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sp.
1. Diagnstico de la situacin actual o lnea base.
La papa (Solanum tuberosum L.) es el cuarto cultivo alimenticio a nivel mundial (L pez et al,
2009) y uno de los cultivos ms representativos de la regin andina, como fuente de
alimentacin y de ingresos econmicos, especialmente para productores de bajos recursos
(Culqui, 2006). La produccin nacional se concentra en las provincias de Carchi, Pichincha,
Cotopaxi, Tungurahua y Chimborazo. Segn el INEC en 2012 Ecuador plant 35556
hectreas de papas, obteniendo un tonelaje final de 284629 (Andes, 2014).
Las enfermedades del suelo se distribuyen en todas las zonas paperas del Ecuador,
especialmente en zonas fras y hmedas, en sectores donde predomina el monocultivo; y se
diseminan a travs de rastrojos, por suelo y aguas contaminadas, implementos agrcolas o
mediante el uso de semilla contaminada. Entre los microorganismos ms comunes propios
del suelo que presentan un efecto patognico en el cultivo de papa estn: los hongos Costra
negra (Rhizoctonia solani), podredumbre seca del tubrculo
(Fusarium solani) (Mora et al,
S.A.) y el tizn tardo (Phytophthora
nativos
sobre P. infestans
Objetivos especficos
4. Mtodos a utilizar.
Obtencin y activacin de microorganismos
Activacin de actinomicetos
Se tomarn las cepas L37, Ch50 y C92 de actinomicetos del laboratorio de Microbiologa
Molecular de la Universidad de Las Fuerzas Armadas - ESPE obtenidos de trabajos
experimentales anteriores.
Los microorganismos se resuspendern en 10 mL de agua peptonada estril al 0.1% (p/v)
por una hora y se agitarn en vrtex. Se colocar una gota directamente en matraces con
glicerol extracto de levadura [YGB, glicerol 5% (p/v), extracto de levadura 2.5 g/L], e
incubarn a 25C durante 10 das, en agitacin constante de 150 rpm. Los medios se
prepararn con agua destilada y se ajustarn con solucin NaOH 0.1N a pH 7.17.2 antes
de ser autoclavados. Se deben realizar cinco repeticiones. Una vez reconstituidos los
actinomicetos, se realizarn pases sucesivos en los mismos medios de cultivo
suplementados con agar (15-20 g/L). E incubar a 25C por 5 das (Franco e
t al, 2009).
Obtencin de fitopatgenos
Phytophthora infestans
El Centro Internacional de la Papa proporcionar la cepa C95. Para la rplica se emplear
el medio papa dextrosa agar (PDA), donde se realizarn cortes de 5 mm2 en el consorcio,
se extraer el implante y se lo sembrar en una nueva caja de PDA y se incubar a 20C
por 5 das (Ochoa & Montoya, 2010).
Despus de 7 das se debe tomar una porcin de micelio areo, el cual ser colocado sobre
medio Agar-centeno. Para mantener la virulencia del patgeno durante su almacenamiento
en medio artificial, se debern hacer subcultivos, transfiriendo el micelio areo del medio de
cultivo hacia un tubrculo y viceversa (Baquero, Brenes, & Gmez, 2006).
Fusarium sp.
24C y un fotoperodo de 12:12. A los 7 das los aislamientos se debern transferir a otras
cajas Petri con PDA para su purificacin.
Pruebas de antagonismo entre actinomicetos
Se realizar una siembra abundante de una cepa actinomicetos con el asa bacteriolgica, a
una distancia de 3 cm del borde. Se proceder a sembrar en el extremo opuesto a 3 cm de
la primera cepa 1 gota de la segunda cepa de actinomicetos, se incubarn a 25C por 10
das.
Se realizar una observacin diaria de la interaccin de los actinomicetos, en donde se
medir con una regla en milmetros, el crecimiento de la segunda cepa frente a los primeros
actinomicetos, modificado de (Garcs, 2014).
Se seleccionarn los grupos de dos cepas que no presenten actividad antagonista entre s.
Co-cultivo de actinomicetos
Fermentacin
Para los grupos seleccionados en la prueba de antagonismo entre actinomicetos:
Para cada cepa, se prepararn 50 mL de medio ISP 1, y se inocularn con 0.5 mL de cultivo
de 24 h de crecimiento. Los frascos sern incubados con agitacin de 120 rpm a 28C
durante 4 das, modificado de (Alam & Singh, 2011). Se realizarn cinco repeticiones.
El caldo fermentado ser transferido a tubos y sern centrifugados a 5000 rpm por 5
minutos El sobrenadante ser tratado como extracto crudo extracelular y ser usado para:
extraccin por solventes, debido a que la naturaleza del metabolito es incierta (Alam &
Singh, 2011).
Solvente
Peso de
caja
Petri
vaca
(g)
Peso de caja
Petri despus
del secado
(g)
Peso del
metabolito
(g)
Cantidad de
agua destilada
usada
(mL)
Concentracin de
metabolito
(g/mL)
Cloroformo
Etil acetato
Metabolito intracelular
Despus de colectar el metabolito extracelular, se resuspender el pellet de clulas en 467
L de buffer TE (Tris 200mM, EDTA 50mM), 30 L de SDS al 10 % y 3 L de Proteinasa K.
Los tubos se incubarn a 37C por 1 hora y sern centrifugados a 10000 rpm por 10
minutos, se colectar el sobrenadante, que corresponde al metabolito intracelular.
Secuencia
F1
(5-AGAGTTTGATCITGGCTCAG-3)
R5
(5-ACGGITACCTTGTTACGACTT-3)
Secuenciacin
La secuenciacin ser llevada a cabo enviando el tubo que contenga los productos de la
PCR a la empresa Macrogen Inc., mediante la secuenciacin a gran escala desarrollada por
Applied Biosystems, concretamente el modelo 3730XL. Servicio que requiere para un
producto de PCR no purificado: concentracin de 10 ng/mL y un volumen mnimo de 20 L.
5. Resultados obtenidos o esperados.
Cultivo puro de actinomicetos
Se seguir un modelo de 3x2, en donde las 3 cepas seleccionadas sern dispuestas a dos
tratamientos, para cada tratamiento se harn 5 repeticiones, con la finalidad de obtener un
nmero de datos muestrales, n= 30. La herramienta estadstica que se utilizar para
almacenar los datos es una tabla de contingencia (doble entrada Tabla 3), y para el anlisis
de los datos se utilizar la prueba de homogeneidad de Chi cuadrado (permite determinar si
dos variables cualitativas estn o no asociadas). El parmetro a medir es el crecimiento
bacteriano a los 10 das despus de la siembra. Adicionalmente se deber establecer un
control para verificar la realizacin adecuada del experimento.
Tabla 3. Tabla de contingencia, Crecimiento de cepas actinomicetos 1,2 y 3 con los
tratamientos 1 y 2 a las 240 horas.
Crecimiento
bacteriano
Cepas
(CFU/mL)
Tratamiento 1
L37
Ch 50
C 92
Tratamiento 2
L37
Ch 50
C 92
Media
L37
Ch 50
C 92
Media
P CIR =
x 100
Identificacin molecular
Los resultados obtenidos de la secuenciacin de los fragmentos correspondientes al gen
ADNr 16S sern analizados con el algoritmo bioinformtico BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool, que por medio de su programa BLASTN, permite comparar una secuencia
nucleotdica desconocida con una base de datos de la misma naturaleza e identificar la
especies.
Estos resultados, poseern el nivel cientfico y experimental necesario para ser publicados
en revistas de alto impacto relacionadas a la Microbiologa aplicada, Fitopatologa,
Biotecnologa y afines. El objetivo final del proyecto de investigacin es la divulgacin
cientfica, base para la consecucin de un bioproducto a partir de los actinomicetos
seleccionados.
6. Referencias bibliogrficas.
Alam, J., & Singh, A. (2011). Extraction and purification of antibacterial metabolites
from Actinomycetes spp. isolated from soil sample. International journal of
Pharmaceutical research and Development (IJPRD), 63-71.
Crawford, D., Lynch, J., Whipps, M., & Ousley, M. (1993). Isolation and
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Dasthi, Y., Grkovic, T., Ramadan, U., Hentschel, U., & Quinn, R. (2014). Production
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Lpez, R., Barandilla, L., Ritter, E., Hasse, U. y Galarreta, J. (2009). Evaluacin del
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programas de mejora gentica. Revista Latinoamericana de la Papa, vol. 15, no. 1,
pp. 55-57. ISSN 1853-4961
Mora, E., Pumisacho, M., Reinoso, I., Aucancela, R. (S.A.) COnozca y maneje las
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Ochoa, C., & Montoya, A. (2010). Consorcios microbianos: una metfora biolgica
aplicada a la asociatividad empresarial en cadenas productivas agropecuarias.
Universidad nacional de Colombia.
Rodrguez, R., Pea, K., Fernndez, E., Almeyda, I., Acosta, E., & Rodrguez, R. A.
(2014). ANTAGONISMO E IDENTIFICACIN GENTICA DE UN ACTINOMICETO
CON POTENCIAL PARA EL BIOCONTROL DE Phythophtora capsici Leonian.
Nuevo Len - Mxico: Facultad de Ciencias Biolgicas