Isolamento e purificao de bioprodutos

1 Introduo
Neste captulo sero descritas e analisadas algumas das principais operaes unitrias
tpicas usadas no isolamento e purificao Downstream de bioprodutos e realizadas aps
a descarga do fermentador ou biorreactor. A diversidade e crescente importncia
apresentada pelos produtos biotecnolgicos incentivaram o desenvolvimento de vrios
processos e estratgias de purificao. Uma dessas estratgias baseia-se na introduo de
modificaes genticas em novos microrganismos produtores com o objectivo de aumentar
ou facilitar a purificao especfica, em particular de protenas, integrando estratgias de
biossntese e purificao no desenvolvimento de novos bioprocessos.
A natureza dos produtos da indstria biotecnolgica, designados por bioprodutos,
bem como sua localizao na clula produtora so muito diversificados (ex: cidos
orgnicos, antibiticos, polissacardeos, hormonas, aminocidos, peptdeos e protenas,
entre muitos outros). Como resultado dessa diversidade, no h processos de isolamento e
purificao de aplicao geral pois exigem comprovao experimental prvia.
O processo de isolamento e purificao de um dado bioproduto pode ser dividido em
quatro etapas principais:
- Separao de clulas e/ou fragmentos celulares do meio de cultivo (clarificao);
- Concentrao e/ou purificao de baixa resoluo, a qual compreende a separao do
bioproduto alvo, por exemplo uma protena, em relao a molculas com caractersticas
fsico-qumicas significativamente diferentes (gua, ies, pigmentos, cidos nucleicos,
polissacardeos, lpidos, etc);
- Purificao de alta resoluo, a qual compreende a separao de classes de biomolculas
com caractersticas fsico-qumicas muito semelhantes ao bioproduto alvo,
- Finalmente, operaes para acondicionamento final do bioproduto que permitem a sua
estabilidade durante meses ou anos.
Para alm destas operaes tpicas, no caso de produtos intracelulares ou associados
s clulas, necessrio efectuar a rotura ou permeabilizao celular, processo que
efectuado sobre um concentrado de clulas, tambm designado por pasta celular, obtido

aps a separao ou clarificao do meio de cultivo.

A efectivao de cada etapa no necessariamente compreende a aplicao de uma
nica operao unitria individual. Por exemplo, aps uma precipitao especfica de
impurezas, por adio de um sal, necessria uma dilise para ajuste da fora inica a
valores adequados a uma purificao do bioproduto alvo, por exemplo, usando uma
cromatografia de troca inica. Por outro lado, h bioprodutos (ex: cidos orgnicos, enzimas
industriais, etc) cuja aplicao no requer elevado grau de pureza, de modo que operaes
cromatogrficas no so necessrias. Todavia, a reduo do nmero de etapas de fundamental
importncia na viabilidade do processo industrial. Este facto facilmente compreensvel, por
exemplo, se a cada operao unitria o rendimento em produto for de 90%, a aplicao de nove
operaes levar a um rendimento final de cerca de apenas 40%.
Na Tabela.1 so descritas algumas operaes unitrias viveis em escala industrial.
Tabela 1 Operaes unitrias viveis em escala de produo industrial.

Etapa do processo

Operaes unitrias

Clarificao

Filtrao convencional;
floculao

centrifugao;

filtrao

tangencial;

Rotura celular

Homogeneizao de alta presso; moagem em moinho de bolas;

rotura celular por processos qumico ou enzimtico

Isolamento e purificao
de baixa resoluo

Precipitao; ultrafiltrao; extraco em sistemas de duas

fases liquidas imiscveis

Purificao de alta resoluo

Cromatografia de troca inica; de afinidade (biolgica ou qumica);

hidrofbica; de fase reversa; filtrao gel ou excluso molecular
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Tratamento final

Cristalizao; liofilizao; secagem

A definio das operaes unitrias de um processo de isolamento e purificao de

um dado bioproduto depende do uso final da biomolcula alvo, das suas caractersticas
fsico-qumicas, bem como a natureza e importncia das eventuais impurezas presentes na
formulao do bioproduto final. Produtos destinados a usos teraputicos e analticos so,
obviamente, os que requerem maior nvel de pureza e, portanto, a complexidade do
processo de purificao elevada. A principal consequncia desta complexidade o custo

do processo de purificao em relao ao custo final do produto, o qual pode chegar a

80%.1

2. Processos de separao slido-liquido

A separao das clulas de um meio de fermentao esgotado ou de uma suspenso
celular, mais ou menos concentrada, frequentemente a primeira operao unitria do
processo de isolamento e purificao de um dado bioproduto. O meio resultante, praticante
isento de clulas, denominado clarificado ou filtrado consequncia respectivamente de
uma centrifugao ou filtrao. Sero descritas aqui algumas operaes unitrias de
clarificao viveis em escala industrial: filtrao convencional, filtrao tangencial e
centrifugao. A Figura 1 apresenta a faixa de dimenso das clulas microbianas a serem
removidas e a respectiva operao unitria mais adequada.

Figura 1 - Classificao de operaes unitrias de clarificao em funo das dimenses de clulas

microbianas.

2 1 Filtrao
A filtrao convencional aplica-se clarificao de grandes volumes de suspenses
celulares, em geral, previamente diludas, da ordem de milhares de litros, contendo
bioprodutos extracelulares e situaes nas quais condies de asspsia no so
absolutamente necessrias.2
Na operao de filtrao da suspenso celular, sob presso, direccionada
perpendicularmente a um meio filtrante. A fraco volumtrica que atravessa o meio
filtrante denominada filtrado, e da contnua deposio das clulas sobre o meio filtrante,
resulta a formao de um bolo de filtrao.
O processo de filtrao descrito pela lei de Darcy, a qual correlaciona o fluxo de

filtrao (F) da fase lquida expresso, em geral, em litros por m2 de rea e por hora,
(tambm designado por outros autores como velocidade do lquido- m/h) que permeia ou
atravessa o meio filtrante de acordo com a diferena de presso aplicada (equao 1):
F = K.P / (.l)

(1)

onde: F = fluxo de filtrao da fase liquida (l /m2.s)

K = permeabilidade do leito (m2)
P = diferena de presso atravs do leito (N/m2)
l = espessura do leito (m)
= viscosidade do lquido (kg/m.s)
l / K = resistncia filtrao (1/m)
O fluxo de filtrao da fase lquida que permeia ou atravessa o meio filtrante pode ser
determinado experimentalmente no laboratrio ou num prottipo escala piloto de acordo
com a equao 2.
F = dV / (A.dt) (2)
onde: A = rea de filtrao (m2)
V = volume de filtrado (L)
t = tempo de filtrao (s)
As resistncias da operao de filtrao (l / K) so definidas como a soma das
resistncias do meio filtrante (Rm) e do bolo de filtrao (Rc) de acordo com a equao 3.
l / K = Rm +Rc

(3)

A resistncia do bolo de filtrao, Rc depende da concentrao de clulas na

suspenso, X (g/L), do volume filtrado at um certo instante, V, da rea de filtrao, A, e da
resistncia especfica do bolo de filtrao, (m/g), de acordo com a equao 4.
Rc = X V / A

(4)

Para os bolos de filtrao compressveis formado por miclio, de alguns fungos e

leveduras, a resistncia especfica varia com a presso de acordo com a equao 5:
= (P)s

(5)

onde: = constante relacionada ao tamanho e forma das clulas,

S= compressibilidade do bolo de filtrao (adimensional que varia de 0 a 1).
A compressibilidade S pode ser determinada atravs de ensaios de filtrao em escala
de laboratrio, com base na determinao de valores da constante em funo da presso.

A combinao das equaes 1 a 5 resulta na equao 6, que representa o tempo

necessrio filtrao (t) de um volume V de suspenso contendo clulas sujeitas
compressibilidade, sob uma determinada diferena de presso constante atravs de uma
rea fixa A e quando Rm desprezvel em relao a Rc.
t = X V / (2 P(1-s) A2)

(6)

Bolos de filtrao rgidos apresentam S igual a zero e, portanto, exigem tempos de

filtrao significativamente menores em relao aos bolos de filtrao contendo fungos e
algumas leveduras ou bactrias na forma de miclio muito compressveis, para as quais o
valor de S pode facilmente chegar a 0,8. Adjuvantes de filtrao, normalmente terra
diatomcea, podem ser adicionados aos meios de fermentao compostos por suspenses
celulares deste tipo, mais ou menos diludas, e/ou depositados na forma de uma fina
camada sobre o meio filtrante. A adsoro das clulas e, em particular miclio, sobre essas
partculas de adjuvante resulta na reduo da compressibilidade do bolo de filtrao, bem
como evita a penetrao de clulas ou seus fragmentos celulares no meio filtrante, com
consequente entupimento do filtro.
O equipamento mais frequentemente utilizado na clarificao deste tipo de
suspenses celulares o filtro rotativo a vcuo, FRV, apresentado na Figura 2. Consiste
num tambor oco e rotativo (1 rpm) coberto com uma malha metlica filtrante, a qual, por
sua vez, coberta com uma camada de 5 a 20 cm de terra diatomcea e, neste ltimo caso,
corresponde aproximadamente a uma carga de adjuvante de cerca 20 Kg/m2. O tambor fica
parcialmente submerso em um recipiente que contm a suspenso diluda e, em geral,
previamente tratada com adjuvante de filtrao antes de ser filtrada, a qual suavemente
agitada para evitar sedimentao das clulas e do adjuvante de filtrao. Esta suspenso
celular previamente tratada alimentada continuamente para dentro do recipiente
submergindo a mesma rea externa do tambor e a reduzida presso no interior do mesmo
promove a suco do miclio adsorvido no adjuvante de filtrao contra o meio filtrante e,
logo, a filtrao. Verifica-se na Figura 2 que o FRV dividido em zonas de imerso, de
lavagem, de secagem e de remoo contnua de uma fina camada de poucos milmetros do
bolo de filtrao, que constitui vantagem deste tipo de filtro sobre os demais.
Estes filtros podem funcionar durante vrias horas (16 a 18 horas) mas antes de
esgotar a camada de adjuvante de filtrao depositada em cima do meio filtrante. Antes de

iniciar uma nova etapa de filtrao o FRV tem de ser lavado e revestido com nova camada
de adjuvante de filtrao que pode levar algumas horas (ex: 6 a 8 horas). Estes tempos de
funcionamento e preparao do filtro tm de ser considerados quando se pretende escolher
o FVR mais adequado para um dado bioprocesso.

Figura 2 Filtro rotativo a vcuo com adjuvante de filtrao.

Com esse objectivo conveniente comear por definir o caudal operacional (Qop) do
batch a filtrar, isto , volume a filtrar (Vfilt) pelo tempo disponvel de filtrao (Tdisp)
antes de chegar a este sector da fbrica um novo batch a filtrar.
Qop = Vfilt / Tdisp
Assim, a rea do FRV pode ser estimada a partir do Qop e se se tiver determinado
num prottipo escala laboratorial ou piloto o fluxo de filtrao (F) que atravessa o bolo de
filtrao com as mesmas caractersticas e submetido mesma diferena de presso.
A = Qop / F
No caso de se pretender escolher um equipamento de srie de algum fabricante
credenciado neste tipo de aplicaes o FRV pode ser escolhido no catlogo do fabricante
com uma rea superior ao estimado aps um sobredimensionamento de 20%.
No caso do miclio no ser muito compressvel nas condies de funcionamento

optimizadas na escala laboratorial e piloto ento, neste caso, usa-se outro tipo de FRV com
uma tela filtrante aderente ao meio de filtrante do tambor pois no necessrio o uso de
adjuvante de filtrao. Neste caso, aps a aderncia do miclio tela filtrante por suco, o
miclio lavado na zona de lavagem e, posteriormente, parcialmente seco (30 a 50%) na
zona de secagem. Por ltimo, este tipo de miclio removido continuamente da tela
filtrante por simples aco da gravidade quando a tela filtrante d uma volta de cerca de
180 antes de ser de novo encaminhada ao recipiente contendo a suspenso celular a filtrar
(Figura 3).

Figura 3 FRV com tela filtrante.

2.2 Centrifugao
Clulas em suspenso em um meio lquido sofrem sedimentao por aco da fora
da gravidade, processo denominado sedimentao cujo tempo depende principalmente do
tamanho das clulas, da diferena de densidade em relao ao meio lquido, da
concentrao celular e, tambm da viscosidade da suspenso celular.
A centrifugao compreende a acelerao dessa sedimentao, por aco de um
campo gravitacional centrfugo.

Suspenses celulares, de bactrias e leveduras, com dimenses muito pequenas para

serem separadas eficientemente no FRV ou no podem ser tratadas facilmente com
adjuvantes de filtrao (por exemplo, quando o bioproduto intracelular) ou exigirem
condies de assepsia (por exemplo, quando se trabalha com microrganismos patognicos)
ento, nestes casos, as clulas podem ser clarificadas ou separadas do meio de fermentao
atravs da centrifugao.
Da centrifugao resultam sempre novas suspenses celulares mais concentradas (ex:
at 120 a 250 g peso seco/l) em relao original (ex: 2 a 100 g peso seco/l), tambm
designada por pasta celular. Esta pasta celular mesmo muito concentrada est em grande
contraste com o bolo de filtrao onde as clulas esto parcialmente secas, apesar de
estarem relativamente hmidas (20 a 50%), o que constitui vantagem desta ltima operao
unitria em relao centrifugao.
A centrifugao destas clulas baseia-se na diferena de densidade entre a clula (c)
e o meio lquido (), na viscosidade do meio lquido (), na fora motriz [dada pelo produto
entre o quadrado da rotao angular (w - rad/s) e a distncia radial desde o centro da
centrfuga at a clula (r) sedimentada no extremidade, em geral, cnica da centrifuga] e no
dimetro da partcula, d, de acordo com a equao 7, onde vc, representa a velocidade de
sedimentao da clula no campo centrifugo.2
vc = d (c - ) w2 r / (18 )

(7)

A razo entre a fora motriz, w2 r, e a acelerao padro da gravidade, g, representa

um mltiplo desta ltima e dada pela equao 8. Fc representa, portanto, o incremento da
fora da aco da gravidade na sedimentao forada em um campo centrfugo.
Fc= w2 r / g

(8)

O valor da varivel Fc deve ser mencionado na caracterizao de uma centrifugao,

juntamente com o tempo adoptado para se obter um determinado grau de clarificao. Por
exemplo, para a centrifugao de leveduras, valores da ordem de 3.000g e alguns minutos
so suficientes para obter sedimentao completa das clulas.
Na clarificao de suspenses microbianas, comum a utilizao de centrfugas
tubulares e centrfugas de discos (Fig. 4). As primeiras podem operar sob refrigerao e
com valores de Fc bastante elevados, da ordem de 13.000 a 17.000g, embora a sua
capacidade seja limitada a algumas dezenas de litros na extremidade cnica de

sedimentao da centrfuga e o modo de operao seja descontnuo. As centrfugas de

discos, embora operem sob valores menores de Fc, de 5.000 a 15.000g, permitem
processamento contnuo at 200 m3/h. A incluso dos discos aumenta a rea de
sedimentao, reduzindo o tempo em relao a uma centrfuga sem discos.

Figura 4- Dois tipos bsicos de centrfugas. Centrfuga de discos (a) centrfuga tubular (b).
Devido natureza descontnua e contnua do modo de operao das centrfugas
consideradas, a tubular aplica-se a suspenses celulares com o mximo 30 g/l de clulas
enquanto a centrfuga de discos usa-se para suspenses celulares mais concentradas e maior
volume a processar. Valores de concentrao celular at 100 g/l resultam de cultivos em
alta concentrao celular ou de operaes prvias de floculao das clulas pelo uso de
floculantes para agregar as clulas bacterianas mais pequenas (ex: Escherichia coli)
aumentando o tamanho e/ou densidade destas novas partculas celulares.
Estes floculantes tiram partido do facto de as clulas microbianas serem
caracterizadas por uma carga global negativa na sua superfcie.
Um critrio qualitativo simples pode ser utilizado no projecto da operao de
centrifugao em escala industrial. Baseia-se na manuteno do valor do produto entre Fc
(equao 8) e o tempo (t).2
Para operar a centrfuga industrial com a mesma eficincia obtida a nvel laboratorial
ou escala piloto procura-se manter o mesmo valor constante de Fc . t . Por exemplo, se
3.000g durante cinco minutos so suficientes para a obteno de um sedimento compacto e

um sobrenadante de turbidez aceitvel, 1.500g durante dez minutos, na centrfuga

industrial, devero resultar um sobrenadante e um sedimento de mesmas caractersticas em
relao quele obtido em laboratrio ou escala piloto.
A clarificao de suspenses de leveduras por centrifugao eficientemente
realizada enquanto para bactrias a reduzida dimenso das partculas exige valores de Fc
significativamente maiores e, portanto, quando possvel o uso de agentes floculantes ou
recomenda-se uma comparao com a microfiltrao quanto a desempenho e custo.
As centrfugas tubulares podem funcionar durante algum tempo at atingir a
capacidade mxima de volume de clulas sedimentadas no seu interior. Nesta altura a
centrfuga tem de parar para ser removido sedimento celular e isto pode levar algum tempo
diminuindo a produtividade do equipamento antes de este voltar a estar em condies
operacionais.
Assim, para escolher o modelo para um dado bioprocesso necessrio saber o
volume das clulas microbianas produzidas e existente no final da fermentao (Vclulas) e a
capacidade volumtrica na centrfuga tubular de modo a calcular o nmero de
sedimentaes necessrias.
De acordo com o tempo disponvel (tdisp) at recepcionar outro lote (batch) neste
sector da fbrica e tendo em conta o tempo de centrifugao (tcent) para atingir a capacidade
mxima e o tempo de descarga (tdesc) do sedimento ser ento possvel estimar o nmero de
centrifugaes a processar neste perodo.
N ciclos centrifugao = tdisp / (tcent + tdesc)
Ento a capacidade da centrifuga tubular a operar eficientemente num dado
bioprocesso seria de:
Capacidade centrfuga tubular = Vclulas / N ciclos centrifugao
No caso de se ter um volume de fermentao ou uma concentrao celular muito
elevada ento temos um grande volume de clulas para sedimentar, neste caso, o melhor
escolher uma centrfuga de discos que opera com descarga contnua ou descargas
intermitentes na forma de uma pasta celular mais concentrada do que a suspenso celular
original.
Na escolha do modelo mais adequado da centrfuga de discos de um dado fabricante
com experincia de fabrico deste equipamento e j validado em aplicaes semelhantes tem

de saber-se o caudal operacional exigido pelo bioprocesso.

O caudal operacional (Qop) calculado pela razo do volume a processar por batch
(Vferm) e o tempo disponvel (tdisp) para processar o lote ou batch de fermentao. Este
tempo disponvel o tempo real de centrifugao eficiente descontando o tempo para
atingir o estado estacionrio de funcionamento, isto , atingir a fora g correcta e aps
terminada a centrifugao lavar e limpar os discos e rectificar se est tudo bem antes de
novo funcionamento (em projecto pode considerar-se cerca de 6 a 8 horas).
Qop = Vferm / tdisp
Com base nos caudais nominais definidas pelo fabricante para aplicaes
semelhantes ento escolhe-se o modelo de centrfuga com um caudal nominal cerca do
dobro do caudal operacional definido anteriormente.
2.3 Microfiltrao de filtrao tangencial
Microfiltrao de filtrao tangencial (Figura 5) o termo empregado para definir os
processos de microfiltrao nos quais o fluido de alimentao escoa tangencialmente
superfcie do meio filtrante em oposio filtrao perpendicular, por exemplo, que ocorre
no FRV. Nesses processos a tenso de torque do fluido minimiza a acumulao de clulas e
seus fragmentos na superfcie da membrana.1,3,4,5

Figura 5. Esquema de uma filtrao tangencial.

O desempenho de uma filtrao tangencial , em geral, caracterizado por duas

variveis: fluxo de filtrado e coeficiente de reteno de slidos em suspenso ou solutos. O

fluxo de filtrado (J) em microfiltrao varia de 50 a 100 l/h.m2 e definido pela equao 9:
J = Qfil / A

(9)

onde: Qfil = Caudal operacional de filtrado (L/h)

A = rea da membrana (m2)
A determinao do coeficiente de reteno (R) de solutos ou slidos R dada pela equao
10.
R = 1 Cf / Cr

(10)

onde: Cf = concentrao de solutos ou slidos no filtrado

Cr = concentrao de solutos ou slidos no concentrado ou retentado.
O fluxo de filtrado e o coeficiente de reteno de solutos ou slidos so influenciados pelos
fenmenos de concentrao de polarizao (formao de um gradiente de concentrao de
clulas ou solutos prximos superfcie da membrana) e fouling (bloqueio ou
estreitamento dos poros da membrana resultante da deposio de solutos ou slidos no
interior do meio filtrante). O fenmeno de concentrao de polarizao reversvel com
uma simples alterao das condies de operao do processo, como por exemplo o
aumento da velocidade tangencial, da presso ou a variao do pH. No caso do fouling,
estas alteraes no processo no podem resolver o problema e, por isso, para recuperar o
fluxo tem de se proceder a lavagens com diferentes agentes alcalinos ou detergentes, gua
quente, e backwashing, isto , fluxo de gua e outros agentes de limpeza no sentido
contrrio ao convencional da operao de filtrao.1. Os efeitos da concentrao de
polarizao e do fouling podem ser minimizados, quando se conduz a filtrao a uma
velocidade de escoamento da suspenso (ve) da ordem de 0,2 a 0,5 m/s para mdulos de
membrana placas e quadros, de 2 a 5 m/s para filtros tubulares e a uma presso
transmembranar (PTM) na faixa de 100 a 500kPa.1,4,6,7,8,9 A velocidade de escoamento da
suspenso, ve, e a presso transmembranar so definidas pelas equaes 11 e 12.
ve = Qa /At

(11)

onde: Qa = Caudal de alimentao do meio (m3/h)

At = A rea da seco transversal do canal de escoamento da suspenso (m2)
PTM = (Pa + Pr) / 2 - Pf
onde: Pa = presso de alimentao (N/m2)

(12)

Pr = presso no retentado (N/m2)

Pf = presso do filtrado (N/m2)
Os fenmenos de fouling e concentrao de polarizao aumentam a resistncia
passagem da fase liquida e, logo, diminuem fluxo de filtrado atravs da membrana
representada pela equao 13.
J = PTM / ( (Rm +Rcp +Rf)) (13)
onde: = viscosidade do fluido de alimentao
Rm = resistncia da membrana
Rcp = resistncia devido concentrao de polarizao
Rf = resistncia devido ao fouling
Uma grande variedade de membranas e equipamentos para filtrao tangencial est
disponvel no mercado. A escolha da membrana e do filtro mais adequado vai depender do
material a ser filtrado e do processo global de purificao.3 As membranas de microfiltrao
so fabricadas, em geral, na forma de tubos constitudos por fibras ocas ou tubos paralelos
concntricos (Fig. 6) ou de placas e quadros (Fig. 7). Os filtros com membranas do tipo
fibras ocas, assim como os do tipo placa e quadro, possuem uma elevada rea filtrante por
unidade de volume do filtro, porm so bastante susceptveis a entupimentos nos canais de
escoamento da suspenso celular. Os filtros com membranas de tubos paralelos
concntricos, possuem pequena rea filtrante por unidade de volume, porm podem ser
operados em regime turbulento e so de limpeza fcil.

Figura 6. Filtro tubular dotado de vrias fibras ocas.

Figura 7. Filtro tipo placa e quadro.

As variveis de um processo de filtrao so as mesmas em qualquer escala.
Portanto, a partir de estudos realizados em laboratrio, obtm-se a velocidade tangencial de
alimentao, a presso transmembranar e a capacidade de filtrao (J). Aps definidas essas
condies de trabalho, poder ser feita a ampliao de escala em funo do volume a ser
processado. O processo de filtrao tangencial pode ser conduzido utilizando-se um ou
mais filtros. No caso de ser utilizado somente um filtro, necessrio instalar um sistema de
recirculao quando se desejar um retentado mais concentrado. Para os sistemas
constitudos por mais de um filtro, o sistema pode ser configurado em srie ou em paralelo
sem essa recirculao.
Os diferentes mdulos de microfiltrao funcionam durante algum tempo em estado
transiente mas rapidamente se forma a camada de concentrao de polarizao e fouling
e, ento, atinge-se um fluxo de filtrao mais ou menos constante (50 a 100 l/m2. h) de
acordo com o tipo de condies operacionais, em particular, de diferena transmembranar,
caudal de alimentao, viscosidade da suspenso celular, distribuio do tamanho das
clulas e fragmentos celulares, presena de agentes tensioactivos como antiespumas, leos,
etc.
Aps finalizada a separao das clulas ou a concentrao da suspenso celular tem
de proceder-se a um perodo (em falta de tempos reais e em projecto admitir cerca 6 a 8 h)
de lavagem e regenerao das membranas com solues de hidrxido de sdio, detergentes,
gua quente, e backwashing no final do qual se faz um teste de fluxo de filtrao com
gua para avaliar a eficincia da membrana antes de poder voltar a operar novo batch de
meio de fermentao.
Na escolha de uma unidade de microfiltrao para separao das clulas de bactrias

e leveduras ou esterilizao de meios de cultura usam-se membranas com 0,2 a 0,45 m de

dimetro mdio de poro. Para escolher o nmero de filtros necessrios de acordo com o
fabricante com provas dadas neste tipo de aplicaes e com equipamento de srie precisa-se
de saber qual o caudal operacional (Qop) a processar, isto , saber o volume a processar
(Vproc) e o tempo real de microfiltrao (tmicrofilt) disponvel para processar o batch.
Qop = Vproc / tmicrofilt
Se dividir este valor pelo fluxo de filtrado da microfiltrao (J) obtido
experimentalmente em escala laboratorial ou piloto podemos ento estimar a rea de
filtrao:
A = Qop / J
Se no se souber qual o fluxo de filtrado obtido na microfiltrao pode admitir-se um
valor mnimo de 50 l/m2.h e ter, assim, uma primeira estimativa do valor da rea do mdulo
de microfiltrao. Com este valor, em geral, sobredimensionado cerca de 20%, pode-se
ento estimar o nmero de filtros de um dado fabricante a funcionar em srie ou em
paralelo que constituem o sistema de microfiltrao de acordo com os prossupostos
anteriores.
3 Rotura das clulas
A libertao dos produtos intracelulares, biossintetizados e acumulados no interior
das clulas microbianas, requer a rotura ou permeabilizao das clulas com recurso a
operaes conduzidas sobre o concentrado obtido aps a clarificao.3,10,11,12 A rotura ou
permeabilizao celular para a recuperao de produtos intracelulares termolbeis ou
sujeitos a aco de proteases deve ser conduzido rapidamente e a baixas temperaturas.
H diferentes estruturas de paredes celulares (Fig. 8). As clulas animais possuem
membranas frgeis e fceis de serem rompidas enquanto as bactrias, leveduras e outras
formas de fungos possuem paredes rgidas e que exigem elevadas tenses de corte para o
conseguir.10

Figura 8. Diferentes estruturas de paredes celulares de microrganismos.

Os mtodos de rotura ou permeabilizao celular podem ser classificados como:
mecnicos (homogeneizador de alta presso, moinho de bolas, sonicao ou ultrassons),
no mecnicos (choque osmtico, congelamento e descongelamento, secagem); qumicos
(com agentes alcalinos, solventes, detergentes e cidos) e enzimticos (lise enzimtica ou
inibio da sntese da parede celular).11
Para se definir o processo de rotura ou permeabilizao celular a ser utilizado, alguns
factores so levados em considerao, como: rendimento, especificidade, necessidade de
controlo de temperatura, custo da operao unitria e capital a investir.10,11
3.1 Mtodos enzimticos
Mtodos enzimticos de rotura celular so adequados para a recuperao de

biomolculas sensveis tenso de corte ou presso de trabalho geradas pelos mtodos

mecnicos. H enzimas especficas que so capazes de hidrolisar paredes celulares de
clulas microbianas. Quando uma certa poro de parede extracelular fragilizada
(permeabilizada) ou removida, a presso osmtica interna rompe a membrana
citoplasmtica, permitindo que o contedo intracelular seja liberado para o meio externo.
As paredes celulares de leveduras so muito diferentes das bactrias e, portanto, os sistemas
enzimticos para a lise celular so especficos para cada grupo particular de microrganismo.
As paredes celulares de leveduras possuem duas camadas principais (Fig. 8), sendo
uma camada externa que compreende o complexo protena-manano e uma camada mais
interna de glucano. O sistema enzimtico para a rotura celular de leveduras composto,
portanto, de diferentes enzimas como glucanases, proteases e mananases. Estas enzimas
atuam sinergeticamente na lise da parede celular, mas somente duas delas so essenciais
para a rotura completa da clula: uma protease para degradar a camada externa de protenamanana e uma glucanase para degradar a camada interna de glucano.
A composio das paredes celulares das bactrias varia com o facto de elas serem
gram-positivas ou gram-negativas. Nas bactrias gram-positivas os peptidioglicanos esto
em maior proporo na parede e esto associados com cido teicico e polissacardeos. As
bactrias gram-negativas tm uma parede celular de dupla camada, composta por
peptidioglicano, protenas, fosfolipdeos, lipoprotenas e lipopolissacardeos. As principais
enzimas bacteriolticas so: glucosidases, acetilmuramilalanina amidases, endopeptidases e
proteases.
Algumas vantagens desse tipo de rotura celular so: facilidade no controlo do pH e
temperatura, baixo investimento de capital e alta especificidade para degradao da parede
celular. As principais desvantagens so: o elevado custo das enzimas e a variao da
eficincia da lise enzimtica com o estado fisiolgico do microrganismo.1,3,5,8,10
3.2 Mtodos mecnicos
Embora existam muitos exemplos especficos de rotura celular por processos
qumicos e enzimticos, so os mtodos mecnicos que tm sido mais utilizados
industrialmente. O tamanho e a forma das clulas, assim como a estrutura da parede celular,

so factores determinantes para a definio do tipo de processo a ser utilizado para a rotura
celular por processos mecnicos. De entre os equipamentos que podem ser utilizados
industrialmente, destacam-se o homogeneizador de alta presso e o moinho de bolas.3,12
Os homogeneizadores so, basicamente, constitudos de pistes projectados para
aplicar altas presses suspenso celular, forando sua passagem atravs de um orifcio
estreito seguida de coliso contra uma superfcie em uma cmara de baixa presso (Fig. 9).
A queda instantnea de presso associada ao impacto, provoca uma eficiente rotura celular
sem danificar protenas. Nesse tipo de rotura mecnica as clulas maiores rompem-se mais
facilmente, assim como presses mais elevadas aumentam a eficincia da rotura celular.
Presses de 5.000 a 20.000 psi e velocidades de alimentao na faixa de 180 a 280 m/s
(caudal de alimentao a dividir pela seco recta do tubo de acesso cmara de
homogenizao) so comumente utilizadas para a rotura celular (Fig. 9). O processo
conduzido a presses elevadas proporciona altos rendimentos de recuperao, usando
somente uma etapa do processo. No entanto, rotura celular em mltiplas etapas de
homogeneizao podem ser utilizados para aumentar o rendimento do processo.8,10 Do
mesmo modo, um melhor controlo da temperatura por arrefecimento prvio da suspenso
celular d melhor resultados antes de voltar a proceder a nova etapa de homogenizao.

Figura 9. Homogenizador de alta presso utilizado na rotura de clulas.

Vrios factores operacionais afectam o desempenho de um homogeneizador de alta
presso: presso de operao, temperatura, fase de crescimento do microrganismo,
condies de cultivo, tipo de clula e concentrao celular.3,12 Um modelo matemtico de
primeira ordem permite descrever a libertao da protena intracelular a partir de uma

clula cuja concentrao mxima intracelular equivalente [Protm] obtm-se no final com a
libertao total.
d[Prot]/dt= k (P) n
Da sua integrao para n passagens da suspenso celular no homogenizador resulta a
equao 14, que representa a variao da eficincia desse processo de rotura celular em
funo do nmero de passagens (n) atravs da vlvula do homogeneizador e da presso
(P), fixadas as condies de operao como temperatura e tipo de clula.13
log ([Protm]/ ([Protm] [Prot])) = k (P) n

(14)

onde: [Protm,] = concentrao mxima de protena disponvel para ser liberada (g/l)
[Prot] = concentrao de protena liberada (g/l)
k = constante de rotura celular que depende da temperatura, da concentrao e do tipo
de clula (min-1)
= constante que funo do tipo de clula e das condies de crescimento (varia de
0,86 a 2,9)3,12
Na ampliao de escala do processo de rotura celular em homogeneizador de alta
presso, alguns parmetros devem permanecer constantes como: velocidade de
alimentao, presso e temperatura de operao, nmero de passagens atravs da vlvula do
homogeneizador, viscosidade e concentrao celular da alimentao.
Para escolher o homogenizador de alta presso a usar na rotura celular industrial
deve-se ento ter em conta o caudal operacional (Qop) a processar, isto , volume da
suspenso celular e o tempo disponvel para processar cada batch. Neste caso tem de se
ter em conta que no caso de mltiplas etapas de homogeneizao (n) para alm do tempo
efectivo de homogeneizao (thomog) tem de se considerar o tempo necessrio para proceder
ao arrefecimento (tarref) da suspenso celular antes de efectuar nova etapa e aps terminada
a homogeneizao o equipamento deve ser limpo (tlimpeza) como seja uma operao rpida
com gua quente e alguma soluo alcalina.
tdisp = n . (thomog + tarref) + tlimpeza
A escolha do modelo de homogenizador de alta presso de um dado fabricante com
provas dadas neste tipo de aplicaes, nas mesmas condies de presso e temperatura,
pode ser efectuado com base no caudal nominal do fabricante em relao ao caudal
operacional sobredimensionado cerca de 20%.

4. Processos de concentrao de bioprodutos

4.1 Precipitao
O processo mais simples na concentrao de bioprodutos seria usar processos de
desidratao como evaporao contudo para alm do gasto de energia associado a esta
operao, ela tambm incompatvel com muitos bioprodutos termolbeis. Assim, a
precipitao de bioprodutos em meios aquosos um dos mtodos tradicionais de
concentrao deste tipo de bioprodutos.
A precipitao no apresenta elevada capacidade de separao de bioprodutos com
propriedades fsico-qumicas muito semelhantes como sejam diferentes protenas, razo
pela qual considerado um mtodo baixo ou moderado em termos de poder de purificao.
A precipitao de um dado bioproduto depende essencialmente da sua solubilidade
como sejam: concentrao e pI do bioproduto e impurezas, fora inica, temperatura, tipo e
natureza dos ies, presena ou adio de solventes ou co- solventes, entre outras variveis.
Do mesmo modo tambm esta varivel (solubilidade) que permite o passo reversvel de
redissoluo de um dado bioproduto entretanto precipitado. Nestas duas etapas sequenciais
obtm-se a eliminao de algumas impurezas que no precipitam ou no redissolvem com o
bioproduto alvo e, por outro lado, procura-se simultaneamente no passo de redissoluo
concentrar tambm o bioproduto alvo em relao soluo original.
Por exemplo, a solubilizao de protenas precipitadas pode ser dimensionada de
modo a promover a reduo do volume inicial e, portanto, levar ao aumento da
concentrao. Em funo desta possibilidade, a precipitao/redissoluo pode anteceder
processos de elevada resoluo, como a cromatografia.
O aumento de escala desta operao de precipitao depende ento do volume a
processar e da solubilidade do bioproduto alvo nas condies experimentais optimizadas
escala laboratorial ou piloto e, do modo como ser possvel remover o precipitado (ex:
centrifugao ou filtrao) e efectuar de seguida a sua redissoluo. Contudo, os
rendimentos de precipitao e redissoluo de qualquer bioproduto devem ser elevados (>
90%) de modo a no afectar gravemente o rendimento global do bioprocesso.
A precipitao de protenas resulta normalmente numa modificao da sua estrutura

tridimensional. Trata-se, portanto, de mtodo agressivo para essas molculas, pois sua
funo bioqumica depende da estrutura. A aplicao desse mtodo somente vivel,
portanto, quando a adequada conformao da protena recuperada no passo de
redissoluo.
A precipitao de protenas em altas concentraes salinas d-se o nome de saltingout. A adio de sais a concentraes de 1,5 a 3,0 M reduz a disponibilidade de gua,
devido a hidratao dos novos ies adicionados e dissolvidos na soluo de precipitao.
Em consequncia, reduz-se a disponibilidade de molculas de gua que circundam as zonas
hidrfobas da superfcie da protena, criando-se condies para a agregao e consequente
precipitao, a qual ocorre principalmente por interaco entre as zonas hidrfobas de
diferentes molculas de protena. Estas interaces entre as protenas conduzem formao
de agregados proteicos cuja dimenso pode ser facilmente separada da soluo de
precipitao por centrifugao ou filtrao.
Uma descrio quantitativa clssica do salting-out dada pelo modelo de Cohn 14
(equao 15), no qual o parmetro uma constante que representa a solubilidade da
protena em um sistema com fora inica zero, e funo do tipo da protena, pH e
temperatura, com valor mnimo no ponto isoeltrico. O parmetro Ks chamado constante
de salting-out e funo do tipo de agente de precipitao e da protena, sendo
independente do valor do pH e da temperatura.
Log S = - Ks I

(15)

onde: S = solubilidade da protena (M)

I = fora inica do meio (M)
= constante que representa a solubilidade da protena quando I zero (M)
Ks = constante de salting-out
Misturas de diferentes protenas no obedecem a essa equao, j que a solubilidade
de uma determinada protena reduzida pelas demais molculas estruturalmente
semelhantes e pode inclusive ocorrer ento a co-precipitao, ou seja, a agregao de
diferentes protenas.
Os sais mais adequados so aqueles que apresentam elevada solubilidade, aumentam
a tenso superficial do solvente, resultando menor nvel de hidratao das zonas hidrfobas
e, portanto, aumentam a probabilidade de interaco entre estas zonas. Os sais mais

empregados so: citrato de sdio, sulfato de sdio e sulfato de amnia.

Vrios solventes orgnicos miscveis em gua, particularmente os lcoois e a acetona,
promovem tambm a precipitao de protenas. O principal efeito a reduo da actividade
da gua pela diminuio da constante dielctrica do meio (Fig. 10).

Figura 10 Agregao de protenas por interaces electrostticas entre superfcies com

cargas de sinal oposto em meio aquoso contendo solvente orgnico.
As consequncias da reduo da constante dielctrica do meio de precipitao podem
ser descritas da seguinte forma: imobilizao parcial das molculas de gua atravs da
hidratao do grupo polar do solvente orgnico, com simultneo deslocamento das
molculas de gua das zonas hidroflicas do bioproduto e, consequentemente, reduo da
densidade da camada de hidratao e da parcela de solubilidade conferida por estas zonas.
Ainda, devido reduo da constante dielctrica do meio de precipitao resulta,
assim, uma maior disponibilidade de cargas superficiais da protena (antes neutralizadas por
ies de sinal contrrio em soluo) para interaces electrostticas com outras molculas de
protenas. Finalmente, ocorre atraco electrosttica entre diferentes molculas de protena,
atravs das cargas superficiais de sinal contrrio com formao do precipitado e agregados
proteicos mais fceis de separar da soluo de precipitao. A reduo da constante
dielctrica ou polaridade do meio de precipitao interfere, portanto, na fraco da
solubilidade da protena conferida pelas interaces inicas e hidroflicas com o solvente

aquoso, por exemplo, a gua ou tampo.

O solvente polar afecta a camada de hidratao que se localiza prxima s zonas
hidrfobas da protena e passa a circund-las, devido maior solubilidade destas em meio
de precipitao com solvente. Esse tipo de interaco do solvente com as zonas hidrfobas
internas causa alterao irreversvel da conformao da protena. A reduo da temperatura
at valores da ordem de 0C ou menores, minimiza esse efeito, pois a flexibilidade da
molcula proteica menor, o que reduz a capacidade de penetrao do solvente. Para altas
temperaturas, a molcula proteica possui uma flexibilidade natural e permite o contacto do
solvente polar com os resduos internos hidrfobos da protena, causando desnaturao.
A precipitao da enzima amiloglucosidase produzida por Aspergilius awamori em
cultura submersa, por aco de etanol (60% v/v), promoveu aumento de 67% da actividade
especfica (razo entre a actividade enzimtica Act e a concentrao de protena total
[Prot]), o que significa que houve real purificao da enzima. Recuperao de 100% da
actividade enzimtica foi obtida quando a temperatura foi controlada em 5C.15 Isto
significa que nestas condies experimentais ocorreu a precipitao

total da

amiloglucosidase enquanto uma parte (33%) das impurezas, protenas no enzimticas,

permanecem em soluo nestas condies experimentais.
1,67 = Actespi / Actespo = {Acti/[Proti] / Acto/[Proto]}
Como no houve perda de actividade ento
Acti = Acto
e, logo,
1,67 = [Proto] / [Proti]
isto , reduo de 33% na quantidade de protena no enzimtica.
Uma vantagem significativa do uso de solventes a reduo da densidade do meio
lquido, o que favorece a sedimentao do precipitado, podendo-se eliminar inclusive a
necessidade do uso de uma centrfuga.
Na precipitao por aco de solventes, o parmetro crtico na ampliao de escala
do processo o controlo da transferncia de calor para baixar e manter a temperatura baixa
na soluo de precipitao. Perdas no rendimento e na qualidade final do produto so
frequentemente verificadas. O processo contnuo, em reactores do tipo CSTR ou de fluxo
tipo pisto, pode apresentar vantagens no controlo desses parmetros, resultando um

fraccionamento mais preciso e reduo de perdas por desnaturao.

J na precipitao por "salting-out, as caractersticas do precipitado so o factor
fundamental para a adequada ampliao de escala do processo. Nesse caso, manter
constante a potncia transmitida por unidade de volume durante a agitao e o tempo do
processo, recomendvel. O objectivo no modificar a tenso de corte imposta no
agitador, de modo a obter agregados de precipitados de densidade e tamanho constante.
Factores como a concentrao do agente de precipitao, pH e temperatura do
processo, obviamente so mantidos constantes no aumento de escala do processo.
5 Ultrafiltrao
No caso de protenas e outros bioprodutos afins nem sempre conveniente e possvel
recorrer precipitao como processo de concentrao devido s potenciais alteraes
conformacionais irreversveis da sua estrutura tridimensional ou desactivao no caso de
enzimas. Por isso, a ultrafiltrao (UF) tem sido uma operao muito estudada na
concentrao de protenas, enzimas, anticorpos, hormonas, e outros bioprodutos afins, em
geral, tambm termolbeis.
A ultrafiltrao consiste no transporte de solues atravs de membranas com poros
de dimetros de 0,001 a 0,1 m, sob presso transmembranar de 100 a 500 kPa e fluxo de
filtrado de 10 a 200 l/h.m2, e so usadas para concentrar macromolculas como protenas ou
polissacardeos. Nesse processo, a gua e outras molculas pequenas (menores que os
dimetros dos poros) passam pela membrana enquanto molculas com tamanhos superiores
ao dimetro nominal de separao do poro da membrana (tambm designado cut-off)
ficam retidas no concentrado. Dimetro nominal de separao a melhor forma de
expressar o tamanho do poro de uma membrana de ultrafiltrao. Ele definido como a
massa molecular mnima de uma molcula globular que retida pela membrana.1,3,5,16
Os tamanhos dos poros das membranas de ultrafiltrao no so uniformes e
apresentam uma distribuio normal ao redor do tamanho mdio do poro. A faixa dessa
distribuio varia de acordo com o mtodo de fabricao da membrana e, tambm, entre
fabricantes. Por isto, o cut-off da membrana a ser utilizada deve ser 20% menor que a
massa molecular da protena alvo mas pode atingir os 50%.5

Concentrar protenas por ultrafiltrao tem vrias vantagens, a saber: separar

bioprodutos de caldos fermentados diludos, promover a concentrao de compostos a
baixa temperatura e presso, possibilitar a retirada de sais e outras molculas pequenas e
manter constante o pH do meio.5,16
A ultrafiltrao pode tambm ser aplicada para a purificao de protenas de acordo
com o tamanho das molculas. Apesar de ser um mtodo atractivo de purificao, na
prtica a resoluo ou seja a purificao obtida com esta tcnica baixa. Isso ocorre porque
a distribuio do tamanho dos poros no uniforme, as molculas lineares passam mais
facilmente pela membrana que as globulares e a concentrao de polarizao e o fouling
reduzem o cut-off da membrana.5
O aumento de escala segue os mesmos procedimentos delineados na microfiltrao e
no caso de no se saber o fluxo de filtrao experimental pode assumir, em termos de
projecto, o valor de 25 l/h.m2.
6. Extraco com duas fases lquidas imiscveis
6.1 Extraco com sistemas de duas fases lquidas, uma aquosa e outra de solvente orgnico
A extraco de biomolculas em sistemas de duas fases lquidas imiscveis,
constitudas de uma fase aquosa e outra de um solvente orgnico (ex: metilisobutil cetona
MIK), utilizada em escala industrial h cerca de 60 anos na purificao de antibiticos,
cidos orgnicos e outros bioprodutos afins.2
Esta operao unitria tem, em geral, como principal objectivo a concentrao dos
bioprodutos na fase de solvente orgnico e eliminao de muitas impurezas tambm
extracelulares presentes nos meios de fermentao.
A extraco de um dado bioproduto depende essencialmente da sua solubilidade nas
duas fases imiscveis (orgnica vs aquosa) de acordo com vrios factores principais como
sejam: natureza do solvente orgnico, temperatura, pI, pH do meio aquoso, cargas
superficiais, concentrao do bioproduto, fora inica, presena de agentes complexantes
como tensioactivos ou detergentes, entre outros. Estes ltimos tendem a neutralizar as
cargas dos bioprodutos como molculas complexas e multifuncionais como os antibiticos

permitindo, desse modo, a sua acumulao na fase orgnica.

O aumento de escala desta operao de concentrao resultante da extraco depende
da potncia de agitao necessria para dispersar uma fase imiscvel na outra, da razo
volumtrica das duas fases a processar, do coeficiente de partio (Kpart) do bioproduto alvo
entre as duas fases imiscveis e da eficincia com que se separam as duas fases aps a
extraco por simples sedimentao ou centrifugao.
Kpart = [Bioproduto]org / [Bioproduto]aq
O rendimento da extraco depende muito do diagrama de fases obtido no equilbrio
assim como das condies optimizadas na escala laboratorial e piloto que levaram
maximizao do coeficiente de partio.
6.2 Extraco em sistemas de duas fases lquidas aquosas
No caso de bioprodutos serem protenas, altamente sensveis desnaturao do
solvente orgnico, podem ser purificadas em sistemas constitudos por duas fases aquosas
imiscveis, resultante de uma partio diferenciada da molcula alvo e impurezas entre as
fases lquidas aquosas. O elevado teor de gua, 75 a 80% em massa, garante o
microambiente ideal para a manuteno das propriedades biolgicas das protenas. Em
1956, Albertsson17 props o uso de sistemas de duas fases aquosas para a purificao de
protenas e partculas celulares. Desde ento, este tipo de extraco tem sido aplicada
purificao de produtos obtidos em clulas animais, vegetais e microbianas, na separao
de vrus, organelos e cidos nucleicos.
Nos sistemas de duas fases lquidas aquosas, a molcula alvo e as impurezas so
tambm separadas, como resultado de suas diferentes solubilidades nas duas fases lquidas
aquosas imiscveis. So factores decisivos as propriedades superficiais das protenas, como
carga elctrica e hidrofobicidade, alm da massa molecular. 1,17
Sistemas de duas fases aquosas so formados pela utilizao de determinados
polmeros (ex: dextrano - Dx, polietilenoglicol - PEG) em uma mesma soluo ou ainda,
polmeros (ex: PEG) em combinao com solutos de baixa massa molecular (ex: tampes e
sais). Alguns exemplo de sistemas deste tipo de extraco mais comuns so
polietilenoglicol (PEG)/dextrano (Dx), polipropilenoglicol(PPG)/Dx, sulfato de dextrano de

sdio/PPG; PEG/ fosfato de potssio, PEG/sulfato de magnsio, PEG/citrato de sdio.

Actualmente so muito utilizados os sistemas PEG/sal, por apresentarem rpida
separao das fases, baixo custo e, principalmente, maior selectividade na separao deste
tipo de biomolculas.
O sistema de duas fases aquosas tambm representado em um diagrama de fases, no
qual a ordenada representa a composio em massa da molcula que apresenta maior
concentrao na fase superior (fase de menor densidade) e a abscissa representa a
composio da molcula de maior concentrao na fase inferior (fase de maior densidade).
Composies representadas por pontos acima da curva de equilbrio levam formao de
duas fases e, abaixo da curva, a uma s fase. A formao de um sistema de duas fases
aquosas depende, portanto, da concentrao dos componentes do sistema. A Figura 11
apresenta a curva binodal de um diagrama de fases em um sistema PEG/fosfato.

Figura 11 - Curva binodal de um sistema PEG/fosfato(% m / m).

No equilbrio, o sistema de composio inicial M, passa a apresentar as composies
indicadas pelos pontos T (fase superior) e B (fase inferior), de tal modo que ambos os
componentes do sistema esto presentes nas fases lquidas. A recta TMB chamada linha
de equilbrio (tie-line). Sistemas cuja composio inicial encontra-se sobre uma mesma
linha de equilbrio, possuem a mesma composio final (fases superior e inferior), porm, a
relao de volumes entre as fases diferente para cada composio inicial e, logo, conduz a
rendimentos de extraco diferentes. A razo entre os segmentos TM e BM igual razo
entre os volumes de fase inferior e superior. As diversas linhas de equilbrio existentes so

paralelas entre si.

Quanto maior for a massa molecular do polmero, menor a concentrao necessria
para a formao de duas fases, ou seja, a curva binodal desloca-se no sentido da regio
monofsica. Valores de pH, tipo de sal e temperatura tambm so variveis que influem a
curva binodal.
A literatura apresenta diagramas de fases para diversos sistemas de duas fases
aquosas, principalmente PEG/dextrano e PEG/sal. Porm, como os diagramas so
especficos para cada sistema e condio (pH, temperatura e massa molecular dos
polmeros),

frequentemente

necessrio

determin-lo

ou

comprov-lo

experimentalmente.17
A partio de protenas ou outras biomolculas entre as duas fases aquosas imiscveis
regida pela condio de menor potencial qumico ou maior solubilidade, isto , a
biomolcula apresentar maior concentrao na fase onde seu potencial qumico for menor.
Frequentemente, determina-se o coeficiente de partio, Kpart, para avaliao da eficincia
da extraco (equao 16). Esse coeficiente dado pela relao entre as concentraes de
uma determinada biomolcula nas fases superior e inferior, no equilbrio. Coeficientes de
partio para a molcula de interesse e para as demais molculas, significativamente
distintos, indicam ocorrncia de purificao.
Kpart= Csi / Cii

(16)

onde: Csi = concentrao do soluto i na fase superior

Cii = concentrao do soluto i na fase inferior
Como as biomolculas distribuem-se entre as fases em conformidade com suas
solubilidades, caractersticas fsico-qumicas das protenas (hidrofobicidade e carga
superficial) e da soluo (pH e fora inica), sero determinantes para o valor do K.
Por exemplo, para sistemas formados por fosfatos ou sulfatos, a solubilidade das protenas
significativamente reduzida pelo mecanismo de salting-out, j que concentraes de 0,5
a 2 M so necessrias para o estabelecimento das duas fases. Consequentemente,
deslocamentos da composio do sistema para longe da curva binodal resultam em aumento
do efeito de salting-out e, portanto, reduo da solubilidade das molculas, com
consequncias sobre os valores de Kpart.17
O tipo de polmero e sua massa molecular tambm influem no valor de Kpart. Por

exemplo, em sistemas constitudos por PEG de massa molecular superior a 1.500 Da, a
partio de protenas pode ser favorvel fase salina, devido ao mecanismo da excluso
molecular. A magnitude desse fenmeno directamente proporcional massa molecular
das protenas.1
A clarificao para remoo de clulas e seus fragmentos pode ser executada em um
sistema de duas fases aquosas. Como a centrifugao requer valor elevado de Fc (factor de
centrifugao) para promover a sedimentao de slidos de pequena dimenso, os sistemas
de extraco podem ser vantajosamente aplicados, pois ainda podem reduzir o nmero de
operaes unitrias do processo, j que atravs de uma etapa de extraco pode-se clarificar
o meio e fraccionar protenas. As clulas e seus fragmentos, geralmente localizam-se na
interface do sistema ou na fase lquida inferior.
O equilbrio rapidamente atingido aps a agitao e mistura dos diferentes
componentes para formao de fases. A completa separao das fases em sistemas
PEG/dextrano requer 5 a 30 minutos, dependendo da concentrao e massa molecular do
polmero. Nos sistemas PEG/fosfato esse tempo inferior a 5 minutos. Embora sejam
intervalos de tempo bastante reduzidos, a separao das fases usualmente acelerada
atravs do uso de centrfugas.
A repetida aplicao da extraco em sistemas de duas fases aquosas recurso
vigoroso na purificao de protenas. Na purificao de amiloglucosidase extracelular
produzida por Aspergilius awamori, atravs de uma sequncia de duas extraces em
sistemas PEG/fosfato, a maior parte dos contaminantes foi gradativamente extrada na fase
superior, enquanto a enzima permaneceu na fase salina e foi totalmente recuperada.18 Essa
estratgia particularmente importante na purificao de meios muito complexos, por
exemplo, meios contendo protenas diversas, cidos nucleicos, polissacardeos e pigmentos
oriundos da rotura celular.
Modificaes nos sistemas de duas fases aquosas para a partio de protenas por
afinidade podem aumentar a resoluo na purificao. Normalmente utiliza-se um polmero
ligado a algum componente que tenha afinidade pela protena de interesse. Por exemplo,
sendo a molcula alvo uma enzima, o substrato pode ser acoplado ao polmero.
No aumento de escala, valores idnticos do coeficiente de partio (Kpart) em relao
escala de laboratrio podem ser obtidos, desde que as composies e propores dos

volumes de fases sejam mantidas, alm da promoo de condies adequadas completa

homogeneizao para que o equilbrio entre as fases seja atingido. A purificao em
extractores centrfugos, de volumes de 10.000 1itros de meio contendo insulina produzida
em E. coli, tem sido estudada em empresas como a Genentech Inc.19
So diversas as vantagens apresentadas pelos sistemas de duas fases aquosas para a
purificao de protenas e outras biomolculas afins: possibilidade de operao contnua em
larga escala temperatura ambiente; manuteno das protenas em soluo em fases de
polmeros ou sais que as protegem da desnaturao; possibilidade de eliminao de
algumas etapas do processo de purificao para molculas intracelulares, devido
extraco de clulas e seus fragmentos simultnea ao fraccionamento de protenas e outras
biomolculas.
7 Processos de purificao de bioprodutos
7.1 Cromatografia
Nos processos cromatogrficos, os bioprodutos presentes numa fase lquida so
adsorvidos em um suporte de material poroso. A posterior remoo gradual dos
bioprodutos por aco de uma fase lquida mvel (eluente), resulta na separao das
diferentes molculas (Fig. 12).

Figura 12. Ilustrao de um processo cromatogrfico genrico, onde trA, trB e trC
representam os tempos de reteno das molculas A, B e C.
A configurao fsica geral a de uma fase estacionria (suporte ou matriz slida)

empacotada em uma coluna, atravs da qual a fase mvel circula, em geral, com recurso a
uma bomba pisto ou de seringa que cria presso positiva e empurra o lquido para dentro
da coluna onde contactar com o suporte slido. A fase estacionria constituda por um
suporte polimrico poroso, que se apresenta em partculas esfricas de aproximadamente
100 m, embebidas em um dado solvente, o qual pode constituir a maior parte desta fase
(~90%).
O cromatograma um grfico que representa a concentrao das biomolculas no
eluente que sai da coluna, medida em termos de absorvncia, por exemplo a 280nm ou
valor do ndice de refraco, em funo do tempo ou do volume de eluente que passou pela
coluna. O volume que passa pela coluna at o instante de sada de uma certa biomolcula
(instante este representado por uma curva ou pico no cromatograma) o volume de
reteno, Vr, especfico daquela biomolcula. Alternativamente ao volume de reteno,
utiliza-se o tempo de reteno, tr, e relacionados entre si pelo caudal da fase mvel que
atravessa a coluna (Figuras 12 e 13).

Figura 13 Representao ilustrativa de um cromatograma e variveis tpicas de um processo

cromatogrfico.
Na Figura 13 representam-se algumas grandezas utilizadas na avaliao do
desempenho de processos cromatogrficos. A concentrao das biomolculas A, B e C
determinada mediante a comparao do valor da rea abaixo das respectivas curvas, com os
valores obtidos com uma recta de calibrao obtida com a biomolcula pura.
A eficincia da purificao pode ser avaliada em funo do grau de separao das
biomolculas, o qual denominado resoluo cromatogrfica, Rs. Na separao de duas

molculas, A e B, Rs determinado pelos valores dos tempos de reteno e pela grandeza

Wb (definida na Fig. 12), conforme a equao17:
Rs = (trB - trA) / ((1/2) . (WbA-WbB))

(17)

Para valores de Rs < 1 as biomolculas so incompletamente separadas; valores de Rs

iguais a 1, as curvas tocam-se nas bases (situao das molculas A e B na Fig. 12); e para
valores de Rs > 1 as duas molculas encontram-se totalmente separadas, situao
representada na Figura 12 para as molculas B e C.
A seguir, descrevem-se os processos cromatogrficos industrialmente mais utilizados,
como: a filtrao gel ou tambm designada cromatografia de excluso molecular, baseada
na separao de molculas em funo do seu volume efectivo na fase mvel, e a troca
inica, baseada na adsoro das biomolculas ao adsorvente. Processos como a interao
hidrofbica10 (baseada na adsoro de zonas mais hidrfobas de biomolculas sobre
ligandos hidrofbicos ou alquilicos covalentemente ligados ao suporte cromatogrfico) e a
cromatografia de afinidade20 (baseada em interaces especificas entre determinados
resduos de aminocidos e ligantes associados matriz ou, interaces bioqumicas
especficas) vm ganhando cada vez mais uso e, portanto, tambm devem ser considerados
no desenvolvimento de um processo de purificao de protenas e biomolculas afins.
7.2 Filtrao Gel
As diferentes biomolculas so inicialmente retidas nos poros de uma matriz de
porosidade definida, em funo de seu tamanho ou volume efectivo. Molculas cujo
volume efectivo excede o volume do poro, so expulsas da coluna rapidamente no chamado
volume espacial, Ve, o qual representa o volume de eluente presente nos interstcios da
matriz. Em contrapartida, biomolculas com volume efectivo mais pequeno em relao ao
volume dos poros, penetram nos mesmos e, em seguida, so arrastadas pelo eluente, o qual
uma soluo tampo adequada manuteno da estabilidade da biomolcula alvo. Em
face deste comportamento, a ordem de recuperao selectiva das molculas no fluxo de
eluente tem incio com as maiores biomolculas, prosseguindo em direco s de menor
dimenso resultando na prtica na colecta de fraces de eluente com biomolculas
diferentes volumes efectivos. As diferentes molculas so, portanto, excludas do leito em

funo de seu tamanho ou volume efectivo (Fig. 14)

.
Figura 14 Recta calibrao de protenas numa coluna de filtrao gel
Condies que resultem da excluso da biomolcula de interesse (ex: protena) e
reteno das impurezas (ou vice-versa), so as mais apropriadas. Essas situaes
pressupem diferenas significativas entre o volume efectivo da biomolcula alvo e das
impurezas, o que nem sempre ocorre.
H vrios modelos na literatura que descrevem o mecanismo de separao na
filtrao gel em funo das dimenses dos poros do gel e tamanho da biomolcula alvo.21
As matrizes para filtrao gel de alta resoluo so constitudas de polmeros
vinlicos hidroflicos ou agarose com elevada proporo de ligaes cruzadas, em partculas
de 5 a 50 m. Aumentos de resoluo e redues do tempo de separao so obtidos com o
uso de pequenas partculas.
No desenvolvimento do processo devem ser consideradas as seguintes variveis: pH e
eluente compatveis com o produto, seleco do gel com base na sua porosidade e
compatibilidade com o pH a ser adoptado.
7.3 Cromatografia de troca inica
A cromatografia de troca inica das mais frequentemente utilizadas, pois as resinas

empregadas apresentam elevada capacidade de adsoro de biomolculas (ex: protenas).

Este um processo de separao baseado na interaco que zonas de uma
biomolcula tm com os stios inicos de carga oposta na matriz slida. A fase estacionria,
ionicamente carregada, tem a capacidade de reter solutos que esto na fase mvel e
apresentam cargas de sinais opostos. Para ocorrer a adsoro dos ies da fase mvel na
estacionria, controlam-se factores como pH e fora inica.10 De acordo com o grupo
inico ligado covalentemente matriz slida, os suportes ou adsorventes inicos so
classificados em aninicos e catinicos. Os suportes aninicos trocam anies e apresentam,
portanto, grupos inicos positivos ligados matriz enquanto os suportes catinicos,
inversamente, trocam caties e apresentam grupos inicos negativos ligados matriz.1
Aps serem adsorvidos matriz, os bioprodutos podem ser subsequentemente eludos por
deslocamento competitivo com outros ies, com a mesma carga da protena adsorvida,
porm com maior fora de interaco com a fase slida estacionria. Os diferentes graus de
interaco electrosttica entre o suporte e os ies da fase mvel regem esse tipo de
cromatografia.22
Esse mtodo tem uma aplicabilidade muito ampla, pois considera-se que todas as
biomolculas (ex: protenas) so electricamente carregadas quando expostas a um
determinado pH. Mesmo protenas com pontos isoeltricos idnticos podem ser separadas
de uma mistura, pois o stio de anexao da protena matriz de troca inica determinado
pela carga superficial da protena e a sua proximidade de outras cargas e no pela sua carga
global.3 comum encontrar condies de adsoro da protena alvo matriz, enquanto a
maioria das impurezas, com a mesma carga inica global, so eludas.23,24
A matriz de um suporte inico constituda de um material poroso, natural ou
sinttico, inerte, insolvel em gua e em solventes orgnicos, apresentando ligaes
covalentes a grupos funcionais inicos. Quanto natureza dos materiais, os adsorventes so
classificadas em inorgnicos e orgnicos, podendo, estes ltimos, serem naturais ou
sintticos. Em geral as resinas orgnicas so mais eficientes, altamente polimerizadas, com
ligaes cruzadas e amplamente utilizadas.
A capacidade total de um suporte inico medida pela quantidade de molculas
carregadas na fase mvel, que podem ser adsorvidas por unidade de volume ou massa de
adsorvente. Por exemplo, a capacidade ou massa de protena adsorvida depende da

porosidade e do tamanho dos poros da resina. Para uma determinada protena, a capacidade
de adsoro do adsorvente pode ser determinada somente aps ensaios laboratoriais. Poros
maiores tornam os stios carregados mais acessveis que poros menores, pois facilitam a
difuso de protenas no interior dos poros do suporte. Nesse caso, o tamanho do poro
normalmente descrito pelo seu limite de excluso, isto , a maior protena globular (medida
em daltons) que pode ser absorvida pelo poro.10
Os tipos de grupos ligados matriz classificam os suportes inicos em fortes, mdios
e fracos. Os suportes inicos fortes so aqueles que esto completamente ionizados em
grande faixa de pH. Os suportes inicos fracos e mdios so aqueles que dependem do grau
de dissociao do grupo funcional ligado covalente sua estrutura e, logo, a sua capacidade
influenciada pelo valor do pH na fase mvel. Por outro lado, no h diferena se uma
resina de troca inica fraca ou forte em termos de disponibilidade de carga. importante
notar que os termos fraco e forte no se referem interaco de ligao da protena
resina e nem estabilidade da matriz; eles se referem somente extenso da dissociao
dos grupos funcionais na matriz no sentido clssico da qumica cido-base e funo do
valor do pH.10,22
A cromatografia de troca inica processada de forma descontnua em quatro ou
cinco etapas principais (Fig. 15).
No primeiro caso as etapas so: de carga da amostra, eluio do bioproduto e
regenerao seguida de uma etapa de equilbrio da fase slida enquanto, no segundo caso,
h que acrescentar mais uma etapa de lavagem da matriz que antecede a etapa de eluio
para eliminar as impurezas no adsorvidas com utilizao dea mesma soluo usada
previamente na etapa de equilbrio do suporte inico e a eficincia de lavagem pode ser
relacionada com a recuperao da linha de base de absorvncia da fase mvel medida por
um espectrofotmetro sada da coluna.
Na primeira ou duas primeiras etapas (carga e lavagem do adsorvente) a protena alvo
adsorvida e impurezas no adsorvidas so eliminadas da fase slida pela lavagem. Na
etapa de eluio aplica-se um eluente (por exemplo, NaC1 1M) para promover a desoro
da protena da fase slida. Na etapa seguinte consiste na desoro e eliminao de todas as
protenas e outras impurezas que ainda permanecem ligados coluna atravs da
regenerao do adsorvente atravs do uso de agentes alcalinos em solues salinas (ex:

NaOH 0,5 M em NaCl tambm 0,5M). Por ltimo, procede-se etapa de equilbrio pelo
uso de uma soluo tampo de modo a repor o pH e a fora inica que promovem a
mxima adsoro do bioproduto alvo.10

Figura 15. Cromatograma tpico de uma coluna com monitorizao A280nm.

No aumento de escala de um processo cromatogrfico aumenta-se o volume da
coluna. Em geral, o seu comprimento permanece constante, de tal forma que o aumento do
volume do processo implica no aumento do dimetro da coluna. A velocidade superficial
linear da fase mvel (caudal dividido pela rea da seco recta da coluna) deve ser a mesma
nas duas escalas. O grau de resoluo cromatogrfica e o rendimento do processo so
definidos nas colunas em pequena escala. Se todas as outras variveis so mantidas
constantes, o desempenho do processo, em maior escala, dever ser muito prximo quele
obtido escala de laboratrio.10
O aumento de escala pode ento ser estimado de acordo com a massa de
biomolculas alvo a processar (o produto da concentrao da biomolcula alvo pelo volume

a carregar na coluna) em relao capacidade de adsoro do suporte (g biomolcula/ml ou

g de adsorvente) determinado no laboratrio ou escala piloto. Com base na estimativa do
volume de suporte ou adsorvente e fixado a altura da coluna calcula-se o dimetro da
coluna mas no esquecendo que tem de se manter constante a velocidade superficial linear
(vl) optimizado em pequena escala.
Com base no dimetro da coluna e da velocidade superficial linear ento possvel
calcular o caudal operacional que pode atravessar a coluna escala industrial.
Qop = vl D2/ 4
Nos suportes cromatogrficos da Pharmacia base de gis de agarose os volumes
tpicos admitidos coluna nas 5 etapas principais so, em geral:
- O volume de equilbrio corresponde, em geral, 3 a 5 volumes de coluna de modo a
garantir que o adsorvente se encontra nas condies ideais (ex: cargas inicas) para a
adsoro do bioproduto alvo.
- O volume de carga no deve exceder a capacidade de adsoro e, em geral, a nvel
industrial no deve conduzir a um rendimento da etapa de adsoro e lavagem inferior 90 95%.
- O volume de lavagem com a mesma soluo usada na etapa de equilbrio da coluna
corresponde a cerca de 3 a 5 volumes de coluna para eliminar as impurezas no adsorvidas
e recuperar a linha de base de monitorizao da absorvncia da fase mvel.
- O volume de eluio do eluente corresponde tambm a cerca de 3 a 5 volumes da coluna
de modo a fraccionar o bioproduto alvo das outras impurezas que tambm tinham sido
adsorvidas. Convm identificar na colecta a fraco de eluente com maior pureza e
concentrao em bioproduto alvo e, em geral, a nvel industrial tambm convm obter um
rendimento de eluio equivalente a 90 a 95% da quantidade de biomolcula adsorvida.
- O volume de regenerao corresponde tambm entre 2 e 5 volumes de coluna de modo a
garantir que o bioproduto, mas principalmente impurezas, so eliminadas na sua totalidade
da coluna e, desse modo, no afectam negativamente a eficincia da coluna na prxima
etapa de adsoro e eluio do bioproduto alvo.
Com base nestes volumes admitidos coluna e caudais operacionais pode-se ento
estimar os gastos de reagentes e recursos humanos calculando o tempo de ciclo completo
do processo cromatogrfico.

tciclo = tcarga + tlavagem + teluio + tregenerao + tequilibrio

Assim, de acordo com o tempo disponvel para processar um determinado lote ou
batch e o tempo de ciclo completo do processo cromatogrfico ento possvel calcular o
nmero de ciclos possveis efectuar no tempo para processar um batch. No caso de ser
possvel fazer mais do que um ciclo de cromatografia e o bioproduto em soluo est em
condies de elevada estabilidade isto significa que se pode reduzir o volume do adsorvente
e, logo, a coluna estimado anteriormente subdividindo o volume de batch a aplicar pelo
nmero de ciclo. Esta optimizao importante pois permite diminuir o investimento na
coluna cromatogrfica fazendo vrios ciclos no tempo disponvel entre processamento de
dois lotes de produo consecutivos.
8 Tratamento final
O grau de pureza necessrio de um produto biotecnolgico depende de sua aplicao
final. A simples secagem de microrganismos cultivados para produo de protena celular
suficiente para a sua comercializao. Extractos enzimticos impuros, ou parcialmente
purificados, podem ser utilizados como catalisadores em converses qumicas industriais
como, por exemplo, na produo de xarope enriquecidos de frutose utilizando a enzima
glucose isomerase. No entanto, uma purificao praticamente total necessria para grande
parte dos produtos biotecnolgicos, especialmente aqueles de uso farmacutico e analtico.
Neste caso os bioprodutos devem estar puros, secos, cristalinos ou amorfos. Para tanto,
devem ser submetidos a alguns tratamentos finais como a cristalizao ou a liofilizao.2
A liofilizao o processo de remoo de um solvente, tipicamente a gua, de uma
soluo por sublimao. Nesse processo a amostra congelada e, em seguida, submetida a
baixa presso para sublimao da gua livre e os solutos so concentrados na forma slida e
secos. Como resultado as propriedades fsico-qumicas (pH, fora inica, viscosidade,
ponto de congelamento, tenso superficial e interfacial) da fase no congelada alteram-se
significativamente. Os materiais liofilizados so apresentados na forma de p e as
actividades biolgicas mantm-se estveis por muito mais tempo, quando comparada com a
conservao em soluo aquosa. Por esse motivo, muitas protenas comerciais esto
disponveis na forma liofilizada. Porm, se a liofilizao no for adequadamente planeada

pode ocorrer desnaturao da enzima.3,5 Embora seja uma tcnica amplamente empregada
na conservao de muitos materiais, em sua maioria biolgicos, h uma srie de factores
envolvidos na liofilizao, que devem ser manipulados de forma a obter-se um material de
boa qualidade.25
A cristalizao o processo de nucleao e crescimento ou agregao de cristais de
bioprodutos presentes em solues homogneas supersaturadas. uma tcnica vulgarmente
utilizada na fase final dos processos de purificao de antibiticos, cidos orgnicos,
protenas, entre outras biomolculas. A cristalizao de grande importncia em processos
biotecnolgicos, pois permite a armazenagem estvel destes bioprodutos durante meses ou
anos. Na etapa final de purificao de bioprodutos estes devem estar em um grau
relativamente elevado de pureza apesar da cristalizao pode ocorrer em misturas impuras.
Aps a cristalizao, o bioproduto (ex: antibitico) pode ser recuperado por filtrao ou
centrifugao seguido de secagem. Bioprodutos cristalizados so estveis, pois as
molculas esto imobilizadas. No caso da cristalizao de enzimas a partir de solues
proteicas impuras, por exemplo contaminadas por proteases, tm sua actividade preservada
uma vez que a enzima tambm cristaliza.2,24
importante destacar que algumas protenas podem ser desnaturadas com a
cristalizao. Uma alternativa simples precipitar a protena com sulfato de amnio e obter
um precipitado amorfo. Esse procedimento proporcionar a maioria das vantagens da
cristalizao, excepto que no haver garantia da inactivao pelas proteases e, ainda, ser
necessrio remover o sal imediatamente antes da reutilizao da protena.2 Outra opo para
a estabilizao de protenas mant-las em glicerol, sorbitol ou sacarose na concentrao
de aproximadamente 50% e armazenar a -50C. Caso a amostra congele, as protenas sero
protegidas pelos agentes estabilizantes (ex: glicerol, sorbitol, sacarose, etc) dos danos
causados pelos cristais de gelo formados.24
9 Rotinas analticas
A percentagem de recuperao e o grau de purificao da biomolcula alvo devem
ser monitorizados em cada etapa do processo de isolamento e purificao.
Rotinas que levam medio directa de uma certa quantidade de bioproduto (ex:

protena) presente num determinado volume, isto , a sua concentrao, viabilizam a

determinao de balanos de massa e, portanto, as percentagens recuperadas em cada etapa
do processo. No caso de antibiticos, cidos orgnicos, e outros bioprodutos similares a sua
quantificao feita com recursos a processos analticos simples como mtodos
espectrofotomtricos, titulao, cromatografia (ex: HPLC, entre outros). No caso de
bioprodutos como as enzimas a sua quantificao indirecta obtida com relativa facilidade,
quando a biomolcula considerada apresenta actividade biolgica especfica, como por
exemplo, actividade enzimtica ou antignica.
A actividade enzimtica por definio a velocidade inicial da reaco especfica
catalisada pela enzima, determinada em condies padronizadas de pH, temperatura, fora
inica e concentrao do substrato; portanto, condies facilmente reprodutveis. Define-se,
em geral, uma unidade de actividade enzimtica como sendo a quantidade de produto
liberado ou substrato consumido (mol) em um minuto nas condies do ensaio. Dessa
forma, em cada etapa do processo, determina-se a capacidade biolgica da molcula
considerada (unidades de actividade enzimtica) a qual, associada aos volumes envolvidos,
permite determinar a percentagem recuperada quando comparada com a quantidade
disponvel aps a etapa isolamento ou purificao anterior.
O exemplo que segue representa um balano de actividade enzimtica realizado em
um processo de extraco em sistema de duas fases aquosas, muito embora os princpios
adoptados neste exemplo, apliquem-se a qualquer outro mtodo de purificao. frequente
expressar a actividade enzimtica especificamente em relao a um volume, Actinicial (U/L),
conforme se apresenta no exemplo que segue. Na equao 18, Vinicial refere-se ao volume de
meio contendo enzima e impurezas, a ser submetido extraco, e o termo ACTinicial,
representa a actividade enzimtica total contida no meio.
ACTinicial (U) = Actinicial (U / L) x Vinicial (L)

(18)

Aps a extraco, a enzima distribui-se entre os volumes das fases superior, Vfase
superior

e inferior, Vfase inferior em conformidade com sua solubilidade, conforme foi discutido

anteriormente. A actividade enzimtica total, ACT, em cada fase pode ser determinada
pelas equaes 19 e 20.
ACTfase superior (U) = Actfase superior (U / L) x Vfase superior (L)

(19)

ACTfase inferior (U) = Actfase inferior (U / L) x Vfase inferior (L)

(20)

As percentagens recuperadas e extradas em cada fase, atingido o equilbrio, Rfase superior e

Rfase

inferior

podem ser determinadas atravs da equao 21, onde ACTfase representa a

actividade enzimtica na fase considerada.

R(%)=ACTfase / ACTinicial x100

(21)

Eventuais perdas do produto, fsicas ou por desnaturao, so determinadas atravs da

equao 22. Tais perdas, importante frisar, podem ocorrer em qualquer etapa do processo
de purificao de enzimas.
ACTperda = ACTinicial - ACTfase superior - ACTfase inferior

(22)

A purificao refere-se variao da fraco da biomolcula alvo em relao s

outras impurezas, isto , razo da concentrao do bioproduto alvo em relao
concentrao das impurezas. Um aumento dessa fraco significa o enriquecimento do
meio em relao biomolcula alvo.
Quando a biomolcula uma enzima, a pureza em cada etapa pode ser definida como
sendo a razo entre a actividade enzimtica Act (U/ml) e a concentrao de protena total,
[Prot] (mg/ml), razo essa tambm denominada actividade especfica, Actesp (equao 23).
Nesse caso, o grau de pureza, GP, ser dado pela variao do valor de Actesp entre duas
etapas de isolamento ou purificao consecutivas ou reportada em relao ao meio inicial,
conforme se descreve na equao 24:
Actesp (U/mg)= Act / [Prot]

(23)

GP = Actesp i / Actesp o

(24)

onde: Actesp i = actividade especfica em uma certa etapa do processo

Actesp o = actividade especfica no meio inicial
A determinao de concentrao total de protena possvel com recurso a vrios
mtodos analticos, por exemplo, biureto-reagente alcalino de cobre; Lowry-FolinCiocalteau; absoro de raios UV a 280nm (aminocidos aromticos) ou a 205-220nm
(peptdeos); cido bis-cincrnico; Bradford, Biureta, etc. Cada um desses mtodos baseiase em princpios diferentes, razo pela qual os resultados obtidos no so iguais e, portanto,
no devem ser comparados. Alm disso, mesmo que se adopte uma nica metodologia, o
resultado obtido somente expressar a verdadeira concentrao de protenas se a curva de
calibrao for determinada com soluo de protenas de composio idntica soluo
alvo.26 Para minimizar esta situao usa-se uma protena como a Albumina de Soro Bovino

(BSA), como protena padro (standard).

No caso de purificao de protenas, a electroforese rotina comum no
acompanhamento de processos de purificao. Consiste na separao das protenas por
aco de um campo elctrico que fora o movimento das molculas electricamente
carregadas atravs de um gel de poliacrilamida ou agarose. As protenas apresentam
mobilidade em conformidade com sua carga total, massa molecular e intensidade do campo
elctrico. Segue-se a deteco, a qual compreende a colorao das protenas distribudas
sobre o gel, geralmente com o corante Coomassie Brilliant Blue, embora outros corantes
possam ser utilizados. Como resultado, visualiza-se uma sequncia de traos (bandas) azuis
e supe-se que a cada banda corresponda uma protena. A introduo de padres permite
estimar a massa molecular das protenas da amostra, bem como identificar a banda
correspondente protena alvo. O nmero de bandas obtidas est directamente relacionado
pureza da amostra e, portanto, a uma completa purificao corresponde uma nica banda,
relativa biomolcula alvo.27 A anlise electrofortica da Figura 16 representa a evoluo
da concentrao intracelular de uma protena heterloga (troponina C) no cultivo de
Escherichia coli.

Figura 16 Gel de electroforese tpico indicando a evoluo da acumulao da protena

intracelular troponina C (TnC) em Escherichia coli. esquerda do gel esto indicadas as
massas moleculares dos padres (kDa) e abaixo, o tempo de cultivo em horas.
Ao lado das rotinas de monitorizao de um processo de purificao, deve-se
tambm adoptar rotinas destinadas a determinar as principais caractersticas das molculas

presentes no meio a ser purificado. Essa caracterizao do meio dever nortear a seleco
adequada de operaes do processo de purificao.
Um procedimento bsico consiste no fraccionamento das protenas presentes no meio
em um sistema de filtrao gel preparativa, isto , um sistema capaz de processar volumes
da ordem de vrios mililitros. A aplicao de rotinas especficas para a deteco da
molcula alvo nas diversas fraces, associada determinao da concentrao de protena
total em cada fraco, permite determinar a proporo em massa das molculas que
constituem as impurezas.
Impurezas de massa molecular significativamente distintas em relao massa
molecular da molcula alvo, podem ser eliminadas por filtrao gel ou ultrafiltrao. A
massa molecular pode ser estimada de duas formas: atravs de uma curva de calibrao
(Fig 14) com molculas de massas moleculares conhecidas no sistema de filtrao gel
acima mencionado (so variveis desta curva, a massa molecular ou volume efectivo das
molculas e o volume de eluio de cada uma delas); injectando-se no gel de electroforese
molculas de massa molecular conhecida juntamente com as fraces obtidas na filtrao
gel.
Grandes diferenas entre a solubilidade da molcula alvo e impurezas, so um
indicativo de que mtodos como a extraco em sistemas de duas fases aquosas ou
precipitao devem ser explorados. Uma forma simples de avaliar a solubilidade de
protenas submet-las precipitao com (NH4)2SO4. As protenas que exigirem menor
concentrao do sal para precipitarem totalmente, so as de menor solubilidade. Assim,
possvel ordenar as molculas fraccionadas na filtrao gel preparativa de acordo com a sua
ordem de solubilidade.
A cromatografia de troca inica das mais utilizadas, devido ao elevado poder de
resoluo e capacidade de processamento. A opo por esta cromatografia obviamente deve
considerar a capacidade de adsoro das molculas sobre uma determinada resina catinica
ou aninica. Essa capacidade determinada atravs de curvas de titulao electrofortica.
Na curva de titulao electrofortica, determina-se a velocidade de migrao de uma
protena, denominada mobilidade, em um campo elctrico sob determinadas condies
(temperatura, tampo, composio do gel). Trata-se de uma electroforese conduzida em um
gel que apresenta um gradiente de pH formado entre um ctodo e um nodo, estando o

ctodo sob valor de pH maior em relao ao nodo. As protenas, por apresentarem carcter
anfotrico, tero carga positiva sob valores de pH abaixo de seu ponto isoelctrico (pI) e
carga negativa sob valores de pH acima do ponto isoeltrico. Dessa forma, onde quer que
as protenas estejam em relao ao gradiente de pH, elas migraro em direco ao seu ponto
isoeltrico em conformidade com a sua carga. Protenas com mobilidades electroforticas,
isto , distncias percorridas, muito diferentes na regio de valores de pH abaixo do pI
provavelmente sofrero separao eficiente em uma resina trocadora de caties.27
10 O processo integrado de purificao
Conforme mencionou-se anteriormente, as etapas iniciais do processo de purificao
compreendem as operaes unitrias, destinadas remoo de clulas e seus fragmentos
celulares seguidas de operaes de concentrao e purificao da biomolcula alvo. A
determinao das caractersticas do produto e das principais impurezas fundamental no
sucesso da seleco das operaes subsequentes de purificao propriamente dita, uma vez
que o fraccionamento est baseado nas propriedades fsico-qumicas das molculas
envolvidas (Tabela 2).
Tabela 2 Caractersticas relevantes de microrganismos e seus produtos ao processo de
purificao em escala industrial.
Operao unitria
Centrifugao
Filtrao convencional
Microfiltrao
Homogeneizao de alta
presso
Moinho de bolas
Extraco e precipitao
Cromatografia de troca
inica
Ultrafiltrao, filtrao gel

Caractersticas determinantes
Densidade e tamanho das clulas; viscosidade do meio
Compressibilidade e tamanho das clulas
Tamanho das clulas ou partculas
Resistncia fsica da parede celular ao gradiente de
presso
Resistncia fsica da parede celular tenso de corte
Solubilidade de protenas
Mobilidade electrofortica de protenas
Massa molecular

Alguns critrios norteiam a escolha das operaes de clarificao e homogeneizao

de alta presso. Grandes volumes de suspenses de leveduras so eficientemente
clarificados por centrifugao enquanto para volumes moderados de suspenses bacterianas

uma comparao entre a centrifugao e a filtrao tangencial merece ser efectuada.

Microrganismos filamentosos, por outro lado, so clarificados atravs de filtrao
convencional, devido reduzida velocidade de sedimentao destes organismos de baixa
densidade e elevada viscosidade associadoa este tipo de suspenses celulares.
A modificao da estrutura de molculas um recurso importante para o aumento do
poder de resoluo de determinadas operaes de purificao e, consequentemente, reduo
do nmero de etapas envolvidas.28 Por exemplo, a introduo de sequncias terminais
estrutura da protena alvo que a transferiram e acumulem no espao periplsmico e
implementao destas modificaes via engenharia gentica, possibilita a extraco apenas
das molculas do espao periplsmico, o que significa menor contaminao do bioproduto
alvo.
A adsoro em leito expandido tem sido cada vez mais adoptada, pois possibilita a
reduo do nmero de etapas, uma vez que a captura de protenas se d a partir de meios
que contm partculas, procedimento que viabiliza a clarificao de uma suspenso ou de
um homogeneizado de clulas e a purificao da molcula alvo em uma nica operao.
Alm disso, a reduo do tempo de processamento diminui a possibilidade de hidrlise da
molcula alvo por aco de proteases, normalmente presentes quando se trata de produtos
intracelulares.30
A caracterizao prvia do produto e impurezas, descrita anteriormente,
fundamental seleco das operaes de purificao, pois quanto mais reduzido for o
nmero do reduzido nmero destas operaes menor o custo do processo e maior o
rendimento do produto.
Alm da caracterizao das molculas, tambm devem ser consideradas
caractersticas inerentes s operaes. Por exemplo, na filtrao gel ocorre diluio
significativa, isto , a concentrao das molculas nas fraces colectadas menor que a
concentrao na amostra injectada na coluna. Por essa razo, a filtrao gel empregada na
ltima etapa de um processo de purificao, pois ao contrrio, acarretaria aumento do
volume de meio a ser tratado ao longo do processo. No final do processo, pode-se empregar
a ultrafiltrao para ajuste da concentrao. A cromatografia de troca inica, ao contrrio
da filtrao gel, promove o aumento da concentrao das molculas.
Em resumo, pode-se dizer que o sucesso tcnico e econmico do processo de

produo de um bioproduto alvo est relacionado seleco adequada das tcnicas de

isolamento e purificao e da ordem de aplicao das mesmas. As seguintes regras gerais
podem ser consideradas para uma abordagem inicial do problema: escolha de processos de
purificao baseados nas diferenas apresentadas em uma dada propriedade fsico-qumica
das molculas (produto e impurezas); remoo das impurezas presentes em maior
concentrao nas etapas iniciais do processo; aplicao de tcnicas de alta resoluo em
relao ao produto, nas etapas finais do processo.31