TEHNICA REALIZRII DE CULTURI CELULARE

Majoritatea tipurilor de celule animale i vegetale pot supravieui n condiii

corespunztoare ntr-un vas de culturi de esut. Prin cultura de celule se obine o
multiplicare "in vitro" a celulelor provenite dintr-un fragment de esut. Se poate
studia comportamentul celulelor n condiii strict definite; este posibil s determinm
efectele asupra comportamentului celular prin adugarea sau extragerea de
molecule specifice (hormoni sau factori de cretere) i s obinem populaii
omogene de celule pentru analize biochimice sau pentru studiul interaciunilor ntre
un tip celular sau altul.
Observaiile efectuate se verific n comparaie cu comportamentul celulelor
"in vivo" (mediul natural). Metoda permite:
1. Studiul caracterelor morfologice i proprietilor biologice ale celulelor din
diferite esuturi, separate de organism i sustrase influenei sistemului
nervos i curentului sanguin;
2. Studiul unor probleme de biologie tisular (de exemplu afinitatea sau
antagonismul ntre sue tisulare diferite);

Fig. 1 Morfologia fibroblastelor dermice umane n cultur

(DMEM+glucoz+glutamin+antibiotic+ser fetal 10%).
Microscopie n contrast de faz, x100, la 3 zile de la subcultivare.
Tehnica pentru culturile de celule dateaz din 1907, pornind de la un
experiment destinat rezolvrii unei controverse n neurologie, "doctrina neuronal",
care susinea c fiecare fibr nervoas provine dintr-o singur celul nervoas i nu
este produsul fuziunii mai multor celule; doctrina a fost confirmat i au fost puse
bazele culturilor de celule. Experimentele care au debutat n 1907 au implicat
cultura unor fragment mici de esuturi sau explante. Astzi culturile se fac mai ales
din suspensii de celule disociate din esuturi existnd posibilitatea purificrii tipurilor
celulare individuale din amestecul de tipuri de celule diferite.

Tipuri de culturi de celule

I. Dup felul substratului, culturile de celule pot fi:
- pe suport organic nutritiv;
- pe suport organic nenutritiv;
- pe suport anorganic;
- n suspensie n mediul lichid.
II. Dup modul de iniiere a culturii:
A. Culturi iniiate cu fragmente de esut:
a.- pe suport nutritiv
- culturi n pictur suspendat
- culturi n flacoane
- culturi n tuburi rotate
b.- pe suport nenutritiv
c.- n suspensie n mediu lichid (se obine numai supravieuirea celulelor)
B. Culturi iniiate cu celule dispersate:
a.- culturi de celule libere n mod natural (culturi de leucocite din sngele
periferic, de elemente hematopoietice din mduva osoas sau de celule recoltate
din exudatul peritoneal)
b.- culturi de celule obinute prin dispersarea celulelor din fragmente de
esut
III. Dup tipul de material biologic cultivat:
A. Culturi de organe (organocultur) - reprezint scoaterea din organism a unui
fragment de organ (intestin, trahee, rinichi) i introducerea acestuia ntr-un mediu
nutritiv; acestea se menin "in vitro" un timp limitat
B. Culturi de celule - se obine o multiplicare celular "in vitro":
a.- cultura de esuturi obinut din fragmente de esut; n jurul explantului
(fragmentului extras) se formeaz o coroan de celule n multiplicare, de tip
fibroblastic sau epitelial
b.- cultura celular propriu-zis obinut prin cultivarea ntr-un mediu nutritiv
a unei suspensii de celule provenit prin deplasarea celulelor prin metode fizice sau
metode chimice (asocierea factorilor chimici - enzime, ageni, chelatori - cu factori
mecanici - agitaie)

Materiale de lucru
Culturile de celule se prepar ntr-un spaiu de lucru steril, amenajat special,
ce include instalaia de ap curent, gaze, electricitate. Nevoile de baz ntr-un
laborator de culturi de celule sunt:
1. Arie de lucru steril

Fig. 2 Suprafaa de lucru steril n hota de manipulare a celulelor

Aceast arie de lucru este sterilizat cu ajutorul unui dispozitiv special cu
radiaii ultraviolete care se gsete n incinta hotei.
Suprafaa de lucru se dezinfecteaz cu tampoane de tifon sau lavete de unic
folosin i soluie incolor de dezinfectare, antibacterian i antiviral. Nu se
folosete spirtul medicinal. Toate instrumentele de lucru introduse in aria de lucru
trebuie s fie sterile sau ambalate steril. Se evit orice contact al minilor sau
hainelor cu suprafaa intern a hotei.
Sterilizarea cu radiaii ultraviolete se face timp de 20 minute nainte i dup
procedura de lucru propriu-zis.

2. Sticlrie, instrumente fine

Fig. 3 Sticlrie i aspirator electromecanic cu tubulatura montat

Sistemul de aspiraie este extrem de util pentru eliminarea mediului de cultur din
recipientele de lucru. n vasele reziduale se afl soluie de cloramin pentru
inactivarea produselor biologice.

3. Dispozitive de curat i sterilizat

Fig. 4 Sistem de curare a sticlriei pentru culturi de celule

4. Recipiente de stocare pentru mediu, ser, sticlrie i instrumentar specific

(ex pipete automate, pipete de unic folosin.

Fig. 5 Instrumentar de lucru i consumabile pentru culturile celulare

5. Incubator i hot cu flux laminar

Fig. 6 Hota de flux laminar pentru manipularea celulelor n cultur

6. Surs de ap pur

Fig. 7 Sursa de ap biologic pur pentru culturile celulare

7. Microscop, agitator magnetic, balan analitic, centrifug

Fig. 8 Agitator, baie de ap i centrifug pentru culturi celulare

8. Substane chimice

Fig. 9 Medii de cultur i EDTA pentru detaarea celulelor aderente

Spaiul de lucru de lucru steril necesit o iluminare adecvat, un trafic sczut de aer,
suprafee de lucru uor de curat, o hot laminar i lmpi ultraviolete. Sticlria
trebuie s fie neutr, perfect transparent, fr asperiti; se mparte n recipiente
speciale n care se fac culturile i n sticlrie obinuit de laborator. Instrumente fine:
bisturie, lame sterile, pense fine, foarfeci chirurgicali. Dispozitivele de curat i
sterilizat includ autoclave, un cuptor de sterilizare i spltoare de pipete.
Recipientele pentru stocare includ un frigider pentru stocarea mediului i serului,
rafturi i dulapuri pentru sticlrie.
Incubatoarele necesare sunt cu manon de ap sau cu CO2, n funcie de
sistemul tampon folosit n mediu. Hota pentru flux laminar trebuie s fie suficient de
mare pentru a putea pregti mijloacele necesare preparrii i hrnirii culturilor, cu o
bun iluminare i un sistem de lumin UV pentru sterilizarea aerului. Sursa de ap
pentru cltire va fi pur, pentru aceasta fiind necesare un deionizor, un aparat din
sticl pentru distilat i un al doilea pentru bidistilarea apei. Totodat mai este
necesar un microscop cu contrast de faz,un agitator magnetic pentru amestecarea
soluiilor i o balan analitic. Reuita culturii celulelor "in vitro" depinde n mare
msur de pregtirea sticlriei, splarea i sterilizarea ei, de pregtirea
instrumentarului i n special de tehnicile aseptice aplicate. Mediul de cultur trebuie
s asigure celulelor cultivate "in vitro" condiii apropiate de acelea pe care le ofer
organismul viu. Deosebirile eseniale dintre aceste dou modaliti de via i de
multiplicare celular sunt:
- "in vivo", celulele sunt supuse controlului neuroendocrin i influenei
esuturilor i organelor din vecintate; "in vitro" celulele nu mai sufer acest control;
- "in vivo", aportul de substane nutritive i eliminarea produselor de
matabolism se face n mod continuu prin intermediul circulaiei sanguine i limfatice;
"in vitro", aportul i eliminarea sunt periodice.
Tehnicile aseptice
Tehnicile aseptice presupun urmtoarele reguli:

- accesul limitat n zona de culturi de esut;

- suprafeele se decontamineaz cu etanol 70% nainte i dup utilizare;
- nu se pipeteaz cu gura, nu se mnnc, fumeaz n zona de lucru;
- hainele de protecie se folosesc numai n cadrul incintei, fiind interzis
purtarea lor i n afara ei;
- se spal minile nainte i dup operaii, iar prul se leag
- micrile de bra se fac n afara zonei de lucru
- se controleaz emisiile de aer, se sterilizeaz incinta cu lmpi UV
Mediile de cultur celular
Mediile de cultur celular trebuie s asigure:
- echilibrul ionic obinut cu soluii izotone (pstrarea continu a presiunii
osmotice)
- pH optim, (pH=7,2-7,4) meninut cu substane tampon (tampon fosfat,
tampon bicarbonat de sodiu-CO2); n mediu exist i un indicator de pH (rou fenol
vireaz de la galben la rou aprins i apoi violaceu)
- temperatura optim, coninutul de oxigen i de CO2 favorabil
- elementele nutritive, indispensabile metabolismului: hidrai de carbon
(glucoza), proteine animale, lichidele biologice cu plasm, ser sanguin, lichid
amniotic) i aminoacizi eseniali, grsimi (colesterol i cefalin), vitamine (A,B),
hormoni, substane stimulatoare ale creterii
- evitarea contaminrii cu germeni patogeni prin adugarea de antibiotice
(penicilin, streptomicin) i antifungice (micostatin, stamicin)
- stimularea multiplicrii i creterii celulelor prin adugarea de extracte
embrionare
Mediile de cultur se clasific dup mai multe criterii:
a - dup consisten: - lichide, semilichide (mediu nutritiv + agar sau
coagulant plasmatic sanguin)
b - dup compoziie: - naturale, semisintetice (soluii sintetice - AA, soluie
salin, vitamine i componeni naturali, ser plasm, extract embrionar), sintetice
c - dup valoarea nutritiv i dup scopul urmtor: - medii de cretere (permit
o proliferare abundent a celulelor de cultur), medii de meninere (pstreaz
activitatea celulelor, fr ale favoriza proliferarea, utilizate pentru ntreinerea
culturilor ajunse la dezvoltare maxim).
Mediile nutritive conin:
1. o soluie salin (soluie tampon + indicator)
2. elementele proteice (ser, plasm, lichid amniotic, aminoacizi)
3. elemente stimulatoare ale creterii (extracte tisulare de origine embrionar
sau adult)
4. vitamine
5. antibiotice
Tehnica culturii celulare
Toate etapele culturii celulare respect riguros regulile de asepsie.
Recoltarea se face din cele mai variate esuturi provenite de la om, animal
insecte sau plante. Dup proveniena lor, esuturile ce urmeaz a fi cultivate es
mpart n:

a. esuturi normale:
- embrionare (se cultiv uor, cretere rapid)
- adulte (medii complexe, cretere lent precedat de un timp de laten de 6 -10
zile)
b. esuturi tumorale
Recoltarea trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:
- s evite contaminarea esuturilor cu microorganisme prin respectarea
riguroas a asepsiei
- s se evite traumatizarea n timpul recoltrii i n cursul manevrelor
ulterioare
- s se realizeze ct mai curnd dup deces
- de la recoltare i pn la prepararea culturii esutul se pstreaz la rece (la
0
+4 C), ntr-o soluie salin cu antibiotice, timp de 3-4 ore. Dac culturile nu se pot
face n acest timp, esutul se spal i se taie la 1-3 mm, se pstreaz la 40C, n
mediu nutritiv, n flacoane ermetice cu dop de cauciuc. Apoi se spal n bi de
soluie salin cu antibiotice i se urmrete nlocuirea cheagurilor de snge i a
poriunilor inutilizabile.
Tehnica de lucru pentru diferite esuturi este dup cum urmeaz:
A. Pentru esuturi embrionare umane recoltarea se face de la embrioni de 1-3
luni. Se evit excesul de dezinfectante. Embrionul se depoziteaz ntr-un cristalizor
steril, cu capac, ce conine o soluie salin cu antibiotice. Astfel ambalat, embrionii
sunt trimii n cel mai scurt timp la laborator. Aici, cu pense sterile, se aleg
fragmente de esut embrionar, ndeprtnd cu atenie cheagurile de snge;
fragmentele curate se trec n alt cutie Petri steril cu soluie salin. Transvazarea
fragmentelor se repet de 2-3 ori i de fiecare dat se folosesc alte instrumente
sterile; prin transvazrile succesive se elimin cheagurile de snge i poriunile de
esut neutilizabile (strivite). Dup ultima splare, fragmentele se pun ntr-o eprubet
de centrifug steril i cu ajutorul unor foarfeci sterili bine ascuii se obine o mas
cu aspect omogen. Dac dispersarea mecanic nu d rezultate bune, celulele se
elibereaz sub aciunea tripsinei i agitrii. Aciunea tripsinei se oprete prin rcirea
soluiei i apoi celulele se separ de soluia de tripsin prin centrifugare. Apoi
celulele se resuspend n mediul nutritiv i se efectueaz numrarea lor. n final
celulele se dilueaz i se nsmneaz n vase de cultur.
Tegumentul embrionului trebuie considerat contaminat; sterilizarea lui se face
cu alcool iodat, avnd grij ca antisepticul s nu ptrund n cavitile embrionului
dup incizarea lui.
Cu o pipet Pasteur sau cu o ans steril se ia o cantitate din suspensia de
esut embrionar i se ntinde pe una din suprafeele unui recipient de cultur, steril,
fcndu-se o repartizare ct mai uniform a suspensiei. Recipientul, cu faa pe care
este ntins suspensia situat n jos, se las la temperatura camerei sau la
termostat, la 370C, timp de 30-60 minute. Dup trecerea acestui timp se introduce
mediul nutritiv, avnd grij ca el s nu antreneze fragmentele de pe sticl.
Recipientele sunt astupate cu dop filetat cu filtru cu pori i incubate ntr-un termostat
la 370C i atmosfer 5%CO2. n timpul incubrii, recipientele nu trebuie micate din
loc cel puin 3-4 zile.

Metoda este analog i la recoltarea de placent uman, de esuturi

embrionare animale i de esuturi embrionare de pui.
B. Pentru esuturi adulte provenite prin intervenie chirurgical (piele,
mucoase, muchi, esut uterin, rinichi, splin i ganglioni, mduv osoas,
amigdale, apendice, tiroid). Fragmentele recoltate n apropierea morii clinice, n
soluie salin cu antibiotice. Fragmentele se las 2-3 ore n aceast soluie i apoi
se efectueaz etapele de prelucrare preliminar identice cu ale embrionului.
C. Pentru esuturi tumorale.
D. Pentru esuturi vegetale.
Controlul culturii
Controlul culturii trebuie realizat naintea oricrui experiment. El se poate
realiza prin:
1. Controlul mediilor:
- control pentru contaminani (bacterii, fungii, micoplasme, virui)
- control al constantelor fizico-chimice (pH, proteine totale)
- control de eficien, aprecierea densitii celulare pe suprafaa suportului,
evaluarea eficienei de formare a coloniilor celulare
2. Controlul morfologic (aspectul morfologic al celulelor n cultur).
a. tehnici de microscopie optic:
- examinarea celulelor n stare vie la microscopul cu contrast de faz
(aprecierea formei celulelor, a gradului de granularitate a citoplasmei,
a conturului nucleului)
- examinarea preparatelor fixate i colorate
b. tehnici de histoautoradiografie
c. tehnici de microscopie electronic.