Sunteți pe pagina 1din 25

LP II

MICROBIOLOGIE ALIMENTAR
CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL
ALIMENTELOR
Examenul microbiologic cantitativ
Determinarea NTGMA
Determinarea numrului total de drojdii i
mucegaiuri

Tehnicile principale utilizate pentru numrtoare


n microbiologia alimentar primeaz interesul studierii microbiotei prezente ntr-un
aliment din punct de vedere cantitativ i calitativ.
Dei sunt disponibile numeroase tehnici de numrtoare , la ora actual nu exist
tehnica perfect.
Anumite tehnici:
- nu permit diferenierea germenilor mori de cei viabili;
- altele sunt incapabile s deosebeasc anumite celule microbiene, care pot fi
asociate microbiotei prezente n aliment (Staphylococcus, Enterococcus , etc..) i
permit evaluarea unitilor formatoare de colonii (UFC).

Principalele tehnici de numrare


Metodele generale directe
1) Numrtoarea direct
Se realizeaz la microscop cu ajutorul microcamerelor gradate de volum cunoscut
(celulele Thoma, Malassez, Nageotte, Salimbni Cloup etc...) dup o diluie n ser fiziologic
pentru germenii mori sau n ap formolizat 10% n cazul celor vii.
Se mai poate estima la microscop numrul de microorganisme dintr-un produs
anume dup etalarea i colorarea unei cantiti cunoscute de produs (microlitri) pe o
lam. O numrtoare direct se poate realiza dup filtrarea prin membrane sau diluiile
produsului, colorarea membranelor i observarea la microscop. Aceast tehnic permite
evaluarea dup colorarea cu acridin orange i observarea la epifluorescen a
microorganismelor moarte sau vii.
Acest colorant este intercalant al acizilor nucleici formnd cu acetia complexe
fluorescente verzi (ADN) sau orange (ARN)

2) Determinarea materiei/greutii uscate, sau dozajul proteinelor microbiene,


dozajul acizilor nucleici (de exemplu dup sonicaie i / sau extracie n mediu alcalin)

3) Nefelometrie

Turbiditatea unui mediu reprezint, n anumite condiii, proporia


numrului de microorganisme prezente n mediul respectiv. Astfel
absorbana unei suspensii microbiene la o lungime de und superioar sau
egal cu 540 nm variaz liniar pn la valori inferioare sau egale cu 0,8
numr de germeni. Este posibil compararea vizual a turbiditii unui mediu
cu o gam etalon de albumin (metoda Mestrezat: opacitatea unei suspensii
de 5. 109 stafilococi per mL este identic cu cea a unei suspensii de albumin
de 0,5 g per litru).
4) Sistemul luciferin luciferaz
Aceast metod permite numrtoarea microorganismelor vii prin dozajul
ATP-ului intracelular, coninutul n ATP intracelular fiind constant pentru un
microorganism dat; acest coninut este egal cu 0 dac microorganismul este
mort. Dup liza celulei, ATP-ul este dozat pe cale enzimatic.
Numrul de fotoni emii la 562 nm determinai prin numrtoare prin
scintilaie, este proporional cantitii de ATP, aceasta fiind n funcie de
numrul de celule vii.

Metodele generale indirecte


1) Dozajul unui metabolit primar sintetizat, sau dozajul unei cantiti de
substrat consumat.
Aceste metode se aplic doar n condiii bine definite (ex: faza exponenial de
multiplicare, temperatur, mediu, etc).
2) Reducerea unui colorant
Anumite microorganisme modific potenialul oxido-reductor al mediului n
care se afl; viteza la care are loc aceast modificare este n funcie de numrul de
microorganisme, de activitatea lor metabolic (reductoare rapide) i ali parametri
precum natura mediului, microorganismul, temperatura, etc
Printre indicatorii disponibili, cei mai utilizai sunt albastrul de metilen i
resazurina. Modificarea culorii intervine cnd: Eh = Eo - 0,05 V.
Cnd se folosete resazurina, reducerea este urmat de variaii de culoare de la
albastru la lila, apoi mov, roz i incolor la final.
3) Diluia i cultura
Aceast metod permite n principiu numrtoarea germenilor vii. Cultura se
realizeaz fie n mediu lichid (1 microorganism sau un grup de microorganisme
determin dup inoculare i incubare, apariia unei culturi) fie n mediu solid (1
microorganism sau un grup de microorganisme dau natere unei colonii).
n acest caz, pe mediu solid, nsmnarea se poate face prin ncorporarea n masa
gelozei sau pe suprafa.

Numrtoarea pe un mediu solid: UFC

Aceast metod se realizeaz n plci Petri. Se bazeaz pe principiul c


toate bacteriile vii introduse n masa sau pe suprafaa unui mediu cu
geloz dau natere dup incubare la o colonie macroscopic. Numrul
total de colonii corespund aadar numrului de UFC prezent ntr-un
inocul.
Dezavantajele metodei:
Bacteriile strict aerobe se dezvolt greu n masa gelozei, contrar bacteriilor
strict anaerobe care se dezvolt doar n condiii de incubare corespunztoare
(cilindru pentru anaerobioz).
Pot exista anumii antagoniti bacterieni (bacteriocine etc...).
Dac temperatura amestecului mediului cu inoculul este superioar de 4547C, se poate produce inactivarea microorganismelor.
Aceast metod de obinere a culturii prin ncorporare necesit o dispersie
omogen n geloz, deci o distribuie omogen a coloniilor.
Numrtoarea n cazul etalrii este realizabil doar pe suprafaa mediului
perfect uscat. Operaiunea de etalare pe suprafa trebuie controlat
(adsorbia germenilor pe ansa de nsmnare) i volumul de inocul care nu
trebuie s depeasc 0,5 mL pe plcile de 9 cm diametru (volumele
superioare nu sunt absorbite de mediu i mpiedic numrtoarea)

Numrtoarea pe un mediu solid: UFC

MEDII DE CULTIVARE:
Medii neselective pentru bacterii: Plate count agar, TSYE,
Muller Hinton
Medii neselective pentru fungi: Suport creterea majoritii
speciilor fungice i bacteriene contaminante i patogene: DG
18, Sabouraud Dextrose Agar; Potato Dextrose agar; Brain
Heart Infusion agar; Cornmeal agar

Numrtoarea pe un mediu solid: UFC


Tehnica de numrtoare prin ncorporare n mediul geloz

Mediul geloz este topit la bain-marie i apoi meninut la o temperatur constant


de 45 1C.
Se pipeteaz 1 ml din eprubeta cu diluie cunoscut n centrul plcii Petri, n condiii
sterile. Se noteaz fiecare plac Petri, menionndu-se originea analizei, mediul
utilizat, i diluia corespunztoare. Se procedeaz similar pentru fiecare diluie n
parte i este recomandat s se realizeze duplicate.
Se adaug agarul la temperatura de 45C1C peste inocul. Temperatura crescut
a gelozei poate distruge germenii, iar o temperatur sczut determin solidificarea
iregular i distribuia incorect a suspensiei bacteriene. Se amestec prin micri
circulare i orizontale.
Pentru evitarea formrii coloniilor de dimensiuni mari pe suprafa se poate aplica
tehnica stratului dublu.

Se depun ntre 100 pn la 500 microlitri din proba de analizat pe suprafaa


gelozei i se vor repartiza uniform cu ajutorul perlelor de sticl sterile.

Numrtoarea n mediu lichid: UFC

Aceast metod prezint avantajul c se poate


studia caracterul biochimic al
microorganismului, dificil de evideniat pe
mediu geloz, precum producerea de gaz, sau
se poate efectua numrtoarea cu o faz de
reanimare iniial.
Aceast metod se bazeaz pe principiul c un
inocul conine minimum un microorganism care,
dup nsmnarea ntr-un mediul lichid, va
determina o cultur. Tehnica presupune o bun
disponibilitate a nutrienilor pentru
microorganisme.

Divizarea volumelor mari de lichide

Pentru evitarea acumulrii produilor de degradare cu posibil activitate inhibitoare, se


nsmneaz 1 mL de inocul n 100 mL mediu de cultur. Acesta va fi repartizat n 10
eprubete, cu 10 ml per eprubet i incubate. Presupunnd o distribuie omogen a
microorganismelor, se poate concluziona prezena de 1 la 10 microorganisme n inoculul
iniial de 1 ml.
Dac toate 10 eprubete prezint cultur.........peste 10 germeni/ml
Dac 9 eprubete prezint cultur..................peste 9 germeni/ml
............................................................................................................
Dac 1 eprubet prezint cultur....................... Peste un microorganism/ml.

Metoda Mc Grady (tehnica numrului probabil NPP)

McGRADY, MH. (1918) Tables for rapid interpretation of fermentation test results. Public Health J.,
Toronto, 9, 201-210.

Aceast metod permite revelarea celui mai mic coninut de microorganisme spre diferen
de majoritatea metodelor de numrtoare pe mediu solid. Se bazeaz pe o analiz statistic
i determin prin calcul numrul cel mai probabil (NPP). Exist numeroase variante ale
metodei n funcie de ncrctura microbian de evaluat. Principiul metodei const n faptul
presupunerii c microorganismul este distribuit n mod normal n mediu i c un
acelai volum din eantion conine aproximativ acelai numr de microorganisme (n
realitate sunt mai multe sau mai puine); numrul cel mai probabil corespunde valorii
medii.
Ex.: un produs lichid conine 100 microorganisme / 100 ml
Eantioanele de 10 mL vor avea n medie 10 germeni per coninut (mai multe de 10 tuburi)
i puini germeni la 1 tub. Eantioanele de 1 ml conin n medie 1 germene la eprubete mai
numeroase de 1 i eprubete negative.

Numrtoarea prin filtrare

Metoda const n trecerea unui volum din eantion sau diluiile acestuia printr-o
membran filtrant (ex. o membran Millipore sau Sartorius sau de 47 mm diametru a
crui porozitate medie este de 0,45 mm la 0,22 m) pe care sunt reinute
microorganismele de cercetat.
Dup filtrare se spal plnia superioar cu ap distilat autoclavat sau cu o soluie
tamponat steril pentru recuperarea tuturor germenilor i pentru eliminarea de pe filtru a
eventualilor ageni cu efect cid. Filtrul se pune pe suprafaa unui mediu de numrat sau
pe un mediu geloz specific microorganismului de cercetat, cu faa de portaj a
microorganismelor orientat n sus. Dup incubare se numr coloniile formate la
suprafaa filtrului.

Numrtoarea prin filtrare

Avantajele metodei:
- timpul de incubare este mai scurt (18 h n loc de 24 h);
- volumul eantionului de analizat poate fi mai mare (civa litri), ce va permite
numrtoarea germenilor n lichide cu coninut sczut de microorganisme
precum apa;
- nu exist interferene ntre microorganisme (separai la suprafaa filtrului i
crescui pe mediul de cultur prin traversul porilor) i agenii microbiocizi
asociai produsului (clor, antibiotice, conservani), care sunt eliminai;
Diferenele aprute ntre rezultatele numrtoarei specifice unui
microorganism dat, au cel mai probabil, ca origine natura mediului de cultur
ales dect metoda utilizat, temperatura i durata incubrii, lundu-se n calcul
variaiile legate de modul de aplicarea tehnicii.

Interpretarea numrtorilor

Calculul ncrcturii microbiene a produsului


Plecnd de la numrul de uniti formatoare de colonii sau de la NPP
determinate pentru o diluie dat, acestea se raporteaz la produsul analizat.
n cazul produselor lichide, acestea nu prezint dificultate deoarece este
suficient s se multiplice numrul de NPP regsit la o diluie dat, prin
inversarea acesteia.
Ex: s-au numrat 256 de colonii ntr-o eprubet nsmnat plecnd de la
0,1 mL la diluia 10-3 de produs, numrul de UFC pe mL este egal cu:
256 x 1 / 0,1 x 1 / 10-3 fiind egal cu 256.104 UFC / ml.
n cazul produselor solide, broiajul sau suspensia iniial este considerat o
diluie iniial. Spre exemplu 10 g de produs sunt suspensionai n 90 mL
bulion tripton sol. salin, se consider c 1 mL din suspensie corespunde la
0,1 g de produs.

Numrtoarea n mediu solid

Valoarea densitii microbiene din aliment este obinut prin multiplicarea


numrului de colonii observate (prin numrtoare manual sau automat) cu un factor
lund n considerare volumul nsmnat i al diluiei
Exemplu :
- pentru lapte (lichid) 150 de colonii numrate ntr-o plac Petri nsmnat cu 1 mL dintro diluie de 10-3, densitatea microbian va fi de 150.103 UFC per ml de lapte.
- pentru un aliment solid se ine cont de apa pe care o conine sau realizarea primei diluii
plecnd de la x g de produs i adugarea diluantului n cantitate suficient pentru y
mL.

Determinarea numrului de germeni mezofili


aerobi (NTGMA) din produsele alimentare
Metoda orizontal pentru enumerarea microorganismelortehnica de numrare a coloniilor la 30C
SR EN ISO 4833
EN ISO 4833:2003

Cu referire la :
ISO 6887-1:2002 (Pregtirea probei pentru analiz, suspensiei iniiale i
diluiilor decimale pentru examen microbiologic)
ISO 7218:1996 (Reguli generale pentru examen microbiologic)
ISO 8261:2002 (Lapte i produse lactate. Ghid general pentru pregtirea
probei pt analiz, suspensiei iniiale i diluiilor decimale pt examen
microbiologic)
ISO 11133-1:2002 (Microbiologia produselor alimentare i nutreurilor. Ghid
pt prepararea mediilor de cultur)

Principiul metodei:
Prepararea a dou plci turnate prin folosirea unui mediu de
cultur specific i a unei cantiti specifice de prob, dac
produsul iniial este lichid sau a unei cantiti specificate de
suspensie iniial n cazul altor produse.
Prepararea, n aceleai condiii, a altei perechi de plci
turnate, folosind diluiile decimale ale probei sau ale
suspensiei iniiale.
Incubarea plcilor n condiii de aerobioz timp de 72 h la
30C
Calcularea numrului de microorganisme pe mililitru sau
gram de prob din numrul de colonii obinute pe plcile
selectate.
Mediu de cultur PCA (Digest enzimatic de cazein, Extract
de drojdie, Glucoz anhidr, Agar, ap)
Tehnica diluiilor decimale
Metod de nsmnare- tehnica nglobrii n mediul de
cultur
Incubare

Pentru calcul: plcile ce conin mai mult de 15 colonii


i mai puin de 300 de colonii
NTG=NxD/n,
n care,
N- numrul de colonii luat n calcul
D- inversul diluiei nsmnate n placa Petri (ex.10, 100,
1000... (factorul de diluie)
n- numrul de plci luate n calcul
Buletin de analiz:
- Toate informaiile necesare pentru identificarea complet a probei
- Metoda de eantionare folosit
- Metoda de aaliz folosit, cu referire la standardul internaional
- Toate condiiile de operare nespecificate n standard (opionale)
- Rezultatele obinute n analiz

Determinarea numrului total de drojdii i


mucegaiuri
Metod orizontal pentru numrarea drojdiilor i
mucegaiurilor
SR ISO 21527-2:2008

ISO 6887-1:2002 (Pregtirea probei pentru analiz, suspensiei iniiale


i diluiilor decimale pentru examen microbiologic)
ISO 7218:1996 (Reguli generale pentru examen microbiologic)
ISO 8261:2002 (Lapte i produse lactate. Ghid general pentru
pregtirea probei pt analiz, suspensiei iniiale i diluiilor decimale pt
examen microbiologic)
ISO 11133-1:2002 (Microbiologia produselor alimentare i nutreurilor.
Ghid pt prepararea mediilor de cultur)

Principiul metodei:
Prepararea a dou plci turnate prin folosirea unui mediu de
cultur specific i a unei cantiti specifice de prob, dac produsul
iniial este lichid sau a unei cantiti specficate de suspensie iniial
n cazul altor produse.
Prepararea, n aceleai condiii, a altei perechi de plci turnate,
folosind diluiile decimale ale probei sau ale suspensiei iniiale.
Incubarea plcilor n condiii de aerobioz timp de 5-7 zile la 25C
Calcularea numrului de microorganisme pe mililitru sau gram de
prob din numrul de colonii obinute pe plcile selectate.
Mediu de cultur Dichloran 18% glycerol agar DG 18
Tehnica diluiilor decimale
Metod de nsmnare- tehnica inundrii pe mediu de cultur
Incubare

Pentru calcul: plcile ce conin mai puin de 150 de colonii


Numrarea coloniilor se face dup 2 zile de incubare, apoi n zilele
5-7 de incubare
NTG=NxD/n,
n care,
N- numrul de colonii luat n calcul
D- inversul diluiei nsmnate n placa Petri (ex.10, 100, 1000...
(factorul de diluie)
n- numrul de plci luate n calcul
Buletin de analiz:
- Toate informaiile necesare pentru identificarea complet a probei
- Metoda de eantionare folosit
- Metoda de analiz folosit, cu referire la standardul internaional
- Toate condiiile de operare nespecificate n standard (opionale)
- Rezultatele obinute n analiz