Unitatea Executiv pentru Finanarea nvmntului Superior, a

Cercetrii, Dezvoltrii i Inovrii (UEFISCDI)

Direcia de Finanare a Dezvoltrii i Inovrii
Programul: RESURSE UMANE - Proiecte de cercetare pentru
stimularea constituirii de tinere echipe de cercetare independente
- TE
PROIECT Identificarea de noi variante genetice la pacienii cu
infertilitate masculin utiliznd NGS c metod avansat de
analiz genetic molecular
Cod nregistrare proiect: PN-II-RU-TE-2014-4-0527
Contract nr.: 329 din 01/10/2015
Director de proiect: Asist. Univ. Dr. Florina Raicu
Introducere
Infertilitatea masculin este responsabil de 40-50% din cazurile de
infertilitate a cuplului i reprezint o problema complex de santate cu o
baza genetic i epigenetic substanial. Deoarece nu se cunoate cauza
infertilitii pentru 50-60% dintre cazuri este foarte probabil c factori
genetici nc necunoscui s reprezinte un procent important care s
explice bazele moleculare ale infertilitii masculine idiopatice.
Mecanismele
spermatogenezei
nu
sunt
asociate
strict
numai
cromozomului Y ci i cu mai multe sute de gene poziionate pe autozomi,
care se considerea c sunt implicate n spermatogenez. Cauzele
infertilitii masculine pot fi explicate de existena unui numr mare de
combinaii de factori genetici, incluznd mutaiile mongenice sau
poligenice, i factori de mediu. Recent mai multe studii de asociere
genomic extins au identificat polimorfisme mononucleotidice asociate
(Single nucleotide Polymorphisms - SNPs) unor gene care au prezentat
corelaii semnificative cu parametri reproductivi alterai.
Obiective
Obiectivul major este s mbuntim gradul de cunoatere a bazelor
moleculare ale infertilitii masculine idiopatice prin identificarea
interrelatiilor
dintre
modificrile
aprute
n
genele
candidate
rspunztoare de infertilitate i variantele genetice la nivel genomic.
Metoda de secventiere intit de nou generaie - Targeted Next
Generation Sequencing - i-a demonstrat deplin potenialul imens pentru
testarea panelurilor de gene selectate pentru asocierea cu anumite boli.
Metoda secventierii intite este direcionat ctre un set limitat de gene i
spre deosebire de celelalte dou variante NGS, secventierea exomica i
secventierea ntregului genom, permite obinerea unui grad mare de
acoperire cu secvene citite, crescnd astfel rat de detectare a inseriilor
i deletiilor (indels) i reducnd nevoia de interpretare a variantelor de
secvene genice.
Avnd n vedere evoluia recent a tehnicilor de Secventiere de
Nou Generaie i identificarea unui numr semnificativ de gene asociate
direct cu infertilitatea masculin precum i a unor gene candidate, am

propus dezvoltarea unui protocol de secventiere intit pentru un panel de

228 de gene. Aceast abordarea nu numai c va oferi posibilitatea de a
identifica noi mutaii i SNP-uri, dar va reprezenta o metod important
pentru identificarea de biomarkeri relevani care pot fi utilizai c inte
farmacologice.
Secventierea intit se va realiza cu kit-ul Ion PGM 200 sequencing
cu ajutorul Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM). Identificarea unor
metode de diagnostic i tratament cu accentul pe descoperirea de noi
molecule int reprezint o cerin urgen i va putea s fie atins numai
prin intermediul noilor tehnologii.
Gradul de orginalitate al propunerii este accentuat de absena n
literatur de specialitate a unui studiu asemntor cu cel propus de noi
care s caracterizeze infertilitatea masculin.
Rezultate anticipate
Beneficiul anticipat al acestui studiu este dezvoltarea unei metode
tiinifice care s aduc o contribuie semnificativ la nelegerea
complexitii mecanismelor genetice ale infertilitii masculine.Vom
configura i analiza prin secventierea intit NGS un panel de gene
confirmate i candidate la pacieni cu infertilitatea idiopatica i indivizi
sntoi.
Pentru o analiz amnunit vom avea n vedere i analiz prin
exome sequencing.Se va dezvolt o schem personalizat de analiz a
datelor care s conin algoritmi de filtrare i clasificare bioinformatici,
care s ofere un protocol clar de utilizare.
Aceast abordare va oferi geneticienilor capacitatea s creasc
sensibilitatea clinic a mai multor teste i va avea o contribuie
substanial pentru identificarea de variante i mutaii rare care pot fi
analizate ulterior la scar mare.

Etapa I 2015
Activitate:
Configurarea panelului de ampliconi pentru mbuntirea gradului de
acoperire a genelor int cu ajutorul programului Ion AmpliSeq Designer.
Rezultate:
Designul final al panelului de gene i pregtirea pentru obinerea librriilor
pentru 228 de gene
Avnd n vedere posibilitatea de extindere a panelui de gene n
funcie de noile studii din literatur de specialitate am configurat 2
paneluri cu gene: n primul panel am inclus 90 de gene direct asociate cu
infertilitatea masculin, iar n cel de al doilea panel am inclus 138 de gene
candidate. Panelurile de gene vor avea posibilitatea s testeze ipoteza n
ce privete capacitatea de identificare a unui ct mai numr extins de
mutaii asociate i variante genetice de risc. Panelurile de gene au inclus
gene confirmate i candidate implicate n spermatogenez, meioz,
rspunsului inflamator, stresul oxidativ, biogenez microARN, metilarea

ADN, sistemele de reparare a ADN, glicozilare, biotransformare enzimatic

dar i alte gene care sunt implicate n spermatogenez. Cele 2 paneluri de
gene a fost configurate online, utiliznd programul Ion AmpliSeq Designer
v3.0 conform recomandrilor ghidului Ion Torrent, n seturi de separate de
primeri ce acoper secvenele de codificare exonice i/sau introni i
secvenele UTR pentru cele 228 gene.
Cele dou paneluri de gene sunt acoperite n ntregime de
aproximativ 4000 de ampliconi cu un grad de acoperire de peste 99, 98 %,
dup acoperirea regiunilor cu un grad de acoperire redus. Acoperirea
genele din panel a fost verificat pentru fiecare cromozom n parte cu
ajutorul programului IGV (Integrative Genomics Viewer).