaridad es muy
importante para elegir el tipo de disolvente y para
saber en que parte del sistema quedara nuestro
analito, permitindonos as obtener una buena
separacin de los constituyentes del mismo.

RESULTADOS

En la columna cromatografa se apreci muy

claramente la separacin de las fases, los
primeros tubos que colectamos eran muy
coloridos, y gradualmente fueron perdiendo esta
caracterstica, lo que nos indica la separacin por
volmenes.
En la cromatografa de columna es importante que
la columna no se seque en ningn momento ya
En la tercera experiencia, en la mescal hexano:
que el aire se introduce en la misma, agrietndola.
Acetato de etilo 1:1 es poco polar por lo que al
Las grietas impiden el normal desarrollo de los
hacerla pasar por la columna, eluyeron las
equilibrios de adsorcin y desorcin entre el
sustancias no polares, mientras que las polares
adsorbente y el disolvente, reducindose la
quedan adheridas a la matriz de la columna, es
capacidad de separacin.
decir al slica-gel; al cambiar la mezcla a acetato
de etilo: metanol 1:1 de mayor polaridad, las
Al desarrollar el cromatograma en el caso de
molculas
polares
van
movindose
al
que las sustancias sean coloreadas, se
identifican a simple vista las posiciones de los
reemplazarse su interaccin con la slica-gel por
distintos pigmentos separados.
interaccin con la mezcla acetato de etilo:
En ocasiones el cromatograma no presenta
metanol 1:1. Con lo que observamos una mayor
coloracin,
siendo
necesario
utilizar
separacin.
reveladores, en trminos generales los
reveladores son soluciones reactivas que se
En la cromatografa de capa fina se ocuparon 3
emplean para poner en evidencia la presencia
tintas, amarilla, naranja y rosa, el Rf (distancia
de los componentes de la muestra, mediante
recorrida por el solvente /distancia recorrida por el
reacciones que generan especies cromognicas
soluto) de cada una es de:
o fluorescentes.
Tinta amarilla = 2.3 cm /3.9 cm = 0.59
Tinta naranja = 1 cm /3.9 cm = 0.256
Tinta amarilla = 0.5 cm /3.9 cm = 0.128
DISCUSIONES

Comercialmente estn disponibles placas

cromatograficas con revelador fluorescente
incluido, y su presencia generalmente se seala

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con F254, F366 o F254, 366. Estos sealamientos se

refieren a las longitudes de onda ms usadas,
254 y 366 nm.
Existen reveladores de carcter bastante
general, en tanto que otros son especficos
para
ciertos
grupos
funcionales.
Los
componentes orgnicos reaccionan y se
visualizan con el revelador de sulfato srico, al
someterse a una temperatura de 100C. Las
cetonas y los aldehdos pueden evidenciarse
con la 2,4-dinitro-fenilhidracina. La ninhidrina
reacciona con los grupos aminados. Los
alcaloides dan reaccin positiva con el reactivo
de Dragendorff. Las grasas con la rodamina B
producen manchas que fluorescen con la luz
UV.
Los reveladores lquidos pueden distribuirse
sobre las placas cromatograficas por aspersin
con
un
nebulizador
o
por
inmersin.
Generalmente se obtienen mejores revelados
por nebulizacin.
Para
trabajar
en
una
separacin
de
cromatografa en capa fina es necesario
realizar
primero
un
anlisis
del
comportamiento cromatogrfico en placa de la
mezcla
a
separar.
Se
prueba
dicho
comportamiento en distintos disolventes y
mezclas de disolventes, resultando adecuado
para la separacin aquel en el cual el
componente que tenga mayor movilidad no
supere una Rf = 0,6.

Con la cromatografa de columna se determin

que solventes son ms efectivos para realizar
una separacin, mientras que con la
cromatografa en columna se pudo apreciar la
velocidad a la que eluyen los licopenos.
BIBLIOGRAFA
Brewter Ray Q. Curso de Qumica orgnica
experimental.
Editorial Altambra.Espaa 1974
Pgs. 43-48
Wilbert Adolfo Villegas Casares, Pablo Oscar
Acereto Escoffi, Mim Elizabet Vargas
Quionez. Anlisis Ultravioleta-visible. La
Teora Y la Prctica en El Ejercicio
Profesional.
Pg. 3

CONCLUSIONES
Se conoci la tcnica de cromatografa y los
factores que la afectan, as como la efectividad
de diferentes mezclas de solventes para
realizar la tcnica.

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