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v=b-NHyzF23yA

CARVAJAL, J.D; CASTILLO - PASTUZAN, E.A; LAGOS -IBARRA, D.A; MORABETANCOURT, Y. F; TONGUINO - GAMEZ, N.M.
San juan de pasto, mayo 31 de 2013
Universidad de Nario
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA PARA DETERMINAR CANTIDAD Y
CALIDAD DE ADN EN Anadara tuberculosa
RESUMEN
En la prctica se realizo electroforesis con gel agarosa para determinar la cantidad y calidad
de ADN, y se ejecuto el protocolo pertinente para la realizacin de este, utilizando la
extraccin de ADN anteriormente de Anadara tuberculosa. Procedimos a la preparacin del
gel agarosa a un 2% donde se corren las muestras de ADN extrado con anterioridad para
aclarar la presencia de ADN y el estado en que se encuentra este, posteriormente se procede
la preparacin de la muestra para poder observar la corrida del ADN en el gel agarosa y
finalmente se hace observacin electroforticamente de este, donde es transportado al
cuarto oscuro para hacer la observacin en los rayos UV y determinar la calidad cantidad
de ADN y si el procedimiento fue hecho correctamente.
Se pudieron encontrar algunas inconsistencias, que pudieron ser producto de una mala
preparacin del gel agarosa, mala utilizacin del tampn o incluso la una mala extraccin
del ADN realizada anteriormente.
ABSTRACT
In practice performed agarose gel electrophoresis to determine the quantity and quality of
DNA and the protocol was performed relevant to the realization of this, using the above
DNA extraction of bloody tuberculosis. Proceeded to the preparation of agarose gel at 2%
which run the DNA samples prior to clarify the presence of DNA, and the state in which is
located, then proceeds to prepare the sample to observe the run DNA in the agarose gel and
then electrophoretically observation is this, where it is transported to the darkroom to make
the observation in UV and determine the quality and quantity of DNA if the procedure was
done correctly.
They could find some inconsistencies, which might be the result of poor preparation of
agarose gel, misuse of buffer or even poor DNA extraction previously made.
INTRODUCCION
La electroforesis de los cidos nuclecos
es el mtodo ms empleado para separar,
identificar
y purificar molculas o
fragmentos de ADN y ARN
La electroforesis de cidos nuclecos se
llevan a cabo en geles de agarosa y se
considera un mtodo sencillo y altamente
eficiente para separar fragmentos de ADN

Una de las caractersticas es que los

cidos
nuclecos
estn
cargados
negativamente debido a los grupos
fosfatos una vez que el ADN es expuesto
al campo elctrico y en soluciones
buffers migran hacia el nodo (electrodo
positivo) la velocidad de migracin est
limitada por las fuerzas de friccin
ejercidas por el soporte o gel. Cada
molcula aporta una carga negativa y la

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relacin carga masa de cada molcula es

la misma independiente del tamao; por
lo tanto la migracin o movilidad del
ADN en un gel va depender del tamao o
conformacin as como tambin del poro
del gel
Despus de la electroforesis los
fragmentos de ADN pueden observarse al
utilizar compuestos fluorescentes o
pueden marcarse radiactivamente. El
bromuro de etidio es el colorante ms
utilizado para la visualizacin de ADN
en los geles, se intercala en las bases de
los cidos nuclecos y emite una
fluorescencia cuando es iluminado con
los rayos ultravioleta que permite
visualizar pequeas cantidades de ADN,
el uso de este compuesto debe ser
manejado con mucho cuidado y con el
cumplimiento riguroso de los protocolos
de bioseguridad de los laboratorios
debido a que se considera un agente
altamente cancergeno.
OBJETIVO
Determinar clida y cantidad de ADN a
partir de electroforesis en gel agarosa.
METODOLOGA
PREPARACIN
EN
GEL
DE
AGAROSA
Se prepara gel de agarosa a un 2%
Donde se corren las muestras de ADN
extrado con anterioridad para aclarar
la presencia de ADN y el estado en que
se encuentra este
Se hace una reparacin de la cubeta de
electroforesis con el peine respectivo,
pesar 0,8 gramos para electro foresis, En
un frasco Prex se tapa , se agrega 40 ml
de buffer TAE IX o 136 ml de buffer Tae
10x , pasar la agarosa a buffer y tapar de
una forma cuidadosa para evitar escape
de la sustancia .

Calentar por 30 segundos en el

microondas, hasta que la agarosa este
disuelta evitando que la sustancia
empiece a hervir posteriormente se deja
enfriar un poco sin dejar de coagular, se
adiciona a la solucin 2 l de bromuro de
etidio y agitar, colocar la solucin en la
cmara de electroforesis evitar
la
formacin de burbujas Sobre todo cerca
del peine, posteriormente se deja
polimerizar el gel durante 30 minutos en
la prctica se tienen normas de seguridad
con rigor puesto se manejan reactivos
como el bromuro de estudi que es una
sustancia altamente cancergena su
mismo manejo debe ser especial por lo
tanto hay que usar siempre guantes y
evitar manipulacin de esta sustancia
peligrosa
Preparacin de muestra
Colocar 5 l de buffer de carga,
Adicionar sobre un buffer de carga 5 l
de ADN extrado. Verificar si el contenido
de ADN esta dentro del tubo eppendorf
est completamente diluido (ADN sin
congelar), luego se observa una corrida
del gel; Una vez polimerizado el gel de
agarosa retire con cuidado el peine
adicionar la cubeta dentro de la cmara
de electroforesis colocar buffer TAE XI
hasta que la solucin sobrepase 1 mm
por encima del gel.
En el primer paso servir 5 l del tubo
(100 mg / l)y en el segundo paso servir
5 l de ADN de timo (10 mg / l). El
ADN de timo se utiliza para comprobar
que la cantidad de ADN obtenido.
Se sirve
la muestra previamente
preparada se deja asentar las muestra por
5 minutos se tapa
la cmara de
electroforesis y conectar a la fuente de
energa correr el gel a 110 V por 40
minutos
Observacin electroforticamente el
ADN

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Terminado los 40 minutos se desmonta la

cubeta de electroforesis, el gel se
transporta hasta el cuarto oscuro; se llena
el gel y la cubeta de electroforesis dentro
de un recipiente plstico. Se coloca el gel
sobre el transiluminador. Mientras
observa el ADN, dejar la cubeta dentro
del recipiente plstico se tapa el
transiluminador y en el laboratorito debe
de proteger su visin de los rayos UV con
una mscara se enciende transiluminador,
se limpia con toalla de papel el vapor
formado en el interior de la tapa del
equipo y posteriormente se observa la
calidad y cantidad de ADN finalmente se
toma un registro fotogrfico de sus
resultados y se apaga el equipo.
Descarte del gel de agarosa
Se saca el gel agarosa se limpia los
equipos se los translada el gel y la cubieta
a zona de electoforesis. Se elimina el gel
en una botella por sanidad y seguridad se
laba la cubeta, el peine y los materiales
usados en el desarrollo de esta practica,
posteriormente Almacenar el buffer TAE
IX de la camara de elestroforesis en
resipientes indicados sacar las camara de
elestroforesis y guardar con sus respectiva
fuente .
RESULTADOS

Ilustracin 1 Resultados de extraccin de ADN.

DISCUSIN
La electroforesis en gel de agarosa es un
mtodo normalizado que se utiliza para
separar, identificar y purificar fragmentos

de ADN. Se trata de una tcnica sencilla y

rpida que permite diferenciar fragmentos
de ADN que no pueden separarse
adecuadamente con otros procedimientos
(M. Somma). En nuestro caso se hizo
para para la identificar la calidad y
cantidad de ADN presente en las muestras
tomadas anteriormente a partir de
Anadara tuberculosa, como se puede
observar
en
las
5
muestras
correspondientes al nuestro grupo las
lneas patrn de solo 2 muestras fueron
bien definidas, como la separacin de fue
de fragmentos de ADN la muestras 1 y 4
se puede encontrar gran concentracin de
cidos de nucleicos y de buena calidad,
mientras que en las muestras 2, 3 y 5 no
hay una adecuada diferenciacin de estos
fragmentos
al
estar
en
menor
concentracin y los patrones se observan
difusos esto debido a que los geles de
agarosa permiten una electroforesis
rpida, pero con una resolucin limitada
por cuanto las bandas que se forman en
los geles tienen tendencia a ser difusas y a
esparcirse. (M. Somma).
El desplazamiento de los cidos nucleicos
se debe a la carga elctrica tomada por
estos segn el pH presente en la solucin
del gel. Los geles (poliacrilamida o la
agarosa) se colocan en la cubeta de
electroforesis, sumergidos en un tampn
de pH alrededor de 8. De esta forma, las
molculas de ADN sometidas a
electroforesis se desplazarn al polo
positivo ya que a pH superiores a 5
poseen carga negativa (Carmen Alicia
Padilla Pea).
La utilizacin de colorantes fluorescentes
actan mediante insercin entre las pares
de bases que conforman el cido nucleco.
El bromuro de etidio es ampliamente
utilizado para la visualizacin de ADN y
es este un reactivo altamente toxico. Sin
embrago en la actualidad existen

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colorantes fluorescentes alternativos,

como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR
Green I, Vistra Green y Syto60,
desarrollados
especficamente
para
reducir los riesgos (Duque, 2009)
La electroforesis es uno de los mtodos
de cuantificacin ms utilizados para la
separacin de molculas segn la
movilidad de estas en un campo elctrico
(Berth M, 2007), existen diferentes tipos
de electroforesis en gel los cuales tienen
una funcin de terminada como la
electroforesis en gel de muestras grandes
de ADN y ARN se efecta en geles de
agarosa, la electroforesis de protenas se
lleva a cabo en geles de poliacrilamidaSDS
(SDS-PAGE),isoelectroenfoque,
geles
nativos
o
electroforesis
bidimensional, electroforesis capilar,
electroforesis de ADN, zimografa o
zimogramas (Bandow J, 2008). Uno de
los mtodos ms usados en los ltimos
aos y gran importancia en medicina; es
la electroforesis capilar la cual presenta la
versatilidad
de
poder
separar
aminocidos, cidos orgnicos, iones
inorgnicos, carbohidratos, esteroides,
tioles,
contaminantes alimenticios,
material gentico y algunos frmacos
importantes en el estudio de diferentes
ramas en el rea de la saludo usualmente
el anlisis de los diferentes analitos puede
realizarse en unos minutos; se requiere de
pequeas
cantidades
de
muestra
(GARCA-CANAS V, 2007). En si l
electroforesis es una tcnica sensible y
altamente verstil que se encuentra
involucrada en investigacin genmica y
farmacutica, pero que adems se
expande constantemente en el diagnstico
molecular y clnico con resultados
asombrosos sin contar con las
aplicaciones forenses que de alguna
forma la hicieron saltar a la fama en sus
inicios (Jonathan J Magaa1, 2008)

CONCLUSIONES
-

La preparacin inadecuada en el
gel de agarosa la resolucin de las
bandas que se forman tiende a ser
difusas.
La composicin y la fuerza
elctrica del tampn pueden
afectar la movilidad de ADN, ya
que en ausencia de iones se
desplaza lentamente o no se
mueve, y con demasiados iones se
sobrecalienta o se funde.
Al utilizar reactivos altamente
peligroso como el caso de
bromuro de etidio para la tincin
de ADN, genera una desventaja
para esta este mtodo.
La electroforesis puede ser
utilizada mediante la tcnica de
separacin basada
en la migracin diferencial de
molculas ADN, protenas, iones
inorgnicos,
carbohidratos,
esteroides, frmacos, etc.

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