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RNA STRUCTURE AND FOLDING.

BIOPHYSICAL TECHNIQUES AND
PREDICTION METHODS
Dirigido por Dagmar Klostermeier
y Christian Hammann. Walter de Gruyter
GMBH; Berln, 2013.

ARN
Tcnicas recientes para descubrir
su estructura y funcin

os estudios sobre secuenciacin genmica han sacado a la luz la existencia de una diversidad y complejidad
inesperadas de especies de ARN. Se estima que no llega al 2 por ciento del genoma humano la fraccin que codifica
protenas, por ms que la mayor parte del
ADN se transcriba en ARN. Se desconoce
la razn biolgica de esa tarea carsima
desde el punto de vista energtico, pero
s sabemos ya que el ARN no codificador
desempea mltiples funciones, incluidas
la catlisis y la regulacin gnica. El ARN
comprende, en efecto, un abanico extenso de fenmenos celulares. Su papel en
la traduccin proteica se conoce desde
hace decenios; ms reciente es el conocimiento de sus actividades catalticas, a
travs de ribozimas, sus actividades reguladoras, a travs de microARN, pequeos
ARN interferentes, ARN mensajero y ARN
no codificadores. Transcrito como molcula unicatenaria, el ARN puede emparejarse consigo mismo, con otra molcula
de ARN o con ADN. Puede enlazarse con
numerosas macromolculas biolgicas y
metabolitos celulares.
Los pormenores de su mecnica de
operacin dependen de la estructura. De
ah el supremo inters en el plegamiento adoptado. Y, si bien el estudio del plegamiento del ARN no es nuevo, las tcnicas tradicionales ofrecen solo un cuadro
promediado del comportamiento de esta
molcula y no nos permiten acceder a
la multiplicidad de conformaciones en
las que puede plegarse, ni a los estados
transitorios de su cintica. Adems, las

92 INVESTIGACIN Y CIENCIA, octubre 2014

protenas se hallan indisolublemente asociadas con el plegamiento y la estructura

in vivo del ARN.
La estructura polimrica del ARN comienza con su composicin qumica monomrica de cuatro nucletidos estndar:
adenina, citosina, guanina y uracilo. En
la naturaleza, sin embargo, hay ms de
cien nucletidos de ARN. Los cidos nucleicos son molculas muy flexibles, que,
a diferencia de las protenas, adoptan
estructuras terciarias diversas para una
misma secuencia. Tamaa flexibilidad
en su conformacin desempea un papel
crucial en sus procesos celulares. El ARN
se pliega de una manera jerrquica, con
la formacin inicial de estructuras secundarias, regiones dplices generadas por
emparejamiento de bases.
El conocimiento pormenorizado de la
dinmica molecular del ARN avanza de
la mano de la determinacin de su estructura terciaria. Para el anlisis de la
estructura y formacin se recurre a la espectroscopa ptica y la calorimetra. Las
sondas utilizadas en espectroscopa aportan una lectura de los cambios operados
en el entorno debidos a las transiciones
estructurales; las tcnicas calorimtricas
miden directamente el intercambio de
calor producido durante esas transiciones. Los mtodos espectroscpicos (resonancia magntica nuclear, infrarrojos,
transferencia de energa por resonancia
de fluorescencia, o FRET, y resonancia
electrnica paramagntica) resultan apropiados para investigar la dinmica de las
molculas de ARN en diferentes escalas.

La espectroscopa de resonancia magntica nuclear y los infrarrojos obtienen

informacin estructural en una escala de
longitud subnanomtrica, mientras que la
espectroscopa FRET y la espectroscopa
de resonancia electrn-electrn aportan
informacin para distancias en el rango
de 1 a 10 nanmetros.
A lo largo de los ltimos diez aos hemos asistido a progresos sin precedentes
en la bioqumica del ARN. Tras el crucial
descubrimiento de la interferencia por
ARN, por Andrew Fire y Craig Cameron,
como mecanismo central de la posttranscripcin de la regulacin gnica, se
entiende la participacin de molculas de
ARN no codificadoras en vas reguladoras
de todos los niveles del flujo de informacin gentica. Las funciones del ARN se
fundamentan en su capacidad para adoptar estructuras tridimensionales nicas
que son especficamente reconocidas por
los ligandos. Las reglas estructurales que
gobiernan las interacciones ARN-ligandos se basan en la identificacin de los
nucletidos y los tomos implicados en
el reconocimiento especfico, y en mecanismos en cuya virtud ARN y ligando se
adaptan entre s. En ausencia de estructuras de alta resolucin, los enfoques
bioqumicos y genticos han permitido
cartografiar el sitio de enlace con el ligando (footprinting de ARN), para aportar
informacin topogrfica sobre complejos
ligando-ARN y para identificar contactos
especficos y su respectiva contribucin
al enlace.
La bioconjugacin especfica y las estrategias de marcaje del ARN desempean funciones importantes para diversas
aplicaciones de la bioqumica del ARN.
Las investigaciones in vitro de la estructura y funcin del ARN mediante mtodos
espectroscpicos requieren la incorporacin especfica de sitio de marcadores
de los grupos funcionales. Los estudios
sobre sntesis, localizacin y maduracin
de ARN que aplican tcnicas de imagen
exigen la agregacin selectiva de cromforos para la visualizacin. A las reacciones
de marcaje ideal se les exige precisin en
la selectividad y proceder bajo condiciones que sean compatibles con la naturaleza delicada del ARN. Se estn haciendo
cada vez ms habituales la microscopa de
muy alta resolucin y la espectroscopia
de fluorescencia unimolecular.
Se recurre a la electroforesis en un gel
de poliacrilamida para recabar informacin angular relativa sobre la disposicin
de los brazos helicoidales en las articu-

laciones nucleoacdicas. Aunque en un

principio se aplic al ADN, se generaliz
para investigar las molculas de ARN.
Se trata de un mtodo que no requiere
instrumentos complicados o carsimos;
su taln de Aquiles se esconde en que la
electroforesis carece de un riguroso marco terico si la comparamos con otros
mtodos estructurales, de suerte que las
conclusiones que emergen no suelen caer
en el dominio de lo cuantitativo. Mientras que podemos determinar la simetra
de una articulacin determinada, sus ngulos coaxiales se miden solo en un sentido muy relativo. Sin embargo, la comparacin de los ngulos puede frecuentemente aportar informacin suficiente
para una buena descripcin de la estructura. Este mtodo de electroforesis en gel
comparada se desarrolla a menudo en
conjuncin con otros mtodos biofsicos,
en particular con el empleo de la FRET.
Los tratamientos tericos de la electroforesis en gel de los cidos nucleicos se
basan en el concepto de reptacin: el
ADN y el ARN migran, serpenteando,
a lo largo de un tubo formado por matriz
polimrica de un gel. La electroforesis es
un mtodo sencillo, muy poderoso, para
el estudio de la conformacin global de
las articulaciones helicoidales del ARN.
Tambin es un mtodo muy mal entendido, no cuantitativo en sentido estricto,
de muy baja resolucin. Su nivel de detalle dista mucho del alcanzado por la
cristalografa. La electroforesis en gel es
mucho ms simple y rpida que la cristalografa y, por supuesto, no requiere
cristal alguno. La electroforesis en gel
comparada descubri la estructura en
X empaquetada de la articulacin Holliday del ADN diez aos antes de que la
observaran los cristalgrafos. El mtodo
ha desempeado un papel destacado en
la interpretacin de la estructura de diversos sistemas de ARN.
La transferencia de energa por resonancia de fluorescencia es una transferencia no radiativa de energa desde un
cromforo donante hacia un cromforo
aceptor a travs de una interaccin espacial de sus dipolos de transicin. La
eficiencia de ese proceso depende de
la distancia que separa las tinciones
fluorescentes. El marco terico para la
descripcin cuantitativa de la FRET y
su distancia fue formulado por Theodor
Frster. Numerosos estudios han validado la FRET como una poderosa tcnica
de fluorescencia para medir distancias
intramoleculares en macromolculas y

seguir cambios en la distancia causados

por cambios conformacionales. En particular, la tcnica FRET resulta indicada
para estudiar extensos multidominios o
multicomponentes que se caracterizan,
adems, por su flexibilidad y no pueden
abordarse por resonancia magntica
nuclear ni cristalografa de rayos X. De
ah su enorme inters en la investigacin sobre el ARN y los complejos ARNprotena.
Por su parte, la microscopa de fuerza
atmica ha contribuido a nuestra comprensin de la estructura del ARN vrico.
Ha dado frutos espectaculares en la investigacin del virus satlite del mosaico
del tabaco. Mediante el uso de microscopa de fuerza atmica, pinzas magnticas
y pinzas pticas, podemos acotar molculas y medir fuerzas en un rango tpico
de entre 0,1 y 100 piconewtons. En su
origen, las mediciones de fuerza se emplearon para investigar las propiedades
mecnicas y los mecanismos de motores moleculares. En fecha ms reciente,
los estudios unimoleculares de sistemas
basados en el ARN han adquirido mayor
difusin, con ejemplos prominentes en el
despliegue mecnico de las estructuras de
ARN, la observacin de helicasas de ARN
vrico y los estudios sobre el ensamblaje
del ribosoma.
Podemos recurrir a la aplicacin de
las pinzas pticas para abordar algunos de los retos que plantea la investigacin sobre la estructura y el plegamiento del ARN. Para sondear, una a una, las
molculas de ARN, necesitamos una
mquina que nos permita acceder a su
escala. Con una distancia entre pares de
bases de menos de un nanmetro y un
plegamiento que se desarrolla en el rango
del milisegundo y a energas equiparables a la energa trmica, una molcula de
ARN puede estudiarse con herramientas
sumamente precisas. Las pinzas pticas
se originan a partir de la obra seminal
deArthur Ashkin, quien descubri que
partculas dielctricas, de una micra de
tamao, podan quedar atrapadas en el
foco de un haz convergente de lser. El
haz atrapador de la partcula poda actuar a modo de pinza microscpica. Para
sondear una molcula de ARN con unas
pinzas pticas, hemos de empezar por
aislarla y ejercer una fuerza de atraccin
sobre cada extremo. La molcula de ARN
de inters suele ser muy pequea para
una manipulacin fcil. Por consiguiente,
el fragmento de ARN se incorpora a una
construccin mucho mayor.

La dispersin de pequeo ngulo (SAS),

o de dispersin de rayos X de pequeo ngulo (SAXS), constituye un mtodo poderoso para el anlisis de la estructura y
las interacciones de macromolculas biolgicas en solucin. SAXS posibilita una
aproximacin nica a las protenas, cidos
nucleicos y sus complejos, su plegamiento
y despliegue molecular, agregacin, forma,
conformacin y ensamblaje. Cualquier
evento de dispersin est caracterizado
por una ley recproca entre tamao de
partcula y ngulo de dispersin. La radiacin electromagntica incidente interacta
con los electrones en una muestra. Una
parte de ellos emitir radiacin coherente.
Donde las ondas interfieren constructivamente tendremos un mximo, que es lo
que detectamos. Los avances en la recoleccin automtica de datos facilitan los
experimentos.
Para un examen estructural eficiente se requiere una muestra de buena
calidad. Igual que los mtodos de alta
resolucin (cristalografa molecular de
alta resolucin o resonancia magntica
nuclear), la SAXS requiere miligramos
de material muy puro y monodisperso
que permanezca soluble incluso a elevadas concentraciones. Pero comparada
con esos dos mtodos, la SAXS tiene en
su ventaja la velocidad en la recogida de
datos y caracterizacin de la muestra. No
requiere ulterior cristalizacin. Muchas
aproximaciones al anlisis de datos mediante SAXS desarrolladas para protena
se mostraron tiles para las molculas
de ARN.
La resonancia magntica nuclear en
solucin ofrece una poderosa ventaja
en el estudio de los ARN y sus interacciones moleculares en las soluciones fisiolgicamente relevantes. La cristalografa
de rayos X es la tcnica ms poderosa
para dilucidar la estructura tridimensional de macromolculas biolgicas [vase
Aportaciones de la cristalografa a la
medicina, por Juan A. Hermoso; Investigacin y Ciencia, julio de 2014]. La determinacin exitosa de la estructura de un
ARN o de un complejo ribonucleoproteico
requiere, como mnimo, la preparacin de
cristales bien ordenados, recogida de datos de difraccin, solucin experimental
o computacional del problema de fases,
construccin de modelo, refinamiento cristalogrfico y validacin de la estructura. La
fuente principal de estabilidad de las estructuras del ARN es el empaquetamiento
de los nucletidos y pares de bases.
Luis Alonso

Octubre 2014, InvestigacionyCiencia.es 93