Gua de Estudio para Microbiologa Experimental

Prctica 1 Higiene y seguridad en el laboratorio microbiolgico

1 Qu es un microorganismo?
Organismo microscpico consistente en una clula o grupo de clulas. Por razones prcticas,
este trmino tambin incluye a los virus, que no son seres celulares.
2 Qu es un laboratorio de microbiologa?
Es un lugar habilitado para manejar y estudiar microorganismos. El trabajo debe realizarse de
acuerdo a los estndares tcnicos y de seguridad propios de un laboratorio de microbiologa.
3 Describe las caractersticas (prcticas, equipo de seguridad e instalaciones) de los niveles de
bioseguridad de los laboratorios en funcin del grupo de riesgo al que pertenecen los
microorganismos.
Nivel
bioseguridad
1
2

de

Prcticas
Reglas de higiene
y seguridad
Nivel 1 + bata y
guantes
protectores.
Manual
de
desechos
infecciosos.
Acceso limitado a
las
reas
de
trabajo.
Nivel 2 +
Ropa especial de
laboratorio.
Acceso limitado y
controlado a las
instalaciones.
Nivel 3 +
Entrada a travs
de una sala de
cambio de ropa.
Ducharse al salir
del
rea
de
trabajo
y
descontaminar
todos
los
materiales a la
salida.

Equipo
seguridad
Ninguno

de

Instalaciones
Bsicas

Equipos
de
proteccin como
gabinetes
de
seguridad
para
aislar
aquellas
actividades
que
generen
aerosoles.

Bsicas

Uso de equipo de
proteccin
para
aislar todas las
actividades
riesgosas.

De contencin

Usar para todas

las
actividades
equipo
de
contencin
mxima.

De
contencin
mxima

4 Dibuja el smbolo universal del material biolgico infeccioso.

5 Describe los 4 grupos de riesgo.

Grupo
riesgo
1

de

Caractersticas
Microorganismos
con
probabilidades
de
enfermedades en humanos.

Microorganismos
pocas
provocar

Incluye
a
los
microorganismos
patgenos
que
pueden
provocar
enfermedades en humanos, pero tienen
pocas probabilidades de provocar un
dao grave para el personal de
laboratorio
Est constituido por agentes patgenos
que provocan enfermedades humanas
graves, pero que de manera ordinaria
no se propagan de una persona
infectada a una persona sana.
Agentes patgenos que provocan
enfermedades graves en las personas y
que pueden propagarse fcilmente de
un individuo a otro.

Bacillus cereus
Escherichia coli K12
Lactobacillus
acidophilus
Actinomyces sp
Bordetella
bronchiseptica
Clostridium sp
Klebsiella pnemoniae
Mycobacterium
tuberculosis

Virus del bola

6 Defina microorganismo viable.

Microorganismo capaz de reproducirse.
7 Defina microorganismo inocuo.
Aquel que no hace dao.
8 Microorganismo patgeno.
Microorganismo capaz de causar enfermedad o de causar dao a un hospedero.
9 Defina contaminacin.
Alteracin de la pureza o las condiciones normales de un objeto o medio por agentes qumicos,
fsicos o biolgicos. Presencia en particular de microorganismos no deseados en un ambiente o
rea determinados.
10 Defina asepsia.

Conjunto de procedimiento destinados a prevenir la presencia de microorganismos no deseados

en objetos, medios o cultivos. Implica no tener microorganismos contaminantes.
11 Defina tcnica asptica.
Conjunto de manipulaciones utilizadas para evitar contaminaciones durante el manejo de objetos
estriles o de cultivos microbianos.
12 Defina desinfeccin.
Proceso de eliminacin de la mayora de los microorganismos. No implica la eliminacin de todos
los microorganismos presentes.
13 Defina esterilizacin.
Eliminacin de toda forma de vida de un objeto o medio; implica no slo la eliminacin de
microorganismos de todo tipo, sino tambin de formas de resistencia, como esporas.
14 Defina descontaminacin.
Tratamiento que hace que un objeto inanimado se pueda manipular sin riesgos para la salud.
15 Defina zona asptica.
Regin de unos 40 cm de dimetro alrededor de la flama del mechero, en la que es posible evitar
el arribo de contaminantes durante el manejo de objetos estriles o de cultivos microbianos.
16 Defina RPBI.
Agente biolgico infeccioso cualquier organismo que sea capaz de producir enfermedad. Para
ello se requiere que el microorganismo tenga la capacidad de producir dao, est en una
concentracin suficiente, en un ambiente propicio, tenga una va de entrada y estar en contacto
con una persona susceptible.

Prctica 2 Uso y cuidado del microscopio de campo claro

1

El microscopio ptico est integrado por qu sistemas?

Est integrado por un sistema ptico que permite iluminar el objeto en estudio y amplificar su
imagen, y un sistema mecnico que da soporte y movimiento a los componentes pticos.
2 Describa el fundamento del microscopio ptico.
En la microscopa de campo claro, el campo microscpico o rea observada est brillantemente
iluminada y los objetos en estudio aparecen ms oscuros en el fondo. La luz procedente de la
lmpara y del condensador atraviesa la preparacin (en la cual se encuentra el objeto en
estudio) y permite que la primera lente (objetivo) forme una imagen aumentada de lo que hay
en ella, antes de ser vista, esta imagen es amplificada nuevamente por otra lente que
corresponde al ocular.
3. Indique en la imagen los componentes del microscopio e indique su funcin.

Sistema mecnico
Soporte. Dar estabilidad al aparato, lo que disminuye la vibracin; su funcin es mantener en
posicin a todos los componentes del microscopio.
1
2
3

Base o pie: Alberga la fuente de iluminacin.

Brazo: Permite movilizar el microscopio con la mano, soporta todo el sistema ptico a travs
del cabezal y el revlver.
Cabezal: une el cuerpo de los tubos y el revlver.

Cuerpo de los tubos: Conduce la imagen desde las lentes del objetivo al ocular. Aloja en la
parte superior a los tubos intercambiables.
5 Tubos intercambiables: Soportan los oculares y permiten alinearlos con el objetivo
seleccionado para efectuar una observacin.
6 Revlver: Es el disco que soporta a los objetivos y se gira para colocar el objetivo requerido
bajo el tubo.
7 Platina: Es la pieza donde se coloca la preparacin en estudio. Presenta un orificio central por
donde pasa la luz a la preparacin y est equipada con pinzas para sujetar la preparacin y
dos tornillos.
8 Tornillos que permiten desplazar la preparacin en direccin X o Y.
9 Tornillo macromtrico: Permite acercar la preparacin, con lo cual se localiza la imagen y se
logra un enfoque aproximado.
10 Tornillo micromtrico: Con ste se desplaza el tubo de forma ms lenta, lo que permite hacer
los movimientos finos que se requieren para obtener el enfoque exacto y preciso.
Sistema ptico
Sistema ptico
Est integrado por una fuente luminosa, una lente condensadora de luz que la dirige hacia el
espcimen y dos juegos de lentes que amplifican la imagen.
11 Interruptor: Su localizacin vara en los diferentes modelos.
12 Regulador de intensidad de iluminacin
13 Fuente luminosa: Es una lmpara que se encuentra alojada en la base y emite la luz que pasa
por el diafragma de campo luminoso y el condensador, para despus iluminar la preparacin.
14 Diafragma de campo: Se abre o se cierra para regular la intensidad de la luz que entra al
condensador, slo algunos microscopios tienen integrado a la lmpara este tipo de
diafragma, en otros nicamente se regula el voltaje.
15 Condensador: Concentra los rayos de luz en un punto o foco sobre el campo donde se sita la
muestra, de tal manera que los rayos, despus de atravesar la preparacin, penetran a la
lente del objetivo con el menor ngulo posible, ste posee dos tornillos laterales que permiten
centrar el condensador, hasta alcanzar una posicin que origine un foco preciso.
16 Objetivos: Son las lentes que amplifican la imagen del campo microscpico y por tanto, del
objeto en estudio. Se encuentran ubicados en la parte inferior del tubo. La mayora de los
microscopios tienen tres objetivos que proporcionan diferentes aumentos, siendo los ms
comunes 10X, 40X y 100X.
17 Oculares: Compuestos por lentes que multiplican el aumento del objetivo, estn ubicados en
la parte superior del tubo intercambiable.
4. Mencione los 4 datos que estn en el objetivo.
Coeficiente de aumento, apertura numrica, longitud mecnica del tubo, espesor del
cubreobjetos.
5. Defina poder de resolucin.
Capacidad para presentar dos puntos cercanos como puntos distintos y separados lo que
determina la mxima amplificacin til que se puede obtener con un microscopio ptico.
6. Defina apertura numrica.
Es una propiedad de la lente que determina la medida del tamao del cono de luz que el objetivo
puede admitir y que est dada por: el dimetro real del objetivo, la distancia focal y el ndice de
refraccin del medio que hay entre la muestra y la superficie frontal del objetivo.
7. El aceite de inmersin aumenta la cantidad de luz que pasa a la lente objetivo?

Verdadero
8 Aceite de inmersin
Sustancia transparente con propiedades pticas y las caractersticas de viscosidad necesarias
para su uso en microscopa. Aumenta la cantidad de luz que pasa a la lente objetivo. ndice de
refraccin de 1.51.
ndice de refraccin mayor que el del aire y similar al del vidrio.
Mayor resolucin imagen ms clara.

Prctica 3 Preparaciones microbiolgicas

Preparaciones en fresco
1 Describa para qu se emplean las preparaciones en fresco.
Las preparaciones en fresco se emplean para observar la movilidad, el tamao, la agrupacin de
los microorganismos.
2 Ventajas y desventajas de la preparacin en fresco.
Permiten observar microorganismos vivos en su estado natural sin las alteraciones que provocan
la fijacin y las tinciones. Sin embargo, la observacin es difcil debido a que la escasa diferencia
entre los ndices de refraccin del medio y de los microorganismos, no permite un buen
contraste; por otra parte, el continuo movimiento de los microorganismos, as como el causado
en el fluido, frecuentemente dificultan la observacin.
3 Las preparaciones en fresco se pueden realizar por?
En gota pendiente o suspendida: se coloca la muestra lquida que contiene a los
microorganismos en un cubreobjetos y ste se invierte rpidamente sobre un portaobjetos
excavado.
En portaobjetos normal: se coloca una gota de la muestra entre el porta y el cubreobjetos.
4 Qu se hace en la preparacin en fresco para evitar la desecacin del fluido?
Se sellan los bordes del cubreobjetos con vaselina o aceite.
5 Menciona los colorantes que se pueden agregar
Colorantes muy diluidos denominados colorantes vitales como el rojo neutro, verde Janus o rojo
Congo que aumentan el contraste de las clulas sin afectar su viabilidad.

Preparaciones fijas y teidas

1 La preparacin consiste en?
Una capa de la muestra extendida sobre un portaobjetos libre de grasa. Esta preparacin debe
ser lo suficientemente delgada para permitir el paso de la luz a travs de ella. El extendido o
frote se puede hacer de varias maneras, por ejemplo:
Al colocar con asa una gota de la muestra fluida en el portaobjetos y extenderla en el mismo
procurando formar una pelcula delgada.
Cuando se parte de una muestra slida, con el asa se suspende el desarrollo microbiano en una
pequea gota de agua y se distribuye en el portaobjetos.
Los extendidos o frotes se dejan secar al aire; para asegurar que las clulas queden adheridas al
portaobjetos , posteriormente a fin de inducir la coagulacin de protenas, la preparacin se fija
con calor moderado o mediante la adicin de sustancias deshidratantes y/o precipitantes como
metanol o cloruro mercrico. Esto tiene como objetivo inactivar rpidamente a los
microorganismos para evitar deformaciones en las clulas, as como su desprendimiento en los
lavados que se realizan durante la tincin.
2 Describa la tincin positiva y negativa.
Negativa-Cuando no se tie la estructura de inters. (Tincin de cpsula)
Positiva-Cuando se colorea directamente a los microorganismos o a las estructuras en estudio.
(Tinciones simples, diferenciales, selectivas)
3 Qu es un colorante y mencione sus caractersticas.
Compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les confieren color; estn
formados por un grupo cromforo, que es la parte de la molcula responsable del color, y un
grupo auxcromo que, al formar sales, les permite disociarse y combinarse.
4 Defina al colorante cido y bsico, ejemplifique con colorantes.
Colorantes aninicos o que poseen grupos cargados negativamente, como los carboxilos.
(eosina).
Colorantes catinicos o que poseen grupos cargados positivamente, y que se unen a estructuras
cargadas negativamente. Se comercializan normalmente como sales de cloruro. (cloruro de azul
de metileno).
5

Los colorantes cidos se combinan con los componentes bsicos de la clula, como el
citoplasma, en tanto que los colorantes bsicos se combinan con?
Los componentes cidos como el ADN y el ARN, es decir, los colorantes se combinan con los
componentes celulares en funcin de sus respectivas cargas positivas y negativas, por tanto, los
factores como fuerza inica, composicin del medio, temperatura y pH afectan las tinciones.
6 Defina mordente.
Compuestos que intensifican las reacciones de tincin o favorecen al adsorcin o combinacin
entre el colorante y la clula. (Cuando la afinidad qumica entre el colorante y el componente
celular es baja)
7 Tincin negativa
Consiste en aplicar una sustancia que oscurece el fondo, lo que permite contrastar a las clulas
que quedan incoloras.
8 Tincin de cpsula
Esta estructura corresponde a una cubierta extracelular constituida por polisacridos,
generalmente detranas o alginatos, que se acumulan alrededor de la clula; su formacin
depende de la especie y de la composicin del medio de cultivo.

El desarrollo de microorganismos capsulados en medios lquidos produce viscosidad como

sucede en el pulque y alimentos deteriorados por microorganismos capsulados.
Como la cpsula no se combina fcilmente con colorantes, se observa casi siempre con tincin
negativa, usando tinta china o nigrosina para oscurecer el fondo y en ocasiones un colorante de
contraste para teir a las clulas.
9 Tinciones simples.
Consisten en aplicar un solo colorante a la preparacin para observar la morfologa, tamao y
agrupacin de los microorganismos.
Se usan principalmente colorantes bsicos como el azul de metileno, cristal violeta o la
safranina.
10 Tinciones diferenciales
Consisten en aplicar una combinacin de colorantes, mordentes y decolorantes que permiten
poner de manifiesto alguna diferencia importante en la composicin qumica de los
microorganismos. De este modo, se pueden distinguir microorganismos que, aun cuando
presenta igual morfologa, manifiestan diferencias en su composicin qumica.
11 Tincin de Gram
La tcnica consiste en aplicar cuatro reactivos
Cristal violeta (colorante primario) (1 min) imparte su color a todos los microorganismos.
Lugol (mordente) (1 min) aumenta la unin entre el colorante y el sustrato, formando un
complejo cristal violeta yodo ribonucleato de magnesio.
Alcohol-acetona (decolorante) (gotas) G(-) disuelve los lpidos de la pared celular, lo que
facilita la salida y contrae lo que determina la retencin del colorante primario. G(+) el
peptidoglucano se deshidrata y contrae lo que determina la retencin del colorante primario.
Safranina (colorante de contraste) (1 min) imparte el color slo a las bacterias que durante la
decoloracin perdieron al colorante primario.
Las bacterias que retienen el colorante primario G(+) morado
Las bacterias que retienen el colorante de contraste G(-) rojo

Gram variable
Durante las primeras 8 h de crecimiento se comportan como G(+) y posteriormente se tornan
como G(-).
Ventajas: Sencillez, duracin breve, proporciona informacin til (sensibilidad a agentes
qumicos).
12 Tincin de Ziehl-Neelsen (BAAR)

Se aplica especialmente para la diferenciacin de bacterias de los gneros Mycobacterium y

Nocardia (resistentes a la decoloracin alcohol cido)
Esta caracterstica se debe a que su pared celular tiene:
Contenido de lpidos superior a 60% representado por las ceras A,B,C y D.
Polisacridos como glucanas, mananas, arabinogalactanas y arabinomananas.
Glicolpidos.
La pared celular de Mycobacterium sp se comporta de manera hidrofbica debido a que
presenta tres capas fibrosas: la externa es una especie de pequea cpsula difusa con
estructuras fibrilares que tienen como componentes ms importantes a los micsidos-C y
ceras D, con propiedad hidrofbica; la intermedia es una cpsula fibrosa compuesta
principalmente por cidos miclicos y arabinogalactana; la interna pertenece propiamente a
la pared celular bacteriana que se encuentra dividida en dos subcapas compuestas por los
lipopolisacridos y el complejo mucopptido-arabino-galactana.
Para teir a estos microorganismos es necesario emplear agentes que intensifiquen y faciliten
la penetracin del colorante primario. Los colorantes ms apropiados para estas tinciones son
los colorantes bsicos como la fucsina, rosanalina. La fucsina bsica se une a los cidos
miclicos de la pared celular; la mezcla de sustancias polares y no polares, como la anilina y
el fenol, intensifican la unin del colorante a la pared celular, y el calentamiento facilita la
penetracin del mismo debido a que suaviza las ceras, y la decoloracin se realiza en fro.
Fucsina fenificada (colorante primario) alcohol-HCl (decolorante) azul de metileno (colorante
de contraste).
13 Tinciones selectivas o especficas

Prctica 6. Tcnicas de cultivo de bacterias

Bacterias
Escherichi
a coli

Morfo
loga
Bacil
o

Agrupaci
n

Req. Oxgeno.

Enfermedades

Anaerobia
facultativa

Diarrea del
viajero
Insuficiencia
renal
Muerte

Anaerobio
facultativo

Conjuntivitis
Queratitis
Endocarditis
Patgeno
oportunista en
las personas
inmunocompet
entes (VIH)
peritonitis
Otitis externa

Serratia
marcesce
ns

Bacil
o

Micrococc
us luteus

Coco

Tetrada
No
formador
de
espora

Aerobia
Obligada

Pseudomo
nas
aeruginos
a

Bacil
o

Empaliza
do
Corto

Aerobio
estricto

Staphyloc
occus
aureus

Coco

Racimos

Anaerobia
facultativa

Escherichia coli

Serratia marcescens

Microccocus luteus

Pseudomonas aureginosa

Sndrome de
piel escaldada

Esquema

Staphylococcus aureus

Prcticas 6 Cultivos de Hongos y Actinomicetos

Microorganismo

Tipo

Streptomyces
griseus

Actinomicet
o

TGram

Incubacin
de
28C
3-7
das

Filamentoso

YPDM

Streptomyces
erythraeus
TGram

Cuadrante
radial
Actinomicet
o
Incubacin
de
28C
3-7
das
YPDM
Cuadrante
radial

Saccharomyces
cerevisiae
TSimple

Levadura
Incubacin
de
28C
2-5
das
Sabouraud
Cuadrante
radial

Rhodotorula sp

Levadura

TSimple

Incubacin
de 28C 57 das
Cuadrante
radial

Filamentoso

Penicillium sp
Fresco
Impronta

Filamentos
a
Incubacin
de
28C
5-7
das

Microconidios
Unicelular
Conidiforos
Vesculas
Esterigmas o filides

Sabouraud

Aspergillus niger

Siembra
central
Filamentos
a
Incubacin
de
28C
5-7
das

Conidios
Conidiforos
Vesculas
Esterigmas o filides

Sabouraud
Siembra
central
Rhizopus sp

Filamentos
a

Esporangiosporas
Esporangio

Incubacin
de
28C
5-7
das
Sabouraud
Siembra
central
Alternaria sp

Filamentos
a
Incubacin
de
28C
5-7
das
Sabouraud
Siembra
central

Dictioconidias
Conidios
multicelulares

Fusarium sp

Filamentos
a
Incubacin
de
28C
5-7
das

Macroconidios
Conidiforos
Vesculas
Esterigmas o filides

Sabouraud
Siembra
central

Geotrichum sp

Filamentos
a
Incubacin
de
28C
5-7
das
Sabouraud
Siembra
central

Artroconidios