ENZIMAS DE RESTRICCIN

BIOLOGA MOLECULAR
Dr. Jos Carmen Gudio
Patricia Obregn Reyes

Vida, pasin y obra de las enzimas de restriccin

INTRODUCCIN
Las enzimas de restriccin son nucleasas que cortan ADN de doble cadena cuando
reconocen un patrn de secuencia especfico. Generan fragmentos de ADN
conocidos como fragmentos de restriccin. Las enzimas de restriccin son
herramientas imprescindibles en biologa molecular, ingeniera gentica y
biotecnologa.
Se descubrieron en los aos 60 y su uso en biologa molecular empez en los 70
permitiendo el desarrollo de las tecnologas de ADN recombinante. Las enzimas de
restriccin tienen actividad endonucleasa y cortan enlaces fosfodister en las dos
cadenas del ADN. [1]
Todas las enzimas de restriccin caen en una de tres clases, basadas en su
estructura molecular y necesidad de co-factores especficos. Las endonucleasas
de clase I tienen un peso molecular de alrededor de 300.000 Daltons, estn
compuestas de subunidades no idnticas y requieren Mg2 +, ATP (adenosina
trifosfato) y SAM (Sadenosil-metionina) como cofactores para la actividad. Las
enzimas de clase II son mucho ms pequeas, con pesos moleculares en el
intervalo de 20.000 a 100.000 Daltons. Tienen subunidades idnticas y requieren slo
Mg2 + como un cofactor [1]. La enzima Clase III es una molcula grande, con un
peso molecular de alrededor de 200.000 Daltons, compuesta de subunidades no
idnticas. Estas enzimas difieren de las enzimas de las otras dos clases en que
requieren Mg2 + y ATP pero no SAM como cofactores. Las endonucleasas clase III
son las ms raras de los tres tipos.
Las enzimas de restriccin de tipo I y III reconocen una secuencia especfica pero
cortan a una distancia variable del sitio de reconocimiento (sitio de restriccin). Las
enzimas de restriccin de tipo II reconocen una secuencia especfica conocida
como secuencia diana y siempre cortan entre los mismos nucletidos. De ah que
generen siempre los mismos fragmentos de restriccin. La secuencia diana es de
tamao variable, la mayora de 4 y 6 nucletidos, y con frecuencia es parcialmente

palindrmica. Algunas enzimas de restriccin cortan generando extremos llamados

romos mientras que otras cortan generando extremos llamados cohesivos. [2]
El nombre dado a cada nueva enzima transmitira tanto el gnero como la especie
de la bacteria de la que fue aislado, el nmero de la cepa y el orden en serie en el
que se encontr la enzima. Por lo tanto, la enzima de restriccin designada Bam HI
fue la primera enzima encontrada en la bacteria Bacillus amyloliquifaciens, cepa H
mientras que la enzima de restriccin Hae III fue la tercera enzima encontrada en
Haemophilus aegyptius.
A medida que la lista de enzimas de restriccin creci y se identificaron sus
secuencias de reconocimiento, se encontr en algunos casos que ms de una
enzima poda reconocer la misma secuencia. El trmino isoschizomer (mismo
cortador) en las enzimas de restriccin que reconocen la misma secuencia de
ADN.
Las enzimas de restriccin al cortar ADN pueden producir dos tipos de cortes:
-

Abruptos: Cortan en un solo punto.

Cohesivos o pegajosos: Cortan de manera escalonada en dos puntos

diferentes.
Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque
pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la
misma enzima de restriccin.

Las enzimas de restriccin son una herramienta bsica en Biologa molecular: en

laboratorios de PCR, creacin de sondas para hibridacin, laboratorios de
secuenciacin de ADN, ingeniera gentica, procesos de clonacin, manejo de
genotecas y en muchas otras reas de genmica.
Las enzimas de restriccin tienen diferentes aplicaciones que son de gran
importancia en investigaciones en biologa molecular y en las tcnicas que emplea
la biotecnologa moderna:

Hacer mapa de restriccin de un plsmido o bacterifago

El ADN se corta con varias enzimas de restriccin, solas y en parejas, para

determinar el nmero de sitios de corte y sus posiciones relativas en la molcula, el

orden y la distancia entre ellos.
Fragmentar ADN para separacin por electroforesis
Los fragmentos obtenidos despus de la actuacin de las distintas enzimas de
restriccin, se pueden separar por tamaos mediante la tcnica de electroforesis y
as estudiar los distintos fragmentos. Por ejemplo: Para la tcnica de Southern
blotting o en las usadas para identificar polimorfismos de ADN en distintos individuos
(RFLP).
Generacin de fragmentos para ser clonados en los vectores apropiados, y crear
ADN recombinante
Se puede cortar una molcula de ADN con una enzima y, con el mismo tipo de
enzima, cortar el fragmento de ADN de inters para clonar. Se unen con ligasas
estas dos molculas de ADN, generando as una molcula de ADN recombinante.
Este vector recombinante puede usarse para transformar clulas que expresen el
gen de inters clonado o puede usarse simplemente para tener clonado
(guardado) ese fragmento de ADN de inters. Por ejemplo: Para los proyectos de
secuenciacin de genomas. [3]
Uso de enzimas de restriccin para crear marcadores de peso molecular de ADN
confiables para la electroforesis en gel
Desde entonces, se han utilizado muchas combinaciones de ADN genmico vrico
y enzimas de restriccin para producir marcadores de peso molecular.

OBJETIVO
Analizar con la tcnica de electroforesis los fragmentos de ADN generados a travs
de la digestin por enzimas de restriccin.

MATERIALES Y METODOLOGA
Materiales

Reactivos

Sistema de electroforesis horizontal

ADN

Micropipetas

Enzimas de restriccin

Puntas para micropipetas amarillas y blancas

Amortiguador TBE

Lampara de luz UV

Agarosa

Tubos Eppendorf de 1.5mL estriles

Bromuro de etidio

Azul de bromofenol

RESULTADOS

Figura 1. Secuencia de ADN para obtener las enzimas de restriccin necesarias

Figura 2. Sitios especficos de corte de las enzimas de restriccin

Figura 3. Posicin de sitio de corte y especificidad de las enzimas de restriccin

12 11 10 9

5 4 3 2 1

Figura 4. Corrida de la electroforesis

Pocillo 1: Banda del marcador de peso; Bio-Rad CA 94547.

Pocillo 2: Se puede observar la banda de 480 pb.
Pocillos 3 al 5: Bandas donde se le inyecto el gen con la enzima JAE3.
Pocillos 9 al 12: Bandas donde se le inyecto el mismo gen con la enzima JINF1, la
cual cort por completo al gen.

DISCUSIN Y CONCLUSIN
En los resultados que obtuvimos en el gel de electroforesis, podemos observar
como nuestro producto que pusimos al principio fue de 400 pb, el cual fue cortado
en 150 pb obteniendo un producto con un peso molecular prximo a 250.
En el segundo producto de PCR con el mismo peso de 400 pb, utilizamos una
enzima que cort por completo el fragmento de ADN ya que no se distinguen otras
bandas en los mismos pocillos de esas muestras.
Esta enzima tiene un sitio de corte que entre 194 a 198 pares de bases, lo que
significa que nuestra banda quedara justo a la mitad de la original.
Gracias a estos resultados, se pueden comparar las bandas obtenidas con las del
marcador y se puede saber el peso molecular, el cual nos indica que las bandas
obtenidas fueron entre 200.

REFERENCIAS
[1]http://medmol.es/glosario/52/
[2]http://rebase.neb.com
[3]http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1&n
ote=34