Sunteți pe pagina 1din 193

UNIVERSITATEADINBUCURETI

Nanomateriale
aplicaii
n
biosenzori,sursedeenergie,medicin
biologie

Elementedenanotehnologie

ioanstamatin2008

Cuprins
1. Introducere n nanotehnologie
2. Biosenzorii n contextul transdisciplinaritii tiinelor
2.1 De la chemosenzor la biosenzor
2.2 Biosenzorii i nanotehologiile
2.3 Biosenzori, biodiagnostic, nanobiotehnologie, nanomedicin
2.3.1 Biocipurile i tehnologiile actuale ale secolului XXI
2.3.2 Biocipuri, nanobiotehnologia, nanomedicina
2.3.3 Scurt istoric
2.3.4 Referine
3.Stadiul dezvoltrii actuale n domeniul biosenzorilor
3.1 Sisteme, arii de biosenzori, caracteristici de rspuns
3.1.1 Sisteme integrate
3.1.2 abloane
3.1.3 Sensibilitate
3.1.4 Stabilitate
3.1.5 Selectivitate
3.1.6 Parametrii de caracterizare a semnalelor biosenzorilor
3.1.7 Zgomot, rezoluie, drift
3.2 Componentele biologice ale biosenzorilor
3.2.1 Principiile recunoaterii moleculare
3.2.2 Imobilizarea moleculelor gazd
3.2.3 Transducia semnalului
3.2.4 Tipuri de componente biologice
3.2.5 Integrarea componentelor biologice n biosenzori
3.3 Traductori i electrozi
3.3.1 Electrozi
3.3.2 Electrozi n senzori electrochimici
3.4 Fenomene de transport
3.4.1 Cinetica Enzimelor
3.4.2 Fenomene de transport
4. Biosenzori electrochimici
4.1 Senzori chimici vs senzorii biochimici
4.2 Biosenzor electrochimic
4.3.Clasificare
4.4 Receptorul
4.5 Moduri de transducie electrochimic
4.6 Analii, reacii monitorizate.
4.7 Construirea unui biosenzor electrochimic.
4.8 Criterii de performan

1
7
7
11
14
14
15
18
23
25
27
27
27
28
29
29
30
33
34
35
42
42
43
46
51
52
53
54
55
56
59
59
62
62
63
65
67
67
69

4.9 Exemple de biosenzori electrochimici


4.10 Referine
5. Biosenzori microbieni
89
5.1 Principiu de funcionare
5.2 Rspunsul fiziologic al senzorului microbian
5.3 Referine
6. Senzori pe structuri semiconductoare FET
99
6.1 Tranzistori FET, ISFET, CHEMFET, REFET
6.2 Referine
7. Biosenzori cu fibr optic
105
7.1 Fibre optice, caracteristici generale
7.2 Fibre optice cu reele Bragg induse
7.3 FOBS n medicin
7.4 Referine
8. Celule de biocombustie
117
8.1 Necesitatea implementrii surselor alternative de energie
8.2 Celule de biocombustie-celule bioelectrochimice
8.3 Mecanisme n celulele bioelectrochimice
8.4 Clasificare
8.5 Celule de biocombustie microbiene (MFC)
8.6 Elemente de electrochimia MFC
8.7 Referine
9. Nanoparticule n medicin
131
9.1 Nanofbrile, Nanocarboni, rolul lor n microbiologia clinic
9.2 Nanocarboni
9.3 Puncte cuantice
9.4 Referine
10 Nanotuburi de carbon
165
10.1 Istoric
10.2 Structur, proprieti
10.3 Funcionalizare
10.3.1 Purificarea nanotuburilor
10.3.2 Evaluarea puritii CNT
10.3.3 Selectarea nanotuburilor dup lungime i diametru
10.3.4 Separarea CNT dup proprietile lor metalice sau semiconductoare
10.3.5 Ataarea de grupe funcionale
10.4 Referine
11 Nanofire, nanosenzori
179
11.1 Senzori FET cu nanofire
11.2 Limitele de detecie i rspuns pentru nanobiosenzori
11.3 Referine

73
85
90
93
98
99
104
106
109
110
116
117
118
119
121
122
125
128
133
136
147
162
165
167
169
169
170
172
172
174
176
179
183
186

Aceeast carte este dedicat


n primul rnd celor doi copii Ionu i erban pentru nelegerea i sprijinul acordat,
suportul spiritual al timpurilor grele,
acelor Oameni care mai cred n adevr
i lui Nini Pop prietenul de o via

1. Introducere n nanotehnologie
Discovery consists of seeing what everybody seen and thinking what nobody has thought
Albert von Szent-Gyogyi
The Scientist Speculates,1962
If our small minds, for some convenience, divide thisUniverse into parts - physics, biology,
chemistry, geology, astronomy, and so on remember that nature does not know it!
R. P. Feynman, 1963
When nature finishes to produce its own species, man begins using natural things in harmony
with this very nature to create an infinity of species
Leonardo da Vinci

Secolul XXI se confrunt cu transformri de anvergur att n tiinele naturii ct i


la nivel social, economic, uman. Societatea tinde spre informatizare i globalizare a
schimburilor comerciale datorit dezvoltrii i integrrii pe vertical respectiv pe orizontal a proceselor de producie avansate ce nglobeaz ultimele inovaii ale tiinei i tehnologiei. Ca orice transformare impactul asupra mediului, dezvoltrii sociale, sntii,
dezvoltrii demografice respectiv a necesarului de energie este considerabil. Asistm la
transformri i crize de neimaginat altdat: reducerea considerabil a combustibililor
fosili, noi tipuri de boli, epidemii care altdat erau necunoscute, transformri ale naturii
datorit nclzirii glo-bale, creterea accelerat a stresului, modificri drastice n mediu
datorit noxelor i deeurilor, dispariii de specii naturale etc.
Cum acionm s prevenim? Cum monitorizm aceste fenomene? Ce soluii avem
pentru surse noi de energie i combustibili ecologici? Cum reintegrm deeurile? Cum
prevenim bolile sau le vindecm pe acelea incurabile?
Ce soluii ne ofer tiinele i tehnologiile actuale sau cele de viitor?
Un rspuns categoric nu exis iar lucrurile trebuiesc privite n dinamica dezvoltrii
societii care este o societate de consum adic lucrurile bune astzi devin neutilizabile
mine datorit apariiei altora mai performante.
Un rspuns actual este dezvoltarea i implementarea nanotehnologiilor la orice
scal de dezvoltare a societii n curs de globalizare.
Nanotehnologia este germinat de rezultatele tiinelor interdisciplinare din secolul
XX i a noilor instrumente de investigare la scal nanometric a materiei. Ea a generat
ulterior o larg intermixare a tiinelor altdat considerate fundamentale i a propulsat
noi domenii de cercetare de neimaginat cu cteva decenii n urm. n sens restrictiv este
tiina materialelor a cror proprieti depind de dimensiune i cuprinde:
1

Nanotiinele: fenomenele i legile fundamentale ale fizicii, chimiei, biologiei aplicate la scal nanometric.
Nanoinginerie: manipularea moleculelor pentru a construi noi tipuri de
materiale; instrumentele i metodele prin care sunt proiectate i realizate
dispozitive la scal nanometric, asamblarea lor n produse de larg consum i
pentru noi cercetri avansate.
Nanotehnologia, tehnologia fabricaiei secolului 21, cuprinde ingineria de nalt
precizie, direcia principal n aplicaiile biomedicale din arii ca terapia genetic, transportul dirijat de medicamente, noi tipuri de medicamente, tehnici de sintez la scal nanometric sau mai concis arta manipulrii atomilor individuali i a moleculelor pentru a
construi structuri cu proprieti dirijate.
Nanotehnologia reprezint abilitatea de a construi obiecte prin asamblarea de atomi
n secvene de timp bine precizate. A construi structuri pornind de la atomi i molecule
este necesar inventarea de dispozitive de asamblare la scal nanometric. Rolul lor este de
a asambla atomii i moleculele n miliarde de configuraii specifice unei structuri nanometrice. Capacitatea ansamblurilor de a se autoreplica este una din cerinele de baz a instrumentelor nanometrice. Fiecare nanoinstrument va trebui s opereze n mod propriu i
s fie programabil.
Materialele sintetizate a cror dimensiuni caracteristice se situeaz ntre 1nm i 100
nm au proprieti dependente de dimensiune. Aceasta prezint un interes tiinific
deosebit. Cu ct dimensiunea unui material se reduce cu att fenomenele cuantice sunt mai
pronunate iar defectele sunt mai puin importante ca n procesele de sinterizare ca
exemplu.
Interesele industriale sunt enorme: depirea limitrilor din litografie pentru
tehnologia semiconductorilor, cererea de control la nivel molecular, simplificarea proceselor, durificarea suprafeelor, aplicaii fotonice, controlul permeabilitii, biocompatibilitate pentru a enumera cteva din ele
Nanotehnologia: este un domeniu multidisciplinar care aduce marile realizri tiinifice din Fizic, Chimie, Biologie, Matematic i tiina materialelor spre aplicarea lor
la a construi cu atomi i molecule materiale la scal nanometric cu inteligen artificial,
structuri biocompatibile, surse de energie neconvenionale, nanoroboi pentru medicin,
cipuri cu densitate mare a componentelor i biomateriale auto-replicabile etc. Metoda de
construcie de jos n sus este astzi cunoscut ca building from bottom-up. Este
domeniul unde structurile biologice (ADN, proteine, oligomeri i bio-oligomeri) sunt
arhitecturate cu materiale sintetizate la scal nanometric utiliznd tehnici combinte din
fizic i chimie (microscopia de fore atomice, nanolitografia, fascicule mole-culare,
nanoelectrochimie, sol-gel) cu cele din genetic; domeniul unde moleculele i polimerii
devin dispozitive electronice (electronica molecular); domeniul unde proprietile
materialelor sunt exploatate la extrem pentru tehnica spaial; domeniul unde se dezvolt
ntrega tehnologie a informaiei.
Ramurile Nanotehnologiei: nanofabricaie, nanomecanic, nanorobotic, nanocompozite i compozite nanostructurate, nanobiotehnologie, nanomedicin, electronic
2

molecular, MEMS, NEMS (sisteme micro/ nanoelectromecanice), microfluidic, medicamente inteligente, textile inteligente, biosenzori, econanotehnologie.
Nanotehnologia a revigorat ntreaga industrie electronic; astzi dimensiunile unui
tranzistor nu depete 180 nm ntr-un procesor
Aceste domenii de cercetare vor profita de combinarea eforturilor teoretice i
experimentale din electronica molecular i materialele inteligente supramoleculare.
Conexiunea dintre ramurile nanotehnologiei o constiuie Sistemele Micro i Nanoelectromecanice, discipline noi create o dat cu dezvoltrile rapide din nano i microlitografie, microelectronic, stereolitografie.
Dispozitive MEMS, NEMS, bioMEMS sunt aplicate la structuri complexe
inteligente care cu o decad n urm practic erau de domeniul science fiction. Domeniul
este focalizat n prezent pe crearea de micro/nanosisteme n efortul de combatere a
terorismului, aplicaii n securitatea domestic (protecia caselor, terenurilor etc), securitatea electronic, siguran n exploatare.
Aspectele multidiscipinare sunt extem de complexe pentru nelegerea ingineriei
acestor sisteme ce acoper arii extem de largi: nanostructuri, nanoelectronic, microfluidic, senzori biochimici de nalt rezoluie, detecia substanelor chimice i a agenilor
biologici nocivi, microsenzori pentru radioactivitate, senzori cu consum redus de putere,
aplicaii medicale, investigri noninvazive, biomimetic, secvenierea rapid a ADN-ului,
transportul la int a medicamentelor, polimeri electronici, nanooptic, tehnici analitice la
nivel nanometric, nanoasamblare, nanointegrare, tehnologia informaiei la scal nanometric, nanosisteme multifuncionale, bionanointerfee.
Tehnologiile implicate n aceast ramur: microstereolitografie, microformri prin
matriare i extrudare la dimensiuni submironice.
Produse i servicii generate de nanotehnologie:
Dispozitive chimice inteligente, compatibilitate pentru microsisteme;
chimice, biocompatibilitate pentru bioMEMS;
Senzori i actuatori inteligeni;
Microsisteme MEMS inteligente pentru microanalize;
Nanosisteme utilizate n transportul la int a medicamentelor;
Electronica comunicaiilor: microantene cu autocontrol, reconfigurabile;
tehnologia Bluetooth; RF-MEMS;
Laborator-pe un cip (lab on chip): compensare, autocalibrare, transmisie de
date; cipuri hibride; interfee auto-adaptabile;
Materiale pentru electronic packaging;
Polimeri, biopolimeri autoasamblabili;
Sisteme CAD/CAM pentru structuri MEMS: modelare electro-termomecanic, microfluidic;
Pentru medicin, farmacie, bioingieria dispozitivelor Lab- on cip, biologie
molecular, inginerie genetic, proteomic, biomimetic: nanoboi transportori de medicamente reparatori de esuturi, nanoboi cu proprieti de
anticorpi, nanoboi sanepizi.
3

Tehnologie IT: dispozitive pe structuri CNT (nanotuburi de carbon),


nanofotonic, pile sau celule de combustie nanometrice, dispozitive
spintronice.
Practic este imposibil de a predicta implicaiile nanotehnologiei dar simplu am
putea considera c noile domenii ce apar se dezvolt ntr-un ritm alert. Oricum trebuie s
remarcm un lucru esenial despre nanotehnologie i produsele ei:
Primul lucru care trebuie a fi cunoscut despre tehnologie este acela c tehnologia prin
ea nsi nu creaz bogie, plus valoare i bunstare. Numai produsele i serviciile care
sunt create de tehnologie pot fi vndute sau comercializate. n timp ce este adevrat c
tehnologia poate conduce la procese care pot crea plus valoare prin mbuntirea
eficienei unor operaii existente, dezvoltarea i furnizarea acestor procese este frecvent
realizat de ctre o alt firm ce ofer acest tip de serviciu. Exist deasemeni o asociere
apropiat dintre un nou proces i un nou produs sau serviciu
Denzil J. Doyle, Making Technology Happen,2001
ntruct capitolele ce trateaz diferite aspecte ale implicaiilor nanomaterialelor n
biosenzori i medicin, consider c este necesar a da unele definiii:
Nanobiotehnologie: tiin multidisciplinar care aplic instrumente i procese din nano
/microfabricaie pentru a construi dispozitive n vederea studierii biosistemelor, microanaliza biomoleculelor prin interfaarea unei singure celule, ridicarea profilului metabolismului i biochimismului ei, analiza rspunsului la diferii analii; nanoparticule
inspirate din biologie; biosenzori, celule de combustie microbiene, noi tipuri de markeri
etc
Nanomedicin: descrie un set de capabiliti a sistemelor de maini moleculare care pot
fi utilizate n diagnostic, tratament i reparri de esuturi sau organe: dispozitive medicale
nanorobotice, abilitatea de a recunoate, sorta i transporta molecule, autogenerare, comunicare cu medicul, abilitatea de a migra prin tot corpul de a manipula obiecte microscopice, de a dezafecta celule i virui, evidenierea genelor responsabile de cancer
eventual repararea lor.
Econanotehnologie: nanotehnologia n protecia mediului i a polurii, epurarea mediului i soluii noi de energie regenerabil, recuperarea i meninerea biodiversitii, toxicitatea nanoparticulelor (nanonoxe).
Lucrarea de fa abordeaz teme i subiecte de mare actualitate fiecare capitol
putnd fi studiat separat. Ea este rezultatul leciilor de curs inute la seciile de master de
Biofizic i Fizic medical, Fizica Polimerilor dar mai ales al cercetrilor din diferite
contracte naionale i internaionale pe teme diverse ce au dezvoltat aceste subiecte:
1. FP-6, TOK, Biological and microbial fuel cells ( TOK-Marie Curie)
2. NATO-SfP 974214, Carbon-Ceramic composite materials for electrical engineering applications.
3. PN-II-2007, Dezvoltare de biosensori bazai pe acizi nucleici pentru evaluarea i monitorizarea unor ageni toxici cu aplicaii n bioterorism.
4

4. CEEX-PD-3158, proiect postdoctoral, Celule de combustie stocare de hidrogen.


5. CEEX- Ctr 25/2005, Impactul micotoxinelor produse de specii de fungi ale
genului Fusarium, asupra lanului alimentar; investigarea unor metode de
contracarare a toxicitii acestora n scopul mbuntirii calitii i securitii
alimentare la nivelul standardelor impuse de aderarea la UE.
6. CEEX-Ctr 88/2005, Materiale alternative multifuncionale cu cost sczut,
pentru pile de combustie cu electrolit polimer (PEMFC) ce opereaz la temperaturi mai mari de 180C.
7. CEEX-Ctr. 635/2005, Sticle ecologice obinute prin nanotehnologii, pentru
atenuarea, adaptarea i reastaurarea factorilor de mediu naturali .
8. PCI 2006-Universitatea din Bucureti, Msurarea, caracterizarea i manipularea structurilor nanometrice cu microscopia de fore atomice
9. CEEX-Ctr 60/2006, Administrarea dirijat de medicamente prin nanostructuri procesate prin tehnici laser pulsate avansate
10. CEEX- Ctr. 110/2006, Model experimental pentru studiul biodisponibilitii
unor factori nutriionali (Ca, B, fitosteroli) i influena lor asupra mineralizrii osului la porc, suport tiinific n studiul osteoporozei
11. MATNANTECH / PF 256 / 2004 Nanostructuri pe baz de carbon sintetizate
prin tehnici avansate i aciunea lor asupra microorganismelor patogene.
12. CERES / PED, 2004, Acoperiri nanostructurate de biopolimeri obinute prin
evaporare laser pulsat asistat de o matrice pentru aplicaii n industria
farmaceutic
Prin multitudinea subiectelor tratate cartea se adreseaz specialitilor din diferite
domenii ale fizicii, biologiei, chimiei, medicinei i ingineriei ncercnd s furnizeze
instrumente utile de investigare, concepere, design de dispozitive de senzare i de utilizare a nanomaterialeor n diverse domenii. Este conceput n aa fel nct s furnizeze
cunotinele necesare pentru iniierea studenilor, tinerilor cercettori n a aborda domenii
multidisciplinare dar i pentru cercettori avansai care doresc s-i extind aria de investigare spre multidisciplinaritae.
Cartea include o serie de rezultate originale, idei i concepte de utilizare ale nanomaterialelor care sunt publicate pentru prima dat.
Fiind rezultatul multiplelor cercetri i experimentri n domenii diverse aduc pe
aceast cale mulumiri cercettorilor i profesorilor care au participat i sprijinit aceast
iniiativ:
Profesor universitar dr Ioan Pnzaru, Rector al Universitii din Bucureti, pentru
sprijinul acordat n abordarea acestor cercetri multidisciplinare i de a nfiina
primul centru de cercetare n nanotiine i surse alternative de energie
Profesor universitar dr. Ion Mihilescu, pentru primul ajutor acordat de a iniia i
forma centrul de cercetare.
Profesor universitar dr. Emil Barna, Prorector al Universitii din Bucureti, pentru
nelegerea i ncrederea acordat.
5

Profesor universitar dr. Anton Ciucu, pentru discuiile i sugestiile n elaborarea


capitolelor de biosenzori
Profesor universitar dr Ion Mihailescu, INFLPR, pentru dezvoltarea de cercetri i
a aplicaiilor radiaiei laser n manipularea biopolimerilor
Dr. Ion Morjan i Dr. Ion Voicu, INFLPR, pentru discuiile fructuoase de utilizare
a nanocarbonilor
Dr. Luminia Stamatin, S.C Biolumimedica, pentru experimentele i cercetrile
dezvoltate pe bionanocompozite, aplicaii n parazitologie i microbiologie medical
Dr. Ionela ranu, IBNA, pentru discuiile fructuoase de utilizare a punctelor
cuantice n detecia micotoxinelor.
Dr. Rmbu Gimi Aurelian i Dr Iulian Iordache, ICPE-CA, pentru multiplele
discuii i cercetri comune n domeniul celulelor de combustie respectiv biocombustie
Dr. Rodica Cristescu, INFLPR, pentru dezvoltarea de cercetri n metode de transport dirijat al medicamentelor la int.
Dr. Elisa Mihai, Dr. Bogdan Sava Alexandru, INOE, pentru de dezvoltarea de
cercetri n domeniul sticlelor ecologice.

2. Biosenzorii n contextul transdisciplinaritii tiinelor


2.1 De la chemosenzor la biosenzor
Lumea n care trim este rapid dominat de informaia digital i de necesitatea de
a investiga materia la scal din ce n ce mai mic cu instrumente aparent ultrasofisticate
ce pot vedea atomii i moleculele la lucru prin interacia i asamblarea lor pe diferite
nivele de organizare. Iniial, revoluia digital a implicat n principal computere autonome
care gradual s-au integrat n reele complexe practic globalizate.
Unirea calculatoarelor cu sistemele de telecomunicaii a dus la o cretere enorm a
accesibilitii la informaie i de aici creterea cerinei pentru aceasta. n prezent, aceast
cerin este dominat de un amestec de texte, audio i imagini structurate n baze de date
care astzi sunt omniprezente prin accesibilitatea la internet. Comunicaiile i internetul
din ultima decad va alimenta cererea pentru mai multe surse de informaii i date despre
aspecte importante din viaa noastr, sntatea, mediul nconjurtor, mncarea, munca
noastr.
Corpul uman i n general toate fiinele vii i-au dezvoltat, n decursul evoluiei,
senzorii specifici care s menin echilibrul fiziologic i metabolic n raport cu interaciunea i schimburile cu mediul nconjurtor. Din nefericire modificrile ambientale,
societatea din ce n ce mai tehnologizat, implicarea abuziv i neraional a omului
asupra biosistemelor regulatoare ale naturii a condus la dezechilibre pe care fiinele vii
nu i le mai pot regla prin sistemelor lor senzoriale proprii. Avem din ce n ce mai mult
nevoie de senzori artificiali care s fie interfaa monitorizrii i schimbrii.

Figura 2.1- Schema tipic a unui instrument de control i msurare n senzor. Semnalul
de la senzor trece ntr-un buffer- amplificator operaional-cu impedan mare de
intrare i protecie. Semnalul este digitizat de ctre ADC transformndu-se din
analog n digital.n form digital poate fi procesat, stocat, afiat, disponibil spre
alte locaii prin reeaua de comunicaii

Astfel senzorii ofer portale dintre lumea real sau analoag n care trim i lumea digital a computerelor i a sistemelor moderne de comunicaie prin care ne racordm
7

spre mediul ambiant. Senzorii fac posibil ca s se obin informaii n timp real despre
lucruri pe care le putem vedea, atinge, mirosi i auzi i despre alte lucruri care nu le
putem detecta lucruri care pot fi nocive sau folositoare pentru noi. Semnalul electronic
colectat de la senzor este trecut ntr-un circuit unde este digitizat de un convertor analogdigital (ADC) (figura 2.1). Informaia digital poate fi apoi stocat n memorie, reprodus
vizual pe un monitor sau facut accesibil lumii reale printr-un port digital de
comunicaie.
Din lumea extrem de diversificat a senzorilor ne vom ocupa de biosenzori, clas a
senzorilor chimici, ns pentru o descriere concis a problematicii biosenzorilor att de
vast i variat o definiie se impune de la nceput n contextul general a noiunii de
senzor aa cum figura 2.1 descrie conceptul de detecie i prelucrare a semnalului.
Senzorul n accepiune larg este un dispozitiv ce detecteaz un analit, A, prin intermediul
unui receptor, R, ce este cuplat la un traductor, T. Interacia analit-receptor
produce un schimb de electroni sau emite/absoarbe fotoni pe care traductorul l
transform ntr-un semnal electric sau fotonic, analogic sau digital

n figura 2.2 este prezentat schema de principiu a unui senzor.

Figura 2.2- Principiul general de construcie i funcionare a unui senzor. Interacia A-R
produce un semnal intern preluat de detector , aflat n contact intim cu transfer spre
traductor (figura 2.1)

Un senzor chimic sau biologic funcioneaz pe principiul descris n figura 2.2 prin
emiterea de semnal (tensiune sau curent electric, fotonic) ca rspuns la o reacie chimic
cum ar fi legtura dintre dou molecule. Acest eveniment implic un receptor chimic sau
biologic, R (ligand macrocilic, enzim anticorp etc) care se leag cu o molecul int
specific dintr-o prob de studiat, analitul, A. Transmiterea semnalului este realizat prin
cuplarea cu un traductor, T care interfaeaz procesele din senzor cu unitatea de prelucrare transformare ntr-un semnal msurabil. Detaliu de funcionare i construcie
pentru chemosenzor /biosenzor este prezentat n figura 2.3. Conceptul descris n figura
2.3 arat c biosenzorii sunt o clas, astzi extrem de vast cu particulariti specifice.
Astfel putem s adncim definiia de biosenzor spre particualaritile lui.
Biosenzor-dispozitiv sensibil la un stimul fizic sau chimic (cum ar fi cldura sau
aciditatea, metabolismul) care transmite informaii despre procesele vitale. Biosenzorii se
8

ocup cu detectarea semnalelor fiziologice i transformarea lor n semnale tehnice


standardizate, de cele mai multe ori electrice, pentru a fi cuantificate din analog n digital.

Figura 2.3 n chemosenzor, procesul chimic selectiv ce apare n sau pe filmul


/membrana chemosenzitiv este cuplat cu traductorul de semnal . Exemple
de mecanisme comune implicate includ legarea host-guest (reactantsubstrat reactiv), reacii catalitice sau redox. n senzorul biologic un proces
biologic selectiv este direct legat de membran care este cuplat la traductor pentru generarea semnalului

Analiza de semnale n medicin i biologie vizeaz prelucrarea semnalelor nregistrate prin msurtori n scopul extragerii maximului de informaie util n diagnosticare
i monitorizare. Pe baza acestei descrieri generale se observ c senzorii n particular biosenzorii pot fi clasificai dup natura traductorului sau a semnalului procesat, figura 2.4.
Figurile 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 arat c un senzor este un instrument de msurare a mrimilor fiziologice transformndu-le n semnale msurabile.
Acest aspect a parcurs n ultimii ani drumul de la simpli traductori i aparate de
msur la sisteme complexe care integreaz att electronica analogic, ct i digital.

Figura 2.4- Clasificarea senzorilor dup natura proceselor msurate de traductor

Stadiul actual de dezvoltare este cel din figura 2.1 unde totul este integrat i
digitizat. Operaiile care n mod tradiional se efectuau analogic (filtrare, sumare, scdere,
difereniere, integrare) tind s se fac n msur tot mai mare prin algoritmi de calcul implementai n unitatea de achiziie i procesare de date devenind sisteme moderne de
msurare i transmitere a mrimilor fiziologice.
Efectul acestei tendine de miniaturizare i digitizare a aparaturii simultan cu cretearea performanelor a condus la implementarea de funciuni mai complexe care la
nivelul analogic ar necesita un numr mare de componente liniare discrete (rezistori, condensatori, tranzistori, diode, amplificatoare operaionale).
Biosenzorii au o istorie recent. n a doua jumtate a secolului XX biosenzorii erau
considerai ca o ramur derivat a chemosenzorilor. Dezvoltarea ca tiin transdisciplinar s-a datorat succeselor curente ale biosenzorului de msurare a glucozei pentru diabetici
o metod convenabil, igienic, compact de automonitorizare. Cu acest eveniment biosenzorii au artat un potenial enorm de a detecta o varietate larg de analii n medicin,
industria alimentar, monitorizarea mediului, aprare, securitate. n tabela 2.1 sunt sumarizate interferenele aplicaiilor chemosenzorilor -biosenzorilor n decursul evoluiei
lor. Aa cum este prezentat n tabela 2.1, exist multe domenii cu aplicaii importante
pentru senzorii chimici i biologici, de la monitorizare continu a proceselor chimice din
industrie, sesizarea monoxidului de carbon n case, din mediu ambiant la medicina
curent, terapie intensiv, telemedicin
Tabela 2.1: Aplicaii de uz comun ale chemo i biosenzorilor
Aplicaii
Exemple
Automobile
Sistemul de control al alimentrii cu combustibil,
monitorizarea emissilor de gaze i noxe
Aprare
Aplicaii militare, contramsuri n armele biologice i
chimice
Industria aeronautic Sisteme de monitorizare a calitii aerului n carlinga
avionului,
Agricultur
Detecia pH, ierbicide, pesticide
Industria Chimic
Sisteme de monitorizare a emissilor de gaze toxice,
testare materiale
Securitate civil
Detcia gazelor
Mediu, Protecia
Detecia poluanilor din aer, api sol, BOD, controlul
mediului
detergenilor
Medicin
Diagnostice clinice in vivo sau in vitro, determinarea
concentraiei de gaze anestezice, telemedicin, terapie
intensiv
Control Vamal
Detecia substanelor ilegale, periculoase, droguri,
explozivi, substane radioactive
Alimente, Buturi
Determinarea compoziiei chimice, mirosuri, nivelul
de degradare, odorante, controlul fermentaiei, etc

10

2.2 Biosenzorii i nanotehologiile


Dezvoltarea impetuoas a biosenzorilor ca`o consecin a cerinelor din medicin,
protecia mediului, securitate alimentar a impulsionat tehnologiile actuale spre limite i
performane nebnuite. Noiunea de senzor, respectiv biosenzor, a evoluat pe msura
creterii cerinelor de diagnostic noninvaziv, de investigri i analize fr reactivi suplimentari, de a fi utilizai de nespecialiti, de a lucra on-line (regim continu de monitorizare) sau de a fi de unic folosin. Datorit evoluiilor actuale spre nanotehnologii biosenzorul i perfecioneaz definiia. Actual prin biosenzor se nelege ncorporarea sau
integrarea unui element biologic cu un traductor fizic i cu instrumentele i electronica
aferent. Se ateapt ca n urmtorii anii s includem n definiie termeni ca interfee hibride alctuite din biocomponente i procesoare moleculare
n mileniul III biosenzorul nu mai poate fi disociat de tehnologiile avansate din
optoelectronic, tehnologia siliciului, procesarea de date, electronic molecular, tehnologia IT&C. Aa cum se va prezenta n urmtorul capitol clasele de biosenzori se extind
i se perfecioneaz odat cu noile avansri n nanotehnologie cu un impact asupra biotehnologiei i medicinei, ecotehnologiilor care acum o decad era de neimaginat.
Domenii specifice ale biologiei i medicinei unde nanotehnologia se implementeaz cu o puternic vigurozitate a generat noi direcii astzi cunoscute sub denumiri de nanomedicin, nanobiotehnologie termeni deja consacrai (subdomeniul biosenzori deja este
privit ca interdisciplinar dintre nanobiotehnologie i nanomedicin).
Nanotehnologia i biosenzorii s-au impulsionat reciproc n dezvoltare. n etapele
iniiale s-au interferat reciproc prin implementarea unor algoritmi numerici mai puternici
i mai compleci (software) ce s-au realizat n cadrul structurii fizice de calcul numeric,
(hardware) existente. La acestea au concurat progresele tehnologice n termeni de reducere a volumului fizic al componentelor discrete iar ulterior a circuitelor integrate digitale
care au continuat cu o integrare i ultraminiaturizare pn la nivelul de 1nm. n paralel
dezvoltarea n timp a medicinii a urmat, n mare, evoluia ncercrilor omului de a se cunoate mai bine, de a mpinge tot mai departe cunotinele n ceea ce privete mediul n
care se dezvolt.
Treptat, tehnologii avansate i nanotehnologii din ce n ce mai sofisticate au ptruns tot mai mult n cercetarea medical i a mediului nconjurtor, realiznd o investigare tot mai amnunit, mai riguroas, a fenomenelor vieii, a bolilor, a mediului.
Secolul 21 aduce disciplinele din tiinele naturii, anterior considerate independente, ntr-un context de interdisciplinaritate nebnuit odat cu dezvoltarea acestui nou concept: nanotehnologia.
Nanotehnologia reprezint tiinele la scal nanometric, manipularea materiei nanometrice n realizarea de noi structuri i ansamble moleculare. Un nanometru reprezint
a miliarda parte dintr-un metru, aproximativ 1/80000 din diametrul firului de pr sau de
10 ori diametrul atomului de hidrogen.
O definiie: Nanotehnologia este tehnologia bazat pe arta manipulrii atomilor individuali i
a moleculelor pentru a construi structuri cu proprieti dirijate.

11

Nanotehnologia reprezint abilitatea de a construi obiecte prin asamblarea de atomi


la un moment de timp n secvene bine precizate. n prezent cu instrumentele puse la
dispoziie de nanotehnologie, inginerie genetic, proteomic construim obiecte de jos n
sus=bottom-up adic ansamblm atomi i molecule n structuri.

Figura2.5- Dispunerea organizrii materiei pe scal nanometric-micrometric

Pentru a realiza aceasta este necesar de alte tipuri de instrumente i dispozitive de


dimensiuni nanometrice. Pentru a realiza obiecte macroscopice avem nevoie de miliarde
de aceste mici dispozitive (ansambleri).
A reproduce aceste tipuri de instrumente avem nevoie de o metod de a se autoreproduce sau de instrumente de replicare (replicatori). Noile instrumente nanometrice necesit a fi programabile pentru a realiza un anumit tip de operaie. n figura 2.5 sunt prezentate diferite nivele de organizare ale materiei. la scal nanometric i micrometric.
Se constat imediat c instrumentele nanotehnologiei au dimensiuni sub acelea ale
virusurilor. Obsevm uor din figura 2.6 cum noile instrumente ale nanotehnologiei pot
manipula atomi i molecule la scal nanometric.
Iat c n acest context traductorii, componente eseniale ntr-o structur senzorial,
capt semnificaii cu totul deosebite datorit miniaturizrii i integrrii pe scar larg n
circuitele integrate devenind ele nsi cipuri cu o puternic interfaare a proceselor de
reacie analit-receptor.
Cnd receptorul conine componente biologice parial sau total integrate pe traductor atunci orice tip de senzor capt definiia de BIOSENZOR- ca un atribut generic.
n acest context i noiunea de biosenzor evolueaz mai ales privit ca domeniu de
aplicaie. n ultima decad termenul de biosenzor a fost n variate moduri aplicat la un
numr de dispozitive fie pentru monitorizarea sistemelor vii sau pentru acelea care au
ncorporate elemente biotice. Recent comitetul IUPAC [1] a ncercat o lmurire a definiiei termenului de biosenzor printr-o sistematizare a literaturii de specialitate care n decursul timpului a fost utilizat pentru a descrie termometre, spectrometre de mas, dispozitivele de determinare a daphniei n ecosistemul apelor, echipamente electrofiziologice,
identificri de elemente chimice prin electrozi ionselectivi.
12

Figura 2.6- Manipulatoare al materiei de la scal micro (a) -implantri din ingineria
genetic- la nanoscal (b) unde prin AFM ( microscopia de fore atomice) se pot
poziiona i asambla atomi sau molecule (mecanosinteza) sau lucra cu fluide i
transport de elemente bio( micro/nanofluidic) (c)

Prin consens s-a stabilit c termenul trebuie s fie rezervat pentru utilizarea n context modern ca un senzor ce ncorporeaz elemente biologice cum ar fi, enzime, anticorpi,
acizi nucleici, microorganisme sau celule. IUPAC sugereaz ca acest termen s fie pe
deplin folosit n acest context. O dat cu dezvoltrile din nanotehnologie care au adus o
extrem de larg interdisciplinaritate iar materialele sunt n prezent manipulate la scal
nanometric noiunea de biosenzor capt o definiie mai larg:
Biosenzorul va fi definit ca un dispozitiv analitic compact ncorpornd un element senzorial
biologic sau derivat biologic integrat intim cu un traductor fizico-chimic. Scopul
biosenzorului este de a produce un semnal electronic analogic sau digital care este
proporional cu concentraia unui analit singular sau a unui grup de analii [2].

Actual, biosenzorii sunt utilizai n foarte multe domenii cum ar fi medicin, industria chimic, alimentar, farmaceutic, tehnic militar i de aceea este necesar cunoaterea principiilor de construcie i funcionarea lor. Domeniul n care aceste dispozitive iau gsit o larg utilizare fiind cel medical se impune cunoaterea mecanismelor de reacie
i a afinitii enzimelor i microorganismelor pentru diferite substraturi de interes.
Cercetrile actuale au ca scop miniaturizarea de a crea arii de senzori, structuri integrate, laboratoare de analiz pe un singur cip, creterea sensibilitii i a timpului de
via, scderea timpului de rspuns, lrgirea plajei de utilizare i scderea costurilor de fabricaie a acestor dispozitive.

13

2.3 Biosenzori, biodiagnostic, nanobiotehnologie, nanomedicin


Astzi vorbim despre platforme de diagnostic, imagistic molecular i diagnostic
molecular, caracterizarea proceselor i structurilor biologice. Toate acestea au la baz
fundametarea i dezvoltarea biosenzorilor. Fr ei nu am putea astzi s dezvoltm domenii ca: sisteme de detecie i identificare, recunoatere molecular, nanoparticule funcionalizate cu sisteme biologice, arii de senzori cu nalt sensibilitate i rspuns rapid,
imagistic cu microscopia de baleiaj prin fore atomice- SPM (scanning probe microscopy) a structurilor biologice, detecia intracelular a biomoleculelor, ingineria nanobiointerfeelor.
Dup cum se observ ne apropiem de punctul unde detecia unei singure molecule,
determinarea in vivo cu precizie a proprietilor biologice i a interaciunilor specifice va
fi posibil. Atingerea acestui el va permite cercettorilor, medicilor, tehnicienilor de:
- A obine o detecie sigur a biomoleculelor n volume de probe minimale,
evaluarea i diagnoza rapid din materiale neprocesate, direct prelevate- de
exemplu diagnoza rapid a bolii sau detecia incipient a contaminrii biologice.
- A studia ciclul de via n timp real a organismelor la nivel molecular, de exemplu pentru determinarea interaciei intracelulare a proteinelor virale cu celulele lor int conducnd astfel la o mai bun nelegere a bolilor asociate.
- Investigarea dinamicii proteomice i astfel diferenierea cilor i a rspunsului celular la schimbrile din mediul ambiant.
Astzi discutm i elaborm concepte despre:
1. Platforme de diagnostic: arii de biosenzori incluznd acelea de a utiliza nanoparticule imobilizate i metode de identificare rapid cu cantiti minimale
de probe de material.
2. Diagnostic imagistic la nivel molecular: utilizarea nanoparticulelor ca soluie alternativ de diagnostic n timp real a analizei intracelulare, imagistic
medical cu nanoparticule. (Un capitol special n lucrare va fi acordat punctelor cuantice fluorescente ca elemente de identificare i analiz)
3. Caracterizarea structurilor i a proceselor biologice: utilizarea de instrumente cum ar fi SPM- cu sond nanometric pentru investigarea in situ a interaciilor biomoleculare i de aici mbuntirea, perfecionarea nelegerii
dinamicii celulare i a ciclurilor de via.
4. Senzori: detecia n timp real de biomolecule sau organisme cu aplicaii pentru dispozitive de diagnostic fie la distan fie n sistem ambulatoriu
2.3.1 Biocipurile i tehnologiile actuale ale secolului XXI

Ce este un Biocip?
Un biocip este un dispozitiv ce conine o structur de elemente senzoriale individuale (biosenzori) interconectate dup funcii i specificiti de recunoatere, integrate pe
14

un cip. Numrul de biosenzori pe un cip poate fi de ordinul 106 uniti. n acest grad de
integrare se pot realiza un imens set de teste distincte extrem de rapid i eficient.
Biocipurile sunt adesea construite pe acelai principii ale microtehnologiei ca i
microcipurile. n contrast cu microcipurile, biocipurile nu sunt n general structuri electronice ( dei ele pot conine diferite structuri electronice cuplate la elementele biosenzoriale). Premiza cheie a biocipurilor este aceea c ele pot realiza reacii chimice/ biochimice la micro i nanoscal. Fiecare biosenzor poate fi gndit ca un microreactor care
realizeaz a reacie chimic specific cu un analit. Biosenzorii din biocip pot fi realizai
pentru a detecta o larg varietate de analii incluznd ADN, anticorpi, proteine, biomolecule.
Biocipurile n contextul micro i nanotehnologiilor
Biocipurile n general sunt arii 2D de senzori plasai ntr-o reea specific cu
coordonate bine precizate. De exemplu (figura 2.7) un senzor la coordonatele x-y de
valoare (4,5) poate senza anticorpul pentru HIV, n timp ce senzorul la coordonatele (7,3)
poate detecta anticorpul pentru virusul Influenza. Pentru a aranja senzorii n coordonate
precise sunt abordate tehnici sofisticate de microdepunere de construire a unui lan sau o
matrice de senzori. Tehnica microdepunerii este costisitoare i de randament sczut.
O alt tehnic recent angajeaz tehnica indexrii dup funcia ce o ndeplinete i
forma microbiosenzorului. Astfel senzorii pot fi plasai oriunde pe cip iar softurile de recunoatere de imagini pot fi utilizate pentru a citi biocipul. Dispunerea i formarea biosenzorilor pe cip este realizat prin microlitografie sau tehnologia ink-printing sau de
contact-printing. Avantajele sunt multiple: 1. senzorii pot fi produi n loturi sau secvene
care pot fi asamblai n paralel sau serial furniznd un randament nalt de fabricaie.
2.Senzorii pot fi asamblai pe arii foarte mici, cu distane reduse ntre ei. 3. Pot fi generate
structuri 3D furniznd semnale mari fa de structurile 2D . 4. Poate fi ncorporat orice
tip de reacie biochimic 5. Senzorii pot fi produi separat i asamblai ulterior dup specificitate i natura aplicaiei. Iat un concept avansat de platform de diagnostic tip
biochip (figura 2.7) pentru a detecta o clas de virusuri.
2.3.2 Biocipuri, nanobiotehnologia, nanomedicina

Implementarea cuceririlor din biologie chimia supramolecular i biochimie pe


suportul nanotehnologiei i a instrumentelor de investigare la scal nanometric dezvoltate n fizic a generat noul domeniu, acela al nanobiotehnologiei, unde biosenzorii i biocipurile ocup un loc preferenial. Inferarea lor n medicin a generat noul domeniu:
nanomedicina domeniul unde tehnicile non invazive i autoreparatorii sunt elementele
eseniale ale viitorului medicinei. Curnd vom asista la sisteme i nanoroboi care vor lua
locul chirurgiei i tratamentelor invazive: transportul dirijat al medicamentelor la int,
nanoboi injectabili cu informaii precise ce vor repara organe, generarea intern de celule
de biocombustie pentru ntreinerea activitii inimii sau a sistemelor pulmonare, neuronale, reglarea glucozei din snge de ctre celulele de biocombustie miniaturizate etc.

15

Figura 2.7- Arii de senzori interconectai prin nanofire (NW) ce pot detecta natura
virusului care trece prin structura de microcanale dintr-un fluid biologic colectat.
Fiecare arie de senzori detecteaz forma, dimensiunea tipul de toxin, activitatea
specific, prelund un semnal de prezen (S) i un semnal de detecie specific

Cteva din perspective sunt sumarizate, ncepnd de la faimoasa publicaie a lui


Feynman: (Richard Feynman Plenary Lecture on Nanotechnology, 1963):
1. Electronica la scal molecular- manipularea electronilor pe structuri ADN
i proteine, asamblarea lor n structuri cu proprieti electronice
2. Nanobioelectronica pentru biosenzori
3. Celule de biocombustie- sursa intern de energie ce consum glucoza sau
alte polizaharide din snge genernd energie elec-tric pentru biostimulatoare
sau pentru reglarea dozelor din bolile de diabet. Ele sunt surse de convertire
a deeurilor i biomasei n materiale rgenerabile ( agricultur, pesticide, etc).
Celulele de biocombustie sunt componentele de baz n designul biosenzorilor microbieni.
4. Circuite bioelectronice
5. Arhitecturi supramoleculare la interfaa electrod-electrolit, pentru aplicaii
n biosenzori
6. Detecia electrochimic a acidului 2,4 diclorofenoxiacetic sau a altor toxine,
mirosuri, odorizante etc. ( nasuri electronice)
7. Nanostructuri polimere,1D-2D-3D, elemete suport n biosenzori, protezare
medical
8. Microarii ca pori de legtur cu sistemele biologice. Interfeele neuronale
artificiale
9. Dispozitive de calcul nanometrice formate din biomolecule cuplate cu interfee clasice i biologice
10. Optica nanometric n biosenzori i biotehnologie
11. Materiale nanocompozite, nanostructurate
16

12.
13.
14.
15.
16.

Biocipuri, componente n alte tipuri de arhitecturi


Asamblarea de peptide la interfee
Dinamica i fluctuaiile ADN-ului
Imprimare molecular
Investigarea sistemelor de polimerizare electrochimic n procese sol-gel.
Modificarea electrozilor prin funcionalizarea xerogelurilor anorganice
17. Biosenzori impedimetrici pe structuri de proteine i celule
18. Polimeri inteligeni: aplicaii la elaborarea de dispozitive bioanalitice
19. Investigri n timp real cu biosenzori n timpul operaiilor chi-rurgicale
20. Investigarea mediilor moleculare prin optica neliniar, lumi-niscen, etc
Alte domenii transdisciplinare generate de biosenzori i nanotehnologii
Microarii, biocipuri, sisteme microbioanalitice
Neuroprocesoare- senzarea i procesarea In-Vivo i In-Vitro a semnalelor neuronale
Transportul electric prin ADN,
Cip genetic
Msurarea amperometric a exocitozei veziculare din neurotransmitori:
descifrarea semnificaiei biologice i fizico-chimice
Nanobiotechnologie i NanoBiosisteme
Nanoimprintarea biomoleculelor i a biosuprafeelor cu microscopia de fore
atomice
Studiul relaxrilor n ADN cu pensetele optice (optical tweezers)
Recunoaterea de mono/oligonucleotide pe monostraturi de filme polimere.
Dinamica biopolimerilor, starea dinamic a motilitii pe baz de actin
Reglarea proteinelor motor, microtubule
Nanobiotehnologie i Biosenzori
Monitorizarea noninvaziv a glucozei prin biocipuri ce controleaz
ultrasonic pielea permeat
Arii de microace, cip-microfluidic pentru integrarea unei celule n sistem
Senzori colorimetrici pentru analiza bacterial
Senzori bacterieni pentru detecia metalelor grele
Efectul biorecunoaterii (bioafinitatea) i implicaiile asupra vieii cotidiene.
Monitorizarea genotoxicitii n timpul degradrii fotocatalitice a
paranitrofenolului.
Monitorizarea electrochimic a bacteriilor biotinilate denitri-ficatoare
Celule-biocip pentru detecia toxicitii
Iat numai cteva din domeniile unde biosenzorii au impulsionat cercetrile cu realizri notabile. Biosenzorii au propulsat domenii de grani i au creat noi domenii i
tiine: chimia supramolecular; tehnici de autoasamblare; concepia de noi receptori sin17

tetici utiliznd metode combinatoriale; imprintri moleculare (molecular imprinting);


nanosisteme; ingineria proteinelor, acizilor nucleici i a zaharidelor ca receptori i sisteme catalitice; ingineria biomoleculelor capabile de a avea funciuni suplimentare cum ar
fi transducia semnalelor (fire moleculare) sau transmiteri mecanice (motoare moleculare,
brae moleculare; senzori cu acizi nucleici, cipuri cu ADN; imunosenzori, senzori pe
structuri enzimatice; receptori naturali i sintetici; proteomica i analiza individual a celulei; bioelectronica, celule de biocombustie, sisteme nanoanalitice
Dei aceste cuceriri ale tiinelor de grani apreau ca lucruri de neimaginat acum
20 ani totui avem cteva elemente cheie de control care indiferent de scala de lucru sunt
de o importan perpetu: selectivitatea, sensibilitatea, stabilitatea n proiectarea de sisteme senzoriale integrate cu structuri i aranjamente de elemente senzitive.
Observm c indiferent ce concept se abordeaz n construcia i realizarea de biosenzori ne confruntm cu urmatoarele probleme:
1. Sterilizarea direct a biosenzorilor este imposibil;
2. Pentru calibrarea biosenzorilor sunt necesare msuratori discrete;
3. n majoritatea cazurilor, concentraiile compuilor depesc domeniile de
rspuns liniar ale biosenzorilor;
4. Stabilitatea biosenzorilor este afectat de stresul mecanic i termic;
5. Sensibilitatea i reproductibilitatea: parametrii ce asigur bu-na funcionare a
biosenzorilor, gradul de noninvazivitate.
Merit n acest context s sumarizm o scurt retrospectiv a dezvoltrii istorice a
biosenzorilor pentru a realiza conexiunea dintre fenomene fundamentale i tendinele actuale.
2.3.3 Scurt istoric
1986: ROYAL SOCIETY, Londra, s-au definit biosenzorii ca fiind dispozitive bazate pe cuplajul
spaial direct al unui compus biologic activ imobilizat cu un traductor i un amplificator
electronic.
as a compact analytical device incorporating a biological or biologically-derived sensing
element either integrated within or intimately associated with a physicochemical transducer. The
usual aim of a biosensor is to produce either discree or continuous digital electronic signals
which are proportional to a single analyte or a related group of analytes.[2]

Succesul biosenzorului pentru determinarea de glucoz, a constituit placa turnant


a exploziei biosenzorilor. El s-a dezvoltat datorit cerinelor extraordinare a bolnavilor de
diabet i a abilitii biosenzorilor de a oferi o metod convenabil, igienic i compact de
moni-torizare personal. Biosenzorii ofer un mare potenial de a detecta o larg varietate
de analii n medicina curent specifice laboratorelor clinice sau tratamentelor n regim
ambulator; n industria alimentar, n monitorizarea factorilor poluani din mediu.
1950 -1960 Electrodul Clark
O problem deosebit de important in chimia analitic o constituia selecia i n
particular, cea fcut la concentraii sczute i n prezena substanelor care interfereaz.
18

Determinarea sensibil i selectiv a unui mare numr de compui era i este n


continuare foarte util pentru cercetrile tiintifice, ca i pentru unele ramuri industriale
(chimic i alimentar). n domeniul snatii devenea indispensabil gsirea de metode
pentru diagnosticarea unor boli iar senzorii cu o fin selectivitate i uor de manevrat
devenise o problem cheie n perfecionarea analizelor de laborator. n aceast perioad o
serie de senzori pe structuri solide erau folosii la determinarea parametrilor fizici cum ar
fi temperatura, presiunea, energia sunetului dar analizele calitative i cantitative fcute
asupra compoziiei chimice rmneau dificile. Cele mai cunoscute n aceast etap erau
pH-metrele care sunt puin aplicabile msurtorilor unor substane fiziologice importante
cum ar fi: ureea, colesterolul. Ele au devenit utile n primele investigri n cazul macromoleculelor cum sunt: enzimele, anticorpii, sau microorganismele. Fiinele vii ns sunt
capabile s se adapteze la schimbrile propriului lor metabolism i la mediul inconjurator
cu ajutorul aa numiilor receptori care sunt alctuite din structuri proteice complexe i
sunt, n mare parte, legate de membranele celulare. Ele posed o mare afinitate pentru
factorii specifici, cum ar fi: hormoni, enzime sau anticorpii. Legtura dintre aceti factori
determin activarea unor cascade de enzime, care provoac schimbri n proteina
receptoare i o amplificare a semnalului. Aceste considerente erau oarecum bine statuate
n aceast perioad dar pn n 1956 nu s-a realizat nici un progres semnificativ de a gsi
o metod de msurare.
n 1956, pentru a simplifica msuratorile de glucoz s-a adoptat principiul hrtiei
folosit la determinarile de pH, [3]. Impregnnd o hrtie de filtru cu enzime de glucoz,
Free a obinut primul test-fie de enzime, care poate fi privit ca un predecesor al biosenzorilor optoelectronici.
n aceast perioad se ridica necesitatea de determinare a coninutului de oxigen
din snge, respectiv a glucozei. Leland C. Clark Jr., a inventat un electrod destinat a fi
folosit pentru msurarea oxigenului dizolvat n sngele bolnavilor operai. Acesta este
format dintr-un electrod de platin i un electrod cu o membran de plastic permeabil la
gaze. Polaritatea electrodului a fost astfel stabilit nct intensitatea curentului prin circuit
s depind de viteza de difuzie a oxigenului prin membran, vitez ce este direct proporional cu concentraia extern a oxigenului. O dat cu electrodul Clark, considerat primul
biosenzor, ncepe i clarificarea scopului i definiiei conceptului de biosenzor ce continu
a fost modificat i reactualizat. Profesorul Leland C Clark Jr este considerat printele
domeniului biosenzori. n 1956, Clark public articolul su despre electrodul de oxigen
(discutat pe larg n [3]). Clark prin acumularea unei bogate experiene lanseaz n 1962
prin conferina susinut la Academia de tiine din New York o viziune general asupra
conceptului de biosenzor i direciile de dezvoltare: "to make electrochemical sensors
(pH, pola-rographic, potentiometric or conductometric) more intelligent" by adding
"enzyme tran-sducers as membrane enclosed sandwiches".[4]

1962 Electrodul enzimatic


Clark extinde folosirea acestui "electrod de msurare a oxigenului" la determinarea
nivelului de glucoz in snge. El a mbrcat senzorul pentru oxigen cu un strat subire
19

de gel ce contine un biocatalizator, enzima glucozoxidaza, urmat de o membran semipermeabil de dializ ce permite glucozei s difuzeze n senzor, dar oprete enzima s
difuzeze. Cu ct intr mai mult glucoz, cu att mai mult oxigen este consumat de enzim. Deci, o cantitate mic de oxigen existent se traduce prin existena unui nivel ridicat
de glucoz. Clark i Lyons [4] introduc termenul de electrod enzimatic, adeseori greit
atribuit de muli autori de recenzii ca fiind introdus de Updike i Hicks [5] care au avut
meritul de a descrie experimental detaliile necesare de a construi un electrod cu enzim
pentru glucoz. Prima descriere a unui biosenzor a fost realizat de Clark i Lyons n anul
1962, unde era prezentat de fapt un electrod de platin cu enzima oxidoreductaza, ntr-o
construcie de sandwich. Anodul de platin polarizat la +0,6V, rspunde la peroxidul
produs de enzim n reacie cu substratul. Acest tip de biosenzor deschide calea pentru
msurarea glucozei din snge.

1969 Senzori enzimatici, traductori poteniometrici


Guilbault i Montalvo [6] descriu un electrod-enzim poteniometric. Autorii descriu un senzor de uree folosind ureaza imobilizat pe un electrod-membran, selectiv la
amoniac. G.Guilbault a in-ventat un sistem de masur pentru uree n fluidele corpului
uman. Dispozitivul lui folosete enzima ureaza ce transform urea n bioxid de carbon i
amoniac. Electrodul sesizeaz schimbrile concentra-iei ionilor de amoniu. Acest
dispozitiv a constituit o mbuntire pentru c se bazeaz pe o detecie poteniometric
(senzor poteniometric). n timp ce senzorii de tip Clark msoar trecerea curentului prin
electrod (senzor amperometric), senzorul poteniometric msoar tensiunea cerut pentru
meninerea curentului la zero. Electrodul nu consum nici un fel de reactani de aceea este
mai puin susceptibil la erori cauzate de schimbrile survenite n mediul extern. n plus,
sistemul poteniometric are o curb logaritmic de rspuns astfel nct poate urmri o
concentraie de peste 100 de ori mai mare n raport cu alte tipuri. Ulterior au fost folosite
n construcia de biosenzori peste 100 de enzime. Cercettorii n domeniu au realizat c
nu numai enzimele singulare se pot folosi, ci i esuturi ce reacioneaz la aminoacizi i
la alte bio-molecule. De exemplu, folosirea pulpei de banan pentru msurarea
dopaminei, miezul de porumb pentru piruvat, frunza de castravete pentru cistein, sfecla
de zahr pentru tirozina, ficatul de iepure pentru guanina i pudra de muschi de iepure
pentru monofosfat de adenozina. Rechnitz [7, 8] a mers i mai departe n folosirea unor
pri din sisteme biologice; unul din senzorii si conine o antenul, un mic organ de sim,
de la un crab albastru, supus diseciei pentru a folosi fibrele nervoase conectate la un
electrod. Acest dispozitiv poate msura concen-traia unor droguri, precum i a toxinelor
din mediu.

1970 Miniaturizarea electrozilor.


La nceputul anilor 70 au fost perfecionai primii senzori enzimatici, cu indicaii
calorimetrice iar ulterior s-au folosit indicatori optici [2]. Noile descoperiri din biotehnologie au perfecionat biosenzorii. n 1970, s-au construit multielectrozi miniaturizai pe un cip de siliciu [2, 8] ce poate realiza msurtori pe esuturi neuronale. Toate
20

cercetrile n acest sens au condus la adoptarea unei tehnici generale de combinare a


componentelor chimice cu circuitele integrate intr-un singur sistem. Unii cercettori au
miniaturizat biosenzorii electronici, alii au dezvoltat un ntreg sistem bazat pe sensibilitate optic - n 1969, G.Vurek si R.Bowman [9] au demonstrat primii senzori pe fibre
optice folosit la analize clinice.1970- Yellow Springs Instrument Co. (Yellow Springs,
OH) comercializeaz primul senzor pentru monitorizarea glucozei

1974 Traductorii termici. Termometrele n variate forme, termorezistenele i termistorii au fost propui ca biosenzori prin imobilizarea de enzime pe suportul traductor i
msurarea efectului termic datorit efectelor termice induse de reacia enzimatic.
Biosenzorii cu traductori termici propui n 1974 au devenit termeni uzuali astzi
ca sonde termice enzimatice [10] sau termistori enzimatici [11].

1975 Bioanalizoare de glucoz, senzori microbieni, optici


In anul 1975, DIVIES [12] a folosit o bacterie ntr-un senzor de alcool n timp ce
GUILBAULT a construit n 1976, un NADH-senzor folosind o mitocondrie. Aplicarea
modelelor enzimatice de mare stabilitate n biosenzori a oferit o nou alternativ enzimelor. n 1975 JANATA (citat n [7]) a realizat un imunoelectrod. Ideile lui Clark
devin realitate n 1975 prin lansarea de succes de compania Yellow Springs Instrument
Company (Ohio) a analizorului de glucoz pe principiul deteciei amperometrice a
peroxidului de hidrogen. Este perioada lansrii, n lume, a primului analizor de laborator.
Biosenzori microbieni. n 1975 biosenzorii iau o nou rut evoluionar cnd
Divies [12] sugereaz c bacteriile pot fi utilizate ca element biologic ntr-un electrod
microbian pentru msurarea concentraiei de alcool. Articolul marcheaz nceputurile
eforturilor de cercetare din Japonia i ulterior n toate rile a aplicaiilor biosenzorilor n
protecia mediului i biotehnologie.
Optode. Lubbers i Opitz [13] introduc termenul de optod n 1975 pentru a descrie senzorul cu fibroptic ce are imobilizat un indicator pentru msurarea bioxidului de
carbon i a oxigenului. Autorii extind conceptul dezvoltnd un biosenzor optic pentru
alcool prin imobilizarea alcooloxidazei la o terminaie a senzorului cu fibr optic pentru
oxigen [14]. Optodele comerciale au n prezent performane excelente pentru msurarea
in vivo de pH, pCO2 i pO2, ns optodele enzimatice nc sunt sub lupa cercetrii fr a
primi o larg audien comercial.

1976 Implementri noninvazive, mediatori pentru transferul de electroni


n 1976, Clemens i colab.[15] ncorporeaz un biosenzor electrochimic de glucoz
la un pancreas artificial marcnd implementarea comercial de ctre compania Miles
(Elkhart) a Biostatorului. Biostatorul nu a fost comercializat pe scar larg el fiind nlocuit de un analizor de glucoz cu cateter continu - VIA Medical (San Diego). n acelai an
La Roche (Elveia) introduce Lactate Analyser LA 640 n care mediatorul solubil hexacianoferatul este utilizat pentru transferul mediat de electroni de la lactat dehidrogenaza
spre electrod. Cu toate c nu a cptat un uz comercial s-a deschis generaia biosenzorilor
21

cu mediatori n transferul de electroni cu aplicaii n analizorii de lactate pentru domeniul


sportiv i aplicaii chimice. Un important avans pentru aplicaii in vivo a senzorului de
glucoz a fost raportat de Shichiri i colabl.[16] ce descrie un electrod enzim tip ac
pentru implantri subcutanate, 1982, un succes tiinific ns fr o valorificare
comercial.

1980- 2000-2007
Imunosenzori, efectul SPR.
Ideia construirii de imunosenzori cu fixare direct de anticorpi pe un traductor
piezoelectric sau poteniometric a fost explorat din anii 70. ns pavarea drumului spre
un succes comercial este realizat de Liedberg et al. [17] descriind aplicarea fenomenului
de rezonan a plasmonilor (SPR) pentru a monitoriza afinitatea reaciilor n timp real.
1987, MediSense (Cambridge, MA) introduce primul biosenzor pentru monitorizarea glucozei n regim ambulatoriu. BIAcore ( Pharmacia, Suedia), lansat n 1990
utilizeaz tehnologia SPR
Ferocenii ca mediatori n electrozii enzim, aplicaii n ambulatoriu, microminiaturizarea
n 1984, una din cele mai citate publicaii [18] anun un electrod enzim cu
utilizarea ferocenilor i a derivailor si ca un mediator de imobilizare pentru oxidoreductaz. Acest principiu st la baza electrozilor enzim lansat de MediSense
(Cambridge, USA) n 1987 ca un instrument de msur n form de creion pentru monitorizarea glucozei din snge a pacienilor n regim ambulatoriu. ntreaga sa electronic a
fost proiectat pe modelul de credit card n formatul unui mouse-computer. MediSense
a atins o cretere exponenial n vnzri (US$175 milioane) fiind ulterior adsorbit de
Abbott. Companiile Boehringer, Mannheim i Bayer au n prezent biosenzori cu mediatori deinnd 85% din totalul pieei internaionale. Interesant c cele trei companii dezvolt tehnologii pe baza fotometriei de reflexie convenionale pentru diagnosticul ambulatoriu. Jurnalele academice conin descrieri de largi varieti de dispozitive exploatnd
enzime, acizi nucleici, celule receptor, anticorpi, celule n combinaie cu traductori
electrochimici, optici, piezoelectrici i termici [19]. n cadrul oricrei permutri n tehnicile traductorilor alte mirade de posibiliti apar n concepte de proiectare ale senzorilor
rezolvnd diverse probleme din medicin [20], alimente i buturi [21], procese industriale [22], monitorizarea mediului [23], aprare i securitate (detecia drogurilor, explozivilor). Biosenzorii au nceput s fie folosii cu succes i n alte domenii dect cele
medicale de exemplu msurarea necesarului de oxigen biochimic, ce reprezint un indiciu
al prezenei materiilor organice din apa uzat.
Biosenzorul bazat pe drojdie, realizeaz o citire a rezultatelor n 30 minute fa de
5 zile pentru a obine rezultatele prin metode conventionale. Biosenzorii sunt folosii i
pentru a determina calitatea hranei i prospeimea ei. Cu mare succes sunt folosii n procesele industriale, pentru a determina compoziia chimic a materialelor. Aceste msurtori sunt importante n special n biotehnologie unde n mod curent nu se pot monitoriza
culturile de microorganisme procese de fermentaie ce produc proteine active i alte pro22

duse ca interferon sau insulina. O larg gam de aplicaii sunt cuprinse ntr-o serie de
monografii ce au condus la un important impuls al dezvoltrii biosenzorilor [24, 25, 26,
27 -34].
2.3.4 Referine

1 Theavenot Daniel R., Toth Klara,. Durst Richard A,. Wilson George S, Electrochemical
Biosensors: Recommended Definitions and Classification Pure Appl. Chem., Vol.
71, 12, pp. 2333-2348, (1999)
2.Turner, A.P.F., Karube, I. and Wilson, G.S. Biosensors: Fundamentals and Applications. Oxford University Press, Oxford. 770p. (1987)
3 Clark, L.C. Jnr. Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs 2, 41-48 (1956).
4 Clark L.C. and Lyons C., Ann. N.Y.Acad. Sci., 102, 29-45 (1962)
5 Updike, S.J. and Hicks, J.P. Nature 214, 986-988 (1967).
6 Guilbault, G.G. and Montalvo, J. JACS 91, 2164-2569 (1969).
7 Ho MYK, and Rechnitz GA, "An Introduction to Biosensors," in Immunochemical
Assays and Biosensor Technology for the 1990s, Nakamura RM, Kasahara Y, and
Rechnitz GA (eds), Washington, DC, American Society for Microbiology, pp 275290, (1992).
8 Rechnitz GA, Chem Eng News, 5:2436, (1988)
9 Vurek G. si Bowman R ,Scientific American, August pag 48 (1991).
10 Cooney, C.L., Weaver, J.C., Tannebaum, S.R., Faller, S.R., Shields, D.V. and Jahnke,
M. In: "Enzyme Engineering" (Eds. E.K. Pye and L.B. Wingard Jnr.) 2, 411-417.
Plenum, New York. (1974).
11 Mosbach, K. and Danielsson, B. Biochim. Biophys. Acta. 364, 140-145 (1974).
12 Divies, C. Annals of Microbiology 126A, 175-186 (1975).
13 Lubbers, D.W. and Opitz, N. Z. Naturforsch. C: Biosci. 30c, 532-533 (1975).
14 Voelkl, K.P., Opitz, N. and Lubbers, D.W. Fres. Z. Anal. Chem. 301, 162-163 (1980).
15 Clemens, A.H., Chang, P.H. and Myers, R.W. Proc. Journes Ann. de Diabetologie,
Paris (1976).
16 Shichiri, M., Kawamori, R., Yamaski, R., Hakai, Y. and Abe, H. Lancet, 1129-1131
(1982).
17 Liedberg, B., Nylander, C. and Lundstrm, I. Sensors and Actuators 4, 299-304 (1983).
18 Cass, A.E.G., Francis, D.G., Hill, H.A.O., Aston, W.J., Higgins, I.J., Plotkin, E.V.,
Scott, L.D.L. and Turner, A.P.F. Anal. Chem. 56, 667-671 (1984).
19 Turner, A.P.F. "Advances in Biosensors", I; II; Suppl. I; III. JAI Press, London, UK,
1991; 1992; 1993; (1995).
20 Alcock, S.J. and Turner, A.P.F. IEEE Engineering in Medicine and Biology,
June/July, 319 (1994).
21 Kress-Rogers, E. "Handbook of Biosensors and Electronic Noses: Medicine, Food and
the Environment", CRC Press, Boca Raton, USA, (1996).
23

22 White, S.F. and Turner, A.P.F. In: "Encyclopedia of Bioprocess Technology:


Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation"(Eds. M C Flickinger and S W
Drew). Wiley, New York, USA, (1997)
23 Dennison, M.J. and Turner, A.P.F. Biotechnol. Adv., 13, 1 (1999)
24 Kress-Rogers E, Handbook of Biosensors and Electronic Noses, Boca Raton, USA:
CRC Press (1997)
25 Scheller F, Schmid R D, Biosensors:Fundamentals, Technologies and Applications,
GBF-Monograph, vol 17, Germany, VCH, (1992)
26 Schmid R D, Scheller F, Biosensors Applicationsin Medicine, Environmental
protection and Process Control, GBF-Monograph, vol 13, Germany, VCH, (1989)
27 Wagner G, Guilbault G G, Food Biosensors Analysis, New York, USA, Marcel
Dekker Inc, (1994)
27. Cooper Jon M., Cass A. E. G., Cass Tony (Eds), Biosensors, Oxford Univ Press,
pp268 (2004)
28. Marc Lambrechts & Willy Sansen,(Eds) Biosensors, Taylor&Francis, pp360, (2006)
29. Stamatin Ioan Berlic C. Vaseashta A., Thin Solid Films 495,1-2 pp 312-315, (2006)
30 Vaseashta A, Gallios G, Miroslava Vaclavikova, Brumfield James, Vaseashta Sherri,
Ornprapa Pummakarnchana, Stamatin Ioan, Nanostructures in Environmental Pollution Detection, Monitoring, And Remediation, International Symposium on Nanotechnology in Environmental Protection and Pollution, ISNEPP2006, June 18 21, 2006 , The Hong Kong University of Science & Technology International
Conference Center, China (http://www.isnepp.org/)
31. Vaseashta A., Irudayaraj J., Vaseashta S., Stamatin I., Erdem A. Approach To An Interdisciplinary Bionanotechnology Education Program: International Network
Perspective, MRS-spring meeting 2006, symp KK, 0931-KK05-04, (2006)
32. Vaseashta A., Erdem A., Stamatin I., Nanobiomaterials For Controlled Release Of
Drugs & Vaccine Delivery, MRS-spring meeting, symp S Smart Nanotextiles,
MRS Proceedings Volume 920, 0920-S06-06 (2006)
33. Ciucu Anton, Biosensors For Environmental Monitoring. Ed Niculescu, Bucuresti,
pg. 352, (2000)
34. Ciucu Anton, Aplicaiile Analitice ale Biosenzorilor n Controlul Polurii Mediului,
Editura Ars Docendi, Bucureti, pg 175, (2000)

24

3.Stadiul dezvoltrii actuale n domeniul biosenzorilor

Componente i terminologie
Analit(A): Elementul necunoscut ce trebuie
determinat
Receptor(R): Molecula de biorecunoatere,
elementul biologic/ biochimic care interacioneaz cu analitul printr-o reacie specific.
Traductor: Elementul care detecteaz
semnalul de la interacia analit-receptor
Procesare de semnale: Preluarea de date
credibile, eliminarea zgomotului,
parametrizare.

Lanul de comand
Recunoaterea specific a analitului
Transducia- transformarea efectului
fizico-chimic a interaciei A-R ntr-un
semnal msurabil
Procesarea semnalului i amplificarea

Trstura unic a biosenzorului este aceea c ncorporeaz un element


biologic n proximitate sau este integrat cu traductorul de semnal pentru a
da un sistem de investigare specific pentru un analit int fra a fi necesar
reactivi suplimentari

25

26

3.1 Sisteme, arii de biosenzori, caracteristici de rspuns


Cinci arii cheie de dezvoltare a tiinei i tehnologiei sunt identificate ce au contribuit la facilitarea implementrii pe scar larg a biosenzorilor: sensibilitatea, selectivitatea, stabilitatea, sisteme integrate, paterningul (modelarea i multiplicarea ca arii de
senzori cu funciuni i aplicaii multiple). Vom descrie acestea n ordine invers lund n
considerare stadiul actual i metodele moderne de analiz a semnalelor rezultate din interacia analit-receptor conform cu figurile 2.1, 2.2, 2.3.
3.1.1 Sisteme integrate

Succesele notabile atinse cu senzorii individuali prin soluii pragmatice au implicat


dezvoltarea de sisteme care s integreze o gam larg i variat de senzori cu performane
optimizate i suportate de electronic i software sofisticate. n procesele de monitorizare
sistemele integrate au nglobat i multe elemente din fluidic i tehnologia separrilor/
fracionrilor. Unul din sistemele integrate cuprinznd modul rotaional aseptic de prelevare probe, sistem de injecie de fluide robotizat i electrozi reutilizabil formai prin
metoda ink-jet printing a fost descris n [1]. Sistemul conine electrod enzimatic cu GOX
imobilizat n gel iar detecia de ap oxigenat se realizeaz pe un electrod de carbon
rodinizat (acoperire cu Rh). Dei electrodul enzim are bune caracteristici de stabilitate i
eficien, problema monitorizrii i prelevrii automate de probe ntr-un sistem integrat
cere optimizarea de muli parametri datorit interferenelor reciproce. Exist o cerin
crescnd pe domenii specifice (mediu i analize medicale) de sisteme integrate ultraperformante care s funcioneze n condiii in vivo cum ar fi cele de dializ iar mai recent s
utilizeze biointerfee, tehnici evanescente, microscopie de fore atomice pentru a senza n
adncimea fenomenelor biologice (de exemplu identificarea i nelegerea interaciei proteinelor) [2]. Exploatarea in vivo a sistemelor de detecie att pentru glucoz i lactat a
fost confirmat prin eficacitatea utilizrii de copolimeri fosfolipidici i mbuntirea hemocompatibilitii [3]. Imunosenzorii ofer un alt exemplu pentru dezvoltarea de sisteme
integrate unde sunt nglobate microseparrile, metodele cromatografice, cuplaje electrochimice cu detectorii optici care n final conduc la un sistem miniaturizat. Sunt c-teva din
exemple prin care nivelul de integrare i miniaturizare devine din ce mai accen-tuat. n
seciunile urmtoare se va prezenta unele dintre exemple de tipul ADN-nanotub, sau
biocipuri-biointerfee care arat direciile de evoluie ale domeniului.
3.1.2 abloane

Succesul senzorilor analitici individuali a continuat dup cum s-a prezentat n seciunea anterioar cu sistemele integrate astzi larg utilizate n laboratoarele clinice medicale. Necesitatea integrrii i diversificrii parametrilor investigai impune crearea de arii
de senzori ntr-o singur unitate de msur. Astfel a aprut necesitatea realizrii de modele de senzori dispuse pe arii i geometrii sofisticate utiliznd tehnologii avansate de
fotolitografie, autoasamblare, ink-jet printing denumite tipare sau abloane (templates) ce
ndeplinesc o serie de funcii predeterminate.
27

Metoda de asamblare de arii de senzori cu funciuni diversificate dar specifice pentru un set ct mai larg de analii se numete ablonare sau simplu astzi prin termenul asimilat de patterning. Tipare sau abloane de senzori ofer meniuri relevante pentru locaii
i situaii specifice. Un exemplu n acest sens l constituie situaiile critice din medicina
ambulatorie. Clinicianul are la dispoziie instrumente portabile de la care poate obine informaii asupra concentraiilor a ase analii cheie din probele de snge: iar n seciile
medicale / spitale instrumentele pot msura pn la 4 parametrii. Aceste instrumente sunt
configurate pentru glucoz, lactat, uree, creatinin. Multiplicarea numrului de analii
pentru investigare necesit instrumente cu senzori cu un mare grad de miniaturizare, integrare pn la arii nanometrice. Aceste solicitri vin acum nu numai din domeniul medical, industria farmaceutic solicit intens senzori de evaluare medicamente produse n
regim de producie de serie cu nalt productivitate i care necesit analiza fiecrui produs
pentru anumite caracteristici bine precizate cum ar fi dozarea relativ la funciunea i rolul
lor n organism. Ariile de nanosanzori sunt preconizate a fi larg utilizate n condiii de
ambulatoriu i medicina de urgen unde trebuiesc identificai para-metrii fiziologici/
biochimici i stabilit medicaia de urgen. n prezent sunt dezvoltate tipuri de arii de
senzori optici utiliznd 12 canale de interferometre de tip Mach-Zhender [4] construite pe
1cm2 de siliciu cu 244 electrozi adresabili individual.
Tehnologia avansat ink-jet a dezvoltat metode de a analiza fracii de nanolitri pe o
suprafa de senzori tridimensional la o vitez de 6m/sec [5]. Este de ateptat ca n viitor
s se produc arii de 1 milion senzori/cm2 utiliznd fotolitografie, imprintarea prin contact
sau tehnici de autoasamblare, adsorpie/desorpie sub fascicul laser ce va permite s
scriem proteine pe suprafaa de analizat cu foarte mare precizie. Tehnici laser, MAPLE
(Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation) sau DW (direct writting) abordate pentru
imobilizarea materialelor biologice pe substraturi sunt nc n stadiul de laborator dar au
mari perspective de utilizare ca metode de imprintare molecular.
3.1.3 Sensibilitate

Fie c sunt senzori individuali, sisteme integrate sau arii de senzori toi sunt
caracterizai prin parametrii unici iar unul din acetia este sensibilitatea i limita de detecie pentru o gam de analii. Detecia de urme a diferiilor analii (indicatori, aditivi, contaminani) cu o suficient sensivitate i siguran sunt criteriile de baz a unui biosenzor
pentru a fi utilizat. Desigur astzi limita de detecie n laborator este mpins pn la un
atom atunci cnd este folosit microscopia de fore atomice. ns n cazul biosenzorilor
aceasta este pe departe dect un deziderat. De exemplu electrozii enzimatici, larg studiai
i continu perfecionai utilizeaz nc paleative cum ar fi concentrarea analitului de
interes ceea ce conduce la dificulti majore de proiectare i miniaturizare [6]. S-au raportat pe acest principiu microbiosenzori pentru vapori de fenol unde fenoloxidaza s-a imobilizat pe gel de glicerol cu o arie de electrozi interdigitizai [7].
Vaporii de fenol sunt direct partiionai n gel i oxidai la chinon. Amplificarea
semnalului pentru a obine o sensibilitate rezonabil s-a mbuntit prin amplificare
redox a cuplului chinon/catechol rezultnd o limit de detecie de 30 ppb fenol. Acest
28

principiu este fezabil a fi extins i la ali compui carbonici pn la limite de pri per trilion.
Limite de detecie ultrajoase pot fi atinse cu senzorii de afinitate cuplat cu detecia
electrochimic [8] pentru a obine dispozitive senzoriale performante.
Structurile ADN au fost studiate ca posibili receptori. Structuri sandwich de dispersii de cristal lichid i compleci ADN-polication au fost studiate cu relativ succes pentru identificarea a diferii analii [9]. Policationul cu rol de a menine integritatea structural a ADN-ului iar complecii formai de ADN-protamine permit detectarea hidrolitic a enzimei tripsin la limita de detecie de 10-14 M. Eliminarea policationului conduce
la creterea distanei dintre cele dou lanuri ADN rezultnd apariia unei benzi intense n
spectrul de dicroism circular ca urmare a modificrii texturii.
3.1.4 Stabilitate

Practic este cel mai mare dezavantaj al complexelor biologice-instabilitatea lor inerent. S-au abordat diferite strategii de a mbunti longevitatea i a prezerva structura
receptorilor biologici. Imobilizarea n matrici prin tehnica sol-gel n optode pentru senzorii de glucoz este una din strategii. n acest caz se utilizeaz doi indicatori de fluorescen: clorura hexahidratat de (2,2'-bipiridil) rutenium(II) i 1-hdroxipirene-3,6,8 acid
trisulfonic. Pe lng proprieti optice bune ale gelului s-a mbuntit i stabilitatea
enzimei GOX [10].Alte exemple cu succese limitate este cazul monooxigenazei utilizat
n detecia hidrocarbonilor; detecia halogenurilor organice cu metaloporfirine; tetraclorura de carbon, haloalchene (percloretilena) i insecticide (DDT) [11]
3.1.5 Selectivitate

mbuntirea selectivitii unui biosenzor poate fi abordat pe dou nivele: interfaare direct traductor-receptor biologic pentru reducerea interferenelor (figurile 2.12.4) i noi receptori cu afinitate mbuntit sau cu noi capaciti de afinitate. De notat c
selectivitatea este un parametru cheie care impune performanele unui senzor. Sunt cteva
strategii de mbuntire a acestui parametru.
Utilizarea mediatorilor pentru mbuntirea performanelor unui biosenzor amperometric a devenit o strategie comun. n [12] se descrie utilizarea pirolochinonei ca mediator ntr-un electrod enzim cu glucozoxidaz pentru msurarea glucozei din buturi.
Alternativ detecia electrocatalitic a produilor de reacie rezultai din reaciile enzimatice poate fi mbuntit prin electrozi modificai chimic ca de exemplu electrozi
rodinizai [13] sau electrozi de carbon modificai cu hexacianoferat [14]. De exemplu
folosirea albastrului de prusia pentru modificarea suprafeei electrodului la detecia amperometric a apei oxigenate la ambele poteniale de oxidare i reducere pentru electrodul
enzimatic n detecia lactatului [15] i a glucozei [14].
O soluie mult mai elegant este de a cuta centrii redox a enzimei via un fir molecular pentru a se realiza transferul de electroni spre electrod. n acest sens s-a publicat
mult despre enzime legate prin fire moleculare dar n general preocuprile s-au axat pe
mediatori imobilizai pe diferite lanuri polimerice. Firele moleculare sunt privite ca
intermediari n transferul de electroni pe distane lungi fiind alctuite din grupuri de dou
29

piridine legate de tiofene cu lungimi diferite (tienoviolagen). Firele de acest tip pot fi folosite n conjucie cu tehnici de autoasamblare pentru a produce un electrod izolat care
transfer electroni pe ci moleculare predeterminate [16]. Aceasta ar conduce la electrozi
enzimatici liberi de interferene electrochimice. Modelarea i proiectarea asistat de
calculator ne permite de a modela reaciile cu transfer de electroni, legarea receptorilor i
interaciile acestora cu o mare acuratee. Aceasta mbuntete nelegerea noastr a interfeei receptor/traductor permindu-ne astfel s dezvoltm noi tipuri de receptori cu selectivitate mare.
Pentru a obine liganzi mbuntii pentru utilizri n optosenzori cum ar fi glicohemoglobina (HbA1c), o nou peptid sintetic, aceasta a fost construit pe baz de
librrie combinatorial chemometric format din 1 milion L-amino acid hexapeptid pornind de la 10 aminoacizi [17]. Librria de hexapeptide a fost selectat si analizat n raport cu HbA1c, HbA1b, HbAF, HbA0, i gsii liganzii secvenai. Liganzii individuali
sau arii de liganzi n conjuncie cu tehnica de recunoatere a formelor sunt domenii ce vor
contribui la cresterea selectivitii i stabilitii.
3.1.6 Parametrii de caracterizare a semnalelor biosenzorilor

Paragrafele precedente au introdus calitativ parametrii de care depinde rspunsul


senzorilor n particular a biosenzorilor pentru a atinge performanele dorite. Interacia
analit-receptor este preluat de traductor i transformat ntr-un semnal fizic. Figura 3.1
prezint tipurile de semnale ce pot fi preluate de la suprafaa unui biosenzor ca rspuns al
interaciei A-R conform cu figurile 2.1-2.6. Semnalul fizic preluat de traductor este transmis spre lanul electronic de msur. Se observ din figura 3.1 c exist o varietate foarte
larg de mrimi ce pot fi colectai de la traductorii biosenzorilor i transformate n semnale fizice. Procesarea semnalelor n general este adaptat din tehnicile standard acumulate din tehnologia siliciului. Pentru msurarea parametrilor chimici i fizici ( mas,
concentraie, temperatur, indice refracie, cmp electromagnetic, cureni, poteniale etc)
ca rezultat al transferului interaciei A-R este necesar un traductor specific. Acesta este
interfaa transmiterii procesele fizice, chimice i biologice care le transform n semnale
spre procesare electronic, optic, stocare, comunicaii, integrare n sisteme web sau de
supra-veghere.
Orice interacie A-R implic un rspuns iar pentru fiecare set de valori rezult o
curb de rspuns specific. Curba de rspuns este un rspuns calibrat a unui senzor ca
funcie de msurandul respectiv aplicat la intrare (ceea ce rezult din interacia A-R).
Mrimea msurat poate fi de orice natur dar pentru cei mai muli biosenzori unde
interfaa este electrochimic sau electrooptic vom lua n considerare unul din parametrii:
rezistena electric R sau inversul ei conductana (G=1/R), frecvena (f)-mult utilizat n
fenomenele de rezonan; n cazul optosenzorilor, absorbana, deplasarea frecvenei, randamentul cuantic, etc.
Pentru fiecare biosenzor vor fi analizai aceti parametrii n paragrafele destinate
lor.

30

Figura 3.1 Tipuri de mrimi ce pot fi transformate de ctre traductori n semnale fizice
msurabile

Este recomandat conform normelor dezvoltate n micro i nanoelectronic s


utilizm urmtoarele notaii pentru rspunsul la ieire [18]:
G (conductan);
G/G0 (conductan relativ);
(G - G0) (conductan, variaia absolut);
(G - G0)/G0 (conductan, variaia relativ).
n cazul n care semnalul la ieire este frecvena, reprezentarea semnalului la ieire
este:
f (frecven);
f/f0 (frecven relativ);
(f - f0) (variaia absolut a frecven);
(f - f0)/f0 (frecven ,variaia relativ).
Pentru comunicaii i integrarea sistemelor senzoriale spre telemedicin, securitatea
i controlul de la distan a modificrilor mediului sau controlul degradrii mediului, n
lanul de msur trebuiesc introduse sensibilitile blocurilor electronice sau a altor
mrimi, figura 3.2

31

Figura3.2 - Schema unui senzor complex. M- mrimea rezultat din interacia (msurandul) A-R, Y1- semnalul electric obinut la traductor, Yi- semnalele rezultate din
lanul de msur. S-sensibilitile pentru fiecare verig din lanul de msur

Cu definiiile din figura 3.1 i 3.2 sensibilitatea, introdus calitativ n paragraful


3.1.3, capt semnificaii msurabile. Sensibilitatea, S, este definit ca derivata rspunsului ( ce este o funcie de punctul i momentul de msur) n raport cu msurandul M.
Pentru cazul conductanei G avem patru cazuri de definiie a sensibilitii:
dG
;
dM
d ( G/G 0 )
S=
;
dM
d ( G-G 0 )
S=
;
dM
S=

3. 1

Cazul ideal pentru care rspunsul senzorului este liniar expresia sensibilitii se
simplific, relaiile 3.1 lund forme uor prelucrabile i adaptabile la o larg serie de convertori analog digitali (ADC). n tabelul 3.1 sunt prezentate expresii des utilizate n evaluarea biosenzorilor n condiii de offset nul. Pentru ali parametrii msurabili de un biosenzor cum ar fi frecvena sau absorbana expresiile din tabela 3.1 se modific doar prin
nlocuirea mrimii msurate de traductor.

32

Tabela 3.1- Expresii ale sensibilitii pentru biosenzori cu rspuns liniar


n conductn electric
Rspuns liniar pe poriuni a curbei
Rspuns liniar cu offset nul
de rspuns
G
G
S=
;
S= ;
M
M
( G G0 )
G G0
S=
;
S=
;
M
M
( G G0 ) / G0
( G G0 ) / G0 ;
S=
S=
;
M
M

Cu referire la figura 3.2 se observ c introducerea n lanul de msur a o serie de


componente electronice acestea la rndul lor contribuie cu sensibilitatea i nivelul de amplificare specific. Propagarea sensivittii n lanul de msur se descrie simplu ca un produs de sensibiliti.
dY1
S interna;
dM
dY
S T = 2 S traductor;
dY1
Si =

SA =

dY3
S- amplificator (I,V,G,R,etc);
dY2

SF =

dY4
S- filtru;
dY3

S A/ D =

3. 2

dYies
S- convertor analog-digital;
dY4

Sensibilitatea general a biosenzorului se estimeaz astfel:


S=

dYies dY1 dY2 dY3 dY4 dYies


=

dM dM dY1 dY2 dY3 dY4

3. 3

= Ai AT AA AF AA/D

Unele din aceste definiii se vor utiliza pentru cazuri specifice de clase de biosenzori.
3.1.7 Zgomot, rezoluie, drift

Zgomotul este un factor important ce afecteaz sensibilitatea, selectivitatea i


rezoluia biosenzorilor. n situaii practice sunt prezente diferite tipuri de zgomote care
sunt legate de modul de operare sau de punctul de msurare a biosenzorului: zgomote
termice, electrochimice, de contact electric, fluctuaii, generare-recombinare sarcini electrice, bariere de potenial aleatorii. Toate aceste tipuri de zgomote nu sunt generate simultan ntr-un biosenzor, ele sunt dependente de natura interaciei A-R i de lanul de m33

sur n care este integrat traductorul. Orice tip de zgomot este caracterizat prin densitatea
spectral i descris printr-o funcie S(f) ce reprezint ptratul tensiunii de zgomot la o
frecven dat.
Pentru un domeniu de msur unde se realizeaz nregistrarea semnalului i pe o
gam de frecvene de interes (f1-f2) unde se manifest zgomotul atunci se estimeaz valoarea medie a ptratului tensiunii de ieire:
f2

V 2 = s( f )df
f1

cu
s( f ) = 4kTR, pentru zgomot termic
s( f ) = 2qI , pentru acumulari/descarcari
spontane de sarcina

3. 4

s(f)=kV 2 / f , 1; pentru fluctuatii de sarcina


k1k2
s(f)=
pentru generare-recombinare sarcini
1 + w2 2

parametrii reprezentnd caracteristicile fiecrui proces ce produce un anumit tip de zgomot: k-constanta Boltzman, q-sarcina electric, I-curent, R-rezistena electric, V-tensiunea de zgomot, - timp de recombinare
Rezoluia este definit ca fiind cantitatea de msurand care produce un semnal de
zgomot pentru o tensiune de ieire. Definiia rezoluiei se exprim:
R=

tensiune zgomot
S

3. 5

unde S este definit n 3.2. Se observ c senzorii cu sensibiliti mai mari ce produc zgomote egale reprezint o soluie practic important. n practic relaia 3.5 se reconsider
acceptnd zgomote de 3, 6, 9 ori mai mari fa de relaia de evaluare teoretic 3.5.
Aceasta este n funcie de nivelul de precizie al msurtorilor ce trebuie realizate cu
un senzor.
Driftul reprezin deplasri fluctuante, nepredictibile, a semnalului la ieire. Nu are
semnificaie statistic. Prezena sa poate fi redus printr-un design adecvat al componentelor biosenzorului. Driftul se accentueaz pe msura mbtrnirii componentelor
biosenzorului. Analize detaliate asupra rolului acestor parametrii se pot gsi n diferite referine specifice microtehnologiei semiconductorilor. Particular pentru senzori i biosenzori se pot consulta [19, 20,21, 22].

3.2 Componentele biologice ale biosenzorilor


n capitolul 2 s-a prezentat evoluia noiunii de senzor cu o larg extindere spre
inter i transdisciplinaritatea domeniului. n aceast seciune se vor descrie succint componentele biologice ale biosenzorului ca element activ imobilizat pe membran (fig 2.3)
i proprietile specifice cerute n contextul general al parametrilor de caracterizare i
componentelor sale. Dei aceast parte este bine dezvoltat n domeniul tiinelor vieii
34

iar celelalte componente constituie arsenalul micro i nanotehnologiilor considerm oportun o succint prezentare a elementelor necesare pentru dezvoltarea conceptelor ulterioare.
Vom accepta ca o definiie general: un senzor ideal este un dispozitiv care va
detecta un analit, inta supus analizei i care este prezent ntr-o prob dat. Majoritatea probelor conin i ali analii care pot interfera cu rspunsul biosenzorului. Acesta
trebuie s posede o selectivitate specific pentru a identifica analitul int. Prin urmare
este necesar s se proiecteze biosenzori cu selectivitate pentru un analit cu capacitatea
de discriminare a interferenelor produse de ceilalali componeni din proba analizat.
Capacitatea de identificare i selectivitate specific reprezint componenta cheie a
recunoaterii moleculare.
Recunoaterea molecular se realizeaz prin componenta din senzor format din o
molecul gazd (de exemplu, host-chemoreceptor) ce se leag selectiv cu analitul
(guest) int (molecula/ complexul molecular oaspete) ce necesit a fi identificat.
Pentru fiecare sistem host-guest (gazd-oaspete) ntotdeauna exist o reacie chimic specific din multitudinea canalelor de reacie posibile. Cnd ansamblul host-guestreacie specific a fost identificat atunci molecula gazd se imobilizeaz sau ncorporeaz n senzor, de regul pe o membran ce interfaeaz traductorul sau un electrod de contact. n final, trebuie gsit un mod de a semnala c evenimentul de legare/ recunoatere a
avut loc (transducia spre traductor). Figura 2.3 schieaz toate aceste aspecte ntr-un concept unitar
3.2.1 Principiile recunoaterii moleculare

Una din cerinele cheie pentru recunoaterea molecular este existena gruprilor
sau de centrii cu reactivitate specific din molecula gazd care pot nchide sau lega
ioni, atomi, molecule, biomolecule. Exemple pentru acest fel de sisteme gazd-oaspete cu
capaciti de recunoatere pot fi vzute n procesele din viaa cotidian. Toate organismele vii folosesc enzime, care sunt proteine ce conin buzunare, centre active, proiectate s recunoasc un analit specific. Acest lucru nseamn c numai un analit specific
este capabil s intre n buzunarul enzimei.
Enzimele pot fi folosite n biosenzori ca elemente receptoare gazd cu capacitate de
recunoatere molecular, dar sunt n general instabile[23,24].
Este astfel necesar s se sintetizeze clase noi de macromolecule/ biomolecule care
sunt capabile s joace rolul de molecule gazd-receptoare. Pentru a proiecta molecule
gazd ce pot fi folosite ntr-un biosenzor sunt luate n considerare urmtoarele criterii:
Molecula gazd trebuie sa fie stabil la condiiile n care va fi folosit
Trebuie sa fie capabil s lege selectiv analitul din prob
Trebuie sa fie capabil s fie imobilizat ntr-un film/membrana care este n
contact cu proba.
Trebuie s semnaleze c un eveniment de legare gazd-oaspete a avut loc
n mod ideal trebuie s elibereze analitul dup detectare astfel nct gazda s
fie liber pentru a fi reutilizabil.
35

Receptori Sintetici

Receptorii biologici includ: anticorpi, receptori membranari, enzime, ribozomi,


lectine etc. Ei leag analiii utliznd mecanisme de recunoatere molecular de tipul
"lock-and-key" (cheie-lact, identificare-imobilizare), figura 3.3.
Receptorii biologici n general nu sunt soluii practice pentru multe aplicaii
deoarece specificitatea, sensibilitatea i stabilitatea nu pot fi optimizate. Receptorii artificiali sunt medii de imobilizare care pot fi optimizai prin proiectare molecular pentru
orice tip de aplicaie.
Figura 3.3 arat pe un model generat c numai un tip de receptor are specificitate i
reacioneaz la un analit-protein, ceilali rmn neutri.
Proiectarea i sinteza receptorilor sintetici se bazeaz pe instrumentele dezvoltate
de proteomic i ingineria genetic producnd componente de recunoatere ce pot rspunde la apariia
i identificarea unor boli necunoscute, n bioterorism, la dezvoltarea de medicamente anticancer,
antivirale, kituri de testare rapid, diagnostice clinice i veterinare.
n prezent se dezvolt platforme i arii de receptori artificiali fundamentate pe tehnici de matematic combinatorial, biologia interfeei, chimia
suprafeelor. Acestea au indus dezvoltarea de diverse medii de receptori artificiali cu capacitate de
selecie rapid i diversificat pentru orice analit Figura 3.3- Model, generat de computer, program Accelrys
int.
Developer Studio. Numai un
Tehnica actual de producere a receptorilor
tip de receptor identific
sintetici se numete CARA- combinatorial array of
proteina din analit, model lockreceptor analysis. Se vor prezenta cteva exemple de
and-key, tehnica CARA
recunoatere molecular pe structuri relativ simple
de receptori sintetici, macrocicluri cu capacitate de
imobilizare i identificare pentru ioni metalici. Aceste exemple vor crea o baz mai profund de a nelege mecanismele implicate n biosenzori cu enzime, anticorpi, celule etc.,
unde joac un rol important de sisteme receptor. Chimia supramolecular a dezvoltat o
gam variat de macrocicluri [25, 26, 27] cu rol de receptori sintetici. n figura 3.4 sunt
descrise clase variate de macrocicluri. Cea mai comun caracteristic pentru clasele de
macrocicluri este c ele conin caviti ce se comport ca buzunare gazd pentru moleculele oaspete. Selectivitatea gazdelor poate fi realizat n modul de citire prin variaia
mrimii cavitilor preformate.
De exemplu, 12-crown-4 are o cavitate mic ideal pentru legarea ionilor mici cum
ar fi Li+, n timp ce18-crown-6 are o cavitate mare care se potriveste mai bine ionilor mai
mari cum ar fi K+. Este evident c mrimea cavitilor este important pentru selectivitatea gazdei, dar rmne ntrebarea ce anume atrage un ion sau molecul ntr-o cavitate
preformat i ce factori stabilizeaz complexul gazd-oaspete [28].
36

n enzime, interaciile necovalente slabe (legtura de hidrogen, electrostatic,


dipol-dipol, van der Waals, -) sunt folosite s lege oaspetele n buzunarul enzimei.
Aceste interacii stabilizeaz interacia gazd -oaspete. Macrociclurile descrise n
figura 3.4 conin functionaliti polare care sunt capabile de interacie cu oaspeii prin
legtura de hidrogen, interacii electrostatice i interacii dipol-dipol. Este de asemenea de
dorit ca legarea din cavitate s nu fie prea puternic, pentru c este important ca analitul,
oaspetele, s fie eliberat din gazd dup ce a fost detectat i msurat. Eterii crown i
calixarenele sunt ideali pentru legarea cationilor metalici, lucru bazat pe mrimea cavitii
lor dar i pe densitatea mare de electroni prezent pe atomii de oxigen din cavitate.

Figura 3.4- Clase de macrocicluri cu caviti de diametre diferite i reactiviti specifice

n figura 3.5 este prezentat structura tetraetilestercalix[4]arena. Acest compus a


fost preparat din macrociclul de baz calix[4]arena prezentat n figura 3.4. Dei compusul de baz leag selectiv Li+ fa de ali cationi metalici [29, 30, 31], versiunea modificat a mocrociclului de baz are o selectivitate foarte bun pentru Na+. Astfel prin modificare sintetic este posibil s se mreasc capacitatea cavitii gazdei i pot fi introduse
funcionaliti noi care vor favoriza legarea unor molecule i ioni specifici. Alt exemplu
de calixarene modificate, care demonstreaz mai mult acest principiu, este grupul de
tetrafosfinoxid de calix[4]arena (figura 3.5).

37

Tetraetilestercalix[4]arena

Tetrafosfin oxid de calix[4]arena

Figura 3.5-Cavitatea tetraetilesterului este selectiv pentru sodiu n timp ce cavitatea


oxidului tetrafosfinic este selectiv la calciu

Schimbnd grupurile de legare asupra aceluiai ablon calix[4]arene din esteri n


oxizi de hidrogen fosforat, se schimb selectivitatea de la Na+ la Ca2+. Mrind numrul de
uniti repetabile n esteri i oxizi de hidrogen fosforat la ase, crete capacitatea cavitii
iar selectivitatea se schimb n favoarea cationilor mai mari cum ar fi Cs+ si respectiv
Pb2+.
Acest tip de senzori a fost folosit la detectarea cationilor metalici de interes biomedical i pentru mediul nconjurtor. Unii compui gazd au fost dezvoltai de asemenea
pentru detectarea selectiv a moleculelor neutre mici fr sarcin. S-a decoperit c structurile de calixarene au aplicaie larg n acest domeniu [5,6]. Un exemplu implic folosirea amidei de tetra-(S-propanol) calix[4]arena ce conine patru jumti chirale laterale
pentru diferenierea selectiv dintre enantiomerii de fenilalanilol. Structura acesteia este
prezentat n figura 3.6
Alte tehnici ale chimiei supramoleculare pot fi angajate n sinteza de receptori sintetici ce simuleaz proprietile enzimelor. Amintim structuri de baz ce pot fi modificate: porfirinele, polimerii semiconductori din clasa tetrahialofulvenelor, poliacene, PPV
(poliparafenilvinilidene). Alte abloane pot fi considerate polizaharidele modificate. Un
arhetip liniar sunt polianilinele ce conin cele dou tipuri de stri redox

38

Figura 3.6-Model, vedere lateral, a complexului format de S-fenilalanilol i


amida de S-propanalol calix[4]arena (model generat cu MacroModel v
6.0

Bazele moleculare ale interaciunii Ag-Ac

Dintre multiplele clasificri ale biosenzorilor cei de bioafinitate au o larg gam de


aplicaii iar interaciunile antigen-anticorpi (Ag-Ac) joac un rol important i din ce mai
mult sunt considerate un important instrument n dezvoltarea principiilor de recunoatere
molecular. Prezentm n continuare noiunile strict legate de biosenzori.
Interaciunile Ag-Ac, in vivo sunt ntotdeauna reversibile. Factorii care condiioneaz interaciunea Ag-Ac sunt:
Complementaritatea structural dintre determinantul antigenic i situsul de
combinare al anticorpului. Acesta este factorul exclusiv al specificitii reaciei. Complementaritatea structural presupune adaptarea conformaional a
celor dou grupri reactante i a fost gndit n termeni structurali, pe principiul cheie-lact similar cu mecanismul descris anterior
Complementaritatea chimic a gruprilor reactante este consecina complementaritii structurale i semnific intrarea n aciune a unor fore intermoleculare care stabilizeaz i consolideaz interaciunea celor dou grupri.
Formarea legturilor intermoleculare necesit existena unor grupri atomice
suficient de apropiate pe cele dou molecule. Distana dintre ele este invers
proporional gradului de complementaritate.
Dei complementaritatea structural nu este strict obligatorie, o potrivire spaial
ct mai nalt este mai favorabil interaciunii. Ea se exprim prin congruena suprafeelor
de contact care furnizeaz fore de atracie intermolecular ce stabilizeaz complexul.
39

La interaciunea Ag-Ac particip urmtoarele tipuri de legturi necovalente:


legturile de H, forele electrostatice, legturi van der Waals i legturi hidrofobe. Toate
sunt fore nespecifice cu valoare mic i natura lor face ca reacia s fie reversibil.(figura
3.7)

Figura 3.7- Interacii specifice Ag-Ac

Legturile de H se formeaz cnd doi atomi au n comun un nucleu atomic de H (un


proton). Protonul comun se gsete ntre doi atomi de N sau de O sau ntre unul de N i
unul de O. Nucleul de H este legat covalent de unul dintre cei doi atomi (de N sau de O).
Legtura de H are energia de legare de 3-7 kcal/mol.
Forele intermoleculare implicate n formarea complexului Ag-Ac. Aciunea acestor fore necesit un contact strns ntre cele dou grupri reactante.
Legturile de H rezult prin formarea unei puni de H ntre doi atomi apropiai.
Forele electrostatice se datoreaz atraciei grupelor ionice cu sarcini opuse situate
la periferia celor dou lanuri proteice.
Forele Van der Waals rezult prin interaciunea ntre diferii nori electronici, reprezentai sub forma dipolilor oscilani. Legturile van der Waals, cele mai slabe fore de
interaciune, sunt active pe distane foarte mici dintre gruprile reactante. Energia de legare este de 1-2 kcal/mol.
Legturile Van der Waals nu se bazeaz pe o separare permanent a sarcinilor electrice, ci pe fluctuaii ale acestora, induse de apropierea moleculelor. La o distan intermolecular limit se formeaz cmpuri electrice instantanee, cu efect polarizant asupra
moleculelor nvecinate.
ntre atomii suficient de apropiai, apare o for de atracie reciproc indus de sarcina dipol fluctuant, pe care un dipol o induce n dipolul nvecinat. Aceste fore se mai
numesc i fore de dispersie. Intensitatea lor depinde de distana dintre gruprile implicate
i este invers proporional cu puterea a 7-a a distanei. Valoarea lor este optim la 1-2 .
40

Legturile hidrofobe, care pot contribui cu jumtate din fora de legare Ag-Ac, sunt
produse prin asociaia gruprilor nepolare i hidrofobe, de unde moleculele de ap sunt
excluse. Distana optim dintre gruprile reactive variaz cu tipul de legtur.
Forele electrostatice (coulombiene sau ionice) sunt rezultatul atraciei dintre atomi
sau dintre grupe de atomi cu sarcin electric opus, situate pe cele dou grupri reactante: de exemplu, ntre un cation (Na+) i un anion (Cl-) sau ntre COO- i NH3+.
Energia de legare a acestor fore este semnificativ la distane foarte mici (sub 100
) dintre gruprile reactante. Juxtapunerea exact a ionilor favorizeaz aciunea acestor
fore. Energia de legare este de 5 kcal/mol i variaz invers proporional cu ptratul distanei dintre cele dou grupri reactante (1/d2).
Legturile hidrofobe (sau apolare) apar ntre grupri nepolare (neionizate) n soluii
apoase i sunt consecina tendinei de excludere a reelei ordonate de molecule de ap,
dintre molecula de antigen i cea de anticorp. Aceste legturi sunt favorizate de aminoacizii cu grupri apolare, care au tendina de asociere, diminund numrul moleculelor de
ap din vecintatea lor. Prin eliminarea moleculelor de ap dintre gruprile reactante,
distana dintre situsurile active scade foarte mult i crete valoarea forelor stabilizatoare.
Complementaritatea spaial sau forele intermoleculare nu sunt, fiecare n parte,
suficiente pentru a forma legturi stabile. Pentru stabilitatea interaciunii Ag-Ac sunt
necesare ambele condiii. Cu ct energia de legare a reactanilor este mai mare, cu att
complexele Ag-Ac sunt mai stabile.
Interaciunea gruprilor reactante ale antigenului i anticorpului este definit de doi
parametri: afinitatea i aviditatea anticorpilor.
Msurarea afinitii anticorpilor se poate realiza prin dializa la echilibru (figura
3.8). Interaciunea Ag-Ac este reversibil. n interiorul sacului de dializ, haptena este
parial sub form liber i parial legat cu anticorpii, n funcie de afinitatea anticorpilor. Prin membrana sacului de
dializ poate difuza numai haptena liber i concentraia sa extern va egala concentraia haptenei libere din interiorul sacului. Msurarea concentraiei haptenei n sacul de dializ permite calculul cantitii de hapten legat de anticorpi.
Renoirea constant a tamponului duce la disocierea
total i la pierderea haptenei din sacul de dializ, ceea ce denot natura reversibil a legturii Ag-Ac [32].
Afinitatea anticorpilor msoar fora de legare dintre un
determinant antigenic i situsul complementar de legare la un
anticorp specific. Afinitatea este rezultanta forelor de atracie Figura 3.8-aranjament
experimental pentru
i de respingere care mediaz interaciunea celor doi reactani.
msurarea prin
Tria acestor interaciuni se msoar n reacia dintre un
dializ a
interaciunii Ag-Ac
antigen monovalent ( haptene) cu anticorpii specifici. O interaciune cu afinitate nalt presupune structuri complementare
perfecte n timp ce complementaritatea imperfect a gruprilor reactante determin o
afinitate sczut, deoarece forele de atracie sunt active numai pe distane foarte mici i
41

sunt diminuate de forele de respingere. Complexele Ag-Ac formate de anticorpi cu afinitate mic, persist n circulaie i se depun pe membrana bazal a glomerulilor renali.
Complexele formate de anticorpii cu afinitate mare se elimin rapid din circulaie,
fr efecte defavorabile asupra funciei renale.
Interaciunea Ag-Ac este caracterizat permanent prin formarea i anularea diferitelor tipuri de legturi intermoleculare. In vivo, probabil toate reaciile Ag-Ac sunt
reversibile, dar reaciile secundare, in vitro (aglutinarea, precipitarea), n condiiile echilibrului reactanilor, sunt ireversibile.
3.2.2 Imobilizarea moleculelor gazd

O dat ce un compus receptor a fost dzvoltat pentru identificarea unui analit specific este necesar ca acesta s fie imobilizat n dispozitivul senzorial. Cea mai folosit
metod este incorporarea moleculei gazd n membrane flexibile de polimeri fixate pe suprafaa senzorului. Majoritatea membranelor sunt formate fie turnate din soluie de polimeri sau polimeri plastifiai i preformai n filme subiri. Polimerii utilizai sunt n
general solubli n solveni organici uzuali. Este esenial ca receptorul-molecula gazd s
fie solubil ntr-o varietate de solveni organici. Aceasta se obine prin introducerea de
grupri lipofile cum ar fi t-butil n calixarene.
Problemele acestor metode de imobilizare apar cnd membranale intr n contact cu
proba (care este de obicei apoas). S-a constatat c moleculele gazd se filtreaz n timp
din membrane micornd astfel perioada de via a senzorului.
O modalitate de a evita aceast problem este s se lege covalent molecula gazd n
polimerul membranei. Aceast abordare poate fi destul de greoaie din punct de vedere
sintetic pentru c trebuie ncorporate unitile reactive in molecula gazd, care poate
afecta selectivitatea. n cazul n care gruprile reactive au fost introduse n molecul
acestea pot fi folosite s lege covalent gazda n polimeri i la suprafeele substratului (de
exemplu silice) cu cuplare simultan la electrod (platina). Detalii asupra tehnicilor de
imobilizare sunt descrise n [33].
Alte tehnici de imobilizare abordate n prezent sunt: ink-jet printing, polimerizrile
n plasm, transport electroforetic, electro-polimerizrile, fiecare cu avantaje specifice.
3.2.3 Transducia semnalului

Aa cum a fost menionat anterior, este esenial ca evenimentul de legare dintre


gazd i oaspete (interaciunea receptor-analit, R-A) s fie detectat. Este astfel necesar s
fie disponibil un mod de identificare i transducie a semnalului provenit de la evenimentul interaciei receptor-analit spre exterior pentru a fi prelucrat sau procesat. Acesta
este n termen general definit ca traductor. Prin urmare traductorul trebuie s fie n contact intim cu receptorul sau membrana ce a imobilizat receptorul.
Electrozii, interaciile interfaciale sunt determinante n captarea semnalului de la o
interacie R-A i transformarea acestuia n semnal electric sau fotonic. Exist diverse moduri de identificare a evenimentului R-A, colectare de semnal i transducia lui spre exterior ca semnal electric. Modul de identificare a semnalelor i de transducie a acestora
definete tipul de biosenzor. De exemplu dac interacia R-A este identificat prin metode
42

electrochimice atunci biosenzorul se va numi Biosenzor electrochimic. Aceasta semnific imobilizarea receptorului pe un traductor electrochimic care msoar un curent ( metoda amperometric) sau o tensiune (poteniometric) ntre doi electrozi.
Dac R este imobilizat pe un component optic atunci vom defini biosenzorii optici.
( cu fibr optic, de fluorescen, de absorbie, de rezonan plas-monic -SPR).
Aceste metode de msurare i transducie a semnalului induce i clasificarea biosenzorilor ce va fi prezentat n detaliu n capitolele urmtoare. n continuare se va prezenta cteva din aspectele generale legate de metodele de ncorporare a elementului de
transducie n gazd (elementul receptor). Pentru detecie,
la majoritatea biosenzorilor electrochimici, este necesar
ca membranele ce conin molecula gazd s fie plasate pe
o suprafa a unui electrod care la legarea oaspetelui conduce la un rspuns electrochimic (figura 2.2, 2.3). Aceast abordare funcioneaz foarte bine cnd analiii int
sunt specii ncrcate cum ar fi cationii metalici.
Din pcate moleculele neutre nu pot fi detectate din
punct de vedere al transduciei electrochimice. Pentru a evita aceast problem s-au folosit cu succes metodele optice de detectare. De exemplu o gazd chiral n calixarene ce conine uniti de naftil, fluorescente. La legarea
cu oaspetele are loc atenuarea fluorescenei ca rezultat al
interaciei dintre grupurile naftilfenil din gazd respectiv Figura 3.9- Calixaren
fluorescent, gruprile
analit. Atenuarea fluorescenei este propor-ional cu conpirenice ataate sunt
centraia de analit. Metodele optice sunt deseori folosite
suficient de libere pentru a
pentru c ele ofer o sensibilitate mai mare dect tehnicile
permite atenuarea
fluorescenei la legarea
electrochimice O calixaren ce prezint fluorescen la leNa+.[29]
garea cu un analit este prezentat in figura 3.9 [34]. n absena analitului oaspete acest compus nu prezint fluorescen pentru c substituentul pirenic nu poate veni n contact cu substituentul nitrofenil
invecinat (iar atenuarea fluorescenei are loc datorit interaciei lor). Totui n prezena
ionilor Na+ este observat fluorescena, pentru c ionul Na+ intr n cavitate i se leag cu
oxigenii din gruprile fenoxi i carbonil din gazd.
Aceast legare induce o conformaie mai rigid ndeprtnd gruprile de nitrofenil
de pirene prevenind atenuarea fluorescenei.
3.2.4 Tipuri de componente biologice

Din cele prezentate anterior rezult c biosenzorul este un sistem de analiz,


bioelectronic care combin un traductor cu un component biologic ce se afl ntr-o interdependen specific. Biosenzorii utilizeaz sisteme biologice cu diferite nivele de recunoatere ale substanelor ce vor fi determinate. Primul pas n aceast interacie este formarea complexului specific al substanei biologic active, imobilizate, R (receptorul, substratul cu componenta biologic senzitiv) cu analitul A ( definit adeseori ca semnalul
chimic). n tabelul 3.2 sunt prezentate succint scheme specifice dup care este conceput
43

un biosenzor n relaie cu natura receptorului i a semnalului chimic/ biochimic. Se constat c exist dou clase generale de biosenzori care sunt bazai pe rspunsul datorit
bioafinitii dintre R cu A ce modific distribuia de sarcini electrice ce poate fi msurat
cu traductori specifici, fie de consumarea substratului printr-o reacie specific a acestuia.
Tabela 3.2- Clasificare biosenzori dup acticvitatea biologic
2. Biosenzori metabolici
1.Biosenzori de bioafinitate

A + R AR

Modificarea densitatii electronilor


Receptorul R
1.
2.
3.
4.
5.

Colorant
Lectina
Apoenzima
Anticorp
Sistem de trans-port

Semnalul chimic A
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Proteine
Zaharide
Glicoproteine
Substrat Inhibitor
Grup Prostetic
Antigen
Hormon
Substrat Analog.

A + R AR P + R

Consumarea substratului si formarea produsului


Receptorul R
1. Enzime
2. Microrganisme
3. Microbi
4. Tesut Striat

Raspunsul chimic A
1.
2.
3.
4.
5.

Substrat
Cofactor
Inhibitor
Activator
Activitatea enzimei

Componenta biologic din care este alctuit elementul de recunoatere molecular


(R) este reprezentat prin diferite specii active ce pot fi: enzime sau sisteme enzimatice,
anticorpi (Ab) sau antigeni (Ag), receptori, populaii de bacterii sau celule eucariote, fragmente de esuturi, uneori chiar celule embrionare. Analiii sau substanele ce pot fi analizate (A) sunt: glucoza sau alte zaharuri, aminoacizi, alcooli, lipide, nucleotide. Ei pot fi
identificai prin interacia lor specific sau poate fi masurat concentraia lor prin diverse
metode. Att R ct i A reprezint specii moleculare distincte, cu nalt specializare macromolecular (anticorpi, antigene, enzime, receptori, etc), sau sunt sisteme complexe
(celule, esuturi, chisturi de protozoare, ou de parazii intestinali).
Din cele prezentate mai sus i din tabela 3.2 observm c biosenzorii se pot
clasifica n general n dou grupe dup componenta biologic. Senzori catalitici ce utilizeaz enzime, microorganisme sau celule pentru a cataliza o reacie cu o substan int.
Senzorii de afinitate ce utilizeaz anticorpi, receptori i acizi nucleici ce se leag de
o substan int. Reaciile sunt cuantificate prin traductori electrochimici, optici, evanesceni etc
Dup componenta biologic activ ei pot fi subclasificai dup cum urmeaz:
1. Biosenzorul enzimatic. Enzimele sunt proteine cu nalt energie, caracterizate
prin funcia lor catalitic. Moleculele de substrat modificate conduc la reacii de oxidare,
reducere, hidroliz, ce pot fi msurate cu ajutorul biosenzorului enzimatic. Biosenzorul
enzimatic produce un rspuns linear in funcie de concentraia substratului.
2. Imunosenzorul. Anticorpii sunt glicoproteine produse de sistemul imunitar la
intervenia unui substane din exterior, antigenul. Teoretic este posibil producerea de
anticorpi i fr s se identifice un antigen. Imunosenzorul este un senzor de mare sensibilitate. Principiul de funcionare se bazeaz pe interaciunea Ag-Ac, descris la paragraful anterior, de recunoatere molecular (3.2.1)
44

3. Biosenzorul cu receptori
Normalitatea proceselor biologice este asigurat de procese moleculare de sensibilitate mare bazate pe specializarea unor proteine structurale, numite receptori capabile de
a recunoate un numr de semnale fiziologice. Este i cazul neurotransmitorilor, a cror
aciune este mediat prin prezena unor receptori n membrana plasmatic, n situsuri sau
inte celulare. n acest caz activarea situsului biologic activ se face prin canalele ionice.
Receptorul pentru acetilcolina este primul receptor cunoscut n feno-menele de
neurotransmisie.(Un excelent studiu a fost prezentat de Costa M, Department of
Physiology and Centre of Neuroscience, School of Medicine, Flinders University,
Adelaide Australia, NATO-ASI,Il Ciocco,Italy Biosensors 2005, Advances In Sensors;
The Lessons From Neurosciences). Acest domeniu este n stadiu de laborator cu
rezultate notabile [35, 36,37, 38, 39, 40, 41,42 ,43, 44, 45, 46]
4. Biosenzorul bazat pe celule sau esuturi
Msurarea speciilor moleculare n acest caz nu se rezum la interacia cu compuii
de analizat, transformrile ce au loc pot fi msurate ca produi rezultai. Este de dorit s
se opereze cu populaii de celule a cror ci metabolice principale s fie cunoscute. Un relevant exemplu este oferit de de biosenzorul L-arginina, care asociaz populaii de celule
bacteriene de Streptococcus faecium n combinaie cu un electrod pentru amoniac.
Arginina este metabolizat de microorganisme, dup schema din figura 3.10 [47 ]

Figura 3.10-Mecanismele pentru transformarea L-argininei prin intermediul Streptococcus faecium

Este dificil de obinut asemenea complexe de reacii n afara structurilor celulare.


Asemntor cu utilizarea populaiilor celulare ca elemente senzitive se pot folosi fragmente sau pri de esuturi, vegetale sau animale. n acest caz, avantajul este mai mare,
deoarece nu se fac eforturi suplimentare pentru meninerea celulelor viabile, ntr-un aranjament natural. Pentru biosenzorul de adenozin a fost propus un element biosenzitiv
tisular, obinut din mucoasa intestinului subire de la un soarece. Pentru biosenzorul de
dopamina, specialistii s-au orientat la pulpa fructului de banana, avnd in vedere c aceasta are proprietati biocatalitice remarcabile.
5. Biosenzori cu proteine redox. Proteinele redox sunt implicate n procese biochimice precum respiria celular i reaciile caracteristice sistemului de fotosintez.
Principalele tipuri de proteine redox implicate i cunoscute sunt:
1. CITOCROMII, conin ionii de fier n grupul prostetic, iar citocromul c
este implicat n transferul de electroni n mitocondrie.
45

2. FEREDOXINELE, conin ioni de fier i sulf, n combinaii dimerice ale


cloroplastelor (2Fe-2S) feredoxina i combinaii tetramerice din feredoxina
bacterian 2 (2Fe- 2S), implicate n procesele de fotosintez i respectiv de
transferul ionilor fixai de azot.
3. PROTEINELE ALBASTRE, conin cupru legat de cel mai mic rest de
cistein, implicat ntr-o structur tetraedric, cum ar fi plastocianina i
azurina, ce mediaz transferul de electroni n fotosintez i posibil n reducerea nitriilor.
4. FLAVOPROTEINELE, conin un un grup prostetic i un cunjugat organic,
sunt implicate n transferul proteinelor ca de exemplu flavotoxinele.
Aceste proteine au un rol important n natur, datorit localizrii pe suprafaa lor a
centrilor redox. Arhitectura subtil a moleculelor ofer selectivitate i specificitate acestor
molecule n interacia lor cu alte proteine sau enzime, ca de exemplu structura citocromului c. Fierul porfirinic (hemul), este situat n centrul moleculei i bine nvelit sau
ascuns, el este expus solvenilor ntr-o mica proporie de 0,06%, din totalul suprafeei moleculare. Proteina suport un potenial pozitiv de +9mV datorit excesului de resturi
lizinice, bazice. Se manifest un moment de dipol de 324 Debye, ce produce un dezechilibru n balanul distribuiei spaiale a lanurilor acide. Un numr de resturi de lizin
se distribuie n jurul solventului la care este expus centrul hemului ce interacioneaz cu
proteinele redox [48].
3.2.5 Integrarea componentelor biologice n biosenzori

Recunoaterea specific a analitului, transformarea semnalului fizico-chimic produs de interaciunea cu receptorul ntr-un semnal electric, procesarea i amplificarea semnalului au fost desrise pe larg n seciunile anterioare, ele constituind elementele principale din alctuirea oricrui tip de biosenzor. Biosenzorii descrii n literatura de specialitate se subdivid n trei generaii (figura 3.11). La senzorii din prima generaie, biocatalizatorul este prins la suprafaa membranei i apoi acest aranjament este fixat pe suprafaa traductorului (fig 3.11a). Adsorbia sau fixarea covalent a componentului biologic
activ la suprafaa traductorului permite eliminarea membranei semipermeabile, care este a
doua generaie (fig.3.11b). Legarea direct a biocatalizatorului la dispozitivul electronic
care traduce i amplific semnalul, cum ar fi tranzistorul cu efect de cmp, st la baza miniaturizrii biosenzorilor care este a treia generaie (fig.3.11c). n funcie de natura imobilizrii i a interaciei dintre cele trei com-ponente A-R-membran-contact cu electrozii
spre traductor i procesele din biosenzor au evoluat n funcie de generaie.
Dei numrul i varietatea metodelor utilizate n cazul construciei biosenzorilor
este foarte mare, totui cteva principii fundamentale sunt n general valabile pentru toate
tipurile. n primul rnd, specificitatea i selectivitatea este dominat de componenta biologic i este direct legat de natura ei: enzimele, anticorpii, microorganismele. Specificitatea deriv din legarea analitului la componentul biologic folosit ca receptor.

46

La baza acestei secvene dominant este reacia biochimic A-R i procesul de


ciocnire dintre A i R. n al doilea rnd, tran-sportul analitului spre i prin suprafaa considerat spre R constituie de asemenea un factor important. Acest proces este legat de
transportul unei mrimi fizice prin meca-nisme tipice de difuzie, migraie, convecie.
n al treilea rnd, semnalul senzorului este dependent reaciei A-R presupus a fi la o
vitez constant. Strile tranzitorii i condiiile de pseudoechilibru biochimic, sunt dominate de cinetica reaciilor, natura transportului care la rndul lor sunt cuplate cu reaciile
de interfa A-R substrat de imobilizare. Chiar i n cazul unui echilibru real, viteza
reaciei n apropierea strii de echilibru va fi
important n determinarea timpului de
DIALIZOR RECEPTOR TRADUCTOR ELECTRONICA
rspuns. n acest caz, cinetica acestor procese necesit considerarea unor condiii suR
plimentare. Clasificarea din figura 3.11 suPRIMA GENERATIE
R
marizeaz stadiul integrrii biosenzorilor cu
R
microtehnologiile secolului XX. Mileniul III
MEMBRANA
SENZOR
a produs, o dat cu dezvoltarea nanotehnolgiilor i a instrumentelor de mani-pulare a
R
atomilor (microscopia de fore atomice), o
A DOUA GENERATIE
R
adevrat revoluie n medicin. Noile tipuri
de materiale la scal nanometric cu diferite
R
SENZOR MODIFICAT BIOCHIMIC
nivele de biocompati-bilitate, noua generaie
de celule de biocom-bustie fundamentat pe
R
o mai bun ne-legere a metabolismului,
A TREIA GENERATIE
manipularea informaiei stocate la nivel moR
lecular au condus la o generaie de biosenR
zori cu un nalt nivel de integrare. InforBIOCHIP
Figura 3.11- Generaiile biosenzorilor. Rmaia molecular stocat iniial n comporeceptorul
nentele moleculare de baz poate fi exprimat dirijat la un nivel superior numit "supramolecular" n care interaciunile dintre molecule se realizeaz dup algoritmi prestabilii, putnd conduce la materiale adaptative, funcionale i inteligente. Mai precis, se
construiesc materiale pe baza unor principii moderne de concepie, supramoleculare i
combinatoriale. Sunt dezvoltate tehnici separative, de stocare i detecie utiliznd membrane "biomimetice" care funcioneaz dup modele biologice sau dup principii fizicochimice precise. Prin urmare avem posibilitatea explorrii diversitii moleculare, supramoleculare i combinatoriale n scopul elaborrii de materiale adaptative cu proprieti
optime sau funcii multiple. Aceste concepte sunt utilizate de natur, de exemplu, din
milioane de conformaii pe care le poate adopta o protein numai una prezint activitate
enzimatic foarte precis. Prin astfel de exemple, natura ne nva s optimizm explornd
diversitatea. n acest context se exploreaz sisteme integrate de nivel nanometric format
din senzori, surse de energie (celule de biocombustie- adeseori denumite gastroboi) ce
utilizeaz metabolismul corpului uman, manipulatoare pentru chirurgie nanometric,
47

rezervoare de medicamente nglobate n polimeri inteligeni.Toate acestea au dimensiunea unui virus. Termenul astzi este din ce mai mult utilizat: Nanomedicin [49].
Pentru a realiza avansurile de integrare ne vom limita la prezentarea schematic a
unui biosenzor de ultim generaie bazat pe ADN, structuri de nanotuburi i polimeri
semiconductori [50]. Figura 3.12 descrie principial secvenele de formare a unui senzor
cu ADN. Biosenzorul electrochimic cu ADN din figura 3.12 este rezultatul cerinelor
diagnosticului medical de a determina rapid i cu acuratee segmentele din secvena unui
ADN. Rezultatele din genetic, biologia molecular preluate pe suportul nanotehnologiilor au condus la una dintre cele mai precise metode de detecie: senzor electrochimic cu ADN (combinarea principiului senzorului ISFET cu fire moleculare din nanotuburi). Principiul de funcionare prezentat n figur const n colectarea de semnal ntre
doi electrozi unul electrod de lucru i altul de referin. Electrozii auxiliari au la rndul
lor un rol bine precizat.
Mecanismul de senzare const n modificarea caracteristicii I-V ( curent tensiune)
n prezena unei molecule int. Nanotuburile de carbon sunt excepionali pentru electrodul de lucru avnd vitez de transfer de electroni mare i o rezoluie spaial excelent.
Numai capetele nanotuburilor sunt active electrochimic, prile laterale fiind inerte,
aceasta ofer un avantaj excepional i anume electrozii de CNT pot fi fixai ntr-un strat
izolator lsnd numai capetele expuse spre mediul electrochimic.inta n senzorul ADN
este o secven necunoscut de ADN (sau oligonucleotide) ataat prin funci-onalizare la
gruprile carboxilice sau aminice de CNT.

48

Figura 3.12- Principiul de construcie a unui biosenzor tip FET realizat prin funcionalizare nanotuburilor
cu ADN

49

50

3.3 Traductori i electrozi


Din paragrafele precedente rezultat c orice eveniment al interaciei R-A este
identificat i transdus spre traductori prin intermediul electrozilor. Prin urmare traductorul transform detecia indus de variaia fizico-chimic din elementul senzitiv al
biosenzorului ntr-un semnal, de regul electric care este amplificat de un circuit electronic (vezi figura 2.1). Traductorul este n contact intim prin intermediul electrozilor cu
materialul biologic iar activitatea acestor componente poate fi masurat cu un sistem electric, termic sau optic. Traductorii sunt necesari pentru transformarea mrimii primare de
intrare ntr-o mrime electric, i reprezint unul din elementele cheie al ntregului sistem. Principalele tipuri de traductori folosii n msurarea interaciei R-A sunt [51]:
Traductori de tensiune sau de curent ce msoar ntre doi electrozi o diferen
de potenial sau un curent electric. n acest caz electrozii nu reprezint un traductor n
adevratul sens al cuvantului, deoarece nu transform o mrime de alt natur ntr-una electric, ci doar intermediaz preluarea i transmiterea semnalelor electrice dintr-un mediu cu proprieti fizico-chimice aparte, mediul biologic spre exterior.
Pot fi traductori cu electrozi de suprafa (n contact) sau de volum (imersai n
mediu). Electrozii sunt n general mini sau microminiaturizai
Traductori de temperatur
prin contact:
termistorii,
termocupluri,
jonciuni semiconductoare,
tranzistori,
circuite integrate specializate.
prin radiaie termic:
detectori semiconductori,
bolometre rezistive,
bolometre piroelectrice.
Traductori de debit :
mecanici
optici, prin efect Doppler,
ultrasonici, prin efect Doppler,
magneto-electrici, bazai pe tensiunea electromotoare produs de
particule ncrcate care se mic ntr-un cmp magnetic folosii
pentru msurarea debitului de aer, snge, fluide biologice n general cu aplicaii n micro i nanofluidica sistemelor biologice
Traductori de presiune:
manometre clasice, cu membran i traductor de deplasare
piezoelectrici, piezorezistivi, inductivi,
cu semiconductori, circuite integrate
51

Traductori de deplasare.
poteniometrici,
optici.
Traductori pentru msurarea concentraiilor (pH-metre)
semiconductori cu proprieti de suprafa, dependente de
concentraia diferitelor substane,
traductori spectrometrici
Traductori de radiaie
ecrane fluorescente,
scintilatori,
semiconductori.
3.3.1 Electrozi

Tipuri de electrozi :
A.
electrozi externi, sau de suprafa, sunt n general electrozi metalici, care
fac contact cu componenta bioactiv din senzor fie n mod direct (electrozi uscai sau solizi), fie prin intermediul unei soluii electrolitice (electrozi lichizi). Electozii solizi sau uscai sunt realizai n general din argint,
platin, aur, sau nichel. Pentru cazul n care avem contact direct cu epiderma va trebui s se ia n considerare c suprafaa pielii nu este n
general uscat sau inert chimic, ci exist poluri electrochimice care au
ca principal component clorura de sodiu. n momentul n care un electrod metalic vine n contact cu soluia electrolitic va aparea un schimb
de ioni ntre metal i electrolit. Ionii metalici, n masura n care sunt solubili n soluia electrolitic vor migra n electrolit, n timp ce ionii negativi
a electrolitului vor migra ctre electrodul metalic, recombinndu-se cu ionii metalici pentru a forma o sare a metalului din care este fomat electrodul. Aceast migrare a ionilor n direcii opuse echivaleaz cu un transfer de sarcina ce duce la apariia unui potenial de electrod. O condiie pe
care trebuie s o ndeplineasc electrozii este aceea c metalele din care
sunt confectionai s nu fie solubile n electroliii prezeni pe suprafaa
pielii, sau dac sunt solubile, reaciile chimice aprute s fie total reversibile la aplicarea unui potenial electric pe electrozi.
n aceast clas de electrozi numii i reversibili intr:
electrozii din metal n contact cu un electolit ce conine proprii
si ioni,
electozii nemetalici n contact cu un electrolit,
electrozii compui dintr-un metal i o sare greu solubil a acestui
metal n electrolitul cu anion comun cu sarea metalului.
B. Electrozi interni, sunt n general realizai din fire foarte subiri, dintr-un metal
rezistent: oel inoxidabil, platin, wolfram. Poriunea activ a electrodului poate fi acoperit cu cu un strat metalic bun conductor (aur, argint) iar cea inac52

tiv cu un strat izolator, de exemplu un polimer sau o pelicul subire de sticl.


Suprafeele de contact cu componenta activ din senzor au totui dimensiuni
mari n comparaie cu dimensiunile celulare, de aceea se folosesc pentru nregistrri extracelulare.
C. Microelectrozii, sunt tot electrozi interni, ns sunt asfel construii nct s
poat msura potenialele n contact direct cu receptorul din biosenzor. Suprafaa de contact cu R are dimensiuni micronice.
Microelectrozii pot fi :
solizi, compui, care pot fi realizai prin depunerea unui strat conductor
(platin, aur,) pe un suport de sticl avnd un vrf deosebit de subire. O
alt variant constructiv const n inserarea unui conductor metalic
sau din fibr de carbon ntr-un suport de rain epoxidic amestecat
cu o past conductoare.
lichizi, sunt folosii n prelevrile celulare i constau dintr-o pipet de
sticl avnd un vrf de dimensiuni micronice, umplut cu o soluie electrolitic coninnd n general clorur de potasiu. n soluia de electrolit
este cufundat un fir conductor, pentru a prelua potenialul electric.
3.3.2 Electrozi n senzori electrochimici

Electrodul de aur . Muli ani s-a crezut c nu este posibil transferul direct al electronilor ntre electrod i proteine, datorit denaturrii lor.
Cteva considerente de ordin practic au dus la concluzia c centrul activ din hem
este adsorbit ireversibil atunci cnd rezult denaturarea proteinelor n contact cu electrodul. Modificarea suprafeei electrodului de aur prin adsorbia pe suprafaa lui a 4,4bipiridil, a dus la modificarea configuraiei suprafeei electodului pentru interacia cu
citocromul c[59]. Este important de subliniat c 4,4bipiridil nu este o substan electroactiv, n regiunea de potenial i deci nu joac rol de mediator. Aceast achiziie n
domeniul electrochimiei a fost posibil datorit legrii cvasireversibile a citocromului c
de electrodul modificat, de aur, cu 4,4 bipiridil, din acest demers rezultnd c legturile
de hidrogen din resturile de lizin s-au legat de azotul din piridil care a modificat suprafaa electrodului.Tranzitul prin proteine-electrod complex, orienteaz rapid transferul de
electroni, care se realizeaz dup urmtoarea schem:
difuzia citocromului c pe electrod,
legarea proteinelor pe suprafa,
transferul de electroni,
desorbia proteinelor.
Urmnd acest procedeu au fost posibile mai mult de 60 de modificri de suprafee
pentru electrochimia proteinelor i a electrodului de aur. Prin urmare folosind un reactiv
bifuncional (X-Y), n care grupul X este electrodul legat cu azot (N), fosfor (P) sau sulf
(S) i grupul Y, ce trebuie s fie legat prin legturi slabe de proteine. Rezultatele din
electrochimia proteinelor s-au extins i la aminoacizi i peptide.
53

Electrodul de grafit. Electrochimia proteinelor a fost extins i la electrodul de


carbon. Formele de carbon- grafitul pirolitic, carbonul vitros, mezocarbonii, sunt structuri
n care planele grafenice, se aranjeaz ordonat n reele hexagonale de tipul ABABA..sau
dezordonat lund diferite forme turbostratice Planul grafenic bazal este hidrofob dar defectele existente sau induse conduc la legturi C-C libere i se produce o cretere a legturilor C-O prin oxidare (detalii n cap 9). Electrochimia direct a proteinelor ncrcate
pozitiv poate prin urmare s fie efectuat pe marginile planurilor grafitice ale electrodului
de carbon. Transferul direct al electronilor pentru proteinele ncrcate negativ, cum ar fi
plastocianina cu electrodul de grafit (marginile sau muchiile planelor), poate fi ajutat cu
cationi de mangan, calciu, crom, complexai cu compui amino, Cr (Am6)3+, folosii ca
promotori al reaciilor. n acest context promotorii sunt specii redox inactive n soluii dar
care dau posibilitatea s se fac transferul electronilor la proteinele redox.
Electrozii de Au i grafit i tehnicile de microminiaturizare pn la dimensiuni de
10 sunt discutai n detaliu n referinele [52, 53]. Electrozii microminiaturizai prezint
avantaje specifice printre care amintim mbuntirea polarizrii, contacte cu materialul
biologic la nivelul situsurilor active. Electrozi pentru variate sisteme de pH metre, ISE au
fost analizai pentru variate sisteme de analiz de ctre IUPAC [54, 55, 56].

3.4 Fenomene de transport


Specificitatea i selectivitatea sistemului considerat depind de componentul
biologic receptor al biosenzorului i de afinitatea lui pentru analit. Afinitatea este o caracteristic specific enzimelor, anti-bioticelor i receptorilor fiind folosit n multe funcii
din organismelor vii. Afinitatea se bazeaz pe cuplajul chimic dintre un component i
partenerul su complementar. n cazul componenilor cu afinitate mare, procesul de difuzie este foarte rapid, conducnd la formarea complexului ca exemplu cel de tipul antigenanticorp (figura 3.12).
Reacia de asociere specific recunoaterii moleculare va fi caracterizat prin constanta ratei de reacie care n general este de ordinul nti. n msurtorile cu biosenzori
este esenial s considerm concentraia unui component constant iar pe a celuilalt, variabil. Cu aceast condiie, suma concentraiilor anticorpilor liberi i a celor legai la echilibru va fi constant i independent de concentraia antigenului adugat. O discuie de
detaliu asupra cineticii antigen-anticorp se poate gsi n orice monografie de biochimie,
cu particularitate pentru aplicaii n biosenzori pot fi recomandate referinele [57, 58, 59,
60]

54

3.4.1 Cinetica Enzimelor

Adugarea enzimelor n soluii coninnd molecule de substrat este condiia esenial n reaciile de cataliz a enzimelor. O discuie de detaliu asupra cineticii enzimelor i
a mecanismelor enzimatice este practic imposibil ntr-un paragraf. Mai mult extragerea
informaiei necesare din tiina enzimelor pentru a
fi aplicate la dezvoltarea de senzori cum ar fi electrodul enzimatic este o sarcin extrem de dificil.
Se va utilza referinele [61,62] pentru a schia cteva din proprietile enzimelor necesare descrierii senzorilor enzimatici.
Considerm o reacie simpl, cu un singur
substrat S, care se combin cu enzima E pentru a
forma complexul intermediar enzim substrat,
ES. Acest complex fiind instabil sufer o nou
reacie n urma creia se obine produsul P.
Schematic aceste reacii se pot scrie:
E+S

k1

k2
ES
E+P
k 1

unde: k1 -constanta ratei reaciei de formare a


complexului ES; k--1 -constanta vetezei de reacie Figura 3.12- Cinetica interaciei Ag-A ,
c
de consumare (dispariie) a complexului; k2 con- reprezentare general. [A-A] reprezint
stanta vitezei de reacie de obinere a produsu-lui P concentraiile reactanilor. Kd-constanta de
Vitezele de formare i de consumare a com- reacie. a) Curba generala a rspunsului
funcie de concentraia de antiplexului sunt egale. Imediat ce E i S intr n reac- interaciei
gen Ag.b) Reprezentarea n valori reciproce
ie, sistemul se dezechilibreaz, concentraia com- conduce la liniarizarea proce-sului i
plexului va fi zero i viteza de formare a complex- determinarea constantei de reacie
ului este cu mult mai mare dect viteza consumrii ( prelucrare dup [53-56])
lui. Pe msur ce reacia se desfoar, ES crete i implicit crete viteza dispariiei
complexului n raport cu rata formrii lui. Se observ c, iniial excesul substratului determin consumul enzimei iar n timpul desfurrii reaciei ncepe regenerarea constant
a enzimei ajungndu-se la atingerea strii de echilibru.
Din analiza acestor reacii rezult dou concluzii importante :

La o concentraie mic a substratului: rata reaciei este proportional cu


concentraia substratului i invers proportional cu constanta ratei reaciilor de formare i de dispariie a complexului sau rata reaciei de
disociere n reactanii iniiali plus rata reaciei de descompunere n produi.
La o concentraie mare a substratului: viteza maxim este limitat de
concentraia enzimei. Astfel cele dou secvene corespund celor dou
procese care pot controla viteza total a reaciei.
55

O detaliere asupra proprietilor i caracteristicilor catalitice a enzimelor precum i


o sintez asupra tehnicilor de imobilizare sunt prezentate n [56,57]
3.4.2 Fenomene de transport

Cnd reacia are loc n soluii omogene, cu o vitez uniform, aceeai n tot mediul,
este necesar s considerm modificarea n timp a concentraiei componenilor. Dac reacia se produce la suprafa, concentraia reactanilor i produilor prezint modificri locale. Variaia n funcie de distan a concentraiei este semnificativ la scar molecular.Transportul de la regiuni cu concentraii mai mari spre cele cu concentraii mai mici
este un factor important n controlul vitezei reaciilor. Trei mecanisme ale transportului de
mas au loc n soluie: difuzia,convecia, migraia .
Difuzia
Considerm c moleculele din soluia studiat prezint micare brownian suferind
ciocniri cu solventul. n acest caz, probabilitatea ca o molecul s se mite ntr-o direcie
va fi egal cu probabilitatea ca orice alt molecul s se mite n alt direcie. Punnd
condiia egalitii probabilitilor pentru fiecare molecul, probabilitatea net a micrii
globale a moleculelor dintr-un element de volum dat din soluie spre altul alturat, este
dependent de numrul de molecule din fiecare element de volum al soluiei. Rezult c
micarea speciilor chimice se face din regiunile cu concentraie mai mare spre cele cu
concentraie mai mic cu o vitez dependent de diferena de concentraie dintre cele
dou regiuni, ajungnd la echilibru cnd aceast diferent devine egal cu zero. Timpul
necesar ajungerii sistemului la echilibru reprezint timpul de rspuns i reprezint un
criteriu important pentru stabilirea performanei biosenzorului. Determinarea timpului de
rspuns n funcie de membranele permeabile este necesar n operaionalizarea aplicaiilor biosenzorilor. Grosimea membranei trebuie s fie atent aleas, astfel nct difuzia
s conduc la sensibilitatea optim i la cel mai stabil rspuns.
Convecia
Convecia se refer la micarea soluiei n ntregime sub aciunea unor fore mecanice externe. Cnd reacia se produce la suprafaa membranei, convecia este folosit pentru sporirea vitezei transportului de mas, prin nlocuirea soluiei n contact cu membrana
cu alta nou. Meninerea reaciei la o vitez constant este important pentru controlul
difuziei i determinarea sensibilitii. Vscozitatea reprezint mrimea fundamental care
controleaz fluxul i ea reflect rezistena soluiei la micarea de alunecare reciproc a
straturilor. Aceast rezisten este descris formal de legea lui Newton. Pentru o for
dat, fiecare subsecven a stratului de soluie se mic n raport cu secvena anterioar,
asfel nct viteza soluiei, n raport cu subsecvena staionar, crete constant cu creterea
distanei faa de ea. Cnd reacia are loc la suprafaa membranei i speciile sunt generate
sau consumate, ele trebuie s difuzeze prin stratul staionar, numit strat de difuzie.
Migraia
Migraia se refer la micarea speciilor cu sarcina electric ntr-un mediu n care
exist un gradient de potenial. n sistemele electrochimice, ea reprezint mecanismul de
meninere a echilibrului ntre sarcinile create i distruse de electronul de transfer, datorat
curentului dintre cei doi electrozi. n orice caz, contribuia migraiei la viteza global a
56

transportului de mas, la generarea speciilor electrochimice, este nesemnificativ i nu


prezint prea mare importan. De notat c literatura de specialitate surprinde foarte puine aspecte asupra modelrii i simulrii fenomenelor de transport i a reaciilor chimice
de interfa ntr-un biosenzor.[63]

57

58

4. Biosenzori electrochimici
Un biosenzor electrochimic este un dispozitiv integrat, autonom, capabil s furnizeze informaii analitice cantitative sau semicantitative specifice folosind ca element de
recunoatere molecular un receptor biochimic (element de identificare biologic), care
se afl n contact spaial direct cu un traductor electrochimic. Datorit abilitii lor de a fi
calibrai n mod repetitiv un biosenzor electrochimic se distinge de un sistem bioanalitic
care necesit pai adiionali de procesare, ca de exemplu adiionarea de reactiv.
Biosenzorul disponibil pentru un singur tip de msurtoare, sau incapabil s monitorizeze continu analiza concentraiei sau s nu fie regenerat rapid i reproductibil este definit a fi de unic folosin. Din prezentrile anterioare s-a artat c biosenzorii sunt clasificai n funcie de specificitatea lor biologic cu referire la mecanismul, sau la modul
de interpretare a semnalului fizico-chimic (traductorul). Biosenzorii electrochimici se disting numai prin natura traductorului indiferent de natura componentei biologice conform
cu clasificarea din tabelul 4.1 Elementul de recunoatere biologic are la baz o reacie
chimic catalizat sau o reacie de echilibru cu macromolecule ce au fost izolate n prealabil sau sintetizate n mediul lor biologic original. n cazul reaciilor reversibile starea
de echilibru poate fi n general atins dac nu mai exist un consum net de ctre agentul
biocomplexului imobilizat i incorporat n senzor. Biosenzorii electrochimici pot fi clasificai n funcie de analizele si reaciile pe care le monitorizeaz: monitorizare direct a
concentraiei analiilor sau a reaciilor productoare sau consumatoare a acestora; alternativ, o monitorizare indirect a inhibitorului sau activatorului elementului de recunoatere biologic (receptorul biochimic). O proliferare rapid a biosenzorilor electrochimici
i a diversitii lor a condus la o lips de rigoare n definirea criteriilor de performan. Cu
toate c fiecare biosenzor poate fi evaluat pentru o anumit aplicaie, este util s se stabileasc o serie de protocoale standard pentru stabilirea criteriilor de performan conform normelor i criteriilor IUPAC [64]. Aceste criterii includ caracteristicile de etalonare (sensibilitate, domeniul de liniaritate i operaional al concentraiei, limitele determinrii cantitative i detecia specific), selectivitate, starea de echilibru i timpul de rspuns, reproductibilitate, timp de via, stabilitatea.
4.1 Senzori chimici vs senzorii biochimici

Un senzor chimic este un dispozitiv ce transform informaia chimic ntr-un semnal electronic sau fotonic raportnd concentraia unui compus specific identificat la proba
analizat [65, 66]. Senzorii chimici de obicei conin dou componente de baz: un receptor = un sistem de recunoatere chimic (molecular) i un traductor fizico-chimic.
Senzorii biochimici (biochemosenzorii) sunt senzori chimici, n care metoda / sistemul de identificare utilizeaz un procedeu biochimic.
Senzorii biochimici sau "biochemosenzorii " sunt dispozitive care introduse ntr-un
mediu biologic, ofer la ieire semnale electrice msurabile ce caracterizeaz acest mediu. Acetia pot avea la baz o serie de senzori chimici, cum ar fi electrozii pH, electrozii
ionselectivi (EIS) etc. Modelul schematic este similar cu cele prezentate in figurile 2.1,
59

2.2, 2.3. Biochemosenzorii convenionali utilizeaz un electrod electrochimic, ca element


de conversie a semnalului biochimic ntr-un semnal electric n timp ce tipurile mai noi
utilizeaz traductori cum ar fi: fibrele optice, dispozitivele piezoelectrice, tranzistorii cu
efect de cmp (FET), SAW (unde acustice de suprafata). Biochemosenzorii detecteaz,
practic, specii electroactive produse sau consumate ntr-o reacie de orice tip.
Toi biosenzorii sunt mai mult sau mai puin selectivi (non-specifici) pentru un
anumit analit, unii sunt prin construcie i concepere doar specifici pe o anumit clas de
analii dac folosesc clasa enzimelor (ex: biosenzori pentru detecia fenolului) sau celule
(ex: n msurarea consumului biologic de oxigen). Noiunea de recunoatere este deseori
folosit n biosenzori sau n sistemele biosenzoriale prin asociere cu sistemele senzoriale
ale corpului uman. Simurile ca mirosul sau gustul, sunt alctuite din sisteme ce conin o
celul receptoare pentru identificare cuplate cu ci neurotransmitoare de procesare prelucrare semnale.
Fenomene de acest tip au loc i n biochemosenzori dar la nivel mult simplificat
fa de complexitatea recunoaterii moleculare din sis-temele vii. Exemple de semnale de
transfer simple sau multiple sunt prezentate n tabelul 4.1. Aceste exemple se limiteaz la
principalii biochemosenzori.
Pentru tipurile de receptori prezentai n tabela 4.1 se pot selecta diferii electrozi i
metode de msur din tabela 4.2 pentru a forma un biosenzor electrochimic. Biosenzorii
sunt clasificai dup elementul de recunoatere (tabela 4.1) sau dup modul de transducie
(tabela 4.2). De reinut c toi biosenzorii indiferent de tipul de clasificare trebuiesc tratai
unitar ca un microsistem, elementul de recunoatere biologic fiind n contact direct,
intim, cu elementul traductor

60

Tabela 4.1 Tipuri de receptori folosii n biosenzori cuplai cu tehnici electrochimice de msurare pentru
recunoaterea specific de specii. Cupluri receptori biologici- tehnica de msur electrochimic sunt
indicate prin litere boldate [67]
Tipul de analit
Receptorul/ sistemul chimic
Tehnica de msurare
/biochimic de recunoatere
Natura traductorului
Potentiometric
1.Ioni
Oxizi metalici multivalenti
Cristale anorganice cu con-ducie Voltametric
ionic,
Ioni permselectivi
Ionofori biologici
Enzime
Sticle schimbatoare de ioni
2. Gaze dizolvate,
Strat dublu lipidic sau membrane Amperometric
Amperometric i poteniometric
vapori i mirosuri
hidrofobe ;
Amperometric, potentiometric sau de
Electrod de metal inert
impedan
Enzime
Piezoelectric, optic
Anticorpi, receptori
3. Substrate

4. Anticorp/
Antigen

Enzime

Celulele
Membrane receptor
Tesuturi de animale sau de plante
Antigene /anticorpi;
Duplex de oligonucleotide,
Aptamer

Amperomrtric sau potenio-metric in


serie cu 1 sau 2 metale
Electrozi de carbon,
Conductometric,
Piezoelectric, optic,calorimetric
idem
Amperometric,
Poteniometric
Impedanmetrie,
Piezoelectric, optic,
Rezonana plasmonilor (SPR)
Optic

Enzime specifice indexate


Indexri
fluorescen,
chemiluminiscen
5. Diferite
Liganzi specifici
Idem cu 4
proteine, substante
proteine receptor
cu greutate
Enzime specifice
moleculara mica
fluorescenti
*Pe lng determinarea sub raport cantitativ a analiilor, biosenzorii sunt folosii i pentru a detecta i
cuantifica micro-organisme: receptorii sunt bacterii, drojdii sau oligonucleotide cuplate cu traductori
electrochimici, piezoelectrici, optici sau calorimetrici.

61

4.2 Biosenzor electrochimic

Un biosenzor electrochimic este un biosenzor cu traductor electrochimic (tabela


4.2). Este considerat a fi un electrod modificat chimic (CME), ca un conductor electric ce
transmite electronii din procesul de interacie spre exterior n sistemul electronic de
msurare. Electrodul poate fi metal, semiconductor sau material cu conductivitate ionic
acoperit cu un film biochimic sau bioactiv [68 ,69, 70]. Biosenzorul electrochimic este un
microsistem integrat receptor - traductor, capabil s dea informaii analitice selective,
cantitative sau semicantitative folosind un element de identificare biologic. El poate fi
folosit pentru a monitoriza att elemente biologice ct i nebiologice. De notat c senzorii
chimici care ncorporeaz componente nebiologice ca receptor, dei este folosit la monitorizarea proceselor biologice (ex: pH sau senzorii de oxigen) nu sunt biosenzori. Totui
ei, de exemplu electrodul Clark, sunt de o importan major n lanul biosenzorial de
msur. Similar senzorii fizici utilizai n medii biologice cum ar fi cei ce msoar presiunea arterial etc, nu sunt considerai biosenzori
Tabela 4.2 Tipuri de traductori electrochimici, tipul de msurtoare i analitul corespun- ztor [62]
Electrod ion-selectiv (ISE);
K+, Cl-, Ca2+, FPoteniometric
Electrod de sticl

H+., Na+. . . .

Electrod gazos
CO2, NH3
Electrod metalic
Reacii redox
Electrod metalic
O2, Zaharuri, alcooli:
Amperometric
Electrod-carbon
zaharuri, alcooli, fenoli,
Electrozi modificati chimic (CME),
oligonucleotide
Electrozi tip pieptene
Uree, Oligonucleotide
Conductometric,
Electrozi metalici
Impedanmetric
Tranzistor cu efect de cmp cu selectivitate
H+., Na+. . . .
Tranzistori cu efect
ionic (ISFET)
de cmp (FET)
FET cu sensibilitate la Enzime (ENFET)
* Biosenzorii utilizeaz i alte tipuri de traductori non-electrochimici.: a) biosenzori piezoelectrici b)
biosenzori-SAW, traductorul msoar unde acustice de suprafa ntr-un circuit de rezonan (shear and
surface acoustic wave); c) biosenzori calorimetrici (elementul activ este cuplat cu un termistor sau cu un
termocuplu); d) biosenzori optici, utilizeaz fenomene optice cum ar fi fibra optic i fenomenele de
reflexie, refracie, interferen; biosenzori cu fluorescen, chemoluminiscen, absorbia luminii e)
biosenzori SPR ce folosesc interacia analit-receptor imobilizat pe un film metalic depus pe o prism
optic msurnd variaia indicelui de refracie datorit modificrilor induse n sarcina electric a
metalului.

4.3.Clasificare

Biosenzorii electrochimici dup terminologia stabilit n tabela 4.1 i 4.2 pot fi clasificai n funcie de specificitatea lor biologic, dup mecanism sau modul de transmitere a semnalului sau, alternativ, combinaia acestora dou. Ei pot fi: amperometrici, poteniometrici, cu efect de cmp (FET) sau senzori conductometrici (msurarea conduciei
62

electrice) respectiv de impedan (impedanmetrici). Alternativ pot fi numii de exemplu:


senzor amperometric enzimatic [71] pentru a specifica natura receptorului i a traductorului. Primii biosenzori ce au fost studiai sunt cei enzimatici i imunosenzorii.
4.4 Receptorul
Element de recunoatere biocatalitic

n acest caz, biosenzorul are la baz o reacie catalizat de biomacromolecule,


prezente n mediul biologic original i care sunt izolate n prealabil sau sunt obinute pe
cale sintetic. Reacia este monitorizat de un detector integrat (traductorul) ce msoar
strilor staionare sau de tranziie ori produsul final de reacie prin intermediul biocatalizatorului imobilizat n biosenzor.
Tipuri de biocatalizatori frecvent utilizai:
1. Enzime (simple sau complexe enzimatice)- cel mai des folosite ca sisteme de
recunoatere
2. Celule, microorganisme (ex: bacterii, fungi, celule eucariote sau drojdii), organele sau componente celulare (perei celulari, mitocondrii)
3. esuturi (seciuni din esuturi de plante sau animale)
Biosenzorii cu elemente de recunoatere cu biocatalizatori sunt cei mai cunoscui i
studiai, nc de la nceputul abordrii lor de Clark i Lyons . Unul sau mai muli analii,
de obicei numite substraturi S i S, reacioneaz n prezena uneia sau mai multor
enzime, celule etc, obinndu-se produii P i P dup urmtoarea schem de reacie:
biocatalizator
S + S '
P + P'

Exist patru strategii prin care traductorul asociat poate monitoriza consumul de
analit S prin reacia biocatalitic:
1. Detectarea consumului co-substratului S, ex: diminuarea oxigenului prin
lanul de reacii indus de oxidaze, bacterii sau drojdii. Semnalul msurat
reprezint diminuarea consumului de co-substrat fa de valoarea iniial.
2. Reciclarea produsului de reacie P cum ar fi: peroxihidrogen, H+, CO2, NH3.,
n scheme de reducere prin oxidoreducatz, hidroliz, liaz etc. Semnalul de
la traductor se va amplifica.
3. Detecia centrilor activi din biocatalizator: redox, co-factori, grupuri prostetice ce evolueaz n prezena substratului S prin folosirea unui mediator
imobilizat. Acesta reacioneaz rapid cu biocatalizatorul i este uor de detectat n lanul de transducie. Diferii derivai ferocenici, tetrathia-fulvalene,
tetracianochinodimetan (TTF+ TCNQ- ), sruri organice, chinone, colorani
chinonici, complexe de Ru sau Os n matrici polimere pot fi folosii ca mediatori.[72 ]
4. Transfer direct de electron dintre situsul activ al reaciei redox enzimatice i
traductorul electrochimic.
A-3-a strategie elimin, parial sau total, dependena rspunsului senzorului de
concentraia cosubstratului, S, descrete influena interferenei dintre specii. Aceasta se
realizeaz printr-o vitez de reacie mai mare pentru cuplul mediator- biocatalizator imo63

bilizat pe substrat fa de reaciile cosubstrat- biocatalizator. O alt alternativ este restricionarea analitului s reacioneze localizat pe un film. n acest caz analitul difuzeaz
restrictiv printr-o membran a crei permeabilitate favorizeaz transportul cosubstratului
[73,74]. Utilizarea mediatorilor conduce la diminuarea concentratiei substraturilor mpreun cu lanurile de reacii prin utilizarea unei membrane cores-punztoare, a crei permeabilitate s favorizeze transportul cosubstratului.
Cnd enzimele sunt imobilizate n cadrul acelorai lanuri de reacie, se poate mbunti performana i abilitile biosenzorului. Trei posibiliti sunt frecvent folosite:
1. Unele enzime faciliteaz identificarea biologic prin convertirea secvenial
a produilor seriilor de reacii enzimatice ntr-o form final electroactiv:
acest mod permite o plaj mai larg de analiz a biosenzorului [75]
2. Complexul enzimatic, aplicat n serie, poate regenera co-substratul primei
enzime i amplifica semnalul de ieire al biosenzorului prin regenerarea unui alt cosubstrat al primei enzime.
3. Complexul enzimatic, aplicat n paralel, mbuntete selectivitatea biosenzorului prin scderea concentraiei locale a substratului electrochimic de interferen: aceast secven este o alternativ a utilizrii unei membrane
permselective sau a unei metode secveniale (ex: interpretarea unui semnal
de ieire generat de un biosenzor i de un senzor de referin, fr a exista
element de recunoatere biologic).[76 ]
Element de recunoatere pe baz de biocomplexare sau de bioafinitate

Operarea biosenzorului se bazeaz pe interacia dintre analit cu macromolecule sau


cu ansamble moleculare organizate [77]. La atingerea echilibrului nu mai exist consum
de analit de ctre agentul de biocomplexare imobilizat n substrat. Rspunsul la reacia
analit-agent de biocomplexare este monitorizat de un detector integrator. n unele cazuri
reacia de biocomplexare se automonitorizeaz printr-o reacie biocatalitic complementar. Detectorul integrator monitorizeaz strile staionare sau tranzitorii.
1. Interacia anticorp-antigen (detalii asupra interaciei Ac-Ag sunt prezentate
n seciunea 3.2). Cele mai relevante exemple de biosenzori ce folosesc
receptori de biocomplexare au la baz reacii imunochimice, ex: legarea
unui antigen (Ag) cu anticorpul caracteristic (Ac). Complexele formate de
Ac-Ag trebuie s fie detectate cu condiia ca celelalte reacii non-specifice
s fie minimizate. Pentru fiecare determinare de Ag corespunde un anumit
Ac ce trebuie produs izolat, purificat etc. Unele studii recente au analizt
monitorizarea direct a formrii complexului Ag-Ac utiliznd tranzistori cu
efect de cmp cu selectivitate ionic (ISFETs). Creterea sensibilitii senzorilor imunologici se realizeaz prin adugarea de enzime specifice la cupluri
Ag-Ac ns aceasta necesit pai adiionali de sintez. Cum tria legturii
sau constanta de afinitate variaz n limite largi aceste sisteme opereaz
ireversibil (biosenzor de unic folosin) sau dac sunt cuplate n sisteme
analitice de injecie a fluidelor (FIA) atunci Ac se poate regenera din disocierea complexului cu ageni cum ar fi glicin-HCl la pH 2.5
64

2. Receptor:antagonist/agonist. Recent s-au folosit ca sisteme de recunoatere


molecular n analiza conductometric, ISFET sau senzorii optici cu receptori cu canale ionice, membranari sau structuri proteice [78]. De exemplu, o
protein transportoare, lactoz- permeaza (LP), poate fi ncorporat ntr-un
bistrat lipozomic ce permite transportul protonic de glucid cu un raport stoichiometric de 1:1. Acest mecanism a fost identificat prin fluorescen dependent de pH a unui fluorofor imobilizat n lipozomi[79]. Lipozomi cu LP
au fost ncorporati ntr-un bistrat lipidic depozitat pe un ISFET sensibil la
pH. Rezultatele preliminare arat c acest ISFET modificat e capabil sa detecteze ireversibil, lactoza dintr-un sistem FIA. Biosenzorul cu receptor
proteic a fost descoperit de curnd [80]. Legarea analiilor, numii aici agoniti, de proteine receptoare imobilizate este monitorizat prin schimbarea
fluxului de ioni prin aceste canale. De exemplu, glutamatul, ca agonist,
poate fi determinat n prezena altor agoniti ce pot interfera prin determinarea fluxurilor de Na+ sau Ca2+, utiliznd metoda conductometric sau
electrozi ioni-selectivi. Datorit dependenei canalului ionic de natura legturilor aceasta produce o independen de natura enzimelor pentru a se atinge sensibilitatea dorit.
Evoluia actual de integrare a biochemosenzorilor pe cipuri a fcut din metodele
electrochimice un instrument puternic de determinare i detectare a legrii oligonucleotidelor i a indexrii secvenei genetice (modulele de nanoelectrochimie ce doteaz n
prezent microscopia de fore atomice). S-au abordat dou metode. Prima se refer la intercalarea n duplexul de oligonucleotide, n timpul formrii structurii dublu helix a ADNului a unei molecule care este electroactiv. A doua metod este detecia direct a guaninei care este electroactiv.
n concluzie, dei cercetrile au avansat rapid nu cunosc nc o dezvoltare similar
cu cea a biosenzorilor bazai pe biocatalizatori unde cercetrile au produs o larg cunoatere a domeniului. Aceste tipuri avnd la baz monitorizarea reaciilor de echilibru ce
au un domeniu de liniaritate restrns nu pot monitoriza continuu concentraia analiilor. O
parte din aceti biosenzori nu pot opera prin intermediul unor membrane de separare analit - element senzitiv. Stratul sensibil adeseori trebuie s fie n contact cu mediul biologic
unde se afl analii.
4.5 Moduri de transducie electrochimic
Amperometria

Metoda amperometric se bazeaz pe msurarea curentului electric n procesele de


reducere sau oxidare a speciilor electroactive. Metoda const n meninerea unui potenial
constant al electrodului de lucru (Au-,Pt-, C) n raport cu un electrod de referin, care
poate servi i ca electrod auxiliar, i msurarea curentulu care este de ordinul 10-9 -10-6 A.
Curentul electric este direct corelat cu concentraia speciei electroactive sau a vitezei de consum a substratului biocatalitic. Cum vitezele de reacie biocatalitice sunt ade65

sea alese pentru a fi de ordinul nti la fel i curenii sunt de obicei proporionali cu concentraia analitului.
Poteniometria

Msurtorile poteniometrice constau n determinarea diferenei de tensiune dintre


doi electrozi (fie doi electrozi de referin sau unul de lucru unul de referin) separai
printr-o membran permselectiv. Traductorul poate fi un electrod ion-selectiv (ISE), care
este un senzor electrochimic ce are la baz un film subire sau o membran permselectiv
ca element de recunoatere [17, 81]. Cele mai cunoscute dispozitive poteniometrice sunt
electrozii pH; ns i ali electrozi selectivi la ioni ca : F-, I-, CN- , Na+, K+, Ca2+, NH4+,
sau gaze (CO2, NH3) pot fi folosii.
Diferenele de potenial dintre indicator i electrodul de referin sunt proporionale
cu logaritmul activitii ionice sau fugacitatea gazului (sau concentraia), descrise de
ecuaia Nernst-Donnan. Acesta este doar cazul n care:
Membrana sau stratul selectiv sunt infinite i concentraia altor ioni neglijabil
Diferenele de potenial la diferite suprafee de separare a fazelor sunt fie
constante, fie neglijabile, fa de potenialul principal de msur dintre membran i soluia de analizat.
Pentru orice biosenzor cu substrat biocatalitic, acesta este adiacent cu detectorul
poteniometric, trebuiesc luate n considerare urmtoarele etape:
1. Transportul substratului de analizat spre suprafaa biosenzorului,
2. Difuzia analitului spre stratul de reacie,
3. Reacia analitului n prezena biocatalizatorului
4. Difuzia produsului de reacie nspre suprafaa senzorului sau volumul
soluiei fie spre recirculare fie spre eliminare.
Rspunsul senzorului biocatalitic poteniometric descrie fie o stare cuasistaionar
sau tranzitorie. Situaia este mai complex n cazul senzorilor imunoenzimatici cu toate c
complexul Ac-Ag atinge o stare de echilibru prin reaciile sale, reversibile sau ireversibile, activitatea enzimelor asociate complexului este msurat prin consumul de analit n
starea staionar.
Un alt aspect important al biosenzorilor cu ISE, este dependena mare a rspunsului
lor de pH i de tria ionic.
Detecia acumulrii de sarcin superficial ( tranzistorii cu efect de cmp-FET)

Este un principiu de transducie care determin concentraiile ionilor prin metoda


efectului de cmp indus de o sarcin superficial, al unui tranzistor care poart aceai
denumire. ISFET tranzistor cu efect de cmp ion selectiv este denumirea general a
acestei metode de transducie [82]. Principiul const n controlul unui curent electric sub
influena unui potenial aplicat direct pe un electrod-poart. Cnd ISFET este cuplat cu un
strat biocatalitic sau cu un biocomplex ei devin biosenzori i se numesc ori cu efect de
cmp enzimatici (ENFET) sau imunologici (IMFET). Indiferent de cazul particular prin66

cipiul este acelai curentul dintre dren i surs este controlat de mrimea unui potenial
electric (FET).
Conductometrie, impedanometrie

Multe reacii ale enzimelor , ca de exemplu ureaza, i muli recep-tori ce sunt


membrane biologice pot fi monitorizate prin conductivitatea ionic sau prin variaia impedanei utiliznd microelectrozi interdigitali (pieptene intercalat) [83]. Sensibilitatea masurtorilor este dependent i de conductana altor ioni din soluia de investigat. n aceast
situaie msurtorile se realizeaz n montaje fie difereniale sau n punte unde una dintre
probe este senzorul cu enzim iar cealalt este de referin fr enzim.
4.6 Analii, reacii monitorizate.

Biosenzorii se pot clasifica fie n funcie de analii sau de reaciile care le monitorizeaz. ntre monitorizarea indirect a inhibitorilor i monitorizarea directa a analiilor
(sau a activitii biologice) exist o imens diferen.
Monitorizarea direct a analiilor sau a activitii biologice cu consum sau producere de analii. Monitorizarea direct a analiilor sau, alternativ, a activitii biologice,
este indiscutabil cea mai mare aplicaie a biosenzorilor. Trebuie s se in seama de faptul
c acelai biosenzor poate monitoriza activitatea enzimei sau a celulei vii, consumul sau
producerea unui compus dat fie continuu sau secvenial
Monitorizarea indirect de inhibitor sau activator a receptorilor biochimici.
Alternativ, biosenzorii au fost dezvoltai pentru monitorizarea indirect a pesticidelor organice sau a unor compui anorganici (metale grele, fluoruri, cianuri) [84, 85]
substane ce inhib proprietile biocatalitice ale enzimelor folosite n construcia biosenzorilor. Oricum aceste dispozitive sunt de obicei ireversibile. De exemplu la imunosenzori activitatea biologic iniial se poate regenera doar prin tratament chimic i prin
urmare nu fac parte din clasa biosenzorilor recondiionabili sau reutilizabili. Potenialul
lor de aplicaie este acela de avertizare i nu de monitorizare exact a unui analit specific.
Se recomand ca acetia s fie considerai de unic folosin. De exemplu, biosenzorul cu
cianur ce folosete ca inhibitor citocromoxidaza care se regenereaz prin splare cu un
tampon de fosfai la pH=6,3 [86].
4.7 Construirea unui biosenzor electrochimic.
Imobilizarea receptorilor biologici

nc de la inceputul cercetrilor n acest domeniu, odat cu realizarea senzorului


enzimatic pentru glucoz, prima descriere apartine lui Clark si Lyons n 1962, experiment
n care glucozoxidaza este imobilizat ntre dou membrane, a aprut o bogat literatur
asupra tehnicilor de imobilizare a receptorilor biologici. Enzimele, anticorpii, celule sau
esuturi cu activitate biologica mare, pot fi imobilizai ntr-un film subire pe suprafaa
unui traductor prin variate metode[59,61, 87, 88, 89, 90, 91, 92]. Urmtoarele proceduri
de imobilizare ale receptorilor biologici sunt cele mai des folosite:
67

1. Imobilizarea pe membran pe suprafa neexpus la analit: o soluie enzimatic, o suspensie de celule sau de esut se confineaz ntre membrana
permeabil la analit i electrodul de msur (detectorul electrochimic)
2. Reinerea receptorilor biologici ntr-o matrice polimerica, ca de ex: poliacrilonitril, gel agar, poliuretan (PU) sau alcool polivinilic (APV), hidrogeluri redox cu centrii redox ca de exemplu [Os(bpy)2Cl]+/2+ [93]
3. Reinerea receptorilor biologici ntre straturi autoasamblabile (SAM) sau n
membrane din stratul dublu lipidic (BLM).
4. Legarea covalent a receptorilor de suprafaa membranelor prin intermediul
gruprilor bifuncionale: glutaraldehide, carbodiimide, SAMs, avidin-biotin
silanizate.
5. Modificarea structurii ntregului electrod (ex: pasta de carbon modificat cu
enzime sau grafit n rini epoxi [94].)
Receptorii sunt modificai fie singuri fie n amestec cu alte proteine, ca de
exemplu albumina serica bovin (BSA), fie direct pe suprafaa traductorului fie n membrana de polimer. De curnd, membranele preactivate pot fi folosite direct pentru imobilizarea enzimelor sau anticorpilor, fr modificari chimice.
Legarea covalent i reticularea sunt mult mai dificile fa de imobilizarea sau reinerea receptorilor pe membran. n cazul structurilor microsenzoriale unde membrana este direct depus pe traductor atunci legarea covalent este mai sigur i stabil.
Membrane interne i membrane externe

Pe lng straturile de reacie sau membranele cu receptorii imobilizai muli biosenzori, n special cei destinai aplicaiilor clinice sau biologice, ncorporeaz una sau mai
multe membrane auxiliare de separare interne sau externe cu trei funciuni importante:
1. Barier de protecie. Membrana exterioar previne interfe-rena sau intrarea
n straturile de reacie a unor molecule mari (ca de ex: proteine sau celule),
n acelai timp reduce trecerea componentelor din straturile de reacie n
soluia de analizat. Aceste funcii sunt foarte importante, de exemplu, pentru
un senzor de glucoz implantat, eliminarea de glucoz-oxidaz care nu este
de origine uman poate cauza reacii imunologice. O membran se alege
pentru a conferi o permselectivitate specific care s reduc interferenele cu
alte specii n rspunsul biosenzorilor. De exemplu biosenzorii pentru
glucoz in vivo sau ex vivo posed o membran de acetat de celuloz ncrcat negativ pentru a descrete efectele de interferen cu ascorbatul sau ureatul care sunt electrochimic detectate mpreun cu apa oxigenat generat
enzimatic
2. Barier exterioar de difuzie pentru substrat. n cazul enzimelor acestea au
o cinetic ce urmeaz modelul Michaelis-Menten [95]. Vitezele de reacie
enzimatice sunt neliniare cu concentraia. Domeniul de liniaritate dinamic
poate fi larg dac rspunsul biosenzorului este controlat de difuzia substratului prin membran i nu de cinetica enzimei. Acest control se realizeaz
prin implantarea unei membrane exterioare subiri peste o enzim cu acti68

vitate mare: cu ct este mai subire membrana cu att este mai scurt n timp
rspunsul biosenzorului. Mai mult, bariera de difuzie exterioar induce pentru rspunsul biosenzorului o independen fa de enzimele active i mbuntesc stabilitatea.[67,68]
3. Suprafee biocompatibile. Biosenzorii sunt supui la dou seturi de modificri cnd sunt n contact direct cu esuturile organice fluide sau implantate
in vivo, de regul n matrici biologice active, sau n medii de cultur:
Modificri ale probei biologice gazd cauzate de reaciile induse
de biosenzor d.p.d.v a toxicitii, imunogeneticii, carcinogeneticii, trombogeneticii, mutageneticii etc.
Modificarea proprietilor de operare ale biosenzorului de ctre
componentele probei biologice sau de structura ei: pasivizarea
suprafeei de la electrod.
Alegerea unui strat extern de protecie biocompatibil este esenial pentru stabilitatea rspunsului dup implantare pentru traductorii de recunoatere molecular care
cer un contact direct dintre prob i receptorul biologic.Toate aceste tipuri de membrane
i straturi protectoare depind de diametrul senzorului iar funcie de caz se pot utiliza materiale polimerice depuse prin dip- sau spincoating (acetat de celuloz, Nafion, poliuretan, colagen, policarbonat). Microbiosenzorii sunt de obicei realizai prin traparea enzimei printr-un proces de electropolimerizare.
Dac implantarea biosenzorului nu afecteaz funcionarea normal a mediului
gazd i invers dac mediul gazd nu influeneaz operaiile normale ale biosenzorului,
atunci biosenzorul este considerat biocompatibil.
4.8 Criterii de performan

Pentru orice senzor construit pe principiul recunoaterii moleculare [75] este important de al caracteriza prin rspunsul su care este legat de parametrii de operare i de
vitezele reaciilor limitative. Precizia, acurateea, sensibilitatea, reproductibilitatea sunt
criterii de baz n estimarea performanelor biosenzorilor [65,75]. Aceti parametrii sunt
n direct relaie cu mecanismele de reacie, fenomenele de transport i cinetica proceselor din volum respectiv la interfa.
Cele mai multe criterii au fost elaborate pentru biosenzorii enzimatici, ei fiind i cei
mai studiai n literatura de specialitate. n cazul imunosenzorilor elementul cheie este
capacitatea de captur a suprafeei adic numrul de molecule de pe suprafa care sunt
active. O metod de verificare a acestui parametru este msurarea activitii specifice
adic raportul dintre numrul de molecule active la numrul de molecule imobilizate.
Aceast estimare este dependent de modul de imobilizare (orientarea molecular,
numrul de puncte de ataare sau situri active) iar raportul se situeaz ntre limite 0.150.3, foarte rar atingnd unitatea.
Capacitatea de captur devine important cnd suprafaa se micoreaz ca n aplicaii de microfluidic. O alt problem ntlnit la imunosenzori este aceea a regenerrii
suprafeei fr pierderea semnificativ a activitii.
69

Oricum rapida proliferarea a biosenzorilor i a diversitii lor a condus la o lips de


rigurozitate n criteriile de performan. Cu toate c fiecare senzor poate fi evaluat pentru
aplicaia lui particular este util s se stabileasc protocoale standard pentru evaluarea
criteriilor de performan n conformitate cu standardul i definiiile IUPAC [65]. Patru
seturi de parametrii sunt descrii n cele ce urmeaz ca fiind cazuri particulare a criteriilor
generale prezentate n seciunea 3.1.
Calibrarea sau etalonarea biosenzorilor electrochimici este realizat n general
prin adugarea de soluii standard de analit i ridicarea graficului de rspuns n regim
staionar, Rss (steady-state response) funcie de concentraia analitului, c, sau de loga-

c
, unde c0, reprezint o concentraie de referin. Semnalul de rspuns,
0
c

ritmul, log

Rss este corectat n raport cu zgomotul de fond Rbl (background). c0, concentraia de referin este de regul estimat n mol/l dei aceast valoare mare nu este utilizat niciodat atunci cnd domeniile de msur se raporteaz la 1-10 mmol/l iar n prezent s-au
atins sensibiliti de ordinul nmol/l i pmol/l.
Rspunsul n regim tranzitoriu este important pentru analiza probelor n regim dinamic i n tehnicile de eantionare ns este mai puin semnificativ n monitorizarea continu. Rspunsul tranzitoriu este estimat prin panta (dR/dt)max dup adiia de analit n celula de msur. O metod de evaluare este de a introduce senzorul ntr-un sistem FIA
pentru analiza secvenial de probe ntr-un regim hidrodinamic precizat.
Sensibilitatea i domeniul liniar de msur a concentraiei n regim staionar sunt
determinate din reprezentare grafic:
Rss Rbl
c
versus log 0
c
c

sau
Rss Rbl
c
versus log 0
c
c
log 0
c

Aceast metod este mult mai concis dect curbele de calibrare curent utilizate de
plotare a rspunsului corectat la linia de baz funcie de concentraie sau logaritmul ei. n
acelai mod se determin i rspunsul n regim tranzitoriu prin:
dR
dR

dt max sau dt max versus log c


c
c
c0
log 0
c

n toate cazurile parametrii se estimeaz n domeniul de rspuns liniar al biosenzorului. Orice biosenzor electrochimic are o limit superioar de liniaritate a rspunsului.
Aceast limit este direct legat de proprietile biocatalitice sau de biocomplexare
a receptorului biochimic sau biologic. Mai mult n cazul biosenzorilor cu enzime aceast
limit este semnificativ influenat de membranele i de substraturile de imobilizare unde
barierele de difuzie i cinetice secundare au un rol important.
70

Concentraia local a analitului n stratul de reacie poate fi cu dou ordine de


mrime mai mic dect n volumul soluiei. Cinetica enzimatic fiind descris de mecanismele Michaelis Menten i exprimat prin parametrii KM i VM, biosenzorii sunt
adesea caracterizai prin parametrii apareni KM i (Rss-Rbl): KM reprezint concentraia
analitului la valoarea lui (Rss-Rbl)max/2 din curba de rspuns, VM, viteza maxim de reacie
[23,24,48,96]. Cnd valoarea aparent KM este mare raportat la activitatea enzimei n
faz de soluie ( enzime solubile) atunci exist o barier de difuzie dintre prob i stratul
de reacie cu enzima imobilizat sau rata de reacie a cosubstratului cu enzima este mare.
De reinut c pentru cinetica enzimei n faz de soluie, KM, este uzual determinat din
reprezentarea grafic de tipul Lineweaver-Burk [96]:

1
1
vs
c
Rss Rbl
Pentru orice biosenzor electrochimic trebuiesc stabilite numrul de standarde utilizate i cum matricea de probe standard poate fi simulat sau duplicat, ele fiind necesare
pentru a specifica procedurile pentru fiecare tip de senzor legat de aplicaia sa. Acestea
sunt de importan special pentru cazul senzorilor de unic folosin ce utilizeaz imunoafinitatea sau reaciile de inhibiie.
Sensibilitatea este panta curbei Rss Rbl vs c sau log c i nu trebuie confundat cu
c0

limita de detecie (LOD) cuantificat n raport cu linia de baz sau cu semnalele de zgomot. Domeniul de concentraii de lucru este determinat de limitele de detecie inferioare
respectiv superioare.
Selectivitatea, sigurana n exploatare
Selectivitatea i sigurana sunt determinate ca pentru orice tip de senzor amperometric sau poteniometric [97, 98]. Ele depind de alegerea receptorului i a traductorului.
Cele mai multe enzime sunt specifice dar sunt i clase de enzime nonselective, cum
ar fi, alcooloxidaze, grupul de zaharuri oxidaze, peroxidaze, lactaze, tirosinaze, ceruloplasmin, alcooldehidrogenaze, glucozdehidrogenaze, NADH-dehidrogenaze etc.
Ele au fost folosite pentru dezvoltarea de biosenzori pentru determinarea fenolilor
din mediu [99, 100] sau n monitorizarea calitii alimentelor. Bacteriile, drojdiile, culturile de celule sunt n mod natural nonspecifice. Pe de alt parte electrozii de oxigen, electrozii pH, ISFET-urile prezint o selectivitate specific pronunat la fel i electrozii
metalici care sunt sensibili la numeroase substane. Selectivitatea proprie poate fi modificat cnd aceti traductori sunt asociai cu receptorii. De exemplu ENFET este pH senzitiv la soluia tampon i la protonare dar selectivitatea sa nu este modificat.
Cnd traductorul interfereaz cu alte substane cunoscute ca ascorbat sau urai la
senzorul de glucoz bazat pe detecia peroxidului de hidrogen aceste efecte secundare pot
fi restricionate prin utilizarea de membrane permselective exterioarea sau interioare.
Alternativ, se concep senzori cu i fr receptori biologici ce funcioneaz prin
compensare - senzori difereniali. Tipuri de senzori difereniali sunt dezvoltai pe principiul ISFET sau ENFET. Exist diferite proceduri de determinare a selectivitii biosenzorului dar dou sunt recomandate de normele IUPAC.
71

Prima const n evaluarea rspunsului biosenzorului prin adugarea de substane ce


produc posibile intereferene. n acest caz se compar curba de calibrare a analitului n
condiii identice de msur. Selectivitatea se exprim ca raportul dintre semnalele pentru
analit i analit cu susbstanele de interferen. A doua procedur const n adugarea de
substane de interferen ntr-o celul dat ce conine o concentraie de analit cunoscut.
Selectivitatea este exprimat ca procentul de abatere fa de curba de calibrare a
analitului. Aceast metod depinde de concentraia analitului. Sigurana n exploatare a
senzorului depinde de selectivitatea i reproductibilitatea i de acurateea msurtorilor.

72

4.9 Exemple de biosenzori electrochimici


4.9.1 Electrodul Clark, aplicaii n medicin

Principiul de construcie
Clark a studiat electrochimic oxigenul ca un gaz reductor i platina ca un electod
de metal. Platina folosit pentru detectarea oxigenului electrochimic, este recunoscut sub
denumirea de electodul Clark . Electrodul are o membran organic care acoper stratul de electrolit i doi electrozi metalici. Oxigenul difuzeaz prin membrana i este redus
electrochimic la catod. ntre catod i anod se aplic o tensiune fix, pentru care reacia de
reducere a oxigenului are loc.Temperatura influeneaz mult viteza de reacie i
solubilitatea (figura 4.1A). Acesta este un electod polarografic utilizat pentru msurarea
concentraiei oxigenului n lichidele corpului sau n gaze. Mostra sau eantionul de
msurat este n contact cu o membran (polipropilen sau teflon ) prin care oxigenul
diuzeaz ntr-o camer de msur coninnd soluie de clorur de potasiu saturat 50%. n
camer sunt doi electrozi, unul este de referin, Ag/AgCl i altul este de platin, mbrcat
n sticl. Curentul electric la potenialul de polarizare de - 600 mV, este proporional cu
concentraia oxigenului n soluie. Pentru polarizare invers la+600mV se pot realiza
msurtori pentru hidrogen. Reaciile sunt foarte sensibile la temperatur i trebuie
meninut la valori de 0,10C. Electrodul este calibrat utiliznd un amestec din cele dou
gaze oxigen i hidrogen- de concentraie cunoscut. Astfel electrodul de oxigen sau
electrodul Clark s-a dovedit a fi un analizor al gazelor din snge atunci cnd efectum
analize de chimie n laboratorul clinic i n general n aria ngrijirilor medicale, regim
ambulatoriu sau de terapie intensiv. Clark a avut ingenioasa idee de a plasa pe suprafaa
electrodului de platin o enzim care reacioneaz cu oxigenul. Enzimele sunt plasate
ntr-o membran nchis la suprafa, care poate fi recunoscut ca cel mai simplu model de
biosenzor. Curba msurtorilor concentraiei de oxigen a fost proporional cu concentraia glucozei. Acesta a fost primul biosenzor construit, care a ajutat mult la progresul
analizelor de laborator. Pentru scopuri medicale detaliem cteva din etapele funcionrii
acestui tip de electrod. Oxigenul difuzeaz prin membran i este redus electrolitic la
catod. Cu ct este mai mare presiunea parial a oxigenului, cu att difuzeaz mai mult
oxigen la un moment dat. Senzorii de temperatur ataai probei permit compensarea pentru membran a vitezei de difuzie i solubilitate. Instrumentele de msur nregistreaz:
curentul catodului, temperatura probei, temperatura membranei, presiunea ba-rometric,
salinitatea. Cu aceste informaii se poate calcula oxigenul coninut n prob, fie n pri
per milion (ppm), sau n procente ale saturaiei n oxigen. Configuraia geome-tric a
electrodului Clark, are o mare importan. n particular, grosimea stratului electrolitic
dintre catod i membrana trebuie s aib o anumit limit, pentru a asigura liniaritatea i
micorarea driftului de curent.

73

Figura 4.1-Electrod Clark, principiu de construcie i moduri de operare galvanic (A)


respectiv polarografic (B)

Calibrarea unui sistem polarografic este de strict necesitate. n primul rnd trebuie
asigurat proporionalitatea dintre curent i concentraia de oxigen, cu erori sub 1%
(Pentru probele biologice rolul i parametrii aerului sunt eseniale. Aerul, privit ca un
amestec de gaze ce are un procent constant de oxigen, aproximativ 20,9%, cnd intr n
contact cu apa, cantitatea dizolvat depinde de mai muli factori: timpul optim pentru
dizolvarea oxigenului, omogenitatea soluiei de ap, temperatura apei, presiunea aerului,
srurile coninute n ap, alte substane dizolvate n ap, care sunt consumatoare de oxigen). Oxigenul coninut n ap este determinant pentru procesele biologice i chimice, de
aceea msurarea oxigenului dizolvat n ap este foarte important Pentru a gsi presiunea
parial a oxigenului dizolvat, el trebuie s fie saturat n ap pur la o anumit temperatur.
Consideratii practice
1. Agitarea: consumarea oxigenului de ctre proba de investigat poate cauza
scderea concentraiei de oxigen la stratul de grani dintre membran i
prob. Aceasta necesit agitarea continu.
2. Membranele: se folosesc dou tipuri de membrane; membrane libere, neasamblate i membrane de acoperire sau capsule. Membranele libere sunt mai
ieftine, dar exist dificulti de instalare i rezultatele nu sunt repro-ductibile.
Grosimea membranei determin ct de gros trebuie s fie stratul de electrolit
adiacent catodului, aceasta afectnd timpul de rspuns al probei. Precizia
74

fabricrii membranei d o grosime de electrolit ct mai reproductibil, accelernd asfel timpul de msurare i elimin problemele de asamblare.
3. Electrolitul: electrolitul n orice tip de electod de oxigen Clark trebuie s fie
schimbat periodic, altfel se pierde capacitatea de reducere a oxigenului.
Timpul de meninere a electrolitului depinde de rata cu care oxigenul este redus.
4. Calibrarea: aer saturat cu ap. n condiii de echilibru presiunea oxigenului
n apa saturat cu aer este egal cu presiunea parial a aerului saturat cu ap,
adic la o umiditate relativ de 100%. Electrodul msoar valoarea maxim
a presiunii pariale de oxigen. Deoarece difuzia oxigenului n ap i aer sunt
diferite, se aplic un factor de corecie la calibrarea apei saturate cu aer pentru a obine o valoare corect. Cnd se msoar concentraii sczute (sub 2
ppm) este necesar un al doilea punct de calibrare, punctul pentru standard de
oxigen. La concentraia de 0 oxigen (prin adugare de sulfit de sodiu) curentul prin electrodul Clark este 0, acesta constituie al doilea punct de referin.
Aplicaii ale electrodului Clark sunt la msurarea oxigenului dizolvat: tratamentul
apelor uzate, producerea vinului, bioreacii, monitorizarea apei din mediu
4.9.2 Electrodul enzimatic

Electrodul enzimatic (n unele referine cunoscut ca electrod enzim) este o combinaie dintre o sond electrochimic de orice tip (amperometric, poteniometric sau conductimetric) cu un strat subire (10-200 microni) de enzim imobilizat. n aceste dispozitive funcia enzimei este de a furniza selectivitatea n virtutea afinitii sale biologice
pentru un substrat de molecule (figura 4.2). De exemplu o enzim este capabil de a
cataliza o reacie a unui substrat dat pentru un izomer specific dintr-o mulime de substraturi cu diveri izomeri. Tipic gradul de avansare a unei reacii enzimatice ( direct
legat de concentraia analitului) este monitorizat prin viteza de formare a produsului sau
dispariia unui reactant. Dac produsul sau reactantul este electroactiv atunci rspunsul
poate fi monitorizat direct prin amperometrie adic variaia curentului pentru un potenial
aplicat dat. Metoda final de analiz folosit va depinde n cele din urm de proprietile
specifice ale enzimei.
Principalele consideraii sunt:
1. Conine enzima grupuri redox active ?
2. Sunt electroactivi produii reaciei biochimice ?
3. Este electroactiv unul din substraturi sau cofactorii?
4. Care este viteza i timpul de rspuns?
5. Care este aplicaia final a senzorului
Rspunsul la primele trei criterii va depinde n mare parte de sistemul supus investigaiei. Rspunsul la ultimele chestiuni este dependent de cerinele aplicaiilor specifice.
Dac enzima nu conine grupri redox atunci biosenzorul se rezum la a msura
produii sau consumul substratului prin reacia lor la electrodul de transducie. Curentul
electric este direct legat de concentraia analitului.
75

Figura 4.2- Principiul de funcionare a electrodului enzim, fr mediatori

Biosenzori bazai pe rspunsul electrochimic datorat H2O2


Cele mai multe enzime comune folosite n designul de electrozi enzim sunt acelea
ce conin grupri redox ce i schimb starea redox n timpul reaciei biochimice. Enzimele redox sunt oxidazele i dehidrogenazele, pirolochinolin-chinonele (PQQ). Ele acioneaz prin oxidarea substratului acceptnd electroni n timpul procesului iar n continuare se transform n stare redus. Aceste enzime revin n starea activ oxidat prin
transferarea electronilor spre molecula de oxigen rezultnd apa oxigenat,(H2O2). Att
oxigenul ct i peroxidul fiind electrochimic activi, atunci ei continu prin reducerea la
cosubstrat (oxigenul) sau oxidarea peroxidului (produs de reacie). Metoda bazat pe
reducerea oxigenului la electrodul de O2 este una din cele mai simple metode dar sufer
de cteva dezavantaje i anume- rspuns lent, dificulti n miniaturizare, acuratee i reproductibilitate sczut. Msurtorile asupra oxidrii peroxidului surmonteaz dificultile de mai sus i n prezent este cea mai popular metod [101].
Sisteme cu mediatori
O limitare major a sistemului de msur cu ap oxigenat descris mai sus l constituie potenialul de operare mare (circa 0,8V fa de electrodul de referin Ag/AgCl)
necesar pentru oxidarea peroxidului ceea ce conduce la creterea interferenelor. Utilizarea mediatorilor (molecule care pot transporta electroni ntre centrul redox al enzimei i
electrod) pot minimaliza acest inconvenient (figura 4.3)

Figura 4.3- Electrod enzimatic cu mediatori. Mecanismul de intermediere a transferului de


electroni de ctre mediatori de la enzim la electrod

76

Depinznd de natura mediatorilor potenialul aplicat poate fi redus sub limita interferenelor unor specii cum ar fi ascorbat, ureat i paracetamol. Un vast numr de compui
sunt capabili de a aciona ca mediatori n electrodul enzimatic. Dintre acetia cei mai
populari sunt complecii metalici. Reprezentativi pentru complecii organometalici sunt
ferocenii i derivaii lor deoarece au o larg plaj de poteniale redox, sunt inde-pendente
de pH iar schemele sintetice sunt directe fr complicaii. O serie de ali mediatori prezentai n figura 4.4 au fost intensiv studiai n literatura de specialitate. Compilarea a o
serie de articole de sintez din revistele Biosensors B, Biosensors & Bioelectronics
(Elsevier 1996-2004) arat ponderea tipurilor de mediatoriutiliza n biosenzorii cu enzime ( procentele din figura 4.4 reprezint ponderea apariiei tipului de mediator pentru 135
articole consultate).

Figura 4.4- Tipuri de mediatori utilizai n electrozii enzim

Sisteme bi-enzimatice
Lucrri recente s-au focalizat pe comunicarea direct a transferului de electroni
dintre enzime i electrozi. Succesele n domeniu sunt limitate la enzima peroxidaz HRP(horse redish peroxidaza) care catalizeaz reducerea peroxidului de hidrogen pentru un
numr de compui organici. Cnd enzima este imobilizat pe electrod, necesarul de reductor organic este prevenit de electrodul nsi care furnizeaz echivalenii reductori.
Cuplarea peroxidazei cu o enzim oxidaz permite construcia de sisteme bienzimatice prin care peroxidul produs de oxidaz este detectat de sistemul electrod-peroxidaz care opereaz la poteniale mult mai mici n raport cu un electrod simplu de
platin.(figura 4.5) De aici rezult i minimalizarea interferenelor speciilor active.

77

Figura 4.5 Sisteme de senzori bi-ezimatici

Meecanisme implicate n senzorul amperometric enzimatic


Amperometria, ramur a electrochimiei, care se ocup de fenomenele de reducere
(adiie de electroni) i oxidare (eliminare electroni), e.g fenomene redox, prin msurarea
curentuli electric la poteniale constante. n teorie orice ansamblu de atomi poate fi oxidat
sau redus dac se furnizeaz suficient energie. n general domeniul de energii necesar
pentru procesele redox este limitat de condiiile experimentale. Moleculele ce pot fi uor
oxidate sau reduse se numesc electroactive iar potenialele la care acestea au loc se numesc poteniale redox. Oxidarea sau reducerea implic un transport de sarcin deci apare
un curent electric i cum totul are loc ntr-o celul electrochimic sub un potenal aplicat
ntre electrodul de lucru i unul de referin,acesta se numete adeseori curent Faradeic.
Curentul Faradeic este direct proporional cu concentraia analitului electroactiv.Transferul de sarcin ce apare n celula electrochimic este descris de ecuaia general:

O + ne = R

4. 1

unde n este numrul de electroni (e) transferai de la oxidantul O la reductorul R. Este un


proces reversibil simplu care are loc la interfaa dintre electrod (sursa de electroni) i mediul ionic conductor ce conine speciile electroactive de analit.
Curentul msurat (I) n timpul electrolizei este o msur direct a ratei reaciei
electrochimice ce are loc la electrod:

I = nF

dN
dt

4. 2

unde dN/dt reprezint viteza de reacie la electrod ( de oxidarea sau reducere), [mol/sec],
N numrul de moli , F-constanta Faraday (96,845 C/mol)
Viteza reaciei la electrod este direct proporional cu fluxul de molecule spre electrod, J (mol/sm2) i aria acestuia, A:
78

dN
= AJ
dt

4. 3

Combinnd ecuaiile 4.2 i 4.3 se obine ecuaia fundamental a tuturor proceselor


implicate ntr-un biosenzor amperometric:

I = nFAJ

4. 4

Fenomene de difuzie:
Datorit naturii heterogene a proceselor viteza de reacie depinde att de rata de
transfer de electroni la interfa i de transportul de mas de analit la electrod din volumul
soluiei. Pentru un biosenzor amperometric, dealtfel pentru orice proces electrochimic,
este necesar s se cunoasc modul de transport al analitului ca specie electroactiv la suprafaa electrodului. Dou procese sunt importante: difuzia i convecia. Difuzia este fenomenul de transprt al moleculelor dintr-un spaiu cu concentraie mare spre unul cu concentraie mic. Este o consecin a micrii perpetue a moleculelor i a echilibrrii potenialelor chimice. Fenomenul de difuzie are un rol important n procesele care stau la baza
funcionrii senzorului amperometric. Dac considerm relaia (4.4) observm c transportul de substan electroactiv conduce la concentrarea analitului spre electrod.
Iniial concentraia de O era uniform n tot volumul soluiei. Cnd curentul trece
prin soluie concentraia de O la suprafaa electrodului devine mai mic fa de volumul
soluiei datorit conversiei aces-tuia ntr-o form redus R. n acest context apare un flux
suplimentar spre electrod dinspre soluie iar acest fenomen de difuzi este descris de prima
lege a lui Fick:

J ( x, t ) = DO

cO ( x, t )
x

4. 5

unde DO este coeficientul de difuzie a oxidantului iar cO concentraia acestuia n volumul


soluiei, x-direcia de transport spre electrod iar t-timpul, J-densitatea de flux de substan
electroactiv (O), adic numrul de moli de substan transportai n unitatea de timp pe
unitatea de suprafa.
Curentul care trece prin biosenzor este dependent de fluxul de material spre electrod adic prin introducerea ecuaiei 4.5 n 4.4 obinem:

I = nFAJ (0, t ) = nFADO

cO (0, t )
x

4. 6

79

Stratul de difuzie Nernst:


Una dintre cele mai simple ci de a nelege efectele dependente de timp asupra
curentului electric ce trece prin electrod o constituie dezvoltarea conceptului de strat de
difuzie introdus de Nernst (1904). Cnd un electrod este polarizat la interfaa sa cu fluidul
au loc reacii de oxidare sau reducerece care reduc la zero concentraia analitului. Pentru a
compensa scderea de concentraie are loc difuzia analitului din volumul soluiei spre
electrod. La echilibru dintre viteza cu care se consum speciile la electrod i difuzia acestora din volumul soluiei se stabilete un profil specific al concentraiei funcie de distana
de la electrod (figura 4.6). Pe figur se observ cteva puncte cheie. Electrodul, bara neagr, este situat n partea stng a figurii. Axa x este orientat dinspre electrod spre volumul soluiei cu originea pe suprafaa electrodului. Pe axa y este reprezentat concentraia analitului din soluie. Observm dou regiuni distincte n evoluia concentraiei.
n volumul soluiei ea este constant i repre-zentat prin linia orizontal c=cO. A
doua regiune situat lng electrod prezint o cderea concentraiei spre zero. Aceast
regiune, cunoscut ca stratul de difuzie Nernst are grosimea . Grosimea exact a acestui
strat depinde de natura soluiei i de cinetica reaciilor la electrod. Pentru soluii omogene
care nu sunt supuse agitrii sau altor factori grosimea
stratului de difuzie se situeaz ntre 0,01 i 0,001 mm. O
important presupu-nere a acestui model este c atunci
cnd analitul atinge suprafaa electrodului acesta se consum instantaneu prin oxidare sau reducere. n practic
aceasta este uor realizabil prin alegerea unui potenial
de polarizare convenabil. n concluzie teoria stratului de
difuzie ne arat c:
Exist ntotdeauna un strat subire , staionar n contact cu suprafaa elec-trodului
a crui grosime este dependent de procesele implicate i de natura soluiei.
n cadrul acestui strat difuzia controleaz Figura 4.6-formarea stratului de
difuzie Nernst
transferul de analit spre electrod prin gradientul de concentraie .
n afara stratului limit difuzia este neglijabil iar concentraia este meninut la valoarea c0 fie prin agitaie sau convecie
Din figura 4.6, pentru cazul ideal, gradientul descreterii concentraiei este liniar
astfel nct putem s scriem:

dc cO ce
=

dx

47

Deoarece concentraia la electrod, ce=0 atunci

dc cO
=
dx

48

i fluxul de substan prin stratul de difuzie conform cu 4.5 este


80

J = D0

cO

49

iar curentul limit prin stratul de difuzie spre electrod devine ( 4.6):

IL =

nFAD0cO

4.10

Astfel curentul electric de limitare datorit stratului de difuzie este direct proporional cu concentraia analitului i invers proporional cu grosimea stratului.
Biosenzorul n condiii de neechilibru. Ecuaia Cottrell
Cazul prezentat anterior referitor la formarea stratului de difuzie a fost evaluat n
condiiile n care soluia cu analii era omogen sau supus unei agitaii continui pentru
omogenizare. Rezultatele au artat un profil de difuzie staionar la suprafaa electrodului
( adic gradientul de concentraie nu se schimb n timp) i de aici a rezultat un curent
staionar. Se va prezenta cazul apropriat de realitate cnd analiii sunt n cantiti foarte
mici ntr-un volum dat de soluie nesupus agitrii. Pn la aplicarea potenialului pe electrod soluia i electrolitul (de regul analitul) pot coexista fr ca o reacie chimic s aib
loc. Cnd un potenial este aplicat pe electrod cu o valoare suficient de mare pentru a se
iniia electroliza componentei electroactive (la t=0) atunci concentraia la suprafaa
electrodului (x=0) se reduce la zero. Din acest moment se stabilete un gradient de concentraie cu o curgere de material dinspre soluie spre electrod. ntruct soluia este staionar (fr micare prin agitare) stratul de difuzie nu va mai fi constant n grosime. El
va crete dinspre electrod spre soluie iar gradientul de concentraie se va modifica continu n timp rezultnd un curent nestaionar pe electrod. Astfel va trebui s se dezvolte un
nou tip de relaii de legtur pentru acest proces de schimbare a fluxului la electrod. A doua lege a lui Fick leag evoluia concentraiei de timp i spaiu. Pentru cazul unidimensional legea a doua a lui Fick se scrie:

cO ( x, t )
2 cO ( x, t )
= DO
t
x 2

4. 11

unde toate variabilele au aceai semnificaie uzual. Ecuaia diferenial 4.11 are soluii
diferite pentru diferite condiii de grani. Utiliznd transformata Laplace pentru ecuaia
4.11 se obine dependena concentraiei de parametrii x i t:

x
c( x, t ) = c erf

Dt

4. 12

unde erf- reprezint funcia eroare. Considernd derivata funciei 4.12 la interfaa cu
electrodul (x=0) se obine:

c
dc
=
Dt
dx x =0

4. 13

iar curentul la electrod se calculeaza din 4.6 cu nlocuirea expresiei din 4.13:
81

i = nFAD

dc(0, t )
D
= nFAc0
dx
t

4. 14

cunoscut ca ecuaia Cottrell pentru orice proces ce implic difuzia ntr-un spaiu unidimensional, semiinfinit. n acord cu aceast ecuaie produsul dintre curent i rdcina
ptrat a timpului este o constant, adic nu se stabilete un curent staionar pe suprafaa
electrodului.
Model matematic pentru electrodul enzimatic, regimul cinetic vs regimul difuzional
Comportarea i performanele unui electrod enzimatic sunt strict dependente de o
serie de factori (imobilizarea pe electrod, tipul de electrod, tipul de substrat de imobilizare, natura soluiei cu analii- fluidul biologic) care n final impun cinetica i
transportul, elementele ce definesc parametrii de funcionare. Cu elementele de baz prezentate anterior precum i cu descrierea cineticii enzimelor se poate elabora un model de
funcionare ce ne permite s stabilim parametrii de lucru a electrodului enzimatic.
Fiind un electrod cu o enzim imobilizat pe suprafaa sa cinetica reaciei este dominant la interfa iar procesele de difuzie sunt dominante dinspre volumul soluiei spre
electrod.
Prin urmare cele dou procese sunt spaial separate (figura 4.7).

Figura 4.7-Model matematic de funcionare a electrodului enzim pe baza a dou procese concurente-cinetic
i difuzional. Modelul const din trei regiuni: convectiv (x>L) unde concentraia analitului este
meninut constant la c=Svol , difuzional (0<x<L) unde au loc procese de difuzie pur, cineticunde la x=0 au loc reaciile controlate de enzim

Pentru a surprinde procesele biochimice i fizice s-au impus cteva simplificri:


coeficienii de activitate i partiia analitului sunt considerai unitari pentru cele trei domenii, furnizarea de orice tip de co-substrat este constant i independent, enzima este
distribuit uniform pe toat suprafaa electrodului la x<0, semnalul dat de senzor (curentul electric) depinde numai de generarea de produi care la rndul lor sunt dpendeni de
fluxul de analit (substrat) n senzor. Condiiile de grani sunt stabilite la cele dou interfee (c=S1) i n adncimea stratului de enzim spre interfaa cu electrodul (c=0).
82

Utiliznd S1 ca referin pentru concentraia de substrat la intrarea n zona enzimei


imobilizate i considerentele de cinetic enzimatic intuitiv se poate constata pentru concentraie o descretere exponenial care se exprim:

c ( x ) = S1 exp

De

x; x<0

4. 15

unde este Vmax/ KM iar De reprezint coeficientul de difuzie a substratului n stratul cu


enzima imobilizat.
Rspunsul senzorului este comtrolat de cinetica de reacie a enzimei dac aceasta
se efectueaz cu o vitez mic fa de procesul general de difuzie. n aceste condiii i
presupunnd c numai jumtate din produii generai de enzime difuzeaz spre electrod
atunci curentul (Icinetic) de electrod poate fi exprimat ca:

I cinetic = nFAL

k2 [ E ][ S ]

2 ( K M + [ S ])

4. 16

unde se observ c este direct proporional cu grosimea stratului de enzime imobilizate ,


concentraia de enzime [E] i cea de substrat [S].
Pentru cazul n care ncrcarea enzimei este mare ( KM <<[S]) atunci se atinge un
curent maxim de:

I cin max = nFAL

k2 [ E ]
2

4. 17

Combinnd ultimele dou ecuaii se obine n final;

I cinetic = I cin max

[S ]
( K M + [ S ])

4. 18

relaie ce permite determinarea experimental a parametrilor electrodului enzim n regim


cinetic de funcionare. O simpl analiz a ecuaiei de mai sus pune n eviden o comportare a curentului cinetic similar cu ecuaia Michaelis-Menten ce descrie cinetica enzimei.
Rezultatele nu sunt surprinztoare deoarece rspunsul este dictatat n principal de
reaciile enzimatice i nu de procesele de difuzie. Singura diferen dintre ecuaiile cinetice ale enzimei i relaia 4.18 este aceea c termenul vitez de reacie este nlocuit cu
expresia curentului. n consecin i forma curbelor de rspuns este identic. n cazul n
care procesele din stratul enzimatic de grosime d este mai rapid dect procesele de difuzie
i transport ( adic concentraia S1 este aproximativ 0) atunci rspunsul senzorului este
determinat de controlul transportului de analit. Concentraia S1 fiind neglijabil atunci ea
este practic zero n tot stratul unde enzima este imobilizat. Aceasta este posibil cnd
parametrul adimensional 2 este supraunitar:

2 =

d2
De

Vmax d 2
K M De

4.19

83

Acest parametru compar viteza de reacie enzimatic (Vmax/KM) cu difuzia prin


stratul cu enzima imobilizat (d2/ De). Dac 2<1 atunci regimul cinetic este predominant
iar dac 2>1 rspunsul este sub controlul difuziei.
Analog situaiei cinetice se poate deduce o expresie general pentru senzorul opernd n regim limitat de procesele de difuzie astfel:

Id =

2 I max De [ S ]
k2 [ E ]d 2

4. 20

Comparnd cele dou cazuri limit se constat c Id este dependent att de grosimea
d i de coeficientul de difuzie n timp ce Icinetic este dependent de L i independent de coeficientul de difuzie. ntruct S1 reprezint maximul de concentraie posibil n stratul cu
enzim atunci rspunsul liniar a senzorului va fi determinat de S1 cnd S1<< KM. Este
posibil s determinm o expresie pentru S1 ca funcie de Svol astfel:

S1 =

Svol
L
1+
De
DS

4. 21

Aceast relaie arat c S1 este dependent de coeficienii de difuzie i poate fi optimizat printr-o atent selecie a parametrilor de difuzie DS, De ( difuzia n stratul de
imobilizare i n stratul limit), grosimea L. n termeni operaionali creterea grosimii
stratului de difuzie sau descreterea difuzivitii pot fi limitate prin caracteristicile de timp
de difuzie prin membrana (stratul) de imobilizare.
Timpul caracteristic de transfer prin membran (=L2/DS) este adesea factorul ce
determin performanele senzorilor n general i a electrodului enzim n particular, parametrii cinetici sunt determinani n stabilirea regimurilor de lucru ale biosenzorului
electrod enzimatic.

84

4.10 Referine

1. Tothill, I.E., Newman, J.D., White, S.F. and Turner, A.P.F. Enzyme and Microbial
Technol,pp296 (1996)
2. Cullen, D.C. n "4th World Congress on Biosensors", 29-31 May, Bangkok, Thailand.
Elsevier Applied Science, Oxford, UK. p. 50. (1996)
3. Fisher, U., Alcock, S.J. and Turner, A.P.F. Biosensors& Bioelectronics, 23, p 10,
(1995)
4. Turner, A.P.F., Newman, J.D. and Rickman, A. "Optics for Environmental and Public
Safety", Munich, Germany, 19-23 June 1995, Europto Series, Berlin, Germany.
5. Newman, J.D., Marazza, G. and Turner, A.P.F. Anal. Chim. Acta vol 262, 13 (1992).
6. Saini, S. and Turner, A.P.F. Trends Anal. Chem., vol14, 304 (1995)
7. Dennison, M.J., Hall, J.M. and Turner, A.P.F. Anal. Chem., vol 67, 3922 (1995).
8. Alcock, S.J., White, S.F., Turner, A.P.F., Setford, S., Tothill, I.E., Dicks, J.M.,
Stephens, S., Hall, J.M. and Warner, P.J. British Patent Application 9416002.5,
(1994)
9. Skuridin, S.G., Yevdokimov, Y.M., Efimov, V.S., Hall, J.M. and Turner, A.P.F. Biosensors& Bioelectronics., 11, 903 (1996).
10. Psoma, S. and Turner, A.P.F. "3rd World Congress on Biosensors", 1-3 June, New
Orleans, USA. Elsevier Applied Science, Oxford, UK, (1994)
11. Dobson, D.J., Turner, A.P.F. and S Saini,. Anal. Chem.(seriile 1990-1996)
12. Loughran, M.G., Hall, J.M. and Turner, A.P.F. Electroanal.7, 1 (1996).
13. Newman, J.D., White, S.F., Tothill, I.E. and Turner, A.P.F. Anal. Chem., 67, 4594
(1995
14. Jaffari, S.A. and Turner, A.P.F. UK Patent GB9402591.3 (1994) .
15. Selkirk, J.Y., Turner, A.P.F. and Saini, S. "4th World Congress on Biosensors", 29-31
May, Bangkok, Thailand. Elsevier Applied Science, Oxford, UK. p. 198. (1996)
16. Albers, W.M., Lekkala, J.O., Jeuken, L., Canters, G.W. and Turner, A.P.F. Bioelectrochem. Bioenerg. (1996).
17. Chen, B. and Turner, A.P.F. in"24th Symposium European Peptide Society",
Edinburgh, Scotland, September, paper No 23 (1996)
18. DAmico A,.DiNatale C. A Sensors Journal, IEEE, vol1, no 3, pp:183 190 (2001)
19. Muller R., Kamins T., Chan M. Device electronic for integrated circuits JohnWiley &
Sons, 3rd edition, (2003).
20. DiNatale C., Salimbeni D., Paolesse R, Macagnano A., DAmico A.. Sensors and
Actuators B 65 220-6. (2000)
21. DAmico A.et al. Sensors and Actuators B 7 685-8. (1992)
22. Walker N.J. Science 296 pp. 557559. (2002)
23. Ciucu Anton, Biochimie analitic Partea I, Ed U B, pp. 144,(2000)
24. Mutihac Lucia, Fundamentals of analytical biochemistry, Ed UB, pg. 194 (2005).
85

25. Dietrich B., Viout P.and Lehn J.M.: Macrocyclic chemistry: aspects of organic and
inorganic supramolecular chemistry, Ed. Weinheim, New York : VCH, (1993).
26. Cram D. J. and Cram J.M: Container molecules and their guests, (Monographs in supramolecular chemistry no. 4, Stoddart J. F. (ed.)), The RoyalSociety of Chemistry,
Cambridge, (1994).
27. Zolotov Y.A., Macrocyclic compounds in analytical chemistry (Chemical analysis:
vol.143, V.Y. Nagy and Y.A. Zolotov (eds.)), Wiley, New York (1997).
28. Mutihac Lucia, Hans-Jrgen Buschmann, Mutihac Radu-Cristian, and Eckhard
Schollmeyer , J. Incl. Phenom. Macrocyclic Chem.51, 1, 1-10, (2005).
29. Diamond D., G. Svehla, E. Seward and M.A. McKervey, Anal. Chim. Acta, 204, 22331. (1988)
30. Diamond D. and K. Nolan: Calixarenes, Anal.Chem., 73, pp. 22A-29A. (2001)
31. Asfari Z., V. Bohmer, J. Harrowfield and J Vicens: Calixarenes 2001,Kluwer
Academic Publishers, Netherlands, (2001).
32. Roitt I. M. Essential Immunology, ninth edition, Blackwell Science (1997)
33. Carr, P. W. and Bowers, L. D. Immobilized Enzymes in Analytical and Clinical Chemistry , Blackwell Science (2000)
34. Kubo Y, Maseda S,Tokita S, Kubo M, Nature vol 382, pp522 (1996)
35. Buck L. and R. Axel, Cell, 65,175187, (1991)
36. Caterina E et al. Nature 389, 27-28 (1997)
37. Corey D.P et al. Nature 432, 723730, (2004)
38. Fleig A and Penner R. The TRPM ion channel subfamily: molecular, biophysical and
functional features. TIPS 25 (12), (2004)
39. Friedrich R.V. Nature 430, 760-768 (2004)
40. Hallem E.A. et al. Cell 117, 965979, (2004)
41. Basbaum Julius D. A.I.Nature 413, 204-207(2001)
42. Lin S-Y.,Corey D P, Current Opinionin Neurobiology 15:350357, (2005)
43. Neher E, Nature Biotechnology 19,24-36 (2001)
44. Suh G.S.B et al.. Nature Neurosci 431, 657-658(2002)
45. Sukharev S. and Anishkin A.. Mechanosensitive channels: what can we learn from
simple model systems? TINS 27(6),( 2004)
46. Voels et al., Nature Chemical Biology 1,26-35 (2005)
47. Shinichi Komaba, et all, Sensors and Actuator B:Chemical, 52, 1-2, 78-83 (1998)
48. Dinischiotu Anca, Costache Marieta, Biochimie generala, vol I, proteine, glucide i lipide, Ed. Ars Docendi,(2004)
Costache Marieta, Anca Dinischiotu Biochimie general, vol II, acizi nucleici: structur i organizare,Ed. Ars Docendi,(2004)
49. Freitas Robert A, Nanomedicine, vol 1-4, (seriile 1998, 2004), (www.foresight.org/
Nanomedicine/NanoMedTOC.html)
50. Hui Peng, et all, Biosensors & Bioelectronics, 20,18211828, (2005)
86

51. Barboric Andrei, Principii i sisteme de msurare a mrimilor fiziologice, Ed UB,


117p, (2000)
52. Forster R.J, Chem Soc.Rev. 23, 4, pp 289 (1994)
53. Forster R.J, in Encyclopedia of Electrochemistry, P.A Unwin and A.J. Bard (ed)
Wiley, New York, (2000)
54. Buck R.P, et al, Pure and Appl.Chem, 74, 11, pp 2169-2200 (2002)
55. Umezawa Yoshio et all, Pure and Appl.Chem, 74, 11, pp 923-994, (2002)
56. Umezawa Yoshio et all, Pure and Appl.Chem, 74 11, pp 995-1099, (2002)
57. Scheller Frieder, Schubert Florian, Biosensors, Ed Elsevier, (1992)
58. Freitag R, Biosensors in Analitical Biotechnology, UK, Ac. Press (1996)
59. Buerk D.G, Biosensors Theory and Applications, Lancaster, USA, technomic Publishing Comp. Inc (1993)
60. Hall E.A.H, Biosensors, UK, Open Univ. Press (1990)
61. Cornish-Bowden, A Principles of enzyme kinetics. London: Butterworth. (1976).
62. Fersht, A. Enzyme structure and mechanism, 2nd ed, New York: W.H.Freeman &
Co.Henderson, P.J.F. (1978).
63. Stamatin Ioan, Berlic C., Vaseashta A., Thin Solid Films, 495, 1-2 p 312-315, (2006)
64 . Thevenot Daniel R, et all, Pure Appl. Chem., 71,12, p. 2333-2348, (1999).
65. Cammann K. Fresenius Z. Anal. Chem. 287, 1 (1977).
66. Turner A. P. F, I. Karube, G. S. Wilson (eds.) Biosensors, Fundamentals and Applications. Oxford University Press (1987)
67. Bergveld P, D. R. Thevenot. Advances in Biosensors, Supplement 1 (A. P. F.
Turner, ed.), p. 31. JAI Press,London, UK (1993).
68. Durst R. A, Baumner A. J., Murray R. W., Buck R. P., Andrieux C. P.. Pure Appl.
Chem. 69, 1317 (1997).
69. Kutner W, J. Wang, M. L'Her, R. P. Buck. Pure Appl. Chem. 70, 6, 1301 (1998).
70. Ciucu Anton, Biosensors for environmental monitoring. Ed Niculescu, Bucuresti, pg.
352, (2000)
71. Inczedy J, T. Lengyel, A. M. Ure (eds.). IUPAC Compendium of Analytical Nomenclature, 3rd edn. Blackwell Science, Oxford (1998).
72. Bartlett P. N, P. Tebbutt, R. G. Whitaker. Prog. React. Kinet. 16, 55 (1991).
73. Scheller F. W, D. Pfeiffer. Z. Chem. 18, 50 (1978).
74. Bindra D. S, Y. Zhang, G. S. Wilson, R. Sternberg, D. R. Theavenot, D. Moatti, G.
Reasch. Anal. Chem. 63, 1692 (1991).
75.Wollenberger U, F. Schubert, F. W. Scheller. Trends Biotechnol. 11, 255 (1993).
76.Theavenot D. R, P. R. Coulet, R. Sternberg, J. Laurent, D. C. Gautheron. Anal. Chem.
51, 96 (1979).
77. Aizawa M. Anal. Chim. Acta 250, 249 (1991).
78.Sugawara M, H. Sato, T. Ozawa, Y. Umezawa. In Frontiers in Biosensorics,
Fundamental Aspects (F. W.Scheller, F. Schubert, J. Fedrowitz, eds), pp. 121-131.
Birkhauser Verlag, Basel (1997).
87

79. Kiefer H., B. Klee, E. John, Y. D. Stierhof, F. Jaehnig. Biosens& Bioelectron. 6, 233
(1991)
80. Sugawara M., . Hirano A, Rehak M., Nakanishi J., Kawai K., Sato H., Umezawa Y.
Biosens &Bioelectron. 12,5,425 (1997).
81. Ciucu Anton, Aplicaiile Analitice ale Biosenzorilor n Controlul Polurii Mediului,
Ed Ars Docendi, Bucureti, pg 175, (2000)
82. Covington A. K. Pure Appl. Chem. 66, 565 (1994);
Buck R. P, E. Lindner. Pure Appl. Chem. 66, 2527 (1994).
83. Cullen D. C, R. S. Sethi, C. R. Lowe. Anal. Chim. Acta 231, 33 (1990).
84. Ciucu A, C. Negulescu, R.P. Baldwin, Biosens& Bioelectron.,18,2-3, 293-300, (2003)
85 Noguer T., Gradinaru A., Ciucu A., J.L. Marty, Anal. Lett., 32, 1723-1738. (1999)
86 Amine A., M. Alafandy, J. M. Kauffmann. Anal. Chem. 67, 2822 (1995).
87.Guilbault G. G. Handbook of Immobilized Enzymes. Marcel Dekker, New York
(1984).
88. Mosbach K (ed.). Methods in Enzymology, vol. 137. Acad Press, N Y (1988).
89. Cass A. E. G (ed.). Biosensors, A Practical Approach. IRL Press, Oxford (1990).
90. Go pel W, T. A. Jones, M. Kleitz, I. Lundstrom, T. Seiyama (eds). Chemical and
biochemical sensors. In Sensors, A Comprehensive Survey (W. Gopel, H. Hesse,
J. N. Zemel, eds), vols 2 & 3. VCH, New York (1991).
91. Blum L. J, P. R. Coulet (eds). Biosensor Principles and Applications. Marcel Dekker,
New York (1991).
92. Kas J., M. Marek, M. Stastny, R. Volf. In Experimental Techniques in Bioelectrochemistry (V. Brabec, D. Valz, G. Milazzo, eds), Chapter 6, pp. 361-447.
Birkaeuser Verlag, Basel (1996)
93. Rajagopalan R, A. Aoki, A. Heller. J. Phys. Chem. 100, 3719 (1996).
94. Gorton L. Electroanalysis 7, 23 (1995).
95. See J. E. and E. T. Bell, Proteins and Enzymes, Marcel Dekker (1988).
96. Laidler K. J., The Chemical Kinetics of Enzyme Action, Claredon Press, London,
(1958)
97. McNaught A. D, A. Wilkinson. Compendium of Chemical Terminology, 2nd edn.
Blackwell Science, Oxford (1997).
98. Umezawa Y., K. Umezawa, H. Sato. Pure Appl. Chem. 67, 507 (1995).
99. Nistor C., J. Emneus, L. Gorton, A. Ciucu, Anal. Chim. Acta, 387, 309-326 (1999)
100. Lindgren A., Stoica L., Ruzgas T., Ciucu A., Lo Gorton, The Analyst, 124, 527532,(1999)
101. Ciucu A., Nica A.G., Gorton L, Rom. J. Biochem., 39 (1-2), 55-62. (2002)

88

5. Biosenzori microbieni
Exist dou clase de biosenzori microbieni ce folosesc acelai principiu: msurarea
activitii metabolismului n prezena analitului.
Prima clas utilizeaz microorganime imobilizate de la care se msoar produii rezultai din metabolism. Aceast clas a devenit comun definit ca biosenzori microbieni.
A doua clas msoar activitatea electric a metabolismului microorganismelor
atunci cnd consum un biocombustibil, de exemplu glucoza. Aceast clas este cunoscut sub denumirea generic de celule bioelectrochimice sau celule de biocombustie.
Fiind dezvoltat ca un domeniu separat al celulelor electrochimice generatoare de
energie electric, pe baza consumului de biocombustibili, s-a neglijat aspectul capacitii
acestora de a fi adevri biosenzori. Vom trata aceste dou clase separat punndu-le n
eviden performanele i capacitile lor din punct de vedere al cerinelor de a fi biosenzori. Biosenzorii microbieni conin microorganisme imobilizate i un lan de transducie
mult mai diversificat (figura 5.1). n general sunt utilizai pentru un singur proces biochimic [1].
Senzorii microbieni prezint urmatoarele avantaje:
Sensibilitate mai mic la inhibare sau impurificarea analitului;
Au o toleran mai mare n ceea ce privete valoarea pH-ului i a temperaturii;
Au un timp de via mai lung dect electrozii enzimatici;
Sunt mai ieftini fa de electrozii enzimatici;
Variabilitate mare pentru c se adapteaz uor la condiii specifice de mediu;
Independen la cofactori;
Rspuns fiziologic la produii toxici;
Preparare uoar deoarece cultivarea microorganismelor este simpl;
Dezavantajele acestor dispozitive sunt urmtoarele:
Au un timp de rspuns mai mare dect electrozii enzimatici;
Reutilizarea lor ntr-o nou msuratoare necesit un timp mai mare;
n principiu schema unui senzor microbian este identic cu cea a unui biosenzor
enzimatic. Schema const n imobilizarea celulelor intacte n contact intim cu un traductor specific care convertete produii sau efectele metabolismului ntr-un semnal biochimic (figura 5.1).
Senzorii microbieni i-au gsit o serie de aplicaii industriale n procesele biochimice i microbiologice n domenii precum producerea medicamentelor, industria alimentar, tratamentul apelor reziduale i producerea de energie.unde reaciile de fermentaie i
transfer de electroni au un rol important. n domeniul laboratoarelor clinice microbiologie, parazitologie-unde intensiv se utilizeaz medii de cultur senzorii microbieni pre89

zint un potenial important pentru implementare. Cele mai multe materiale din mediile
de cultur nu pot fi determinate prin metode spectrofotometrice fiind optic inactive sau
netransparente. O combinaie mediu de cultur-substraturi de imobilizare cu o cupla-re
adecvat spre un traductor ca n figura 5.1 este fezabil cu avantaje asupra reducerii timpilor de investigare i rspuns la un diganostic specific. Monitorizarea continu, rapid,
sensibil i controlul factorilor variabili deja menionai permit evaluarea substraturilor i
produilor de metabolizare, a numrului de celule viabile prezente n culturi, a tipurilor de
microorganisme.

O2
Analit
NH3
H2S
H+

Oxigen

Microorganisme
imobilizate

Electrod
amperometri
Electrod
potentiometric

pH?

Fotoni

Optrode

Cldur

Termistor

PPProcesare semnal

Figura 5.1 Schema de principiu a senzorului microbian

5.1 Principiu de funcionare


5.1.1 Biosenzori microbieni electrochimici

Biosenzorii microbieni conin microorganisme imobilizate ntr-o membran i un


dispozitiv electrochimic. Clasificarea lor se realizeaz dup tipul activitii respiratorii
msurate sau dup tipul activitii electrochimice, metabolice, optice etc. n cazul modificrii activitii respiratorii a microorganismelor, imobilizate ntr-un substrat, aceasta este detectat de un electrod de oxigen (fig.5.2 a). Prin msurarea activiti respratorii sau a
consumului de oxigen se estimeaz concentraia substratului. n cazul msurrilor de produi de metabolizare se folosesc alte metode electrochimice (figura 5.2.b). Senzorul microbian electrochimic prezint importante diferene fa de senzorul enzimatic. El este
alctuit din componente vii ce produce un rspuns fiziologic, n timp ce senzorul enzimatic include alterarea analitului. Microorganismele utilizate n acest caz sunt aerobe.
90

Senzorul se introduce ntr-o soluie tampon saturat cu oxigen. Dup adiia la substrat, activitatea respiratorie a microorganismelor crete, producnd scderea concentraiei
oxigenului n apropierea membranei. Folosind electodul de oxigen, concentraia substratului poate fi msurat prin detectarea scderii concentraiei oxigenului.
Un alt tip de biosenzor microbian detecteaz activitatea metabolic,electrochimic,
cum ar fi: hidrogenul, dioxidul de carbon, amoniacul i acizii organici, care sunt secretai
de microorganisme (figura 5.2b). Se pot utiliza att microorganisme aerobe ct i anaerobe.
curent
Anod plumb

Substrat

A
H2--------- Celula de combustie
CO2--------- electrod gazos
Substrat

NH3--------- electrod gazos


H+--------- electrod

Figura 5.2- Principiul de funcionare a senzorului microbian electrochimic a) Msurarea


activitii respiratorii, catod Pt b) Biosenzor microbian ce msoar ali metabolii

Cei mai muli biosenzori microbieni se bazeaz pe msurarea activitaii respiratorii


i folosesc activitatea microorganismelor aerobe. Traductorul acestui tip de biosenzor poate fi: electrochimic (poteniometric, amperometric), fotodetector, termistor, ISFET.
5.1.2 Biosenzori fotomicrobieni

Se bazeaz pe fenomenele optice ce le pot avea microorganismele n procesele metabolice: fotoluminiscen, electroluminiscen, chemoluminiscen, activitate optic specific (polarizare dependent de chiralitate, indice de refracie, absorban, etc). De exemplu intensitatea luminescenei fotobacteriilor (luminobacterii) este dependent de activitatea metabolic. Este astfel posibil de a construi biosenzori microbieni puternic senzitivi
prin combinarea acestor fotobacterii cu un fotodetector.
Luminescena in vivo a fotobacteriilor se produce prin urmtoarele reacii enzimatice:
NAD ( P ) FMN
NAD( P ) H + H + + FMN
NAD( P) + FMNH 2
oxidoreductaza

E (luciferaza) + FMNH 2 E FMNH 2


E FMNH 2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H 2O + h

91

unde RCHO=aldehid alifatic i RCOOH=acid gras, FMN (flavin mononucleotid).


Luminescena este puternic afectat de modificrile condiiilor externe pentru bacterii care pot conduce ulterior la acumularea accidental a concentraiilor intracelulare de
NAD(P)H, FMN, H2, ATP i aldehide (sinteza enzimatic a aldehidelor necesit cofactor
ATP). Utiliznd acest principiu pot fi detectate hrana acestor microorganisme (ex. glucoz
i aminoacizi) i inhibitorii lor (ex. toxine i metale grele). Intensitatea luminescenei n
general este un parametru mai sensibil pentru activitatea metabolic dect pentru activitatea de generare a cldurii. Mai mult chiar, rspunsul metabolic al celulelor poate cauza
luminiscena la fotobacterii.
5.1.3 Termistor microbian

Biosenzorii microbieni pot fi construii prin plasarea microorganismelor imobilizate n imediata vecintate a unui termistor care msoar cldura metabolic absorbit sau
cedat produs de acetia (Fig. 5.3). Acest tip de senzor se bazeaz pe principiul general
al msurrii schimbului de entalpie. Deoarece multe reacii metabolice sunt nsoite de o
evoluie considerabil a cldurii, calorimetria se poate aplica pentru a msura o larg varietate de analii. Lipsa specificitii datorate principiului de detecie n general este compensat adecvat prin utilizarea biocatalizatorilor specifici, imobilizai. Oricum, partea cea
mai mare a cldurii eliberat n reaciile metabolice poate fi pierdut n soluie fr a fi
detectat de termistor i limiteaz sensibilitatea acestei tehnici.
Tipuri de msurtori: entalpia reaciilor metabolice, clduri specifice, latente.Termistorii, elementul de transducie, sunt cei mai utilizai ei fiind realizai de obicei din materiale semiconductoare (n majoritate materiale oxidice i au n general un coeficient de
temperatur negativ). Dei au fost raportate foarte multe cazuri de aplicaii ale calorimetriei n analizele biochimice, ea nu poate fi folosit ca o analiz de rutin datorit
costurilor ridicate ale instrumentelor sensibile i complexe ce trebuiesc folosite pentru
acest tip de msurtori. Ca exemplu, gelul de drojdie de bere este introdus n coloana separatoare de sticl care constituie ieirea termistorului. Soluia ce trebuie analizat este
pompat printr-un schimbtor de caldur ce se afl n baia de ap, controlat termostatic
i apoi prin coloana de sticl. Prin acest procedeu se poate msura glucoza , fructoza i
caseina.
Recent microminiaturizarea i introducerea elementelor de microfluidic a condus
la o nou generaie de termistori microbieni care pot senza efecte termice de la un numr
relativ mic de microorganisme.
Un microtermistor microbian cons din asamblarea tuturor componentelor direct pe
suprafaa semiconductoare a oxidului respectiv (figura 5.3b).

92

b
a
Figura 5.3 Tipuri de termistori microbieni,
a) cu reactor termostatat

b) Cu microreactor construit pe termistor

5.2 Rspunsul fiziologic al senzorului microbian

Acesta include o serie de factori:


Substratul este absorbit prin membrana celular;
Respiraia;
Luminiscena i electrochimismul metabolismului bacteriilor;
Secreia sau separarea produilor metabolici de cei nemetabolici;
Modificrile sau degradrile intracelulare ale substratului prin secvene metabolice sau enzime ce nu particip la proces;

Figura5.4 Rspunsul fiziologic al senzorului microbian

93

Comportamentul microorganismelor este dat de starea fiziologic a lor i aceasta


este dat de limitarea extrem a nutrienilor. Metabolismul este o condiie ce asigur supravieuirea celulelor [1]. Prima condiie critic pentru formarea unui semnal la senzorul
microbian este utilizarea substratului (figura 5.4). Solutul poate intra n celule prin sistemul de translocaie specific, nti prin transport activ sau prin difuzie forat.
Transportul pasiv realizat numai prin difuzie datorit gradienilor de concentraie
de oxigen i nutrieni este de mic importan. Transportul activ asigur acumularea substanelor nutritive n substrat n sensul gradientului de concentraie. Aceasta face ca n
substrat s se acumuleze proteine cu o nalt specificitate care se consum n metabolismul energetic. De asemenea cuplajul celulelor cu sistemul de transducie a fenomenelor
energetice, n special n lanul respirator este un important aspect al transportului activ,
fiind crucial pentru formarea semnalului n senzorul microbian, de exemplu folosirea glucozei, sucrozei, i a altor oligopeptide. Dup utilizarea substratului el este degradat specific de secvenele enzimatice prezente i care imobilizeaz celulele. Potrivit condiiilor
aerobice, se consum oxigenul. Astfel acizii organici cum ar fi lactic i piruvaii , dioxidul
de carbon, ionii de amoniu i hidrogenul sulfurat, sunt secretai i se acumuleaz n produi ai metabolismului celular. Este bine de amintit importana fierului n biologia bacteriilor, n general i mai ales la cele Gram pozitiv, n special.
Multiplicarea eficient a bacteriilor patogene n esuturile organismului gazd este
condiionat de prezena obligatorie a fierului feric, ntr-o form accesibil metabolismului lor. Fierul este necesar pentru anumite reacii enzimatice eseniale pentru cretere dar
este i un component cheie al catenei de transport al electronilor n membrana celu-lar respiraie celular[2]. Prin urmare microorganismele cultivate pentru prepararea unui biosenzor microbian trebuie s provin din culturi pe medii echilibrate metabolic n ceea ce
privete fierul feric, care s asigure o buna respiraie celular microorganismelor i o
bun funcionare a electrodului Clark. Se pot folosi i alte tipuri de electrozi, n biosenzorii microbieni, combinaie cu electrozi pentru H2, CO2, NH3. Ei au o plaj mai mare de
msurare, rspund la alte contaminri i au limite de detecie i sensibilitate mult mai
mari fa de electrodul Clark.
La o temperatur i presiune constant, standard, proporia de oxigen din aer, n volume, este de 20.9%. n soluie apoas i n echilibru cu aerul atmosferic, proporia de
oxigen este tot de 20.9%, din totalul gazelor dizolvate. n amndou cazurile n aer i n
soluie, balana azotului este mai mare dect balana dioxidului de carbon.Concentraia
gazelor dizolvate n soluie variaz cu temperatura, i poate fi afectat de solut sau ali
solveni prezeni n soluie. De exemplu, o soluie cald reine mai puin oxigen dect o
soluie rece. Prezena etanolului mrete semnificativ capacitatea unei soluii apoase de a
reine oxigen. n studiile de specialitate se arat c micile diferene de temperatur pot
afecta echilibrul mediului cu aerul din camer, la fel i unii reactivi pe care i adugm n
celula de lucru (de exemplu etanol).
Selecia dispozitivului de transducie este dat de fiziologia celulelor pe care le
utilizm n structura senzorului (respiraia, fotoluminiscena, gravimetria). Cel mai utilizat este tipul amperometric sau poteniometric, electrodul Clark i electrozii ion selectivi
94

de tipul ISFET. Se mai poate utiliza microbalana cu cristal piezoelectric, detector optoelectronic, termistori, sau ISFET dar electrodul de oxigen predomin n senzorii microbieni. Produii metabolici ca lactatul sau piruvatul, dioxidul de carbon , ionii de amoniu i
de hidrogen sulfurat sunt determinai poteniometric cu electozi ion selectiv (ISE). Combinaia direct a microorganismelor cu un tranzistor cu efect de cmp (FET) a fost
dezvoltat pentru estimarea glucozei a alcoolului cu Acetobacter i a xilozei bazat pe celule de Gluconobacter oxidans. S-a constatat c o serie de mediatori solubili cu potenial
redox, cum ar fi etosulfatul de fenazina, fericianida sau fericianida n combinaie cu benzochinona, au posibilitatea msurrii directe a electronilor urmrind activitatea metabolic a celulelor. Recent au fost utilizai mediatori insolubili cum sunt ferocenii, tetrahiafulvalenele i tetracianochinodimetanul, care au fost incorporate n paste de carbon n
contact cu Paracoccus denitrificans .(figura 5.5).

Figura 5.5- Schema de functionare a biosenzorului microbian cu mediatori

O alt tehnic interesant de biosenzor microbian a fost creat prin luminiscena fotobacteriilor conectate cu un detector optic. Astfel a fost creat i descris un senzor
microbian pentru determinarea ionilor de metal i a ionilor aromatici. Prin inginerie genetic genele ce rspund de emiterea luminii de la fotobacteria Vibri au fost transferate n
structura genetic a bacteriilor Escherichia coli sau Seratia marscescens. Viitorul traductorilor n biosenzorii microbieni l dein ns cristalele piezoelectrice, microbalanele cu
cuar cu unul din electrozi funcionalizai.
Prin combinarea microorganismelor cu enzime este posibil s creasc selectivitatea
senzorului microbian. Aceste combinaii sunt capa-bile s determine biopolimeri, cum ar
fi amidonul, proteinele i lipidele, ce nu pot fi apreciai cu ajutorul microorganismelor.
Pentru aceasta microorganismele au fost combinate cu hidrolaze. A rezultat astfel
un senzor hibrid, amperometric, pentru determinarea NAD+, ce are la baz celule de E.
coli i NADase. Ureea i creatinina s-a determinat utiliznd o combinaie de bacterii nitrificatoare i ureaz sau creatinaz. Din experimente cu senzorul BOD s-a ajuns la concluzia c se pot combina mai multe specii de microorganisme i se pot utliza mai multe
substraturi n acelai experiment. Un alt exemplu tipic de biosenzor coninnd populaii
mixte din specii diferite de microorganisme avnd capaciti metabolice specifice l reprezint biosenzorul cu bacterii nitrificatoare. Acest senzor care a fost dezvoltat n special
95

pentru investigarea apelor uzate conine culturi mixte din specii de Nitrosomonas sp. i
Nitrobacter sp. n acest caz s-a folosit un sistem amperometric de msurare pentru determinarea amoniacului. Controlul oxigenului prin senzorul de oxigen este necesar pentru
msurarea concentraiei de amoniac n eantionul de msurat.
Pentru c biosenzorul reacioneaz i cu ali nitrii sau uree, de obicei se nsumeaz
cantitile de substane nitrificatoare. Principalul impediment este surplusul de substrat
(amoniac sau uree). Acest procedeu, al combinrii diferitelor specii de microorganisme,
este folosit cu succes i n domeniul toxicologiei. De obicei se poate folosi un inhibitor
atunci cnd concentraia substratului este prea mare. O posibilitate este folosirea membranelor de dializ, atunci cnd substratul este n exces.
Senzor electrochimic microbian: detector de gaze.
Acest tip de senzori este uor de fabricat i utilizat, deoarece obinerea unui semnal
electro- chimic este cea mai rspndit metod de obinere a semnalului de rspuns.
Dispozitivele poteniometrice msoar densitatea de sarcin acumulat la suprafaa
unui electrod. Un exemplu de senzor care utilizeaz voltametria ciclic este senzorul cu
gaz. Senzorul CO2 folosete bacterii autotrofe. Este cel mai rspndit din punct de vedere
comercial, dar prezint dezavantajul c diverii acizi ionici i acizi organici sau anorganici volatili afecteaz potenialul din interiorul celulei, pH-ul i membrana gaz permeabil ce acoper electrodul. Bacteria autotrof, Pseudomonas S-17, care se poate dezvolta
numai n prezena carbonailor, este sursa de obinere a carbonatului. Ea este incubat n
condiii aerobe la 300C, timp de o lun i este imobilizat pe vrful electrodului de oxigen.
Pentru mrirea domeniului de selectivitate celula se acoper cu o membrana
semipermeabil de PTFE. Sensibilitatea msu-rtorilor se obine folosind o soluie tampon, saturat n oxigen cu pH=6,5, coninnd ioni metalici i 20 moli de glucoz. Timpul
de via al senzorului este mai mare de o lun. Fiind un senzor micro-bian, se utilizeaz la
testarea alimentelor.
Aplicatii ale biosenzorilor microbieni
S-au construit multe tipuri de biosenzori microbieni ce sunt utilizai n monitorizarea virusurilor i n industria alimentar [3]. n tabela 5.1 sunt prezentate cteva din
multitudinea aplicatiilor biosenzorilor microbieni.

96

Tabela 5.1- Aplicaiile biosenzorilor microbieni


SENZOR
Microorganismul
Dispozitiv
imobilizat
Zahar asimilat

Brevibacterium
Electrod O2
lactofermentum
Glucoza
Pseudomonas
Electrod O2
fluorescens
Acid acetic
Trichosporon
Electrod O2
brassicae
Etanol
Trichosporon
Electrod O2
brassicae
Metanol
Unidentified bacteria Electrod O2
Acid formic
Citrobacter freunca Celula
combustie
Metan
Methylomonas
Electrod O2
flagellata
Acid glutamic
Escherichia coli
Electrod O2
Cepholosorin
Citobacter freunda Electrod pH
BOD
Trichosporon
Electrod O2
cutaneum
Lisina
Escherichia coli
Electrod O2
Amoniu
Nitrilying
Electrod O2
bacteria
Dioxid de azot
Nitrilying
Electrod O2
bacteria
Nistatin
Saccharomices
Electrod O2
cerevisiae
Acid nicotinic
Lactobacillus
Electrod pH
araboesis
Vitamina B1
Lactobacillus
Celula
fermenti
combustie
comumitate
-----Celula
microorganisme
combustie
mutageni
Bacillus subtilis ree Electrod O2
Nota: a-mmol; b-p.p.m ; c- unit/cm3; d-numr/cm3

Timp
de Domeniu
raspuns
De masura
min
mgxdm-3
10
10-200
10

2-2510

10

3-60

10

3-25

10
30

5-2510
10-103

0-6,6a

5
10
15

8-800
100-55*102
3-60

5
10

10-107
0,05-1

0,51-255b

1h

0,5-0,54c

1h

10-5-5

6h

103-107

15

108-109 d

1h

1,6-2,85*103

97

5.3 Referine
1

De Anthony P. F. Turner, Ursula Bilitewski, Biosensors for Environmental Monitoring,


pp421, Ed Taylor &Francic, (2000)
2 Veronica Lazar, Microbiologie medical, Ed. Univ. Bucureti, (2001)
3 Y. Lei et al., Analytica Chimica Acta 568 200210, (2006)

98

6. Senzori pe structuri semiconductoare FET


6.1 Tranzistori FET, ISFET, CHEMFET, REFET

Tranzistorul cu efect de cmp (FET) este adesea folosit ca traductor pentru senzorii
i biosenzorii electrochimici. FET este un traductor ce poate converti o informaie chimic ntr-un semnal electric. FET are un rspuns rapid i selectiv pentru analit, un timp de
via de ordinul lunilor i permite un nalt nivel de integrare i miniaturizare. Din principiul de funcionare FET-urile sunt capabile s msoare conductana unui semiconductor funcie de un cmp electric perpendicular pe suprafata oxidului de la poart. n cea mai
simpl versiune (ex.: MOSFET metal oxid-semiconductor FET) el este alctuit dintrun substrat de siliciu dopat tip p ce conine dou regiuni de difuzie de tip n (sursa i drena). Dac substratul este dopat n atunci poarta i drena sunt dopate cu acceptori p. Structura este acoperit cu un strat dielectric de bioxid de siliciu pe care este depus un electrod
de metal ( figura 6.1). Cnd un potenial este aplicat la electrodul poart purttorii minoritari din substrat sunt atrai la suprafaa semiconductorului. Astfel, conducia electric
dintre surs i dren este modificat funcie de potenialul aplicat dintre poart i substrat
[1-5]. n cazul ISFET (ion-selective field effect transistor), electrodul de metal de la poart al MOSFET-ului este nlocuit de o soluie de electrolit care este n contact cu electrodul
de referin i cu bioxidul depus pe poart. SiO2 (figura 6.1b). Electrodului de referin
poate fi considerat ca poart pentruMOSFET.

Figura 6.1 Schema reprezentativ a structurilor a) MOSFET, b) ISFET

n ISFET, curentul electric Id, curge de la surs la dren printr-un canal. Ca n


MOSFET, rezistena canalului depinde de cmpul electric perpendicular pe direcia curentului. Deasemenea, depinde de diferena de potential de la poart oxid-electrolit. n consecin conducia electric a canalului nu este direct influenat de tensiunea aplicat pe
99

poart datorit acumulrilor de sarcin la interfaa oxid-electrolit. Cnd SiO2 este utilizat
ca dielectric, natura chimic a oxidului de la interfa este reflectat n mrimea curentului surs dren. Suprafaa oxidului de la poart conine grupe funcionale OH, care
se afl n echilibru electrochimic cu ionii din soluia probei (H+ i HO-). Grupele hidroxil
de la suprafaa oxidului de la poart pot accepta sau ceda protoni iar o schimbare de pH
va modifica potenialul de la suprafaa SiO2. Cinetica disocierii locale descrie traducerea
semnalului n funcie de starea de ionizare a grupelor SiOH de la suprafaa amfoteric.
Valorile standard ale sensibilitii pH msurate cu ISFET_SiO2 sunt 37 40
mV/unitate pH. Selectivitatea i sensibilitatea ISFET sunt controlate complet de proprietile la interfaa electrolit/dielectric. Alte materiale anorganice de poart pentru senzorii
pH ca Al2O3, Si3N4, Ta2O5 au proprieti mai bune dect SiO2 la rspuns n pH, histerezis
sau drift mai mic.ISFET-urile au fost alese ca elemente traductoare pentru c suprafaa de
SiO2 conine grupe reactive SiOH care pot fi folosite pentru atari covalente ale moleculelor organice i polimerilor [6-10].
MEMFET, SURFET
ISFET-ul poate fi modificat cu o membran sensibil, ce conine ionofori. Dac
oxidul este acoperit cu o membran sensibil la ioni, acest lucru este cunoscut sub
denumirea de MEMFET. n acest caz, stratul este penetrabil pentru ionii specifici iar
potenialul membranei se modific fiind detectat de structura FET. Un FET sensibil la
ionii de potasiu K+ a fost obinut prin acoperire din solveni cu o membran PVC plastifiat coninnd valomicina la suprafaa oxidului de la poarta. SURFET este un ISFET cu
un strat ce blocheaz anumite specii de ioni, sensibili la pH ul dielectricului porii. La
suprafaa acestui strat, potenialul de suprafa este stabilit de asocierea selectiv a ionilor. Un exemplu de SURFET este ISFET-ul cu poart de perilen cu molecule benzo 18crown-6 ionofore ce selecioneaza ionii de potasiu. n contrast cu MEMFET, unde coeficientul de asociere al ionoforilor cu ionii recunoscui de membran determina selectivitatea, n SURFET este acelai proces dar faza apoas (electrolitul) controleaz selectivitatea.[7-12,18,21]
CHEMFET
ISFET-urile modificate cu membrane plastifiante PVC sunt lipsite de o interfa
bine definit. Studiile au artat c schimbri n concentraiile de dioxid de carbon influeneaz puternic msurtorile. Acest lucru a fost atribuit difuziei dioxidului de carbon
prin membran cu formarea acidului carbonic la interfaa dintre membran i oxidul de la
poart. Consecutiv, concentraia protonilor, care determina potenialul la interfaa membran-dielectric, prezint variaii mari. Acest fenomen se explic prin existena unei cantiti mari de ap n PVC n consecin i o concentraie apreciabil de H+. Rolul de interpunere a CO2, duce la necesitatea unei mari cantiti de ap din interiorul matricei membranei, n consecin un nou tip de membran se impune. Dup mai multe ncercri descrise n literatura de specialitate, s-a gsit soluia de a modifica direct suprafaa oxidului
prin ataarea de grupe funcionale sau de membrane funcionalizate cu 3(trimetoxi-silil)
propil metacrilat. Noile tipuri de senzori se numesc CHEMFET (chemically modified
100

FET) care pare s rezolve n mare masur problemele. Suprafaa modificat cu metacrilat
poate mai departe reaciona cu monomerii vinil, metacril sau prepolimeri.
Utilizarea monomerilor fotopolimerizabili hidroxietil metacrilat (HEMA) este
avantajos din punct de vedere al produciei a CHEMFET-urilor, care este n general bazat pe fotolitografie. Introducerea unui asemenea strat de hidro-gel, n care o soluie apoas
tampon de sruri poate fi absorbita, ntre oxidul de la poart i membran elimin
interferarea CO2 la rspunsul CHEMFET. Mai mult, acesta stabilizeaz potenialul dezvoltat n membrana senzitiv (figura 6.2). Rspunsul pentru diferite valori de pH respectiv pentru diferite poteniale de referin sunt prezentate n figura 6.3.

a
b
Figura 6.2 a) Model de senzor CHEMFET, cu electrodul de referin (RE) n soluie tampon b)
Reprezentarea schematic a dispunerii n CHEMFET a straturilor de polimer modificat pe poarta de
SiO2,.Rolul hidrogelului HEMA i a membranei modificate chimic de selectare ioni i transfer de ioni

Figura 6.3 - a) Caracteristici ale sistemului CHEMFET electrod de referin Ag/AgCl- nregistrate pentru o
soluie tampon cu pH=4, b) Curentul de dren , Ids, n diferite soluii tampon (pH=4, pH=7, pH=10)
pentru acelai potenial Vref= -2V

Problemele interfeei membran/poart, au fost rezolvate prin funcionalizare


HEMA cu funciuni hidroxietil astfel asigurndu-se atari chimice a gelului poli (2 hidroxietil metacrilat) (poliHEMA) ntre membrana hidrofob i stratul de oxid de la poarta.
101

Aceasta nou arhitectur a FET-urilor ne permite s facem noi senzori chimici cu


membrane polimerice ce conin receptori moleculari. Au fost dezvoltai civa tranzistori
CHEMFET selectivi la K+, Na+, Ag+, cationi a metalelor tranziionale (Pb2+, Cd2+) i la
anioni (NO3-). Senzorii prezint un timp de via limitat din cauza extragerii prin dizolvare a componenilor electroactivi, adic liganzii i locurile ionice. Componenii electroactivi cu lipofilie crescut pot fi aplicai pentru a crete durabilitatea senzorului, dar o
metod mai eficient este bazat pe ancorarea covalent a acestor componeni la matricea
membranei.
Utilizarea membranelor ce conin legturi covalente ionofore i locuri ionice dispuse la legturi covalente mbuntesc semnificativ durabilitatea CHEMFET-urilor [816]
REFET
Utilizarea electrozilor convenionali de referin limiteaz n mare masur aplicaiile ISFET-urilor n domeniile unde se cer dimensiuni reduse ale acestora. Dezvoltarea
unui electrod de referin miniaturizat (REFET reference field effect transistor) este
de mare interes pentru aceti senzori. Una dintre incercrile de a rezolva problema este
fabricarea electrozilor prin ink-jet sau screen printing (serigrafie) din Ag/AgCl ce includ
o cavitate umplut cu gel i un tampon poros de siliciu. Toate construciile au dezavantajul unei caviti interioare umplute cu lichid, ceea ce nseamn un timp de via limitat
din cauza lipsei soluiei de referin. O mai bun rezolvare a problemei electrodului de referin poate fi utilizarea a dou ISFET-uri chimice diferite, ce opereaz diferenial cu un
electrod de cuasi-referin (QRE) comun (ex.: metal conductor, Pt) care poate fi integrat
cu uurin pe un cip. Acest dispozitiv are avantajul adiional c poate reduce perturbrile
externe ce influeneaz ambele ISFET-uri (ex: lumina i temperatura). Suprafaa oxidului
de la poart are sensibilitate la pH datorit prezenei grupelor hidroxil care se pot disocia
i pot accepta protoni. S-a gasit c eliminarea total a grupelor sensibile la pH nu poate fi
realizat prin modificarea chimic a monostratului. Sensi-bilitatea la pH poate fi diminuat atand la suprafaa porii un strat polimer hidrofob blocator de ioni. n aceast modificare polimerul este chimic legat la suprafaa porii, ceea ce se traduce printr-un timp
de via ndelungat. Pentru straturile blocatoare de ioni, o ataare stabil a fost realizat
prin depunere n plasm. Oricum, au fost observate variaiile potenialului cu compoziia
electroliilor pentru REFET-uri modificate.
Depunerea de straturi polimerice foarte subiri este limitat din cauza diminurii
sensibilitii electrice (transconductana cete cu grosimea dielectricului).
n contrast cu polimerii blocatori de ioni, modificarea REFET-ului cu polimeri neblocatori de ioni (conductivi) au avantajul unei trans-conductane echivalente a REFETului cu ISFET-ul. Asemenea membrane hidrofobe neblocatoare de ioni dau senzorului un
timp de via mai scurt dac nu sunt ancorate chimic la suprafa. Dou tipuri de structuri
REFET pot fi distinse ce rezolv problema penetrrii ionilor n stratul polimer rezultnd
din dou mecanisme diferite de operare. ntr-o structur REFET neblocatoare de ioni exist schimb de ioni ntre soluie i polimer iar la echilibru termodinamic dintre ionii din
soluie i cei din polimer conduce la potential electric al membranei. ntr-o structur blo102

catoare de ioni REFET, schimbul de ioni este neglijabil i n acest caz potenialul electric
msurat este potenialul suprafeei rezultate din reaciile reversibile ion-compleci de la
interfaa polimerului [8-20].

103

6.2 Referine

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Bergveld P., IEEE Trans. Biomed. Eng., BME-17, 70 (1970).


Sze, S. M., Physics of Semicondutor Devices, Wiley, New York 431, (1981)
Dolocan V., Fizica electronica a starii solide, Ed. Academiei 1(984)
Munteanu I., Fizica solidului, Ed Credis, (2005)
Bousse L., and Bergveld P., Sens. Actuators, 6, 65 (1984).
Van den Berg A., Bergveld P., Reinhoudt D.N., and Sudholter E.J.R., Sens. Actuators,
8, 129 (1985).
7. Bousse L., de Rooij N.F., and Bergveld P., IEEE Trans. Electron. Devices, ED- 30,
1263 (1983).
8. Sibbald A., IEE Proc., 130, 233 (1983).
9. Blackburn G.F., and Janata J., J. Electrochem. Soc., 129, 2580 (1982).
10. Van der Wal P., Skowroska-Ptasiska M., van den Berg A., Bergveld P., Sudholter
E.J.R., and Reinhoudt D.N., Anal. Chim. Acta, 231, 41 (1990).
11. Sudholter E.J.R., van der Wal P., Skowroska-Ptasiska M., van den Berg A.,
Bergveld P., and Reinhoudt D.N., Anal. Chim. Acta, 230, 59 (1990).
12. Fiedler U., and Ruzicka J., Anal. Chim. Acta, 67, 179 (1973).
13. Mascini M., and Palozzi F., Anal. Chim. Acta, 73, 375 (1974).
14. Brzzka Z., Holterman H.A.J., Honig G.W.N., Verkerk U.H., van den Vlekkert H.H.,
Engbersen J.F.J., and Reinhoudt D.N., Sens. Actuators, 18-19, 38 (1994).
15. Reinhoudt D.N., Engbersen J.F.J., Brzzka Z., van den Vlekkert H.H., Honig G.W.N.,
Holterman H.A.J., and Verkerk U.H., Anal. Chem., 66, 3618 (1994).
16. Van der Wal P.D., Sudholter E.J.R., and Reinhoudt D.N., Anal. Chim. Acta, 245, 159
(1991).
17. Cobben P.L.H.M., Egberink R.J.M., Bomer J.G., Bergveld P., Verboom W., and
Reinhoudt D.N., J. Am. Chem. Soc., 114, 10573 (1992).
18. Cobben P.L.H.M., Egberink R.J.M., Bomer J.G., Haak J.R., Bergveld P., and
Reinhoudt D.N., Sens. Actuators, 6, 304 (1992).
19. Dumschat C., Fromer R., Rautschek H., Muller H., and Timpe H.-J., Anal. Chim.
Acta, 243, 179 (1991).
20. Smith R.L., and Scott D.C., Proc. of the Symposium on Biosensors, IEEE 84, CH2068-5, 61 (1984).
21. Smith R.L., and Scott D.C., IEEE Trans. Biomed. Eng., BME 33, 83 (1986).
22. Kuisl M., and Klein M., Messtechnik, 36, 48 (1983).
23. Bergveld P., van den Berg A., van der Wal P.D., Skowroska-Ptasiska M., Suholter
E.J.R., and Reinhoudt D.N., Sens. Actuators, 18, 307 (1989).
24. van den Berg A., van der Wal P., Ptasiski D., Sudholter E.J.R., Reinhoudt D.N., and
Bergveld P., Proc. of the 2nd International Meeting on Chemical Sensors, Bordeaux, ,
419. (1986)

104

7. Biosenzori cu fibr optic


Biosenzorii optici coreleaz variaia concentraiei masei, cu modificarea unor parametri caracteristici luminii: lungimea de und, indicii de refracie, polarizarea, absorbana, extincia, fluorescena, chemiluminiscena, rezonana plasmonilor de suprafa (SPR)
Exist cteva configuraii tipice de biosenzori pe fibr optic, ele fiind sistematizate
n figura 7.1
1

R a
R b

3
4
A

R
B

Led

FD
C

Senzori optici:
A- principiu de functionare: 1-fibra optica incidenta
2-radiatia reflectata, 3-fereastra, 4- reactiv -R
B- tipuri de senzori: a-cu fibra optica bifurcata,
b- monofibra cu separare radiatie incidenta/reflectata
c- transmisie
C- senzor otic pentru determinarea albuminei
O-film albumina, ///-membrana bromcrezol,verde
FD- fotodioda

Figura 7.1 Trei tipuri de biosenzori cu fibr optic. Principii de funcionare

Ei ncorporeaz una sau dou fibre optice. Dac este folosit doar o fibr optic,
este necesar ca cele dou radiaii luminoase: cea incident i cea de referin, s se modifice n timp i de asemenea s i modifice lungimea de und.Lumina incident trebuie s
fie n limitele unghiului de reflexie total, deci forma geometric a suprafeei senzorului
are o importan esenial (figura 7.1 A). Cel mai important domeniu de aplicaie al unui
asemenea tip de senzor este determinarea fluorescenei celulei, care depinde de raportul
NADH/NAD intracelular, obinnd asfel o msurare precis a strii celulei.
Senzorii optici prezint urmtoarele avantaje:
Nu sunt perturbai de cmpul electric,
Pot fi utilizai n msurtori repetate n msurtori repetate,
n timpul msurtorilor proba rmne neschimbat, din punct de vedere chimic i fizic
Se folosete cu protecie la ntuneric; lumina diurn influeneaz procesele
de msurare.
Pe lng fibra optic, aceti senzori mai conin o surs de lumin i un traductor de
semnal. Principiul de funcionare se bazeaz pe dependena dintre concentraia substratu105

lui i absorbia luminii sau variaia oricrui tip de proprietate optic. Membrana sau suportul senzorului, acoperit cu coninut de oxigen sau cu ali indicatori de pH, markeri
fluoresceni, prezint reacii de cuplaj cu diferite enzime cum ar fi conversia glucozei,
lactozei, etanolului si complexului antigen anticorp.
Senzori optici cu oxidani imobilizai pentru determinarea glucozei, acidului uric i
penicilinei au fost obtinui de Kobayashi [1]. n acest caz msurarea semnalului se face
prin chemiluminiscen care depinde de conversia peroxidului de hidrogen la luminol.
Semnalul de rspuns al suprafeei respective la lumina transmis de fibr, sub aciunea
peroxizilor permite msurarea peroxidului de hidrogen, ATP-ului i NADH-ului [2].n
figura. 7.1.C este prezentat senzorul optic pentru determinarea albuminei serului uman.
Schimbarea culorii bromcrezolului verde este folosit pentru msurarea semnalului. Shimbarea polarizrii luminii sau a grosimii substratului ne dau informaii asupra
cuplajului molecular cnd nu intervin reacii auxiliare. Prin aceast metod, formarea
complexului de molecule mari antigen- anticorp absorbit de o suprafa reflectant de siliciu poate fi sesizat direct ( figura 7.2)
V(mV)
gelatina

Cuva
1

Anti IgG

IgG
T(min)

Imunosenzor reflectometric
1-radiatie laser incidenta,
2- radiatia reflectata
3- fotodioda

Dependenta semnalului
masurat functie de grosimea
stratului data de reactia dintre
G(IgG) si anti IgG; gelatina este
adaugata prin absorbtie nespecifica oe suprafata substratului de
siliciu

Figura 7.2- Principiul de funcionare a imunosenzorilor reflectometrici

Figura7.3 Experimentul Tyndall

7.1 Fibre optice, caracteristici generale

n 1870 Tyndall (figura 7.3) a demonstrat c lumina se poate propaga ntr-un jet de
ap curbat. Acesta poate fi considerat ca primul pas spre comunicaii prin medii optice
Spre sfritul secolului, Alexander Graham Bell a fost primul care a ncercat
s transmit informaii n sensul modern, folosind lumina. Dispozitivul su
se numea fototelefon i era folosit pentru a transmite voce cu ajutorul luminii
solare pn la distana de 200 m. Lumina solar era modulat de emitor cu
ajutorul unei diafragme acionat de microfon. Receptorul capta lumina
emis de emitor i o concentra pe o rezisten de seleniu prin care trecea un
curent, proporional cu fluxul luminos care cdea pe rezisten
n anul 1934, americanul Morman French a patentat un dispozitiv numit telefon optic, dispozitiv care unea ideile lui Bell si Tyndall. Patentul descria un
aparat care transmitea vocea cu ajutorul luminii, ca mediu de comunicaie
fiind folosit un cablu optic
106

n anul 1964, Premiul Nobel a fost atribuit inventatorilor laserului ntr-un articol publicat n anul 1966 n Anglia Charles Kao si George Hockham susineau c fibra optic putea fi folosit pentru a transmite informaii; totui,
exista o problem: pentru a putea face posibil transferul prin fibra optic,
aceasta trebuia s aib o atenuare mai mic de 20 dB/km, comparat cu 1000
dB/km obinui n acel moment.
n anul 1970 compania Corning Glass Works din Statele Unite a reuit s obin o atenuare mai mic de 20 db/km cu fibr optic multimod step index la
633 nm
n anul 1972 se fabricau fibre optice multimod cu index gradient ce aveau o
atenuare de 4 dB/km.
n prezent, atenuarea unei fibre optice monomod cu index treapt este mai
mic de 0,20 dB/km la lungimea de und de 1550nm.
Fibra optica este un mediu de comunicaie folosit pentru a transmite semnalele luminoase. n termeni tiinifici, fibra optic este un ghid de unda pentru radiaiile electromagnetice. Avantaje ale fibrei optice asupra tehnologiilor convenionale:
Distane mari ntre repetoare (peste 120 km comparat cu 2 km la sistemele
bazate pe pulsuri electrice mare importan pentru comunicaiile de date i
pentru aplicaiile industriale o are faptul c transmisiile prin fibra optic sunt
imune la interferene exterioare
Distanele mari ntre repetoare la fibr optic sunt posibile datorit atenurii
mici a semnalului; fibrele optice singlemode au o atenuare mai mic de 0,20
dB/km, ceea ce nseamn c dup 40 de km parcuri n fibr, 10% din semnal rmne
Tehnicile de msurare optic au aparut de mai mult de un secol, dar actualul
reviriment n domeniul deteciilor cu fibra optic a nceput n deceniul 7, odat cu dezvoltarea conecticii pe baza de fibra optica pentru industria de telecomunicaii. Anterior,
cu citeva mici excepii, msuratorile precise cu ajutorul fibrelor optice erau efectuate n
laboratoarele metrologice. La sfritul anilor 1970, a devenit tot mai evident c fibrele optice ar putea fi utilizate pentru a conecta sursa optica i aparatura electronica de detecie
pentru msurtori, permind chiar folosirea celor mai sensibile tehnici interferometrice n
medii ostile precum tuneluri de vnt i n mediul submarin. Cercetrile iniiale s-au axat
pe folosirea senzorilor cu fibr optic pentru monitorizarea parametrilor fizici precum
temperatura i presiunea, dar in deceniul 8 s-a constatat ca exista un potential real in domeniul chimic si medical. Un fapt important a intervenit n anul 1989 cnd s-a inventat o
tehnic simpl de producere a fibrelor optice cu reele Bragg. Figura 7.4 arat construcia
unei fibre optice tipice din silice (bioxid de siliciu). Un miez cilindric din sticl este nconjurat de ctre un nveli construit dintr-o sticl cu un indice de refracie mai mic.

107

Figura7.5- Elementele constructive ale fibrei optice

Pentru protecie sunt adugate mantale de plastic. Fibrele optice pot fi ntr-o varietate de mrimi, dar un invelis obinuit are un diametru de 125 micrometri, n timp ce
miezul variaz de la civa micrometri pn la 50 micrometri. Proprietile de baz privind
propagarea luminii pot fi inelese din punct de vedere conceptual prin principiul reflexiei
interne totale [3], care se refer la incidena unei unde de lumin la contactul dintre dou
materiale cu indici de refracie diferii. Cnd fasciculul de lumin trece dintr-un mediu cu
indice de refracie mare ntr-un mediu cu un indice de refracie mai mic, acesta apare la
un unghi r mai mare decat unghiul de incidenta i (Figura 7.5a). Aceasta nseamn c, n
cazul creterii unghiului i, se va ajunge ca unghiul r sa fie de 900, cunoscut ca unghi critic
(ic) (Figura 7.5b). Dac unghiul de inciden este mai mare de ic, atunci radiaia luminoas este reflectat, nveliul exterior comportndu-se ca o oglinda (Figura 7.5c). n
cazul unei fibre optice, att timp ct fasciculul este incident pe suprafaa de contact dintre
nveli i miez, la un unghi mai mare dect cel critic, acesta va fi reflectat si deci confinat
n miez.

Figura7.5- Ilustrare a propagrii luminii dintr-un mediu cu indicede refracie n1 ntr-un


mediu de refracie cu n2 (n1>n2) i a fenomenului de reflexie total, principiu de
baz a propagrii luminii ntr-o fibr optic.

Recent, au inceput sa fie produse fibre optice avnd n componena lor goluri de aer
dispuse axial, de diferite forme. Prima categorie se compune din fibre n care zona conductoare este format dintr-un defect constnd dintr-un gol de aer ntr-o structur omogen (Figura 7.6b,c).
108

Figura 7.6- Tipuri de fibr optic de ultim generaie

n figura 7.6 b fibra este format prin adugarea goluri suplimentare n structura
fibrei. n acest caz, miezul este cel care are un indice de reflexie mai redus prin comparaie cu materialul ce-l nconjoar astfel, propagarea nu poate surveni prin aplicarea
principiului reflexiei interne totale. n schimb, n partea alcatuit din goluri axiale propagarea este oprit pentru o anumit lungime de und. n figura 7.6 c defectul are un indice de refracie mai mare fa de miezul fibrei: propagarea luminii se realizeaz prin acelai proces ca i la fibrele convenionale, defectul formnd un miez cu un indice de reflexie ridicat n timp ce structura ncojurtoare defectului se comport ca un nveli cu un
indice de reflexie mai sczut dect cel al miezului, determinat de forma i proporiile relative ale aerului i sticlei;
7.2 Fibre optice cu reele Bragg induse

Reele de tip Bragg sunt o modificare local n structura intern a fibrei prin reflectarea unui fascicul de lumin de o anumit lungime de und, n timp ce le permite celorlalte s treac. Lungimea de und pentru care un fascicul de lumin este reflectat de-pinde
de presiunea sau temperatura aplicat n zona reelei Bragg; astfel, prin activarea unei
surse de lumin cu un spectru larg de lungimi de und n fibra optic i prin monitorizarea lungimii de und a razei reflectate, cu ajutorul unui spectrometru, se poate msura temperatura sau presiunea aplicat.
Reelele Bragg prezint un interes special pentru c acestea se formeaz n interiorul fibrei. Senzorul astfel format este extrem de compact si poate fi nglobat cu uurin
n alte materiale compozite. n plus, cteva reele Bragg pe aceeai fibr permite funcionarea lor n sistem multiplex, permind astfel msurtoro n multiple zone. Printre
senzori de un considerabil interes actual se afl fibrele optice cu reele Bragg [4]. Acesta
este un sensor intrinsec cruia i-a fost impus o modulare periodic spaiala a indicelui de
refracie a miezului unei fibre monomod. Modulaia este produs n mod normal de expunerea fibrei la dou unde de lumin ultraviolet; interferena lor produce o distribuie n
variatia intensitatii axiale (Figura 7.7). Modificarea indicelui de refracie este continu.
Sensibilizarea la lumina ultraviolet se produce n mod obinuit datorit dopantilor
folosii pentru controlarea indicelui de refracie a miezului. Soluia alternativ const n
sensibilizarea fibrei prin expunerea la hidrogen, prin expunere la presiune mare [5].
109

Efectul n fibrele optice cu reele Bragg const n reflectarea undelor de lumin ce


satisfac condiia Bragg B= 2n unde n este indicele de refracie, iar este distana dintre
maximele modulaiei indicelui de refracie. Ambele depind de presiunea i temperatura la
care este supus fibra optic cu reele Bragg. Astfel, prin iluminarea fibrelor optice pe
reele Bragg cu o sursa de lumin cu un spectru larg de lungimi de und i monitorizarea
lungimii de und a fasciculului reflectat se poate msura temperatura i presiunea.

Figura 7.7- Principiul senzorului cu retea Bragg de


interferen: B=2n, n-indice de refracie, distana dintre dou maxime consecutive, Blungimea de und a radiaiei reflectate

7.3 FOBS n medicin

Fibra optic ca senzor poate fi plasat n pielea pacientului sau n interiorul corpului lui pentru a msura direct parametri biomedicali. Senzorul cu fibr optic este propus a se folosi n multe i rapide determinri medicale, iar aplicaiile lui se extind continuu. Indubitabil, proliferarea acestor tipuri de aplicaii pentru senzorul cu fibr optic
conduce la un numr mare de aplicaii i combinaii ale acestora care n viitor vor conduce la microminiaturizare, versatilitate, funcionalitate. El poate fi ataat n interiorul unui
cateter i introdus n esutul hipodermic, realiznd o minim monitorizare acolo unde este
nevoie. Senzorul cu fibr optic este netoxic, inert chimic, i se poate folosi cu succes n
interiorul organismului. El se poate asocia cu echipamente pentru monitorizarea pacientului. Este simplu de manipulat cu greutate neglijabil. Evoluia senzorului medical cu
fibr optic se bazeaz pe multiplele performane i biocompatibilitate.
Biocompatibilitatea este primul pas n confortul pacientului, biosenzorul nu trebuie
s afecteze parametrii fiziologici a organismului dar nici funcionalitatea lui nu trebuie
compromis de produii de dezasimilaie a pacientului. Senzorii cu fibr optic pot fi
clasificai ca extrinseci, fibra acioneaz ca o cale pentru semnal i intrinseci, interaciile
survin n fibra nsi. Se disting trei tipuri de FOBS:
110

Senzori noninvazivi care sunt n contact cu pielea;


Senzori minimal invazivi, care sunt introdui n cavitile organismului;
Senzorii invazivi, care sunt introdui n organele interne sau in vasele de snge
Aplicaii n medicin

n ultimul deceniu fibr optic este un produs foarte folosit n toate domeniile de
vrf ale tiinei i tehnologiilor avansate. Era de ateptat ca i tiintele medicale s beneficieze de aceste avantaje pe care le ofer fibra optic, atat n ceea ce privete costurile dar
i competenele acestui material nou. Avnd n vedere uurina cu care se poate manipula, posibiliti nelimitate de sterilizare, costuri reduse, se poate estima c acest produs va
cuceri tot mai mult piaa medical. Pn n prezent se cunosc urmtoarele domenii medicale care au recurs la folosirea de biosenzori cu fibr optic:
n medicina de urgen i n cardiologie: analiza elementelor sngelui, saturaia n oxigen a hematiilor, analiza gazelor sngelui, pH ul sngelui.
n monitorizarea respiraiei
n angiologie:,monitorizarea perfuziilor microvasculare.
n aprecierea refluxului biliar prin absorbia direct a bilei de ctre pigmentul
biliar, bilirubin.
Determinarea facil a pH-ului stomacului; se introduce un microabsorbant
indicator si modulator de pH, acid alcalin.
n oncologie se urmrete monitorizarea temperaturii n timpul curelor de
terapie citostatic, sau se diagnosticheaz tumorile de dimensiuni mici i
foarte mici, greu abordabile.
n oftalmologie, se poate depista o cataract la debutul ei.
n dermatologie se poate testa calitatea i integritatea straturilor pielii, se pot
depista tumori de dimensiuni mici, se poate folosi n cosmetic pentru refacerea esuturilor prin stimulare, sau n eritema. In ceea ce privete diagnosticul unor piodermite se poate folosi un biosenzor cu fibr optic, care se
bazeaz pe consumul de oxigen (BOD ).
n stomatologie se pot diagnostica cariile de dimensiuni foarte mici care sunt
inaparente, sau cele de sub alte lucrri dentare. De asemeni se poate aprecia
culoarea dinilor sau integritatea nervului dintelui.[6].
Principalele tipuri de aplicaii ale senzorilor n scopuri biomedicale sunt prezentate
n tabelul 7.1:

111

Tabela 7.1 FOBS- aplicaii medicale, clasificare


Cardiovascular, terapie intensiva
1.
2.
3.

Saturarea cu oxigen a
sngelui
PH-ul sngelui
Continutul de gaze din
snge PCO2 (presiunea
parial)

Monitorizarea respiratiei

1.
2.

Reflectana direct a elementelor din componenta sngelui.


Fluorofori legati covalent pe o matrice de celuloz ataat pe
captul FO
3. Determinarea pH cu fluorofori n contact cu o soluie tampon
de bicarbonat. Concentraia de CO2 msurat prin pH ca o
variatie a presiunii partiale
4. Fluorofori fixate in matrice polimera la capatul fibrei optice;
atenuarea fluorescentei cu concentraia de oxigen
Rata respiratiei: fibra optica n conductul nazo-faringian;
Modificarea reflexiei cauzata de umiditatea aerului in timpul
respiratiei

Angiologie
1.
2.
3.
4.

Perfuzie microvasculara
Fluidica sngelui
Fluxuri biliare
pH - stomacului

Msurarea debitelor prin efect Doppler a radiaiei laser;


retroimpratierea radiaiei laser; analiz spectral.
Microdeformarile fibrei optice sub aciunea presiunii sngelui .
Fibra optic se dispune ntre plci rigide
Controlul Bilirubinei
pH- controlat de variatii alcalin-acide din tractul digestive;
Microsfere: Metacresol purpuriu albastru bromophenol fixat in
poliacrilamide situate in capatul fibrei optice, care la randul lui
este imersat in tubul de dializa

Oncologie
1. Monitorizarea
temperaturii n timpul
terapiei
2. Diagnoza tumoral
3. Presiune
Oftalmologie

Atenuarea fluorescenei
Recunoaterea naturii tumorii prin tehnici de autofluorescenta:
excitare cu laser He-Ne a unui tesut si analiza fluorescentei prin
fibre optice
Interferometrie FabryProt

Analiza evolutiei cataractei

Imprastierea dinamica a luminii

Dermatologie
Controlul dermatologic
pielii
Stomatologie
1. Culoarea dentara
2. Starea pulpei dentare

al

Umiditatea pielii
Spectroscopie de reflexie de banda larga
Saturarea cu oxigen a pulpei dentare

Monitorizarea sngelui , oximetria

Ca rspuns la cererile medicilor, senzorii cu fibr optic pot monitoriza acum electroliii din snge precum potasiu, sodiu i calciu, in plus fata de coninutul de gaze n snge. Aici miniaturizarea fibreilor optice este din plin folosit. n figura 7.8 este prezentat
un cateter din fibre optice (0,5 mm diametru) ce poate fi introdus n aorta descendent capabil prin cele trei tipuri de fibre s msoare concentraia de gaze i pH ul sngelui: msu112

rarea saturatiei oxigenului, care reprezinta cantitatea de oxigen transportata de hemoglobina din hematii n funcie de capacitatea sa maxim. Materialele din care sunt alctuii traductorii chimici sunt ionofori care se pot fixa reversibil de electrolit un separator
molecular (spacer) i respectiv fluoroforul. Gradul de fluorescen, prin excitaie cu diode
electroluminiscente n violet, este modulat de ionofori proporional cu concentraia de
analit.Senzorul este utilizat fie extracorporal n circuitul extern de analiz a gazelor din
snge fie intracorporal pentru monitorizarea continu a gazelor sanguine n cazul situaiilor critice ale bolilor copiilor nou nscui.

Figura 7.8 FOBS-oximetru, pentru monitorizarea gazelor din snge


Senzorul este introdus prin cateter n circuitul aortei nou
nscutului

Accidentul cerebrovascular este cauzat de reducerea cantitii de snge ctre creier.


Dac durata lipsei de alimentare cu snge a creierului este prea mare, celulele
creieruului vor suferi schimbri ireversibile. Din acest motiv monitorizarea strii celulelor
este de o mare importana. ocurile hemoragice sunt datorate rupturii vaselor sanguine
sau cele ischemice datorate ocluzrii vaselor (prin depuneri sau arteroscleroza).
Parametrul chimic capabil s monitorizeze starea celulei este pH deoarece acidul
lactic, format cnd esutul celulei moare produce o descretere n pH. Orice scdere a pH
ului sngelui de la 7,4 indic prezena moriicelulei. Cele mai recente realizri n domeniu
sunt senzorii de pH invazivi ce determin starea celulei. Senzorul este format din colorant
fluorescent ncapsulat ntr-o matrice de gel (poliacrilamid) ataat la captul fibrei
optice. Colorantul, seminaftorodamina-L-carboxilat este caracterizat prin emisia formei
acide centrat pe 580 nm i a formei alkaline centrat pe 680 nm. Cele dou forme sunt
sensibile la pH. Excitaia apare la 533nm pentru ambele forme. Separarea emisiei se realizeaz direct prin filtre optice iar sensibilitatea este 0.05 uniti pH mult sub limita
standardelor clinice admise (0.1 pH).
Monitorizarea streptococilor mutans din saliva uman i oraganul cutanat

Caria dentar este o afeciune multifactorial, o afeciune bacterian, care este caracterizat de o demineralizare a poriunii anorganice a dintelui i de o distrucie orga113

nic a substanei dintelui. Numeroase expe-rimente efectuate pe animale de laborator au


scos n eviden c fiecare carie dentar are ca agent etiologic o specie de streptococci
mutans.
Adevrata cantitate de ageni patogeni din interiorul cariei este dat de dimensiunea cariei. O investigaie pe un numr de 235 de copii, cu vrste ntre 11-12 ani cu nici o
carie dentar sau cu mici modificri ale structurilor dinilor, sugereaz c acest test salivar
poate aduce reale informaii despre riscul cariei dentare n special n cazurile n care medicul stomatolog nu poate evalua acest risc prin tehnicile obinuite. Studiu n acest sens a
artat cu usurin c aciditatea bacteriilor din genul Streptococcus mutans i Lactobacilli,
ce formeaz colonii de 105 per mililitru sunt predictibile pentru riscul de carii dentare [7,
8].
Coninutul salivei umane n ceea ce privete ncrctura bacterian este de aproximativ 109 per mililitru de saliva. De aceea saliva poate fi considerat un mediu selectiv
pentru creterea bacteriilor [9] A fost demonstrat o corelaie semnificativ ntre numrul
streptococcilor mutans n saliv i prevalena lor n problemele dentiiei [10]. O metod
simpl a fost adaptat pentru detecia i numrarea streptococcilor mutans, numit Dentocult SM, n anul 1998[11]. Dentocult SM este un dispozitiv produs de Orion Diagnostica,
Espoo, Finlanda, ce const dintr-un suport special fabricat cu un mediu de cultur cu agar
salivar ce contine 20% sucroz. Acesta este inoculat cu saliv i densitatea creterii streptococcilor umani este apreciat dup o incubare de 48 de ore la 37 de grade C. Identificarea este morfologic a coloniilor distincte pe agar selectiv i neselectiv, pe forma distinct
a celulelor, vizibil n lumina microscopului.
Aceast tehnic are i unele mici dezavantaje, acelea c are nevoie de timp mai
mult pentru creterea bacterian i totodat necesit laboratoare adiionale, situate pe
lng cabinetele stomatologice.
Pentru a monitoriza activitatea streptococcilor n saliva uman a fost creat un biosenzor cu fibr optic (FOBS) care monitorizeaz reaciile cu sucroza mediate de Streptococci mutans printr- un indicator fotosenzitiv imobilizat intr-un nvelis de sticl poroas.
Suprafaa miezului fibrei optice este tratat sau mbracat ntr-un film de sticl poroas
utiliznd tehnica sol-gel [12]. Analiza spectroscopic a artat c exist dou faze distincte
n absorbia luminii la 597 nm pe o durat de 120min: una ntre 0-60 minute, i alta de la
60-120 minute. Aceast investigaie arat potenialul enorm pe care l au biosenzorii n
monitorizarea activitii microorganismelor n organismul uman.
Tehnica sol-gel este utilizat pentru imobilizarea indicatorului fotosenzitiv, este
simpl n vreme ce principiul mediului selectiv bacterian este folosit ca transfer specific
pentru streptococii mutans necesit timp i este laborioas. De aceea FOBS se dovedete
a fi un test rapid de msurare cantitativ a activitii streptococcilor mutans n Saliv.Totodat acest test se poate adapta i la alte domenii medicale unde activitatea bacterian este implicat n distrucie celular, sau tisular.
n figura 7.9 este descris metoda de formare a unui biosenzor dintr-o fibr optic
pentru observarea i detecia S. Mutans. Experimentele acestui studiu au urmrit faza de
114

recunoatere biochimic a semnalului i faza analizei spectroscopice. Criteriile care au


stat la baza conceperii unui montaj experimental [13, 14]:
1. Streptococcii mutans sunt parial anaerobi avnd o cretere optim la 370C,
2. Glucoziltransferazele i fructoziltransferazele din streptococcii mutans, catalizeaz sinteza glucanului insolubil n ap i a polimerilor de fructan, n
sucroz, formnd acid lactic ce se regsete n saliva acid
3. Streptococcii mutans din saliva uman, sintetizeaz att polizaharide extracelulare ct i intracelulare, din sucroz
4. Polizaharidele extracelulare ajut adiia bacteriilor la suprafaa dintelui, n
timp ce polizaharidele intracelulare sunt stocate pentru energia bacteriilor.
5. Aceste polizaharide, intracelulare, ajut bacteria s continue fermentaia
chiar i atunci cnd nu exist o form exogen de hran
6. Tolerana acid a streptococilor face ca activitatea lor s continue chiar i la
un pH sczut.
7. Un pH indicator, fotosenzitiv, produce o culoare caracteristic, conform unui
gradient de culoare, n funcie de pH ul salivei i este folosit la construcia
FOBS.
Pe baza acestor considerente s-a conceput i realizat un montaj experimental cu un
spectrometru UV-viz cu fascicul dublu n care n locul unei cuve s-a introdus fibra optic.
n cuva de referin s-a utilizat soluia tampon cu albastru de bromfenol pentru diferite valori de pH, de la 4 la 7. Un experiment iniial a ajutat la determinarea lungimii de
und i a picului caracteristic pentru indicatorul din soluia tampon i pentru diferite valori de pH din saliv, induse de activitatea bacterian.

Figura 7.9- Senzor cu fibr optic pentru investigarea microorganismelor din saliv i organul cutanat

Analiza spectroscopic n UV-viz. la un pH de 4 i 7 al soluiei cu albastru de


bromfenol a artat un pic proeminent la 590 nm lungime de und. Intensitatea picului
descrete de la pH 7 spre 4. Compararea cu datele din literatur au artat o concordan
115

bun observndu-se c n mediu cu saliv, sucroz i albastru de bromfenol absorbia a


fost stabil la 590 nm lungime de und pentru un interval de timp de 15 min, 30min, 1h i
24 de ore [15].De notat c pentru fiecare set de fibre corodate i procesate ca n figura 7.9
necesit calibrare independent datorit neomogenitilor rezultate din etapele de
pregtire a fibrei optice ( de origine OceanOptics- fibre pentru spectrometrul HR-2000)
7.4 Referine

1 Kawachi M. Kobayashi M., Opt. Lett. 9, 183- (1984)


2 Mrs Bulletin, Review in optical sensors May ( 2002)
3 Hecht E. Zajac A., Optics ,Addison-Wesley, Reading, MA, p. 81 (1974).
4 Rao Y.-J., Meas. Sci. Technol. 8 p. 355,(1997)
5 Bennion I., Williams J.A.R., Zhang L., Sugden K., Doran N.J., Opt. Quantum Electron.
28 p. 93, (1996)
6 Baldini F. Mignani A. G., Bulletin Materials Research Society, vol. 27, no. 5, (2002)
7 Kneist S, et all, Journal of Dental Research 75, 1251-1259 (1998)
8 Emilson C. G, Bratthall D, Journal of Clinical Microbiology 4, 95-98. (1976)
9 W. H. Bowen. Salivary influences on the oral micro flora. n: Saliva and oral health,
second ed. Brithish Dental Journal, London,(1996)
10 Gronroos L., Quantitative and qualitative characterization of mutans Streptococcus in
saliva and in dentition, Academic dissertation, University of Helsinki, Finland.
(2000)
11 Alaluusua S, M.Nystrom, Gronroos L, Peck L, Caries research 23, 49-54 (1989)
12 Brinker C. J, Scherer G. W,. Sol-Gel Science: the Physics and Chemistry of Sol-Gel
Processing. Academic Press, New York (1990)
13 Collins C. H,. Patricia M. L., Grange J. M, Microbiological Methods, 7th ed.
Butterworth-Heinemann Ltd, Great Brritain (1995)
14 Lazar Veronica, Microbiologie medical, Ed. Univ. Bucuresti. (2001)
15 Kischen A. et all. Biosensors and Bioelectronics 18, 1371- 1378, (2003)

116

8. Celule de biocombustie
O major provocare pentru dezvoltarea aparatelor medicale implantabile este gsirea surselor de curent potrivite. Acestea trebuie s fie capabile s genereze energie electric pentru perioade lungi de timp.
Celulele sau pilele de biocombustie (BFC) promit mult n acest sens prin funcionarea lor pe baza reaciilor pereche oxidarea glucozei reducerea oxigenului molecular la
ap. n condiii ideale, produsele secundare ale BFC ar fi dioxidul de carbon i apa.
Glucoza i oxigenul sunt amndou prezente n celulele i esuturile tuturor organismelor eucariote, inclusiv ale oamenilor. Este posibil, dealtfel, introducerea lor ntre
resursele organismului, chiar i a proprietilor metabolice ale celulelor noastre pentru a
genera suficient energie pentru alimentarea aparatelor clinice cum ar fi sisteme de
transport al medicamentelor, aparate de diagnosticare i dispozitive de cretere uman.
8.1 Necesitatea implementrii surselor alternative de energie

O problem foarte complex, creia tiina i tehnica contemporan trebuie s-i


gseasc soluie, este ritmul mereu crescnd al nevoilor energetice, provocat de dezvoltarea continu a industriei i de creterea numrului de consumatori n toate sectoarele
vieii sociale. n prezent se studiaz o ntreag gam de metode pentru generarea i stocarea energiei. Termeni ca economia hidrogenului, biocombustibili, combustibili regenerabili, celule fotovoltaice, pile de combustie sunt alternative la noi surse de energie ce
trebuie s nlocuiasc cile clasice. Un argument indiscutabil n favoarea cutrii altor ci
de conversie a energiei, l reprezint faptul c rezervele de combustibili fosili fiind n
scdere (petrol: 40 ani, crbuni: 224 ani, gaze naturale: 62 ani), costul lor va deveni
curnd inacceptabil.
Dioxidul de carbon, cel mai insiduos poluant este produs de vehicule i industrie n
cantitate mai mare dect cea pe care plantele verzi o pot converti napoi, la oxigen, prin
procesul de fotosintez i concentraia acestuia n atmosfer crete n timp. CO2 absoarbe
radiaia IR, Pmntul nclzit de Soare reradiaza ca un corp negru la cca 300K i aceast
energie reradiat nclzete atmosfera; astfel, o parte din gheaa polar se va topi conducnd la o cretere a nivelului apelor mrilor i oceanelor. n consecin, trebuie rezolvat
problema folosirii energiei curate i trebuie gsit o cale convenabil de stocare a energiei electrice (indiferent cum ar fi obinut ea), care s permit folosirea ei dup necesiti
i n locaii ct mai diversificate.
Lumea pare a fi n pragul unei noi ere, a tehnologiei avansate i a noilor combustibili. Atenia cercettorilor este ndreptat ctre surse neconvenionale de energie, ca de
exemplu: eoliene, solare, hidraulice, geotermale, mareice, nucleare. Aceste tipuri de energie nu sunt disponibile n orice moment, fiind variabile, imprevizibile i, n general, netransportabile de la locul de producere ctre cel de utilizare. Dar alte surse neconven117

ionale de energie, precum pilele de combustie, reprezint o alternativ posibil pentru


viitor deoarece pot conduce la randamente superioare fa de cele obinute n prezent.
Sistemele bazate pe motoare termice funcioneaz cu randamente de pn la 50%,
n timp ce teste tehnice au indicat pentru pilele de combustie randamente electrice de 70%
Rolul celulelor de combustie n viitor depinde de viteza cu care se vor epuiza combustibilii fosili i de viteza cu care vor deveni disponibile noile surse de energie. Dar,
chiar dac energia solar va fi disponibil din abunden, pare probabil c va fi folosit
pentru a obine H2 prin electroliza apei, care va fi stocat i trimis prin conducte (sub form gazoas) sau n rezervoare (sub form lichid) la locurile de trebuin, unde va fi folosit pentru a produce energie electric cu ajutorul unor celule de combustie H2/O2 (din
aer). Printre cile cele mai noi de generare a energiei electrice, celulele de combustie au o
utilizare tot mai divers i eficient o dat cu dezvoltarea i implementarea materialelor
nanostructurate n elementele lor pasive i active. Transformarea energiei chimice n energie electric, prin intermediul pilelor de combustie, deschide un larg domeniu de aplicaii i prefaeaz noi descoperiri n domeniul mijloacelor de conversie direct a energiei
chimice sau nucleare n energie util
8.2 Celule de biocombustie-celule bioelectrochimice

Celulele sau pilele de combustie sunt dispozitive care transform energia chimic a
combustibililor (hidrogen, gaz natural, gazolin, etc.) i a oxidantului (oxigen sau aer) n
energie electric. Prile componente ale unei celule combustibile sunt: electrozii (locul
de producere a reaciilor electrochimice), electrolitul (asigur transferul ionilor de la anod
la catod) i conductorii electrici (asigur transferul electronilor prin circuitul exterior).
Sub influena catalizatorilor, de obicei metale platinice sau aliaje ale acestora, la
anod se produce oxidarea hidrogenului, iar la catod reducerea oxigenului cu formarea i
eliminarea produilor finali (ap, electricitate i cldur). Principiile care guverneaz
performana pilelor de combustie sunt cele termodinamice i cinetica proceselor de electrod pentru reaciile care au loc la interfeele electrod electrolit. Celulele de combustie
se clasific n principal dup dou criterii. Unul ia n considerare temperatura de funcionare iar cellalt electrolitul pe care-l utilizeaz.
Clasificarea se poate face innd seama i de natura combustibilului (gazos sau
lichid) sau de faptul c pila este alimentat direct cu combustibil sau cu produsul obinut
dup o prealabil reformare a acestuia. Dup natura electrolitului utilizat se deosebesc
urmtoarele tipuri de pile de combustie[1]:
Celule de combustie cu electrolit alcalin (AFC)
Celule de combustie cu membrane schimbtoare de protoni (PEMFC)
Celule de combustie cu electrolit acid fosforic (PAFC)
Celule de combustie pe baz de metanol (DMFC)
Celule de combustie cu electrolit de tip carbonat topit (MCFC)
Celule de combustie cu electrolit de tip oxid solid (SOFC)
Celule de combustie regenerative (RFC)
118

Celule de combustie pe baz de zinc i aer (ZAFC)


Celule de combustie cu acizi solizi respectiv superacizi (SAFC)
Celule de biocombustie = Celule bioelectrochimice (BFC)
8.3 Mecanisme n celulele bioelectrochimice

Celulele bioelectrochimice numite celule de biocombustie microbiene (MFC) sunt


dispozitive ce extrag electroni din metabolismul microorganismelor prin cuplarea oxidrii
glucozei cu reducerea oxigenului molecular la ap. Electronii care apare n plasma
membranei bacteriene sunt extrai din lanul metabolic i canalizai ctre electrozi unde
se descarc pe o sarcin electric din circuitul exterior. Pentru creterea efcienei transferului de electroni din plasma membranei ctre electrozi au fost folosii mediatori electronici (electronofori). Aceste molecule au proprieti speciale de intermediere a transportului de electroni de la memebrana celulei microorganismelor la electrozi.
Mediatorii intr n lanul de transport electronic, fiind redui n proces, dup care se
reoxideaz transfernd electroni anodului celulei.

Figura 8.1. Reprezentarea schematic a principiului de funcionare a unei celule de combustieMicrobiene.


Rolul mediatorului (dreapta) solubul care poate fi transportat n bacterie pentru reducere sau
reducerea poate aprea la suprafaa membranei. Mediatorul are rol de extraacie electroni din procesul
de metabolizare a materiei organice de ctre bacterie i transportul acestuia ctre anod

Principiul de funcionare a MFC ce utilizeaz combustibil glucoza i un mediator


de transfer de electroni este descris n figura 8.1. Oxidarea complet a unui mol de glucoz n dioxid de carbon va elibera 24 moli de electroni.
Astfel, este disponibil o sarcin total de 2.32x106 C per mol de glucoz. Curentul
generat de acest proces oxidativ va depinde de viteza metabolismului i de eficiena transferului electronic ctre electrod.
Celulele de biocombustie microbiene sunt compuse din dou compartimente
separate de o membran permeabil pentru protoni (PEM). Un compartiment este pentru
anod iar cellalt pentru catod. Principiul funcionrii acestor celule de biocombustie este
strns legat de procesele biochimice care apar n organismele microbiene, anume glicoliza, ciclul acidului citric i lanul de transport electronic.
119

Electronoforii intervin n timpul procesului de transport electronic, transportnd


electroni din plasma membranei bacteriene ctre anod. Protonii pompai din bacterie n
mediul anodic traverseaz PEM spre compartimentul catodic. Mediatorul (cel mai cunoscut fiind fericianura) este oxidat din nou n fericianid, n timp ce ionii de hidrogen se
combin cu oxigenul formnd ap.
Pentru fericianur mecanismul de oxidare-reducere este bine cunoscut:

Pe baza cunotinelor actuale despre funcionarea celulelor de biocombustie se fac


eforturi pentru maximizarea curentului i puterii prin:
compararea i folosirea de combinaii diferite de bacterii i electronofori [2,
3, 4]
folosirea de culturi mixte de bacterii [5],6,7
folosirea mediului anaerob la anod [2,3, 6,7,8 , 9, 10]
creterea vitezei de alimentare (cu zaharuri) i ali biocombustibili [7]
modificarea electrozilor cum ar fi imobilizarea electro-noforilor [2, 4, 7, 11]
i folosirea polimerilor conductori [11], materiale carbonice nanostructurate
barbotarea de oxigen n compartimentul catodic [2,10].
Pentru celulele de biocombustie microbiene au fost raportate densiti de curent n
jur de 1.5mAcm-2 [7,11], puteri de pn la 3.6 Wm-2 [7]. Rabaey et al [7] au folosit n
experimentele lor o cultur amestecat de bacterii investignd influena vitezei de alimentare cu glucoz asupra puterii. S-au folosit electrozi de grafit obinuit. S-a observat o recuperare a electronilor de 89% pentru viteze de hrnire de 0.5 g L-1 pe zi. n studiul lui
Schroeder et al [11], a fost folosit un anod de polimer activ modificat catalitic (polianilin). A fost folosit o cultur bacterian de Escherichia Coli K12. Cel mai clar dezavantaj al ntregului proces a fost costul de producere al electrozilor. Au fost obinute
densiti de curent comparabile cu cele ale echipei Rabaey et al [7]. Valorile pentru
cureni din literatur n celule de biocombustie microbiene s-au situat ntre 1 Acm-2 i 30
Acm-2. Unele articole au asigurat o atmosfer anaerob la anod [2,6, 8-9] i oxigen barbotat n compartimentul catodic [2, 10]. Aceti factori au contribuit mpreun pentru producerea de cureni mari. De obicei atmosfera anaerob se obine prin trecerea de azot i
dioxid de carbon prin compartimentul anodic. Eliminarea oxigenului conduce la creterea
transferului de electroni de la bacterie la electrod mai mult dect prezena lui. Aerarea
compartimentului catodic mbuntete reacia de reducere a oxigenului la ap.
Ca rezultat, viteza de oxigenare a catodului s-a dovedit a fi un parametru ce poate fi
manipulat pentru optimizarea sistemului generator de curent.n cadrul acestui tip de
celule combustibile, una sau mai multe reacii de electrod sunt catalizate de procese biologice.
Cercetrile n acest domeniu sunt ncurajate de urmtoarele dou considerente:
existena imensei cantiti de materie vegetal disponibil n natur i posibilitatea elimi120

nrii deeurilor de natur organic n mediul ambiant prin transformarea lor n fertilizatori
organici. Procesele biochimice pot genera energie prin degradarea cu randament ridicat a
materiei organice la temperaturi moderate, n soluii neutre sau aproape neutre [12, 13].
Celulele de biocombustie folosesc biocatalizatori pentru conversia energiei chimice
n energie electric [14 a-h]. Aa cum cele mai multe substraturi organice sufer o ardere
cu eliberare de energie termic, oxidarea n prezena biocatalizatorilor a substanelor organice de ctre oxigen sau ali oxidani la interfeele a doi electrozi furnizeaz mijloace
pentru conversia energiei chimice n energie electric. Materiale organice abundente cum
ar fi metanolul, acizii organici sau glucoza pot fi folosite ca substraturi pentru procesele
de oxidare i oxigenul molecular ori H2O2 se pot comporta ca substraturi, fiind reduse.
Puterea disponibil a celulelor de combustie (Pcel) este:

Pcel = d ( Ecel I cel )

8.1

unde Ecel este tensiunea electromotoare a celulei i curentul acesteia, Icel dac este
aplicat o sarcin electric.
Tensiunea ideal a celulei este afectat de diferena dintre potenialele convenionale ale oxidanilor i compuilor combustibili (Eox - E.comb), pierderi ireversibile n
tensiune ca rezultat al limitrilor cinetice ale proceselor transferului de electroni la nivelul
electrozilor, rezistenei ohmice interne i gradienilor de concentraie, care duc la
descreterea valorilor. Curentul celulei este controlat prin dimensiunile electrozilor,
perme-abilitatea ionic i viteza de transfer prin membrana ce separ compartimentele
anodului i catodului biocelulei.
Celulele de biocombustie folosesc biocatalizatori, enzime i chiar organisme celulare ntregi ntr-unul sau dou moduri. Fiecare (i) biocatalizator poate genera substrat
combustibil pentru celul prin transformri biocatalitice sau procese metabolice, ori (ii)
biocatalizatorii pot participa la transferul n lan al electronilor ntre substratul combustibil i suprafeele electrozilor. ns cele mai multe enzime redox nu particip la transferul
direct de electroni cu electrozii, i astfel o varietate de mediatori electronici sunt folosii
pentru contactul electric dintre biocatalizator i electrozi [15]. Recent, au fost dezvoltate
noi abordri cu privire la rolul suprafeelor electrozilor cu monostrat i multistrat constnd
n enzime redox, electrocatalizatori i bioelectrocatalizatori care stimuleaz transformrile
electrochimice la nivelul electrozilor [16].
8.4 Clasificare

Celulele de combustie se clasific n dou mari categorii [17]:


INDIRECTE un anumit compus, folosit la alimentarea unor bacterii, este
convertit ntr-un produs ce poate servi apoi drept combustibil n pila de combustie. Ca exemplu se pot meniona: producerea hidrogenului din hidrai de
carbon, cu ajutorul bacteriei Clostridium cellobioparum, hidrogen din acid
formic cu Escherichia Coli; amoniac din uree cu Bacillus Pasteurii, etanol
din hidrai de carbon, cu Saccharomyces (drojdie). Alturi de producerea de
biocombustibil, procesele biochimce pot fi adaptate i pentru generarea de
121

oxidant. Ca exemplu poate servi procesul de fotosintez din plante, n care


oxigenul este produs din dioxid de carbon.
DIRECTE - au la baza acelai proces ca i pilele indirecte, cu deosebirea c
microorganismul poate funciona n dou feluri. El poate servi ca generator
continuu de enzime necesare procesului electrochimic, n care organismul
nsui nu beneficiaz de pe urma procesului i astfel dispare treptat. De
aceea, o parte din microorganisme se alimenteaz pentru cultur, consumnd
o parte din combustibil. Alternativ, microorganismele se pot cultiva pe electrod sau n imediata vecintate a acestuia, iar produii de metabolism sunt
utilizai direct la producerea de energie electric. Acest tip de pile prezint o
mare dificultate: condiiile favorabile pentru dezvoltarea microorgansmelor
vii (soluii neutre sau aproape neutre i temperatur apropiat sau egal cu
cea ambiant) sunt net defavorabile pentru producerea eficient a energiei
electrice n pilele de combustie.
Lund drept criteriu de clasificare natura microorganismelor utilizate pentru funcionarea celulelor bioelectrochimice se disting:
CELULE ENZIMATICE de COMBUSTIE se utilizeaz catalizatori biologici de tip enzimatici pentru oxidarea combustibilului la anod, respectiv
pentru reducerea oxigenului la catod.
CELULE MICROBIENE de COMBUSTIE sunt utilizate microorganisme
precum bacterii pentru conversia combustibililor i acioneaz ca surs de
producere a energiei. n cadrul acestui tip de celule se disting dou subclase:
o CELULE MICROBIENE de COMBUSTIE cu mediator a cror funcionare necesit adugarea unui mediator electronic artificial: acid 2,6antrachnon disulfonic, tionin, 2-hidroxi-1,4-naftochinona, albastru de
metilen, Fe(III)EDTA, puncte cuantice solubile n ap[18a-g]
o CELULE MICROBIENE de COMBUSTIE fr mediator a cror funcionare nu necesit adugarea unui mediator electronic artificial, pentru
c se utilizeaz bacterii care pot transporta direct electronii prin circuitul
exterior [19,20]
Recent s-a artat c bacteria metalreductoare din familia Geobacteraceae, poate
transfera electroni direct ctre electrozi folosind enzime redox active electrochimic cum
ar fi citocromii pe membrana lor extern [16-18]. Acestea sunt celule de biocombustie
microbiene fr mediatori fiind considerate a avea un potenial mare de aplicaii comerciale dect celulele de biocombustie cu mediatori deoarece mediatorii folosii sunt scumpi
i toxici pentru microorganisme [19].
8.5 Celule de biocombustie microbiene (MFC)

Folosirea unor microorganisme ca microreactoare n celulele de combustie elimin


necesitatea de izolare a enzimelor individuale i permite biomaterialelor active s funcioneze n condiii apropiate de mediul lor natural, rezultnd de aici o nalt eficien.
122

Microorganismele sunt dificil de manipulat sau, n orice caz, au nevoie de condiii


speciale pentru a fi active iar contactul lor electrochimic direct cu electrozii este virtual
imposibil. n MFC fr mediatori exist posibilitatea de a funcionaliza anodul cu materiale biocompatibile cu microorganismele din compartimentul anodic. n acest caz microorganismele vor forma biofilme pe suprafaa anodului iar transferul de electroni se realizeaz prin interfaa membrana celular- suprafaa anodului. n figura 8.2 este prezentat o celul de biocombustie microbian pe care s-au realizat diferite studii i cercetri cu diferite microorganisme.
Celula MFC (figura 8.2) const din dou compartimente un anod i un catod separate printr-o membran schimbtoare de protoni (PEM) din polimer perfluorosulfona
(Nafion, DuPont). Electrozii sunt din hrtie carbonic care pot fi funcionalizai cu diferite
materiale biocompatibile.
n compartimentul catodic se afl o soluie tampon de pH neutru.

Figura 8.2-Celul de biocombustie microbian, montaj experimental

n compartimentul anodic s-a preparat o soluie de glucoz de 200g/l n care s-a introdus diferite microorganisme. O sarcin de 1 Kohm a fost meninut pe tot parcursul
experimentelor. n figura 8.3 este prezentat rspunsul a trei specii de microorganisme, E.
Coli, Klebsiela i S. Aureus. Cele trei tipuri de microorganisme rspund diferit ceea ce
face ca MFC s devin un biosenzor de identificare i analiz a comportrii acestora.[21,
22,23]. Au fost folosite bacteriile prezente n apa menajer n MFC. Aa cum s-a artat,
bacteriile apei menajere se dovedesc a fi biocatalizatori potrivii pentru producerea de
electricitate [24,25].

123

Apa menajer a avut un pH ntre 7,3 i 7,6 i un coninut chimic de oxigen (COD)
de 200-300 mg/L. a fost deasemenea folosit un mediu de glucoz (170-1200 mg/L) cu
urmtorul coninut (per litru): NH4Cl, 310 mg; KCl, 130 mg; NaH2PO4H2O, 4,97 g;
Na2HPO4H2O, 2,75 g; mine-rale (12,5mL)
i vitamine (12,5mL) [26].
Microorganismele au abilitatea de a
produce substane active electrochimic,
substane ce pot fi intermediari metabolici
sau produi finali ai respiraiei anaerobe. n
scopul generrii de energie, aceste substane combustibile pot fi produse ntr-un loc i
transportate la celulele de biocombustie
pentru a fi folosite drept combustibil. n
acest caz, reactorul microbian biocatalitic
produce biocombustibil iar partea biologic
a aparatului nu are contact direct cu partea
electrochimic. Aceast schem permite
prii electrochimice s opereze n condiii
care nu sunt compatibile cu partea biologic a aparatului. Aceste dou pri pot fi
chiar separate n timp, funcionnd complet Figura 8.3-Rspunsul a trei tipuri de microorganisme n MFC (putere funcie de timp,
individual. Cel mai folosit combustibil n
min)
aceast schem este hidrogenul gazos, ce
permite buna dezvoltare i eficien marea celulelor de combustie H2/O2 n operarea alturi de bioreactoare. n Figura 8.4 se arat cum (A): Cu un bioreactor microbian separat
de restul celulei se furnizeaz combustibilul n compartimentul anodic i cum (B). Cu un
bioreactor microbian se furnizeaz combustibilul direct n compartimentul anodic al celulei combustibile.
Potrivit unei alte abordri, procesul de fermentare micro-biologic continu direct
n compartimentul anodic al unei celule de combustie, alimentnd anodul cu produse de
fermentaie generate in situ. n acest caz, condiiile de operare din compartimentul anodic
sunt dictate de sistemul biologic, aa c exist o diferen semnificativ ntre acestea i
celulele de combustie convenionale. Exist o diferen ntre o adevrat celul de biocombustie i o simpl combinaie a unui bioreactor cu o celul de combustibie convenional. Aceast ultima configuraie se bazeaz de asemenea n mod frecvent pe producerea biologic a hidrogenului, dar oxidarea electrochimic a H2 se face n prezena
compuilor biologici n condiii blnde. n acest tip de sistem sunt deasemenea folosite i
alte produse metabolice (alcooli, H2S).

124

Celule bioelectrochimice pe baz de


electrozi enzimatici
O metodologie n plus pentru
dezvoltarea celulelor bioelectrochimice implic aplicarea enzimelor redox pentru oxidarea i reducerea substraturilor specifice de combus-tibili
i oxidani la electrozi i generarea de
energie electric. n consecin este
esenial proiectarea de electrozi enzimatici integrai care cresc contactul
electric.
Caracterizarea detaliat a vitezelor de transfer electronic la interfa- Figura 8.4 Reprezentarea schematica a unei
microbiocelule combustibile
, vitezele biocatalitice i rezisten- A-furnizare indirect B-furnizare de biohidrogen
ele electrice interne este esenial
pentru construcia de celule de biocombustie.
Modificarea chimic a enzimelor redox cu uniti sintetice care mbuntesc contactele electrice cu electrozii furnizeaz mijloace generale pentru sporirea energiei electrice a celulelor de biocombustie.
Modificarea sitului specific al enzimelor redox i funcionalizarea electrozilor reprezint mijloace noi i atractive. Conectarea electric efectiv a proteinelor cu electrozii
sugereaz c eforturile viitoare pot fi direcionate ctre dezvoltarea mutanilor structurali
a proteinelor redox.
Nanoingineria suprafeelor electrozilor cu uniti biocatalizatoare co-factori de
transfer ale sintezelor organice permite controlul transferului electronic n cascade. Prin
reglarea potenialelor redox duce la sporirea generrilor de putere ale celulelor de biocombustie. Configuraiile celulelor de biocombustie discutate mai sus pot fi extinse teoretic i altor enzime redox i substraturi combustibile, permind numeroase aplicaii tehnologice.
Un potenial important al celulelor de biocombustie este folosirea lor n ansambluri
i locaii din fluidele corpului uman, de exemplu sngele. Puterea electric obinut poate
fi folosit n alimentarea cu energie electric a aparatelor implantate ca stimulatoarele
cardiace, pompele, senzorii i protezele.
8.6 Elemente de electrochimia MFC

Similar ca orice celul galvanic n care au loc reacii chimice de generare de


energie util respectiv cldur i MFC se supune acelorai legi ale termodinamicii ns
mecanismele sunt diferite. Pentru simplificare ne vom limita la o analiz termodinamic
a celulei lund n considerare reaciile reversibile.
Puterea electric a celulei (8.1) are dou componente corespunztor celor dou regimuri de funcionare. Primul regim se refer la generarea de electricitate prin acumulare
125

de sarcin pn se atinge o tensiune maxim Ecel. Se presupune c aceasta este constant


pentru al doilea regim de lucru prin conectarea ei la un consumator rezisitiv.
Dac curentul este constant atunci 8.1 devine Pcel= EcelI. Tensiunea electromotoare
produs de sistemul electrochimic poate fi evaluat termodinamic din bilanul energiei libere Gibbs aplicat asupra reaciilor chimice din sistem [17]:
Gr = Gr0 + RT ln
8.2
0
unde Gr este energia liber Gibbs, Gr - energia liber Gibbs a produilor i reactanilor n condiii standard, R- constanta universal a gazelor, T- temperatura iar este
raportul dintre produsul activitilor chimice ale produilor de reacie respectiv a reactanilor.
Lucrul mecanic maxim efectuat de sistem este:
Wmax = Gr = Etem Q = Etem ( znF )
8.3
unde Etem este tensiunea electromotoare a celulei, Q- sarcina electric, z- numrul de electroni transportai per mol, n-numrul de moil, F-constanta Faraday.
Rearanjnd relaia 8.3 se obine,

Etem =

Gr
Gr0
0
=
; Etem
znF
znF

8.4

ce reprezint tensiunile electromotoare generate n condiii de lucru respectiv n condiii


standard. nlocuind 8.4 n 8.2 rezult ecuaia general pentru tensiunea electromotoare generat de o celul electrochimic pentru un cuplu de reacii date:
0
Etem = Etem

RT
ln
znF

8.5

n condiii specifice tensiunea electromotoare este dat de diferenele de tensiuni


electromotoare a reaciilor ce au loc la catod, EC, respectiv la anod, EA adic:
Etem = EC E A
8.6
n MFC, teoretic, randamentul poate fi evaluat ca lucrul mecanic consumat pentru a
transporta znF sarcini n circuitul exterior la diferena de potenial msurat (Ecel= Vmsurat)
raportat la lucrul mecanic maxim efectuat de celul datorat reaciilor de la catod i anod
(Etem znF):

MFC =

Wmasurat Vmasurat znF Vmasurat


=
=
Wmax
Etem znF
Etem

8.7

n realitate datorit rezistenelor interne, Re, (de volum respectiv de interfa) a


celulei potenialul generat va fi:

Ecel = EC E A IRe

8.8

126

n experimente, msurarea potenialelor de electrod pentru determinarea potenialelor la anod, EA, i catod, EC, se raporteaz la un electrod de referin situat n vecintatea acestora. n consecin valorile experimentale nu coincid cu Etem respectiv cu Etem0
din relaia 8.5. n practic pentru o celul ideal cu un cuplu de reacii reversibile se
consider o tensiune electromotoare msurat Ee i o tensiune electromotoare standard de
echilibru Ee0 iar expresia 8.5 se modific corespunztor. Considernd o concentraie de
oxidani, cO respectiv de produi redui, cR atunci relaia 8.5 ia forma:

Ee = Ee0 +

RT
c
ln o
znF cR

8.9

care pentru echilibru ar valorile msurate n circuit deschis trebuie s fie apropiate de Ee.
Excesul de energie liber n sistem indus de suplimentarea de oxidani i de combustibil raportat la valorile de echilibru va conduce la un suprapotenial Ecel mai mare de
Ee. Pentru a maximiza performanele celulei i a obine o tensiune optim este necesar a
maximiza (EC-EA) i de a reduce valorile rezistenelor interne. Densitatea de putere a celulei de combustie se raporteaz la aria electrozilor sau la aria echivalent de catalizatori.

127

8.7 Referine

1 Keith Scott , Ioan Stamatin, JOAM, 9, 6, 1597 - 1605, (2007)


2 R.M. Allen, H.P. Bennetto, Applied Biochemistry and Biotechnology, 39/40, pp. 2740, (1993).
3 D. Park, J. Zeikus, Applied and Environmental Microbiology 66,4, 1292-1297, (2000).
4 S.D. Roller, H.P. Bennetto, G.M. Delaney, J.R. Madison, J.L. Stirling, C.F. Thurston,
Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 34B, pp. 3-12, (1984).
5 D.R. Bond, D.E. Holmes, L.M. Tender, D.R. Lovley, Science 295, 483-485, (2002).
6 D. Park, J. Zeikus, Biotechnology and Bioengineering, 81, 3, 348- 355,(2003).
7 K. Rabaey, et all, Biotechnology Letters, 25,1531-1535, (2003)
8 D.R. Bond, D.R. Lovley, Appl. and Environmental Microbiology 69,1548-1555, (2003).
9 M. Chiao, K.B. Lam, L. Lin, Micromachined Microbial Fuel Cells, IEEE The
Sixteenth Annual International Conference, pp. 383-386, (2003)
10 D. Park, S. Kim, I. Shin, Y Jeong, Biotechnology Letters. 22, 1301-1304, (2000).
11 U. Schroeder, J. Niessen, F. Scholz, A Generation of Microbial Fuel Cells with
Current Outputs Boosted by More than One Order of Magnitude. Angewandte
Chemie International Edition, vol. 42, pp. 2880-2883, (2003).
12 N. Mano, F. Mao, W. Shin, T. Chen and A. Heller, A miniature biofuel cell operating
at 0.78 V, Chem. Commun., 518-519 (2003).
13 M. Chiao, K.B. Lam and L. Lin, Micromachined microbial fuel cells, 16th IEEE
Micro Electro Mechanical Systems Conference, Kyoto, Japan, January 19 23,
2003
14 a.C. Van Dijik, C. LaaneiC. Veeger, Recl. Trav. Chim.Pays-Bas., 104, 245 (1985).
b. W. J. AstoniA. P. F. Turner, Biotechnol. Gen. Eng. Rev.,1, 89 (1984).
c. L. B. Wingard Jr, C. H. ShawiJ. F. Castner, Enzyme Microb. Technol., 4, 137
(1982).
d. A. P. F. Turner, W. J. Aston, I. J. Higgins, G. Davis andH. A. O. Hill, Applied
Aspects of Bioelectrochemistry: FuelCells, Sensors, and Bioorganic
Synthesis, Presented at the Fourth Symposium on Biotechnology n Energy
Productionand Conservation, C. D. Scott (Ed), Interscience, New York,12,
401 (1982).
e. G. T. R. Palmore i G. M. Whitesides, Microbial andEnzymatic Celule de biocombustie, n Enzymatic Conversion ofBiomass for Fuels Production, M.
E. Himmel, J. O. Bakerand R. P. Overend (Eds), ACS Symposium Series
No. 566,American Chemical Society, Washington, DC, pp. 271290(1994).
f. A. T. Yahiro, S. M. LeeiD. O. Kimble, Biochim. Biophys.Acta, 88, 375 (1964).
g. F. D. Sisler, Biochemical Fuel Cells, n Progress n IndustrialMicrobiology,
D. J. D. Hockenhull (Ed), J. & A. Churchill,London, Vol. 9, pp. 111
(1971).
h.S. Wilkinson, Autonomous Robots, 9, 99 (2000).
15. P. N. Bartlett, P. TebbuttiR. C. Whitaker, Prog. ReactionKinetics, 16, 55 (1991).
128

16 I. WillneriE. Katz, Angew. Chem. Int. Ed., 39, 1180 (2000).


17 Liviu Oniciu, Pile de combustie, Ed. Stiintifica, Bucuresti, pp.127, (1971)
18 a.Siebel, D.; Bennetto, H. P.; Delaney, G. M.; Mason, J. R.; Stirling, J. L.; Thurston,
C. F. Electron-transfer coupling in microbial fuel cells: (1) Comparison of redoxmediator reduction rates and respiratory rates of bacteria, J. Chem. Technol.
Biotechnol., , 34B, 3-12 (1984)
b.Delaney, G. M.; Bennetto, H. P.; Mason, J. R.; Roller, S. D.; Stirling, J. L.;
Thurston, C. F. Electron-transfer coupling in microbial fuel cells. II.
Performance of fuel cells containing selected microorganism-mediator
combinations, J. Chem. Technol Biotechnol.,34B, 13-27 (1984)
c. Lithgow, A. M.; Romero, L.; Sanchez, I. C.; Souto, F. A.; Vega, C. A.
Interception of electron-transport chain in bacteria with hydrophilic redox
mediators, J. Chem. Res.,5, 178-179. (1986)
d. Emde, R.,Swain, A.; Schink, B., Anaerobic oxidation of glycerol by Escherichia
coli in an amperometric poised-potential culture system, Appl. Microbiol.
Biotechnol., 32, 170-175 (1989).
e. Park, D. H.; Zeikus, J. G. Electricity generation in microbial fuel cells using
neutral red as an electronophore, Appl. Environ. Microbial.,66(4), 12921297 (2000)
f.Ioan Stamatin, Adina Morozan, Luminita Stamatin, Anca Dumitru, Prospective
Investigations of Biofuel Cells as Source for Applications in Nanobiotechnology, NATO Science Series Volume: Nanostructured and Advanced
Materials for Applications in Sensor, Optoelectronic and Photovoltaic
Technology, Ed. A. Vaseashta, D. Dimova-Malinovska and J. M. Marshall,
(2005).
g. Kim, B. H.; Park, D. H.; Shin, P. K.; Chang, I. S.; Kim, H. J. Mediatorless
biofuel cell, U.S. Patent 5976719, 1999.
19 Chaudhuri, S. K.; Lovley, D. R., Electricity generation by direct oxidation of glucose
in mediatorless microbial fuel cells, Nat.Biotechnol 21, 1229-1232. (2003)
20 Liu, H.; Ramnarayanan, R.; Logan, B. E., Production of electricity during wastewater
treatment using a single chamber microbial fuel cell, Environ. Sci. Technol., , 38,
2281-2285, (2003)
21 Luminita Stamatin, I. Stamatin, Nanobiocomposites based on nanocarbon for cell
culture media, in Nanoengineered Nanofibrous Materials, Ed. Y. Gogotsi, S. Kacac, Kluwer, pp289-298 (2004)
22 A. Morozan, I. Stamatin, L. Stamatin, A. Dumitru, K. Scott, Carbon Electrodes for
microbial fuel cells, JOAM, 9,1, 221-224, (2007)
23 Adina Morozan, L. Stamatin, F. Nastase, A. Dumitru, S. Vulpe, C. Nastase, Ioan Stamatin, Keith Scott The biocompatibility microorganisms-carbon nanostructures for
applications in microbial fuel cells , Phys. Stat. Sol. a 204, 6, 17971803 (2007)
129

24 Liu, H.; Ramnarayanan, R.; Logan, B. E. Production of electricity during wastewater


treatment using a single chamber microbial fuel cell. Environ. Sci. Technol., 38,
2281-2285. (2003)
25 Park, D. H.; Zeikus J. G. Improved fuel cell and electrode designs for producing
electricity from microbial degradation. Biotechnol. Bioeng., 81(3), 348-355 (2003)
26 Lovley, D. R.; Phillips, E. J. P. Novel mode of microbial energy metabolism:
Organism carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron and
manganese. Appl. Environ. Microbiol., 54(6), 1472-1480 (1988)

130

9. Nanoparticule n medicin
Am putea spune c acest domeniu s-a nscut o dat cu experimentele lui Albert
Einstein, care ntr-un capitol al lucrrii sale de doctorat, a calculat mrimea unei singure
molecule de zahr ntr- un experiment de difuzie a zahrului n ap. Experimentul su a
artat c fiecare molecul msoar aproximativ un nanometru n diametru.
Domeniul este relativ nou i a evoluat o dat cu creterea necesitii de a gsi noi
materiale cu biocompatibilitate ct mai mare pentru reducerea intoleranei organismelor
vii. ncepnd cu protezele i aliajele dentare, componente artificiale pentru nlocuirea de
pri ale organelor sau chiar integral ( rinichi, ficat, piele, componente ale inimii, esofag,
plmni,ochi etc) au fost dezvoltate noi materiale cu proprieti din cele mai sofisticate.
Aria sintezei nanomaterialelor a permis o nou abordare. Binecunoscute din tiina
coloizilor nanomaterialele au surmontat principalul inconvenient- pot fi stabile fr a fi
necesar stabilizri n diferite micelii. Nanomaterialele nu sunt altceva dect tot ce cunoatem ca materiale la scal macroscopic dar reduse la nivel nanometric ele prezint ori noi
proprieti ori cele clasice sunt amplificate. Nanomaterialele nu sunt produse prin tehnicile up-down adic formarea lor prin reducere dimensional ci inversbottom-up
mprumutnd mult din tehnicile chimiei supramoleculare, coloizilor, sol-gel, inginerie genetic, biologie/ biochimie molecular. Peste acestea s-au suprapus noile metode de manipularea i sinteza cu microscopia de fore atomice, metode de autoasamblare (SAM), manipularea cu fascicule laser (tweezer), inscripionarea direct prin ink-jet etc.
Dimensiunile lor fiind sub sau comparabile cu cele ale virusurilor (figura 9.1); activitatea lor este adeseori amplificat datorit mesostructurii i forelor superficiale total
diferite de ce se ntmpl la dimensiuni normale. Interesul n poteniale aplicaii biomedicale ale nanomaterialelor i ale materialelor nanostructurate, provine din percepia c
ele sunt capabile s interacioneze cu biomolecule individuale, celule i prile lor individuale i alte structuri biologice. Pe o scal a mririlor pentru inspecia microscopic
(figura 9.1) se observ c domeniul dimensional al nanoparticulelor acoper o vast arie
dimensional n scala nanometrilor compatibil cu microorganismele i virusurile.Vor fi
abordate cteva din aspectele impactului nanoparticulelor n medicin unele din ele fiind
elaborate i dezvoltate n aceast lucrare.
1. Nanofibrile, Nanoparticule de carbon existente n mediul nconjurtor, datorit emanaiilor de gaze incomplet arse- pot fi inhalate i ajung localizate
n diferite organe dar cel mai adesea n circuitul sanguin unde cu glucoza,
hemul i ali mediatori mpreun cu microorganisme patogene pot forma
adevrate celule miniaturizate bioelectrochimice ce pot produce electricitate
iar ca produi pot varia de la cei inofensivi ( ex CO2) la gaze combustibile,
uneori accelereaz formarea toxinelor.Astzi exist largi studii de a crea
miniroboi ce folosesc substanele din circuitul metabolic ce produc electricitate i energia necesar pentru a transporta medicamentele la o int pre131

cizat. Ansamblul gastrobot medicament nvelit n filme inteligente cu recunoatere molecular a celulelor bolnave- unitate de transport format din cili
biomimetic- este intens studiat ca domeniu specific de drug deliveytransport inteligent de medicamente. Structura i activitatea specific a
nanoparticulelor de carbon rezultate din sinteza prin piroliz laser , a artat
c n anumite situaii pot accelera transportul de oxigen spre microorganismele aerobe jucnd rol de pompe de oxigen

Figura 9.1 Comapraie dintr dimensiunile microorganismel i nanoparticule pe o scal a mririlor acoperind
microscopia optic i de fore atomice

2. Nanocompozite/nanobiocompozite- ca definiie acceptat orice compozit care conine cel puin un material nanometric ntr-o matrice dat se numete
nanocompozit. Dac matricea conine materiale biologice sau biocompatibile
ele capt denumirea generic de nanobiocompozite. Nu vom intra n detalii
asupra diferitelor metode de formare a nanocompozitelor. De reinut c orice
tip de matrice de la gel pn la polimeri sau alte solide care conin materiale
nanometrice dispersate, funcionalizate, legate chimic, etc formeaz clasa
nanocompozitelor ( dispersiile lichide, coloizii sunt clase distincte). n aceast lucrare s-a studiat dezvoltara de medii de cultur ce pot induce creterea
accelerat a unor tipuri de microorganisme reducndu-se astfel timpii de
incubare la jumtate n scopul unui diagnostic mai rapid. Ulterior s-a
constatat c o combinaie de creteri pemedii de cultur pe baz de nanocarboni i transferul acestora ntr-o celul de biocombustie cu electrozi pe
baz de nanotuburi de carbon se pot identifica tipule de microorganisme
datorit specificitii lor n mecanismele de transfer de electroni.
132

3. Puncte cuantice(Q-dots)-Nanocristale ce au proprietatea de luminofori sau


de colorani luminisceni sub aciunea radiaiei de la albastru spre ultraviolet.
Diferenele sunt majore fa de luminoforii i coloranii clasici biotinilai sau
nu. Q-doturile au o emisie specific pe o anumitlungime de und cu persisten ndelungat. Biotinilate devin biocompatibile, se pot ataa pe diferite
structuri biologice avnd capacitatea de indexare i identificare respectiv secveniere. Lucrarea abordeaz un singur aspect utilizarea lor n investigarea
unor tipuri de preparate biologice intind spre analiza elementelor componente ale sngelui i a naturii paraziilor. De notat c aceast metod este
pentru prima dat introdus la nivel naional.
n continuare vor fi prezentate aspecte specifice pentru cele dou clase de nanoparticule i acolo unde este posibil comentarii ncercnd surprinderea aspectelor comune
din biologia microrganismelor cu proprietile nanoparticulelor
9.1 Nanofbrile, Nanocarboni, rolul lor n microbiologia clinic
Nanofibrile

De curnd nanofibrilele (NF) au fost menionate ca o conexiune ntre lumea


nanometric i macrometric, pentru c n teorie, avnd diametru unei fraciuni de micron,
nanofibrila poate fi infinit de lung. Ele sunt considerate ca o conexiune de la nanobiecte
spre macroobiecte.[1]. Producerea nanofibrelor prin electrospining (etirare n cmp electric a unei soluii lichide de material prin canale capilare) sau centrifugare capilar, este
de mare actualitate, i o varietate de nanofibrile continui sau poroase au fost realizate cu
aceast metod.
Ele includ: polilactide, (PL) poliglicolide (PG), polietilentereftalai, poliacrilonitril,
polivinilcarbazol, policarbonat, polistiren, polimetil-metacrilat, polivinilpirolidon, polimetacrilat, polioximetilene [2]. Co-electrospining de soluii coloidale cum ar fi hidroxiapatita ntr-o soluie polimer a condus la nanofibrile ce pot ncorpora nanoparticule. Un
alt exemplu cu un impact considerabil pentru medicina reparatorie de esutuei este obinerea de nanofibrile de polioxietilene cu nanotuburi i de aici nanocompozite fibrilare cu
o reziten mecanic foarte mare [3].
Similar, dac se nglobeaz n soluii de polimeri biodegradabili diferite medicamente atunci nanofibrilele pot deschide arii largi de aplicaii pentru industria medicamentelor [4]. Nanofibrile cu polimeri biodegradabili cum sunt polilactidele poliglicolidele sunt de interes pentru ingineria esuturilor de susinere deoarece ei se dizolv
complet dup implantare, nu se comport ca materiale strine n corp [5]. Utiliznd tehnici
de electrospining au fost obinute fibre de colagen de 100 nm n diametru i care au aceleai configuraii cu ale nanofibrilelor de colagen natural. Au fost obinute, prin aceast
tehnic din soluii de colagen cu nanotuburi, nanofibre care au abilitatea de a facilita creterea celulelor i formarea esuturilor de susinere [6].
Aplicaiile nanofibrilelor n lumea medical sunt multiple: pentru filtrarea mediilor
biologice, pentru a transforma sau anihila substanele patogene sau microorganismele. De
exemplu filtrele din nanofibrile au suprafee specifice de ordinul sute de metri patrai per
133

gram care n comparaie cu microfibrilele cu zeci de metri patrai. Filtrele din nanofibrile
sunt foarte utile n procesul de purificare a apelor, procese de dializ dar i n prevenirea
i combatere a bioterorismului.
Recent a fost raportat obinerea unor filtre ce sunt capabile s rein metalele grele,
viruii i bacteriile din ap i s separe proteinele.Aceste filtre au fost fabricate din nanofibrile de alumin (Al2O3) de Aragonide Sanfort [7]. Alumina nanofibrilar atinge
dimensiuni impresionabile de 2 nm n diametru i o suprafa de contact de 500-650
m2/gram. Un exemplu interesant despre cum se asambleaz peptidele pe nanofibrile a fost
descris recent n [8]. Autorii studiaz sinteza moleculelor de peptide molecule amfifile
care se autoasambleaz reversibil cu nanofibrile rezultnd un gel apos. Aceste structuri
sunt n continuare polimerizate pentru a mbunti stabilitatea lor. Nanofibrilele sunt
utilizate ca abloane pentru producerea de nanotuburi prin acoperirea acestora cu un alt
material care dup procesare se poate elimina miezul format din polimer
Nanomaterialele i nanfibrilele nu snt invenia genial a unui creier uman, ele sunt
larg rspndite n natur. Diferite materiale naturale cum ar fi: lemnul, mtasea, prul,
conexiunile celulare, oasele, pielea i celulele vaselor de snge, toate aceste formaiuni
sunt produse prin repetarea regulat a aranjamentului nanofibrilelor alctuite din proteine
i polizaharide. Moleculele de ADN, sunt un exemplu de nanofibrile de 2 nm n diametru
i de 100 nm lungime.
Un exemplu interesant de material nanostructurat utilizat sau produs n natur, este
cel al culorii albastre a penajului la psri. Aceast culoare nu este dat de un pigment albastru al penajului ci de un sofisticat aranjanjament nanostructurat. Culoarea albastr a
penajului la psri este dat de lumina ce este mprtiat coerent pe aranjamentul de fibrile de keratin i bulele de aer ce alctuiesc fulgul penei.[9, 10].Un alt exemplu interesant ce conine nanofibrile naturale este cel al polimerizarii fibrinogenului i formrii
cheagului de snge. Este un exemplu magistral de aranjament nanostructurat de macromolecule i este rezultatul stadiului final al coagularii n cascad. Ansamblu coagulrii
const dintr-o succesiune de etape distincte care influeneaz rata asamblrii fibrelor de
fibrin i aranjamentul final al fibrilelor n procesul coagulrii. Primul pas n procesul de
clivare proteolitic a proteinei plasmatice fibrinogen (factorul 1. n sistemul coagulrii
celulare ), este ndeplinit de enzima numit trombin.Trombina cliveaz peptidele moleculare, mici, cunoscute cu denumirea de fibrinopeptide A i fibrinopeptide B ale moleculei de fibrinogen. Oligomerele cresc i dau protofibrile, care la rndul lor formeaz
fibrilele finale n procesul de coagulare. Dup atingerea unei mase critice protofibrilele
formeaz fibrile i n final o reea sub form de cheag.[11,12]. In vivo, fibrina monomeric n mod spontan formeaz un polimer solid care se leag covalent de celulele sngelui printr-o enzim plasmatic transglutaminaza i se transform ntr-un polimer
insolubil. In vitro, polimerul de fibrin trebuie s polimerizeze reversibil i apoi s repolimerizeze n structura mai sus amintit.
Este posibil s se formeze o fibrin lucrtoare, cu un larg spectru, cu fibrile de grosimi diferite, realiznd n final un polimer de porozitate diferit, cu pori distribuii diferit.
134

Numeroi factori contribuie la determinarea final a diametrului fibrilelor i la funcionarea sistemului[13,14]: tria ionic, pH, raportul fibrinogen / trombin, prezena
altor proteine plasmatice. Autoasamblarea fibrinei apare n special via legturile necovalente A- i B- dintre siturile localizate de polimerizare din domeniile E centrale i
domeniile D periferice ale fibrinei. Natura fizico- chimic a legturilor covalente depinde
de interaciunile electrostatice i legtura de hidrogen ce nsoete resturile de aminoacizi
n cursul procesului de asamblare a fibrilelor de fibrin. Este semnificativ observaia c
efectul triei ionicei ce nsoete procesul de polimerizare, influenaz rata de polimerizare. Deasemeni interaciile hidrofobe particip la polimerizarea fibrinei.
Studiul asupra nanostucturilor de fibrin este de mare interes pentru lumea academic i medical, att n ceea ce privete noua viziune asupra conceptului de boal a
coagulrii ct i n ceea ce privete noile perspective ce se deschid, fibrina are un potenial
important n industria medicamentelor i n cea a esuturilor de susinere.
Nanofibrile carbonice

ACF- fibrele de carbon activate, sunt materiale fibroase nanostructurate, ce au mare potenial n medicina aplicat. Diametru acestor fibrile este de ordinul micrometrilor,
au mari suprafee interne i sunt clasificate n funcie de dimensiunea porilor n trei categorii:
micro, au porii mai mici de 2nm,
mezo, au porii ntre 2-50 nm,
macro, cu porii mai mari de 50nm.
Aceast clasificare se bazeaz pe diferena n mecanismul de adsorbie a gazelor,
clasificare realizat la recomandrile IUPAC. Toate cele trei tipurile de pori contribuie la
nanostructurarea ACF.
GAC- fibre de carbon gaz adsorbante, sunt utilizate cu succes n purificarea sngelui extracorporal, hemoperfuzii.
Rezultate preliminarii comparative ntre cele dou nanostructuri, ACF i GAC au
condus la idea c au un potenial deosebit n aplicaiile medicale.
Aplicaii medicale ale ACF i GAC
Bactericid puternic, dovedit prin impregnarea fibrilelor de carbon activ cu cupru i
amestecarea lor cu un mediu nutritiv pentru culturi de: Pseudomonas mirabilis, E. coli,
Stafiloccocus aureus sau Pseudomonas aeruginosa. n toate cazurile din aceste culturi nu
s-a observat dezvoltarea coloniilor de microorganisme. Importante rezultate pozitive i ncurajatoare sunt n tratarea tumorilor, prin reducerea dimensiunilor acestora sau dispariia
lor. Experimentele s-au efectuat pe animale de laborator dar i pe voluntari umani.
Imobilizarea endotoxinei bacteriene de la Stafilococul auriu, cu ACF (SAC-ACF)
sau de la E.coli (BET-ACF), se poat folosi pentru experimente de tratare a cancerului la
animalele de laborator. n aceste cazuri durata de supravetuire a fost mrita de la 52 zile
la 76 zile, prin hemoperfuzii. Rezultatele sumarizate din literaturt arat marile posibiliti ce se ofer aplicaiilor medicale prin folosirea nanomaterialelor cum ar fi nanofibrin i ACF sau GAC.
135

n cazul fibrelor naturale de fibrin, proprietile lor pot fi semnificativ nbuntite


sau modificate n sensul dorit. n cazul ACF sau GAC, un simplu calcul estimeaz c
suprafaa nanoporozitii nano-fibrilelor este de 200-2000 metri ptrati per gram. O suprafaa specific mare, ca aceea din ACF dar care nu necesit o etap de activare va
reduce semnificativ rezistena mecanic a materialelor carbonice, aceasta este un mare
avantaj. Suprafaa extern care nu are limitri n difuzia intraporoas ar putea reduce rata
de adsorbie prin carbonul poros. n ciuda faptului c nanofibrilele de carbon nu sunt produse pe scar larg, recente descoperiri n domeniu au fcut posibil descoperirea de
nanofibrile din polimeri, care au condus la producerea unor fibrile de carbon prin piroliz
ce va deschide n viitor oportuniti pentru aplicaii medicale a acestor materiale.[15]
9.2 Nanocarboni

Particule carbonice de dimensiuni (sub)micronice sunt rspndite prin intermediul


curenilor de aer pe toata suprafaa Terrei dar sunt cu precdere concentrate n marile
aglomerri urbane, fiind un factor important n fenomenul polurii. Ele au o provenien
foarte divers, de la emisiile motoarelor (ndeosebi cele Diesel), termocentralelor i pn
la incendii. Aciunea lor asupra sntii oamenilor este att direct, prin afectarea sntii oamenilor, n spe a sistemului respirator i a altor sisteme [16, 17], dar poate fi i
indirect, prin creterea incidenei diferitelor infecii bacteriene ca urmare a interaciei
acestor microorganisme patogene cu particule aflate n suspensie.
Microorganismele coexist cu oamenii de foarte mult timp i unele au dezvoltat
relaii simbiotice cu acesta, pe cnd altele atac organismul uman, putnd fi foarte virulente. Poarta de intrare a acestora din urm poate fi att pielea, ct i sistemul respirator
sau cel digestiv. Bacteriile simbionte sunt importante prin faptul c produc o serie de vitamine din grupa B ct i prin faptul c mpiedic dezvoltarea celor patogene.
n cadrul procesului de studiere a interaciilor de tip organism unicelular particule
de dimensiuni submicronice, un factor fundamental l constituie cunoaterea proprietilor
de suprafa ale celor dou sisteme ce interacioneaz:
Pe de o parte a nveliului microorganismelor, care este constituit n cazul
bacteriilor de complexul membranperete bacterian;
Pe de alt parte, suprafaa nanoparticulelor, n particular cele carbonice.
Membrana bacterian (ca i membranele tuturor celulelor vii) este alcatuit n principal dintr-un dublu strat lipidic, cu proprieti de cristal lichid, adic moleculele lipidice
sunt ordonate, dar sistemul are o anumita fluiditate. Ea nu este doar o simpl barier
fizic dintre citoplasm i mediul extern, avnd i o serie de funcii ce depind n mod critic de proteinele ce se gsesc ncorporate n stratul lipidic. Cteva din aceste funcii sunt:
Asigurarea legturilor structurale dintre citoscheleton ( reeaua de proteine
fibrilare din citoplasma celulei) i matricea extracelular;
Transportul selectiv al unor molecule i ioni specifici n interiorul i n afara
celulei;
Cataliza a multor reacii chimice, de cele mai multe ori existnd un sistem de
enzime, fiecare cataliznd o secven dintr-un lan de reacii metabolice.
136

Peretele bacterian are o compoziie i structur complex. Exist dou tipuri principale de structuri ale acestuia care determin clasificarea bacteriilor n dou clase: Gram
pozitiv i Gram negativ. Aceast denumire provine de la metoda Gram de identificare a
bacteriilor ce folosete violetul de genian (un colorant bazic trifenil-metanic) i o soluie
apoas de iod i iodur de potasiu. Dup splare cu alcool, bacteria fie va reine coloraia
puternic violet a violetului de genian, fie va fi complet decolorat. Uneori se aplic i o
colorare suplimentar cu fucsin sau eozin pentru a da bacterilor decolorate o culoare
roiatic i a le face mai vizibile. Bacteriile ce rein culoarea violet sunt cele Gram
pozitiv, iar n caz contrar sunt Gram negativ [18].
Toate bacteriile, cu excepia micoplasmelor, posed un perete bacterian iar principala component a acestuia este mureina, un peptidoglican, care contribuie la rigiditatea
mecanic a acestuia. Toate bacteriile Gram negativ conin un strat adiional n structura
peretelui celular, o membran extern, care este localizat deasupra stratului peptidoglicanic, astfel c la o seciune prin nveliul bacteriilor de acest tip vazut la microscopul electronic apare o structur trilaminar [19]. O alt deosebire dintre cele dou
grupuri const n grosimea stratului peptidoglicanic, care este mult mai mare la cele Gram
pozitiv.

Figura 9.2-Fragment de
peptidoglican

Figura 9.3 Legarea catenelor i


reticularea n peptidoglican
(encarta-2005)

Peptidoglicanul este un polimer insolubil, tridimensional, compus din catene n


care se gsesc alternativ resturi de N-acetilglucozamina i acid N-acetilmuramic ( figura.
9.2). Legtura dintre catene se face ntre resturile de acid N-acetil muramic prin intermediul a cte dou lanuri scurte polipeptidice. A doua polipeptid (de obicei pentaglicina) se
leag n punte (poziiile 2 i 4) ntre dou peptide paralele, identice, legate fiecare la
rndul lor de cte un rest de acid N-acetil muramic din doua catene adiacente ( figura 9.3).
Rigiditatea acestui ansamblu este dat att de legturile covalente, ct i de cele de
hidrogen dintre resturile de aminoacizi C=O.....H-N. Tot legturi de hidrogen pot forma i
137

grupele hidroxil prezente sub forma de CH2OH din catenele principale. De asemenea,
datorit spaiilor relativ mari dintre catene, polimerul peptidoglicanic este mbibat cu molecule de ap, care sunt i ele reinute prin legturi de hidrogen, ceea ce d natere unei
faze de gel n care sunt dispersate o varietate de alte molecule mici.
Polimerul peptidoglicanic nu este lipit direct de membrana intern lipidic, ntre
acestea existnd un spaiu n care se afl apa, numit periplasma. Unii autori consider c
la bacteriile Gram negative i peptidoglicanul este o component a acestei periplasme. O
alt caracteristic a bacteriilor Gram negative o constitiue prezena n membrana extern
a unor lipopolizaharide precun i a unor pori, cu deschidere de circa 1-2 nm, indui de
proteine specifice, numite porine. Cele Gram pozitive prezint la exterior polizaharide
specifice ancorate n perete, precum i polimeri filiformi de tip acid teichoic (ancorat tot
n perete) si lipoteichoic (ancorat in membrana de baza), acizi cu compozitie complexa de
tip poliesteri fosforici ai glicerinei cu resturi de alanina, zaharuri cu/far lipide. De asemenea, bacteriile posed pentru locomoie mai muli flageli care ncastrai n peretele
celular ce asigura deplasarea acestora spre sursele de nutrieni i oxigen. Alte structuri
filiforme prezente pe peretele bacterian sunt pilii. Ei sunt formai din proteine tubulare cu
rolul de a ajuta bacteria s adere la celula gazda , folosind de asemenea la transferul
informatiei genetice de la o celula bacterian la alta prin mecanismul de conjugare,
Multe bacterii prezint pe exteriorul peretelui bacterian un strat mucoid, foarte
puternic imbibat cu ap, numit capsul, ce are o grosime apreciabil. El are n compoziie,
spre exemplu la bacilul de antrax, un polimer al acidului glutamic, iar la alte bacterii
conine polizaharide. Rolul su pare a fi de protecie a bacteriei mpotriva mecanismelor
de aprare a gazdelor infectate.
n afara de proteinele din membrana de baz, se mai gsesc, lipoproteine, i multe
alte tipuri de proteine cu diverse roluri ( de transport, catalitice, antene pentru diverse
semnale, de adeziune etc) [20].
Un alt fapt ce trebuie menionat esta c o mare parte din antibiotice acioneaz prin
blocarea biosintezei peretelui bacterian, n spe deregleaz sinteza peptidoglicanului. n
absena unui perete funcional, materialul bacterian din interiorul celulei este expulzat
afar i bacteria moare [4].
Tabloul zugrvit succinct relev marea complexitate i varietate, dar i importana
nveliului bacterian. Proprietile acestuia l fac apt s interacioneze n multiple moduri
cu suprafaa nanoparticulelor n particular cele carbonice, determinnd o schimbare profund a comportamentului bacteriilor.
Tipuri de nanocarboni

Interacia dintre microorganisme i materialele carbonice a fost studiat din mai


multe puncte de vedere, n special din cel al depolurii apelor folosind carbon activ, care
se tie c are o suprafa specific foarte mare, comparabil cu cea a nanoparticulelor carbonice. Spre exemplu, bacteria Escherichia coli s-a dovedit a crete adsorbtia srurilor de
Pb(II) i de Cd(II) i de a o scdea pe aceea a Cr(VI) din soluii apoase de ctre carbonul
activat [21]. Aceste rezultate se pot explica prin schimbrile de densitate de sarcin
138

superficial a carbonului cnd bacteria este adsorbit i prin considerarea caracteristicilor


structurale i chimice ale peretelui bacterian. De asemenea, se constat un proces
competitiv dintre cationii divaleni de Pb(II) i Cd(II) pe de o parte i cationii electrolitici
pe de alt parte ce sunt atrai spre gruprile funcionale ncrcate negativ ale substanelor
polimerice extracelulare.
O alt direcie a fost aceea a determinrii activitii antimicrobiene a argintului
(0,05% masic) depus pe fibre de carbon activate [22]. Concluzia a fost c efectul antimicrobian nu pare a fi legat exclusiv de prezena argintului i depinde i de concentraia
oxigenului dizolvat.
Nanoparticulele carbonice au dou caracteristici foarte importante care le fac indicate pentru studiul interaciei lor cu microorganismele: au o suprafa specific foarte
mare i o reactivitate foarte ridicat, care le fac apte pentru a influena dezvoltarea
bacteriilor cu care vin n contact. Nanoparticulele de carbon au o foarte mare activitate
chimic pe de o parte datorit legturilor nesatisfacute ( aa numitele dangling bonds),
adic electroni necuplai, iar pe de alt parte datorit gruprilor chimice ce apar la marginile planelor grafenice prin expunerea acestor nanoparticule la oxigenul din aer. Aceste
grupri pot fi att acide: carboxil, hidroxil fenolic, hidroxil lactolic i chiar lactona, dar s-a
emis ipoteza c i alte structuri oxigenate cum sunt resturi de cromen, cetone si pirone pot
prezenta proprietati bazice [23], aa cum se arat n figura 9.4. Sursa bazicitii carbonului o reprezint electronii delocalizai din planele bazale [8].

Figura 9.4- Moedelul structural a nanoparticulelor de carbon [24]

Faptul c suprafaa nanoparticulelor carbonice prezint proprieti acido-bazice ,


ceea ce nseamn donoare si acceptoare de protoni este un alt argument n favoarea unei
interacii puternice cu celulele bacteriene, tiut fiind faptul c acestea prezint sisteme
proteice cu funcii de pompe de protoni.
O alta propritate a suprafeei nanoparticulelor carbonice o constituie cea redox, adic proprietatea de cedare-acceptare de electroni. Un grup de cercetatori americani a
studiat aceasta proprietate prin metode de spectrofotometrie UV-Vis si poteniometrice
expunand particulele de negru de fum de furnal, unor diversi ageni redox cum sunt
Cr(VI), Mn(VII), Fe(III) si SO3-. Abilitatea suprafeei acestor particule carbonice de a
participa la reacii redox cu aceti reactivi a fost corelat cu atribute morfologice cum
139

sunt dimensiunea cristalitelor i aria suprafeei. Datele au artat c abilitatea acestui tip de
carbon de a accepta/dona electroni este funcie de densitatea de defecte pe suprafaa negrului de fum [25].
Transferul de electroni este esenial n multe procese celulare, cum ar fi de exemplu
cele de fotosintez i de respiraie. Se poate presupune asftel i posibiltatea existenei
unui schimb electronic la contactul bacteriilor cu nanoparticulele carbonice, prin intermediul proteinelor existente n peretele bacterian.
Dei suprafaa carbonulului este de obicei hidrofob, structura chimic se poate
modifica pentru a crete hidrofilicitatea [26]. S-a amintit mai sus c oxigenul reacioneaz
cu suprafaa carbonic cconducnd la diverse grupri, polare, cu caracter puternic hidrofil.
Aceste grupri pot atrage nu doar moleculele de ap dar i alte grupe polare ce se
gsesc din abunden pe suprafaa peretelui bacterian, astfel ele pot adera foarte strns la
nanoparticulele de carbon.
Trebuie reinut c grupele carboxil si hidroxil fenolic de la suprafaa carbonului pot
ioniza cu formare de ioni de tip Ar-COO i Ar-O, unde Ar reprezint restul carbonic cu
caracter aromatic. De asemenea, aceste grupe pot interaciona cu structurile ce prezint
molecule ionizate pozitiv de la suprafaa peretelui celular, cu formare de legturi ionice
puternice.
Suprafaa specific foarte mare ca i porozitatea acestor nanoparticule permit adsorbia prin legturi slabe a oxigenului din aer dar i a unor nutrienti din mediul de cultur. Aceste substane adsorbite vor fi eliberate ctre bacteriile care aderente la nanoparticule, fenomen ce poate constitui o explicaie pertinent pentru dezvoltarea foarte rapid a coloniilor de microorganisme.
n concluzie, suprafaa carbonului conine o proportie variabila de situsuri active,
constituite de catre valentele nesaturate de la marginea straturilor grafenice formate de
atomii de carbon, proportie ce creste desigur cu cresterea porozitatii si a dimensiunii suprafeei; pe de alt parte, prezena unor heteroatomi cum sunt n principal oxigenul, hidrogenul si azotul de asemenea introduce situsuri active la suprafaa carbonului, si deci
aceasta suprafaa nu e deloc inert cum ar parea [10].
Un alt aspect demn de a fi luat in cosideraie este acela al Hidrocarburilor Aromatice Polinucleare (PAH-uri), care sunt prezente ntotdeauna adsorbite la suprafaa
particulelor nanometrice de carbon, stiindu-se faptul ca aceste PAH-uri apar ca intermediari in procesele pirolitice ce au ca precursori hidrocarburi in stare de gaz sau vapori.
Aceste molecule ar putea interaciona cu bacteriile n dou moduri: pe de o parte
ar putea fi oxidate de aparatul enzimatic al acestora i s aib loc astfel un fenomen de
biodegradare [27], iar pe de alta parte aceste PAH-uri ar putea strabate barierele membranare si odata ajunse in interiorul celulei sa interfere cu mecanismul de multiplicate al
acizilor nucleici bacterieni, provocnd mutaii genetice cu diverse consecinte [28].
Medii de cultura specifice bionanocompozite cu nanomateriale carbonice

Interacia nanoparticulelor cu structurile vii este studiat la ora actual att din
punctul de vedere al nanotehnologiei dedicate aplicaiilor n biologie i medicin, ct i
din perspectiva contaminrii mediului ambiant i implicit al organismelor cu aceste nano140

particule. Dou proprieti caracteristice ale nanoparticulelor sunt de mare importan n


cadrul acestei interacii: o suprafa specific foarte mare i o mare reactivitate chimic.
Datorit compatibilitii in dimensiune a nanostructurilor de carbon cu microorganismele interaciunea lor este urmatat de o multitudine de efecte pozitive sau negative.
Combinnd dimensiunea nanometric cu reactivitatea nanoparticulelor sub diferite
aspecte biochimice, efectele asupra materiei vii pot fi extrem de benefice dar i dezastruoase. Bionanocompozitele cu matrici de medii de cultur ce nglobeaz nanoparticule
de carbon de diferite forme, dimensiuni i compoziii pot fi utilizate n dezvoltarea de noi
tehnici bioanalitice.
n cele ce urmeaz se descrie realizarea primelor medii de cultur bionanocompozite cu pulberi obinute prin piroliza laser , plasmochimice i respectiv uzuale tipice din
tehnologia negrului de fum i a pigmenilor. Interesul n potenialele aplicaii biomedicale
ale nanomaterialelor i biocompozitelor provine din percepia c acestea sunt capabile s
interacioneze cu biomoleculele individuale, celule sau organite celulare de mrimi micro
sau nanometrice. Toate materialele biocompozite au n structura lor nanofibrile sau nanoparticule cu activiti specifice iar n particular pentru acest caz de studiu nanoparticulele
de carbon.
Diversitatea nanoicroparticulelor existente n mediul ambient sub form de aerosoli
influeneaz dezvoltarea microorganismelor i a bolilor infecioase ale pielii.
Micropartidulele din aerosoli rezultate din activitatea industrial induc largi clase
de mbolnviri cum ar fi: n mine, silicozele; n industria tipografic boala plumbului; n
industria diamantelor, nanoparticulele de diamant induc suferine pulmonare prin eroziunea esutului pulmonar etc.
Deasemeni nanoparticulele pot modifica rata de cretere, dezvoltare a microorganismelor, influennd prin prezena lor pe tegumente dezvoltarea de stafilococii i streptococii cutanate sau a unor parazii cutanai.
n particular nanocarbonii pot accelera dezvoltarea de microorganisme atunci cnd
sunt imersate n medii de cultur observate n primele stadii de cercetare. Aceste observaii conduce la necesitatea de a dezvolta noi tipuri de medii de cultur care s accelereze
creterea coloniilor reducnd astfel timpul de de incubare. n acest scop s-a conceput i
realizat o serie de bionanocompozite care sa devin mult mai eficiente ca medii de
cultur. Bionanocompozitele concepute cu nanoparticule funcionalizate i asamblate n
medii de cultur sunt cocepute pentru creterea rateide dezvoltare a microorganismelor.
Statisticile au artat c atunci cnd atmosfera are un grad semnificativ de ncrcare
cu particule carbonice rezultate de la couri de ardere sau evi de eapament, i procentul
de noxe de tip NOx i SOx este crescut, frecventa mbolnvirilor cu aceste microorganisme fiind mai mare.
Nanopulberi carbonice de diferite morfologii au fost nserate n dou medii de
cultur prin metode adecvate cu scopul de a estima rata de dezvoltare i virulena diferitelor clase de microorganisme
Materiale i metode
141

Nanocarbonii folosii provin din piroliz laser sau din descompunere n plasm
(sursa Institutul Naional Fizica Laserilor Plasm i Radiaii). Ca referin s-au studiat i
specimene de negru de fum. Caracteristicile materialelor sunt prezentate n tabela 9.1.
Structura lor este prezentat n figura 9.5. Se observ c fiecare tip de nanocarbon are o
topografie sppecific cu o structur turbostratic difereniate prin natura compoziiei lor i
a gruprilor funcionale induse din procesele de sintez.
Tabela 9.1 -Nanocarboni compatibili cu aerosolii din mediu folosii n BNC
Tipul
Sursa/metoda
Caracteristici principale
Componeni
Impuriti: oxigen, hidrogen,
CB R
Ardere
Aria specific:
sulf.
Negru de
incompleta a
10-150 m2/g msurat prin
Oxigenul i hidrogenul sunt
fum de canal acetilenei
absoria de azot (metoda
covalent legai de carbonul
BET)
Diametrul: min20- max 300 de pe supraa particulei
Raportul O/H depinde de
nm. Distribuie aleatorie
condiiile arderii incomplete.
In cazul negrului de fum de
canal, coninutul de oxigen
Pigment-negru cu arie
Ardere
Pigment
este de 2-5% iar cel de
specific: 300-500 m2/g.
incomplet n
negru
hidrogen este de 0.5%;
furnal cu
CB- P
n negrul de fum de furnal
ciclonizare
(negru de
coninutul de oxigen este
fum de
dependent de debitul de
furnal)
alimentare a hidrocarburilor
NC-LP1
Precursori etilen, Structur trubostratic,
Hidrogen adsorbit pe
NC- CVD1
butadien
suprafa
NC- LP2
Acetilena cu
Structur trubostratic
Sulf i fluor sunt prezente n
sensibilizator SF6
cantiti apreciabile
NC-LP3
Benzene
Fragmente fullerenice n
Multiple structuri policantiti mici,
aromatice (PAH)
NC-CVD2
Benzene, toluene,

142

A. a)
a Sferule de CB
B-R, scala 100nm
m; b) model penntru CB,
distrribuie aleatoare a planelor grafeenice (BSU) n sfferula de
CB c) CB tratat termic
t
la 3000K
K, alinierea BS
SU- este
circu
umferenial d) dispunerea grrafenelor n CB
B e) CBpariial corodat n pllasm-deschiderrea canalelor cu formare
de nanopori
n
[11,14, 16]

B)
B) NC-LP1-precurs
N
pic a) scala 1000nm b) 10 nm c) Detalii
or etilen/acetilenre, structur turbostratic tip
morffologice d) HRT
TEM- contrast dee faz- se distingg grafenele dispuuse circumferenial

C) LP-NC3
L
din preccursor de benzen
n, structur cu ffullerene
multtistrat i mari can
niti de PAH
D) NC-CVD2,
N
din precursor
p
toluen
n, sferule de nannocarbon
multtistratificate
D)
Figu
ura 9.5-Structurri de nanocarboni utilizai la fo
formarea de medii bionanocom
mpozite (BNC) cu
c matrice
biologic pee baz de medii de cultur Chapm
man i AABTL

Mattricea biologiic:
Pentru miccroorganismeele Gram poziitiv, respectiv
v culturi de Sttaphylococcu
us aureus,
s-a ales un mediuu Chapman cuu adaos de m
manitol.
143

Pentru microorganismele Gram negativ, respectiv culturi de Escherichia coli, s-a


ales un mediu de cultur uzual AABTL.
Prepararea mediilor de cultur bionanocompozite
n vederea obinerii de colonii microbiene pe mediul de cultur, acesta se topete la
o temperatura de 900C, dup care se toarn pe o plac Petri 3ml de mediu de cultur. Pe
acesta plac ,dup ce mediul de cultur se solidific prin rcire, se nsmneaz folosind
o ans, tulpinile microbiene. Acesta este procedeul normal de nsmnare pe mediul de
cultur al coloniilor microbiene. Dispersia de nanocarboni n aceste medii este dificil
datorit diferenelor mari de densitate i proprietilor de autoaglomerare rapid, de
adsorbie pe suprafa de componeni nedorii ce conduce la atenuarea activitii acestora.
Din acest motiv metoda de preparare este laborioas i necesit o serie de etape
dup cum urmeaz:
1. Se dozeaz pulberea pentru concentraii de 0.01, 0,1 i 1% (grame nanocarbon la 100 grame mediu de cultur). Se usuc fiecare cantitate prin desicare sub vid de argon
2. Transferarea pulberii n 10ml ser fiziologic (cel mai bun rezultat se obine cu
serul fiziologic prepart din ap mili-Q, ultrapur,) ulrasonat sub vid pentru o
ct mai bun dezoxigenare.
3. Ultrasonarea eprubetei cu ser fiziologic i nanocarboni timp de 20 min la o
putere de minim 60W. Din observaiile experimentale se constat c cea mai
bun soluie este ca i ultrasonarea s se realizeze n condiii de vidarea sau
atmosfer inert.
4. Se toarn mediul topit pe plcile Petri aezate n baia de ultrasonare simultan
cu serul fiziologic ce conine nanocarboni cu agitare manual viguroas n
cmpul ultrasonor al bii. Operaia de agitare continu pn la punctul de gelifiere dup care se las la agitaie ultrasonic timp de 20-30 min pn la
solidificare complet.
Se recomand pentru studii i cercetri de mare acuratee ca serul fiziologic cu
nanocarboni s fie trecut prin etape de micro/nanofiltrare astfel nct s se selecteze fracii
de nanocarboni cu dimensiuni ntr-o plaj ct mai ngust.
Inspecia vizual i optic arat un mediu omogen fr particule aglomerate sau fenomene de coalescen. Funcie de natura experimentului se poate utiliza n locul serului
fiziologic elueni cum ar fi: alcoolul etilic, acetat de etil, toluen, cu precauiile necesare
asupra scopului experimentului i nivelului de sterilizare.
Pe aceste medii de cultur se fac nsmnri din culturi proaspete de o zi prin procedee normale care demonstreaz c fa de mediile normale pe bionanocompozite
acestea cresc ntr-un timp mult mai scurt i sunt mult mai viguroase.
Au fost efectuate experimente pe mai multe loturi de probe:
De la fiecare pacient recoltat s-au fcut nsmnri pe cele trei tipuri de
concentraii ale aceluiai tip bionanocompozit cu, 0,01%; 0,1%; 1%, coninut
de nanocarboni, i o nsmnare pe mediul de control, simplu.
144

S-au testat totodat tipurile de nanocarbon conform cu tabela 9.1 (nanocarboni din ardere incomplet, carbon turbostratic cu alchene i carbon
aromatic (benzen, toluen), care are un coninut ridicat de hidrocarburi poliaromatice i fragmente de fulerene.
n figura 9.6 sunt prezentate colonii de Staphylococcus aureus crescute pe mediul
de referin i pe bionanocompozite cu concentraii diferite.
Se observ c:
BNC cu CB-R ( negru defum de canal) i CB-P (negru de fum de furnal), nu
prezint nici o mbuntire important, coloniile sunt slab dezvoltate,
aleator dispersate, de dimensiuni mici. Pigmentogeneza lipsete sau este slab
reprezentat.( din tabela 9.1)
BNC cu NC-LP1 (nanocarbon din piroliz laser, precursori etilen):
La concentraia de 0,01% coloniile sunt bine dezvoltate similare
cu referina sau uor mai mari. Pigmentogeneza este normal.
La concentraia 0,1% creterea este exploziv cu pigmentogenez remarcabil.
Peste aceast concentraie, la 1%, creterea este slab reprezentat, atipic iar pigmentogeneza lipsete.
BNC cu NC-LP3 ( nanocarbon cu fragmente fullerenice i PAH-uri):
La concentraii de 0,01% se observ o cretere atipic de colonii.
La 0,1% creterea este remarcabil i pigmentogeneza bine reprezentat.
La 1% creterea un este evident, colonii slab reprezentate
Toate aceste observaii sunt sumarizate n tabela 9.2.
Tabela 9.2-Comparaie calitativ a virulenei n BNC
BNC
0.01%
0.1%
1%
CB-R
N. O
M
Ca in R
CB-P
N.O
M to WD
Ca in R
NC-LP1
WD
Pigmentare
Exploziv
atipic
NC-LP2
slab
Nu
nu
NC-LP3 &
Forme
W. D ,
neconclude
NC-CVD2
atipice
pigmentare
nt
atipica
N.O- diferene neobservabile M-evoluie moderat ;
WD-colonii bine dezvoltate, R-referina
Figura 9.6- Creterea de colonii de Staphyloccocus
aureus pe BNC cu diferite specii de nanocarboni i la
diferite concentraii

Pentru evaluarea eficinei acestor medii de cultur s-au efectuat experimente de


incubare la diferii timpi urmat de inspecia microscopic. S-a urmrit scurtarea timpului
de analiz bacteriologic i de identificare a speciilor de microorganisme. n figura 9.6 se
145

reprezint dependena dezvoltrii de colonii funcie de timpul de incubare pentru dou din
concentraiile de nanocarboni din BNC considerate optime.Se constat c diagnosticul
microbioogic poate fi redus de la 24-48 de ore la 4-8 ore Creterea accelerat a acestor
tipuri de microorganisme cu dezvoltare de colonii viguroase i pigmentogenez bine reprezentat este consecina interaciei acestora cu nanocarbonii din mediul de cultur bionanocompozit.
Microorganismele aerobe, precum Staphylococcus aureus au nevoie de oxigen pentru
dezvoltare iar nanocarbonul are o foarte mare afinitate de a adsorbi oxigenul din atmosfer i al concentra. Acesta este fenomenul principal ce st la baza relaiei nanocarbonmicroorganism. Nanocarbonul are funcia de a pompa oxigenul n mediul cultur prin
urmtorul mecanism: adsorbia preferenial a oxigenului din atmosfer i concentrarea n
jurul su. Mecanismul de transport implicat este diferena de concentraie i difuzia prin
microporii bionanocompozitului.
Din datele de analiz structural i spectroscopie FT-IR arat prezena de grupri OH
i carbonil legate covalent de suprafaa nannocarbonilor ce au proprieti de schimbtori
de ioni. Aceasta este benefic pentru microorganismele aerobe mari consumatoare de oxigen dar ar putea avea un impact major negativ atunci cnd vin n contact cu tegumentele
i pielea. Caracterul de nanoelectrolit al nanocarbonilor poate schimba pH-ul local al
filmelor hidrolipidice i aciditatea pielii favoriznd astfel atacul microorganismelor. Astfel se deschid multe canale pentru infecia microbian.
n concluzie se poate afirma:

BNCul conceput ca un gel cu nutrieni specifici i cu nanocarboni este un


bun mediu de cultur ce asigur o cretere accelerat a bacteriilor aerobe,
in particular genului Stafilococcus.

Nu orice nanocarbon este o bun pomp de oxigen prin urmare nu induce


creteri spectaculoase.

Concentraiile considerate optime sunt probabil i acelea ce se gsesc n


natur i care pot influena aderena microorganismelor pe tegumente
favoriznd astfel infecia primar.

Peste concentraia de 1% se poate considera c nano-carbonii pot fi


bacteriostatici sau bactericizi funcie de natura i structura lor.
Necesitatea unui raspuns mai rapid la investigare clinic bacteriologic cere funcionalizarea unui material avansat n mediul de cultur care s accelereze timpul de detecie al infeciei microbiene
Rezultate experimentale prezentate au artat c microorganismele n contact cu
nanoparticulele de compoziie i structur diferit au o comportare extrem de diferit n
ceea ce privete capacitatea de adaptare i dezvoltare. O deosebit importan trebuie acordat impactului nano-particulelor asupra evoluiei microorganimelor patogene i a
influenei acestora asupra diferitelor tipuri de boli de piele. Din acest motiv conceperea
unor structuri de bionanocompozite cu nanoparticule carbonice simple ar putea da cteva
rspunsuri extrem de importante pentru medicin i industria medicamentelor.
146

Rezultatele acestui studiu conduc la concluzia c se poate schimba sau mbunti


diagnosticul microbiologic n sensulscurtrii timpului de analiz i identificrii microorganismelor patogen.
Deasemeni se poate explica de ce stafilocociile cutanate sunt att de frecvente n
diagnosticul dermatologic, unele sunt greu de tratat i de ce frecvena lor este din ce n ce
mai mare

Figura 9.6-Rata de cretere la dou concentraii BNC001 i BNC01 raportate la referin funcie de timpul de
incubare. Sgeata indic momentul vizibil al creterii sub lupa microscopic [24]

9.3 Puncte cuantice

De la apariia apei pe pmnt, proprietile naturale de dizolvare- cristalizare a srii


sunt perpetue. n timpul cristalizrii o soluie suprasaturat trece prin stadiul de nucleaie,
dimensiunea cristalitelor fiind de domeniul nanometrilor.
Un exemplu concludent este cel al mrii Aral, care poate fi socotit un exemplu la
extrem prin dimensiunea producerii lui. De multe ori n istoria sa, volumul mrii Aral s-a
schimbat dramatic datorit variaiilor climatice. n ultimii 30 de ani reducerea mrii cu
60%, a condus la o concentrare a srii de 25%. n anumite momente din istoriia etapei de
nucleaie au aprut i sunt prezente tone de nanocristale de clorur de sodiu dispersate n
ap. Imaginile luate din staelit arat o reflexie atipic cnd acest fenomen are loc.
Din istoria evului mediu putem aminti sticla de geam frumos colorat a catedralelor, vitralii, ce conin particule de zinc, cadmiu, seleniu, sulf. Catedrala Notre Dame
din Strassbourg se mndreste i astzi cu frumoasele ei vitralii, i este foarte posibil ca
acestea s fie nanocristale ale compuilor, zinc-cadmiu-sulf-seleniu cu proprieti specifice de emisie sub aciunea spectrului superior a luminii naturale.
Relativ recent mecanica cuantic, a demonstrat c electronii liberi se pot confina
ntr-o groap de potenial iar particule cu dimensiuni nanometrice pot expulza electronii
spre periferie formnd un pseudoatom similar modelului lui Bohr cu un nucleu dintr-un
147

miez de ioni n jurul cruia graviteaz electronii genernd un spectru discret similar dar la
energii mult mai mici.
Termodinamica descompunerii fazei prin difuzie controlat a unei soluii suprasaturate a fost dezvoltat i experimentat pe aliaje metalice artnd c pot fi formate particule nanometrice stabile. Chimia colizilor a furnizat procedee de stabilizare fr nglobare n structuri micelare. Sintezele sol-gel de preparare de nanoparticule au devenit un
instrument uzual.
Istoric
1973 LEO ESAKI primete premiul nobel pentru dezvoltarea de structuri cuantice
semiconductoare, teoria confinrii unidimensionale.[29]
1980. EKIMOV i. EFROS, de la Institutul IOFFE, au observat formarea de puncte
cuantice n structura unei sticle coninnd Pb S.[30]
1983 LOUIS BRUS s-a ocupat de confinarea tridimensional de puncte cuantice
crescute in lichide organice.[31]
1984 TADASHI ITOH dezvolt teoria confinrii tridimensionale n punctele
cuantice crescute n volumul cristalelor de clorur de cupru i clorur de sodiu.
1997, profesor WARREN CHAN, de la Universitatea din Indiana a pus n eviden
o metod pentru vizualizarea unei singure proteine i a virusului n actiune. n acelai an a
fost posibil demonstrarea prezenei oligonucleotidelor legate de DNA, prin legarea lor
de punctele cuantice, un pas important n domeniul analizelor genetice.[32]. Ulterior
bioconjugatele coninnd puncte cuantice au artat un drum nou pentru studiile fundamentale n biologie.
AKERMAN si echipa sa au demonstrat n 2002, c polimeri ce au n componenta
lor puncte cuantice au fost folositi pentru diagnosticul cancerului la soareci.[33]. NIE i
GAO, 2002, Universitatea Emory- Giorgia Tech, au injectat polimeri cu puncte cuantice
la oareci urmrind procesul de carcinogenez i de metastazare.
2003, la Universitatea din Toronto, profesorul RED SARGENT i grupul su au
observat electroluminiscena n infrarou (1000-1600 nm) a nanocristalelor de sulfur de
plumb, imersate ntr-un polimer semiconductor. Aceste nanocristale sau materiale de polimeri hibrizi constituie platforma de plecare pentru electronica integrat, tehnologia
optic i cea a comunicatiilor.Toate aceste importante descoperiri ale electroluminiscentei
sau fluorescentei, bazate pe prezena punctelor cuantice are utilizri n biologie i
medicin, cu conditia s fie biocompatibile, netoxice. n acest sens pledeaz si experimentul efectuat n anul 2002, cnd s-a reusit ncorporarea de puncte cuantice in micele
de fosfolipide, rezultnd un polimer fluorescent.[34]
Puncte cuantice-nanocristale semiconductoare

Punctele cuantice sunt cristale semiconductoare nanometrice din clasa compuilor


binari II-VI, III-V sau III-VI.Nu sunt semiconductori tradiionali. Practic aceste tipuri de
materiale nu sunt noi i nici fenomenele fizice implicate- cum ar fi fluorescena dependent de dimensiune. Elemente clasice din fizic cum sunt structura de benzi, raza Bohr,
excitoni concur la fenomenul de fluorescen amplificat, dpendent de dimensiunea
nanocristalelor semiconductoare.
148

n figura 9.7 sunt prezentate elementele de baz a trecerii de la un semiconductor


normal cu dimensiuni macroscopice la un Q-dot i fenomenele implicate pentru a obine
fluoresen amplificat. Electronii n volumul unui material semiconductor cu dimensiuni
mult mai mai mari de 10 nm au larg spectru de nivele de energie . Fiecare electron ocup
un nivel energetic dat i este stabilit c numai doi electroni pot ocupa acest nivel ( principiul de excluziune a lui Pauli).
n volumul semiconductorului nivelele de energie sunt foarte apropiate astfel nct
poate fi considerat a fi un spectru energetic continu (figura 9.7c).Tot ce este ocupat i
contribuie la formarea legturilor chimice formeaz banda de valen Exist o limit superioar de energie pe care electronii o pot ocupa n banda de valen. Pentru a prsi
zona de valen i a deveni liberi s conduc un curent electric este necesar un supliment
de energie bine definit. Acest interval de energie se numete band interzis. Prin urmare
nivelele de energie situate sub banda interzis formeaz banda de valen iar nivelele
energetice de deasupra benzii interzise formeaz banda de conducie. Dac un stimul extern va furniza asupra electronilor din banda de valen suficient energie atunci el va
trece din banda de valen lsnd n banda de valen un gol pozitiv. Astfel se formeaz o
pereche electron-gol care se numete exciton.
Prin urmare exist un minim de energie a radiaie ce provine de la stimulul extern
pentru a produce generarea de perechi electron-gol. Banda interzis are un profil energetic bine stabilit prin compoziia i structura semiconductorului. Electronii care au tranzitat banda interzis n banda de conducie vor staiona un anumit timp dup care se vor
rentoarce n banda de valen starea lor natural. Revenirea n banda de valen se
realizeaz prin emisia unei radiaii electromagnetice cu o lungime de und bine precizat
egal cu energia pierdut datorit tranziiei. n general tranziia electronilor se realizeaz
de la marginea inferioar a benzii de conducie la marginea superioar a benzii de valen.
Pentru semiconductorii clasici aceste tranziii produc emisii cu o frecven fixat.
Punctele cuantice ofer o abilitate nenatural i anume de a-i acorda banda
interzis i de aici lungimea de und a radiaiei emise. Dac privim figura 9.7 e,f observm c perechea electron-gol este separat de o anumit distan. Ne putem imagina c
electronul prsind un atom din structura sa el va gravita pe o raz dat n cristal fiind
strict dependent de proprietile acestuia.
Distana dintre electron i ionul de unde a plecat se numete raza excitonului sau
mai simplu raza Bohr a excitonului, termen mprumutat de la modelul Bohr al atomului
de hidrogen.
Dac privim formarea benzilor de energie de la un semiconductor normal spre un
Q-dot observm imediat c atunci cnd dimensiunea acestuia este mai mic dect raza excitonului (Re) nivlele energetice devin discrete iar electronul este constrns s evolueze n
spaiul delimitat de nanocristal ( fenomen denumit confinare cuantic), figura 9.8
Fluorescena punctelor cuantice este net superioar oricror tipuri de colorni utilizai n tehnicile de biologie, microbiologie, pentru etichetarea i eantionarea materialelor biologice
149

Figura 9.7-Formarea unei perechi electron-gol (exciton) i


fenomenul de fluorescen amplificat.
a) Q-dot cu dimensiunea de ~30nmm miezul este un nanocristal
de CdSe iar nveliul de stabilizare este ZnS.
b) Nanocristal de PbSe (imagine TEM), se observ natura
cristalini dispunerea ordonat a atomilor de Pb (puncte
negre) i de Se
c) structura de benzi a unui semiconductor normal (electronii
ocup la temperaturi normale numai banda de valena.
d) sub aciunea unui stimul extern (radiaie e.m) electronul sare
n banda de conducie lsnd un gol
e) perechea elelctron-gol este un cuplu instabil ce evolueaz n
volumul cristalului ca o cuasiparticul- excitonul.
f) Recombinarea lor ( rentoarcerea electronului n banda de
valen) are loc cu emisia de radiaie cu o frecven bine
precizat.

150

Figura 9.8-Trecerea de la un cristal normal (a) la un nanocristal ( b) conduce la discretizarea nivelelor


benzilor de energie i dpendena largimii benzii interzise de dimensiune. Cnd raza excitonului, Re,
este mai mare ca RQ atunci absorbia radiaiei se realizeaz pe domenii largi iar emisia este extrem de
ngust proprorional cu dimensiunea Q-dotului

151

Aplicaiile punctelor cuantice

Microdomenii de celule maligne ( cancer protein microarrays)


Scopul este identificarea i localizarea zonelor microscopice de celulel maligne.
Cercetarea n domeniul biologiei celulare i a proteinelor este de a gasi noi proteine int.specifice unor produse farmaceutice i de biomarcheri n vederea managementului cancerului i a altor boli umane.
De exemplu ( Evident Technology i Protea Biosciences) se dezvolt o serie cupluri anticorpi-puncte cuantice pentru investigarea de serii de proteine canceroase. Prin
simple investigri de probe se pot identifica configuraii de proteine cu expresii difereniate dintr-o matrice de proteine. Mai mult microzone de esut din diferite tipuri de
cancere pot fi identificate cu anticorpi cuplai cu puncte cuantice fluorescente.
Absorbia celular de receptori mediai cu puncte cuantice
Utilizarea punctelor cuantice ca sonde intracelulare prezint un potenial imens
prin faptul c ele pot fi absorbite n celul Tipuri de puncte duantice solubile n ap
(WSQD) prezint avantajul c pot fi transferate n celul prin metoda receptorului mediat
prin conjugare la o protein de transfer.
Din figura 9.9 se bserv c funcionalizarea punctelor cuantice se realizeaz n general prin straturi lipidice (naturale sau sintetice) covalent legate de nveliul de ZnS prin
interemdiul atomilor de sulf. Structura acestor tipuri de puncte cuantice este format dintr-un miez de cristal nanometric de InGaP ce confer o bun toleran la toxicitate.

Figura 9.9 -WSQD cu functionalizare natural cu


lipide(tipul2) respectiv funcionalizare sintetic
(tipul 1.)

Figura 9.10- Imagistc cu WSQD n domeniul


NIR pentru identificarea tumorilor
( evidenttechnology.com)

Studiile au artat c toxicitatea punctelor cuantice cu miez de CdSe se datoreaz ionilor de Cd ce se elibereaz n celul. Fenomenul se datoreaz aciunii oxigenului ca rezultat al expunerii la UV timp ndelungat al punctelor cuantice.
Acoperirea cu ZnS creaz o suprafa mai benign la aceste fenomene. Desigur
punctele cuantice se pot acoperi cu polimeri ns n foarte multe cazuri aceti produc
moartea prematur a celulelor. Studiile de citotoxicitate au artat c sistemele InGaP/ZnS
sunt mult mai limitate n toxicitate [35, 36,37]
Un exemplu al cercetrilor actuale cu tipul 2 este prezentat n figura 9.10 unde
WSQD sunt utilizate n investigarea tumorilor prin tehnici de imagistic n domeniul NIR
152

( infrarou ndeprtat) unde esuturile sunt transparente iar tumorile pot fi puse n eviden
prin fluorescen direct.n figura 9.10 este prezentat un exemplu pe un oarece cu o
tumor cruia i s-a injectat 100 pmol de WSQD tipul 2 diluate n ser fiziologic . Se observ un contrast evident dintre localizarea tumorii i esuturile normale. Distribuia prin
sistemul limfatic, vezica urinar i ficat practic este inexistent. Investigarea prin imagistic optic n domeniul NIR combinat cu punctele cuantice poate produce un impact
major n detecia i diagnosticul i tratamentul cancerelor
Punctele cuantice un instrument versatil n tiintele vieii

Multiplexarea spectral. Qdoturile emit o radiaie caracteristic cu lungime de und fix


independent de sursa de excitare. Prin urmare Qdoturile pot fi combinate n acelai test
sau analiz i cu aceeai surs de excitare furniznd un semnal ce poate fi multiplexat. Aceasta permite utilizarea lor n matrici sau n sisteme cu rezoluie spaial
Qdoturile au artat c sunt foarte eficiente pentru transferul rezonant de electroni
(donori de electroni) spre fluoroforii organici datorit unei largi acoperiri dintre spectrele
de emisie i absorbie a coloranilor. Deoarece caracteristicile de emisie ale Qdoturilor pot
fi acordate continu este posibil de a crea un numr de donori prin transfer rezonant de energie,pentru orice tip de colorant organic care de obicei emit aproximativ ntre 510-640
nm
Microscopie i colorarea celulelor, imagistic in vivo
Qdoturile conjugate cu anticorpi au fost cu succes introduse n celule permeabilizate i folosite pentru colorarea citoskeletonului, centromerilor, cinetocorilor, organele
din broasc sau embrioane de nematode. Datorit fotostabilittii mari i proprietilor de
multiplexare a culorilor multiple componente celulare pot fi observate n dinamica lor
folosind microscopia confocal cu fluorescen. Deasemeni studiul metabolismului celular devine cu punctele cuantice uor de investigat ca de altfel orice tip de fenomen de
transport
Analize imunologice
Punctele cuantice conjugate cu anticorpi primari au fost folosite pentru colorri
preferniale a suprafeei E. Coli patogene i respectiv nepatogene. O excelent difereniere ntre cele dou specii poate fi realizat prin analiz de multiplexare a fluorescenei
cu diferite puncte cuantice.
Puncte cuantice fluorescente, imagistic de fluorescen, aplicaii n microbiologie,
parazitologie, hematologie

Se va enumera cteva din aplicaii ale punctelor cuantice bioconjugate solubile n


ap cu exemplificri acolo unde este posibil
Evidenierea activitii celulare prin indexare fluorescent:
Traficul molecular intra i extracelular
Urmrirea diferenerii celulelor stem
Monitorizarea instabilitii genetice
Localizri moleculare la nivel celular
153

Imagistic molecular
Detecia timpurie a bolilor i monitorizarea tratamentului
Modaliti multiple de imagistic non invaziv (PET, SPECT, MRI, UV-Viz,
ageni de contrast optic)
Selecii i sortri de nalt performan a materialelor biologice
Microarii (proteomic, genomic)
Coduri de bare
Citometrie reologic
Msurarea multipl i simultan a parametrilor celulari (coninutul de acizi
nucleici, activitatea enzimatic, fluxul de calciu, potenialul membranei, pH)
Sortarea celular (separarea celulelor sau a sub compo-nentelor acestora)
Fluorescen rezonant cu transfer de energie (FRET)
Identificarea interaciei dintre dou sau mai multe molecule
nlocuirea fluoroforilor clasici i extinderea domeniului de fluorescena cu
surse de excitaie minime
Se constat c punctele cuantice deschid o nou etap ntehnicile de analiz i investigare datorit fotostabiltii mult mai mari fa de fluoroforii clasici cu fluorescen
ndelungat permind astfel s se investighezemecanisme moleculare i s elimine contaminrile spectrale ce necesit metode de corecii suplimentare. Montajul de figura 9.11
descrie eficiena noilor materiale ca instrumente de investigare a materiei vii.
Figura 9.11. Metod de investigare a sturcturilor
organismelor vii prin metoda microscopiei de
fluorescn confocale cu fibr optic. Fibra optic este
format dintr-un set de microfibre din care una este de
excitaie. Unitatea laser de scanare conine
microscopul confocal, optica de mrire i detectorul
CCD de prelucrare imagin ( 20-50 cadre/sec).Dioda
laser cu =488nm poate excita toat gama de puncte
cuantice dar i fluoroflori clasici (Syto13, Yoyo1,
FITC, CellTracker Green, Calcein, Rhodamine, 123 or
6G, Cy3,). Sunt prezentate trei aplicaii: acces extern,
endoscopic i invaziv minimal ( cu permisiunea
Cellvizio tech)

n figura 9.12 sunt prezentate cteva cazuri de investigare cu Qdot funcionalizate a


materialelor biologice la nivel celular respectiv molecular.
154

Explorarea
transformrii
liniilor celulare mamliene
cu Q-dots
Carcinom de colon- liniile
HT29 i SW 1222
(detalii,evitenttechnology.c
om)

Figura 9.12 a. Celule neoplazice etichetate cu Qdot conjugate. Marcherul cancerului de plmni, Her2, s-a
detectat pe celule cu o combinaie de Herceptin biotinilat
Cercetri n neurotiine
*Imagistic n adncimea
creierului
*Neurogenez
Postnatal
*Boli neuro-degenerative
Celule stem & terapie
regenerativ
*Reparaii neuronale
Figura 912b Explorri neuronale, investigri cu puncte cuantice funcionalizate
Cercetarea cancerului
Observaii histologice in
vivo
Angiogeneza tumorilor
Imunoterapie
Caracterizare criptfoci
Cancere colorectale

Figura 9.12 c-Explorri histopatologice


Cercetri microvasculare
Arhitecturi microvasculare
Angiogeneza
Hemodinamica
Interacia leucociteendotelium, inflamaii
Permeabilitatea vaselor
Densitatea capilarelor

Microvascularizare a mesenterului
Leucocite
Figura 9.12.d- Explorri sanguine

155

Expresia genelor, cercetri preclinice


detecia drogurilor n ficat
*Distribuia medicamentelor
*Monitorizarea Apoptozei
*Toxicitatea celular
Rezultate puse la dispoziie prin amabilitatea firmei Evident
technology

Figura 9.12-e Exemple de aplicii ale punctelor cuantice n medicin i biologie, explorri genetice

Protocoale eleborate pentru investigarea i identificare unor clase de microorganisme

Materiale
Punctele cuantice utilizate n experimente au fost achiziionate de la Evident
technology, SUA. Protocoalele de funcionalizare s-au derulat sub asistena firmei care a

furnizat materialele i substanele necesare.


Protocoale de funcionalizare puncte cuantice
Principiul functionalizarii
Funcionalizarea punctelor cuantice prin conjugare cu proteine, oligonucleotide i
alte molecule de interes poate fi relativ uor realizat prin protocoale de complexitate medie. Reaciile care au loc sunt urmtoarele:
Protocol 1- Legarea chimic a streptavidinei la punct cuantic tip Evitag
( firma Evident Technology) funcionalizat cu grupri carboxilice
Materiale : (sursa Evident technology)
1. Puncte cuantice CdSe/ZnS funcionalizate cu grupri carboxilice ( EVITAGAndirlock, emisie 540 nm, excitaie sub 450 nm (de la albastru spre UV),
0.25mg/ml
2. Microfiltre pentru separare prin centrifugare- Pall Nanosep tip 100k 300kMWCO
3. Soluie EDC [(1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl 200
mg/ml- livrat cu punctele cuantice
4. Sulfo-NHS (N-hydrocylsulfo-succinimide)- 0.15mg/ml, ap DI
156

5. 10x: (1.37M NaCl; 27mM KCl; 101.4mM Na2HPO4; 17.6mM K2HPO4)


pH 7.4, soluie tampon conform cu specificaiile productorului EVITAG
notat PBS i preparat n laborator
6. Ap steril
7. Streptavidin (5mg/ml)
Metoda- filtrare prin centrifugare, legare chimic ultracentrifugare
Echipamente- centrifug laborator, lamp UV, siringi microlitrice, fiole de stocare
A) activare carboxi-EVITAG prin combinare a urmtorilor reactivi, incubare la temperatura camerei 1h, agitare manual :
50l- ap steril
40l 10x PBS
200l EviTags (0.25mg/ml)
10l EDC (200mg/ml)
100l sulfo-NHS (0.15mg/ml)
Cantitatea excesiv de sulfo-NHS este eliminat prin colectarea soluie dup limpezire, expunere la UV, observarea prii fluorescente a soluiei.
B) Desalinizare centrifugal
Asamblare filtru umectat n PBS n fiola de centrifugare
ncrcare filtru cu soluia de la punctul A, centrifugare min 6000 rpm
minim15 min pn <10% din soluie rmne deasupra filtrului
adugare 500 l la soluia colectat i 1xPBS, filtrare normal pe hrtie milipor dac este cazul
Verificare fluorescentcu expunere la UV.
Soluia se pstreaz n condiii normale
C) Conjugare: prin adugarea proteinei de interes ( 100l Streptavidin, 5mg/ml)
Un raport de 10:1 streptavidin la EviTag, raportul utilizat fiind mg/mg
Incubarea soluiei activate i desalinizate de la punctele A i B cu streptavidin la
temperatura camerei, agitare liber. Soluia cu EVITAG streptavidin se poate realiza
dup 2 ore. Stabilitatea este 6 luni.
Protocolul 1 este adaptat dup specificaiile firmei Evident technology i corectat
cu referina [38]
Protocol 2
Materiale
1.
2.
3.
4.
5.

Soluie tampon fosfat de sodiu, , 0.5M, pH 6.0


Soluie tampon , borat de sodiu , 0.5M, pH 8.3
Streptavidin, 10mg/ml n ap distilat
EviTags, 2nmol/ml n ap distilat
EDC
157

6. sulfo-NHS
Echipamente
Ultracentrifug
Lamp UV
Baie ultrasonic
A) Activare carboxi-EVITAG prin combinare a urmtorilor reactivi, incubare la
temperatura camerei 30h, agitare manual
2ml EviTag
0.4ml fodfat de sodiu
20mg EDC
15mg sulfo-NHS
B) Desalinizare mixtura de reacie prin ultracentrifugare ( max 140000 g), 40 min
C) Aspirare ( prelevare) supernatant cu verificare fluorescen
D) Conjugare .
0.5ml streptavidin, 10mg/ml)
1.5ml ap distilat
0.4ml sodium borate buffer
E) Incubare RT n baie ultrasonic pn cnd precipitatul se dizolv
F) Agitare fiol timp de 2h
G) Stocare 12 h n fiol nchis
H) Centrifugare la 40000 rpm min 80 min
I) Recuperare supernatant n fiol cu 5ml ap
J) Se repet paii H-I dac controlul fluorescenei nu este corect sau prezint turbiditate
peste noapte
K) Pstrare: 40C la ntuneric
Acest protocol este n general satisfctor pentru analize curente de microscopie de
fluorescen pentru investigri uzuale i n parazitologie [39, 40]
Protocol 3
Cuplare oligonucleotide sulfhidril modificate la puncte cuantice EviTags funcionalizate
cu grupri aminice
A) activare amin-EviTags cu sulfo-SMCC
Combinare 1:1 molar echivalent de sulfo-SMCC i amin EviTag n 50mM
de soluie tampon de fosfat de sodiu pH 7,4 ( PBS , pH7 este deasemeni
recomandat)
Incubare 60 minutes la RT ( temperatura camerei)
Eliminarea excesului de reticulator cu coloan de desalinizare echilibrat cu
soluie tampon de conjugare (1mM EDTA, 0.1M fosfat, 0.15MNaCl, pH 7.2;
pentru preparare se adaug 20l de 0.5M EDTA la 10ml de PBS pentru
158

fiecare 10 ml soluie tampon de conjugare necesar). Coloana de desalinizare


PD-10, Amershan Nr 170851-01 sau D-Salt-dextran column, Sigma Aldrich
Fracia de EviTag este identificat prin controlul fluorescenei. n caz de
diluie mare atunci se filtreaz cu filtru 100kD MWCO
B) Cuplare EviTags maleimid activate la gruprile sulhidril
Mixare oligonucleotide sulfhidril modificate ( sursa EvidentTechnology) cu
EviTag maleimid activate n conjugare cu soluia tampon
Incubare 4 ore la 40C
Materiale ( sursa Evident Technology)
1x PBS
10x PBS
Oligonucleotide. 0.1mM (5 sulfhydryl modifi ed oligo)
BMPA, 200mM (N--Maleimidopropiovnic acid)
Omega Nanosep Column 3000 MWCO
H2O
Amine EviTags (0.25mg/ml)
EDC, 100mg/ml
Tris, 1M, pH 7.4
Omega Nanosep 3,000 and 100,000 MWCO spin fi lters
Etape:
A) Activare oligonucleotide prin combinare reactivi i incubare 2 h, RT
450 l 1x PBS
25 l 5 sulfhydryl-modifi ed oligonucleotide (0.1mM)
25 l BMPA (200mM)
B) Purificare oligonucleotide activate
Filtrare prin centrifugare cu filtre de centrifugare (Omega Nanosep 3000 MWCO
spin fi lter); 15 min la 5000g pentru nlturarea excesului de BMPA.
Volumul reinut este aprox 140 l la care se adaug 1xPBS i aducere la 140 l
C) Conjugare EviTag la oligonulcelotide activate
Incubare 2h la RT
70l purifi ed BMPA-oligo
270l H2O
50l 10x PBS
100l amine-EviTags
10l EDC (100mg/ml)
La final se adug 500l 1M Tris pH 7.4.
Utiliznd microscopul optic cu camer video, programul MATLAB cu modulul
Image Processing au fost puse n eviden diferite aspecte din laboratorul clinic. De
159

remarcat c lucrnd cu puncte cuantice solubile n ap funcionalizate cu strptavidin


(WSQD) s-au pus n eviden culturi de E. Coli pe BNC cu concentraii diferite descrise
anterior, Stafilococ aureus pe BNC pe concentraii diferite, identificri rapide de parazii
intestinali ( Enterobius, Giardia, i respectiv investigri de anemii de tip hipocrom )

BNC cu 0,1 % i 0,05% nanocarbon, E. Coli


Matricea biologic de baz, mediul de cultur
AABTL

BNC cu 0,1% NC, cultur Stafilococ aureus. Matricea


biologic de baz, mediul Chapman

Identificarea cu WSQD de Enterobius n examenul

Enterobius, detaliu de fluorescen

160

coproparazitologic direct

Examen coproparazitologic direct, identificare


Giardia cu WSQD

Identificarea anemiilor de tip hipocrom

Tehnica implementat cu WSQD elimin foarte multe din inconvenientele unor


biosenzori de fluorescen ele nsele fiind biosenzori fluoresceni individuali. Au proprieti de stereospaialitate prin funcionalizarea lor cu biomolecule de bioafiniti diferite. nlocuiesc tehnicile clasice de colorare, interferenele dintre lumina de excitaie. Se
constat c WSQD sunt un instrument extrem de eficient n analizele medicale. Combinarea BNC cu WSQD imbuntete substanial tehnicile punnd n eviden numai
printr-o simpl inspecie microscopic diferenieri clare ale microorganismelor de tip parazitar. Este o tehnic eficient care se aplic paraziilor cutanai Demodex, scabiae ( care
sunt de mare risc i nc nu se pot preparate permanentizate). Instrument de difereniere a
tipurilor de anemii [41]

161

9.4 Referine

1 Frenot A., Chronakis I.S. Current Opinion in Colloid and Interface Science; 8: 6475.
(2003)
2 Bognitzki M., Czado W., Frese T., et al. Adv Mater,13,70. (2001)
3 Ko F., Gogotsi Y., Ali A., et al.,Adv Mater; 15,1161-5 (2003)
4 Kenawy E.R., Bowlin G.L., Mansfield K., et al. J Contr. Release; 81:5764. (2002)
5 Boland E.D., Wnek G.E., Simpson D.G., Pawlowski K.J., Bowlin G.L. J Macromol Sci,
38:123143.(2001)
6 Matthews J.A., Wnek G.E., Simpson D.G., Bowlin G.L. Biomacromolecules; 3, 2328.
(2002)
7 Tepper F., Lerner M., Ginley D.American Ceramic Society Bulletin, 80, 57-60. (2001)
8 Hartgerink,J.D., Beniash E., Stupp S.I, PNAS; 99, 51338 (2002).
9 Prum R.O., Torres R.H., Williamson S., Dyck J. Nature, 396, 289. (1998)
10. Shawkey M.D., Estes A.M., Siefferman L.M., Hill G.E. Proc Roy Soc, Ser B; 270,
1455-60. (2003)
11 Doolittle R.F. Fibrinogen and fibrin. Ann Rev Biochem; 53, 195-229. (1984)
12. Henschen A. Thromb Res;Suppl 5, 27-39(1983)
13 Doolittle R.F., Blomback M., Henschen A., et al. Nature; 218, 130-4. (1968)
14 Kudryk B., Reuterby J., Blomback B. Thromb Res; 2, 297-303,(1973)
15 a.Boland E. D., Wnek G. E., Simpson D. G., Pawlowski K. J., Bowlin G. L., J.
Macromol.Sci.,38, 1231-43.(2001)
b.Bognitzki M, Hou H., Ishaque M.,et al. Adv Mater; 12: 637-40. (2000)
c.Hartgerink, J. D., Beniash E., Stupp S. I., PNAS; 99, 5133-8. (2002)
d.Matthews J. A., Wnek G. E., Simpson D. G., Bowlin G. L. Biomacromolecules;
43:4403-12. (2002)
16 D. B. Warheit, Materials today, 32-36 (2004)
17 P.H.M.Hoet, I. Bruske-Hohlfeld, O. Salata, J. of Nanobiotechnology,2:12, (2004)
18 A.M. Glauert, M.J. Thorley, Annu. Rev. Microbiol, 23, 159-198, (1969)
19 Microsoft Encarta Encyclopedia 2002
20 Balbaie V., Posogy N. editori, Epidemiologie medicala, vol II, Ed Medical, Bucureti, (1985)
21 J. Riviera-Utrilla, I. Bautista-Toledo, M.A. Ferro-Garcia, C. Moreno-Castilla, Carbon,
41, 323-329 (2003)
22 H. Le Pape, F. Solano-Serena, P. Contini, C. Devillers, A. Maftah, P. Leprat, Carbon,
40, (2002), 2497-2954
23 M.A. Montez-Moran, D. Suarez, J.A. Menendez, E. Fuente, Carbon, 42, (2002),
24 Stamatin Luminita, Stamatin I., Nanobiocomposites based on nanocarbon for cell culture media, in Nanoengineered Nanofibrous Materials, Ed. Y. Gogotsi, S. Kacac,
Kluwer, pp289-298 (2004)
162

25 Goeringer S., Tacconi N.R., Chenthamarakshan C.R., Rajeshwar K., Wampler W.A.,
Carbon, 39, 512-522, (2001)
26 F.Rodriguez-Reinoso, Carbon, 36, 159-175,(1998)
27 Habe H., Omori T., Biosci, Biotechnol, Biochem., 67, 225-43, (2003)
28 I. Alfheim, A. Lindskog, Sci. Total Environ, 15, 203-22 (1984)
29 http://nobelprize.org
30 Golubkov V, Ekimov A., Onushenko A., Tzehomskii V., Sov. Phys.and Chem.of
glass, 6, 511, (1980 )
31 Rosseti R., Nakahara S., Brus L., J.of Chem Phys, 79,1086, (1983)
32 C. B. Murray, C. R. Kagan, M. G. Bawendi,Annual Review of Materials Science, 30,
545-610, (2000)
33 kerman Maria E., Warren C. W. Chan, Pirjo Laakkonen, Sangeeta N. Bhatia, Erkki
Ruoslahti , PNAS, 99, 20-27 (2002
34 Zhang Q, et all, PNAS, 104, 17843-8.(2007)
35 Christian Kirchner, Tim Liedl, Stefan Kudera, Nano Letters, 5, 2, 331-338, (2005)
36 Austin M. Derfus, Warren C. W. Chan, et al Nano Letters,4, 1, 11-18 (2004)
37 Florescu L. Gavrila, Fleaca C., Voicu I., Morjan I., Stamatin L., Stamatin Ioan, Appl
Surf Sci. 253,19, 7729-7732, (2007)
38 Grabarek Gergely Anal. Biochem. 15;185,131-5 (1990)
39 G.T Hermanson,. Bioconjugate Techniques, Academic Press, New York; pp226,
(1996).
40 Baoquan Sun, et al., Journal of Immunological Methods 249 85-89. (2001)
41 Luminita Stamatin, Cercetri asupra structurilor de biosenzori implicai n diagnosticarea i monitorizarea bolilor parazitare ale pielii, Tez doctorat, 2006, coord
T. esan

163

164

10 Nanotuburi de carbon
Nanotuburile de Carbon (CNT-carbon nanotubes) i microscopia de fore atomice
pot fi considerate promotorii nanotehnologiei. CNT-urile au entuziasmat lumea tiinific
prin proprietile lor remarcabile electronice, mecanice i termice. Posibilitatea funcionalizrii lor a deschis calea spre noi funcii specifice conexiunea spre nanobiotehnologie
i a materialelor avansate, econanotehnologie. CNT-urile au un potenial ridicat pentru
aplicaiile posibile n ramura energiei, a electronicii, IT-ului. Totui, datorit insolubilitii nanotuburilor n solveni, chimici, biochimici i biologici, folosirea acestor
materiale a fost mai degrab limitat. CNT-urile solubile n ap i solveni organici reprezint un interes din moment ce pot deschide noi abordri n dezvoltarea de nanocompozite, nanosenzori, electronic molecular.

10.1 Istoric
Descoperirea lor este legat de cea a fullerenelor, forme alotropice ale carbonului,
molecule compuse din carbon n forma unor sfere, elipsoid sau de tuburi. Fullerenele
sferice se numesc buckyball i acelea cilindrice se numesc buckytub sau simplu
nanotuburi de carbon (CNT). Fiecare dintre ele poate fi considerat ca un mod de
organizare spaial a grafenelor (planele bazale din grafit). Fullerenele au fost descoperite
de n 1985 de Curl, Kroto i Smalley la Universitatea Sussex, UK i Rice University
(Houston, Texas) iar denumirea lor provine de la arhitectul Richard Buckminster Fuller
care a construit un dom cu acest tip de geometrie [1]. n 1996 cei trei chimiti primesc
premiul Nobel pentru aceast descoperire. Aceast familie era diferit de cea a grafitului
i diamantului, C60 este o molecul format din 60 de atomi de carbon.Totul a nceput de
fapt cnd experimentele lui Kroto au fost fcute cu ajutorul unui instrument realizat de
Smalley ce studia clusterii moleculari. Kroto era interesat de tehnica lui Smalley, aceea a
vaporizrii laser, pentru a verifica o teorie despre existena lanurilor lungi de carbon din
spaiul interstellar. Kroto s-a gndit c stelele roii gigante bogate n carbon produc forme
complexe ale carbonului pe care radioastronomia putea s le detecteze. Acest grup de cercetare a ncercat s identifice structura chimic a acestei noi familii folosind un spectrometru de mas. Smalley a alturat mai multe poligoane lipindu-le cu o band izolatoare
obinnd structura perfect simetrica a C60. Aceast nou molecula de carbon (C60) a primit numele de buckyball. n timp ce grafitul conine atomi de carbon sub forma plane
grafenice suprapuse, buckyballs sunt similare unor cuti sferice ce au legturile carbon-carbon foarte puternice cu acelai tip de hibridizare ca n planele grafenice.
n 1991, au fost descoperite nanotuburi de carbon n funinginea depus pe un catod
de carbon a unui arc voltaic. Acestea au fost descoperite de Sumio Iijima n laboartoarele
de cercetare fundamental a firmei NEC din Tsukuba, Japonia. Micrografiile observate cu
165

un microscope electronic de nalt rezoluie au artat c nanotuburile de carbon multistrat


(MWNT) ale lui Iijima erau nrudite cu fullerenele. Dei MWNT sunt nrudite cu fullerenele, ele nu sunt molecular perfecte [2]. n 1993, s-au descoperit simultan nanotuburile
cu carbon unistrat (SWNT) de ctre Iijima i Toshinari Ichihashi de la NEC [3] i Donald
S. Bethune et col [4]de la IBM Almaden Research Center din San Jose, California. Cele
dou grupuri au descris rolul de catalizator pentru fier, nichel sau cobalt, introduse n
anodul arcului voltaic din reactorul de sintez pentru nanotuburi i C60.
Rezultatul a fost o funingine pe pereii camerei iar microscopia de transmisie electronic (TEM) a pus n eviden c funinginea era alcatuit din mai multe SWNT ce
aveau o distribuie variat a diametrelor. Funinginea nu coninea nici un MWNT. n
prezent sunt dezvoltate o serie de metode de sintez pentru fullerene (ablaie laser) respectiv pentru nanotuburi ( ablaie laser, CVD, CTR-chemical transport reaction) unde se
folosesc descompunerile termice ale gazelor (metan, acetilen, etilen) n prezena catalizatorilor nanometrici din grupa fierului [5, 6, 7, 8].
Structurile tipice a celor trei tipuri de carbon C60, SWNT, MWNT sunt prezentate
n figura 10.1

Figura 10.1-Fullerene C60 i C70, nanotuburi multiperei (MWNT), nanotuburi uniperete


(SWNT) forma scaun (armchair) respectiv zigzag rezultai din roluirea i inchiderea planelor
grafenice pe cele dou axe de simetrie. Formele chiralice depind de axa de roluire. SWNT zigzag
au unele din legturi C-C paralele cu generatoarea i au un caracter de semimetal iar SWNT
scaun are lgturi C-C perpendiculare pe generatoarea cilindrului cu comportare de semiconductor.
Formele chirale au o ax de chiralitate similar cu ADN.

n tabela 10.1 sunt prezentate cele mai importante din realizrile tiinifice cu nanotuburi de carbon
166

Tabela 10.1- Cronologia dezvoltrii nanotuburilor


Anul
Evenimentul
Referine
1993
Sinteza SWCNT
[3,4]
1997
SWCNT forma metalic
[9]
Studii spectroscopice, corelaii dintre structura atomic i [10 , 11]
1998
electronic
1998
FET cu SWCNT forma semiconductoare
[12]
1998
SWCNT solubili via modificri chimice
[13]
2000
Senzor chimic cu SWCNT individuali
[14]
2000
Spectru Raman pe SWCNT singular
[15]
2000
Transport balistic n SWCNT
[16, 17]
2001
Operaii logice cu sdispozitive pe baz de SWCNT
[18,19]
2001
Tranzistor cu SWCNT
[20]
2002
Separarea complet n soluie din mnunchiuri cu SWCNT [21]
2004
Electroluminiscena SWCNT
[22]
2004
Spectroscopia modurilor fononice cu rezoluie atomic
[23]

n prezent se cerceteaz descoperirea de noi forme ale carbonului, fizico-chimia fullerenelor, producerea de cantiti industriale de CNT, metode de purificare, solubilizare,
funcionalizare, separare dup natura metalic sau semiconductoare, definirea cu exactitate a proprietilor.
Nanotuburile pot avea proprieti metalice comparabile sau mai bune dect ale cuprului sau pot fi semiconductori, ca siliciul n tranzistori, totul depinznd de structura lor.
Pot conduce de asemenea cldura similar diamantului, i din moment ce este carbon, chimitii pot crea legturi ntre atomii de carbon a fullerenelor i nanotuburilor cu
ali atomi sau molecule. Aceast abilitate de a lega sau ataa alte molecule sau atomi de
nanotuburi sau/i buckyballs le fac s fie un nou nanomaterial ce se poate folosi n sistemele biologice sau s fie legate n materialele compozite.
Teoretic s-a calculat c din nanotuburi se vor face cele mai puternice fibre vreodat
( aproximativ de 100 de ori mai puternice ca oelul), cu doar 1/6 din greutatea lor. Se poate afirma c nanotuburile i buckyball-urile sunt cele mai interesante materiale descoperite n ultimele decade. De notat c din procesele de sintez rezult ntotdeauna mnunchiuri de NT terminate cu jumti de fullerene.

10.2 Structur, proprieti


Structura geometric

Structura geometric din care provine un nanotub este rezultatul nchiderii unui
care este o combinaie liplan grafenic dup o ax chiral definit de un vector chiral
niar a vectorilor celulei unitare a planului grafenic (figura 10.2):
, , unde n i m sunt ntregi (nm) [7]. Vectorul chiral poate fi privit ca vectorul ce
conecteaz dou puncte identice din cadrul planului grafenic definind direcia de roluire.
Unghiul chiral , a nanotubului este definit ca unghiul dintre vectorul reelei, , i
vectorul chiral, , fiind dat de
arctan 3 /
2 . Numai tuburile zigzag i
167

armchair sunt caracterizate prin


, 0 respectiv
, . Ele au simetrie axial
corespunznd grupului punctual de simetrie Dnd (n, impar) sau Dnh (n, par). Toate celelalte
nanotuburi (n,m) prezint simetrie spiral i sunt chirale.

Figura 10.2-Construcia unui nanotub cu vectorul chiral


=(4,2) dintr-un plan grafenic. Vectorul de
translaie =(4,-5) este obinut prin prelungirea direct din punctul O normal pe
pn trece prin punctul
identZic de pe reea.Vectorul de translaie, i vectorul chiral, formeaz dreptunghiul OABB` care este
celula unitar a tubului cilindric desfurat. a) SWNT armchair, b) zigzag, c) chiral

Datorit simetriei C6 a reelei hexagonale unghiul 300 Atunci SWNT cu =300


este cunoscut ca armchair (a, din figura 10.2) iar cel =00 este cunoscut ca zigzag (b).
Pentru celelalte unghiuri ne vom referi la nanotuburi chirale (c, figura 10.2). Din
teoria benzilor de energie, metoda electronilor strns legai (tight binding, TB), formele
metalice de SWNT se obin pentru condiia ca (n-m) s fie un multiplu de 3 altfel este un
semiconductor. Este interesant c pentru fiecare nanotub cu o chiralitate dat exist doi
enantiomeri.
Diametrul dt a unui nanotub este legat de indicele de chiralitate prin ecuaia:
, unde a este constanta reelei hexagonale (a planului grafenic)
.=2.46 . Vectorii de
fiind legat de lungimea legturii a C-C=1.42, prin
3
adic:
translaie pentru celula unitar a tubului sunt definii de componentele lui
,
unde dR este cel mai mare divizor comun dintre 2n+m i 2m+n.
Numrul de atomi per celula unitar a unui (n,m)-tub este dublul numrului de hexagoane (N) din ea:

Din procesele de sintez toate nanotuburile au capetele nchise terminate cu hemisfere de fullerene. n cazul nanotubului (5,5) i (9,0) tuburile se nchid cu hemisfere de
C60, n timp ce nanotuburile mai mari n diametre se nchid dup regula pentagonului
izolat: un numr optim de hexagoane la fiecare pentagon din fulleren. n general exist
ase pentagoane izolate pentru fiecare set de hexagoane n aa fel nct s se minimizeze
deformrile geometrice [24]
168

Rute de sintez

Diametrul mediu pentru SWCNT depinde de ruta de sintez prin care este produs.
n tabela 10.2 sunt prezentate cele mai curente metode.
Tabela 10.2- Diametrele SWCNT funcie de metoda de sintez
Metoda de sintez
Diametrul mediu, nm
(variana, )
Evaporare laser pulsat
~1.3 0.1
(PLV)
Descrcare n arc electric
~1.4
Metoda HiPCO,
~1.0 0.2
descompunere n faz
gazoas la presiune nalt
CVD- catalitic pe suport
~1.0 0.1
solid (CTR-CVD)
~1.4 0.2
~0.8

Referine
[25,26]
[27]
[26, 28]
[29]
[30]
[31]

Cel mai subire nanotub raportat n literatur a avut diametrul de aprox 0.3 nm cu
toate c acestea pot fi observate n cadrul MWNT [32]. Aceste tuburi s-au atribuit la (2,2)
armchair coninnd dou jumti de C12 capete terminale. n toate metodele de sintez
nanotuburile se formeaz sub form de mnunchiuri datorit tendinei lor pronunate de
aderen. Numrul de tuburi din mnunchi este variabil atingnd ca ordin de mrime 100
per mnunchi. mpachetarea lor n mnunchi este trigonal iar energia de coeziune atinge
0.2-0.3 eV/ [33 a,b]. Metodele CVD catalitice permit creterea individual de nanotuburi cu diametre controlate de diametrul i natura catalizatorului respectiv a substratului
de cretere. De notat cteva din inconvenientele metodelor de sintez: 1. Producerea de
nanotuburi nu controleaz chiralitatea; 2. ntotdeauna nanotuburile sunt nchise la capete
i necesit prelucrri i tratamente chimice pentru deschiderea lor.

10.3 Funcionalizare
n aceast seciune se prezint o scurt sintez referitoare la: purificare chimic i
oxidativ; dizolvarea CNT n ap i n solveni organici prin modificri chimice i fizice
precum i a aplicaiilor lor din domeniul chimic i biologic; separarea SWNT metalice i
a SWNT semiconductoare.
10.3.1 Purificarea nanotuburilor

Toate metodele de purificare ale nanotuburilor se bazeaz pe unul sau mai muli
pai: oxidarea cu gaz sau cu vapori, oxidarea chimic, centrifugarea sau filtrarea (incluznd metode cromatografice).
Oxidarea chimic are loc n acid nitric diluat (2.6 M) n reflux pentru a elimina
carbonul amorf sau alte impuriti, catalizatorii. Pentru cantiti mici de material acidul
poate fi ndeprtat prin filtrare sub vid urmat de splarea cu o baz diluat (solubilizarea
catalizatorilor prin trecerea n sruri i a carbonului amorf n acid carboxilic). Pentru
169

cantiti mai mari de material (grame) se nlocuiete filtrarea cu decantarea i oxidarea


chimic repetat, urmat de centrifugare i colectare de supernatant. Adugarea de surfactani n procesele intermediare de purificare este benefic, extracia lor fiind realizat
n etapele finale prin splare cu ap DI i metanol.
MWNT se purific simplu prin oxidare n aer la temperatur nalt ce nu poate fi
aplicat la SWNT deoarece metalul cataliztor poate iniia distrugerea lui. Etapele de oxidare pentru MWNT sunt: 200-2300C, oxidarea materialelor carbonice amorfe (oxidare cu
oxigen 20% umidificat i atmosfer de argon). n urmtoarea etap este tratamentul cu
HCl pentru eliminarea metalelor i a oxizilor metalici prin trecerea lor n sruri solubile.
Dup splare i uscare ciclul se reia la temperaturi de 3000C respectiv 4000C.
10.3.2 Evaluarea puritii CNT

Rezidurile de metal poate fi realizat prin analiza termogravimetric (TGA). Prin


arderea n aer a mostrei SWNT la 10000C, se elimin materialul carbonic iar impuritile
prezente n mostra original sunt transformate n oxizi. Puritatea materialului carbonic se
estimeaz prin metode spectrometrice, TEM, SEM (caracterizare local). Pentru a obine
o msurare standard a puritii, este necesar s fie identificat caracteristica care s fac
diferena dintre SWNT i alte forme de carbon care sunt adesea prezeni n mostrele
SWNT. Aceast tehnic se bazeaz pe spectroscopia NIR a dispersiilor de SWNT fiind
comparate cu probe standard de nanotuburi obinute n arc electric.
Figura 10.3 arat o ilustraie schematic a spectrului electronic al unei mostre tipice
de SWNT produse n arc electric. Tranziiile interband n SWNT ncep la o energie foarte mic i sunt vizibile la aproximativ 3 eV. Absorbia -plasmonic n SWNT i impurittile carbonice se extinde peste toat regiunea spectral cu benzi pn la ~5 eV. Aceste
absorbii domin spectrul i complic folosirea tranziiei interband drept o msurare absolut a puritii SWNT. Caracteristicile interbenzii ncep cu tranziii electronice de energie sczut de la nivelul Fermi al SWNT metalice (M00,~0-0.5 eV). n timp aceasta s-a
dovedit a fi o regiune doar informativ a spectrului. n orice caz, urmtoarele trei tranziii
ale interbenzii (S11, S22 i M11) sunt accesibile spectrometrului NIR i sunt mesagere ale
semnturii SWNT. S22 (7750-11750 cm-1, ~1-1.5 eV), ce este aleas ca semntur a
SWNT datorit faptului c S11 (~4000-8000 cm-1) este extrem de sensibil la impuriti i
dopani. Intensitatea M11 (~12,500-17,500 cm-1) este mai sczut dect S22. din cauz c
probele sunt compuse dintr-un sortiment de diametre i tipuri SWNT. Integrarea intensiti peste ntreaga ntindere a spectrului de tranziie a interbenzii S22, (AA) este folosit
pentru estimri calitattive. Dou cantiti prezint interes pentru o mostr arbitrar X:
suprafaa absorbiei tranziiei interbenzii S22, AA (S,X) i absorbia total, AA (T,X);
raportul lor arat o msur a puritii SWNT. Aceast metod este util, n special pentru
optimizarea proceselor de purificare.

170

Figura 10.3-Ilustrare schematic a spectrului electronic a unui SWCNT obinut prin


arc electric. Spectrul acoper regiunile IR ndeprtat-UV ( aprox 0.001-5.5 eV. Este
detaliat o extensie a regiunii din tranziia interband S22 (adaptare dup [34])

Interaciunea radiaiilor electromagnetice cu molecule i particule poate lua dou


forme, absorbia i mprtierea. Nanotuburile de carbon sunt considerate n general c
posed caracteristicile ambelor aadar, mprtierea este determinat de dimensiunile caracteristice a particulelor (d) i de lungimea de lund a radiaiei incidente ()
mprtierea Rayleigh corespunde dispersiei luminii pe particule cu dimensiuni
caracteristice <1/10 din lungimea de und a radiaiei (d <0.1), i are o dependen foarte
puternic de lungimea de und (s()-4). Seciunea eficace de absorbie este cea mai mare n momentul n care radiaia electromagnetic este polarizat de-a lungul axei SWNT,
i dac se consider c aceasta este componenta dominant, atunci dimensiunea caracteristic a SWNT corespunde cu lungimea d. Pentru un SWNT cu lungimea de d=1 m,
este de ateptat ca radiaia Rayleigh mprtiat s fie important pentru l>10 microni, ce
corespunde frecvenelor <1000 cm-1. n aria spectrului a tranziiei interband (~10,000
cm-1), d, iar n aceast regiune mprtierea Mie trebuie luat n consideraie.
mprtierea Mie devine important n momentul n care dimensiunile caracteristice ale particulelor sunt mai mari dect lungimea de und a luminii (d ), i contribuie la nivelul liniei de baz, influennd msurarea gradului de puritate a mostrei
SWNT, n special n cazul mostrelor slab dispersate. Pentru a obine rezultate credibile n
procedura de evaluare a puritii este esenial s folosim mostre bine dispersate. Acest
lucru poate fi fcut prin folosirea concentraii de SWNT <0.01 mg/mL, sonicate cu un
solvent convenabil ales pn cnd dispersia este omogen vizual.

171

10.3.3 Selectarea nanotuburilor dup lungime i diametru

Sortarea SWNT dup lungimea lor devine extrem de important pentru aplicaii.
De exemplu, nanotuburile cu lungimi scurte (ex: 20-250 nm) sunt ideale pentru nano i
micro electronic sau de ordinul micronilor preferate pentru aplicaii n materiale structurale i de compozite. Tehnici variate au fost folosite pentru a obine SWNT sortate n
funcie de lungime. Aceasta este de obicei realizat prin tehnici cromatografice, electroforez capilar i fracionare. Au fost folosii surfactani pentru a obine soluii de SWNT
dispersate.
Separarea NT dup diametru i a chirilitii se realizeaz prin metodele specifice de
sintez i nu prin procesare fizico chimic. Cele mai cunoscute metode sunt creterile din
structuri mezoporoase cu pori controlati. Tang et al.[35] au raportat decurnd c SWNT
cu diametru de 0.4 nm, cresc ntr-un singur cristal AlPO4-5 zeolit, atingnd o chirilitate
preferenial- care este, (5,0) de form zigzag- opus celorlalte dou chiriliti posibile de
diametru similar (3,3) armchair i (4,2) chirale. Controlul diametrului cavitilor unidimensionale ale zeoliilor mezoporoi ar putea conduce la materiale care s poat servi
drept abloane pentru creterea selectiv de SWNT monodisperse. Tehnicile bazate pe
CVD pe catalizatori suportai de zeolii duc la creteri selective n diametre. Combinnd
dezvoltrile recente din separarea SWNT metalice i semiconductoare, mpreun cu cercetrile n curs pentru a produce nanotuburi cu o distribuie limitat dup diametre se va
atinge condiiile minimale de aplicaii n nanoelectronic
Tierea i oxidarea CNT se poate realiza dup urmtoarea metod:
La 2 mg SWNT se adaug 1ml 3:1(V/V) H2SO4 i HNO3 concentrat. Mixtura este
sonicat 2,4,6,8,10, 12,14 ore funcie de lungimea ce surmrete a fi obinut. Temperatura de lucru se menine la 200C prin rcire cu ghea. Dup sonicare se dilueaz cu 250 ml
ap DI i se filtreaz pe un filtru de PTFE de 40 microni. Splare cu ap pn la pH deasupra lui 5 urmat cu splare n etanol i uscare n vid.[36]
Prin utilizare de acelai raport de acizi i concentraii dar cu tratament la 40-700C
pentru cteva ore cu sonicare se obin CNT scurtate i cu grupri carboxilice ataate.
Acesta este cel mai simplu procedeu de a pregati CNT n vederea funcionalizrii i
solubilizrii [37,38]. Prin fierberea nanotuburilor ntr-un amestec de H2SO4/HNO3 a
rezultat o soluie limpede, incolor care la evaporarea solventului i eliminarea excesului
de acid, rezult un solid alb ce conine nanotuburi funionalizate. Neutralizarea soluiei
acide de ctre o baz rezult un precipitat solid de culoare maro ce conine nanotuburi.
10.3.4 Separarea CNT dup proprietile lor metalice sau semiconductoare

Separarea SWNT n fraciuni metalice i semiconductoare ar trebui s simplifice i


s permit extinderea de aplicaii spre dispozitivele nanoelectronice (tranzistori i circuite
logice), de emisie n cmp, nanosenzori, actuators, materiale pentru ecrane electromagnetice. Metodele de sintez genereaz mixturi sub form de mnunchiuri de SWNT metalice i semiconductoare ntr-un raport de 1:2 , face separarea lor s fie dificil. Prin explorarea interaciunilor fizico-chimice complexe ale aminelor dintr-un surfactant (octadecilamine- ODA, CH3(CH2)17NH2) cu nanotuburi de carbon conduce n etapele de
172

purificre la separarea formelor metalice de cele semiconductoare. Interaciunile slabe


donor-acceptor dintre grupul de amine al ODA i SWNT semiconductoare par s acioneze mpreun ca un zwiterion SWNT-COO-/+NH3-(CH2)17CH3. Spre deosebire de
zwiterion care sunt inui mpreun ntr-un solvent cu constant dielectric mic, complexele donor-avcceptor surfactant-amin-nanotub sunt stabilizate prin grupul alifatic al
ODA spre suprafaa grafenei a SWNT. Studii spectroscopice i termogravimetrice recente
indic faptul c aceste amine interacioneaz mai puternic cu SWNT semiconductoare
dect cu cele metalice. Acest fapt reduce tendina SWNT semiconductor s se aglomereze
n timp ce concentraia este crescut prin evaporarea parial a solventului, lsnd
precipitatul s fie populat n mare parte de nanotuburi metalice. Prin spectrometrie Raman
analiza modurilor de vibraie RBM (radial breathing modes) se pune n eviden c n
supernatant sunt SWNT semiconductoare, iar n fracia precipitat este bogat cu SWNT
metalice. Spectrometria Raman de rezonan arat c un factor de mbogire de ~90% n
SWNT semiconductoare se poate atinge n supernatant. Separri cu o eficien mai nalt
(97% i chiar mai mult) au fost observate pentru SWNT cu diametre de1 nm.
Un alt experiment asupra separrii SWNT metalice/semiconductoare: suspensie
apoas a SWNT n surfactant de Triton X-100 i brominare, urmat de o centrifugare la
24000 g pentru 12 ore. n acest caz supernatantul conine nanotuburi semiconductoare iar
sedimentele nanotuburi metalice. De notat c separarea se bazeaz pe faptul ca nanotuburile individuale n suspensie cu surfactantul apos rmn suspendate pe parcursul
centrifugrii la factori g mari. Explicaia pentru acest rezultat const n formarea de structuri micelare surfactant-nanotub ce exclud apa spre capetele hidrofobe.
Dou efecte sunt concurente la separare: (1) bromul formeaz un transfer complex
de sarcin cu nanotuburile metalice i (2) stabilizarea surfactantului Triton X-100 este
slab pentru nanotuburi metalice (ex., surfactantul are o toleran limitat a puterii ionice,
care, odat depit, i pierd activitatea). Aceste efecte sugereaz c separarea se datoreaz unei destabilizri a suspensiei cu nanotuburi metalice- surfactant, rezultnd din afinitatea lor selectiv pentru brom. A fost artat c un lan de ADN (ss-ADN) se leag
puternic de SWNT prin rearanjare- i astfel produce exfolierea i solubilizarea SWNT n
ap prin desfacerea din mnunchiuri. Mai mult de att, gruprile de fosfat aduc unui
hibrid ADN-SWNT o densitate de sarcin negativ pe suprafaa nanotubului de carbon,
distribuie care ar trebui s fie o funcie de secvena ADN . Bazat pe aceasta, complexul
ADN/SWNT metalic este predispus s aib o suprafa mai mic de nrcare dect complexul ADN/SWNT semiconductor. O separare dielectroforetica a SWNT metalice de
SWNT semiconductoare a fost de asemenea raportat. SWNT solubilizate cu dodecil
sulfat de sodiu (SSD) n D2O n concentraii de 10mg/L au fost supuse la dielectroforez
la o frecven de 10MHz, i un cmp de aproximativ 2 x 103 V/cm. Datorit diferenelor
dintre constantele dielectrice relative ale formei metalice versus semiconductoare cu privire la solvent, nanotuburile metalice au fost ataate ctre zona microelectrodului, lsnd
nanotuburile semiconductoare n solvent. Spectroscopia raman de rezonan a estimat un
factor de mbogire de 80% al fraciunii SWNT metalice depozitate. Lucrri mai recente
indic faptul c SWNT metalice sufer transferuri prefereniale de electroni cu sri de
173

diazoniu n soluii apoase, fa de SWNT semiconductoare. Aceast aparent selectivitate


pare s fie indus de mobilitatea mare a electronilor (pentru SWNT metalice) din zona
nivelului Fermi. (O discuie de detaliu asupra modalitilor de separare i selectare a dup
tipul de nanotub se gsete n seria MRS-Bulletin aprilie 2004)
10.3.5 Ataarea de grupe funcionale

Acidul azotic concentrat i amestecuri de H2SO4 cu HNO3, H2O2 sau KMnO4 au


fost folosite pentru a funcionaliza atand grupri acidice la nanotuburi. Prima data, se
ataeaz grupe acidice la capetele deschise ale SWNT-ului (figura 10.4). Principalele funciuni acidice cuprinde gruprile COOH, -C=O i OH i sunt n proporie de 4:2:1.
Concentraia la suprafa a gruprilor acidice din nanotuburile tratate cu diferii
oxidani variaz ntre 2x1020 pana la 10x1020 situri/g sau echivalent n rapoarte molare
5.5% - 7.7% (COOH), ~6% (-C=O), ~5% (-OH) pentru SWNT-urile scurte sau ~4%
pentru SWNT-urile lungi. Metoda simpl de titrare acido-bazic arat ca trei probe diferite de SWNT purificat au cam 1-3% situsuri acidice i 1-2% au grupe funcionale
COOH. Concentratia grupelor functionale este dependent de timp.
Tratarea SWNT-urilor cu H2SO4 concentrat ce conine persulfat de amoniu,
(NH4)4S2O7 i pentaoxid de fosfor, urmat de tratare cu acid sulfuric i permanganat de potasiu va rezulta un material ce conine C/O/H n proporie atomic de 2.7:1.0:1.2.
Ozonoliza nanotuburile creaz centrii reactivi ce pot fi folosii n alte reacii de
ataare de funciuni acidice sau bazice.
SWNT-urile funcionalizate, purificate i scurtate pot fi dispersate n ap prin sonicare ce prezint o stabilitate rezonabil ( aproximativ 1 lun). Solubilitatea i stabilitatea
soluiei este dependent de pH

Figura 10.4- Tratarea CNT-urilor cu soluii de permanganat de potasiu i acid sulfuric


scurteaz nanotuburile i induce formarea de grupri funcionale pe suprfaa lor

Gruprile carboxilice de la extremitile SWNT-urilor pot reaciona chimic n


soluii organice formnd inele sau compui ce pot fi utilizai n procese de ataare pentru
biomolecule. Cel mai important aspect pentru funcionalizarea ionic sau covalent este
posibilitatea exploatrii gruprilor carboxilice de la capetele tubului sau a pereilor.
174

Aminele sunt reactivi care au atras cea mai mare atenie. Sunt trei tipuri de reacii a
aminelor cu gruprile carboxilice: amidarea; interacia acid-baz; condensarea. De altfel,
aminele pot fi adsorbite fizic n pereii nanotuburilor. n acest sens exist o literatur
bogat asupra proceselor de solubilizare, funcionalizare, amidare ce poate fi consultat
pentru o reacie specific [39].

175

10.4 Referine

1. Kroto H. W, Heath J. R., O'Brien S. C,. Curl R. F and. Smalley R. E. C60


Buckminsterfullerene. Nature 318: 162 - 163(1985)
2. Iijima, Sumio. Helical microtubules of graphitic carbon. Nature 354: 56 - 58(1991)
3 Iijama, Sumio Single-shell carbon nanotubes of 1-nm diameter, Nature 363: 603 605
(1993).
4. Bethune, D. S.; et al. Cobalt-catalysed growth of carbon nanotubes with single-atomiclayer walls. Nature 363: 605607. (17 June 1993).
5 a.Guo, Ting. Self-Assembly of Tubular Fullerenes,J. Phys. Chem. 99: 10694 10697
(1995
b.Guo, Ting Catalytic growth of single-walled nanotubes by laser vaporization,
Chem. Phys. Lett. 243: 49 54 (1995).
c.Flahaut, E.; Bacsa R, Peigney A, Laurent C. Gram-Scale CCVD Synthesis of
Double-Walled Carbon Nanotubes. Chemical Communications 12: 1442 1443
(2003).
6 M. I. Ionescu , I. Stamatin F. Nastase C. Nastase C. Serban, High-quality carbon nanotubes production using plasma-chemistry deposition method, Molecular Crystals
and Liquid Crystals, vol 415, 133-140, (2004)
7 a.Saito R G Dresselhaus & M S Dresselhaus, Physical Properties of Carbon Nanotubes,
CRC press, ISBN 978-1-86094-093-4, (1998)
b.M.S. Dresselhaus, G. Dresselhaus, and P.Avouris, eds., Carbon Nanotubes: Synthesis,Structure, Properties and Applications,Springer-Verlag, Berlin, (2001).
8 Stamatin I., Matei C., Buliga E., The closing of the Carbon structures sheets in fullerenes C60 Rom. Rep. Phys., 48, N78, p599, (1996)
9 Tans S.J., M.H. Devoret, Dai H.J., Thess A., Smalley R.E., Geerligs L.J., Dekker C.,
Nature 386 474477. (1997)
10 J.W.G. Wildoer, L.C. Venema, A.G. Rinzler, R.E. Smalley, C. Dekker, Nature 391
5962. (1998)
11 Odom T.W., Huang J.L., Kim P., Lieber C.M., Nature 391 6264. (1998)
12 Tans S.J., Verschueren A.R.M., Dekker C., Nature 393 4952 (1998)
13 Chen J., Hamon M.A., Hu H., Chen Y.S., Rao A.M., Eklund P.C., Haddon R.C.,
Science 282 9598, (1998)
14 Kong J., Franklin N.R., Zhou C.W., Chapline M.G., Peng S., Cho K.J., H.J. Dai,
Science 287 622625. (2000)
15 Duesberg G.S., Blau W.J., Byrne H.J., Muster J., Burghard M., Roth S., Chem. Phys.
Lett. 310 814. (1999)
16 Krstic V., Roth S., Burghard M., Phys. Rev. B 62 R16353R16355. (2000)
17 Kong J., E Yenilmez., Tombler T.W., Kim W., Dai H.J., Laughlin R.B., Liu L., Jayanthi C.S., Wu S.Y., Phys. Rev. Lett. 87 Art. no. 106801. (2001)
176

18 Derycke V, Martel R., Appenzeller J., Avouris P., Nano Lett. 1 453456. (2001)
19 Bachtold A., Hadley P., Nakanishi T., Dekker C., Science 294 13171320. (2001)
20 Postma H.W.C., Teepen T., Yao Z., Grifoni M., Dekker C., Science 293 7679. (2001)
21 M.J. OConnell, et al. Science 297 593596. (2002)
22 M. Freitag, V. Perebeinos, J. Chen, A. Stein, J.C. Tsang, J.A. Misewich, R. Martel, P.
Avouris, Nano Lett. 4 1063 -1066. (2004)
23 Vitali L., Burghard M., Schneider M.A., Liu L., Wu S.Y., Jayanthi C.S., Kern K.,
Phys. Rev. Lett. 93, Art. no.136103. (2004)
24 Harris P.J.F., Carbon Nanotubes and Related Structures, Cambridge Univ. Press,
(1999).
25 Kukovecz A., Pichler T., Pfeiffer R., Kramberger C., Kuzmany H., Phys. Chem.
Chem. Phys. 5 582587. (2003)
26 Hulman M., Plank W., H. Kuzmany, Phys. Rev. B 6308, Art. no. 081406(2001
27 Journet C., Maser W.K., Bernier P., Loiseau A., De la Chapelle M.L., Lefrant S., P.
Deniard, R. Lee, J.E. Fischer, Nature 388 756758. (1997)
28 A. Kukovecz, C. Kramberger, V. Georgakilas, M. Prato, H. Kuzmany, Eur. Phys. J. B
28 223230. (2002)
29 An L., Owens J.M., McNeil L.E., Liu J., J. Am. Chem. Soc. 124 1368813689,(2002)
30 Choi H.C., Kim W., Wang D.W., Dai H.J. J. Phys. Chem. B 106 1236112365,(2002)
31 Bachilo S.M., et all, J. Am. Chem. Soc. 125,11186 11187 (2003)
32 Zhao X., et all, Phys. Rev. Lett. 92 Art. no. 125502. (2004)
33 a. Monthioux M., et all, Carbon 39 12511272. (2001)
b. Girifalco L.A., Hodak M.,Lee R.S., Phys. Rev. B 62, 1310413110. (2000)
34 Itkis M.E., et all NanoLett. 2 ,p. 155. (2002)
35 Tang Y.H., Lee C.S., Lee S.T., Appl. Phys. Lett. 73, 3902-3904 (1998)
36 Marshall Matthew W., Popa-Nita Simina, Shapter Joseph G.,Carbon 44 11371141,
(2006)
37 Hamon M. A., et all, Appl. Phys. A 74, 333 (2002).
38 .a Sun Y.P., Fu K., Lin Y. Huang W., Acc. Chem. Res. 35, 1096 (2002);
b. Niyogi S.,et all, Acc. Chem. Res. 35, 1105 (2002);
c. Hirsch A., Angew. Chem.Int. Ed. 41, 1853 (2002);
d. Banerjee S, Kahn C, Wong S., Chem.Eur. J. 9, 1898 (2003);
e. Tasis D., Tagmatarchis N., Georgakilas V. Prato M.,Chem. Eur. J. 9, 4000
(2003);
39 Naotoshi Nakashima, Int.J. of Nanoscience vol. 4, no. 1 119137, (2005)

177

178

11 Nanofire, nanosenzori
Detecia speciilor chimice i biologice constituie placa turnant din multe arii din
sntate i tiinele vieii acoperind diagnoza bolilor, descoperirea de noi medicamente
sau de noi droguri. Dezvoltarea de noi dispozitive senzoriale pentru analize rapide a acestor specii la limita de sub picomoli va avea un impact asupra societii n multiple
moduri. Dispozitive ultrasensibile dezvoltate pe nanofire va crea o nou clas de nanosenzori capabili s detecteze proteine, ADN, molecule specifice designului de noi medicamente. Cheia central n recunoaterea molecular este transducia semnalului asociat
cu recunoaterea selectiva speciilor de interes. Nanostructuri cum sunt nanofirele [1-7] i
nanocristale [8-12] ofer posibilitatea unic de a construi dispozitive nanometrice de
senzare. Diametrele lor sunt comparabile cu dimensiunile speciilor biologice i chimice,
prin urmare, intuitiv, reprezint un promitor mijloc de transducie de semnal i interfaare cu instrumentele macroscopice. Nanofirele anorganice i nanocristalele prezint
proprieti electrice [2-5, 13-28] i optice [8-12] unice ce pot fi exploatate pentru senzare.
Dependena de dimensiunea nanocristalelor a proprietilor de emisie i a culorii
deschide mari oportuniti de etichetare respectiv marcare i detecie optic a speciilor
biologice prin comparaie cu coloranii i markerii chimici fluoresceni utilizai curent [812]. Proprietile de comutaie electronic a nanofirelor semiconductoare furnizeaz
modalitatea de senzare i indexare electric cu citire direct. Aceasta devine extrem de
atractiv pentru multiple aplicaii [29-37]. Semnalele electrice de la un asemenea tip de nanodispozitiv pot fi direct rutate spre exterior iar acesta pot fi direct integrat n sisteme
miniaturizate. Detecia de semnale electrice direct de la speciile moleculare reduce timpul
de indexare cu markeri chimici. n paragrafele urmtoare se vor prezenta cteva din aplicaiile dispozitivelor pe baz de nanofire care se pare vor revoluiona, prin proprietile
lor remarcabile, detecia n biologie i medicin.

11.1 Senzori FET cu nanofire


Principiile de construcie ale FET-urilor prezentate n capitolul 6 se transpun direct
n conceperea de senzori pe baz de nanofire, NFET. ntr-un FET standard , (figura 6.1)
siliciul dopat, p-Si, este conectat la surs i dren prin dou contacte metalice prin care
trece un curent electric sub un potenial dat. Conductana semiconductorului este modificat de al treilea electrod (poarta) cuplat capacitiv printr-un strat dielectric. n cazul p-Si
dac se aplic pe poart un potenial pozitiv are loc o diminuare a sarcinilor iar conductana se reduce. Invers dac se aplic un potenial negativ atunci are loc o acumulare de
sarcini i conductana crete. Dependena conductanei de tensiunea aplicat pe poart face din FET un candidat firesc pentru senzarea pe baz electric deoarece cmpul electric
va depinde de speciile de sarcini electrice ce se pot ataa pe nanofir.
179

Exist o multitudine de tipuri de nanofire crescute pe substratul de siliciu. Utiliznd


diferite metode de evaporare termic, procese de depunere chimic din vapori (CVD) sau
construcii pe abloane cu fascicule moleculare. Unul din cele mai studiate exemple este
nanofirul de Si ce poate fi preparat ca o structur cristalin singular cu diametre de 23nm [1-4,42,43]. Ambele tipuri de Si dopat p sau n (n-Si) prezint performanele i caracteristicile comparabile cu cele atinse de industria electronic n privina stabilitii i
reproductibilitii [24]. Caracteristicile electronice ale nanofirelor de Si sunt controlate cu
precizie n timpul procesului de cretere ceea ce este un avantaj raportat la nanotuburile
de carbon. Nanofirele de Si prezint caracteristici de comutaie de nalt performan ceea
ce este un factor decisiv care afecteaz sensibilitatea. Nanofirele de Si au depit inconvenientele de limitare a sensibilitii pentru tranzistorii FET obinuti prin tehnologia planar (vezi capitolul 6). FET urile cu nanofire de Si sunt structuri unidimensionale ce faciliteaz ataarea pe suprafa de specii de biomolecule i markeri de recunoatere molecular. Acumularea sau sracirea de sarcini are loc n volumul nanostructurii fa de
dispozitivul planar care conducea la modificarea regiunii superficiale [29]. n acest context sensibilitatea de a detecta o singur molecul ar putea deveni posibil. n figura 11.1
este prezentat metoda de trecere de la FET construit pe o structur planar de Si la un
NFET unde nnanofirele de Si sunt conectate ntre surs i dren. Cele dou tipuri de
NFET prezint fiecare avantaje i dezavantaje. Structura din figura 11.1b permite ataarea
direct de grupe funcionale sau molecule. Tipul (c) dei are caracteristici superioare nu
permite o ataare direct, n particular grupele funcionale sunt n contact cu electrodul de
Au al porii. n figura 11.2 este prezentat principiul de construcie a unui NFET ce are nanofirul de Si (SiNW) funcionalizat i expus direct la o soluie ce conine analitul. Rspunsul este msurat prin variaia conductanei cu timpul.
Ataarea de molecule receptoare (figura 11.2b) se realizeaz direct pe stratul oxidic
al nanofirului nefiind necesar alte modificri chimice. Cnd dispozitivul este expus direct
cu suprafaa la o soluie ce conine macromolecule cum ar fi proteine ce au o sarcin
pozitiv net atunci legarea va conduce la descreterea n conductan pentru un nanofir
din Si dopat p. n figura 11.3 este descris principiul de funcionare a unui pH-NFET i
rspunsul n conductan. Pentru gruprile naturale de silanol, Si-OH, (figura 11.3-1)
rspunsul n conductan este continu cresctor funcie de echilibrul protonare/ deprotonare care schimb starea suprafeei prin cumularea sau sarcirea de sarcin.
Prin funcionalizarea cu grupri amino (de exemplu 3-aminopropiltrietiloxisilan)
modificarea de sarcin se realizeaz n trepte funcie de valoarea pH ului iar rspunsul n
timp este definit cu mare precizie. De notat c gruprile amino i silanol funcioneaz ca
receptori pentru reaciile de protonare-deprotonare care schimb starea de sarcin a suprafeei nanofirului.
Rezultatele i observaiile anterioare confirm pe deplin astzi realizrile cu nanofire de Si [29-46].

180

Figura 11.1-Trecerea FET de la tehnologia planar (a) unde potenialul de pe poarta G moduleaz sarcina
superficial dintre surs i dren , respectiv conductana la tehnologia pe nanofire (b,c). n (b) este descris
formarea unui nanofir de Si prin corodare n plasm sau cretere pe structura Si-SiO2 ntre contactele sursdren. n (c) este descris conectarea unui nanofir de Si construit pe un ablon de Ge iar poarta este un
electrod de Au depus pe un film dielectric cu permitivitate nalt. Acest tip de structur este proiectat pe un
strat complex de poart format din 2 oxizi SiO2-ZrO2- dielectric high k. Nanofirul Ge-Si formeaz o structur
de benzi de tipul vale cuantic (e) , BV-banda de valen, BC-banda de conducie, EF nivelul Fermi.

Figura 11.2- Principiul de construcie a unui NFET (a) pe structura din figura 11.1b. Fluidul cu analit este
condus spre nanofirul de Si (SiNW) printr-un microcanal. Ataarea de grupe funcionale (b) conduce la
modificarea acumulrilor de sarcin i n consecin conductana se modific n timp (c).

181

Figura 11.3-Schem de realizare a unui NFET funcionalizat cu grupe silanol (a) respectiv amino (b) pentru
msurarea de pH.Rspunsul ipotetic n conductan pentru silanol(1) respectiv amino (2), graficul (d)
corespunde rspunsului n timp la diferite valori de pH.

Figura 11.4- Formarea de NFET din mnunchiuri de nanotuburi prin evaporarea celor metalice i selectarea
SWNT semiconductoare

n cazul nanotuburilor de carbon trebuie abordata o alt metod. Proprietatea lor de


conducie unidimensional respectiv dificultatea de a selecta formele metalice de cele semiconductoare impune o metod oarecum diferit. n figura 11.4 este prezentat o metod
de formare a unui FET din mnunchiuri de SWCNT unde formele metalice sunt evaporate prin aplicarea unei tensiuni nalte ntre surs i dren. n etapa a doua nanotuburile
182

sunt funionalizate cu grupri carboxilice sau amidice prin procedeele schiate n seciunea 10 pe care se pot ataa receptorii. Figura 11.4 arat c SWNT pot fi folosite ca simple nanofire prin care se poate senza un semnal electric prin simpl ataare de molecule
sau prin aplicarea unui potenial pe poart se transform ntr-un FET.
Fie c este un nanofir de Si sau SWCNT senzarea de macromolecule biologice cum
ar fi proteine sau acizi nucleici care n soluii apoase sunt ncrcate electric se poate realiza prin ataarea la suprafaa lor de receptori convenabili alei. Primul exemplu de cuplul
de detecie a proteinelor este molecula de biotin care are o selectivitate mare la streptavidin. Cnd o soluie de streptavidin este n contact cu nanofirul funcionalizat cu biotin
interacia lor modific conductana. Acelai procedeu se aplic i la indexarea ADN ului
prin ataarea de secvene complementare pe nanofir [33-48]. Extinderea de atari de
diferii receptori i crearea de arii cu anticorpi se pot genera platforme de detecie de
virui, droguri.[49-67].

11.2 Limitele de detecie i rspuns pentru nanobiosenzori


Din paragraful anterior s-a constatat efortul cercetrilor de a construi nanosenzori
ultrasenzitivi pentru detecia moleculelor biochimice, virusuri droguri, ADN, la concentraii mici de analit i n flux rapid. Structurile angajate n designul lor sunt planare (FET)
fire cilindrice sau nanosfere. Din considerente electrostatice este cunoscut c structurile
cilindrice sunt mai senzitive la adsorbia de sarcini ( adic ADN, proteine, etc) n raport
cu cele planare de tipul ISFET sau CHEMFET. Din punct devedere electrostatic ISFET
este o structur 1D, firele sunt 2D iar sferele 3D. Rspunsul unui nanosenzor din partea
de detecie este mai mult cinetic ,cnd este imersat n soluie el msoar timpul de captur
a unui anumit numr de analii ( timpul de atingere a valorii maxime, tS). Altfel interpretat, dac exist pe nanosenzor NS receptori per unitate de arie atunci tS este timpul de
saturaie pentru o reacie analt-receptor dat. Acest timp este deasemeni dependent de dimensionalitatea senzorului. Intuitiv se poate constata c tS,2D tS,1D pentru o concentraie
dat de analit, 0. Se pune ntrebarea care sunt limitele de detecie pentru un timp rezonabil de rspuns. Aceasta se poate estima din considerente de cinetic respectiv de difuzie
a analitului.
Se consider un senzor izolat imersat ntr-un electrolit cu analit staionar la t=0.
Suprafaa senzorului este funcionalizat cu receptori pentru moleculele int. Viteza de conjugare dintre analii i receptori este descris de:
11.1
unde N este densitatea de receptori conjugai, N0 este densitatea de receptori de pe suprafaa senzorului, kF, kR, constantele de captur i de disociere, S, concentraia de analii la
suprafaa senzorului care se determin prin combinare cu ecuaia de difuzie:

11.2
cu D coeficientul de difuzie a analitului din soluie. Fluxul de molecule de analit spre
suprafaa senzorului de arie AD:
183

11.3
unde I este fluxul incident de analit pe o arie AD. Rspunsul n timp este dat prin rezolvarea ecuaiilor 11.1 i 2 unde este necesar cunoaterea ratelor de captur respectiv de detaare a analitului la receptori. Lund n considerare dinamica capturii de biomolecule
dezvoltate n [65] cu raportul ratelor de regul kF/kR~105 [66] i pentru concentraii de
N0~104 /m2.[67] ecuaia cineticii 11.1 se reduce la:
11.4
iar fluxul n condiii staionare:
11.5
,
unde densitatea fluxului de analit,CD,SS este capacitana de difuzie echivalent pentru
cazul cnd concentraia 0 a analitului rmne constant la o distan W de suprafaa senzorului (tabela 11.1). Cum fluxul de analit trebuie sa fie echilibrat de viteza de ataare
analit-receptor avem condiia j=dN/dt. Rezolvnd ecuaiile 11.4-5 se obine:
,

11.6

ecuaie ce arat o dependen liniar a concentraiei analitului cu timpul i prin urmare un


rspuns liniar al senzorului n condiii staionare.
Cu aceste relaii se poate estima rspunsul tranzient al unui nanosenzor prin perturbarea strii staionare dup cum urmeaz: cu ct reacia de ataare a analitului progreseaz concentraia sa se diminueaz n apropierea suprafeei senzorului datorit capturii;
distana de srcire este
unde n este dimensionalitatea senzorului (tabe2
lul 11.1). Se poate defini un coeficient de difuzie echivalent cu capacitana, CD(t) ca
funcie de W(t) i inserndu-l direct n 11.6 se obine:
11.7
i cu notaiile din tabela 11.1 conduce la timpul de saturaie tS de a
care pentru
captura NS de molecule. Pentru fiecare tip de nanosenzor se obine o relaie de scalare
unic:
~
11.8
unde MD i kD sunt constante dependente de dimensionalitatea senzorului (tabela 11.1)
Relaiile de mai sus conduc imediat la un numr de concluzii importante pentru estimarea concentraiei minime detectabile pentru un senzor planar, cilindric respectiv
sferic, o problem tipic a deteciei de ADN. S presupunem c timpul maxim de saturaie este de 100s iar NS= 10 m-2 ce corespunde corespunde la dou conjugri per 1
micron lungime, 30nm diametru de nanofir. Considernd coeficienii de difuzie pentru
biomolecule D de ordinul 10-10 m2/s se poate reprezenta un grafic simplu pentru cele trei
tipuri de senzori (figura 11.5).

184

Figura 11.5-Estimarea concentraiei limit (0) de detecie pentru un timp prestabilit de saturare (tS). Pentru
un timp de detec,ie prestabilit la 100s structurile cilindrice (nanofirele) respectiv sferice pot detecta
concentraii de ordinul pmol n timp ce ISFET ca structur planar are limita de detecie de ordinul
nanomolar.
Tabela 11. 1- Geometrii 1D, 2D i 3D de nanosenzori i caracteristicile lor pentru regim staionar de detecie a
analiilor
Tip de
model
W
AD,
CD,SS
CD(t)
MD
kD
senzor
ISFET
1
1/2
2
planar
2
1D

Nanosenzor
cilindric
2D

Nanosenzor
sferic
3D

a0-raza senzorului; distana W a analitului de concentraie constant raportat la suprafaa senzorului

Rezultatele obinute sunt n concordan cu o serie de refeine i articole de sintez


[]

185

11.3 Referine
1. Morales, A. M., and Lieber, C. M., Science 279, 208(1998)
2. Hu, J., et al., Acc. Chem. Res. 32 (5), 435(1999)
3. Lieber, C. M., MRS Bull. 28 (7), 486(2003)
4. Cui, Y., et al., In: Nanowires and Nanobelts Materials, Properties and Devices,
Wang, Z. L., (ed.), Kluwer Academic Publishers (2003), 3
5. Samuelson, L., Materials Today 6 (10), 22 (2003)
6. Xia, Y., et al., Adv. Mater. 15 (5), 353 (2003)
7. Wang, Z. L., Materials Today 7 (6), 26 (2004)
8. Niemeyer, C. M., Angew. Chem. Intl. Ed. 40 (22), 4128 (2001)
9. Chan, W. C. W., et al., Curr. Opin. Biotechnol. 13 (1), 40 (2002)
10. West, J. L., and Halas, N. J., Annu. Rev. Biomed. Eng. 5, 285 (2003)
11. Alivisatos, P., Nat. Biotechnol. 22, 47 (2004)
12. Gould, P., Materials Today 7 (2), 36 (2004)
13. Cui, Y., et al., J. Phys. Chem. B 104 (22), 5213 (2000)
14. Duan, Y., et al., Nature 409, 66 (2001)
15. Cui, Y., and Lieber, C. M., Science 291, 851 (2001)
16. Huang, Y., et al., Science 294, 1313 (2001)
17. Gudiksen, M. S., et al., Nature 415, 617 (2002)
18. Huang, Y., et al., Nano Lett. 2 (2), 101 (2002)
19. Lauhon, L. J., et al., Nature 420, 57 (2002)
20. Cui, Y., et al., Nano Lett3 (2), 149. (2003)
21. McAlpine, M. C., et al., Nano Lett3 (11), 1531.(2003)
22. Zhong, Z., et al., Science 302, 1377 (2003)
23. Panev, N., et al., Appl. Phys. Lett. 83 (11), 2238 (2003)
24. Jin, S., et al., Nano Lett.) 4 (5), 915 (2004
25. Greytak, A. B., et al., Appl. Phys. Lett. 84 (21), 4176 (2004)
26. Wu, Y., et al., Nature 430, 61 (2004)
27. Zheng, G., et al., Adv. Mater. 16 (21), 1890 (2004)
28. Bjork, M. T., et al., Nano Lett. 4 (9), 1621 (2004)
29. Cui, Y., et al., Science 293, 1289 (2001)
30. Comini, E., et al., Appl. Phys. Lett. 81 (10), 1869 (2002)
31. Zhou, H. T., et al., Chem. Phys. Lett. 369 (1-2), 220 (2003)
32. Li, C., et al., Appl. Phys. Lett. 82 (10), 1613 (2003)
33. Hahm, J., and Lieber, C. M., Nano Lett. 4 (1), 51 (2004)
34. Wang, W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 3208 (2005)
35. Patolsky, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 14017 (2004)
36. Kolmakov, A. and Moskovits, M., Annu. Rev. Mater. Res. 34, 151 (2004)
37. Wan, Q., et al., Appl. Phys. Lett. 84 (18), 3654 (2004)
38. Sze, S. M., Physics of Semicondutor Devices, Wiley, New York), 431(1981
186

39. Bergveld, P., IEEE Trans. Biomed. Eng. BME-19, 342 (1972)
40. Blackburn, G. F., In: Biosensors: Fundamentals and Applications, Turner, A. P. F.,
et al. (eds.), Oxford University Press, (1987),
41. Hafeman, D. G., et al., Science 240, 1182 (1988)
42. Cui, Y., et al., Appl. Phys. Lett. 78 (15), 2214 (2001)
43. Wu, Y., et al., Nano Lett. 4 (3), 433 (2004)
44. Iler, R. K., The chemistry of silica, John Wiley & Sons, New York (1979)
45. Bartlett, P. N., In: Handbook of Chemical and Biological Sensors, Taylor, R. F.,
Schultz, J. S. (eds.), IOP Publishing, Philadelphia 139 (1996),
46. Bolt, G. H., J. Phys.Chem. 61 (9), 1166 (1957)
47. Bayer, E. A., and Wilchek, M., Methods Enzymol. 184, 49 (1990)
48. Nielsen, P. E., et al., Science 254, 1497 (1991)
49. Jensen, K. K., et al., Biochem. 36 (16), 5072 (1997)
50. He, L., et al., J. Am. Chem. Soc. 122 (38), 9071 (2000)
51. Hook, F., et al., Langmuir 17 (26), 8305 (2001)
52. Grosios, K., Traxler, P., Drugs Future 28, 679 (2003)
53. Strausberg, R. L, Schreiber, S. L., Science 300, 294 (2003)
54. Stockwell, B. R., Trends Biotechnol. 18 (11), 449 (2000)
55. Becker, J., Nat. Biotechnol. 22, 15 (2004)
56. Blume-Jensen, P., and Hunter, T., Nature 411, 355 (2001)
57. Stadler, K., et al., Nat. Rev. Microbiol. 1, 209 (2003)
58. Atlas, R. M., Nat. Rev. Microbiol. 1, 70 (2003)
59. Niiler, E., Nat. Biotechnol. 20, 21(2002)
60. Weiss, S., Nat. Struct. Biol 7, 72. (2000)4
61. Zhuang, X., Rief, M., Curr. Opin. Struct. Biol. 13 (1), 88 (2003)
62. Huang, Y., et al., Science 291, 630 (2001)
63. Whang, D., et al., Nano Lett3 (9), 1255 (2003)
64. Whang, D., et al., Jpn. J. Appl. Phys. 43 (7B), 4465(2004)
65. Berg H. C., Random Walks in Biology Princeton University Press,NJ,(1993).
66. Lohse J., Dahl O. Nielsen P. E, Proc. Natl. Acad. Sci (PNAS). 96,11804 (1999)
67.Fritz J, E. B. Cooper, Gaudet S,. Sorger P. K, Manalis S. R., PNAS.. 99, 14142 (2002).
68.Gruner G.,Anal Bioanal Chem 384: 322335 (2006)

187