LP BIOTEHNOLOGIE

ACIZI NUCLEICI
Acizii nucleici sunt formai din catene polinucleotidice realizate
prin stabilirea de legturi covalente ntre nucleotide.
Prin hidroliza acizilor nucleici n mediu acid se formeaz:
-

baze azotate:
o baze purinice (adenina, guanina);
o baze pirimidinice (uracil, timin, citozin);

ADN conine timin, ARN conine uracil;

pentoze:
o se gsesc sub form ciclic, -furanozic;
o ADN conine D2-deoxiriboz, iar ARN conine D2-riboz;

acid fosforic.

Nucleozidele sunt compui care rezult prin stabilirea unor

legturi N-glicozidice ntre gruparea semiacetalic a pentozei i atomul
de azot din poziia 9 al unei baze purinice sau din poziia 1 al unei baze
pirimidinice.
Nucleotidele sunt esteri fosforici ai nucleozidelor la gruparea
hidroxil de la atomul de carbon din poziia 5' sau 3' din pentoz. Acizii
nucleici conin nucleozid-5-fosfai.

Structura deoxinucleotidelor
Acizii nucleici:
- sunt polinucleotide realizate prin stabilirea de legturi covalente ntre
nucleotide

- gruparea 5'-OH a unui nucleotid va interaciona cu gruparea 3'OH

din

nucleotidul

urmtor

pentru

stabili

legtur

fosfodiesteric ntre cele dou nucleotide;

- toate legturile internucleotidice au aceeai orientare de-a lungul
unui lan polinucleotidic, astfel c fiecare caten are o anumit
polaritate;
- n ADN cele dou lanuri polinucleotidice sunt antiparalele, adic unul
evolueaz n direcia 5'3', iar cellalt evolueaz n direcia 3'5'.
n mod convenional, monomerii din secvena ADN sau ARN sunt
reprezentai prin literele A, T, G, C, U. Structura unei catene este scris
ntotdeauna n direcia 5' 3' (captul 5' la care gruparea OH de la C5'
este liber i captul 3' la care gruparea OH de la C3' nu este
angajat ntr-o legtur internucleotidic).
ELECTROFOREZA ADN
-

moleculele de ADN la pH fiziologic sunt ncrcate negativ datorit

gruprilor fosfat
- vor migra ctre polul pozitiv la aplicarea unui cmp electric;
- densitatea de sarcin este uniform de-a lungul secvenei astfel
c

cazul

fragmentelor

liniare

migrarea

va

fi

invers

proporional cu mrimea acestor fragmente.

Dintre factorii care influeneaz viteza de migrare a ADN n gel
menionm:
- mrimea moleculei de ADN
- moleculele de ADN bicatenare migreaz n gel cu o rat invers
proporional cu log10 al numrului de perechi de baze (pb);
- concentraia agarozei
- un fragment linear de ADN de o anumit mrime are viteze
diferite de migrare n geluri de concentraie diferit;
- conformaia ADN
- n gel se pot observa mai multe forme fizice ale vectorului
caracterizate de valori viteze de migrare diferite:
2

- forma super rsucit - migreaz foarte repede;

- forma relaxat - migreaz foarte lent;
- forma linear migreaz intermediar ntre cele dou de
mai sus i d informaii asupra masei moleculare reale a
vectorului de interes;
- prezena bromurii de etidiu n gel
- bromura de etidiu este o substan fluorescent ce conine un
grup triciclic planar care se intercaleaz ntre bazele din ADN;
- dup inserare, bromura de etidiu se va orienta perpendicular pe
axa helixului i va stabili legturi van der Waals cu perechile de
baze de deasupra i de dedesubtul planului;
-

aceast

lucru

va

duce

la

creterea

fluorescenei

comparativ cu o soluie de bromur de etidiu liber;

- intercalarea bromurii de etidiu duce la scderea sarcinii
negative totale a ADN i deci a vitezei de migrare n gel;
- limita de detecie este de cca. 10 ng ADN;
- substan cu proprieti mutagene i cancerigene;
- se pot folosi i ali colorani, mai puin toxici, dar mai costisitori
- colorantul SYBR Green I de la Invitrogen;
- voltajul
-

viteza

de

migrare

moleculelor

de

ADN

este

direct

proporional cu voltajul aplicat

La prepararea gelului i pentru migrarea probelor pot fi utilizate
mai multe tipuri de soluii tampon:
-

TAE (Tris-Acetat-EDTA);

TBE (Tris-Borat-EDTA);
TEHNICA PCR

Prin tehnica PCR (polymerase chain reaction, reacia n lan a

polimerazei) se pot amplifica in vitro regiuni specifice dintr-o secven
de ADN. Delimitarea secvenelor amplificate se face cu ajutorul a dou
3

secvene oligonucleotidice sintetice denumite primeri, care se vor

ataa la secvenele complementare din molecula de ADN template i
vor iniia procesul de amplificare de ctre ADN polimeraz n prezena
celor

patru

deoxinucleotidtrifosfai

(dNTP)

dATPdeoxiadenozin

trifosfat, dTTPtimidin trifsofat, dGTPdeoxiguanozin trifosfat, dCTP

deoxicitozin trifosfat.
Secvenele de ADN sintetizate n cursul unei reacii de PCR se
numesc ampliconi.
Teoretic, n fiecare ciclu de PCR are loc dublarea cantitii de
secven int (amplicon). Deoarece ambele catene de ADN sunt
copiate, are loc o amplificare exponenial a numrului de copii de
ADN.
Fiecare etap este optimizat n funcie de ADN template i n
funcie de perechea de primeri care se folosete pentru amplificare.
A. Denaturarea ADN se face la 94C timp de 15 secunde 2 minute. n aceast etap are loc separarea celor dou catene de ADN
prin

ruperea

leg[turilor

de

hidrogen

dintre

bayele

ayotate

complementare.
B.

Hibridizarea

(annealing-ul)

primerilor

cu

secvenele

complementare de ADN monocatenar prin stabilirea legturilor de

hidrogen ntre bazele azotate.

Aceast etap are loc la temperaturi

cuprinse ntre 40-60C, timp de 15-60 secunde.

C. Sinteza ADN se face sub aciunea ADN polimerazei la 72C timp
de 1-2 minute, n funcie de mrimea secvenei care se va amplifica i
n funcie de viteza de polimerizare a enzimei utilizate.
n general, pentru amplificarea unei secvene de ADN se utilizeaz
25-30 de cicluri PCR. nainte de iniierea programului de 25-30 cicluri
de PCR se face o denaturare a ADN template timp de 2-10 minute. La
finalul programului de PCR este indicat s se adauge o etap de 5-7
minute la 72C pentru ca ADN polimeraza s finalizeze sinteza
catenelor de ADN incomplet sintetizate.
4

FACTORI CARE INFLUENTEAZA REACTIA DE PCR

Dintre

factorii

care

influeneaz

desfurarea

reaciei

PCR

enumerm:
1. Secvenele primeri
Primerii sunt secvene oligonucleotidice sintetice care se ataeaz
la secvenele complementare din molecula de ADN template i iniiaz
procesul de amplificare sub aciunea ADN polimerazei n prezena celor
patru tipuri de dNTP-uri.
Primerii trebuie s ndeplineasc anumite condiii:

trebuie s fie constituii, n general, din 18-25 nucleotide;

s conin un procent de 50-60% G i C

ntre temperaturile de topire (melting) ale celor doi primeri nu

trebuie sa fie o diferen mai mare de 5C;

temperatura de annealing se calculeaz astfel nct s fie mai

mic cu 5C sub temperaturile de melting ale celor doi primeri.

se evit complementaritatea primerilor deoarece apar dimeri i

apar diverse artefacte ca produi de PCR

eventualele structuri palindromice se vor plasa n interiorul

primerilor i n nici un caz la capetele acestora

la capete este bine ca primerii s conin nucleotidele G i C;

concentraia optim a secvenelor primer pentru reacia de PCR

este de 0,1-0,5 M.
2. ADN polimeraza i concentraia utilizat
n reacia PCR se utilizeaz polimeraze termostabile. Polimerazele

termostabile pot fi mprite n dou clase:

a) polimeraze cu activitate autocorectoare (proofreading) 3'-5' (Pfu
polimeraza). Aceste polimeraze au activitate 3'-5' exonucleazic i pot
s elimine nucleotidele greit ncorporate ntr-o caten ADN n curs de

sintez. Produii de PCR rezultai n urma amplificrii cu polimeraze cu

activitate autocorectoare au capete drepte.
b)

polimeraze

care

nu

au

activitate

autocorectoare

(Taq

polimearaza). Aceste polimeraze prezint avantajul c randamentul

reaciei PCR este mai mare dect n cazul utilizrii unei polimeraze cu
proofreading.
TEHNICI CROMATOGRAFICE UTILIZATE PENTRU SEPARAREA SI
PURIFICAREA PROTEINELOR
Cromatografia pe coloan permite separarea proteinelor n funcie
de proprietile acestora care vor determina partiia proteinelor ntre
faza

mobil

(un

tampon)

faza

staionar

solid

(beads-uri

cromatografice mpachetate ntr-o coloan cilindric de obicei). Proba

care conine proteina de interes se aplic pe o coloan care asigur
reinerea selectiv a proteinei de interes. Dup aplicarea probei pe
coloan aceasta este splat cu un tampon pentru a nltura materialul
nelegat. n urmtoarea etap, compoziia fazei mobile se schimb
pentru a promova desorbia proteinelor care au fost reinute pe
coloana cromatografic.
Fraciile eluate se colecteaz n tuburi care vor fi apoi testate
pentru a le identifica pe cele care conin proteina de interes. Fraciile
care conin proteina de interes sunt reunite i utilizate n etapa
urmtoare de purificare.
A. Cromatografia de afinitate
Cromatografia de afinitate utilizeaz un ligand specific care este
ataat covalent la matrixul cromatografic.
Tehnica IMAC (Immobilized-metal affinity chromatography) care a
fost prima oar utilizat pentru purificarea proteinelor n 1975 utiliznd
ca ligand chelator acidul iminodiacetic (IDA). IDA a fost ncrcat cu ioni
divaleni cum ar fi Zn2+, Cu2+. IDA prezint trei situsuri de chelatare a
ionilor divaleni i nu stabilete legturi puternice cu acetia, ceea ce a
6

dus la un randament sczut al purificrii i contaminarea proteinelor

purificate.
Acidul nitrilotriacetic (NTA), de la QIAGEN, este un chelator
tetradentat produs de Hoffmann-La Roche care nu prezint aceste
probleme. NTA ocup 4 din cele 6 situsuri de legare a ligandului din
sfera de coordinaie a ionului de Ni2+, lsnd dou situsuri libere pentru
interacia cu proteinele de fuziune cu (His) 6-tag. NTA realizeaz legturi
mult mai puternice cu ionii divaleni dect celelalte rezine chelatoare
i reine aceti ioni n condiii variate. Rezinele cu NTA permit
purificarea proteinelor care sunt n cantitate de mai puin de 1% din
totalul proteinelor cu o puritate de 95% ntr-o singur etap.

Figura 56 Structura complexului cu NTA

B.Cromatografia de schimb ionic
Rezinele pentru cromatografia de schimb ionic conin grupri
ncrcate cu sarcin electric care au caracter acid (n cazul n care
rezina este un schimbtor de cationi) sau bazic (n cazul schimbatorilor
de anioni). Schimbtorii de ioni pot fi clasificai n schimbtori de anioni
sau cationi slabi sau puternici n funcie de afinitatea de legare.

De obicei, proba este ncrcat pe coloan n condiii de trie

ionic mic i eluia se face utiliznd un tampon cu trie ionic mare.
O protein se va lega la o rezin schimbtoare de cationi dac pHul tamponului de lucru este mai mic dect punctul izoelectric (pI) al
proteinei i se va lega de un schimbtor de anioni dac pH-ul este mai
mare dect pI. De aceea, cunoaterea pI al unei proteine este necesar
pentru stabilirea unui protocol de purificare.
Legarea proteinelor de schimbtorii de ioni se face prin interacii
ionice necovalente. Srurile pot competiiona pentru situsurile de
legare cu proteinele.
Trebuie menionat faptul c dup purificarea proteinei pe un
schimbtor de ioni de obicei soluia va avea o concentraie mare de
sare. Inainte de a trece la pasul urmtor de purificare soluia care
conine proteina de interes trebuie dializat.
C. Cromatografia hidrofob
Dintre cei douzeci de aminoacizi care intr n constituia
proteinelor,

opt

aminoacizi

au

caracter

hidrofob.

Majoritatea

proteinelor sunt pliate n aa fel nct majoritatea aminoacizilor

hidrofobi sunt orientai spre interiorul moleculei i au un contact minim
cu mediul exterior hidrofil. Totui, exist aminoacizi hidrofobi care se
gsesc la suprafaa proteinelor.
Proteinele prezint diferene de hidrofobicitate de suprafa
datorit numrului i tipului de aminoacizi hidrofobi care sunt expui la
suprafaa lor. Aceti aminoacizi hidrofobi tind s se aglomereze n
clustere la suprafaa proteinelor.
Cromatografia hidrofob se bazeaz pe interacia dintre proteine
i anumite grupri hidrofobe ataate covalent la un matrix solid.
Majoritatea rezinelor utilizate sunt geluri de agaroz la care au fost
ataate covalent grupri hidrofobe (de ex. octil- sau fenil-sefaroza).
D. Gelfiltrarea

Gelfiltrarea permite separarea proteinelor pe baza diferenei de

mas molecular. Matrixul coloanelor de gel filtrare este format din
beadsuri pe suprafaa crora exist pori de diferite dimensiuni.
Moleculele cu dimensiuni mai mici dect porii vor fi eluate ntr-un timp
mult mai mare comparativ cu cele de dimensiuni mari. Este o metod
blnd, care se bazez pe proprietile fizice ale moleculelor de
separat i nu presupune existena unor interacii chimice ntre prob i
matrixul coloanei. Rezoluia depinde direct proporional de lungimea
coloanei i de viteza cu care se face aplicarea tamponului pe coloan.
Gelfiltrarea poate fi folosit i pentru ndeprtarea srurilor din prob.