PARDEAMIENTO ENZIMATICO

1. OBJETIVOS

identificacin y control del pardeamiento enzimtico

Reconocer las sustancias que causan el pardeamiento enzimtico
Identificar las condiciones ambientales que aceleran o retardan el
pardeamiento
Establecer el efecto del calor ,pH y sustancias inhibidoras del pardeamiento
Comprobar la eficacia de los aditivos que inhiben o retardan el pardeamiento
enzimtico.

2. ASPECTO TEORICO
Las reacciones de pardeamiento forman parte de los procesos naturales de
descomposicin de los tejidos biolgicos.
Existen cuatro tipos principales de reacciones de pardeamiento en los alimentos: la
reaccin de Maillard o reaccin amino-carbonilo, la oxidacin no enzimtica del cido
ascrbico, la caramelizacin, y el pardeamiento enzimtico.
El pardeamiento enzimtico es un proceso oxidativo de los compuestos fenlicos
catalizado por enzimas. Los compuestos o substratos fenlicos naturales suelen estar
separados de la fenolsa en los tejidos vegetales intacto, por lo cual en ellos no se produce
pardeamiento.
La reaccin de pardeamiento exige tres condiciones esenciales para producirse:

Substrato constituido por compuestos polifenlicos

Una polifenoloxidasa o fenolasa ( enzima que cataliza la primera etapa de la
reaccin)
Oxgeno, en calidad de reactivo.

Basta que falte uno solo de estos factores para que la reaccin enzimtica y el pardeamiento
no se produzca. Tanto el substrato como la enzima se encuentran separados entre s en los
vegetales intactos, por lo en tales condiciones el pardeamiento no se es posible. Al cortar,
magullar, estropear, golpear o pelar la fruta u hortaliza, la enzima y el oxgeno entran en
contacto y se mezclan y con ello se inicia de inmediato la reaccin enzimtica.
El pardeamiento se puede controlar usando antioxidantes, entre estos estn:

El cido ascrbico, el cual acta como agente reductor al transferir tomos a las
quinonas que se forman mediante oxidacin enzimtica de los compuestos fenlicos.
El cido sulfuroso y los sulfitos son fcilmente oxidados en los productos alimenticios
para formar sulfunatos y sulfatos, por lo que actan como eficaces antioxidantes.

Las sustancias qumicas causantes del pardeamiento son: catecol, pirogalol y fenol, los
metales como el cobre.
Los factores modifican la velocidad e inhibicin del pardeamiento son: la luz, temperatura, pH,
cidos orgnicos y el tiempo.

Se denomina pardeamiento enzimtico la transformacin enzimtica en sus primeras etapas,

de compuestos fenlicos en polmeros coloreados, frecuentemente pardos o negros. Las
fases de su transformacin son las siguientes

3. MATERIALES ( por grupos)

-

vasos de precipitado de 250 - 500 ml

tubos de ensayo
gradillas
licuadora
pinzas
mechero
termmetros ( 120eC)
vidrios reloj grandes
pHmetro
papel indicador de pH

Por grupo debern traer por lo menos una fruta, tubrculo y una hortaliza:
-

frutas, tubrculos de pulpa blanca como: manzanas, peras, papa, yuca,

bananos pltano verde, lechuga, etc.
Cuchillos y tabla de picar

4. REACTIVOS
- solucin NaCl 2%
- cido ctrico al 1.5 %
- cido ctrico al 0.5%
- bicarbonato de sodio al 1%
- bicarbonato de sodio al 2%

cido ascrbico al 5%
cido ascrbico al 2.5 %
cido ascrbico al 1 %
HCl 2N

5. PROCEDIMIENTO
1. Contacto del aire con el tejido vegetal
Seleccionar un alimento sano, fresco y no muy maduro de una fruta, tubrculos u hortaliza
todas de pulpa blanca. Lavar con agua limpia y secarlas sin estropearlas.
Con ayuda de un cuchillo por cada muestra el mismo bien lavado entre muestra y muestra,
cortar cada unidad en cuatro cuarto, transversal o longitudinalmente.
Dejar ala aire dos cuartos y tomar tiempo inicial y tiempo final hasta la aparicin del
pardeamiento. Sumergir el otro cuarto en agua fra y destilada y anotar tiempo inicial y tiempo
final hasta la aparicin del pardeamiento y el otro cuarto en una solucin NaCl al 2% en vasos
de precipitado de suficientes tamao, de modo que la zona de corte sea muy sensible, anotar
tiempos iniciales y finales de aparicin de pardeamiento.
Establezca una escala para el grado de pardeamiento, especificando los criterios
escogidos.
Tabular los datos donde se observe la condicin, el tiempo (velocidad de aparicin de
pardeamiento) y el grado de pardeamiento.
Analice y fundamente los resultados obtenidos y de un razonamiento lgico de la
aparicin de la pigmentacin sobre los tejidos.
2. Efecto del calor sobre la reaccin de pardeamiento
Preparar un jugo de una de las frutas seleccionadas en 150 ml de agua destilada durante 10 15 segundos.
Rotular 5 tubos de ensayo con las letras A, B, C, D, y E, colocar 10 ml de jugo fresco de la
fruta y someterlos al siguiente tratamiento:

A = A la temperatura ambiente ( anotar tiempos de aparicin del pardeamiento)

B = Calentar a llama directa
en un mechero durante 1 minuto
C = Calentar en bao Mara
a 80 C por 2 minutos
D = Calentar en bao Mara
a 60 C por 2 minutos
E = Calentar en bao Mara
a 40 C por 5 minutos
Tabular los datos y asignar el grado de pardeamiento de acuerdo a la escala diseada.
Deduzca el efecto de la temperatura sobre el tejido analizado,
exponga las razones por las cuales la velocidad de pardeamiento es directamente
proporcional al tratamiento trmico aplicado.
Identifique las fases de pardeamiento en que se encuentra el tejido para la aparicin
del pigmento caracterstico.

3. Efecto del pH sobre la reaccin del pardeamiento Rotular 6 vidrios reloj y sobre ellos
colocar trozos iguales de manzana bien empapados en las siguientes soluciones:

- cido ctrico al 1.5 %

- cido ctrico al 0.5%
- zumo de limn
- agua destilada
- bicarbonato de sodio al 1%
- bicarbonato de sodio al 2%
Tenga la precaucin de tomar pH con potencimetro a las soluciones y a las muestras con
papel indicador.
Dejar los vidrios de reloj con las muestras expuestas durante aproximadamente 5 horas y
determinar tiempos en aparece el pardeamiento.
Tabular los datos y asignar el grado de pardeamiento de acuerdo a la escala diseada.
Deduzca el efecto del pH sobre el tejido analizado A que rangos de pH se estableci menor y
mayor grado de pardeamiento. exponga las razones por las cuales los cambios de pH
modifican el avance de la reaccin enzimtica.
4. Control qumico del pardeamiento
a) control con cido ascrbico
Colocar 5 trozos frescos e iguales de manzana sobre vidrios reloj y rotular con sumo cuidado
y remojemos cada trozo con las siguientes soluciones:
-

agua
cido ascrbico al 5%
cido ascrbico al 2.5 %
cido ascrbico al 1 %
HCl 2N

Anotar el tiempo en que las muestras aparecen los pigmentos marrones en las cuatro
primeras muestras, pues la ltima muestra acta como testigo y patrn de comparacin
debido a que en solucin de HCl 2N el pardeamiento es imposible.

Tabular los datos y asignar el grado de pardeamiento de acuerdo a la escala diseada.

Deduzca el efecto y el papel del cido ascrbico sobre el tejido analizado
Sobre quien acta el cido ascrbico y cual sera el mecanismo qumico de la
reaccin.
Encuentre una explicacin coherente del mecanismo de inhibicin del HCL sobre el
tejido.

PARDEAMIENTO NO ENZIMATICO
1. OBJETIVOS
- Identificar los mecanismos de oscurecimiento debido a la caramelizacin y reacciones de
pardeamiento no enzimtico (reacciones de Maillard), en alimentos tratados trmicamente
como el dulce de leche o arequipe.
- Analizar en forma paralela las diferencias entre el pardeamiento qumico (no enzimtico) y
el pardeamiento enzimtico.
- Reconocer las sustancias causantes de las reacciones de caramelizacin y de reaccin de
Maillard.
2. MARCO TEORICO
Tanto las reacciones de caramelizacin como las de Maillard intervienen azcares reductores.
La caramelizacin es llamada pirolisis, y ocurre cuando los azcares se calientan por encima
de su punto de fusin. Se efecta tanto a pH cido como alcalino y se acelera con la adicin
de cidos carboxlicos y de algunas sales. Se presenta en los alimentos que son tratados
trmicamente de manera drstica.
Las altas temperaturas ocasionan una deshidratacin molecular de los monosacridos y dan
como productos sustancias como el fufural y sus derivados insaturados que se polimerizan
consigo mismo o con otras sustancias semejantes para formar las macromolculas de
pigmentos llamadas melanoidinas. Durante esta transformacin se sintetizan una serie de
compuestos que incluyen furanos, furanosas, lactosas, pironas, aldehdos, cetonas y steres,
de bajo peso molecular y muy olorosas, as como otras de doble ligaduras que igualmente
absorben la energa radiante y por lo tanto producen colores. Por ejemplo se conoce que la
2,5 - dimetilpirazina y la trimetilpirazina se generan por este mecanismo y contribuyen al
aroma tpico de las frituras de las papas; de manera semejante, el maltol, el isomaltol y el etilmaltol, que se forma en la elaboracin del pan, son parte fundamental de su aroma.
La reaccin de Maillard es un grupo de reacciones muy complejas que trae consigo las
formacin de melanoidinas coloreadas que van desde amarillo claro hasta caf oscuro. Para
que se lleve a cabo se requiere de un azcar reductos y un grupo amino libre proveniente de
un aminocido o de una protena.
El caracterstico y deseado color de la costra de los alimentos horneados se debe a esta
reaccin, al igual que el de los diversos postres a base de leche.
Aunque esta reaccin se puede efectuar en diferentes condiciones est principalmente
influenciada por algunos de los siguientes parmetros:
- pH: a pH alcalino se incrementa la velocidad de reaccin, se inhibe a pH cidos.
-Temperatura: las temperaturas elevadas tambin aceleran la reaccin, pero debido a que su
energa de activacin es baja, tambin se observa hasta en condiciones de refrigeracin.

-el tipo de aminocido es decisivo, puesto que stos sern ms reactivos en la medida en que
se incrementan el tamao de la cadena y tengan ms de un grupo amino. Se sabe que en los
sistemas modelo de glucosa -aminocido, la velocidad de reaccin se incrementa con los
aminocidos cuyo grupo amino est mas alejado del carboxilo.
- Azcares reductores: favorecen la reaccin de Maillard son en primer termino las pentosas,
en un segundo termino las hexosas,; as mismo las aldosas actan ms fcilmente que las
cetosas, y los monosacridos son ms efectivos que los disacridos.
3. MATERIALES
-

termmetro
probetas
estufas

Por grupo debern traer:

-

4 1/2 litros de leche

3 libras de azcar blanca
1
/2 1 cucharada de bicarbonato
Una pizca de sal
Cucharas de madera

4. PROCEDIMIENTO
Para la elaboracin de esta prctica se debe consultar:

Composicin de azcares de la leche

Estructura y caractersticas de cada uno de los azcares de la leche.
Composicin de amoncidos de la leche
Estructura y caractersticas de los amoncidos de la leche.
Es el pardeamiento qumico una forma oxidativa? Sustente la respuesta.
Exponga las diferencias entre la caramelizacin y la reaccin Maillard.

1. Elaboracin de Arequipe
Colocar la leche (1 / litro) en un recipiente hondo y junto a ella el bicarbonato, mezcla
uniformemente y coloque sobre el fuego. Cuando la temperatura este entre 30 C , adicionar
el azcar (0,45 KG), dejar hervir y espesar. A partir de ese momento continuar la coccin sin
dejar de batir con una cuchara de madera hasta que se vea el fondo de la paila.
Repita el procedimiento variando algunos de los siguientes aspectos:

la cantidad de azcar + bicarbonato

la cantidad de azcar - bicarbonato
variando el orden de adicin de los ingredientes.

En cada uno de las variaciones registre los tiempos de aparicin del pardeamiento.
Tabule los resultados observados y analice los cambios enfatizando el fundamento del
cambio sobre las caractersticas del producto obtenido.

Que efecto tiene el bicarbonato de sodio sobre las reacciones de caramelizacin y de

Maillard.

Que efecto tiene el orden de adicin de los ingredientes sobre las reacciones de
caramelizacin y de Maillard?
Describa la influencia de la temperatura sobre los azucares del sistema qu reaccin
de pardeamiento favorece? Realice la ecuacin correspondiente de la formacin del
compuesto general por hidrlisis trmica y explique el mecanismo de reaccin.
Que cambios qumicos se podran llevar a cabo intramolecular en los carbohidratos
para la aparicin de la caramelizacin.
Que azucares de la leche estaran involucrados a las reacciones de caramelizacin y
de Maillard en la elaboracin de arequipe. Profundice en el anlisis de su respuesta.
Que amoncidos de la leche podran esta involucrados en las reacciones de Maillard y
como se vera afectada el valor nutricional y biolgico de la protena de la leche.
Investigue las propiedades organolpticas del arequipe asi como sus defectos y
alteraciones

EXTRACCIN DE LA INVERTASA DE LEVADURA DE PANADERA

1. INTRODUCCIN
La invertasa (p-D-fructofuranosidasa, p-D-fructofuransido fructohidrolasa, EC
3.2.1.26), cataliza la hidrlisis de restos terminales no reductores p-Dfructofuranosdicos de fructofuransidos. Entre los sustratos sobre los que acta el
ms significado es, sin duda, la sacarosa, de ah que el enzima se designe con el
nombre de sacarasa. La denominacin trivial de invertasa, con la que tambin se
conoce, hace referencia al hecho de que los productos de la reaccin son
conocidos desde antiguo como "azcar invertido ya que mientras la sacarosa es
dextrorrotatoria, la mezcla equimolecular de glucosa y fructosa que resulta de su
hidrlisis es levorrotatoria, por lo que en el proceso se origina un cambio de signo
(de positivo a negativo) del valor de rotacin ptica.

La invertasa es un enzima ampliamente distribuido, estando presente tanto en

microorganismos como en animales y vegetales, jugando un papel importante en el
catabolismo de fructanos y ms especficamente en el de la sacarosa, en especial en
aquellos organismos en los que dichos azcares son utilizados como fuente de
carbono y energa.
El estudio de la actividad invertasa presenta un gran inters tanto desde un
punto de vista acadmico como de investigacin aplicada, siendo uno de los enzimas
ms conocidos. A modo de ejemplo podemos referir que la invertasa fue el primer
enzima cuya cintica se estudi en profundidad (estudios clsicos de MichaelisMenten) y que fue utilizado industrialmente.
Para la determinacin de la actividad invertasa se utilizar un ensayo indirecto en
el que los productos de reaccin sern detectados espectrofotomtricamente tras su
conversin en derivados coloreados. En concreto, la extensin de la hidrlisis
enzimtica de sacarosa (azcar no reductor) en glucosa ms fructosa (azcares
reductores) se valorar mediante uno de los diversos mtodos existentes para la
estimacin de azcares reductores. Nos referimos exactamente al mtodo del cido
3,5-dinitrosaliclico (DNS), el cual se basa en la reduccin del DNS (de color amarillo)
por la glucosa u otro azcar reductor al cido 3-amino-5-nitrosaliclico (de color rojo
ladrillo) (Chaplin, 1986), cuya presencia puede detectarse por lectura de la
Absorbancia en la zona de 540-570 nm.

En la presente Prctica aplicaremos el mtodo DNS a una gama de soluciones

patrn de glucosa, al objeto de obtener la correspondiente curva de calibrado que,
posteriormente, se utilizar bien directamente, o mediante el coeficiente de extincin
deducido de la misma, para determinar los equivalentes de glucosa formados en el
medio de reaccin de la invertasa y, a partir de ellos, la actividad enzimtica. Adems,
para el anlisis de protenas de los extractos de invertasa, al objeto de determinar la
actividad especfica de stos, se obtendr asimismo una curva de calibrado de BSA
mediante la aplicacin del mtodo colorimtrico de Bradford (Bradford, 1976).
2. OBJETIVO
Purificacin de la actividad invertasa cida extrada por precipitacin selectiva con
sulfato amnico Evaluacin de la purificacin: clculo del rendimiento y del grado de
purificacin de las fracciones
3. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO
3.1.

De uso general

Agitador magntico Balanza (sensibilidad de 1 mg)

Baos termostticos (5)
Bloque seco o bao de agua hirviendo
Centrfuga
pH metro
Acetato sdico
D-Glucosa
Preparado liofilizado de invertasa de levadura
Tartrato sdico potsico
Hidrxido sdico
Sacarosa

3.2. De uso especfico por grupo

Botes de plstico para muestras biolgicas Cubetas de
plstico para el espectrofotmetro (6)
Frasco lavador para agua desionizada
Gradilla con tubos de ensayo de 15x1,5 cm
Gradilla con tubos de ensayo de tapn de rosca 9,5x1 cm
Guantes de ltex
Juego de pipetas automticas (0,01; 0,1 y 1,0 ml)
Juego de pipetas de vidrio (0,1; 0,5; 1,0 y 5,0 ml)
Papel de filtro
Pipetas Pasteur de plstico
Probetas de 10, 100 y 250 ml
Rotulador de vidrio
Vasos de precipitado de 50, 100 y 250 ml
Tijeras
4. PROCEDIMIENTO
Obtencin de un extracto crudo de invertasa de levadura de panadera
Suspender 1 g de preparado liofilizado de levadura en 200 ml de tampn de
extraccin (tampn acetato 0,1 M, pH 5,0, en NaCl 0,5 M). Agitar la mezcla durante 15
min (puede ayudarse la extraccin mediante sonicacin de la suspensin u
homogeneizacin de la misma), centrifugar y tomar el sobrenadante como extracto
enzimtico. El extracto enzimtico, cuando no se est utilizando, se guardar en fro
(frigorfico).