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I.
Introduccin:
Materiales
Tubos 16x160 mm.
Placas de Petri
Pipetas bacteriolgicas de 1 mL
Equipos
Estufa de incubacin regulada entre el rango de 22C a 25 C
(24C 1C).
Medio de cultivo y reactivos
Agar Cloranfenicol- dextrosa- extracto de levadura (cloranfenicol
puede ser reemplazado por oxitetraciclina). - OGY
Solucin de Cloranfenicol u Oxitetraciclina al 0,1%.
Solucin de agua peptonada al 0,1 % o Agua buffer fosfato.
Tincin de Gram o Reactivos para Tincin Simple.
III.
Procedimiento:
1. Prepara la dilucin
Agregar 10 g de muestra en un matraz con 90 mL de agua
peptonada (10-1),
realizar las diluciones (10-2, 10-3) consecutivas.
2. Pipetear por duplicado a placas Petri estriles alcuotas de 1 mL
de la muestra si es producto lquido o 1 mL de la dilucin 10 -1 en
el caso de otros productos.
3. Sembrar por lo menos dos diluciones (10 -2, 10-3) consecutivas por
duplicado.
4. Se recomienda esta serie de diluciones cuando no se conoce el
rango aproximado de microorganismos.
5. Agregar 15 mL de agar fundido y temperado a 47C 2C.
6. El tiempo transcurrido entre la preparacin de la suspensin
inicial y el momento de agregar el agar no debe exceder de los 15
min.
7. Mezclar el inculo con el medio fundido, inclinando y girando las
placas. La forma adecuada de llevar a cabo esta operacin sera
la siguiente:
Mover la placa con movimientos de vaivn 5 veces en una
direccin,
hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj,
mover con movimientos de vaivn en una direccin que
forme ngulo recto con la primera y
C
[ ( 1 xn 1 ) + ( 0,1 xn 2 ) ] x d
Donde:
N = nmero de colonias por ml o g de producto
C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas
n1 = nmero de placas contadas de la menor dilucin.
n2 = nmero de placas contadas de la dilucin consecutiva.
d = dilucin de la cul fue obtenido el primer recuento
6. El resultado se expresa en Recuento de Mohos por gramo o mL
de alimento y Recuento de Levaduras por gramo o mL de
alimento.
Bibliografa
agua 0.95
Agar plate count (PCA)
II. Procedimiento
1. Se verter 15 - 20 ml del medio en placas de Petri de 9 cm de dimetro y
luego de se secan a temperatura ambiente por una noche (21 - 25C).
2. Inocular 0.1 ml de la dilucin decimal apropiada por duplicado sobre el
agar solidificado y distribuir en toda la superficie usando una esptula de
vidrio estril.
3. Si el recuento estimado de la muestra es menor a 100 UFC/g o ml,
inocular 1 ml dividiendo el volumen en cuatro placas, tres con 0.3 ml y
una con 0.1 ml.
4. Incubar las placas sin invertir por 5 das a 22 - 25C en pilas de no ms
de 3 placas; sin tocar hasta que las colonias puedan contarse, ya que el
movimiento de las placas puede provocar un crecimiento secundario
(debido al desplazamiento de esporas) e invalidar el resultado final.
Contar las placas que contengan entre 15 - 150 colonias. Contar por el
lado inferior de la placa luego que el desarrollo de hongos haya ocurrido.
III. Bibliografa
Introduccin:
Vibrio cholera es la especie mejor conocida como causa del clera humano
contrado por agua contaminada, alimentos contaminados, y han sido
registradas 7 pandemias. En el siglo XIX, en Estados Unidos, hubo tanto
epidemias de clera como casos aislados. La mayor parte de los brotes que
ocurrieron en el siglo XX afectaron pases de Asia. Entre 1 991 y 1 992 se inici
una gran epidemia de clera en el Per, que se disemin a muchos pases de
Amrica del Sur, y afect a 640 000 personas y ocasion 5 600 muertes. Esta
epidemia fue llevada a Estados Unidos por sujetos que haban viajado a esos
pases y que comieron alimentos contaminados o introdujeron a este pas, de
manera oculta, alimentos prohibidos. Tanto en la Unin Americana como en
otros pases, adems de las cepas O1 se ha implicado en casos de clera V.
cholerae no O1. Antes se pensaba que las cepas O1 eran incapaces de causar
epidemias masivas, pero en 1 992 se asoci el serotipo no O1, no O139 a una
gran epidemia en India y Bangladesh.
Caractersticas
-
vaina.
Son anaerobios facultativos.
Son oxidasa positiva, no producen gas y son sensibles al compuesto
O/129.
Crecen en concentraciones altas de sales biliares, y tambin en medios
alcalinos.
No crecen en medios con 6% y 8% de NaCl.
La temperatura ptima de crecimiento comprende un rango de 30 a
37C.
La tasa de crecimiento es muy rpida, aun a temperatura ambiente. Las
clulas no se multiplican en cangrejos, peces ni otras vivos. Sin
embargo, en alimentos marinos cocinados, puede haber un crecimiento
veloz a 25 a 35C
Los alimentos alcalinos propician la multiplicacin rpida de las clulas.
Crece en el medio cistina lactosa deficiente en electrolitos de Mackey y
Sandys (1 966), modificado por Bevis (1 968). Lo que lo diferencia de V.
parahaemolyticus y V. alginolyticus.
Tiene dos biotipos Clsico y El Tor, que se diferencian basndose en el
carcter hemoltico.
presentes en un alimento.
El serotipo O1 no posee cpsula, mientras que O139 s la tiene.
Los serotipos no O1, no aglutinan con anticuerpos preparadas en contra
de antgenos O1; similares a los serotipos O1, no son sensibles a
Sobrevive:
Ancas de rana: -20C por ms de 28 das.
Ancas de rana: 4C por ms de 2 das.
Alimentos cocinados (arroz, tallarines, carne, jamn, etc): 5-10C por 2-
5 das.
Alimentos crudos (camarones, pescado ahumado, marisco, ostras, carne
cruda, pescados pequeos, lechugas, pepino, etc.): 5-10C por 4-9 das.
La supervivencia de stas es mayor en alimentos cocinados que se
almacenan a 5 a 10C.
Identificacin
Se puede identificar como vibrio en base:
-
Procedimiento
Material
Instrumentos para la preparacin de las muestras: cuchillos, tenedores
pinzas, tijeras, cucharas y esptulas. Todos esterilizados.
Recipiente de vidrio con tapn de rosca de 500 ml.
Asa bacteriolgica.
Placas Petri
Medios
Procedimieno
1. Pesar 25 g de muestra en recipientes tarados. Cortarla en trozos
pequeos con unas tijeras.
2. Aadir 225 ml de agua de peptona alcalina y mezclar cuidadosamente.
3. Incubar las suspensiones a 35-37C durante 6 horas (rango 4-8 horas).
4. Preparar placas secas de agar tiosulfato citrato sales biliares sacarosa y
de un agar no selectivo como el agar nutritivo, el agar de Aronso o el
agar taurocolato tripticasa telurito gelatina
5. Pasar una asada de la suspensin en caldo a la superficie de cada uno
de los medios slidos y sembrar en estras, de tal manera que puedan
desarrollarse colonias aisladas.
6. Incubar las placas durante 18-24 horas a 35-37C.
7. Hacer una resiembra con un asa a partir del cultivo de 6 horas en agua
de peptona alcalina en un nuevo tubo con 10 ml de agua de peptona
alcalina, incubando el tubo durante 6 horas.
8. Pasar una asada de la suspensin en caldo del apartado anterior a la
superficie de dos placas de dos medios slidos e incubar 18-24 horas a
35-37C.
9. Examinar el cultivo de 6 horas en agua de peptona alcalina para
observacin de la motilidad tpica en gota pendiente o lmina hmeda,
con iluminacin de campo oscuro.
Asa bacteriolgica
Pipetas de 1 ml.
Dihidrocloruro de tetrametil-parafenileno-diamina
Agente vibriosttico O/129
Aceite mineral estril
Solucin de desoxicolato sdico
Placas Petri
Tubos de 150 x 15 mm
Medios
Agar triple azcar hierro
Agar nutritivo
Agar gelatina
parafina fundida.
Incubar los tubos durante una noche a 35-37C.
La produccin de cido (amarillo) en ambos tubos es indicativo de
fermentacin.
La produccin de cido en la parte superior del tubo sin parafina
unido a la falta de crecimiento en el otro tubo es indicativo de
oxidacin (Hugh y Leifson, 1 953).
diferencia
los
miembros
de
la
Familia
enterobacteriaceae de V. cholerae.
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son negativos a
esta prueba, en tanto que V. cholerae es positivo, aunque tambin
lo son las Pseudomonas.
4. Fermentacin de carbohidratos.
-
alcalina).
Los tubos control y las reacciones negativas deben de
permanecer cidos (amarillos).
6. Prueba de la filamentosidad.
-
cepa en estudio.
Colocar un disco seco de papel de filtro (previamente impregnado
con el agente vibriosttico O/129) sobre el cultivo extendido,
Incubar la placa durante 24 horas a 35-37C
V. cholerae es sensible a este agente y no crecer en el rea que
rodea al disco.
Pipetas de 1 ml
Asa bacteriolgica
Solucin salina
Hemates ovinos lavados
Hemates de pollo lavados
Placas
Tubos de 150 x 15 mm
Discos de polimixina B de 50 mg (50 unidades)
Procedimiento
1. Hemlisis de eritrocitos ovinos (prueba en tubo).
-
crecimiento confluente.
Pasar un asa de 3 mm de la dilucin apropiada de prueba del fago
IV a la superficie del agar inoculado.
Incubar 15-24 horas a 35-37C.
El grupo fgico IV de Mukerjee (1 961) es utilizado a la dilucin
para pruebas de rutina segn la tcnica descrita por Mukerjee (1
963).
EL biotipo clsico es sensible al fago IV, en tanto que el biotipo El
Tor es resistente.
3. Sensibilidad a la polimixina B.
-
4. Prueba de Voges-Proskauer.
-
Asa bacteriolgica
Solucin salina formolizada de yoduro mercrico
Antisuero polivalente O
Antisuero Ogawa e Inaba.
Agar nutritivo
Procedimiento
1. Pasar varias colonias tpicas crecidas en placas de agar nutritivo, de
agar gelatina, de agar de Aronson o de agar tiosulfato citrato sales
biliares sacarosa, a tubos inclinados de agar nutritivo, e incubar durante
4-18 horas a 35-37C.
2. Lavar el crecimiento del agar inclinado con solucin salina formolizada
de yoduro mercrico.
3. Marcar dos secciones de aproximadamente 1x2 cm en la cara interna de
una placa Petri o en un portaobjetos, utilizando un lpiz de cera.
4. Colocar una pequea cantidad de la suspensin del apartado 2 anterior
de cada cultivo en la parte superior de cada una de las dos reas
marcadas.
5. Aadir una gota del antisuero O polivalente V. cholerae solamente a una
seccin. Mezclar la gota de antisuero con la suspensin bacteriana,
utilizando una aguja o asa estril. La otra seccin, conteniendo
solamente la suspensin (el antgeno), sirve de control.
6. Mover el portaobjetos atrs y adelante durante un minuto y observarlo
sobre un fondo oscuro. Una aglutinacin rpida y fuerte es indicativa de
reaccin positiva.
7. Investigar los cultivos positivos con los antisueros Ogawa e Inaba. Los
laboratorios estatales o nacionales de referencia hacen normalmente el
serotipado con estos antisueros. La mayora de los serotipos de V.
cholerae reaccionan o con el antisuero Ogawa o con el Inaba, aunque
algunos lo hacen con ambos a la vez.
8. La aglutinacin positiva en porta puede ser confirmada por la
aglutinacin en tubo.
III.
Bibliografa
ICMSF, 2 000. Microorganismo de los alimentos 1. Zaragoza, Espaa.
Introduccin
Material
Tubos de ensayo con tapones estriles.
Bao mara estufa a 37C.
Pipetas graduadas
Reactivos
III.
Procedimiento
IV.
Observaciones e Interpretacin
V.
Bibliografa
Periago, 2014. Higiene Inspeccin y Control Alimentario. Universidad de
Murcia.Espaa.