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1 Semestre 2010/2011
2 Ano Mestrado Integrado em Engenharia Biomdica
1Ano - Mestrado Integrado em Engenharia Biolgica
ndice
I.
II.
gua e pH........................................................................................................................................... 10
III.
IV.
Glcidos ......................................................................................................................................... 34
V.
Lpidos ................................................................................................................................................ 37
VI.
VII.
Metabolismo ................................................................................................................................. 48
a.
b.
c.
d.
ii.
VIII.
Fotossntese .................................................................................................................................. 62
a.
b.
c.
IX.
X.
XI.
XII.
a.
XIII.
ii.
iii.
a.
b.
c.
XIV.
XV.
XVI.
Amino
Tiol
Fosfato
Pirofosfato
Estrutura
De todos os elementos qumicos, apenas uma pequena parte entra na composio das
biomolculas. Os mais abundantes so H, O, C e N e existem vestgios de outros elementos
como Na, Ca, K, P ou S. Em concentraes ainda mais reduzidas, mas desempenhando funes
muito importantes, podemos encontrar Fe, Ni, Zn, I, Cu, etc.
Quanto aos elementos que mais contribuem para a massa de um organismo, destacam-se O, C
(mais abundante nos organismos que no resto do universo), H, N, P e S, que se ligam entre si
por ligaes muito estveis, as ligaes covalentes.
Os diferentes tomos e molculas reagem entre si e estabelecem diferentes ligaes e
interaces:
Covalentes tm origem na partilha de electres e so as ligaes mais fortes;
No-covalentes Individualmente so mais fracas que as ligaes covalentes mas em
conjunto tornam-se mais fortes e so essenciais para a estrutura e funo das
macromolculas:
Ligaes inicas um ou mais electres so transferidos de um tomo para o
outro, mais electronegativo.
Interaces de Van der Waals;
Ligaes por pontes de hidrognio;
Ligaes hidrofbicas.
As biomolculas englobam 4 tipos de macromolculas:
Lpidos;
Protenas cujos monmeros so os aminocidos;
Glcidos cujos monmeros so os monossacardeos;
cidos Nucleicos cujos monmeros so os nucletidos.
A formao destas macromolculas ocorre quando dois monmeros se juntam atravs de uma
reaco de condensao (com libertao de uma molcula de gua, por exemplo).
Todas estas molculas e macromolculas participam em reaces bioqumicas que
apresentam uma srie de caractersticas:
Do-se em ambiente aquoso (condies suaves);
Esto associadas a variaes de energia. A sua forma mais vulgar de energia qumica
o ATP (Adenosina TriFosfato);
I.
Onde:
CH2O formaldedo
NH3 amonaco
HCN cianeto de hidrognio
Ilustrao 2 - Frmula de
Estrutura da Glicina.
NH2CH2COOH glicina
NH2CH2CN ammonitrile
Relativamente organizao celular, as primeiras clulas tinham uma estrutura muito simples,
sem ncleo individualizado, organitos celulares ou sistema endomembranar. Estas clulas
procariticas foram sofrendo uma srie de alteraes at darem origem s clulas
eucariticas, mais complexas e com um ncleo perfeitamente organizado e delimitado,
diversos organitos celulares e sistema endomembranar.
Esta evoluo das clulas procariticas para clulas eucariticas pode ser explicada pela teoria
da endossimbiose.
O
modelo
endossimbitico,
desenvolvido por Lynn Margulis,
defende que os seres eucariontes
tero resultado da evoluo
conjunta de vrios organismos
procariontes, os quais foram
estabelecendo
associaes
simbiticas entre si. Este modelo
admite
que
os
sistemas
endomembranares e o ncleo
resultaram de invaginaes da
membrana plasmtica e que as
mitocndrias e os cloroplastos, at
h cerca de 2100 M.a., eram
organismos autnomos. Nessa
altura, algumas clulas de maiores
dimenses (clulas hospedeiras)
tero capturado clulas mais
pequenas, como os ancestrais das
mitocndrias e dos cloroplastos.
Alguns
destes
ancestrais
conseguiram sobreviver digesto
no interior da clula procaritica de
maiores dimenses, estabelecendo
relaes de simbiose. A ntima
cooperao entre estas clulas ter
conduzido ao estabelecimento de
II.
gua e pH
A gua a substncia qumica predominante nos organismos vivos, perfazendo cerca de 70%
da sua massa. um ptimo solvente para a maioria das molculas polares e apresenta diversas
caractersticas que fazem dela uma molcula nica. Entre as principais caractersticas da gua
destacam-se:
Molcula polar ligao entre tomos com electronegatividades diferentes (a partilha
dos electres entre os tomos assimtrica);
Forma pontes de hidrognio;
Constante dielctrica elevada.
10
11
Molculas anfiflicas (como cidos gordos), que contm simultaneamente grupos polares e
grupos no-polares, tendem a dispor-se em aglomerados de modo a que as suas regies
hidrofbicas no estejam em contacto com a gua, verificando-se assim a formao de
micelas. Nas micelas, as molculas mantm-se juntas no porque existam interaces entre si
mas porque essa configurao contribui para a estabilidade do sistema e para o aumento da
sua entalpia. A formao deste tipo de estruturas constitui o princpio base da formao de
membranas celulares.
Uma outra propriedade caracterstica das molculas de gua a sua tendncia para sofrerem
ionizao segundo a reaco:
12
A 25C,
,
Equao de Henderson-Hasselbach
O valor de pKa expressa a fora relativa de um cido: quanto mais baixo for o valor de pKa mais
forte o cido. Este valor corresponde ao valor de pH do ponto mdio de uma curva de
titulao, ou seja, ao ponto para o qual [HA]=[A-] (ponto isoelctrico).
O pH do sangue ronda os 7.4 e pequenas variaes, como 0.2, so suficientes para provocar a
morte de um indivduo. No entanto, o pH noutros locais do organismo pode ter valores muito
diferentes (ex. pH do estmago pode variar entre 2.5 e 3.0) de acordo com as reaces que
ocorrem nos diferentes rgos/tecidos. Apesar dos diferentes valores que se podem registar
nos mais variados tecidos,
necessrio que, em cada caso, o
pH se mantenha constante,
qualquer que seja o seu valor
ideal, para que as reaces
metablicas
se
dem
correctamente. para isso muito
importante a existncia de
solues tampo.
Alguns cidos ou bases e os seus
conjugados podem ser utilizados
como solues tampo na
medida em que mantm o pH do
meio relativamente constante
face a pequenas variaes das
concentraes
de
outros
cidos/bases da soluo. cidos e
bases fracas so os que melhor
desempenham esta funo. O
intervalo de pH em que as
solues se comportam como
tampo
.
III.
Aminocidos e Protenas
13
sua
configurao
tetradrica, dois aminocidos com a
mesma constituio qumica podem
apresentar imagens espelhadas, que
representam
uma
classe
de
estereoismeros os enatefilos. De
um modo simples, podemos
classificar cada ismero em L (levo)
ou D (dextro) conforme o seu grupo
amina esteja orientado para a
esquerda
ou
direita,
Ilustrao 13 - Ismeros da Alanina.
respectivamente,
numa
representao esquemtica do aminocido (esta classificao tem origem na comparao dos
aminocidos com gliceraldedo, que tambm apresenta este tipo de ismeros).
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Alanina
Apolares
Glicina
Isoleucina
Leucina
Prolina
Valina
Serina
Asparagina
Treonina
Cistena
Glutamina
Bsicos
Metionina
Histidina
Lisina
cidos
Arginina
cido Asprtico
cido Glutmico
15
Aromticos
Fenilalanina
Tirosina
Triptofano
16
e
.
17
Exemplo de um problema:
Qual o pH de uma soluo de glicina em que o grupo NH3 est 1/3 dissociado?
A equao Henderson-Hasselbalch apropriada :
Se o grupo NH3 est 1/3 dissociado, existe uma parte de glicina com carga negativa para
duas partes de glicina neutra. O pKa a utilizar neste caso o do grupo amina (9.6). Tem-se
ento:
Ilustrao 17 - Pptido.
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20
Hlice-
Estruturas Secundrias
Forma cilndrica com o esqueleto da cadeia linear em hlice e os grupos laterais em
direco ao exterior.
Forma-se quando o oxignio do grupo carboxlico forma uma ligao de hidrognio com
o hidrognio do grupo amina de um aminocido quatro resduos a seguir, em direco ao
terminal-C. Ao longo da hlice, todos os tomos de oxignio do grupo carboxlico
estabelecem este tipo de ligao na mesma direco, o que confere direccionalidade a
este arranjo peridico.
ngulos caractersticos:
A solubilidade desta estrutura fica determinada pela natureza das cadeias laterais porque
os seus grupos polares j esto envolvidos em ligaes hidrognio.
Cada espira da hlice representa, aproximadamente, 3.6 resduos de aminocidos e
envolve 13 tomos 3.613 helix. Cada resduo estende-se por 1.5 , logo o passo da
hlice (altura de cada volta) tem 5.4 .
Turns
Folhas-
A hlice possui um momento dipolar bem definido: o terminal amina possui uma carga
parcialmente positiva e o terminal carboxilo possui uma carga parcialmente negativa.
Cadeias, de 5-8 resduos, agrupadas lado a lado, cujas folhas adjacentes se ligam por
pontes de hidrognio. A natureza das ligaes estabelecidas leva as folhas a formarem
planos e a terem uma conformao final pregueada.
Tm uma direco definida pelo que folhas adjacentes podem progredir na mesma
direco paralelas, ou em direces opostas anti-paralelas (menos estveis). Em
ambas as situaes, cadeias laterais R dispem-se para um e outro lado da folha.
Nas zonas de ligao, que fazem a continuao de uma folha para a outra, podem existir
turns e loops.
Pequenas estruturas em forma de U, formadas por 3 ou 4 aminocidos, que
redireccionam o esqueleto da cadeia para o seu interior, revertendo a sua direco, e
permitem que as protenas se tornem estruturas compactas.
Em cada turn estabelece-se apenas uma ligao hidrognio entre o oxignio do grupo
carboxlico do primeiro resduo e o hidrognio do grupo amina do quarto aminocido.
Loops
-turns so das estruturas mais comuns e fazem a ligao entre cadeias anti-paralelas de
folhas-. Muitas vezes contm resduos de glicina ou prolina e formam-se
preferencialmente superfcie da protena, de modo a que os grupos que no esto
envolvidos na ligao hidrognio possam interagir com a gua.
Fazem a ligao entre vrios elementos da estrutura secundria das protenas (ex. ligam
folhas- paralelas).
Podem ocorrer em vrias formas e tamanhos. No entanto, tambm se localizam
superfcie das protenas e, por isso, podem desempenhar um papel importante no
reconhecimento de processos biolgicos (por exemplo, os antignios podem
diferenciam-se entre si pelos loops que ligam as suas folhas-).
Devido sua estrutura no organizada, uma mutao que ocorra numa zona associada a
um loop tem tendncia a ser menos grave do que se ocorresse numa folha ou numa
hlice pois no implica a destruio da estrutura proteica e, consequentemente, a perda
de funo.
21
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Ilustrao 30 - Cromatografia por afinidade: as protenas com afinidade com o gel do tubo ficam ligadas ao
mesmo, enquanto que as protenas sem afinidade saem do tubo.
Na primeira experincia realizada a bioqumica utilizouse a tcnica da electroforese em gel de SDSPoliacrilamida para separar protenas. O SDS um
detergente que cobre as protenas de carga negativa e
confere uma taxa carga/massa similar a todas as
protenas a que se liga. O SDS tambm contribui para
desnaturar as protenas.
Ilustrao 31 - Aco do SDS sobre uma protena.
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Ilustrao 32 - Separao de protenas pela combinao de dois mtodos: ponto isoelctrico e electroforese.
a. Catlise Enzimtica
As enzimas, uma classe particular de protenas, so
catalisadores bioqumicos cuja funo baixar a
energia de activao necessria a uma dada reaco e
permitir que esta decorra a uma velocidade muito mais
elevada.
Em condies biologicamente favorveis, muitas
reaces comuns em bioqumica no so favorveis e
s ocorrem devido interveno de enzimas.
Entre as caractersticas das enzimas possvel
destacar:
So todas de natureza proteica, embora
possam conter uma parte no proteica o
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(Numa fase inicial, assume-se que a reaco inversa formao do produto P negligencivel
porque se verifica [P]~0 ).
Cintica enzimtica Michaelis-Menten
Concentrao total de enzima
Taxa de formao de [ES]
Taxa de desaparecimento de [ES]
Como se assume
, ento
Assim,
Constante de Michaelis
Assim,
Velocidade da reaco
Ento tem-se
Quando [S] suficiente para saturar a enzima, a velocidade da reaco mxima. Em
saturao, [ES]=[ET]
30
Equao Michaelis-Menten
Turnover number
ndice de eficincia cataltica
Quando:
31
Ilustrao 36 - Curva de Michaelis para diferentes concentraes de substrato e para diferentes enzimas.
32
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IV.
Glcidos
34
Alguns glcidos apresentam grupos aldedo (H-C=O) ou cetona (C=O). Se o grupo carbonilo
(C=O) se localizar no final da cadeia carbonada (inclusive num grupo aldedo), ento o glcido
uma aldose. Caso contrrio, uma cetose.
Os hidratos de carbono tm estereoismeros cuja classificao (comparao com
gliceraldedo) segundo uma representao no plano se baseia na posio do grupo OH do
carbono mais afastado do grupo aldedo ou cetona: D - lado direito; L - lado esquerdo. Ao
contrrio do que acontece nos aminocidos, em que a forma mais comum L-aminocido, no
caso dos glcidos, estes apresentam-se maioritariamente sob a forma D.
35
36
Para alm de ligaes glicosdicas os glcidos podem estabelecer outros tipos de ligaes. Por
exemplo, podem estabelecer-se pontes de hidrognio entre monmeros adjacentes como
acontece na celulose (glcido que o organismo humano no consegue digerir sem o auxlio de
outros organismos) e os peptidoglicanos (encontrados na parede celular de procariontes)
formam cadeias ligadas entre si por aminocidos (L e D).
V.
Lpidos
37
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A partir de cidos gordos podem formar-se diferentes tipos de lpidos, sendo os triglicridos
dos mais simples. Os triglicridos constituem uma grande fonte de reserva energtica
(encontram-se armazenados nas clulas adiposas) e so formados a partir de uma molcula de
glicerol associada a trs cidos gordos. Se esses cidos gordos forem iguais o triglicrido diz-se
simples.
A hidrlise de um triglicrido/diglicrido uma forma de obter energia metablica. A reaco
de degradao leva formao de um diglicrido/monoglicrido e libertao de um cido
gordo, energia e uma molcula de gua. Posteriormente o cido gordo pode ser degradado
fornecendo grandes quantidades de energia.
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A fluidez das membranas afectada pelo nvel de saturao das cadeias carbonadas (quanto
mais insaturadas forem maior ser a fluidez) e pela presena de colesterol. Se as membranas
fossem constitudas por cadeias saturadas verificar-se-ia uma cristalizao das mesmas a
temperaturas mais baixas, ou seja, haveria uma grande tendncia das cadeias para se
empacotarem de forma extremamente ordenada e as interaces intermoleculares seriam
fortes, o que diminuiria a fluidez da membrana. Com as ligaes duplas cis ao longo da cadeia
de carbonos, esta deixa de ser linear e no se arruma to perfeitamente como na situao
anterior, o que permite diminuir a temperatura de transio de fase e aumentar a fluidez da
membrana.
Ilustrao 56 - 4 Dos fosfolpidos mais abundantes nas membranas celulares dos mamferos.
superfcie das membranas destacam-se zonas mais densas, as jangadas lipdicas, que so
mais ricas em colesterol e cidos gordos saturados. Estas jangadas so menos fluidas que as
zonas adjacentes e so ricas em protenas com determinadas funes. So bem definidas mas
podem deslocar-se ao longo da membrana.
O colesterol um tipo de lpido formado por um conjunto rgido de anis associado a uma
pequena cadeia carbonada. maioritariamente hidrofbico mas apresenta um grupo
hidrxido OH polar, pelo que uma molcula anfiptica. produzido apenas por animais (no
fgado), intercala-se nas membranas plasmticas (pode formar pontes de hidrognio com os
fosfolpidos adjacentes) regulando a sua fluidez (diminuindo-a, neste caso), e um precursor
de hormonas como a testosterona e o estrognio.
41
Ilustrao 57 - Colesterol.
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VI.
cidos Nucleicos
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Em 1928, Fredrick Giffith descobriu um factor gentico nas bactrias que modificava bactrias
inofensivas em bactrias mortais e, em 1952, Rosalind Franklin obteve a primeira imagem de
raio-X do DNA. Finalmente em 1953, com base nos resultados de experincias anteriores,
James Watson e Francis Crick apresentaram, na Universidade de Cambridge, o modelo de
dupla hlice para o DNA.
Segundo este modelo, a molcula de DNA composta por duas cadeias polinucleotdicas, que
se dispem em sentidos inversos, designando-se, por isso, antiparalelas. No esqueleto da
cadeia distinguem-se duas cadeias laterais e degraus centrais: as bandas laterais so formadas
por molculas do grupo fosfato alternadas com pentoses e unidas por ligaes fosfodiesters;
os degraus centrais so pares de bases ligados por pontes de hidrognio. A especificidade das
ligaes hidrognio entre as purinas e pirimidinas a chamada complementaridade de bases:
a adenina liga-se timina por uma ligao dupla (A=T) e a guanina liga-se citosina atravs de
uma ligao mais forte, uma ligao tripla (G C) a quantidade de adenina e timina, e de
guanina e citosina numa clula sensivelmente a mesma (Regra de Chargaff).
O DNA de dupla-hlice (dsDNA double-stranded DNA) adquire, geralmente, a forma uma
dupla hlice de mo
direita
com
aproximadamente
10 pares de bases
(3.4 cada par) por
volta, ou seja, tem
um passo de 34 ;
20 de dimetro e
uma rotao de 36
entre os resduos.
De um ponto de
vista vertical, a
distncia entre as
cadeias de DNA
pode ser pequena
minor groove, ou
grande major
groove.
Ilustrao 64 - Estrutura do ADN.
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Pentose
Bases
Azotadas
Localizao
ADN
Dupla
Hlice
Desoxirribose
A, G, C, T
Principalmente no
ncleo
RNA
Simples,
por vezes
dobrada
Ribose
A, G, C, U
Forma-se no ncleo
e migra para o
citoplasma
Quantidade
Constante para
todas as clulas da
mesma espcie
Varivel de clula
para clula e com a
actividade celular
Uma vez que o DNA se encontra sob a forma de uma dupla hlice, a sua estrutura pode ser
modificada por factores externos, como a temperatura ou acidez do meio.
O aquecimento do material gentico enfraquece e quebra as ligaes por pontes de
hidrognio entre bases complementares, levando desnaturao do DNA. A quantificao
deste processo pode fazer-se atravs da medio da absorvncia a 260 nm (pico de absoro
das bases azotadas), verificando-se que quanto maior for o valor medido maior a
desnaturao da cadeia em cadeia simples, as bases outrora viradas para o interior da
molcula, esto mais sujeitas radiao, absorvendo-a em maior quantidade. Registando os
valores de absorvncia medida que se aumenta a temperatura do meio verifica-se que estes
vo aumentando, o que indica que a elevao da temperatura actua como agente
desnaturante.
Representando graficamente a absorvncia em funo da temperatura obtm-se as curvas de
melting, nas quais se distingue um ponto de inflexo. Este ponto corresponde temperatura
qual 50% da cadeia dupla de DNA se encontra desnaturada e designa-se temperatura de
melting (TM), ou de fuso. Esta temperatura depende directamente do contedo de citosina e
guanina da molcula, pois quanto maior for o contedo CG maior o nmero de ligaes
triplas. Como estas ligaes so mais fortes, para que sejam quebradas e ocorra desnaturao
necessria uma temperatura mais elevada, pelo que a um maior contedo CG corresponde
uma maior TM.
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VII.
Metabolismo
Entende-se por metabolismo o conjunto de todas as reaces qumicas que se do dentro das
clulas. Inclui:
Catabolismo processos oxidativos e exergnicos nos quais h libertao de energia
pela degradao de produtos complexos em produtos mais simples.
Ex: glicogenlise produz glicose a partir de glicognio;
Anabolismo processos redutivos endergnicos que requerem o uso de energia para
formar produtos complexos a partir de molculas mais simples.
Ex: glicognese armazena excesso de glicose sob a forma de glicognio. Lipognese
armazena glicose e aminocidos sob a forma de lpidos.
Enquanto as vias catablicas convergem para poucos produtos finais as vias anablicas
divergem para a sntese de muitas biomolculas diferentes. Por exemplo, o catabolismo de
lpidos, glcidos e protenas origina um intermedirio comum acetil-CoA, que utilizado na
respirao celular. Este intermedirio, por processos anablicos, pode depois dar origem s
mais variadas molculas, desde fosfolpidos a triglicridos, hormonas esterides e vitaminas.
A maioria dos processos metablicos inclui uma srie de reaces e est organizada em vias
metablicas reguladas por enzimas. As enzimas intervenientes podem encontrar-se isoladas,
em complexos multienzimticos ou formar sistemas associados a membranas. A localizao
de todo o complexo numa zona especfica da clula, como uma regio da membrana, permite
que o processo seja mais eficiente.
Uma via metablica tem incio num substrato especfico e termina num determinado produto.
Durante todo o processo do-se vrios passos, cada um catalisado por uma enzima especfica,
e os produtos de uma reaco tornam-se substratos das seguintes, pelo que se designam
intermedirios. O facto de as vias estarem divididas em vrias reaces permite no s que se
obtenham produtos que, de forma espontnea, no seria possvel obter (acoplamento de
reaces termodinamicamente favorveis a processos desfavorveis), como tambm que se
regule o calor/energia libertado e se mantenha a temperatura da clula dentro de valores
fisiolgicos.
Embora as vias anablicas e catablicas de degradao e sntese dos mesmos compostos
sejam semelhantes, necessrio que apresentem alguns passos diferentes. S assim se obtm
mecanismos de regulao que permitem favorecer uma das vias e inibir a outra, e tambm s
deste modo que ambas as vias podem ocorrer em simultneo e de forma espontnea, j que
48
Ilustrao 68 - ATP.
49
a. Gliclise e Neoglucognese
A gliclise o processo no qual uma molcula de glicose degrada, atravs de 10 reaces
catalisadas enzimaticamente, e forma 2 molculas de cido pirvico, um composto de 3
carbonos. comum a todos os organismos, no utiliza oxignio e d-se no citoplasma, onde se
localizam as enzimas necessrias ao processo.
Pode dividir-se em 3 fases:
50
Ilustrao 70 - Gliclise.
ATP NADH+H+
-1
0
-1
0
0
2
2
0
2
0
2
2
51
Fermentao lctica verifica-se, por exemplo, nos bacilos lcticos, e o cido pirvico
reduzido a cido lctico. Aps a gliclise, o piruvado combina-se com o H+
transportado pela NADH e origina o cido lctico.
O ciclo de Cori traduz uma cooperao metablica entre os msculos e o fgado quando
ocorre fermentao lctica. Aps ser produzido nos msculos, o cido lctico transportado
pelo sangue at ao fgado, onde novamente convertido em glucose pelo processo da
gluconeognese.
Na respirao aerbia (em
presena de oxignio) o
cido pirvico, formado
durante a gliclise,
transportado para o interior
das mitocndrias, onde vai
integrar o ciclo de Krebs e a
cadeia
de
transporte
electrnico. No final de todo
este processo o balano
terico final de ATP ser de
36
nos
organismos
eucariotas e de 38 nas
bactrias.
Os seres humanos consomem cerca de 160 gramas de glucose por dia, sendo que 75% dessa
quantidade consumida no crebro. Os fluidos corporais contm apenas 20 gramas de glucose
e as reservas de glicognio rendem cerca de 180 a 200 gramas de glucose. , portanto,
necessrio que os seres humanos e outros organismos sejam capazes de sintetizar a sua
prpria glicose.
A neoglucognese, ou gluconeognese, a via metablica que conduz sntese de glicose a
partir de cido pirvico. Ocorre, principalmente, no fgado e nos rins e, apesar da maioria das
suas reaces serem inversas s da glicose, algumas, que por razes de ordem termodinmica
no so reversveis (
), variam. Nesses casos, as reaces so
catalisadas por enzimas diferentes e constituem os principais pontos de regulao das duas
vias. Os passos alterados so:
52
b. Ciclo de Krebs
O ciclo de Krebs, ou ciclo do cido ctrico, d-se na matriz mitocondrial e consiste na oxidao
de acetil-CoA a CO2 com libertao de energia sob a forma de electres, que armazenada em
NADH e FADH2, molculas transportadoras de electres.
A acetil-coenzima A o
produto de diversas vias
metablicas mas no um
produto final da gliclise. Para
que o cido pirvico possa
integrar o ciclo de Krebs
necessrio
um
passo
preparatrio em que o
piruvato convertido em
acetil-CoA.
Ilustrao 72 - Formao da acetilcoenzima A.
Na respirao aerbia, aps a
etapa da gliclise o cido pirvico entra nas mitocndrias e, ao nvel da matriz mitocondrial,
sofre 3 reaces que culminam na formao de acetil-CoA:
Descarboxilao removido um carbono ao cido pirvico. Forma-se acetaldedo e
dixido de carbono;
Oxidao so removidos dois H ao acetaldedo. Forma-se cido actico e reduz-se
NAD+ a NADH+H+;
Formao de acetil-CoA o cido actico combina-se com uma coenzima A e forma-se
acetil coenzima A.
O acetil-CoA vai agora integrar o Ciclo de Krebs, que tem 8 passos:
53
54
c. Cadeia Respiratria
A cadeia respiratria, ou cadeia de transporte electrnico, a etapa em que culminam todos
os processos oxidativos de degradao de glcidos, lpidos ou protenas. Esta fase d-se nas
cristas mitocondriais e permite a sntese de ATP utilizando a energia libertada durante a
reduo de O2 a H2O, cujos electres so doados pelo NADH e FADH2 provenientes da gliclise
e ciclo de Krebs.
Nas cristas mitocondriais encontra-se um conjunto de 3 complexos enzimticos (I, III, IV),
ligados por dois transportadores electrnicos (CoQ e Citocromo C). O conjunto destas 8
enzimas, associadas a tomos metlicos (cofactores) capazes de aceitar e doar electres,
forma a cadeia respiratria. Seis das protenas que fazem parte desta cadeia encontram-se
fixas, enquanto as restantes duas so mveis.
Quando os cofactores NADH+H+ e FADH2 libertam hidrognio para a cadeia respiratria d-se
incio ao processo de fosforilao oxidativa. Neste processo as reaces de oxidao e
fosforilao esto acopladas, o que permite a sntese de ATP:
Cada H fornecido cadeia separado em H+ + e-;
Os protes so bombeados para o espao intermembranar criando um
gradiente de pH e um potencial electroqumico transmembranar de H+. Por
cada NADH+H+ so bombeados 10 H+ e por cada FADH2 apenas 6 H+, pois o
FADH2 liberta os seus protes apenas no segundo transportador;
Os electres vo passar de transportador electrnico em transportador
electrnico at serem entregues ao oxignio;
Os electres so fornecidos ao O2, dando origem a ies;
Os ies oxignio atraem H+ e forma-se gua;
O potencial de H+ provoca a difuso destes ies de novo para o interior da matriz
mitocondrial e permite a sntese de ATP via ATPsintase;
O complexo V, ATPsintase, formado por trs partes. A corrente criada pela
passagem de H+ provoca a rotao de duas dessas partes, o rotor e o haste, e
activa os stios activos da terceira parte, o basto, onde formado ATP a partir
de ADP+Pi;
Cada NADH origina 3 ATP e cada FADH2, como s leva ao bombeamento de 6
H+, permite apenas a sntese de 2 ATP.
55
56
57
58
i.
Os triglicridos podem ser degradados e dar origem a 3 cidos gordos, que entram no ciclo de
oxidao dos cidos gordos, e a uma molcula de glicerol, que se torna um substrato da
gliclise. As enzimas responsveis pela quebra das ligaes dos cidos gordos so as lipases.
Para poderem entrar no ciclo de oxidao os cidos gordos livres tm que ser activados, isto ,
tm que ser convertidos em acil-CoA gordo e transportados para as mitocndrias, onde se vai
dar todo o processo de extraco de energia. A activao dos cidos gordos d-se no
citoplasma, pela enzima acil-CoA gordo sintetase e com gasto de 2 ATP, e o seu transporte
est dependente da bomba de carnitina, onde o grupo acil-CoA substitudo por acil-carnitina
para poder entrar na mitocndria. Uma vez dentro do organelo a acil-carnitina volta a ser
convertida em acil-CoA. A enzima acilcarnitina transferase I, enzima responsvel pela
substituio do grupo acil-CoA do cido gordo, pode ser inactivada por malonil-CoA. Este
processo impede o transporte de cidos gordos para a mitocndria quando estes se
encontram a ser sintetizados.
59
60
ATP
-2
61
ii.
Catabolismo proteico
VIII.
Fotossntese
Fotossntese o processo atravs do qual alguns seres vivos produzem matria orgnica a
partir de matria mineral utilizando energia luminosa (armazenada, posteriormente, nas
ligaes qumicas da matria produzida). Os seres que realizam este processo chamam-se
fotoautotrficos e neles esto includas as plantas, as algas e algumas bactrias. A equao
que traduz o processo :
62
Ilustrao 84 A maioria dos cloroplastos encontra-se nas folhas das plantas, existindo, contudo, um pouco por
todas as zonas verdes da mesma.
Caratenides
Ficobilinas
Cor
Distribuio
Plantas, algas, algumas bactrias
Plantas, algas verdes
Algas castanhas, diatomcia
Algas vermelhas
Algas e plantas
Algas castanhas, diatomcias
A
B
Verde
C
D
Carotenos
Laranja
Xantofilas
Amarela
Ficoeritrina Vermelha
Algas vermelhas, algumas bactrias
Ficocianina
Azul
63
Ilustrao 85 - Clorofila a.
Note-se que os fotes azuis, mais energticos, excitam os electres para estados de energia
mais elevados que no caso dos fotes vermelhos.
Em 1930, Van Niel, estudando o comportamento de bactrias sulfurosas capazes de realizar a
fotossntese, concluiu que o oxignio libertado neste processo provinha da gua e no do
dixido de carbono. Marcou a gua com oxignio O18 e verificou que este era libertado na
fotossntese e no integrava os compostos orgnicos formandos. Mais tarde, na experincia de
Calvin, atravs da marcao do dixido de carbono com carbono radioactivo comprovou-se
que as substncias formadas, de carcter radioactivo, derivavam do CO2 fornecido.
Atravs de uma experincia realizada em 1951, Gaffron provou que a luz era necessria para
iniciar o processo fotossinttico, o qual poderia depois continuar durante alguns segundos
mesmo na sua ausncia. A fotossntese compreende assim duas fases sucessivas:
Fase fotoqumica, ou fase luminosa/clara dependente da luz. D-se a excitao dos
pigmentos fotossintticos e a fotlise da gua. uma fase exergnica, produzindo-se
ATP, NADPH e O2;
Fase qumica, ou fase escura tambm conhecida como Ciclo de Calvin. Esta fase
depende no da luz mas sim da presena de CO2 e endergnica. A partir de dixido
de carbono e ATP e electres do NADPH, provenientes da fase fotoqumica, produz-se
glicose (C6H12O6).
64
a. Fase fotoqumica
A fase fotoqumica ocorre nos tilacides e transforma a energia luminosa captada pelos
pigmentos fotossintticos em energia qumica. Nesta fase intervm dois fotossistemas
conjuntos de pigmentos associados a protenas que se encontram na membrana dos tilacides
e
providenciam
a
energia
necessria para excitar os electres
da clorofila:
Fotossistema
II
(PSII)
absorve comprimentos de
onda correspondentes a
680 nm e participa na
sntese de ATP. Encontramse na face da membrana
dos tilacides que est
virada para o interior do
grana;
Fotossistema
I
(PSI)
absorve comprimentos de
onda correspondentes a
700 nm e participa na
sntese
de
NADPH.
Encontra-se na face da
membrana que est em
contacto com o estroma.
Ilustrao 86 - Fotossistema.
Ilustrao 87 - Tilacides.
65
Ilustrao 88 - Fotofosforilao.
66
b. Fase qumica
A fase qumica tambm conhecida como Ciclo de Calvin, ocorre no estroma dos cloroplastos
e onde se d a produo de acares. Este ciclo engloba 3 fases:
Fase 1, fixao de CO2 3 molculas de CO2 reagem com 3 molculas de RuBP
(ribulose bifosfato), um composto com 5 carbonos e 2 fosfatos, dando origem a um
composto com 6C muito instvel. A enzima que participa nesta reaco a RuBP
carboxilase, ou rubisco. O composto instvel divide-se rapidamente formando 6
molculas de 3-fosfoglicerado, que tm apenas 3C cada;
Fase 2, produo de acares seguidamente, d-se a fosforilao do 3-fosfoglicerado
em 1,3-bifosfoglicerado utilizando-se 6 ATP e a sua reduo em gliceraldedo 3fosfato (PAGL) recorrendo-se a 6 NADPH. Formam-se ento 6 PGAL, dos quais um
abandona o ciclo e mobilizado para a sntese de molculas orgnicas. Os restantes 5
PGAL permanecem no ciclo de Calvin;
67
Quando se fala no ciclo de Calvin consideram-se 3 ciclos como a unidade, pois apenas assim se
permite a formao e regenerao correcta de todos os elementos. O ATP e NADPH utilizados
neste processo provm da fase fotoqumica e o ADP e NADP+ resultantes so reintegrados
nessa fase, onde se regeneram. Durante este processo gasta-se mais ATP do que NADH o que
explica a necessidade da fotofosforilao cclica.
c. Variantes do processo
Tanto a mitocndria como os cloroplastos geram ATP via difuso de ies H+, resultante de
uma concentrao de H+ diferente no interior e exterior dos tilacides. Ambos utilizam uma
cadeia transportadora de electres e um complexo ATP sintetase similar. A diferena surge ao
nvel do combustvel a utilizar no processo.
O processo de fotossntese descrito do tipo C3, que o tipo mais comum e ocorre em
plantas que tendem a ocupar reas onde a intensidade da luz do Sol e a temperatura so
68
69
IX.
Replicao do DNA
Durante a diviso celular necessrio copiar o material gentico para que toda a informao
possa ser transferida da clula-me para a clula-filha sem erros. A clula cria cpias do seu
prprio DNA atravs de um processo de replicao semi-conservativa no qual 50% do DNA da
clula-filha pertenceu anteriormente clula-me cria-se uma nova cadeia com base numa
cadeia-molde original.
Ilustrao 93 - Experincia que apoia a teoria de que o DNA se replica de forma semi-conservativa.
Para que ocorra replicao necessrio que o DNA se encontre na forma de cadeia simples.
Existem 3 enzimas responsveis por esta tarefa (helicases, SSB e girases) que, embora no
participem directamente no processo de replicao, so auxiliares de replicao.
A replicao tem incio em zonas
especficas, denominadas origem de
replicao (Ori). Nos procariotas existe
apenas uma destas regies, contrariamente
ao que acontece nos eucariotas, que
apresentam vrias origens de replicao. As
regies Ori so ricas em timina e adenina
a natureza desta ligaes mais fraca que
as de guanina e citosina o que facilita a
abertura da cadeia dupla, e so
reconhecidas por um par de enzimas, as
helicases. Cada helicase envolve uma
cadeia simples do DNA e move-se num
Ilustrao 94 - Aco das helicases e das SSB.
dado sentido, quebrando as pontes de
hidrognio entre bases complementares. Essa quebra bidireccional existem duas foras de
replicao para cada origem de replicao, e requer consumo de ATP.
Quando j se encontra em cadeia simples o DNA tem tendncia a voltar a estabelecer uma
cadeia dupla, uma vez que esta a sua forma mais estvel. Para impedir esse processo existe
um conjunto de protenas, as SSB (single-stranded DNA-binding proteins), que actuam
estabilizando a cadeia simples.
70
A replicao d-se em simultneo nas duas cadeias do DNA. No entanto, enquanto na cadeia
3-5 (leading strand) ocorre replicao contnua no sentido da abertura da cadeia, isto , a pol
III actua sem interrupes no sentido 5-3, na cadeia 5-3 (lagging strand) d-se replicao
descontnua. Como a polimerase s actua no sentido 5-3 e est acoplada a um complexo que
se movimenta na direco da abertura da cadeia dupla, o nico modo de fazer com que a
enzima v nessa direco sintetizar a lagging strand por partes. Os fragmentos descontnuos
so chamados fragmentos de Okasaki e esto associados, cada um, a um novo primer.
Quando a polimerase chega ao final de um destes fragmentos e encontra o fragmento
anterior, dissocia-se da cadeia e a replicao desse pedao termina.
71
Polimerizao
(53)
Sim
Sim
Sim
Exonuclease
(35)
Sim
Sim
Sim
Exonuclease
(53)
Sim
No
No
N de
Cpias
400
?
10-20
72
73
Na seguinte tabela encontram-se algumas das enzimas que participam na replicao do DNA
em mamferos:
Capacidade de
DNA Polimerase
Localizao
Funo
Proofreading (reviso)
Tem actividade da RNA
primase inicia a replicao
do DNA
Ncleo
Replicao do DNA
No
Ncleo
Reparao do DNA
Replicao do DNA
mitocondrial
No
Mitocndria
Sim
Ncleo
Replicao do DNA
Sim
Ncleo
Replicao do DNA
Sim
Ncleo
Reparao do DNA
74
X.
Reparao do DNA
Alteraes no DNA so de grande importncia visto esta molcula guardar uma cpia
permanente do genoma da clula. Se uma alterao no for corrigida antes da replicao
ento vai ser perpetuada para todas as geraes seguintes.
Apesar da replicao ser muito fivel podem verificar-se algumas modificaes do DNA no final
deste processo devido insero de bases incorrectas. E no s nesta fase da vida da clula,
mas em todas as fases do ciclo celular, podem ocorrer alteraes na sequncia e estrutura do
DNA, espontneas ou induzidas por diversos factores externos como qumicos e radiao.
Alteraes ao nvel da molcula de DNA podem impedir os processos de replicao e
transcrio, bem como aumentar a frequncia de mutaes. Para manter a integridade dos
seus genomas as clulas desenvolveram mecanismos de reparao que actuam no sentido de
reverter reaces qumicas responsveis pela alterao do DNA e/ou substituir bases
incorrectas ou danificadas.
As alteraes espontneas dos nucletidos manifestam-se das seguintes formas:
Deaminao remoo de um grupo amina de uma base;
Depurinao remoo da base purina de um nucletido);
Metilao adio de grupos metilo; embora seja um processo normal nos
nucletidos, caso se d de forma incontrolada prejudicial.
A deaminao ocorre principalmente nos nucletidos de citosina e adenina e o resultado da
substituio, na base, de um grupo amina (NH2) por um tomo de oxignio. A deaminao da
adenina d origem a hipoxantina, uma base modificada, e da alterao da citosina resulta
uracilo pelo que esta base, considerada exclusiva do RNA, pode surgir em DNA danificado.
Durante a replicao de uma regio que sofreu deaminao vai formar-se uma cadeia mutada
e outra cadeia intacta pois apenas uma das cadeias originais est modificada. Na deaminao
da citosina, por exemplo, um dos moldes ter um nucletido de uracilo pelo que a cadeia
complementar ir apresentar uma adenina no local de guanina ocorre uma mutao. A outra
cadeia molde, como tem um nucletido de guanina que complementar da citosina, vai
manter-se inalterada.
75
76
Muitos agentes carcinognicos danificam o DNA pela introduo de grandes grupos aos
nucletidos, os aductos de DNA, que alteram a configurao normal das cadeias e, por vezes,
at da prpria molcula de DNA.
Nem todas as alteraes do DNA podem ser reparadas directamente, como acontece com os
dmeros de timina e a alquilao, pelo que as clulas tm mecanismos que permitem reparar
vrios tipos de danos. Os mecanismos mais importantes, tanto em procariotas como em
eucariotas, so os mtodos de reparao por exciso exciso de base, exciso de nucletido
e mismatch repair. Estes mecanismos reconhecem a zona danificada e eliminam a base ou
nucletido alterados permitindo depois a sntese de uma nova cadeia de DNA a partir da
cadeia complementar intacta.
A reparao por exciso de base permite corrigir problemas em bases individuais, quer estas
tenham sido danificadas por oxidao ou ionizao quer sejam o resultado de deaminao ou
depurinao. Neste processo de reparao a base danificada reconhecida e, por aco de
77
reconhecida
por
uma
protena (UvrA) e outras
protenas, as nucleases,
clivam ligaes fosdiesters na
extremidade 3 e 5 da leso
(UvrB
e
UvrC,
respectivamente). Por aco
de helicases, so quebradas
as pontes hidrognio entre as
bases complementares e
removido um oligonucletido
(com cerca de 12 a 13 bases)
que contm a regio
Ilustrao 109 - Reparao por exciso de nucletidos.
alterada. DNA polimerase I e
ligases actuam, de seguida, no sentido de sintetizar correctamente o pedao da cadeia
excisado.
78
XI.
Recombinao do DNA
O genoma de um organismo tem uma enorme plasticidade, facto para o qual contribui a
recombinao gentica troca de material gentico. Podem distinguir-se 2 tipos de
recombinao:
Recombinao homloga entre sequncias de DNA semelhantes homlogas;
Site-specific requer homologia localizada e pode ser considerada um
subgrupo da recombinao homloga;
Recombinao no homloga ou heterloga entre sequncias de DNA no
homlogas;
79
80
Aps a formao da juno de Holliday, que pode migrar ao longo da cadeia, as duas
molculas rodam em torno do seu ponto de ligao. Dependo do sentido dessa rotao, as
cadeias cruzam em direces diferentes e o produto final deste processo pode resultar em
heteroduplexes recombinantes ou no recombinantes.
Para separar as duas molculas ento necessrio cortar as cadeias cruzadas ao nvel da
juno. Se o corte for horizontal ento, aps a ligao das cadeias obtm-se molculas iguais
s originais heteroduplexes no-recombinantes. Por outro lado, se o corte for vertical
verifica-se a recombinao propriamente dita, pois s neste caso h alterao na composio
da cadeia as molculas resultantes so heteroduplexes recombinantes e, caso a regio
recombinada seja codificante, o gene pode deixar de ser transcrito ou a sua traduo pode
resultar numa protena completamente diferente da protena original.
81
No processo de recombinao
homloga intervm enzimas e
protenas especficas, como as DNA
polimerase e ligase e protenas SSB.
Em E.coli, existem dois sistemas
principais que tm um papel
fundamental na regulao dos
mecanismos de recombinao
sistema Rec e sistema Ruv.
O Sistema Rec constitudo por 4
protenas RecA e complexo
RecBCD, e est envolvido nos
passos centrais da recombinao
homloga. O complexo RecBCD
liga-se ao DNA de cadeia dupla
(dsDNA)
e
processa-o,
transformando-o
em
cadeias
simples (ssDNA) prontas a serem
utilizadas pela RecA. A protena
Ilustrao 114 - Aco do complexo RecBCD: RecBCD makes ss
RecA tem trs locais especficos de
nicks where RecA binds; Heterotrimeric product of recB, recC and
recD SOS genes; Complex binds to free end of dsDNA and unwind ligao ao DNA, pelo que comea
it in ATP dependent reaction; Cleavage of both DNA strands; por se ligar a ssDNA, formando um
After Chi sequence (GCTGGTGG), stops cleaving 3 end.
filamento de DNA-protenas, e, de
seguida, associa-se tambm a dsDNA. Segue-se o alinhamento das cadeias homlogas e a
RecA, custa de ATP, catalisa o emparelhamento da cadeia simples com a sua cadeia
complementar proveniente do dsDNA, dando origem a um heteroduplex.
82
O Sistema Ruv responsvel pela resoluo das junes de Holliday. A protena RuvA
reconhece a juno e recruta a protena RuvB. O complexo RuvAB, que tem actividade de
helicase, catalisa a migrao da juno, promovendo a variao da extenso do heteroduplex,
e RuvC, que tem actividade de endonuclease, cliva as cadeias cruzadas. DNA ligases actuam no
sentido de ligar as cadeias das molculas recombinantes, e termina o processo recombinao.
A recombinao site-specific apenas requer homologia de pequenas regies especficas e
permite a introduo ou perda de informao gentica. A grande variedade de
imunoglobulinas do organismo humano deve-se a fenmenos de recombinao site-specific
durante a maturao de linfcitos B e a construo de organismos geneticamente modificados
(OMG) pode ser feita utilizando este processo.
Na criao de OGMs e tambm em processos de recombinao, por exemplo, entre
cromossomas de bactrias e plasmdeos, o que acontece que existem genes flanqueados por
informao gentica homloga a uma regio do DNA. Por recombinao, essa informao
inserida na molcula. Por outro lado, recombinao entre sequncias homlogas de uma
mesma molcula pode levar perda da regio entre essas sequncias.
83
A produo de flagelina, um agente virulento, por parte das salmonelas um bom exemplo de
recombinao intramolecular com repeties invertidas. As bactrias podem produzir,
alternadamente, flagelina H1 ou H2 conforme a orientao de uma das suas sequncias, o
chamado segmento H. Este segmento flanqueado por duas sequncias invertidas, podendo
sofrer inverso por recombinao, e contm o promotor do gene da flagelina H2 e de um
repressor do gene da flagelina H1. Quando o segmento H se encontra numa orientao que
permite a sua transcrio, produzida H2 e silenciado o gene da H1. Quando ocorre
recombinao, o gene de H2 deixa de ser transcrito e passa a ser produzida H1.
A alterao do tipo de flagelina produzida pela salmonela permite-lhe resistir mais tempo num
organismo pois assim que o sistema imunitrio do hospedeiro j est preparado para
combater um tipo de virulncia ela altera o tipo de flagelina produzida, desencadeando uma
nova resposta imunitria.
84
85
86
XII.
Transcrio de DNA
Transcrio o processo atravs da qual se sintetiza RNA a partir da informao contida nos
genes da molcula de DNA. Este processo apresenta algumas diferenas nos organismos
procariotas e eucariotas e est sujeito a mecanismos de regulao, verificando-se que os genes
so transcritos de acordo com as necessidades da clula.
O genoma de procariontes constitudo maioritariamente por regies codificantes, isto ,
regies que contm genes e codificam a sntese de RNA. J nos eucariotas, a maior parte do
seu genoma est sob a forma de regies intergnicas regies no codificantes (cerca de 98%
do genoma humano so regies no codificantes). Sabe-se actualmente que estas regies,
anteriormente sem qualquer funo atribuda e designadas por junk-DNA, tm um papel
importante na transcrio.
Os genes contm informao para a sntese de vrios tipos de RNA, cujo processo de
transcrio o mesmo:
RNA mensageiro, mRNA molde utilizado pelos ribossomas para a sntese de
protenas;
RNA de transferncia, tRNA intermedirio entre mRNA e os aminocidos durante a
sntese proteica ao nvel dos ribossomas;
RNA ribossomal, rRNA um dos constituintes dos ribossomas.
Um gene apresenta 3 regies:
Regio promotora onde se encontra o promotor, o local onde a RNA polimerase se
liga para iniciar a transcrio essencial ao incio da transcrio mas no transcrito.
Tem sequncias especficas em determinados locais as zonas consenso, que so
reconhecidas pela polimerase e que tm que ser semelhantes para todos os genes pois
nos procariotas s existe uma RNA polimerase (apesar de se verificar a existncia de
vrios factores que direccionam a transcrio para locais diferentes, de acordo com
as condies a que a clula sujeita).
87
Na transcrio intervm uma enzima especfica, a RNA polimerase. Esta enzima transcreve a
informao contida no DNA para RNA e, semelhana das DNA polimerases, catalisa o
crescimento de cadeias de RNA no sentido 5-3. No entanto, no necessita de um primer para
iniciar o processo. A RNA polimerase, assim como o processo de transcrio de procariotas e
eucariotas apresenta algumas diferenas:
A RNA polimerase de E. coli um complexo enzimtico formado por 5 subunidades
(duas , , , e ). O factor essencial para o reconhecimento da regio
promotora do gene e para a correcta ligao da RNA polimerase ao DNA mas no tem
actividade cataltica, libertando-se da
enzima quando j se encontram
sintetizados alguns nucletidos de RNA;
Nos eucariotas existe uma polimerase
diferente para cada tipo de RNA
(mensageiro,
de
transferncia
e
ribossomal) mas todas so complexos
formados por 12 a 17 subunidades e
partilham algumas caractersticas, tanto
entre si como com a polimerase dos
Ilustrao 126 - RNA polimerase procaritica.
procariotas.
RNA
polimerase
II
II
III
Genes nucleares
mRNA
miRNA
tRNA
rRNA
5.8S, 18S,
88
III
II e III
Mitocondrial
Cloroplastos
Semelhantes RNA
polimerase bacteriana
89
90
O processo de transcrio acima descrito diz respeito aos organismos procariotas. Nos
eucariotas a estrutura dos promotores e das RNA polimerases diferente, pelo que vo existir
algumas diferenas nos mecanismos de transcrio.
O reconhecimento do promotor e a ligao da RNA polimerase no esto associados a um
factor mas dependem de diversos factores de transcrio factores gerais, comuns
transcrio de todos os genes, ou especficos para determinados genes. Os factores de
transcrio so, geralmente, protenas que tm uma regio que se liga ao DNA e outra regio
que interage com outras protenas e estimula a transcrio.
Na iniciao da transcrio, a RNA polimerase II associa-se ao promotor, ao mediador e a
outros factores de transcrio, dando origem ao complexo RNA polimerase II/Mediador o
complexo de iniciao. A este complexo podem ligar-se ainda estimuladores (enhancers), que
so sequncias de DNA
que se associam a
factores de transcrio
que regulam a actividade
da RNA polimerase. Os
estimuladores situam-se
em regies intergnicas
que
podem
estar
localizadas em qualquer
ponto dos cromossomas,
sendo a sua ligao
possvel
devido
existncia de loops na
Ilustrao 129 - Factores de transcrio dos eucariotas.
molcula de DNA.
A transcrio iniciada quando se d a fosforilao dos resduos de serina e treonina do CDT
(carboxi terminal domain), uma sequncia de aminocidos que faz parte da RNA polimerase.
91
a. Regulao da Transcrio
O genoma de um organismo contm milhares de genes que no so todos transcritos em
simultneo. Existem mecanismos de regulao, tanto em procariotas como em eucariotas,
que actuam ao nvel da iniciao ou da elongao no sentido de silenciar ou promover a
transcrio de determinados genes, de acordo com as necessidades da clula.
Em organismos procariotas a regulao d-se principalmente na etapa da iniciao e pode
envolver diversos mecanismos, dos quais iremos estudar dois exemplos: a regulao do
opero da lactose e do opero do triptofano em E.coli.
92
i.
Opero da lactose
Os genes responsveis por esse metabolismo distribuem-se por uma estrutura monocistrnica
e por uma estrutura tricistrnica. O opero da lactose, a estrutura tricistrnica, constitudo
por um promotor, um operador e por 3 genes que so transcritos em conjunto:
Promotor (P) sequncia promotora, local de ligao da polimerase;
Operador (O) sequncia qual se pode ligar uma protena reguladora (LacI), que
impede a transcrio dos genes do opero;
Gene LacZ codifica a -galactosidase, enzima responsvel pela quebra da ligao
glicosdica entre a glucose e a galactose. o gene mais importante, apresentando
maior afinidade na regio RBS, e o facto de estar na extremidade 5 protege o seu
transcrito de mRNA de uma degradao demasiado precoce;
Gene LacY codifica a permease, uma protena de membrana especfica para o
transporte de lactose para o interior das clulas;
Gene LacA codifica a transacetilase, uma protena que modifica a galactose mas que
no essencial ao seu metabolismo. o gene menos importante e, por esse motivo,
est mais sujeito degradao que os restantes genes.
A estrutura monocistrnica consiste em:
Promotor (Pi) promotor do gene LacI;
Gene LacI gene repressor que codifica uma protena reguladora (LacI). Na ausncia
de lactose, LacI liga-se ao operador do opero da lactose e impede a transcrio dos
seus genes.
Quando h lactose disponvel na clula, esta liga-se protena reguladora LacI, alterando a sua
configurao tridimensional. Consequentemente, deixa de existir afinidade entre esta protena
e o operador pelo que os genes do opero podem ser transcritos. So sintetizadas as protenas
LacZ, LacY e LacA e a lactose degradada. Este tipo de regulao diz-se por induo negativa
visto a presena de LacI impedir a transcrio.
93
Apesar de a lactose ser uma fonte de energia, como a glicose um acar mais simples o seu
metabolismo mais rpido. Como tal, quando existe glucose disponvel na clula esta vai ser
utilizada primeiro e, s quando a glucose se tiver esgotado, que a lactose comea a ser usada
como fonte de energia.
Na presena apenas de um acar, um grfico do crescimento populacional de uma colnia de
bactrias do tipo (1). Mas na presena de dois acares, digamos glucose e lactose, o
crescimento do tipo (2) e diz-se um crescimento diauxico. Em (2) verifica-se que as bactrias
se dividem exponencialmente para depois o seu crescimento estabilizar (a) medida que o
acar mais simples, neste caso a glucose, consumido. Segue-se uma nova etapa de
crescimento e estabilizao (b) quando consumido o acar restante, a lactose. Se
representssemos os nveis de -galactosidade na clula ao longo do tempo obteramos uma
curva do tipo (c).
94
Ilustrao 134 - (1) Crescimento normal. (2) Crescimento diauxico. (a) Glucose e lactose disponveis; consumo de
glucose. (b) Apenas lactose disponvel; consumo de lactose. (c) Nveis de -galactosidade.
Ilustrao 135 - Na ausncia de glicose h maior produo de cAMP e o opero da lactose activado.
95
ii.
Opero do triptofano
96
Para alm da regulao por um complexo repressor existe um outro mecanismo que controla a
transcrio de triptofano. Este mecanismo, associado s regies L e A, de regulao por
atenuao e permite que a transcrio seja inibida mesmo quando a quantidade de triptofano
na clula no suficiente para activar o apo-repressor ou quando este mecanismo no
eficaz.
Se no houve represso ao nvel do operador inicia-se a transcrio das regies L e A. O RNA
resultante pode ser dividido em 4 zonas 1 (L) e 2, 3 e 4 (A), ricas em contedo CG e que
tendem a formar ganchos. Dependo dos ganchos que se formam pode ou no ocorrer
transcrio:
Gancho 2-3, gancho de anti-terminao: este gancho forma-se relativamente longe da
RNA polimerase, no a destabilizando, pelo que a transcrio dos genes continua;
Gancho 3-4, gancho de terminao: a sua formao destabiliza a RNA polimerase e
provoca a sua dissociao do DNA, interrompendo a transcrio.
A quantidade de triptofano disponvel na clula que vai determinar o tipo de gancho que se
forma.
Logo aps a transcrio inicia-se a traduo da regio L no chamado pptido Lder. Este
pptido formado por 14 aminocidos e na posio 11 e 12 requer a introduo do triptofano.
De acordo com a quantidade de Trp disponvel duas situaes so possveis:
97
98
iii.
Regulao em eucariotas
Nos eucariotas necessria a interaco com vrias protenas e entre diferentes regies do
cromossoma para que ocorra a transcrio. No entanto, o DNA encontra-se muito compactado
e associado a protenas, as histonas, o que pode comprometer a sua disponibilidade para a
transcrio. O DNA precisa ento de ser uma estrutura compacta, para que se possa
concentrar no ncleo da clula, mas simultaneamente dinmica, de modo a permitir a
transcrio.
O genoma dos eucariontes est concentrado no ncleo e organizado em cromossomas. Os
cromossomas s se encontram individualizados durante a diviso celular, chamando-se
cromatina sua forma indiferenciada. A unidade bsica da cromatina so os nucleossomas,
sequncias de cerca de 200 nucletidos enroladas em torno de um conjunto de protenas, as
histonas (H1, H2A, H2B, H3 e H4). A cadeia dupla de DNA d duas voltas em torno de dois
discos de 4 histonas (H2A, H2B, H3 e H4) empilhados e ligados lateralmente por uma outra
histona (H1). Os nucleossomas so depois compactados e, no seu conjunto, podem
apresentar-se na forma de:
99
100
XIII.
Processamento de RNA
Aps a sua transcrio, os RNAs sofrem processamento antes de adquirirem a sua forma
funcional. rRNAs e tRNAs de procariotas e eucariotas so processados, em contraste com os
mRNAs, em que os nicos sujeitos a este processo so provenientes de organismos
eucariotas.
a. Processamento de tRNA
Os aminocidos so adicionados s protenas durante a traduo por intermdio de RNA de
transferncia. Como existem 20 aminocidos tm que existir, pelo menos, 20 tRNAs. Na
realidade verifica-se que, conforme a espcie, existem 60 a 80 molculas diferentes de RNA de
transferncia, o que indica que um mesmo aminocido pode ser transportado por vrios
tRNAs.
Cada molcula de tRNA codificada por um gene diferente e da sua transcrio resulta uma
sequncia de nucletidos, pr-tRNA, que se organiza numa estrutura secundria caracterstica.
Essa estrutura, comum ao pr-tRNA e ao tRNA, em forma de trevo devido s ligaes
hidrognio que se estabelecem entre bases complementares e levam formao de ganchos.
Por ser muito estvel, permite ao RNA ter um tempo de vida na clula bastante longo.
O processamento do pr-tRNA leva sua maturao em RNA e sua activao. O
processamento tem duas fases, sendo que em algumas molculas de pr-tRNA ainda
necessrio clivar previamente sequncias nos seus terminais, processo levado a cabo pela
enzima RNase P. O processamento engloba ento 2 fases sucessivas:
Adio de uma sequncia CCA ao terminal 3. Nalguns casos esta sequncia
codificada no prprio gene do RNA de transferncia, mas noutros casos tem que ser
colocada por aco de uma enzima. neste local que posteriormente se vai ligar
covalentemente o aminocido;
101
Aps o processamento ainda necessrio activar o tRNA, passando este a ser designado
aminoacil tRNA. A activao d-se pela ligao de um aminocido ao terminal 3, reaco com
gasto de ATP e mediada pela enzima aminoacil tRNA sintetase. Existe uma enzima para cada
aminocido, verificando-se que a activao de diferentes tRNAs que transportam o mesmo
aminocido feita pela mesma enzima.
Uma vez activado, o tRNA pode seguir para os ribossomas e intervir na sntese proteica. A
sequncia de 3 nucletidos, anti-codo, que permite o reconhecimento do codo de mRNA e a
adio do aminocido correcto, oposta ao local de ligao do aminocido, localizando-se no
terminal de um dos ganchos da molcula de tRNA.
102
b. Processamento de rRNA
Os ribossomas, locais onde ocorre a sntese proteica, so formados por rRNA e protenas
ribossomais. Cada ribossoma tem duas subunidades, uma subunidade pequena e outra
grande, formadas por diferentes rRNAs que so caracterizados pelo seu coeficiente de
sedimentao (S). Tambm os prprios ribossomas se caracterizam por este coeficiente.
Ser
Tipo de
Ribossoma
Subunidade
pequena
Subunidade
grande
Tipo
N de
Protenas
rRNA
constituintes
Tipo
N de
Protenas
rRNA
constituintes
Procariota
Eucariota
70S
80S
30S
40S
21
33
34
49
5S (120 nucletidos),
5.8S (160 nucletidos) e
28S (4700 nucletidos)
103
c. Processamento de mRNA
Nos procariotas, o mRNA est pronto a ser traduzido logo aps a transcrio. J nos
organismos eucariotas, o transcrito de pr-mRNA sintetizado no ncleo ainda vai sofrer
extensas modificaes at poder ser utilizado no processo de traduo.
O processamento de mRNA de eucariotas ocorre no ncleo e inclui:
Capping em 5 adio ao terminal 5 de um nucletido com uma base modificada,
m7G 7-metilguanina. neste terminal que se vo ligar os ribossomas para que se d
a traduo completa do mRNA;
Poliadenilao adio de nucletidos de adenina ao terminal 3 e formao de uma
cauda poli-A de comprimento varivel (pode atingir as 300 bases). Para alm de
regular mecanismos de traduo e estabilidade, esta cauda tem ainda um papel
protector na medida em que atrasa a digesto do RNA pela RNase, permitindo assim
que a sua sequncia codificante se mantenha ntegra durante um perodo de tempo
maior.
104
105
XIV.
Traduo de RNA
Traduo o processo que, ao nvel dos ribossomas, permite a sntese de protenas a partir de
mRNA. Os mecanismos de sntese so semelhantes nos procariotas e eucariotas, embora
existam algumas diferenas, nomeadamente na iniciao da traduo e no nmero de
protenas traduzidas a partir do mesmo mRNA.
O mRNA de eucariotas monocistrnico, ou seja, apenas contm informao para a sntese de
uma protena. J o mRNA de procariotas pode ser policistrnico, o que significa que pode
albergar informao para a sntese de vrias protenas. sequncia de genes contemplados no
mesmo RNA, do qual resulta um mRNA policistrnico, d-se o nome de opero.
Nos terminais do mRNA, tanto de procariotas como de eucariotas, existem regies no
traduzidas (UTR unstranslated regions) que podem conter informao necessria iniciao
e terminao da traduo.
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107
108
Ilustrao 158 - Sequncia sinal no terminal amina que libertada quando a protena chega ao destino.
Assim que um ribossoma se afasta do local de iniciao um outro ribossoma pode ligar-se e dar
incio traduo de mais uma protena. assim possvel que um mesmo mRNA seja traduzido
em simultneo por vrios ribossomas, que esto usualmente espaados de cerca de 100 a 200
nucletidos, e a cujo grupo se d o nome de polissomas.
Durante a traduo, a cadeia polipeptdica que vai sendo sintetizada fica sujeita a interaces
entre os seus aminocidos constituintes. Como a configurao final de uma protena funcional
influenciada pela sua sequncia total de aminocidos e pelo meio em que se encontra, para
prevenir a formao de estruturas tridimensionais antes de ser terminada a traduo e antes
de a protena ter sido transportada para o seu local de aco, um conjunto de protenas
estabilizam a sequncia linear de aminocidos. Quando a cadeia polipeptdica j foi toda
sintetizada e j se encontra no local em que necessria, essas protenas, os chaperes,
dissociam-se da cadeia e permitem ento que a protena adquira a configurao tridimensional
que a torna funcional.
109
A informao para a ordenao dos aminocidos est contida nos genes, existindo um cdigo
de correspondncia cdigo gentico entre as 4 letras do RNA e os 20 aminocidos
conhecidos. Ao conjunto de 3 nucletidos, tripleto, necessrios para a sntese de um
aminocido, chama-se codogene (DNA), codo (mRNA) e anti-codo (tRNA).
O cdigo gentico apresenta diversas caractersticas:
Universal comum a quase todas as clulas;
No ambguo a um tripleto de nucletidos corresponde apenas um aminocido;
Redundante/degenerado vrios codes podem sintetizar um mesmo aminocido. A
degenerescncia do cdigo gentico vai de 1 a 6 (aminocido arginina est associado a
6 codes diferentes);
O terceiro nucletido no to especfico. A degenerescncia d-se muitas vezes na
terceira base;
O tripleto AUG tem uma dupla funo codifica o aminocido metionina e ao
mesmo tempo um codo de iniciao. Podem existir outros codes de iniciao mas a
metionina o mais comum;
Os tripletos UAA, UGA e UAG so codes de finalizao ou codes stop no
codificam qualquer aminocido e sinalizam o fim da sntese proteica.
Aminocidos
Codificao
Aminocidos
Codificao
Aminocidos
Codificao
cido
Asprtico
GAT, GAC
Glicina
GGG, GGA,
GGC, GGT
Prolina
CCT, CCC,
CCA, CCG
cido
Glutmico
GAA, GAG
Glutamina
CAA, CAG
Serina
AGT, AGC,
TCT, TCC,
TCA, TCG
Alanina
GCT, GCC,
GCG, GCA
Histidina
CAT, CAC
Tirosina
TAT, TAC
Arginina
AGG, AGA,
CGT, CGC,
CGA, CGG
Isoleucina
ATT, ATC,
ATA
Treonina
ACT, ACC,
ACA, ACG
Leucina
TTA, TTG,
CTT, CTC,
CTA, CTG
Triptofano
TGG
Asparagina
AAT, AAC
110
Cistena
TGT, TGC
Lisina
AAG, AAA
Valina
GTT, GTC,
GTA, GTG
Fenilalanina
TTT, TTC
Metionina
ATG
Stop
TAA, TAG,
TGA
XV.
Ciclo Celular
O conjunto de transformaes sofridas por uma clula desde a sua formao at sua diviso
conhecido como ciclo celular. Este processo, comum a todos os organismos vivos, inclui
perodos de desenvolvimento (interfase) e perodos de diviso (fase mittica).
Durante a diviso celular uma clula-me origina duas clulas-filhas geneticamente iguais a si.
O seu DNA duplicado e os organelos, enzimas e outros constituintes da clula so repartidos
pelas duas clulas-filhas.
Interfase perodo compreendido entre o final da diviso celular e o incio da diviso seguinte.
Corresponde a 90% da vida da clula e um perodo de intensa actividade biossinttica,
verificando-se o crescimento e duplicao do contedo celular, incluindo o seu DNA. Nesta
fase os cromossomas no so visveis ao microscpio ptico. A interfase engloba ainda 3
perodos diferentes:
111
112
Meiose o processo de diviso nuclear atravs do qual se formam 4 ncleos haplides (n) a
partir de uma clula diplide (2n). O nmero de cromossomas da clula reduzido para
metade pelo que a meiose tambm pode ser chamada de reduo cromossmica.
A meiose, tal como a mitose, precedida pela replicao do DNA dos cromossomas. A esta
replicao seguem-se duas divises consecutivas. A primeira diviso chama-se diviso
reducional, ou diviso I, e a segunda diviso tem por nome diviso equacional, ou diviso II.
Estas divises do origem a 4 clulas diferentes entre si, cada uma das quais com metade do
nmero de cromossomas da clula inicial.
Interfase semelhante interfase descrita para a mitose. Precede a diviso I e,
durante o perodo S, d-se a replicao do DNA. No final desta fase cada cromossoma
constitudo por dois cromatdeos. 2
Diviso I nesta diviso, um ncleo diplide (2n) origina dois ncleos haplides (n).
Como ocorre uma reduo no nmero de cromossomas, esta diviso tambm
designada diviso reducional.
Profase I a etapa mais longa e complexa. Os cromossomas condensam e os
cromossomas homlogos emparelham, juntando-se gene a gene. Ao par de
homlogos tambm se chama bivalentes ou ttradas cromatdicas. Durante o
emparelhamento surgem pontos de cruzamento entre dois cromatdeos
irmos, os chamados pontos de quiasma ou sinapses. Pode ocorrer rotura de
113
os
bivalentes ligam-se a
microtbulos do fuso
acromtico
pelos
Ilustrao 165 - Ponto de quiasma.
centrmeros e os pontos
de quiasma localizam-se no plano equatorial do fuso acromtico. A orientao
de cada par d-se ao acaso;
Anafase I os dois cromossomas homlogos de cada bivalente separam-se e
migram aleatoriamente para plos opostos da clula;
Telofase I Em cada plo da clula constitui-se um ncleo haplide (n) cujos
cromossomas apresentam dois cromatdeos. Os cromossomas descondensam,
tornando-se mais finos e mais longos. O fuso acromtico desaparece e o
invlucro nuclear reorganiza-se. Em alguns casos, segue-se a citocinese e
formam-se duas clulas haplides.
Pode ou no existir uma Interfase entre a diviso reducional e a diviso equacional
mas, em qualquer dos casos, no se verifica a replicao do material gentico.
Diviso II nesta diviso ocorre a separao de cromatdeos, obtendo-se assim, quatro
ncleos haplides (n), cujos cromossomas so constitudos por um nico cromatdeo.
Pelo facto de se manter o nmero de cromossomas, esta diviso tambm designada
de diviso equacional. Esta diviso da meiose em tudo muito semelhante diviso
celular por mitose:
Profase II Os cromossomas constitudos por dois cromatdeos tornam-se
mais grossos e curtos. Organiza-se o fuso acromtico e o invlucro nuclear
desaparece;
Metafase II Os cromossomas no seu mximo encurtamento dispem-se com
os centrmeros na zona equatorial do fuso acromtico;
Anafase II Os dois cromatdeos de cada cromossoma separam-se pelo
centrmero, passando a constituir cromossomas independentes, e migram
para plos opostos da clula;
Telofase II Os cromossomas descondensam, tornando-se mais finos e longos.
Organiza-se o invlucro nuclear e formam-se ncleos haplides. D-se a
individualizao das clulas e a partir de uma clula diplide formam-se quatro
clulas haplides.
114
115
N de divises
N de ncleos formados
Emparelhamento de
cromossomas homlogos
N de cromossomas das
clulas filhas em relao s
clulas me
Crossing-over
Informao gentica das
clulas filhas em relao s
clulas me
Diviso do centrmero
Funo
Mitose
1
2
Meiose
2
4
No ocorre
Ocorre
Igual
Metade
No ocorre
Ocorre
Igual
Diferente
Anafase
Crescimento e reparao de
estruturas do organismo; reproduo
assexuada com criao de clones em
seres unicelulares
Anafase II
Produo de gmetas
ou esporos para a
reproduo sexuada
116
As ciclinas podem associar-se a enzimas com actividade fosforilativa, as cinases Cdk (cyclindependent kinases), de modo a formarem o complexo MPF maturation promoting factor,
que promove a entrada da clula na fase mittica. Quando se associam s Cdks, as ciclinas
ajudam a direccion-las para as protenas alvo.
A associao de uma ciclina B, sintetizada durante a fase G2, a uma cinase Cdk1 (inactiva) leva
formao de um complexo Cdk1/ciclina B (MPF) e fosforilao de determinados resduos
de treonina (14 e 161) e de tirosina (15). A fosforilao de tri-14 e tir-15 provoca uma inibio
da enzima e impede que esta entre prematuramente em mitose. Segue-se a desfosforilao
desses resduos, ficando apenas fosforilado o resduo de tri-161. Esta uma fosforilao
activadora, verificando-se que activa o complexo MPF e despoleta a desagregao da
membrana nuclear, a reorganizao do citoesqueleto e a condensao dos cromossomas,
permitindo assim a entrada da clula na fase mittica. Terminada essa fase, a ciclina dissociase da Cdk1 e destruda por protelise. A cinase desfosforilada e a clula inicia a citosinese e
a interfase.
Diferentes ciclinas podem associar-se mesma Cdk, consoante a fase do ciclo celular em que a
clula se encontra.
117
Ilustrao 171 - Complexo Cdk1/ciclina B que induz a entrada da clula na fase mittica.
Durante o ciclo celular existem pontos de controlo durante os quais a clula verifica o seu
estado e coordena os eventos que ocorrem em cada fase, prevenindo que a clula passe para
uma fase se os eventos da fase anterior ainda no terminaram ou no ocorreram de forma
correcta. Alguns mecanismos de regulao actuam nos perodos G1, S e G2 e na fase mittica:
No final do perodo G1 diversos mecanismos verificam se existe DNA danificado e, em
caso afirmativo, procedem sua reparao para que a clula possa entrar no perodo S
e iniciar a replicao do seu DNA. Mesmo que o DNA no se encontre danificado
algumas clulas podem no iniciar o perodo S, permanecendo num estado de latncia
designado estado G0. O tempo de permanncia nesse estado muito varivel e, em
alguns casos, como nos neurnios e fibras musculares de um indivduo adulto, podem
mesmo no reiniciar o ciclo celular;
Durante o perodo S h monitorizao contnua do DNA replicado de modo a que
qualquer mutao, base incorrecta ou replicao incompleta seja reparada antes da
diviso celular;
No final do perodo G2 h outro momento de controlo em que se verifica a integridade
do DNA replicado. Se a replicao do DNA foi completa e bem sucedida prossegue-se
para a mitose;
Na fase mittica verifica-se se o fuso acromtico est correctamente formado e se os
cromossomas esto alinhados na placa equatorial, podendo ser divididos igualmente
entre as duas clulas filhas.
118
Ilustrao 173 - Aco do factor de transcrio p53 na inibio do ciclo celular e da replicao do DNA.
119
O cancro aparece apenas ao fim de cerca de 6 mutaes chave acumuladas por uma clula:
Crescimento ilimitado ligando os genes que promovem o crescimento;
Pontos de controlo ignorados desligando os genes supressores de tumores;
Ausncia de apoptose desligando os genes responsveis pela apoptose;
Imortalidade nmero ilimitado de divises conseguido pelos genes responsveis pela
manuteno dos cromossomas (por exemplo, manuteno dos telmeros);
Crescimento de vasos sanguneos ligando os genes responsveis pelo crescimento
de vasos sanguneos;
Ausncia de dependncia de densidade e de suporte desligando os genes de
touch sensor.
Uma clula danificada deve ser destruda, quer por aco de macrfagos quer por apoptose
morte celular programada que passa pelos seguintes passos:
A clula diminui de tamanho;
Os cromossomas condensam-se e fragmentam-se;
A membrana nuclear rompe-se;
Formam-se corpos apoptticos.
120
XVI.
O material gentico dos procariontes consiste, na maioria dos casos, numa molcula circular
de DNA que se encontra numa regio do citoplasma da clula designada por nucleide. Os
plasmdeos so molculas circulares de DNA existentes normalmente no interior de bactrias
e cuja replicao independente da do DNA cromossmico.
Os plasmdeos podem ser modificados geneticamente mediante a sua recombinao com
genes exgenos, que so introduzidos numa regio do plasmdeo designada por regio de
mltipla clonagem (multiple cloning site MCS). Este processo inicia-se pela aco de enzimas
de restrio endonucleases, que, ao reconhecerem determinadas sequncias especficas,
cortam a molcula de DNA nessa regio. De referir que no caso de um vector de clonagem
iremos obter um nico fragmento de restrio enquanto no DNA cromossmico se obtm
vrios fragmentos, pois podem existir vrias regies reconhecidas pelas endonucleases de
restrio. O gene a ser introduzido, previamente cortado pelas mesmas enzimas de restrio,
ser fixado no plasmdeo mediante a aco de DNA ligases, voltando este a adquirir a forma
circular.
Outras regies igualmente importantes nos plasmdeos so as marcas de seleco (selectable
marker) e a origem de replicao (origin of replication Ori). As primeiras permitem isolar os
plasmdeos recombinados mediante a introduo de genes que conferem, por exemplo,
resistncia a um antibitico. Deste modo, na presena do mesmo, as bactrias que sobrevivem
sero as que possuem o plasmdeo recombinado. A segunda regio (Ori), contm uma
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