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RESUMO
O Ananas erectifolius uma Bromelicea ainda pouco conhecida, sabe-se, no entanto de seu
uso popular na cicatrizao de leses cutneas. Este trabalho tem por objetivo propiciar
informaes sobre a espcie e investigar seus constituintes qumicos e propriedade
antibacteriana contra cepas de Sthaphylococcus aureus. O extrato etanlico bruto foi
fracionado por partio slido-lquido com hexano, acetato de etila e metanol. As fraes
foram submetidas CCD para determinao de seu perfil cromatogrfico e bioautografia
para anlise da atividade antibacteriana. O isolamento da substncia ativa a partir da frao
hexnica foi realizada em coluna LoBar de gel de slica de fase normal utilizando o sistema
CLAE a baixa presso (at 6 bar). Aps o isolamento do componente ativo procedeu-se nova
bioautografia, a fim de confirmar a atividade da substncia ativa. Esta substncia ativa foi
utilizada como referncia em experimentos posteriores. A fim de se identificar quimicamente
o componente ativo do vegetal procedeu-se ao preparo e fracionamento em coluna de uma
nova partida de extrato etanlico, com monitoramento de atividade, obtendo-se uma frao
rica em substncia ativa.
ABSTRACT
1-INTRODUO
O Ananas erectifolius uma Bromelicea pertencente ao gnero Ananas e popularmente
conhecida como curau [1]. O p de curau utilizado na medicina popular para a
cicatrizao de leses cutneas[2], enquanto que suas fibras podem ser utilizadas para a
fabricao de papel, na produo de componentes para bancos e revestimento de
automveis[3], alm de ser empregadas para confeco de cordas e barbantes[4]. Existem duas
variedades de Curau: o roxo e o branco (Fig.1). A variedade branca foi utilizada para a
realizao deste trabalho (Fig.2).
2- Objetivos
Produzir informaes a cerca da espcie;
Determinar o perfil fitoqumico e cromatogrfico da frao hexnica e do extrato
etanlico bruto;
Avaliar, isolar e identificar o componente com atividade antimicrobiana presente na frao
hexnica.
3- Material Vegetal
O material vegetal foi coletado na Empresa Brasileira da Amaznia Oriental
(EMBRAPA), onde procedeu-se a caracterizao do exemplar no laboratrio de Botnica
pela Dr. Silvane Tavares Rodrigues.
4- METODOLOGIA
4.1- PREPARAO DO EXTRATO
O material vegetal fresco coletado pesou 1,4 Kg, foi lavado, fragmentado, seco a sombra
e a temperatura ambiente (27 C) por 3 semanas, por fim foi levado estufa a 50C por 2
dias.
Aps a secagem, o material vegetal foi triturado com etanol, usando-se para isso 2L do
solvente. O material foi submetido macerao por 6 dias, aps o que foi filtrado, resultando
no extrato etanlico, que foi concentrado, obtendo-se o extrato etanlico bruto seco (EEB),
para ser usado na abordagem fitoqumica e na cromatografia em camada delgada.
Atravs desta tcnica foi possvel obter a frao hexnica, que depois foram submetidos a
CCD e a bioautografia.
4.4.2- Bioautografia
Para verificar a atividade antibacteriana da frao hexnica, esta foi submetida
bioautogarafia. A bioautografia consiste na asperso de uma suspenso de microorganismos,
no caso presente Staphylococcus aureus, sobre um cromatograma, no qual avalia-se a zona de
inibio, se houver, luz natural ou aps a aplicao de um corante [6]. Neste trabalho o
corante utilizado foi eosina na concentrao de 2mg/mL.
Para preparar o inculo de S. aureus, utilizou-se o seguinte procedimento: com o auxlio
da ala de platina transferiu-se algumas colnias, para um tubo contendo 3 mL de caldo
Mller-Hinton. Incubou-se por 24 horas 35 C (utilizando-se como base a escala de Mac
Farland para verificar a turvao no tubo que deveria estar entre 0,5 e 1,0 da referida escala).
Quando necessrio, fez-se diluio da suspenso com caldo Mller-Hinton, at a obteno da
turvao desejada.
A placa cromatografada foi borrifada com suspenso de cepas ativas de S. aureus,
acondicionada em placa de petri, e incubada por um perodo de 24 horas. Em seguida, a placa
foi corada com eosina (2mg/mL). A inibio do crescimento foi indicada por zona de
clareamento no cromatograma.
O equipamento utilizado nas anlises foi o sistema MERCK HITACHI com Detetor de
Arranjo de Diodo (DAD). A parte fsica do equipamento composta por uma bomba dupla
modelo L-7100 dotada de quatro canais, um forno de coluna L-7300, DAD L-7455 e
interface D-7000, alm de um organizador de solventes. A retirada de ar dos solventes feita
por um degaseificador de solventes modelo L-7612, antes da mistura e da entrada deles na
coluna. A coluna usada foi uma LoBar 240-10 Lichroprep SI 60. Todo o equipamento
gerenciado pelo software HPLC SISTEM MANAGER que comanda o processo
automaticamente, analisa o resultado, que apresentado sob a forma de cromatogramas e
espectros das substncias separadas na coluna. Neste experimento utilizou-se a bomba, o
organizador de solventes e o degaseificador.
A amostra foi aplicada na concentrao 83mg do extrato hexnico por mL. Como as
substncias em questo so de polaridade muito baixa, o eluente utilizado na anlise foi
CHCl3/MeOH em gradiente de 1% a 2% de MeOH em 4 minutos e isocrtico a 2% por mais
130 minutos e aps o que a coluna foi lavada com CHCl3 /MeOH em partes iguais.
5- RESULTADOS E DISCUSSO
5.1- RENDIMENTO DO EXTRATO
- 189,84 g de droga seca forneceu 4,67 g de EEB, observando-se que o rendimento foi de
2,46%.
5.2- RENDIMENTO DAS FRAES
Os rendimentos das fraes foram obtidos em relao massa de extrato etanlico bruto,
conforme mostra a tabela 1.
Tabela 1: Fraes e seus respectivos rendimentos.
FRAES
RENDIMENTO (%)
FHex
27,41
FAcOEt
4,50
FMeOH
47,32
EEB
FHex
Acares Redutores
Carotenides
Depsdeos e Depsidonas
Esterides e triterpenides
Fenis e Taninos
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Indicativo
Positivo
-
Bioautografia
Fase mvel: CHCl3/MeOH (97:3)
Concentrao: 40 mg/mL
Tabela 3: Massa e rendimento das fraes obtidas por Cromatografia em Coluna da Fhex
Fraes
Total
158,20
6,20
13,20
102,30
77,80
9,80
7,50
524,40
28,76
1,12
2,40
18,60
14,14
1,78
1,36
4,38
95,31
Massa
(mg)
Rendimento
17,96
4,81
(%)
Bioautografia
- Hex/acetona (4:1)- A, D, E, F, G
- CHCl3/MeOH (95:5)- B, C, H, I, J
- Atividade: D, E, F, G, H
- Determinao do perfil das fraes D, E, F e FHex (Fig.4)
- Bioautografia das fraes D e E. Presena de halos inibitrios antes da borrifao da
eosina.(Fig.5)
Fig.5: Bioautografia
das Fraes.
Rf 0,43
Tabela 4: Massa e rendimentos das fraes obtidas aps isolamento do componente ativo.
Fraes
1
2
3
4
5
Total
Massa (mg)
34,00
1,00
13,90
7,50
1,70
58,10
Rendimento (%)
40,62
1,19
16,60
8,96
2,03
69,04
3(D)
0,90
4(D)
0,90
E
0,89
F
0,30
H
0,42
4- BARROS, M.C. C & SILVA, S.M. Curau (Ananas erectifolius). Belm, 2001. Monografia
(Graduao em Farmcia)- Centro de Cincias da Sade, Universidade Federal do Par.
5- BARBOSA, W.L.R. et al. Manual para Anlise fitoqumica e Cromatografia de Extratos Vegetais.
Edio revisada, Belm, 2001.
6- COLLINS, et al. Introduo a mtodos cromatogrficos. UNICAMP, 7 ed., So Paulo, p.65,68,185,
1997.
7- MARTINI, M & ELOFF, J.N. The preliminary isolation of several antibacterial compounds from
Combretum erythrophyllum (Combretaceae). Journal of Ethnopharmacology 62 (1998), p.255 263.
8- WAGNER, H., BLADT,S. Plant Drug Analysis- A Thin Layer Cromatography Atlas- 2nd Editon
1996.