THSE

En vue de l'obtention du

DOCTORAT DE LUNIVERSIT DE TOULOUSE

Dlivr par l'Universit Toulouse III - Paul Sabatier

Discipline ou spcialit : Microbiologie Molculaire et Gntique Bactrienne

Prsente et soutenue par Hlne TREFFANDIER

Titre : Etude du phosphorelais RcsCDB/FA dEscherichia coli

JURY

M. Jean-Claude LAZZARONI Directeur de Recherche CNRS, UMG, Lyon Rapporteur

M. Francis REPOILA Charg de Recherche INRA, UBLO, Jouy en Josas Rapporteur
M. Bernard MARTIN Professeur, UPS, Toulouse Prsident du jury
M. Kaymeuang CAM Matre de Confrence, UPS, Toulouse Directeur de thse

Ecole doctorale : Biologie Sant Biotechnologies

Unit de recherche : Laboratoire de Microbiologie et Gntique Molculaires

Directeur de Thse : Kaymeuang CAM

 Rsum
Les phosphorelais histidine-aspartate constituent la voie prfrentielle de transduction
des signaux environnementaux chez les bactries et mdient un grand nombre de rponses
adaptatives diffrentes. Le systme Rcs dEscherichia coli est un phosphorelais complexe
constitu de cinq protines. Trois dentre elles sont directement impliques dans le
phosphorelais : le senseur RcsC, un intermdiaire de phosphorylation RcsD et le rgulateur de
rponse RcsB. RcsF est une lipoprotine de la membrane externe ncessaire la perception
des signaux par RcsC. RcsA potentialise lactivit du rgulateur transcriptionnel RcsB
indpendamment de la voie de phosphorylation RcsFCDB. De plus, le gne rcsA sautorgule
tout en faisant partie du rgulon RcsB. Exclusif des Entrobactries, le phosphorelais Rcs
module la formation des biofilms et la virulence de diffrents pathognes. Il est activ par des
altrations de lenveloppe et contrle 2 3 % du gnome bactrien. Cependant, le rle du
systme Rcs dans ladaptation des cellules leur environnement reste peu document.
Mon travail de thse avait pour objectifs (i) de progresser dans la connaissance du rle
du systme Rcs dans des conditions environnementales pertinentes (ii) de rationaliser la
complexit du phosphorelais Rcs et notamment dexpliquer le rle du co-facteur accessoire
RcsA au sein de la rponse Rcs (iii) de tendre vers une vision intgrative du systme par
lidentification de ses partenaires protiques.
Dans le cadre de ces objectifs, mon travail de thse a dmontr le rle essentiel du
systme Rcs pour la survie aux pHs acides, situation rencontre par lentrobactrie E. coli
dans lestomac des mammifres. Il a mis en vidence la capacit du rgulateur de rponse
RcsB agir indpendamment des autres protines du phosphorelais et interagir avec
dautres partenaires. En effet, la rsistance lacidit ncessite RcsB mais aussi le rgulateur
central de la rponse acide, GadE (publication en 1er co-auteur: Castani-Cornet &
Treffandier et al., 2007, Microbiology). Ce travail tablit par consquent une connexion entre
deux systmes de rgulation, le phosphorelais Rcs et le systme de rsistance lacide
glutamate-dpendant. Mes travaux suggrent galement que le co-facteur accessoire RcsA
affecte la cintique dexpression de lensemble des gnes du rgulon RcsB et quil permet
notamment de prolonger la rponse Rcs aprs la disparition du signal activateur du
phosphorelais. Pour finir, il apparat que la rgulation de rcsA est bien plus complexe
quinitialement suppose. En effet, mes rsultats ont mis en vidence deux niveaux de
rgulation : transcriptionnel et post-transcriptionnel.

2
 Summary

Two-component systems, also called phosphorelays are the major signalling pathways
in bacteria. They are widespread and mediate a large variety of adaptative cellular responses.
The Rcs system of Escherichia coli is a complex phosphorelay composed of five
proteins. Three of which are directly involved in the phosphorelay: the sensor RcsC, a
phosphorylation intermediate RcsD, and the response regulator RcsB. RcsF is an outer
membrane-associated lipoprotein necessary for the perception of the signal by RcsC. RcsA is
able to favour RcsBs transcriptional activity independently of the phosphorelay RcsFCDB. In
addition, the gene rcsA is part of the RcsB regulon as well being auto-regulated. Exclusive to
the Enterobacteriacae, the Rcs phosphorelay modulates biofilm formation and virulence in
several pathogens. It is activated by membrane alterations and influences expression of 2 to
3% of the bacterial genome. However, the role of the Rcs system in adaptation to the
environment remains elusive.
The three objectives of my PhD were (i) to explore further the role of the Rcs system in
adaptation to relevant environmental conditions (ii) to rationalize the complexity of the Rcs
phosphorelay and, in particular, to explain the role of the accessory co-factor RcsA in the Rcs
response (iii) to develop an integrated vision of the system through the identification of its
protein partners.
Within the framework of these objectives, my work proved that the Rcs system is
essential for resistance to low pH, a situation encountered by E. coli in mammals stomach. It
showed that the response regulator RcsB can act independently of the other Rcs proteins and
with other partners. Indeed, acid resistance requires not only RcsB but also GadE, the central
regulator of acid response (1st co-author publication: Castani-Cornet & Treffandier et al.,
2007, Microbiology). This work thus established a connexion between two regulatory
systems: the Rcs phosphorelay and the glutamate-dependant acid resistance system. My
research also suggests that the accessory cofactor RcsA modulates the kinetics of expression
of the whole RcsB regulon, in particular by prolonging the Rcs response after the
phosphorelays activating signal has stopped. To finish with, my work revealed a greater
complexity in rcsA regulation than was previously thought to exist, by showing that it is
twofold: transcriptional and post-transcriptional.

3
Introduction................................................................................................................. 7

Avant-propos...................................................................................................................... 8

Chapitre 1. Les phosphorelais His-Asp, des modles dintgration.............................. 10

I. Les connecteurs................................................................................................................ 10
I.1 Rgulation ngative des phosphorelais................................................................. 10
I.1.1 Les phosphatases....................................................................................... 11
I.1.2 Les anti-kinases......................................................................................... 13
I.1.3 Les inhibiteurs de la liaison Rgulateur de Rponse ADN.................... 13
I.1.4 Les inhibiteurs du recrutement de lARN-Polymrase.............................. 14
I.2 Rgulation positive des phosphorelais.................................................................. 15
I.2.1 Les inhibiteurs de la dphosphorylation du rgulateur de rponse.......... 15
I.2.2 Les activateurs de lactivit HK des senseurs........................................... 16
II. Rgulations croises entre phosphorelais....................................................................... 16
II.1 Le cross-talk : un phnomne limit in vivo........................................................ 17
II.2 Rgulations croises in vivo................................................................................. 18
II.2.1 Les phosphorylations croises................................................................. 19
II.2.2 La rgulation dun mme ensemble de gnes par diffrents
phosphorelais..................................................................................................... 20
III. Courbe de rponse : systmes simples vs systmes complexes..................................... 21

Chapitre 2. Le phosphorelais RcsCDB/FA dEscherichia coli...................................... 23

I. Les protines composant le phosphorelais....................................................................... 24
I.1 RcsC...................................................................................................................... 24
I.2 RcsD...................................................................................................................... 27
I.3 RcsB...................................................................................................................... 28
I.4 RcsA...................................................................................................................... 30
I.5 RcsF....................................................................................................................... 31
I.6 IgaA (YrfF)............................................................................................................ 32
II. Conservation et volution du systme Rcs..................................................................... 35
II.1 Conservation des protines Rcs........................................................................... 35
II.2 Evolution du systme Rcs.................................................................................... 36
III. Les cibles du systme Rcs............................................................................................. 37

4
 III.1 Le rgulon Rcs chez E. coli................................................................................ 37
III.2 Cas particulier de lautorgulation...................................................................... 38
III.3 Rles du systme Rcs chez E. coli et chez les autres Entrobactries............... 38
IV. Les signaux activateurs du systme Rcs........................................................................ 41
IV.1 Les mutations...................................................................................................... 42
IV.2 La surexpression de protines............................................................................ 45
IV.3 Les conditions environnementales et nutritionnelles de culture......................... 47

Rsultats....................................................................................................................... 50

Chapitre 1. Le systme Rcs est essentiel la rsistance lacidit chez E. coli........... 51

I. La rsistance lacidit chez E. coli................................................................................ 51
I.1 Le systme AR2 de rsistance lacidit glutamate-dpendant........................... 52
I.2 Rgulation gnique du systme AR2.................................................................... 53
II. Article.............................................................................................................................. 55

Chapitre 2. Rgulation du gne rcsA................................................................................ 65

I. La protine RcsA.............................................................................................................. 66
I.1 RcsA a un rle accessoire potentialisant lactivit de RcsB................................. 66
I.2 RcsA, description et mode daction...................................................................... 66
I.3 Rle biologique de RcsA....................................................................................... 68
I.4 RcsA, exemple unique ?........................................................................................ 69
I.5 Conservation.......................................................................................................... 71
I.6 Rle du co-facteur RcsA dans le dveloppement de la rponse Rcs..................... 72
II. Rsultats.......................................................................................................................... 73
II.1 Identification des dterminants ncessaires la rgulation de rcsA.................... 73
II.2 La bote RcsAB est responsable de lautorgulation de rcsA mais nest pas le 75
seul dterminant impliqu dans la rgulation de rcsA par RcsB................................
II.3 Mise en vidence dune deuxime voie majeure pour la rgulation de rcsA....... 77
II.4 Rle de RcsA dans la rponse Rcs....................................................................... 78

Chapitre 3. Identification des partenaires protiques du systme Rcs chez E. coli..... 80

I. La technique de BACTH (Bacterial Adenylate Cyclase Two Hybrid)............................ 80
II. Rsultats.......................................................................................................................... 81

5
Discussion, Perspectives................................................................................... 82

I. Le systme Rcs et la rsistance lacidit....................................................................... 83

II. Autorgulation du gne rcsA, mcanistique de la rgulation par RcsB et dfinition
des cibles RcsA-dpendantes et -indpendantes............................................................... 85
III. Recherche des partenaires protiques du systme Rcs.................................................. 90
IV. Conlusion....................................................................................................................... 90

Matriels & Mthodes.............................................................................. 92

Rfrences bibliographiques............................................................................ 97

6
Introduction

7
 Signal
ATP ADP

~P ~P
Rponse
N H C N D C
adaptative
module module module module
senseur transmetteur receveur effecteur

REGULATEUR
SENSEUR
DE REPONSE

Figure 1. Transduction du signal au sein dun systme deux composants classique.

8
 Avant-propos

Les systmes deux composants ont un rle prpondrant dans ladaptation des bactries
aux variations physico-chimiques de leur environnement. Ils permettent la perception des
signaux environnementaux et le dveloppement dune rponse approprie, en modulant le
plus souvent lexpression dun certain nombre de gnes. Ces systmes sont galement
retrouvs chez les Arches et certains eucaryotes tels que les champignons, les plantes et les
protozoaires. Plus de 4000 systmes deux composants ont t rpertoris dans 145 gnomes
bactriens squencs (Ulrich et al., 2005). Il existe une relation proportionnelle entre le
nombre de systmes deux composants et la taille du gnome bactrien (Galperin 2005).
Cette proportion varie cependant en fonction du mode de vie des micro-organismes. Elle est
plus leve chez les micro-organismes voluant dans des milieux varis et plus faible chez
ceux voluant dans un habitat stable comme des pathognes et symbiontes obligatoires
intracellulaires tels que Chlamydia, Rickettsia, Buchnera et Blochmannia ou extracellulaires
tels que Helicobacter pylori et Mycoplasma spp., ces dernires tant totalement dpourvues
de systmes deux composants (pour revue, voir Beier & Gross 2006).
Les systmes deux composants tirent leur dnomination du fait quils sont le plus
souvent composs dun couple de protines : un senseur histidine-kinase (HK), gnralement
membranaire, percevant les signaux environnementaux et un rgulateur de rponse
cytoplasmique associ (RR) permettant le dveloppement dune rponse adaptative. La
transduction du signal est ralise via un mcanisme de transfert de phosphate entre un rsidu
histidine du senseur et un rsidu aspartate du rgulateur de rponse (Parkinson & Kofoid
1992) comme schmatis sur la figure 1. Le senseur peroit le signal au niveau de son
domaine N-terminal (domaine senseur). Linformation est transduite son module
transmetteur (ou module H) via un changement conformationnel, activant la phosphorylation
dun rsidu histidine conserv partir dune molcule dATP. Le groupement phosphoryl est
alors transfr sur le module receveur (ou module D) du rgulateur de rponse sur un rsidu
aspartate conserv. Cette phosphorylation active le domaine effecteur du rgulateur de
rponse pour la mise en place de la rponse adaptative. Celle-ci est gnralement mdie par
la rgulation transcriptionnelle directe de gnes cibles par le rgulateur de rponse (pour
revues, voir Stock et al., 2000; Hoch 2000). Nanmoins, elle peut galement se matrialiser

9
Phosphorelais classique: Exemple:

~P REGULATEUR DE
SENSEUR
REPONSE

EnvZ-OmpR
H1 D2
(E. coli)
ORTHODOXE

Phosphorelais complexes:

ArcB-ArcA
H1 D1 H2 D2
(E. coli)
NON-ORTHODOXE

RcsC-RcsD-RcsB
H1 D1 H2 D2
(E. coli)
HYBRIDE

Kin-Spo0F-Spo0B-Spo0A
H1 D1 H2 D2
(B. subtilis)
ORTHODOXE

senseur HK PR HPt PR effecteur

Figure 2. Les diffrents types de phosphorelais. Dans chaque exemple, une histidine kinase
(HK) possdant un domaine senseur rpond un signal environnemental (clair rouge) en
sautophosphorylant sur un rsidu histidine (H1). Le transfert du phosphate sur laspartate
phosphorylable (D2) du rgulateur de rponse seffectue directement dans le cas des systmes
classiques. Dans les systmes complexes, le phosphorelais est ralis en trois tapes ncessitant
donc deux modules supplmentaires (D1 et H2) ports soit par le senseur, soit par dautres
protines. Selon les domaines ports par le senseur, celui-ci est qualifi dorthodoxe, non
orthodoxe ou hybride. HK: histidine-Kinase; PR: Phosphoreciever; HPt: Histidine
Phosphotransfer. Les transfert du groupement phosphoryl entre les diffrents domaines est
indiqu par des flches.

10
au niveau post-traductionnel, par action directe du rgulateur de rponse sur certaines
protines (activit enzymatique ou interaction protique) (Galperin 2006).
Plus de 75% des systmes deux composants dits classiques fonctionnent selon le
schma dcrit ci-dessus. Il en existe cependant de plus complexes tant par le nombre de
modules et de protines impliques que par le nombre dtapes ncessaires au phosphorelais
(Zhang & Shi 2005). Ces systmes complexes utilisent trois tapes de transfert (selon le
schma prsent la figure 2, HisAspHisAsp) et requirent donc un module receveur
et un module transmetteur supplmentaires. Les modules sont dnomms H1-D1-H2-D2
(dans lordre du transfert), H1 est port par le senseur et D2 par le rgulateur de rponse. Les
modules intermdiaires D1 et H2 (ou HPt pour Histidine Phosphotransfer) peuvent tre
ports par le senseur ou par dautres protines indpendantes selon diffrentes combinaisons,
bien qu ce jour, seules trois sur les huit possibles aient t observes (figure 2). Lexistence
de ces systmes complexes a conduit la dnomination plus gnrale de phosphorelais
histidine-aspartate pour dsigner les systmes deux composants. Les exemples de
phosphorelais His-Asp rpertoris chez les eucaryotes appartiennent cette catgorie
complexe, tels le systme Sln1p-Ypd1-Ssk1p de Saccharomyces cerevisae (Posas et al.,
1996) ou les systmes de perception de lthylne et des cytokinines des plantes comme
Arabidopsis thaliana (pour revue, voir To & Kieber 2008), Zea mays (le mas, Asakura et al.,
2003) et Oriza sativa (le riz Du et al., 2007). Les donnes phylogniques indiquent que les
systmes complexes bactriens sont lorigine des systmes eucaryotes (Koretke et al.,
2000; Thomason & Kay 2000) et quil nexiste pas danctre commun aux senseurs hybrides
des systmes complexes. Ceux-ci se seraient dvelopps par recrutement latral de domaines
supplmentaires (Zhang & Shi 2005).
Escherichia coli compte 29 histidine-kinases, 32 rgulateurs de rponse et une protine
isole portant un domaine HPt (Mizuno 1997), rpartis en 23 systmes deux composants
classiques, 5 phosphorelais complexes et 4 rgulateurs de rponse orphelins. Au cours de ma
thse, je me suis intresse lun des cinq phosphorelais complexes, le systme RcsCDB/AF.

11
 CHAPITRE 1. Les phosphorelais His-Asp, des modles dintgration

Les phosphorelais His-Asp, bien quils rpondent chacun des signaux spcifiques,
peuvent tre connects un rseau de rgulation plus vaste. Cette intgration est opre par
des rgulations croises, directes ou indirectes agissant au niveau transcriptionnel ou post-
transcriptionnel. Elles permettent notamment de moduler les rponses adaptatives les unes par
rapport aux autres, certaines tant indissociables et dautres incompatibles. Ce chapitre
abordera les diffrents moyens mis en place par la cellule pour rguler les phosphorelais de
manire intgre. Nous nous poserons galement la question de lintrt volutif des systmes
complexes, majoritaires chez les plantes et les eucaryotes infrieurs. Intuitivement, il semble
raisonnable de penser que le nombre accru de modules, de partenaires et dtapes dans le
phosphorelais largit les possibilits de rgulation, permettant par exemple de moduler le
niveau dactivation du phosphorelais en rponse des signaux de nature diffrente. Nous
verrons galement que la dynamique des systmes complexes est intrinsquement diffrente
de celle des systmes simples.

I. Les connecteurs

Les rgulateurs de rponse sont activs par phosphorylation (pour revues, Hoch 2000; Gao
et al., 2007). Leur action dpend donc la fois de leur senseur HK partenaire mais aussi de
tout facteur cellulaire capable de moduler leur phosphorylation. Lactivit de ces effecteurs,
potentiellement rgule par des signaux diffrents de ceux du phosphorelais cible, permet des
rgulations croises avec dautres systmes de rgulation. Le terme de connecteurs est
utilis pour dsigner ces effecteurs qui connectent un phosphorelais une voie de rgulation
diffrente (pour revue, Mitrophanov & Groisman 2008). Les connecteurs peuvent agir sur les
phosphorelais simples comme sur les systmes complexes mais, comme lillustreront les
exemples ci-dessous, ces derniers offrent plus de possibilits de rgulation.

I.1 Rgulation ngative des phosphorelais

Le cycle cellulaire de Bacillus subtilis est caractris par 3 tats physiologiquement

distincts, dpendants des conditions de croissance. Un tat correspondant une croissance

12
 Blocage de la rplication
Milieu riche en nutriments

Induction de la comptence (ComA)

PhrE Transition phase exponentielle/phase stationnaire

PhrH Induction de la comptence (ComK)

Conditions inhibant la sporulation

Activation des gnes de

sporulation

Conditions inhibant la sporulation

Figure 3. Rgulation du phosphorelais Spo0 de B. subtilis par les connecteurs. Les protines Sda
et KipI bloquent lactivation du phosphorelais en empchant lautophosphorylation de KinA. RapA,
RapB, RapE, et RapH induisent la dphosphorylation de Spo0F~P; Spo0E, YisI, et YnzD en font de
mme avec le rgulateur de rponse Spo0A~P. Lexpression de ces effecteurs est contrle par
diffrents facteurs tels que les conditions de croissance, ltat de la machinerie de rplication et le
dveloppement de la comptence (via laction de ComA et ComK, rgulateurs centraux des gnes de
comptence). Daprs Mitrophanov & Groisman 2008.

13
vgtative dans des conditions favorables, un tat de comptence la transformation lors de la
transition phase exponentielle/phase stationnaire de croissance et un tat de sporulation dans
un milieu dfavorable. Lanalyse des lments essentiels au dveloppement de la sporulation
a conduit lidentification du premier phosphorelais complexe, le systme Spo0 (Burbulys et
al., 1991). Son tude a t lorigine de nombreuses donnes sur la rgulation ngative des
phosphorelais par des lments extrieurs (figure 3). Le phosphorelais Spo0 se compose de
cinq kinases alternatives KinA, KinB, KinC, KinD et KinE, dun domaine receveur isol (D1)
Spo0F, dun domaine HPt (H2) port par Spo0B et dun rgulateur de rponse Spo0A (pour
revue, Piggot & Hilbert 2004).

I.1.1 Les phosphatases

Spo0E, YisI, et YnzD sont des phosphatases de la famille multignique Spo0E dont la
cible commune est la forme phosphoryle du rgulateur de rponse Spo0A (Spo0A~P). La
surproduction de Spo0E, YisI ou YnzD inhibe la sporulation. Inversement, labsence des
phosphatases, seules ou en combinaison, comme dans les souches spo0E ou yisIynzD,
potentialise la capacit sporuler, en accord avec le rle dterminant de Spo0A~P dans le
dveloppement de la sporulation (Perego & Hoch 1991; Perego 2001; Perego & Brannigan
2001). La sporulation est induite par Spo0A~P en conditions dfavorables la croissance
vgtative ou la comptence, gnralement lors de svres carences en nutriments. La
production et lactivit des phosphatases ciblant Spo0A~P sont donc modules par les
conditions de croissance. Ainsi, mme si lexpression de chaque phosphatase rpond plus
particulirement certaines conditions environnementales, elle est globalement stimule dans
des conditions dfavorables la sporulation, afin de maintenir un niveau de Spo0A~P faible.
Lintermdiaire portant le domaine receveur D1, Spo0F~P est galement la cible de
phosphoaspartate-phosphatases qui stimulent son activit intrinsque
dautodphosphorylation (voir figure 3). Ce sont les protines RapA, RapB, RapE et RapH de
la famille Rap (Response-regulator aspartate phosphatases) (Perego & Brannigan 2001; Smits
et al., 2007). Le transfert de phosphate de Spo0F~P Spo0A via le domaine HPt (H2) de
Spo0B tant rversible, la dphosphorylation de Spo0F entrane celle de Spo0A~P (figure 3).
Les gnes rap sont rguls transcriptionnellement et post-transcriptionnellement en fonction
des conditions environnementales (Ishikawa et al., 2002). Au niveau transcriptionnel, leur
expression est active lors du dveloppement de la comptence, prvenant ainsi le
dveloppement de la sporulation en diminuant le niveau de Spo0A~P. Cette activation

14
NarXL et NarQP Nitrates
TorSR ou TMAO e-

Ubiquinol Ubiquinone

FAD FADH2

Succinate Fumarate
Micro-oxie
Sdh
Pi
SixA
ADP
ATP

~P ~P ~P ~P
senseur H1 D1 HPt D2 effecteur sdhCDAB

ArcB ArcA

Figure 4. Rgulation du systme ArcB-ArcA dE. coli par une phosphohistidine-phosphatase, SixA.
La protine SixA dphosphoryle le domaine HPt du senseur non orthodoxe ArcB lors de la prsence
daccepteurs finaux dlectrons tels que les nitrates ou le TMAO, levant la rpression exerce sur lopron
sdhCDAB et permettant la respiration anarobie. SixA, en rpondant aux signaux induisant les
phosphorelais TorSR, NarXL et NarQP, connecte ceux-ci avec le phosphorelais ArcBA.

15
transcriptionnelle de rapA et rapE est ralise par le rgulateur cl de la comptence, ComA,
rgulateur de rponse du systme deux composant ComP-ComA (Mueller et al., 1992; Jiang
et al., 2000). La transcription de rapB est contrle par AbrB dont la rpression est leve
lentre en phase stationnaire (Perego et al., 1994). rapH, est induit par le rgulateur central
tardif de la comptence, ComK (Smits et al., 2007). Au niveau post-transcriptionnel, RapA,
RapE et RapH sont inhibes par la fixation de pentapeptides spcifiques PhrA, PhrE et PhrH,
respectivement (Smits et al., 2007). RapB est la seule protine de la famille Rap (avec RapJ)
ne pas possder de pentapeptide Phr spcifique, son action sur Spo0F nest donc pas rgule
post-transcriptionnellement (Perego & Brannigan 2001). Les pentapeptides Phr sont eux-
mmes rguls en fonction des conditions environnementales telles que la transition phase
exponentielle/phase stationnaire. Ces diffrents niveaux de rgulation convergent encore une
fois vers une diminution de la quantit de Spo0A~P lorsque les conditions environnementales
sont favorables la comptence, vitant le dclenchement de la sporulation.
Le domaine HPt dun phosphorelais peut tre aussi la cible de phosphatases extrieures.
Cest le cas du senseur hybride ArcB qui est dphosphoryl par la protine SixA dans
certaines conditions. SixA est la premire phosphohistidine-phosphatase dcouverte
implique dans un phosphorelais His-Asp (figure 4) (Ogino et al., 1998). Le phosphorelais
ArcB-ArcA est ncessaire la croissance en anarobiose chez E. coli. En conditions
danarobiose (faible concentration extracellulaire en oxygne), le rgulateur de rponse
ArcA~P inhibe la transcription de lopron sdhCDAB codant pour la succinate
dshydrognase, enzyme de la chane respiratoire qui couple loxydation du succinate dans le
cycle de Krebs la rduction de lubiquinone dans la membrane. Nanmoins, lorsque des
accepteurs finaux dlectrons sont prsents dans le milieu, tels que les nitrates ou le
trimthylamine N-oxide (TMAO), cette rpression est leve par SixA qui dphosphoryle le
domaine HPt de ArcB (Matsubara & Mizuno 2000), diminuant ainsi le pool de ArcA~P et
permettant la mise en place de la respiration anarobie partir de succinate comme donneur
dlectrons primaire. Bien quon ne sache pas comment SixA peroit le signal nitrates ou
TMAO , ces donnes prouvent quelle permet de moduler lactivit du systme ArcB-ArcA
en rponse des molcules connues pour activer dautres phosphorelais tels que les systmes
Nar (nitrates) ou Tor (TMAO).

16
 Concentration
extracellulaire en azote

~P

~P

Gnes cibles
dassimilation de lazote

Figure 5. Modle de lexpression des gnes requis pour la respiration et lassimilation de

lazote chez S. meliloti. Lorsque les concentrations extracellulaires (bactriennes) en azote
deviennent importantes, FixT, induit par AsnO, inhibe lautophosphorylation de FixL, rprimant
lexpression des gnes dassimilation de lazote par le symbiote.

17
 I.1.2 Les anti-kinases

Au sein du phosphorelais Spo0 de B. subtilis, le senseur KinA est rgul ngativement par
KipI (Kinase inhibitor protein) et Sda (suppressor of dnaA) (Wang et al., 1997; Burkholder et
al., 2001) (figure 3). Ces protines, en se fixant au domaine H1 de KinA, empchent
lchange du groupement phosphoryl entre lATP et lhistidine 405 de KinA (ou sa
dphosphorylation si la phosphorylation a dj eu lieu). Cette inhibition allostrique implique
deux monomres de KipI ou Sda se fixant chacun de part et dautre du dimre de KinA, au
niveau dun site centr sur une proline situe 5 rsidus de lhistidine 405 (Whitten et al.,
2007; Jacques et al., 2008). En revanche, KipI et Sda naffectent pas le transfert du phosphate
de KinA~P Spo0F et nactivent pas la dphosphorylation de KinA (Wang et al., 1997;
Rowland et al., 2004). La transcription de sda est induite lorsque la rplication est perturbe
ou lors de dommages lADN. Laction ngative de Sda sur KinA empche donc la mise en
place du programme de sporulation lors dun dfaut de la machinerie de rplication afin
dviter de gnrer des spores sans ou portant un chromosome altr (Burkholder et al., 2001;
Ruvolo et al., 2006). Lexpression de kipI est induite par la prsence de sucres, interdisant
linitiation de la sporulation en conditions favorables la croissance (Wang et al., 1997).
Chez le symbiote de plantes Sinorhizobium meliloti, le systme deux composants FixL-
FixJ est responsable de la fixation de lazote par les bactries du nodule en condition
dhypoxie (Fischer 1994). Lautophosphorylation du senseur FixL en rponse aux faibles
concentrations en oxygne est inhibe par la protine FixT, elle-mme rgule par le gne
asnO (Garnerone et al., 1999; Bergs et al., 2001) (figure 5). La rgulation du gne asnO est
encore mconnue mais les auteurs proposent quil relie le systme FixJL aux concentrations
extracellulaires en azote via FixT, permettant dadapter lactivit dassimilation de lazote par
le symbiote aux besoins de la plante (Bergs et al., 2001).

I.1.3 Les inhibiteurs de la liaison Rgulateur de Rponse ADN

Chez B. subtilis, la comptence est induite lentre en phase stationnaire. La synthse du

rgulateur central de la comptence, ComK, est induite indirectement par la phosphorylation
du rgulateur de rponse ComA par son senseur HK partenaire, ComP. En effet, ComA~P
active transcriptionnellement comS dont le produit protge ComK de la protolyse, lui
permettant dexprimer les gnes de comptence (figure 6) (pour revue, Claverys et al., 2006).
La liaison de ComA~P lADN en amont de comS est inhibe par les protines RapC, RapF

18
 Transition phase exponentielle
/phase stationnaire

Induction de la comptence (ComK)

Stress denveloppe/stress thanol/carence en phosphate

ComS
Activation de la
comptence

ComK

Figure 6. Rgulation de la comptence chez B. subtilis par les connecteurs. Les protines RapC,
RapF et RapH inhibent la liaison de ComA~P lADN en amont du gne comS. Elles sont elles mmes
rgules en fonction des conditions mtaboliques via les peptides Phr. Spx lie l-CTD de lARN-
Polymrase, lempchant dinteragir avec ComA~P pour la transcription de ses gnes cibles (ici, comS
pour lexemple). Daprs Mitrophanov & Groisman 2008.

19
et RapH. Ces trois protines ne dphosphorylent pas ComA~P mais lient spcifiquement le
domaine C-terminal de ComA, quelque soit son tat de phosphorylation, inhibant le domaine
effecteur de liaison lADN de manire allostrique (Core & Perego 2003; Bongiorni et al.,
2005; Smits et al., 2007). Notons que dans ce cas, le mode daction de RapH est diffrent de
celui employ envers Spo0F (c.f I.1.1 phosphatases). RapH possde donc deux activits
phosphatase ou inhibiteur allostrique faisant delle un cas unique au sein de la famille Rap
(Smits et al., 2007). Lactivit des protines RapC, RapF et RapH est antagonise par la
fixation de pentapeptides spcifiques de chacune dentre elles, PhrC, PhrF et PhrH. En se liant
aux protines Rap, ces peptides les empchent dinteragir avec ComA (Lazazzera et al., 1999;
Core & Perego 2003). Les gnes rap et phr sont gntiquement lis et organiss sous forme
doprons au sein desquels chaque gne phr possde la plupart du temps son propre
promoteur, induit lentre en phase stationnaire (McQuade et al., 2001). La rgulation post-
transcriptionnelle des protines Rap par les pentapeptides Phr permet donc une leve
dinhibition de ComA~P lentre en phase stationnaire, en accord avec les conditions
favorables au dclenchement de la comptence. Seul le couple rapH/phrH est transcrit sous
forme dun ARNm unique (Hayashi et al., 2006). phrH est donc soumis la mme rgulation
que rapH, savoir une activation par ComK, permettant la fois un rtrocontrle ngatif (via
RapH) et positif (via PhrH) sur le dclenchement de la comptence.

I.1.4 Les inhibiteurs du recrutement de lARN-Polymrase.

Les activateurs transcriptionnels fonctionnent gnralement en recrutant lARN-

Polymrase au travers dinteractions avec les diffrentes sous-units de celle-ci. Certaines
protines peuvent empcher ces interactions. Cest le cas de la protine Spx de B. subtilis qui,
en liant l-CTD de lARN-Poymrase, lempche dinteragir avec les rgulateurs de rponse
ComA, activateur de la comptence, et ResD qui active les gnes rpondant une carence en
oxygne (M M Nakano et al., 1996; Shunji Nakano et al., 2003) (figure 6). Lexpression de
spx est active par des stress denveloppe, le stress alcoolique, le stress oxydatif ou la carence
en phosphate (Antelmann et al., 2000; Shunji Nakano et al., 2003; Thackray & Moir 2003;
Eiamphungporn & Helmann 2008). Ainsi, en conditions extrmes, Spx permettrait dinhiber
des processus tels que la comptence et la croissance au profit des mcanismes indispensables
de rsistance aux stress.
Chez E. coli, la protine TorI interagit avec le domaine effecteur du rgulateur de rponse
TorR, lempchant de recruter lARN-Polymrase pour la transcription des gnes ncessaire

20
 Kinases (~P)
Transition phase exponentielle/
phase stationnaire

Activation de la
comptence
Spo0F (~P) RapH
RapE
RapA ComK
RapB
Spo0B (~P)
Initiation de la
sporulation
ComA ComS

Spo0A (~P) AbrB

RapC Transition phase exponentielle/

Conditions dinhibition
de la sporulation
RapF phase stationnaire
Spo0E
YisI
YnzD

Figure 7. Schma rcapitulatif du lien entre les systmes dinitiation de la sporulation et du

dclenchement de la comptence en fonction des conditions environnementales. En bleu, les
rgulations transcriptionnelles; en noir, les rgulation post-traductionnelles; en vert, les rgulations
environnementales.

Figure 8. Rgulations croises directe et indirecte. A. Schma de la rgulation croise entre

les deux systmes PhoQ-PhoP et PmrB-PmrA via le connecteur PmrD. B. Modle exprimental
de la rgulation directe du gne pbgP par deux phosphorelais. Daprs Kato et al., 2007.

21
lutilisation du TMAO pour la respiration en conditions anarobies (Ansaldi et al., 2004).
TorI nest pas seulement ddie rprimer TorR, elle appartient galement une famille
atypique dexcisionases de phages (Elantak et al., 2005). Sa rgulation est encore inconnue
mais le fait que les gnes torR et torI soient transcrits indpendamment suggre que TorI
agisse comme un connecteur modulant lactivit de TorR en rponse des signaux diffrents
de ceux perus par le senseur partenaire de TorR, TorS.

Lexemple du phosphorelais Spo0 de B. subtilis prsent dans cette section illustre

lavantage volutif de la complexification : elle offre un nombre lev de points de contrle,
permettant le basculement entre diffrents tats physiologiques (comptence, croissance
vgtative ou sporulation) selon les conditions environnementales (figure7).

I.2 Rgulation positive des phosphorelais

I.2.5 Les inhibiteurs de la dphosphorylation du Rgulateur de Rponse

Chez S. enterica, le senseur PmrB phosphoryle son rgulateur de rponse PmrA en

rponse des concentrations extracellulaires leves en Fe3+ ou en Al3+ (Wsten et al., 2000)
ou en rponse des pH moyennement acides (Perez & Groisman 2007). Ce systme gouverne
notamment la rsistance la polymyxine B (Wsten et al., 2000). En absence de signal, PmrB
exerce une activit phosphatase sur PmrA, empchant ainsi la mise en place dune rponse
non requise. Nanmoins, PmrA~P peut tre protg de cette dphosphorylation par la liaison
de la protine PmrD son domaine receveur N-terminal (Kato & Groisman 2004) (figure 8A).
Lexpression de pmrD est induite par un autre systme deux composants, PhoQ-PhoP, en
rponse des concentrations faibles en Mg2+ (Kox et al., 2000). Ainsi, la connexion ralise
par PmrD permet S. enterica dtre rsistante la polymyxine B en rponse au signal Fe3+
peru par PmrB mais aussi en conditions de carence en Mg2+ activant le systme PhoQ-PhoP.
De plus, une tude gntique et mathmatique a montr que la cintique dexpression des
cibles tait diffrente selon la voie de rgulation implique (Kato et al., 2007). Ainsi, en
modifiant la rgion promotrice du gne pbgP, les auteurs ont pu comparer la cintique
dexpression de ce gne rgul, soit directement par le systme PhoQ-PhoP (figure 8B), soit
par PhoQ-PhoP via PmrD et PmrA~P (condition sauvage, figure 8A). La voie PmrD permet
une expression plus leve et plus durable illustrant un des intrts de cette rgulation croise.

22
 ?

b1500

Figure 9. Activation dun senseur HK par un connecteur. La protine B1500 dE. coli connecte les
systmes EvgS-Evga et PhoQ-PhoP en induisant lactivit histidine-kinase du senseur PhoP en rponse
EvgA~P. Daprs Eguchi et al., 2007.

A. B.

Figure 10. Cross-talk versus systmes branchs. A. Schma dun cross-talk. B. Schma de systmes
branchs. HK, histidine-kinase; RR, rgulateur de rponse. Daprs Goulian & Laub 2007.

23
 I.2.6 Les activateurs de lactivit HK des senseurs

Chez E. coli, le systme deux composants EvgS-EvgA est responsable de linduction du

gne b1500 qui code pour une protine membranaire capable dinteragir et dactiver le
senseur PhoQ (Eguchi et al., 2007). PhoQ activ par B1500 phosphoryle PhoP qui transcrit
alors ses gnes cibles en rponse aux conditions activatrices encore inconnues du systme
EvgS-EvgA (figure 9).

Ces diffrents exemples montrent que, grce ces connecteurs extrieurs, les
phosphorelais sont imbriqus dans un vaste rseau de rgulation permettant la modulation de
processus mtaboliques les uns par rapport aux autres. Bien quon retrouve ces connecteurs
associs aux systmes simples comme aux systmes complexes, leur capacit cibler toutes
les tapes du phosphorelais explique en partie lintrt volutif des systmes complexes,
comme lillustre la rgulation du phosphorelais Spo0 de B. subtilis.

II. Rgulations croises entre phosphorelais

Les composants des phosphorelais appartiennent diffrentes familles de gnes dont

chaque membre possde des similarits de squence et de structure avec les autres.
Lhomologie de ces diffrentes protines est en faveur dventuelles communications croises
(ou cross-talk ) entre phosphorelais, i.e le senseur dun systme deux composants
pourrait phosphoryler un rgulateur de rponse autre que son partenaire habituel. Dans les cas
des phosphorelais complexes, le nombre plus important de protines impliques augmente les
possibilits de ces ventuels partenariats.
Cette notion de cross-talk a t prcise par Goulian et Laub (2007). Ils la dfinissent
comme une communication entre deux voies de signalisation qui, une fois limine, laisse
intactes et fonctionnelles les deux voies (figure 10A). Ils prcisent que le cross-talk est
gnralement dsavantageux pour la cellule mais que dans certains cas o la cellule peut en
tirer profit, le terme employ est cross-rgulation . Il faut galement diffrencier cross-talk
et systmes branchs (figure 10B). Ceux-ci font en effet intervenir plusieurs rgulateurs de
rponse pour une histidine kinase (e.g le systme Che dE. coli) ou, inversement, des kinases
alternatives (e.g le systme Spo0 de B. subtilis) mais constituent une seule et mme voie de
signalisation.

24
A. Souche sauvage B. vanS C. vanSphoB

Figure 11. Les diffrents mcanismes mis en place par la cellule pour viter les cross-talk. Exemple
des phosphorelais PhoR-PhoB et VanS-VanR (c.f texte). A. Dans les cellules sauvages, toute
phosphorylation de VanR par le senseur non partenaire PhoR est limine par lactivit phosphatase du
senseur bifonctionnel VanS. B. La dltion de vanS induit donc une augmentation du phnomne de
cross-talk de PhoR vers VanR (reprsent par une flche discontinue paissie). C. La comptition entre
le rgulateur de rponse partenaire et les autres est aussi un moyen de limiter le cross-talk. La dltion
de phoB (additionne celle de vanS) illustre bien cet exemple puisque dans un double mutant
vanSphoB, le cross-talk PhoR-VanR est encore augment (flche discontinue encore plus paisse).
Daprs Goulian & Laub 2007.

25
Bien quil soit souvent fait allusion lexistence de ces cross-talk et quil soit possible de
les recrer in vitro, on ne sait pas sils ont rellement lieu in vivo ni dans quelle proportion. Il
semblerait raisonnable que limportance de ce phnomne soit minimale afin que la cellule
puisse continuer dvelopper des rponses adaptes un signal prcis. Les bactries ont
dailleurs mis au point un certain nombre de mcanismes pour viter ces communications
croises dsavantageuses. Pourtant, dans certaines conditions, un organisme peut avoir intrt
utiliser le cross-talk pour largir le panel de stimuli entranant une mme rponse ou,
linverse, pour mettre en place plusieurs rponses diffrentes suite la perception dun signal
unique.

II.1 Le cross-talk, un phnomne limit in vivo

Plusieurs tudes in vitro ont montr lexistence de cross-talk entre phosphorelais. Une
analyse systmatique des profils de transcription (Oshima et al., 2002) ou des phnotypes de
croissance (Zhou et al., 2003) de diffrents mutants dE. coli dlts pour lun des 30
phosphorelais prouve clairement que, dans ces conditions, plusieurs voies de signalisation
peuvent tre relies. Yamamoto et collaborateurs (2005) rapportent lexistence de 22 cross-
talk sur 692 tests dassociation entre 21 HK et 34 RR non partenaires chez E. coli.
Nanmoins, il est trs difficile de quantifier la relle occurrence de ces phnomnes in vivo.
Plusieurs cas de cross-talk ont t rapports in vivo mais jamais en contexte physiologique, i.e
sans que les paramtres critiques, tels que le senseur ou le rgulateur de rponse, ne soient
muts ou surexprims (Parkinson & Kofoid 1992), laissant douter de leur significativit. Par
exemple, chez E. coli, le senseur kinase VanS du systme VanS-VanR peut phosphoryler le
rgulateur de rponse PhoB. Cependant, cela nest observable quen absence du senseur
partenaire de PhoB, PhoR (Fisher et al., 1995; Silva et al., 1998). Inversement, VanR peut
tre phosphoryl par PhoR uniquement lorsque VanS est mut (Haldimann et al., 1997; Silva
et al., 1998) (figure 11B). Une recherche systmatique de cross-talk entre quatre
phosphorelais dE. coli, UhpB-UhpA, NtrB-NtrC, PhoR-PhoB et ArcB-ArcA a t
infructueuse dans une souche sauvage (Verhamme et al., 2002). En revanche, en absence de
lhistidine-kinase / phosphatase NtrB, les auteurs ont observ la phosphorylation de NtrC par
UhpB et PhoR.

26
 Ces rsultats suggrent quin vivo le cross-talk est limit, et que cette limitation est due
la fois la spcificit du couple senseur / rgulateur de rponse et lactivit phosphatase du
senseur envers son rgulateur de rponse.
Les motifs lorigine de la spcificit du couple HK/RR ont t rcemment identifis par
analyse in silico de la co-volution des couples HK/RR (Skerker et al., 2008). Il sagit dun
cluster dacides amins situ juste en aval du site H1. Quant aux senseurs ne possdant pas
dactivit phosphatase, on peut imaginer quils soient prfrentiellement impliqus dans des
phosphorelais utilisant des kinases multiples (dont certaines possderaient une activit
phosphatase, Alves & Savageau 2003), ou quil existe des phosphatases additionnelles. Cest
le cas de CheZ chez E. coli (pour revue, Stock et al., 2000).
Le cross-talk PhoR VanR dcrit prcdemment nest pas seulement augment en
absence du senseur VanS mais aussi en absence du rgulateur de rponse PhoB (figure 11C)
(Silva et al., 1998). De la mme manire, une tude rcente sur les systmes CpxA-CpxR et
EnvZ-OmpR dE. coli montre que le cross-talk de la kinase CpxA envers le rgulateur de
rponse OmpR require labsence du senseur EnvZ et du rgulateur de rponse CpxR.
Rciproquement, le cross-talk dEnvZ envers CpxR ncessite labsence du senseur CpxA et
du rgulateur de rponse OmpR (Siryaporn & Goulian 2008). Ces donnes suggrent que la
stoechiomtrie senseur / rgulateur de rponse est un autre moyen de limiter les cross-talk. La
faible proportion dhistidine kinase par rapport aux rgulateurs de rponse limiterait les
phosphorylations croises (e.g 100 molcules de EnvZ par cellule dE. coli contre 3500
molcule du senseur partenaire OmpR, Cai & Inouye 2002). En effet, la spcificit du couple
senseur rgulateur de rponse est telle que le senseur va agir en priorit sur son rgulateur
de rponse partenaire. On peut considrer que la forte proportion dun rgulateur de rponse
particulier titre lactivit de son senseur partenaire. En accord avec cette hypothse, la
surproduction du senseur HK augmente le phnomne de cross talk dans diffrents travaux
(Ninfa et al., 1988; Igo et al., 1989).

II.2 Rgulations croises in vivo

Malgr les diffrents mcanismes permettant de limiter le cross-talk in vivo, il existe

quelques exemples de rgulations croises en contexte sauvage. On distinguera les
phosphorylations croises et la rgulation dun mme ensemble de gnes par plusieurs
phosphorelais.

27
 ? Carence en phosphate

Nitrates Nitrites

YycG P P PhoR

NarX P P NarQ

YycF PhoP
YycF PhoP
P P
NarL NarP
NarL NarP
P P

Figure 12. Cross-phosphorylation entre les
phosphorelais NarX-NarL et NarQ-NarP dE.
coli. C.f texte
yocH
Figure 13. Cross-phosphorylation entre le senseur
PhoR du systme PhoR-PhoP et le rgulateur de
rponse YycF de B. subtilis. C.f texte

OmpC

OmpF

Figure 14. Cross-phosphorylation entre le senseur ArcB et le rgulateur de rponse OmpR.

C.f texte. Daprs Wadhams & Armitage 2004.

28
 II.2.1 Les phosphorylations croises

En conditions anarobies, E. coli peut utiliser les nitrates ou les nitrites comme accepteurs
dlectrons dans la chane respiratoire. La rgulation des gnes impliqus dans ce processus
est contrle par deux phosphorelais, NarX-NarL et NarQ-NarP (Stewart 2003). Le senseur
NarX phosphoryle NarL en rponse aux nitrates (figure 12). Le senseur NarQ est stimul
aussi bien par les nitrates que par les nitrites et phosphoryle les deux rgulateurs de rponse
(Stewart & Bledsoe 2003). Cest donc NarX qui est responsable de la discrimination entre le
stimulus nitrates et le stimulus nitrites afin de moduler en consquence lexpression
des gnes cibles des systmes Nar. Les sites de fixation des rgulateurs de rponse NarP et
NarL ne prsentent pas de diffrence de squence. Nanmoins, NarP et NarL se lient ces
sites avec des affinits diffrentes et NarL possde des sites propres qui ne sont pas reconnus
par NarP (Darwin et al., 1997). Ces donnes indiquent de multiples interactions entre ces
deux systmes la fois en terme de cross-phosphorylation mais aussi en terme de rgulation
diffrentielle des gnes dun mme rgulon. Cette rgulation croise permet une rponse
adapte aux variations de concentration extracellulaire en nitrates (Stewart 2003).
Chez B. subtilis, il existe une rgulation croise entre le systme deux composants
PhoR-PhoP de rponse aux carences en phosphate et le systme essentiel YycG-YycF
impliqu dans le mtabolisme de la paroi cellulaire (figure 13) (Howell et al., 2003; Dubrac et
al., 2007). La transcription du gne yocH est stimule lors de carences en phosphate. Cette
induction require le senseur PhoR mais ne dpend pas de son rgulateur de rponse
partenaire PhoP. Par contre, lexpression du gne yocH est sensible au niveau intracellulaire
du rgulateur de rponse YycF que PhoR est capable de phosphoryler in vitro et in vivo. En
revanche, aucune phosphorylation de PhoP par YycG nest dtectable in vitro. La cross-
phophorylation de YycF par PhoR en conditions limitantes en phosphates est observe dans
des souches sauvages o (i) lexpression de yycFG ou phoPR na pas t modifie et (ii) en
prsence du senseur partenaire de YycF, YycG. Ces donnes dmontrent lexistence, in vivo,
dune rgulation croise entre PhoR et YycF en rponse aux faibles concentrations en
phosphate (Howell et al., 2006).
Chez E. coli, il semble exister une rgulation croise entre les systmes ArcB-ArcA et
EnvZ-OmpR (figure 14) (Matsubara et al., 2000). Le systme ArcB-ArcA est responsable de
la modulation des gnes impliqus dans la transition entre croissance arobie et croissance
anarobie (Sawers 1999). Le systme EnvZ-OmpR rgule lexpression de nombreux gnes en
rponse losmolarit du milieu, dont ceux codant pour les porines OmpF et OmpC (Cai &

29
 Carence en azote Azote, ure

NtrB P P NtrY

?
NtrC NtrX
NtrC NtrX
P P

Fixation de
lazote

Figure 15. Phosphorylation croise entre lhistidine-kinase NtrY et le rgulateur de rponse NtrC
de R. capsulatus. C.f texte.

Figure 16. Connexion des phosphorelais PhoQP, PmrBA et RcsCDBAF chez Salmonella enterica.
Le gne ugd possde des sites de fixation pour les rgulateurs de rponse PmrA~P et RcsB~P associ
son cofacteur RcsA. Le systme PmrBA est galement connect au phosphorelais PhoQP via la protine
PmrD. La transcription du gne ugd peut donc tre induite par trois types de signaux diffrents. Daprs
Bijlsma & Groisman 2003.

30
Inouye 2002). Plusieurs donnes suggrent quOmpR puisse tre phosphoryl par ArcB. Des
cellules cultives en anarobie prsentent une expression accrue de la porine OmpC et une
expression diminue de OmpF, concordant avec lactivation dOmpR par phosphorylation.
Ces phnotypes sont observs en absence du senseur partenaire, EnvZ, suggrant que OmpR
soit phosphoryl par une autre voie. La surexpression du domaine HPt du senseur hybride
ArcB en conditions arobies induit les mmes effets quune anarobiose, savoir une
augmentation de OmpC et une diminution de OmpF, de manire indpendante de la prsence
de son rgulateur de rponse partenaire ArcA. In vitro, ArcB peut phosphoryler ArcA et
OmpR mais pas les autres rgulateurs de rponse tests, UvrY ou KdpE. Dans lensemble, ces
rsultats suggrent fortement lexistence dune phosphorylation croise entre ArcB et OmpR
(Matsubara et al., 2000). Pour finir, ArcB semble capable de phosphoryler in vivo le
rgulateur de rponse orphelin RssB, impliqu dans le contrle de la stabilit du facteur
gnral de stress RpoS (Mika & Hengge 2005).
Un autre exemple de rgulation croise entre phosphorelais est trouv chez Rhodobacter
capsulatus lors de la rgulation du mtabolisme de lazote (Drepper et al., 2006). Le systme
deux composants NtrB-NtrC rgule les gnes impliqus dans lassimilation et la fixation de
lazote. Les cellules dpourvues de rgulateur de rponse NtrC ne sont pas capables de
pousser en prsence de N2 ou dure comme source dazote alors que les cellules dpourvues
du senseur NtrB le peuvent. Des cellules mutes pour ntrB et ntrY, un gne codant pour une
autre histidine-kinase, ne sont plus capables de pousser dans de telles conditions, prouvant
que ces deux senseurs sont capables de phosphoryler NtrC in vivo. Le gne ntrY forme un
opron avec le gne ntrX codant pour un rgulateur de rponse. Cette organisation gnique
laisse penser que NtrX est le rgulateur de rponse associ NtrY et que la phosphorylation
de NtrC par ce dernier est le reflet dune communication croise (figure 15).

II.2.2 La rgulation dun mme ensemble de gnes par diffrents phosphorelais

Chez Salmonella, les rgulateurs de rponse RcsB et PmrA peuvent tous deux activer les
gnes ugd et wzz ncessaires la synthse dexopolysaccharides (EPS) (Mouslim & Groisman
2003; Delgado et al., 2006). RcsB et PmrA sont phosphoryls par des voies indpendantes
mais rgulent certains gnes cibles communs en se fixant des motifs ADN diffrents au
niveau des promoteurs (figure 16). Un exemple de rgulation croise de ce type, a t dcrit
pour les phosphorelais EnvZ-OmpR, RcsCDB et CpxA-CpxR dE. coli (Batchelor et al.,
2005; Jubelin et al., 2005) lors de la rgulation des gnes de synthse des curli et la formation

31
Figure 17. Rseau de rgulation contrlant la synthse des curli chez E. coli. La synthse des curli
faible osmolarit rsulte de lactivation transcriptionnelle de csgD par OmpR~P. A forte osmolarit, le
phosphorelais CpxAR est activ. CpxR~P se lie au promoteur de csgD, teignant sa transcription. Le
systme RcsCDB, galement activ par les changement dosmolarit du milieu, inhibe aussi les oprons
de synthse des curli. H-NS peut activer ou rprimer ces deux oprons, selon les conditions
environnementales. Daprs Jubelin et al., 2005

32
des biofilms (figure 17). Des approches systmatiques par microarrays chez E. coli semblent
suggrer que ce recouvrement de rgulons est frquent chez les phosphorelais (Oshima et
al., 2002).

En conclusion, si le cross-talk est un phnomne limit in vivo chez les bactries, il

existe nanmoins des communications croises entre phosphorelais, quelles soient de type
cross-phosphorylation ou partage de rgulon. La complexit des phosphorelais His-Asp-His-
Asp pourrait suggrer une tendance accrue pour ces rgulations croises. En effet, le nombre
accru de modules, de partenaires et dtapes dans le phosphorelais largit les possibilits de
connexions avec dautres rgulateurs et donc de modulation par des signaux diffrents,
intgrant ainsi le phosphorelais dans un vaste rseau cellulaire. Dans ce sens, chez les plantes,
o les phosphorelais complexes sont plus frquents en proportion que les systmes
classiques, les phnomnes de rgulation croise semblent trs rpandus (pour revue, voir
Grefen & Harter 2004), laborant un rseau complexe lchelle cellulaire. Quasiment tous
les processus physiologiques de la plante se trouvent ainsi interconnects, tels que : la
perception des cytokinines (hormones impliqus dans presque tous les processus de
dveloppement et de croissance), la perception de lthylne (impliqu notamment dans la
germination et la rponse au stress), la mise en place des rythmes circadiens, le
dveloppement des gamtophytes, la floraison, la perception de losmolarit, entre autres.
Chez les plantes, ltablissement de ce rseau complexe de rgulation qui permet la
modulation fine des nombreuses cascades de signalisation cellulaire vgtales les unes par
rapport aux autres semble aussi important que les voies de signalisation propres chaque
phosphorelais (Lohrmann & Harter 2002).

III. Courbes de rponse : systmes simples versus systmes complexes

Les systmes deux composants bactriens classiques sont un moyen efficace de

rpondre rapidement des stress externes grce un simple transfert de phosphate. Une tude
base sur des modles mathmatiques a dtermin la dynamique de rponse des systmes
complexes compare celle des systmes classiques (Kim & Cho 2006). Les auteurs ont
labor les courbes de rponse des phosphorelais en fonction du nombre dtapes impliques
dans le phosphorelais, en faisant varier les paramtres biochimiques des ractions mises en
oeuvre. Les phosphorelais classiques se comportent comme un rhostat, ragissant des

33
Figure 18. Courbes de rponse des systmes complexes (sigmode) versus
systmes simples (hyperbole). C.f texte. Daprs Kim & Cho 2006.

34
signaux de faible intensit et dont le niveau dactivation est proportionnel lintensit du
signal. Ce type de rponse est illustr par une hyperbole sur la figure 18. Au contraire, la
courbe de rponse dun phosphorelais complexe est une sigmode, traduisant une rsistance
aux signaux faibles et de courte dure, considrs comme des bruits de fond , mais une
grande sensibilit un vrai signal, de dure plus consquente. Les phosphorelais complexes se
comportent donc comme un interrupteur ON-OFF capable de diffrencier le bruit de fond
dun vrai signal. Cette proprit des systmes complexes est certainement un avantage car elle
vite la mise en place dune rponse coteuse en nergie lors de fausses situations de stress.
En accord avec cette hypothse, la survie des plantes, qui ne peuvent pas se dplacer pour
trouver de meilleures conditions environnementales, dpend avant tout de leur capacit
rpondre vite mais surtout juste et efficacement au signal initial (Lohrmann & Harter 2002).

35
 ? membrane externe
RcsF RcsC RcsD
priplasme
membrane interne

IgaA

ATP P H1
ADP

H2
P D1
D1 P RcsA

P
RcsB
D2

H
T
H

P P
D2 D2

H H
T T gnes RcsA-indpendants
H H P
D2

H
T gnes RcsA-dpendants
H

Figure 19. Le phosphorelais RcsCDB/FA dE. coli. Le signal (symbolis par un clair rouge) est peru
directement par RcsC ou via RcsF qui le relaie RcsC par un mcanisme encore inconnu (symbolis par
un ?). Suite la perception de ce signal, RcsC sautophosphoryle sur son rsidu histidine conserv H1 et
transfre le groupement phosphoryl sur son propre domaine receveur contenant un aspartate conserv
D1. Le phosphate est ensuite relay par le domaine HPt de lintermdiaire RcsD avant dtre transfr
au rgulateur de rponse RcsB. Ainsi activ, celui-ci pourra aller moduler lexpression de ses gnes
cibles en se fixant sous forme dhomodimre une squence ADN appele bote RcsB. Il existe une
autre voie dactivation de RcsB, indpendante du phosphorelais RcsCD mettant en jeu le cofacteur
RcsA. Lexistence de cette voie dactivation de RcsB suggre que RcsA puisse percevoir des signaux de
nature diffrente de ceux perus par RcsC ou RcsF. Dans ce cas, RcsA et RcsB se fixeraient sous forme
dhtrodimre une squence dADN appele bote RcsAB. On distingue ainsi deux classes diffrentes
de gnes rguls par RcsB, les cibles RcsA-indpendantes et RcsA-dpendantes.

36
 CHAPITRE 2. Le phosphorelais RcsCDB/FA dEscherichia coli

Initialement identifi comme rgulateur des gnes cps de synthse de la capsule

(Gottesman et al., 1985), le systme Rcs (regulation of capsule synthesis) est atypique de par
son organisation et la structure de ses protines. Il est lunique exemple de phosphorelais
utilisant trois protines au lieu de deux chez E. coli. Le senseur membranaire RcsC peroit le
signal et sautophosphoryle sur son rsidu histidine conserv (H1). Sensuit un premier
transfert intramolculaire du groupement phosphoryl sur un domaine supplmentaire du
senseur, contenant un rsidu aspartate (D1). Ce groupement phosphoryl est ensuite relay par
lhistidine du domaine HPt (H2) du transmetteur intermdiaire membranaire RcsD, avant
dtre transfr sur laspartate conserv (D2) du rgulateur de rponse RcsB (figure 19)
(Takeda et al., 2001; Clarke et al., 2002). Le rgulateur de rponse possde un domaine HTH
lui permettant de se lier lADN et de rguler lexpression de gnes cibles en rponse au
signal initial.
Le systme Rcs utilise galement deux protines annexes: RcsF et RcsA (voir Gottesman,
1995). RcsF est une lipoprotine de la membrane externe (Castani-Cornet et al., 2006)
requise pour la transduction au senseur RcsC de la plupart des signaux activateurs du systme
Rcs identifis ce jour (voir plus loin le paragraphe portant sur les signaux). RcsA est un co-
facteur accessoire du rgulateur de rponse RcsB. Indpendamment de la voie de
phosphorylation RcsFCD, RcsA stimule lactivit de RcsB, spcifiquement certains des
gnes du rgulon RcsB, notamment ceux ncessaires la synthse de la capsule (Gottesman
& Stout 1991). On distinguera ainsi deux catgories de cibles rgules par RcsB, celles
RcsA-indpendantes et celles RcsA-dpendantes (figure 19). Il existe donc deux voies
dactivation de RcsB, la voie de phosphorylation RcsFCD et la voie RcsA. Ces deux voies
sont cependant connectes puisque (comme nous le verrons plus en dtails dans les chapitres
suivants) lexpression de rcsA est rgule par RcsB. Par consquent, lactivation de la voie
RcsFCD conduira celle de RcsA. Lexistence de cette voie RcsA suggre que RcsB puisse
rpondre des signaux diffrents selon quils proviennent dune voie o de lautre.
Pour finir, une dernire protine a t rcemment implique dans le phosphorelais, en
amont de RcsC, IgaA (Meberg et al., 2001). Cest une protine polytopique de la membrane
interne. Les donnes de phylognie et de gntique suggrent quIgaA maintienne la voie
RcsCD dans un tat inactif.

37
 A.
rcsD rcsB rcsC

B.
domaine senseur domaine domaine domaine domaine
priplasmique PAS ? histidine-kinase ABL receveur (PR)
TM TM
N H1 D1 C
4
5
7

0
6

2
20
41

31
33
35

42

69

82

94
47

70

80
Figure 20. Le gne rcsC et son produit. A. Organisation des gnes rcsCDB au locus 50 min.
B. Les diffrents domaines de la protine RcsC. Les bornes des domaines sont indiques
daprs les limites obtenues avec le logiciel SwissProt (P14376) ou daprs le travail de
Rogov et al., 2006 pour le domaine ABL. Notons que le codon start de RcsC a rcemment
t rvis, plaant la mthionine de dbut de traduction 16 acides amins en amont de celle
initialement dcrite dans la littrature. Jai utilis les nouvelles positions pour ce travail. Le
domaine PAS napparaissant pas dans toutes les bases de donnes, il reste hypothtique.

Figure 21. Exemple de la structure tertiaire du domaine PAS de NifL dAzotobacter vinelandii. En
vert, les feuillets ; en bleu clair, les hlices ; en bleu fonc, les hlices 310. Daprs Key et al., 2007.
NB: Les hlices 310 sont une conformation peu frquente. Le tour d'hlice est plus troit et plus contraint
que celui de l'hlice . Leur longueur dpasse rarement 1 2 tours

38
I. Les protines composant le phosphorelais

I.1 RcsC

La protine RcsC est le senseur du systme Rcs (Parker et al., 1992). Le gne rcsC est
situ 49.9 minutes sur le chromosome dE. coli, en aval de lopron rcsDB et transcrit de
manire convergente (figure 20A). La protine est constitue de 949 acides amins (106.5
kDa), elle est ancre dans la membrane interne (Stout & Gottesman 1990). Sa partie
cytoplasmique, majoritaire, se divise en 4 domaines distincts (figure 20B) : PAS HK ABL
D1.
Le domaine priplasmique de RcsC est le domaine de RcsC le moins conserv en
squence chez les Entrobactries possdant un homologue de cette protine (notamment chez
Yersinia spp, Erwinia spp, Photorhabdus luminescens et Proteus mirabilis chez qui les
pourcentages didentit varient entre 30 et 40% ; NCBI-Blast). Il stend des rsidus 42 313
(SwissProt P14376) et est dlimit par deux domaines transmembranaires. Cette configuration
est typique des senseurs perception extracytoplasmique du signal, les plus nombreux. Ceci
suggre que le domaine priplasmique de RcsC soit impliqu dans la perception de signaux
extracytoplasmiques, quelle soit directe ou indirecte (via linteraction avec des protines
priplasmique).
Dans sa partie cytoplasmique, RcsC possde un domaine PAS pour Per-ARNT-Sim du
nom des protines dans lesquelles il a t dtect pour la premire fois (Per, period circadian
protein; Arnt, Ah receptor nuclear translocator protein; Sim, single-minded protein). Les
domaines PAS permettent la dtection cytoplasmique de certains signaux tels que loxygne,
la lumire, le potentiel redox ou la force protomotrice (Taylor & Zhulin 1999). Bien quils
soient associs de nombreux types de protines effectrices diffrentes (kinases,
phosphodiestrases, facteurs de transcription) (Crosson et al., 2003), ils ont une structure
tridimensionnelle conserve. Ils sont tous constitus de feuillets formant une poche dans
laquelle un co-facteur vient sinsrer, relis par des hlices (figure 21). La diversit des
signaux dtects par ces domaines PAS pourrait tre explique par le fait quils sont capables
de fixer de nombreux co-facteurs diffrents tels que la protoporphyrine IX (hme b) (Gilles-
Gonzalez & Gonzalez 2005) ou le FAD (Taylor 2007). Le domaine PAS de RcsC est putatif,
en effet, il nest pas annot comme tel dans toutes les bases de donnes mais sa prsence
suggre que RcsC puisse percevoir des signaux cytoplasmiques.

39
A. B.

Figure 22. Structure tertiaire du domaine RcsCPR dE. coli. A. Reprsentation tridimensionnelle. La
structure de droite est obtenue par rotation de 90C selon laxe des abscisses. Le dipeptide Asp831-
Asp832 (en gris) et laspartate phosphorylable Asp875 (en rose) sont indiqus. B. Reprsentation
schmatique du repliement du domaine RcsPR. Les feuillets sont reprsents par des triangles et les
hlices par des cercles. Daprs Rogov et al., 2006; 2008.

B.
A.

Figure 23. Structure tertiaire du domaine RcsCABL dE. coli. A. Reprsentation tridimensionnelle. La
structure de droite est obtenue par rotation de 90C autour de laxe. B. Reprsentation schmatique du
repliement du domaine ABL. Les feuillets sont reprsents par des triangles et les hlices par des
cercles. Daprs Rogov et al., 2006.

40
Le domaine Histidine-Kinase (HK) classique est centr sur lhistidine conserve 479 (H1). La
mutation de cette histidine en glutamine (non phosphorylable), abolit lactivation des gnes
cps lors de lactivation du systme (Clarke et al., 2002).
Le domaine receveur de phosphate (D1 ou PR) prsente un aspartate conserv en position
875 (D1) (Clarke et al., 2002). La prsence dun domaine receveur de phosphate C-terminal
fait de RcsC un senseur lorganisation unique chez E. coli. En effet, les quatre autres
senseurs complexes dE. coli possdent un domaine H2 additionnel en aval du domaine D1.
Seuls deux autres senseurs bactriens possdent une structure similaire : VirA chez
Agrobacterium tumefaciens et LuxN chez Vibrio harveyi (Rogov et al., 2006). La structure du
domaine RcsCPR ressemble celle dun domaine receveur (D1), caractristique de la
superfamille CheY, savoir une alternance de feuillets (5) et dhlices (5) adoptant une
structure en fagot o les cinq feuillets sont entours des cinq hlices (figure 22). Ce
domaine est ncessaire la phosphorylation du domaine RcsDHPt. Plusieurs tudes
dmontrent lexistence dune interaction physique entre les protines RcsC et RcsD (Rogov et
al., 2004; 2006; 2008). Elle est majoritairement due aux domaines RcsCPR phosphoryl sur
laspartate 875 et RcsDHPt. La phosphorylation de RcsCPR induit des changements de
conformation aux alentours de laspartate 875, rendant le domaine RcsCPR 5 10 fois plus
affin pour RcsDHPt quen absence de phosphorylation (KD ~20 40mM contre ~200M)
(Rogov et al., 2004; 2008). Le domaine RcsCPR semble avoir une autre fonction, celle
dinhiber lautophosphorylation du domaine HK. En effet, in vivo, une protine RcsC entire
nest pas capable de sautophosphoryler, alors que la version tronque du domaine receveur
D1 lest (Takeda et al., 2001). On peut imaginer quen absence de signal, le domaine RcsCPR
soit repli au contact du domaine HK, empchant lautophosphorylation. La perception dun
signal induirait un changement de conformation suffisant pour permettre cette
autophosphorylation (Rogov et al., 2008).
Lanalyse par RMN du linker entre le domaine HK et le domaine PR a mis en
vidence un quatrime domaine (ABL, pour Alpha-Beta Loop) entre les acides amins 704 et
802 (Rogov et al., 2006). Sa structure est lgrement diffrente de celle du domaine RcsCPR,
les cinq feuillets tant entours de deux hlices dun ct et de trois boucles de lautre (au
lieu de trois hlices alpha), conduisant la dnomination ABL pour - loop (figure 23). En
plus de labsence de trois hlices alpha, le domaine ABL ne possde pas les acides amins
critiques pour la fixation dun groupement phosphoryl, rendant peu probable que le domaine
ABL soit une tape du phosphorelais (figure 24) (Rogov et al., 2006). Trois fonctions sont
envisageables pour le domaine RcsCABL : (i) malgr les arguments avancs prcdemment, un

41
 ABL

PR

ABL

PR

Figure 24. Alignement des domaines RcsCABL et RscCPR dE. coli selon leurs lments de structure
secondaire. Les rsidus impliqus dans la phosphorylation sont encadrs, parmi eux, seul laspartate
phosphorylable est conserv dans le domaine RcsCABL. Le pourcentage global de conservation est indiqu
en gras droite des squences.

Figure 25. Alignement de squence des domaines RcsCABL de huit espces dEntrobactries.
1: Squence d E. coli K12 (SwissProtID : P14376); 2: Shigella flexneri (Q83KD1); 3: Salmonella
paratyphi-a (Q5PCN7); 4: Erwinia carotovora (Q6D7X3); 5: Yersinia pestis (Q8ZGR4); 6:
Sodalis glossinidius (Q2NSL9); 7: Photorhabdus luminescens (Q7N2M7); 8: Proteus mirabilis
(O85663). Le degr didentit (en % par rapport RcsCABL dE.coli) est indiqu droite de chaque
squence; lidentit globale ainsi que les acides amins conservs sont nots en gras; les rsidus
hydrophobes conservs au sein des hlices sont surligns en gris. Daprs Rogov et al., 2006.

42
rle dans le transfert de phosphate ne peut tre totalement exclu. En effet, laspartate en
position 750, conserv chez huit domaines RcsCABL aligns (figure 25), prsente une
localisation similaire celle de laspartate des domaines receveurs standards (D1) (ii) le
domaine ABL de RcsC pourrait potentialiser le transfert entre H1 et D1 au sein de RcsC ou
entre D1 de RcsC et le domaine HPt de RcsD (iii) le domaine ABL pourrait reprsenter un
site de fixation pour des protines modulant le transfert du groupement phosphoryl ou
favoriser les communications croises avec dautres phosphorelais. La recherche de squences
homologues au domaine ABL de RcsC dE. coli est en faveur dun rle structural. Il nexiste
de similarits (25%) que chez huit autres espces dentrobactries (figure 25) et
lalignement des huit domaines ABL ne rvle quune faible conservation de squence (6%),
ce qui nest pas le cas pour les domaines HK et PR qui sont conservs plus de 60% chez ces
huit organismes (NCBI-Blast).

Comme beaucoup de senseurs, RcsC est un senseur bifonctionnel, i.e capable de

phosphoryler mais aussi de dphosphoryler son rgulateur de rponse (Clarke et al., 2002;
Alves & Savageau 2003; Igoshin et al., 2008). Pour ces senseurs bifonctionnels, ltat
dactivation du phosphorelais est fonction du rapport activit kinase/activit phosphatase du
senseur. Lactivit phosphatase de RcsC, prpondrante en absence de signal, induirait un
phosphorelais invers, de RcsB, vers RcsD, au domaine RcsCPR, pour finalement hydrolyser
le groupement phosphoryl associ au domaine RcsCPR en phosphate inorganique. Ce
processus nimplique pas lhistidine du domaine H1(Clarke et al., 2002). RprA est un petit
ARN non codant potentialisant la traduction de rpoS, dont la transcription est rgule
positivement par RcsB (Majdalani et al., 2002). Dans une souche dlte pour rcsC (ou rcsD),
lexpression dune fusion rprA::lacZ est augmente par rapport une souche sauvage
(Majdalani et al., 2002; 2005), en accord avec la perte de lactivit phosphatase de RcsC
permettant le maintien dun pool basal de RcsB~P. Un ensemble de donnes indique en effet
que RcsB est phosphorylable par dautres voies telles que les petites molcules donneuses de
phosphate comme lActyl-phosphate (Fredericks et al., 2006; Castani-Cornet et al., 2007).
La mutation ponctuelle rcsC137 entrane une forte augmentation de lexpression de gnes cps
de synthse de la capsule, galement positivement rguls par RcsB. Cet allle est rcessif par
rapport lallle sauvage rcsC, suggrant une perte de fonction (Brill et al., 1988). La
mutation est une substitution de lalanine 888 du domaine PR par une valine (A888V)
(Majdalani et al., 2005), impliquant une activit phosphatase dpendante du domaine PR.
Lobservation que la mutation rcsC137 peut tre complmente par un mutant rcsC H479Q

43
A.
rcsD rcsB rcsC

B. domaine priplasmique domaine HK-like domaine HPt

TM TM
N H2 C
22
42

9
9

0
30
32

46

67

77

89
Figure 26. Le gne rcsD et son produit. A. Organisation des gnes rcsCDB au locus
50min. B. Reprsentation schmatique des diffrents domaines de RcsD. Les limites des
domaines sont celles donnes par SwissProt (P39838). Lhistidine phosphorylable H2 du
domaine HPt est en position 842.

Figure 27. Structure tertiaire du domaine RcsDHPt. La structure de droite a t obtenue

aprs rotation de 90C autour de laxe des abscisses. Lhistidine phosphorylable 842 est
indique. Daprs Rogov et al., 2008.

44
(mut sur lhistidine conserve du domaine HK et qui a donc perdu son activit kinase) mais
pas par un mutant rcsC D875Q (mut sur laspartate conserve du domaine PR) va dans ce
sens. En accord avec cette hypothse, le domaine D1 seul complmente la mutation rcsC137
(Clarke et al., 2002). Nanmoins, lexplication du phnotype rcsC137 par une perte de
fonction phosphatase nest pas compltement satisfaisante et mrite dtre tudie de manire
plus approfondie.

A lheure actuelle, on ne connat ni la nature molculaire des signaux, ni la manire dont

ils sont perus par RcsC (c.f paragraphe portant sur les signaux activateurs), ni le mcanisme
de leur transduction aux domaines cytoplasmiques du senseur.

I.2 RcsD

La protine RcsD, initialement appele YojN, est essentielle la voie de signalisation Rcs
(Takeda et al., 2001). Elle est code par le gne rcsD situ 49.83 minutes sur le
chromosome dE. coli, juste en mont du gne rcsB avec lequel il est transcrit en opron
(figure 26A). Cest une protine de 890 acides amins avec un poids molculaire thorique de
100,4 kDa (SwissProt P39838), ancre dans la membrane interne et majoritairement
cytoplasmique (figure 26B).
Dans les phosphorelais complexes, lorsque le domaine HPt nest pas port par le senseur,
il est gnralement retrouv sous forme de protine isole constitue uniquement de ce
domaine (Freeman & Bassler 1999; Oka et al., 2002). Dans le cas du systme Rcs,
lintermdiaire de phosphorylation RcsD possde une structure de senseur dgnr. En effet,
en plus du domaine HPt, RcsD possde un domaine priplasmique stendant des rsidus 43
308, limit par deux domaines transmembranaires et suivi dun domaine HK-like. Ce domaine
est nomm ainsi car il possde une structure proche du domaine HK mais est non fonctionnel,
notamment cause de labsence de lhistidine phosphorylable. Cette structure de senseur
dgnr, associe lexistence dinteractions avec RcsC (Rogov et al., 2004; 2006; 2008)
suggre que RcsC et RcsD puissent fonctionner sous forme dhtrodimre (Takeda et al.,
2001). Il nexiste ce jour aucune vidence de la perception de signaux par RcsD via son
domaine priplasmique, nanmoins la possibilit que RcsD soit, en plus de son implication
dans le phosphorelais une voie additionnelle de perception de signaux par le systme Rcs est
considrer. La surproduction de RcsD est dailleurs capable dactiver le systme Rcs chez Y.

45
A.
rcsD rcsB rcsC

Domaine effecteur
Domaine receveur
B. de liaison lADN

N D HTH C
4

9
8
7

9
56

12

14
16
18

20
1

Figure 28. Le gne rcsB et son produit. A. Organisation des gnes rcsCDB au locus 50min.
B. Reprsentation schmatique des diffrents domaines de RcsB. Les limites des domaines
sont celles donnes par SwissProt (P69407). Laspartate phosphorylable D2 du domaine
receveur est en position 56.

46
pseudotuberculosis par exemple, rsultant en une meilleure capacit dinvasion des cellules
de mammifres (Hinchliffe et al., 2008).
Le domaine HPt joue lintermdiaire phosphoryl entre le domaine D1 du senseur RcsC et
le domaine D2 du rgulateur de rponse RcsB. Ceci a t dmontr (i) in vivo en mutant
notamment laspartate conserv du domaine D1 de RcsC (Clarke et al., 2002) (ii) in vitro, par
lobservation que le domaine HPt isol phosphoryl par le senseur non partenaire ArcB, peut
phosphoryler directement RcsB (Takeda et al., 2001). La structure du domaine HPt a t
dtermine par RMN (Rogov et al., 2004). Il se compose de cinq hlices (I V) dont quatre
adoptent la configuration typique des diffrents domaines HPt connus, savoir une structure
en fagot (figure 27). Cette structure est la mme que celle adopte par le domaine HK
lorsquil est sous forme de dimre. Le domaine RcsDHPt interagit avec le domaine RcsCPR~P
pour lequel il possde une forte affinit (KD ~ 20 40M) (c.f avant et Rogov et al., 2006;
2008). Il interagit galement avec le domaine receveur de RcsB avec un KD de 40M. Le
domaine HPt de RcsD est essentiel pour le phosphorelais mais pas suffisant. En effet, ni un
mutant rcsD H842 (site de phosphorylation), ni le domaine HPt sauvage seul ne peuvent
complmenter un mutant nul rcsD (Takeda et al., 2001), dmontrant limportance du reste de
la protine. Ce rsultat va dans le sens de la formation dun htrodimre RcsC-RcsD suite
la perception dun signal, la dimrisation mettant en jeu les domaines RcsCHK et RcsDHK-like.
Il est noter, lappui de cette hypothse, que le plus proche iso-orthologue de RcsD est
RcsC, suggrant la possibilit dune duplication ancestrale ayant donn naissance RcsC et
RcsD (NCBI, BlastP).

I.3 RcsB

La protine RcsB est le rgulateur de rponse du systme Rcs. Le gne rcsB est situ
immdiatement en aval du gne rcsD avec lequel il est transcrit en opron (figure 28A). Il
possde galement son propre promoteur, localis dans la phase codante de rcsD (Takeda et
al., 2001). Il code pour une protine cytoplasmique de 216 acides amins et de 23,7 kDa
(SwissProt P69407). RcsB prsente deux domaines fonctionnels distincts : un domaine
receveur (D2) dans sa partie N-terminale et un domaine effecteur de liaison lADN dans sa
partie C-terminale, grce auquel elle agit comme un rgulateur transcriptionnel (figure 28B).
Le domaine receveur contient un aspartate conserv en position 56 qui, par analogie avec
dautres domaines receveurs, serait le sige de la phosphorylation. Dans ce sens, un mutant

47
A. B.

Figure 29. Le domaine effecteur de RcsB. A. Structure tertiaire du domaine effecteur de

RcsB. Les hlices sont numrotes de 6 10, en accord avec la nomenclature employe pour
NarL. B. Superposition des structures des domaines C-terminaux de RcsB (gris fonc), NarL
(gris clair) et GrpE (gris moyen). Daprs Pristovsek et al., 2003.

Figure 30. Squence protique de RcB. Le domaine HTH est surlign en jaune. Les deux hlices
supposes contacter lADN (8 et 9) sont encadres en vert. Les acides amins importants pour la
reconnaissance de lADN sont souligns en rouge.

48
rcsBD56N dans lequel cet aspartate est remplac par une asparagine nactive plus la
transcription in vivo. Au contraire, la substitution de cet acide amin par un glutamate rend
RcsBD56E constitutivement active (Gupte et al., 1997). Ces rsultats sont en accord avec ceux
observs chez dautres rgulateurs de rponse lors de la substitution de laspartate
phosphorylable par une asparagine ou un glutamate, par exemple : NtrCD54 de S. Typhimurium
et dE. coli (Klose et al., 1993; Moore et al., 1993), CtrAD51 de Caulobacter crescentus
(Domian et al., 1997), OmpRD55 dE. coli (Lan & Igo 1998), AlgRD54 de Pseudomonas
aeruginosa (Whitchurch et al., 2002), RcaCD51 de Fremyella diplosiphon (Li & Kehoe 2005),
VirGD52 dAgrobacterium tumefaciens, (Gao et al., 2006).
Le domaine effecteur de la protine RcsB est un domaine de fixation lADN appartenant
la sous-famille de rgulateur de rponse de type NarL (Baikalov et al., 1996). Celle-ci
regroupe des rgulateurs de rponse denviron 220 acides amins prsentant un motif de
liaison lADN de type Hlice-Tour-Hlice (HTH) et fonctionnant avec lARN polymrase
associe au facteur 70 de mnage (Pao & Saier 1995; Baikalov et al., 1996; 1998). Les sites
de fixation lADN des rgulateurs de rponse de type NarL sont des doublets dheptamres
o deux monomres de NarL peuvent venir se fixer de faon symtrique (Xiao et al., 2002).
Le co-cristal NarL-ADN a t obtenu, prouvant lhomodimrisation du rgulateur de rponse
lors de sa fixation lADN (Maris et al., 2002). Par analogie avec NarL il est probable que la
forme RcsB~P se fixe sur lADN sous forme dhomodimre. En accord avec cette hypothse,
une tude par RMN mene chez Erwinia amylovora a dtermin la structure du domaine C-
terminal de RcsB (Pristovsek et al., 2003). Celle-ci se compose de 5 hlices (6 10, en
accord avec la numrotation des hlices de NarL) (figure 29A). Le motif HTH de liaison
lADN est form par les hlices 8 et 9, maintenues par lhlice 7. Lhlice 10 complte
le cur hydrophobe du domaine. Une superposition des structures tridimensionnelles de
RcsB, NarL et dun autre rgulateur apparent, GrpE (figure 29B) montre que lorganisation
spatiale des hlices est trs conserve malgr une faible similarit de squence (<20%).
Ltude par RMN de linteraction du domaine C-terminal de RcsB avec lADN a mis en
vidence certains acides amins cl : Lys-153, Val-158, Leu-168, Thr-170, Arg-177, Ser-178,
Ile-179, Thr-181, et Ile-182. La plupart des ces rsidus sont situs au niveau du motif HTH ou
dans lhlice 7. Sept dentre eux (RSIKTIS) sont situs dans lhlice 9 (ou dans le linker
entre les hlices 8 et 9), propose pour tre responsable de la reconnaissance de lADN
(figure 30). La structure globale du domaine C-terminal ne montre aucune modification lors
de linteraction avec lADN (Pristovsek et al., 2003).

49
 ftsAZ gaaGAtt/catCtgg
A. osmC tcgGAat/atcCtgc
RcsA- tgaGAcg/aatCtga
rprA
indpendants
bdm cagGAct/aatCtta
rcsC tcaGAta/agaCtgc

B. cps aaaGAaa/ctcCtaa
RcsA-
rcsA aagGAtt/atcCgaa
dpendants
flhD tagGAaa/aatCtta

Figure 31. Botes RcsB vs RcsAB dE. coli A. Alignement des botes RcsB connues. Les trois
nuclotides conservs sont surligns. B. Alignement des botes RcsAB connues, il nexiste aucune
diffrence notable de squence avec les botes RcsB.

Gnes RcsA-indpendants: gaaGAtt/catCtgg ftsAZ

(botes RcsB)
tcgGAat/atcCtgc osmC
tgaGAcg/aatCtga rprA +
cagGAct/aatCtta bdm
tcaGAta/agaCtgc rcsC

Gnes RcsA-dpendants:
(botes RcsAB)
flhD 10N tagGAaa/aatCtta
aaaGAaa/ctcCtaa 62N cps
aagGAtt/atcCgaa 83N rcsA +
Figure 32. Positionnement des botes RcsB ou RcsAB par rapport au promoteur. Les botes RcsB sont
situs immdiatement en amont de lhexamre -35 (bote verte fonce) et font toute lobjet dune
activation par RcsB (symbolise par un +). Dans les cas des botes RcsAB, elles se situent plus en amont
du promoteur dans le cas dune activation (+) ou immdiatement en aval dans le cas dune rpression (-).
En vert fonc, bote -35; en vert clair, bote -10 du promoteur.

50
 Une partie des cibles du systme Rcs est rgule par RcsB indpendamment de son
cofacteur RcsA. Dans ce cas, la squence ADN reconnue par RcsB est appele bote
RcsB . Elle se compose de 14 nuclotides rpartis en deux hmi-sites inverss
imparfaitement rpts (Wehland & Bernhard 2000) avec seulement trois bases trs
conserves : GA (5N) C (figure 31). Pour les cibles impliquant RcsA, la squence ADN
reconnue est appele bote RcsAB . Les botes RcsAB ne prsentent aucune diffrence de
squence avec les botes RcsB (figure 31). En revanche, leur position par rapport au
promoteur diffre : les botes RcsB sont situes proximit du promoteur, immdiatement en
amont de lhexamre -35 alors que les botes RcsAB sont situes plus distance, soit en
amont dans le cas dune activation (~100 paires de bases), soit immdiatement en aval du
point +1 de transcription dans le cas dune rpression (figure 32). La mcanistique de
reconnaissance des botes Rcs soulve encore beaucoup de questions lheure actuelle
dautant que mes travaux de thse ont mis en vidence une troisime catgorie de cibles Rcs,
strictement dpendantes de RcsB et du rgulateur central de la rsistance lacidit chez E.
coli, GadE (c.f Rsultats chapitre1). Dans ce dernier cas, RcsB agit indpendamment du
phosphorelais RcsFCD et de RcsA.

I.4 RcsA

Le gne rcsA est situ 43.58 minutes sur le chromosome dE. coli, i.e distance du locus
50 min et des gnes rcsC, rcsD et rcsB. Il code pour une protine de 207 acides amins et de
23.5 kDa (SwissProt P69405). Sa partie N-terminale ne prsente aucun homologue dans les
bases de donnes. En revanche, sa partie C-terminale possde, comme RcsB, un domaine
HTH de liaison lADN de la sous-famille NarL (Stout et al., 1991).
Le rle et le mode daction de la protine RcsA seront voqus plus en dtail loccasion
de ltude de la rgulation du gne rcsA (c.f Rsultats, chapitre 2).

51
 I.5 RcsF

Le gne rcsF est situ un locus diffrent de ceux des gnes rcsC/DB et rcsA, 4.73
minutes sur le chromosome dE. coli. Il code pour une lipoprotine de la membrane externe
de 134 acides amins et de 14 kDa (SwissProt P69411) (Castani-Cornet et al., 2006).
La protine RcsF a t identifie comme suppresseur, en multicopie, de la mutation ftsZ
affectant la division cellulaire. Cette activit est connecte lactivation des gnes cps de
synthse de la capsule, consquence de lactivation de la voie RcsCDB par la surexpression
de RcsF (Gervais & Drapeau 1992; Carballs et al., 1999). Diffrentes donnes de la
littrature indiquent que RcsF agit en amont de RcsC. En effet, la surexpression de RcsF dans
une souche rcsC nest plus capable dinduire la synthse de la capsule (Majdalani et al., 2002)
alors que le mutant rcsC137 constitutivement actif active toujours la transcription des gnes
rapporteurs en contexte rcsF (Majdalani et al., 2005). De plus, la plupart des signaux activant
le systme Rcs dpend dun allle rcsF fonctionnel (Hagiwara et al., 2003; Majdalani et al.,
2005; Castani-Cornet et al., 2006). Son rle serait donc de relayer les signaux
environnementaux RcsC. On ne sait pas comment RcsF peroit le signal et le transduit
RcsC mais sa localisation priplasmique (figure 19) pourrait suggrer un contact direct entre
les deux protines.
Dautres lipoprotines dont la surexpression induit le systme Rcs ont t dcrites. Cest
le cas de YpdI (Potrykus & Wegrzyn 2004) et de la chaperonne priplasmique spcifique des
lipoprotines de la membrane externe, LolA (Chen et al., 2001). Dans le cas de YpdI,
lactivation du phosphorelais est indpendante de RcsF (lexpression des gnes cps en rponse
une surexpression de LolA dans une souche rcsF na pas t teste). Ceci est galement
vrai lors de la surexpression dune protine de la membrane interne, DjlA (Castani-Cornet et
al., 2006), suggrant que la surexpression de protines denveloppe de manire non spcifique
puisse induire la voie Rcs. Lactivation du systme Rcs par la surproduction de RcsF pourrait
donc tre non spcifique, au contraire de la dltion de rcsF. En accord avec cette hypothse,
la dltion djlA indique que la protine exerce une rpression sur la voie RcsCDB, rsultat
contraire lactivation du systme Rcs observe lors de sa surproduction (Shiba et al., 2006).
La dltion ypdI ne semble associe aucun phnotype particulier (Potrykus & Wegrzyn
2004), quant lolA, elle na pas t teste car cest un gne essentiel.

52
 Membrane Externe

N 4 221 225 358 652 Priplasme

TM4

TM5
TM1

TM3
TM2

Membrane interne

22 202 247 336 674

Figure 33. Topologie putative de la protine IgaA de S. Typhimurium. Les cinq domaines
transmembranaires sont numrots TM1 TM5 par rapport lextrmit N-terminale.
Daprs Dominguez-Bernal et al., 2004.

53
 I.6 IgaA (YrfF)

La premire preuve de limplication de IgaA dans la rponse Rcs a t dcouverte chez

Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium). Chez cet organisme, IgaA a t
initialement identifie lors de travaux sur les mcanismes dattnuation de croissance dans les
cellules non phagocytaires (Cano et al., 2001). Dans cette tude, les auteurs ont isol un
mutant incapable dattnuer la croissance intracellulaire (ncessaire la persistance),
dnomm igaA pour intracellular growth attenuator. Ce mutant prsentait galement un
phnotype mucode d la surproduction de capsule, suggrant une possible relation
fonctionnelle entre IgaA et le systme Rcs. En accord avec cette hypothse, les suppresseurs
de la mutation igaA taient tous des mutations perte de fonction dans les gnes rcsC, rcsD ou
rcsB (Cano et al., 2002; Costa et al., 2003). Une tude ultrieure a prcis la relation
IgaA/systme Rcs chez Salmonella : chez cet organisme, bien que le systme Rcs soit
impliqu dans les tapes tardives de la virulence (Detweiler et al., 2003), il doit tre
absolument rprim lors des tapes prcoces de linfection, comme le montre lattnuation de
la virulence observe dans les souches o le systme Rcs est suractiv (Mouslim et al., 2004;
Garca-Caldern et al., 2005). Ce rle rpresseur essentiel est dvolu IgaA et sexerce de
manire post-traductionnelle puisqu aucune variation de la quantit des protines Rcs nest
visualise entre une souche sauvage et une souche igaA (Domnguez-Bernal et al., 2004).
Ainsi, en rprimant le systme Rcs, IgaA aurait pour fonction lajustement constant de
lamplitude de la rponse Rcs. Trs rcemment, en tudiant leffet dune dltion igaA sur le
systme Rcs, Mariscotti and Garca-del Portillo (2008) ont montr que si 90% des clones
igaA prsentaient la perte de la fonctionnalit du systme Rcs par lacquisition de mutations
spontanes, il tait toutefois possible dobtenir des clones mucodes, suggrant que S.
Typhimurium puisse conserver un systme Rcs fonctionnel, mme en absence de IgaA. Dans
ces clones, les niveaux de RcsC et RcsD sont plus faibles que dans une souche sauvage et
lintensit de la rponse est diminue soulignant limportance du rgulateur IgaA dans la
stabilit et la fonctionnalit du systme Rcs. De plus, la forte frquence de suppresseurs de la
mutation igaA situs dans les gnes rcsC et rcsD compars ceux trouvs dans rcsB (la
taille du gne tant prise en compte) suggre que IgaA module le transfert de phosphate entre
RcsC et RcsD, contrlant ainsi le niveau de signal passant au travers du phosphorelais.
Le gne igaA est annot yrfF chez E. coli ; il code pour une protine de 711 acides amins
(SwissProt P45800). La protine IgaA dE. coli prsente la mme fonction de rpression

54
 A. B.

RcsF
? ME
RcsC RcsD
P
MI

PAS PAS
IgaA
P
D1
H1 ATP P H1
ADP
ABL ABL

H2 H2
Pi+H20 X P
P D1
D1

RcsB P
D2 P
H GadE
T D2
H

H
Actyl-phosphate T
P H
Cross-talk D2

P
H
D2 T gnes RcsA-dpendants
H

H
T
H gadA/BC
RcsA

P P
D2 D2

H H
T T gnes RcsA-indpendants
H H

Figure 34. Modle de fonctionnement du systme RcsCDB/FA dE. coli. A. En absence de signal,
cest lactivit phosphatase de RcsC qui prdomine. RcsB peut tre phosphoryl par de petites
molcules donneuses de phosphate ou par du cross-talk et sa dphosphorylation catalyse par RcsCPR
suit le chemin inverse du phosphorelais (flches pointills noires) B. La perception du signal (clair
rouge) peut se faire par diffrentes voies dentre, aboutissant la phosphorylation de RcsB et son
activation (c.f texte). ME, membrane externe; P, priplasme; MI, membrane interne.

55
envers le systme Rcs que IgaA de S. Typhimurium (Meberg et al., 2001; Majdalani, rsultats
non publis). Les programmes de prdiction de domaines transmembranaires, de topologie et
de localisation sub-cellulaire classent IgaA dans la catgorie des protines de la membrane
interne possdant quatre ou cinq domaines transmembranaires. La figure 33 prsente la
topologie la plus probablement adopte par IgaA, savoir deux boucles cytosoliques et une
grande boucle priplasmique relies par 5 domaines transmembranaires. On ne sait pas encore
par quel moyen IgaA rprime le systme Rcs mais sa localisation pourrait suggrer une
interaction avec RcsC, empchant soit la perception des signaux par le domaine senseur, soit
la dimrisation de RcsC avec lui-mme ou RcsD et donc le transfert du phosphate, en accord
avec lhypothse propose par Mariscotti and Garca-del Portillo (2008). IgaA nest pas le
seul exemple de protine ddie rguler ngativement un phosphorelais en particulier. Chez
B. subtilis, deux protines priplasmiques associes la membrane, YycH et YycI, forment un
complexe ternaire avec le domaine priplasmique dYycG, le senseur HK du systme
essentiel YycG-YycF impliqu dans la synthse de la paroi (Szurmant et al., 2007). Cette
interaction inhibe lactivit auto-kinase du senseur. Les gnes yycH et yycI appartiennent au
mme opron que les gnes codant pour le phosphorelais. Leur mutation, comme la
surexpression du rgulateur de rponse YycF, entrane des altrations de la paroi bactrienne,
dmontrant limportance physiologique du contrle ngatif que les protines YycH et YycI
exercent sur YycG.

Au vu des diffrentes donnes et hypothses dveloppes ci-dessus, le fonctionnement de

la voie de transduction Rcs pourrait tre schmatis selon le modle suivant (figure 34) :

(i) La perception du signal environnemental est majoritairement due la lipoprotine

RcsF qui le relaie au senseur RcsC, probablement au niveau de son domaine priplasmique.
La manire dont RcsF transduit ce signal nest pas connue. Nanmoins, il ne faut pas exclure
la perception directe de signaux par RcsC, soit par son domaine priplasmique, soit par son
domaine PAS, soit par linteraction avec dautres protines (X) au niveau de son domaine
ABL par exemple. Il existe au moins deux situations pour lesquelles RcsF nest pas impliqu
dans la perception du signal par RcsC : la surexpression de la chaperon-like protein DjlA et de
la lipoproteine YpdI.

(ii) Suite la perception de ce signal, le senseur hybride RcsC subit un changement de

conformation, saffranchissant de linhibition allostrique exerce par IgaA et librant son

56
domaine Histidine-Kinase (H1) de linhibition exerce par le domaine receveur (PR ou D1).
RcsC peut ainsi se transphosphoryler. Il nest pas clair si la formation de lhomodimre
ncessaire la transphosphorylation est conscutive la perception du signal ou est
constitutive. Le mcanisme par lequel la perception du signal est transduit la partie
cytoplasmique du senseur reste encore dterminer.

(iii) Le domaine RcsCPR~P interagit avec le domaine HPt de RcsD afin de lui
transmettre son groupement phosphoryl.

(iv) RcsDHPt~P interagit avec le domaine receveur N-terminal du rgulateur de

rponse RcsB et lui transmet son groupement phosphoryl, induisant un changement de
conformation de RcsB pour une conformation active. RcsB agit sous forme dhomodimre ; le
rle de la phosphorylation dans cette dimrisation nest pas connu.

(v) RcsB~P en synergie avec lARN-Polymrase va alors pouvoir se fixer sur ses
gnes cibles (RcsA-indpendants) pour rguler leur transcription.

(vi) Lorsque le signal disparat, le phosphorelais suit le chemin inverse, catalys par la
fonction phosphatase du senseur bifonctionnel RcsC ; la rpression de lactivit kinase par
IgaA et par le domaine D1 est restaure.

(vii) Une voie alternative dactivation de RcsB passe par RcsA, probablement activ
par dautres signaux que ceux perus par RcsF et RcsC. RcsA agirait sous forme
dhtrodimre avec RcsB pour rguler la transcription dautres cibles, dites RcsA-
dpendantes. Parmi ces cibles, on trouve le gne rcsA lui-mme, ajoutant un niveau de
complexit au systme et soulevant la question du rle de cette autorgulation dans le
dveloppement de la rponse Rcs (tudie dans le chapitre 2 des rsultats).

(viii) Une autre voie dactivation de RcsB a t mise en vidence lors de mes travaux de
thse qui nimplique ni le phosphorelais RcsFCD, ni RcsA. Dans ce cas, cest lactivit basale
de RcsB qui est mise en jeu, une activit due la forme non phosphoryle de RcsB ou un
niveau basal de phosphorylation de la protine, due du cross-talk ou des petites molcules
donneuses de phosphate comme lactyl-phosphate. Cette activit basale, en synergie avec le

57
rgulateur central de la rponse acide glutamate-dpendant GadE, module lexpression des
gnes de rsistance lacidit.

II. Conservation et volution du systme Rcs

II.1 Conservation des protines Rcs

Daprs Huang et ses collaborateurs (Huang et al., 2006), le systme Rcs serait exclusif
aux entrobactries. Des gnes homologues rcsC, rcsD, rcsB, rcsA et rcsF sont retrouves
chez E. coli, Shigella spp, S. Typhi et Typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Photorhabdus
luminescens, Proteus mirabilis, Yersinia spp et Erwinia spp. Une tude mene dans notre
laboratoire en collaboration avec lquipe de G. Fichant (bioinformatique) va dans ce sens
(Elodie Darbo, rsultats non publis). La recherche diso-orthologues (issus dun vnement
de spciation unique) des gnes rcsC, rcsD, rcsB, rcsA et rcsF dE. coli K12 montre que 22
organismes possdent des iso-orthologues des protines RcsF, RcsC et RcsB. 18 dentre eux
prsentent le systme Rcs complet, quatre semblent dpourvus de protine RcsA et deux
souches de Y. pestis ne paraissent possder aucun iso-orthologue de RcsD. De plus, certaines
protines annotes prsentent un taux de similarit si faible quun doute subsiste quant leur
fonctionnalit. Cest le cas de la protine annote RcsA chez P. luminescens qui ne prsente
que 26% didentit avec RcsA dE. coli K12 (note RcsAEC dans la suite de ce paragraphe).
Notons que chez Y. pseudotuberculosis, il existe une protine RcsA fonctionnelle prsentant
pourtant un faible taux de similarit avec RcsAEC (<25%). Chez Y. pestis, qui a volu partir
de Y. pseudotuberculosis, il a rcemment t montr que rcsA est un pseudogne, traduisant la
perte de la protine lors de lvolution (Sun et al., 2008). Il en va de mme pour E. carotovora
chez qui aucune protine RcsA na pu tre identifie, bien que des homologues soient
retrouvs chez E. amylovora et stewartii (Huang et al., 2006).
La protine YrfF dE. coli (IgaA) est conserve chez les 22 organismes o le systme Rcs
est retrouv (NCBI-Blast). Le pourcentage didentit est toujours compris entre 50% et 100%,
sauf pour P. luminescens et P. mirabilis chez qui il nest que de 40%. Inversement, aucun
homologue YrfF nest retrouv chez les organismes dpourvus de systme Rcs
(Domnguez-Bernal et al., 2004). Cette observation associe aux donnes gntiques sur IgaA
prsentes prcdemment, supportent lhypothse que le systme Rcs soit la raison dtre de

58
YrfF. Les rsultats concernant la recherche diso-orthologues au-del des entrobactries sont
trs prliminaires. Certains gnomes bactriens appartenant aux - ou -protobactries et aux
Spirochtes possdent les gnes rcsC et/ou rcsB. Deux cas ont t tudis plus avant :
Ralstonia solanacearum et Burkholderia mallei. R. solanacearum possde, sur son plasmide,
un iso-orthologue de rcsC en divergence avec un gne annot rcsB codant pour une protine
prsentant une forte identit de squence avec RcsBEC. Lanalyse de RcsC de R.
solanacearum montre la prsence, en plus des domaines H1 et D1, dun domaine HPt en C-
terminal, expliquant sans doute labsence dhomologue RcsD chez cet organisme. B. mallei
possde un iso-orthologue de RcsB, en opron avec un gne codant pour une histidine-kinase
hybride. Lanalyse de cette squence protique rvle quelle est iso-orthologue RcsC des
Shigella et orthologue (issu de plusieurs vnements de spciation) RcsC dE. coli.
Cependant, cette protine ne semble pas possder de domaine senseur, moins quil sagisse
dune erreur dannotation. De plus, elle possde 150 acides amins en aval du domaine D1. Il
pourrait sagir dun domaine HPt, comme pour R. solanacearum (Darbo et al., non publi).
De plus amples recherches savres ncessaires mais nos rsultats prliminaires
suggrent que le systme Rcs nest pas restreint aux Entrobactries.

II.2 Evolution du systme Rcs

La prsence diso-orthologues de RcsB et RcsC dans des espces loignes suggre

lexistence dun anctre commun entre les Entrobactries et les autres familles. Le
recrutement de RcsB par RcsC se serait pass durant la priode matrialise par la branche
sparant les deux groupes. Le squenage et lannotation dautres espces possdant le
systme Rcs pourraient apporter des prcisions sur lacquisition des protines RcsD, RcsA et
RcsF. En effet, ces protines semblent avoir co-volu et avoir t acquises durant la priode
matrialise par cette mme branche. Quoiquil en soit, le systme Rcs tel quon le connat
aujourdhui, semble avoir merg partir dun anctre commun des Entrobactries (Darbo et
al., non publi).

59
III. Les cibles du systme Rcs

Le systme Rcs a initialement t identifi comme le rgulateur positif des gnes cps de
synthse de la capsule dacide colanique chez E. coli (Gottesman et al., 1985). A lheure
actuelle, selon les tudes, le systme Rcs rgulerait de 2 3% du gnome dE. coli (Hagiwara
et al., 2003; Ferrires & Clarke 2003; Erickson & Detweiler 2006 ; Francez-Charlot thse
2005). 40 % de ces cibles sont impliqus dans la composition de lenveloppe ou le trafic
travers elle, suggrant que le systme Rcs contribue la modification de la surface
bactrienne en rponse des changement environnementaux. Parmi les 60% de cibles
restants, 40 % sont de fonction inconnue, le reste tant impliqu dans diverses fonctions
cellulaires. La nature diffrente des cibles suggre un rle de rgulateur global du systme
Rcs.

III.1 Le rgulon Rcs chez E. coli

Les gnes cibles du systme Rcs sont diviss en deux catgories selon quils sont rguls
par RcsB seul ou par lhtrodimre RcsAB. Les cibles RcsA-dpendantes identifies chez E.
coli sont peu nombreuses : les gnes de synthse de lacide colanique cps (Stout & Gottesman
1990), lopron yjbEFGH responsable de la synthse dexopolysaccharide (EPS) (Ferrires et
al., 2007), lopron flhDC, codant pour le rgulateur matre de la synthse des flagelles
(Francez-Charlot et al., 2003 ; pour revue, voir Francez-Charlot et al.,, 2005), les deux
oprons de synthse des curli csgBA et csgDEFG (Vianney et al., 2005) et enfin, le gne rcsA,
qui sautorgule positivement (Ebel & Trempy 1999). Les oprons flh et csg sont rguls
ngativement par lhtrodimre RcsAB, les autres cibles sont actives. Parmi les cibles
RcsA-indpendantes identifies chez E. coli, se trouvent notamment les gnes ftsAZ essentiels
la division cellulaire (Carballs et al., 1999), le gne osmorgul bdm dont lexpression est
diminue lors de la formation des biofilms (Francez-Charlot et al., 2005), le gne rprA codant
pour un ARN stimulateur de la traduction du facteur gnral de stress S (Majdalani et al.,
2001; 2002) ainsi que dautres gnes rguls par S tels que osmC, osmB et katE (Tanaka et
al., 1997; Bouvier et al., 1998; Boulanger et al., 2005). Le fait que ces gnes soient rguls
la fois par RcsB et S suggre quil puisse exister une interaction fonctionnelle entre le
phosphorelais Rcs et le facteur S bien que limplication dune telle interaction ne soit pas
encore comprise.

60
 III.2 Cas particulier de lautorgulation

Le systme Rcs rgule les gnes codant pour ses propres composants : rcsC (MP.
Castani-Cornet, communication personnelle), rcsB (voir Gottesman, 1995) et rcsA (Ebel &
Trempy 1999), ajoutant un niveau de complexit supplmentaire au phosphorelais.
Des exemples dautorgulation positive ont t dcrits : BvgA-BvgS chez Bordetella
spp (Scarlato et al., 1990); PhoP-PhoQ chez Salmonella spp (Soncini et al., 1995) et son
quivalent MisR-MisS chez Nesseria meningitidis (Tzeng et al., 2006); CpxAR chez E. coli
(De Wulf et al., 1999). Une justification possible de lexistence dune telle amplification de la
rponse pourrait tre dviter la bactrie de mettre en uvre un processus cellulaire coteux
en nergie lorsque ce nest pas ncessaire. En effet, le niveau lev de rgulateur de rponse
phosphoryl ncessaire pour initier la rponse ne serait atteint quaprs amplification du
systme de transduction du signal et donc si le signal persiste (Raivio et al., 1999). Une
deuxime hypothse serait que cette amplification permette une expression temporelle des
cibles, celles hautes affinit pour la fixation du rgulateur tant plus prcocement rgules
comme pour le systme BvgAS de Bordetella spp (Williams & Cotter 2007). Ceci permettrait
dobtenir une rponse diffrente suivant la svrit du stress. grce des sites daffinit
diffrente au niveau des promoteurs de ses gnes cibles, le systme BvgAS contrle au moins
trois phases phnotypiques diffrentes : Bvg, Bvgi, and Bvg+. Dans le cas du systme PhoP-
PhoQ chez Salmonella spp, lautorgulation du rgulateur PhoP est absolument ncessaire au
pic initial dexpression des gnes cibles et la virulence de Salmonella (Shin et al., 2006).

III.3 Rles du systme Rcs chez E. coli et chez les autres Entrobactries

Conserv chez plusieurs -protobactries, dont des pathognes et des symbiotes, le

systme Rcs module la virulence chez Salmonella (Domnguez-Bernal et al., 2004; Mouslim
et al., 2004; Garca-Caldern et al., 2005; Erickson & Detweiler 2006; Wang et al., 2007),
chez Yersinia (Venecia & Young 2005; Hinchliffe et al., 2008), chez les EHEC (Entero
Hemorrhagic Escherichia coli, Tobe et al., 2005) et chez les phytopathognes Erwinia
amylovora (Bereswill & Geider 1997) et Pectobacteruim carotovorum ssp carotovorum
(Andresen et al., 2007).
Chez Salmonella, il a dabord t observ que lactivation du systme Rcs avait un effet
ngatif sur la virulence (Domnguez-Bernal et al., 2004; Mouslim et al., 2004), en partie

61
cause de la surproduction dacide colanique (Garca-Caldern et al., 2005). Des tudes plus
rcentes prouvent que le systme Rcs est indispensable la persistance de linfection mais de
manire RcsA-indpendante (Erickson & Detweiler 2006; Wang et al., 2007). Ainsi, selon
ltape de linfection prcoce ou tardive le systme Rcs joue un rle oppos sur la
virulence de ce pathogne selon quil ait recours ou non au co-facteur accessoire RcsA. Chez
Y. enterolitica et pseudotuberculosis, les mutations rcsC::Kan et rcsD::Kan ont un effet
ngatif sur ladhsion et linvasion de cellules pithliales humaines. Inversement, la
surproduction de RcsD augmente le pouvoir pathogne de ces organismes (Hinchliffe et al.,
2008). Chez les EHEC, RcsB rgule la virulence en modulant la transcription du LEE (Locus
dEffacement des Entrocytes). Le LEE code pour des dterminants de virulence permettant
ladhsion et donc linvasion des cellules pithliales intestinales par le pathogne. En
conditions de non activation, RcsB rprime la transcription du LEE via la rpression dun
activateur transcriptionnel de ce locus, PchA. En revanche, lactivation du systme Rcs a un
effet positif sur la transcription du LEE, via lactivateur transcriptionnel GrvA (Tobe et al.,
2005). Chez E. amylovora, la dltion de rcsB induit lavirulence (Bereswill & Geider 1997),
dmontrant lessentialit du systme Rcs pour la virulence. Chez P. carotovorum ssp
carotovorum, les mutations des gnes rcsC, rcsD et plus particulirement rcsB, augmentent la
production de facteurs de virulence. La mutation rcsF na aucun effet, suggrant une autre
voie de phosphorylation pour RcsB (Andresen et al., 2007).
En ralit, les diffrents effets du systme Rcs sur la virulence de tous ces organismes
passent par la rgulation de processus cellulaires varis tels que la mobilit, la formation des
biofilms ou la production de polysaccharides denveloppe. En effet, outre les gnes cps dE.
coli, le systme Rcs rgule galement la synthse de la capsule chez Salmonella Typhi via la
rgulation de lantigne Vi (Virlogeux et al., 1996) et du gne ugd qui est requis pour la
production de L-arabinose, constituant essentiel du lipide A, impliqu dans la rsistance aux
peptides antimicrobiens cationiques (Mouslim et al., 2003; Mouslim & Groisman 2003). Chez
E. amylovora, le systme Rcs induit galement la production damylovoran, polysaccharide
denveloppe (Kelm et al., 1997). Chez S. Typhimurium, P. mirabilis, Y. enterolitica et
pseudotuberculosis, comme chez E. coli le systme Rcs inhibe la synthse des flagelles et la
mobilit (Belas et al., 1998; Takeda et al., 2001; Cano et al., 2002). Chez E. coli, S.
Typhimurium, P. mirabilis et Yersinia pseudotuberculosis, le systme Rcs est requis pour le
dveloppement normal des biofilms (Ferrires & Clarke 2003; Mireles et al., 2001; Liaw et
al., 2004; Vianney et al., 2005; Hinchliffe et al., 2008). Tous ces processus cellulaires sont
lis. Chez E. coli par exemple, lactivation du systme Rcs (i) inhibe la synthse des flagelles

62
et des curli, tape ncessaire pour ladhsion une surface, et, dans le mme temps, (ii) active
la production dacide colanique requis pour la maturation des biofilms. Cette rgulation
rciproque des structures de surface bactrienne et des exopolysaccharides par le systme Rcs
permet le dveloppement du biofilm depuis ltape dattachement jusqu la maturation,
suggrant limplication du systme dans tout le processus de dveloppement des biofilms.
Trs rcemment, il a galement t mis en vidence limplication du systme Rcs dans la
rsistance certains -lactams, de manire dpendante de RcsF mais indpendamment de
RcsA et de la synthse de la capsule (Laubacher & Ades 2008). Les -lactams sont des
antibiotiques ciblant la synthse du peptidoglycane (PG). Selon ltape de formation du PG
cible, ils peuvent provoquer la lyse de la bactrie (bactriocide) ou lempcher de se diviser
(bactriostatique). Dans cette tude, les auteurs ont utilis deux molcules, lamdinocilline
(bactriostatique) et la cefsulodine (bactriocide). Lobservation, par microarrays, des gnes
induits en prsence de cefsulodine et/ou damdinocilline, montre que le systme Rcs est activ
dans les trois cas. De plus, le systme Rcs augmente la rsistance ces antibiotiques. En effet,
une souche rcsB, au contraire de la souche sauvage, est incapable de pousser en milieu
additionn de lun et/ou lautre des antibiotiques. Paralllement, un mutant rcsC137
(constitutivement actif, c.f le paragraphe portant sur RcsC) prsente une rsistance accrue
lamdinocilline (mais pas la cefsulodine). Cette rsistance aux -lactams ne dpend pas de
RcsA puisque la croissance de mutants rcsA ou rcsA rcsC137 nest pas affecte par la
prsence des deux antibiotiques tests. Elle ne dpend pas non plus de la synthse de la
capsule (toujours synthtise en absence de RcsA, mais dans une moindre mesure, par RcsB2)
puisquune insertion dans le gne cpsE3, suffisante pour abolir la production de capsule, ne
modifie pas la croissance sur milieu additionn dantibiotiques compare celle dune souche
sauvage. En revanche, la rsistance lamdinocilline et la cefsulodine est dpendante de
RcsF. En effet, ltude de lexpression de gnes Rcs-dpendants (osmB, ymgG, ydhA et rprA)
et indpendants (cpxP) en contexte sauvage ou rcsF aprs traitement aux antibiotiques
montre que seuls les gnes Rcs-dpendants ne sont plus exprims en rponse au traitement
dans une souche dlte de rcsF.

Pour conclure, le systme Rcs module un grand nombre de processus cellulaires tels que
la mobilit, la division cellulaire, la formation des biofilms et la pathognicit. La complexit
du phosphorelais ainsi que la grande varit de ses cibles suggrent que le systme Rcs ait un
rle de rgulateur global contrlant le remodelage de la surface cellulaire bactrienne en
rponse aux modifications environnementales. Aujourdhui, on sait quil est impliqu dans la

63
 Type de condition activatrice Fonction (gnes) / Localisation subcellulaire (protines) Rfrence

Mutations:
rfaG/H Biosynthse du LPS coeur Parker et al., 1992; Majdalani et al., 2005
tolB Maintien de lintgrit de lenveloppe Clavel et al., 1996; Mouslim & Groisman 2003
mdoH Biosynthse des MDO (OPG) Ebel et al., 1997
pgi Biosynthse AgO et ECA El-Kazzaz et al., 2004
dsbA/B Formation des ponts di-sulfures dans les protines priplasmiques Missiakas & Raina 1997
pgsA Biosynthse phospholipides acides majeurs Shiba et al., 2004
TAT Export de protines matures du cytoplasme vers le priplasme Bernhard & De Boer 2003
surA Repliement et insertion des protines dans la membrane externe Castani-Cornet et al., 2006

Surexpression:
RcsF Lipoprotine priplasmique associe la membrane externe Gervais & Drapeau 1992
DjlA Protine cytoplasmique associe la membrane interne, cochaperonne de DnaK Kelley & Georgopoulos 1997
UppP Biosynthse de lUnP (lipide carrier essentiel la synthse du PG) El Gachi et al. 2004
LolA Protine priplasmique, transporteur de lipoprotines de la membrane externe Chen et al., 2001
OmpG Porine de la membrane externe Chen et al., 2001
YpdI Lipoprotine putative associe la membrane interne Potrykus J,Wegrzyn G. 2004

Conditions de cultures/Traitements:
Dssication Ophir & Gutnick 1994
Choc osmotique Sledjeski & Gottesman 1996
Zn2+ 20C Hagiwara et al., 2003
Croisance sur des surfaces solides Ferrires & Clarke 2003
Chlorpromazine Intercalant de la bicouche lipidique, modifie la topologie membranaire Conter et al., 2002
-lactams Inhibition de la biosynthse du PG Kaldalu et al., 2004; Laubacher & Ades 2008

64
Table 1: Conditions exprimentales activatrices du systme Rcs.
rsistance aux -lactams. Cependant, au moment o jai entam mes recherches, les rles du
systme Rcs dans ladaptation des cellules leur environnement restaient peu documents.
Dans ce travail, nous verrons comment mes travaux de thse ont permis la dcouverte, pour la
premire fois, dun de ces rles : la rsistance lacidit (c.f Rsultats, chapitre 1).

IV. Les signaux activateurs du systme Rcs

Les bactries Gram ngatives possdent toute une panoplie de rponses aux stress,
permettant de prserver lintgrit de lenveloppe bactrienne. Chez E. coli, quatre rgulateurs
transcriptionnels sont connus pour mdier la rponse aux stress denveloppe : les
phosphorelais CpxA-CpxR et BaeS-BaeR, le facteur sigma alternatif E et la protine
phagique Psp (pour revues, voir Darwin 2005; Raivio 2005; Rowley et al., 2006). Cpx et E
sont activs en rponse au mauvais repliement des protines denveloppe et aux altrations de
la membrane externe alors que Psp est activ par des perturbations de la membrane interne
(Connolly et al., 1997; Darwin 2005; Raivio 2005). Le rle du systme Bae nest pas encore
bien compris mais il est activ par certaines toxines affectant lintgrit membranaire (Raffa
& Raivio 2002). Parmi ces quatre systmes rpondant divers stress denveloppe, aucun ne
semble ddi au stress du peptidoglycane, composant de lenveloppe pourtant essentiel la
viabilit cellulaire. Une tude rcente suggre que le phosphorelais Rcs pourrait tre ce
systme (Laubacher & Ades 2008) puisquil est activ par les -lactams, famille
dantibiotiques inhibant spcifiquement diffrentes tapes de la biosynthse du
peptidoglycane. Ce travail est en accord avec les tudes prcdentes. En effet, mme si la
nature molculaire des signaux induisant la rponse Rcs est encore inconnue, plusieurs
conditions exprimentales activatrices ont t dcrites. Elles ont toutes pour point commun de
porter atteinte lintgrit de lenveloppe et certaines ciblent directement le peptidoglycane.
Les perturbations de lenveloppe activant le systme Rcs peuvent tre spares en trois
catgories : les mutations de gnes affectant la synthse de lenveloppe bactrienne, la
surexpression de protines associes aux membranes et les conditions environnementales du
milieu de culture modifiant les proprits de lenveloppe (pour revues, voir Majdalani &
Gottesman 2005 et Francez-Charlot 2005).
La recherche de signaux activateurs du systme est le plus souvent base sur le suivi de
lexpression des gnes cps de synthse de la capsule ou sur lapparition du phnotype

65
Figure 35. Reprsentation schmatique du systme Tol/Pal chez E. coli

66
mucode, reflet de la surproduction dacide colanique, trs facile voir en culture sur bote.
De nombreuses mutations ou surexpressions de protines ont t identifies comme induisant
lexpression des gnes cps (Table 1). Dans chacun des cas exposs ci-aprs, cet effet est aboli
dans un mutant rcsC, suggrant que toutes ces conditions activent le phosphorelais dans sa
totalit.

IV.1 Les mutations

rfaG, rfaP
La mutation des gnes rfaG et rfaP impliqus dans la synthse du lipopolysaccharide
cur (core LPS) induit la synthse des gnes cps de manire dpendante de RcsC et RcsF
(Parker et al., 1992; Majdalani et al., 2005).

tol/pal
Chez S. Typhimurium, des mutations du gne tolB induisent lexpression des gnes ugd et
cps de manire dpendante de RcsC, RcsB et RcsA (Mouslim & Groisman 2003). Chez E.
coli, TolB fait partie, avec au moins 4 autres protines, du systme Tol/Pal impliqu dans le
transport de macromolcules travers lenveloppe (Journet et al., 2001), dans la division
cellulaire (Gerding et al., 2007) et dans le maintien de lintgrit de lenveloppe. En effet, de
par leur organisation, les protines TolQRAB et Pal sont capables de relier la membrane
externe, la membrane interne et le peptidoglycane (figure 35) (pour revue voir Lazzaroni et
al., 2002). Laltration de lune des cinq protines provoque l'excrtion de protines
priplasmiques (Fognini-Lefebvre et al., 1987) et induit la formation de vsicules de
membrane externe (Bernadac et al., 1998). De plus, les cellules prsentent un phnotype
mucode dpendant du systme Rcs (Clavel et al., 1996). Cest en conclusion de cette tude et
au vu des rsultats obtenus avec les mutants rfa, quil a t propos pour la premire fois que
le systme Rcs rponde des altrations de lenveloppe.

mdoH (opgH)
La mutation des gnes mdo responsables de la synthse des membrane derived
oligosaccharides engendre un phnotype pliotrope. Elle entrane la diminution de la
mobilit et de la chmotaxie ainsi quune augmentation de la production
dexopolysaccharides de capsule (EPS) chez E. coli et chez E. chrysantemi (Fiedler &
Rotering 1988; Bouchart et al., 2007). Ces effets sont dus lactivation du systme Rcs, la

67
Figure 36. Mtabolisme du glucose 6-phophate chez E. coli. La mutation du gne pgi responsable
de la conversion glucose 6P en fructose 6P lentre de la voie glycolytique (Embden-Meyerhof)
induit lactivation du systme Rcs par laccumulation de dTDP-Glucose. ECA, enterobacterial
common antigen; LPS, lipopolysaccharide; CA, colanic acid; MDO, membrane-derived
oligosaccharide. Daprs El-Kazzaz et al., 2003.

68
mutation mdoH induisant le phosphorelais (Ebel et al., 1997). Cette activation est dpendante
de la prsence de RcsF puisquun double mutant rcsF mdoH ou rcsF mdoG ne prsente plus
dactivation des gnes cps (Shiba et al., 2004). Notons que depuis octobre 2003, la
nomenclature a t modifie dans les bases de donnes Swiss-Prot de mdo en opg pour
osmoregulated periplasmic glucans .

pgi
Le gne pgi code pour la phosphoglucose isomrase, enzyme catalysant linterconversion
glucose-6-phophate fructose-6-phosphate au dbut de la voie glycolytique (figure 36). Un
mutant pgi, incapable de mtaboliser correctement le glucose-6-phosphate entrane la
surexpression des gnes cps via le phosphorelais RcsCDB. Dans ce cas, le signal peru nest
pas laccumulation de glucose-6-phosphate mais celle de dTDP-glucose (El-Kazzaz et al.,
2004). Ce produit intervient directement dans la synthse de lantigne O et de lECA
(Enterobacterial common antigen), plaant la mutation pgi dans la catgorie des mutations
activatrices du systme Rcs qui affecte lintgrit de lenveloppe, au mme titre que rfa, tol ou
mdo. La perception du dTDP-glucose priplasmique pourrait se faire directement par le
domaine PAS de RcsC ou indirectement, au niveau du domaine ABL, par interaction dun
connecteur activ par ce mtabolite.

dsbA, dsbB
Le complexe ternaire DsbA-DsbB-ubiquinone est responsable de la formation de ponts di-
sulfures dans les protines priplasmiques (pour revue, voir Inaba & Ito 2008). Lexpression
des gnes cps est induite dans les mutants dsbA ou dsbB (Missiakas & Raina 1997). La
manire dont ces mutations induisent le systme Rcs est encore inconnue. Nanmoins, il faut
noter que RcsF est un substrat de DsbA et quen son absence, RcsF est sous forme rduite
(Kadokura et al., 2004). A lheure actuelle, on ne sait pas si le pont di-sulfure de RcsF dpend
juste de ltat doxydo-rduction du priplasme ou si sa prsence / absence module la capacit
de RcsF activer la cascade Rcs. Si ctait le cas, ce serait le premier exemple de signal post-
transcriptionnel activant le systme Rcs via RcsF. Notons galement que dsbA est une cible
du systme CpxAR (Danese & Silhavy 1997).

pgsA
Le gne pgsA code une enzyme implique dans la synthse des phospholipides acides
majeurs, le phosphatidylglycrol et la cardiolipine (pour revue, Dowhan 1997). Une mutation

69
nulle pgsA nest viable 30C que si elle est associe la dltion du gne lpp codant pour
une lipoprotine majeure de la membrane externe (Kikuchi et al., 2000; Matsumoto 2001;
Suzuki et al., 2002). Bien que le double mutant pgsA lpp se dveloppe normalement 30C, il
prsente une croissance thermosensible se traduisant par une croissance faible 37C et la
lyse des cellules 42C. Ce phnotype est li lactivation du systme Rcs puisquil peut tre
supprim partiellement par la mutation de lun des gnes rcs (Shiba et al., 2004). Seule la lyse
observe 42C est indpendante de RcsA. En effet, contrairement au dfaut de croissance
37C qui est supprim par une mutation dans le gne rcsA, un mutant pgsA lpp rcsA ne
restaure pas une croissance normale 42C (Nagahama et al., 2006). De manire
concordante, une analyse par microarray montre qu 42C, le gne osmB, activ par le
systme Rcs de manire RcsA-indpendante (Boulanger et al., 2005), est en partie
responsable de la lyse dun mutant pgsA (Nagahama et al., 2007). OsmB est une lipoprotine
de la membrane externe (Jung et al., 1989), comme Lpp. Nanmoins, son effet dltre sur un
mutant pgsA 42C ne semble pas rgi par les mmes mcanismes molculaires que ceux
observs pour Lpp (Nagahama et al., 2007). Les auteurs proposent que leffet de la
surexpression dune lipoprotine de la membrane externe telle que OsmB soit exagr par la
forte dstructuration de la bicouche lipidique due labsence des phospholipides acides
majeurs. Ceci suggre que leffet dltre de la surexpression de OsmB sur la croissance dun
mutant pgsA lpp puisse tre non spcifique, tout comme la surexpression de RcsF (c.f I.5
RcsF) ou de DjlA.

Le systme TAT
Des mutations dans le systme de scrtion TAT (twin arginine translocation) activent
lexpression de nombreux gnes appartenant au rgulon Rcs, tels que lopron cps (Ize et al.,
2004). Le systme TAT est responsable de lexport, au travers de la membrane plasmique, de
protines matures portant un peptide signal twin arginine dans leur partie N-terminale. Les
mutations touchant les composants du systme TAT prsentent un dfaut denveloppe d
notamment la mauvaise localisation de deux amidases impliques dans le mtabolisme de la
paroi et la division cellulaire, AmiA et AmiC (Bernhardt & de Boer 2003; Ize et al., 2003). Il
na pas t dmontr si la rponse Rcs passait par RcsC, RcsF ou autre.

surA
Il a rcemment t mis en vidence que le gne surA, dont la mutation affecte lintgrit
de la membrane externe, active galement le systme Rcs. surA code pour une peptidyl prolyl

70
 Membrane Externe
Surproduction RcsC RcsD
Priplasme
de DjlA
Membrane Interne

PAS
J J J J J ?
DnaK
ATP P H1
ADP
ABL
GprE
H2
P D1 P
D1

P
D2
RcsB Induction des
H
T
gnes cps
H

Figure 37. Reprsentation schmatique de lactivation du systme Rcs par la surproduction de DjlA.
Lors de sa surproduction, DjlA recrute DnaK et GprE. Par un mcanisme encore inconnu, cette
surproduction active le senseur RcsC qui sautophosphoryle sur son rsidu H1. Le phosphorelais Rcs est
activ, induisant, entre autres, la transcription des gnes cps de synthse de la capsule.

71
isomrase priplasmique possdant une activit de chaperonne requise pour le repliement
correct et linsertion des protines associes la membrane externe (Lazar & Kolter 1996;
Rouvire & Gross 1996). Les colonies surA sont mucodes dans certaines conditions
(Missiakas et al., 1996). En accord avec cette observation, la mutation surA induit
lexpression dune fusion cps ::lacZ de manire dpendante de RcsC et RcsF (Castani-
Cornet et al., 2006). Notons que la mutation de surA comme celle de rfaD, augmente
galement la rponse au stress denveloppe mdie par E (Missiakas et al., 1996; Rouvire &
Gross 1996). Ce rsultat nest pas surprenant puisquune modification du LPS engendre
laccumulation, dans le priplasme, de protines de la membrane externe mal conformes,
condition connue pour activer la rponse RpoE (Walsh et al., 2003). Etant donn quau moins
deux mutations conduisant lactivation du systme Rcs activent galement la voie RpoE, il
serait intressant de savoir sil en existe dautres.

IV.2 La surexpression de protines

La surexpression de protines associes lenveloppe bactrienne peut entraner

lactivation du systme Rcs (pour revues, voir Majdalani & Gottesman 2005 et Francez-
Charlot et al.,, 2005).

DjlA
Parmi les gnes capables dactiver le phosphorelais Rcs lorsquils sont exprims partir
dun plasmide en multicopie, le plus tudi est le gne djlA. DjlA est une protine associe
la membrane interne possdant un domaine cytoplasmique J typique de la famille de co-
chaperonnes DnaJ/Hsp40 dE. coli. DjlA, via ce domaine, fonctionne comme une co-
chaperonne de DnaK la fois in vitro et in vivo et linteraction directe DjlA-DnaK est
ncessaire lactivation des gnes cps (figure 37) (Kelley & Georgopoulos 1997; Genevaux
et al., 2001). Linduction du systme Rcs par DjlA est galement dpendante de RcsC, de
RcsB, du facteur dchange de nuclotide GrpE et du domaine transmembranaire N-terminal
de DjlA (Zuber et al., 1995; Clarke et al., 1997; Kelley & Georgopoulos 1997; Toutain et al.,
2003). Etonnamment, lactivation du systme Rcs par la surexpression de DjlA ne ncessite
pas dallle rcsF fonctionnel (Castani-Cornet et al., 2006). Rciproquement, la surexpression
de rcsF induit le systme Rcs indpendamment de DjlA, indiquant que ces deux voies
dactivation du systme Rcs soient compltement indpendantes. La surexpression de DjlA

72
Figure 38. Les tapes membranaires de la synthse du peptidoglycane (PG). UppP est
une enzyme qui synthtise lundcaprnyl phosphate (UnP ou C55-P) partir
dundcaprnyl pyrophosphate (UnPP ou C55-PP). LUnP est le lipide carrier essentiel la
synthse du PG sur lequel vont venir se greffer lacide N-actyl muramique (MurNAc, M
vert), la N-actyl glucosamine (GlcNAc, G orange) et le pentapeptide (cinq ronds colors).

73
est une des rares conditions dactivation du phosphorelais Rcs indpendante de RcsF. Sa
localisation dans la membrane interne suggre quelle pourrait interagir physiquement avec
RcsC. De plus, Shiba et ses collaborateurs (2006) ont montr que si la surexpression de DjlA
active la transcription des gnes cps, sa dltion galement, suggrant un effet ngatif de DjlA
sur le systme Rcs en conditions normales . Les auteurs postulent que cette rgulation
ngative aurait pour but de maintenir le systme dans un tat basal de faible activit, dviter
une rponse Rcs dmesure face un signal donn et de permettre un retour plus rapide
ltat basal lors de la disparition du stimulus. DjlA constitue le deuxime exemple de
rgulateur ngatif du systme Rcs agissant travers RcsC, lautre exemple tant la protine
IgaA (YrfF), notamment lors des tapes prcoces de la virulence (Mouslim et al., 2004;
Garca-Caldern et al., 2005). De mme que IgaA pourrait interagir avec RcsC via son
domaine priplasmique, DjlA pourrait interagir avec RcsC ou RcsD via son domaine
cytoplasmique ou mme son domaine transmembranaire. Enfin, le fait que DjlA puisse
fonctionnellement remplacer DnaJ comme co-chaperonne auprs de DnaK (Genevaux et al.,
2001) laisse entrevoir la possibilit que le systme Rcs, via DjlA, puisse percevoir des
signaux intracellulaires en provenance de DnaK.

UppP
La surproduction dUppP (undecaprenyl pyrophosphate phosphatase), anciennement
appele BacA, confre un phnotype mucode aux souches dE. coli cultives sur milieu
solide et une rsistance accrue la bacitracine (El Ghachi et al., 2004). Cette enzyme
synthtise lundecaprenyl phosphate (Un-P) partir dundecaprenyl pyrophosphate (Un-PP)
(figure 38). LUn-P est un lipide carrier essentiel pour la synthse du peptidoglycane et autres
composants de lenveloppe tels que les MDO ou les EPS, (pour revue, Bouhss et al., 2008).
La bacitracine agit en squestrant lUn-PP, provoquant des dommages dans la paroi et
induisant la lyse cellulaire. La surproduction dUpp diminue la proportion dUn-PP dans la
membrane plasmique, expliquant une rsistance accrue lantibiotique. Le phnotype
mucode observ en rponse la surproduction dUpp pourrait suggrer que le systme Rcs
peroive le ratio Un-P/Un-PP dans la membrane plasmique comme signal modulant la
production de polysaccharides.

LolA, OmpG et YpdI

Trois autres protines induisent lactivation du systme Rcs lorsquelles sont
surexprimes : LolA, OmpG et YpdI (Chen et al., 2001). LolA (p20) est une protine soluble

74
du priplasme agissant comme un transporteur spcifique de lipoprotines associes la
membrane externe (Matsuyama et al., 1995). Sa fonction est essentielle pour la survie des
cellules, mme en absence de la lipoprotine majeure Lpp (Tajima et al., 1998). OmpG est
une porine de la membrane externe (Fajardo et al., 1998). On ne sait pas actuellement
comment ces protines activent le systme Rcs. La dltion ompG, contrairement celle de
djlA, na aucune influence sur le niveau dactivation du systme Rcs. Quant celle de lolA,
elle na pu tre teste car elle est ltale (Shiba et al., 2006). YpdI, enfin, est une lipoprotine
potentielle qui active la transcription des gnes cps indpendamment de RcsF (Potrykus &
Wegrzyn 2004).

Lensemble des donnes sur lactivation du systme Rcs par des mutations ou des
surexpressions de protines affectant la composition et/ou lintgrit de lenveloppe renforce
lhypothse initialement mise par Clavel et ses collaborateurs (1996) selon laquelle le
systme Rcs rpondrait des altration de la paroi bactrienne. Il constituerait ainsi le
cinquime systme ddi la rponse aux stress denveloppe chez les bactries Gram-. En
accord avec cette hypothse, nous avons vu quil existe des rgulations croises (notamment
au niveau rgulon) entre les systmes CpxAR, E, et Rcs, permettant sans doute la cellule de
compenser la perte de lun dentre eux. Etonnamment, alors que chacun des systmes CpxAR,
E, BaeSR et Psp rpondent des altrations dune partie prcise de lenveloppe, le systme
Rcs semble activ par toute modification de lenveloppe dans son ensemble (membrane
externe, interne, peptidoglycane ou priplasme).

IV.3 Les conditions environnementales et nutritionnelles de culture

Mis part les traitements chimiques ou antibiotiques, ce sont les conditions activatrices du
systme Rcs probablement les plus pertinentes la biologie des bactries.
La dessiccation induit (modrment) lexpression des gnes cps de synthse de la capsule,
permettant la bactrie de survivre au desschement. En effet, les exopolysaccharides de
surface sont capables de lier plusieurs fois leur poids en eau, permettant le maintien dun
environnement humide autour de la bactrie (Ophir & Gutnick 1994). Cette activation des
gnes cps en rponse la dessiccation est dpendante de rcsB et rcsC et est probablement due
linduction dun stress osmotique, autre condition activatrice du systme Rcs. En effet, un

75
choc osmotique induit par le NaCl ou le sucrose active galement lexpression des gnes cps
de manire RcsC dpendante (Sledjeski & Gottesman 1996).
La croissance sur une surface solide active galement le systme Rcs (Ferrieres & Clarke,
2003). Dans ces conditions, seul le systme CpxA-CpxR de rponse aux altrations
membranaires est activ, contrairement au systme EnvZ-OmpR qui rpond losmolarit.
Ces rsultats suggrent que RcsC sentirait non pas un choc osmotique mais des perturbations
membranaires lors de la croissance sur une surface solide.
De manire moins physiologique, certains traitements induisent le systme Rcs comme la
chlorpromazine (Conter et al., 2002) ou certains antibiotiques ciblant le peptidoglycane
(Sailer et al., 2003; Kaldalu et al., 2004; Laubacher & Ades 2008).
La chlorpromazine est une drogue cationique induisant des modifications de la topologie
membranaire en sintercalant dans la bicouche lipidique des cellules en phase exponentielle
de croissance (Sheetz et al., 1976). Le stress membranaire induit par la chlorpromazine serait
identique celui provoqu par un choc osmotique (van der Heide & Poolman 2000). Quant
aux -lactams (antibiotiques ciblant la synthse du peptidoglycane), plusieurs tudes montrent
leur implication dans lactivation du systme Rcs. Ainsi, 80% des gnes appartenant au
rgulon de lampicilline utilise des concentrations bactriocides sont galement rguls par
le systme Rcs (Kaldalu et al., 2004). Trs rcemment, une tude a galement montr que le
systme Rcs tait activ par un stress du peptidoglycane induit par lutilisation de -lactams
tels que la cefsulodine ou lamdinocilline (mecillinam) (Laubacher & Ades 2008)
De nouveau, ces diffrentes donnes appuient lhypothse selon laquelle le systme Rcs
serait ddi rpondre aux stress de lenveloppe.
En marge de toutes ces conditions activatrices ayant un lien avec un stress denveloppe,
une tude propose que le systme Rcs rponde au Zn2+ basse temprature, via le systme
PhoQP (Hagiwara et al., 2003). Les auteurs montrent en effet que les basses tempratures
(20C), associes des taux levs de zinc et la prsence de glucose (0,4%) dans le milieu,
activent le systme Rcs de manire dpendante de RcsC et RcsF. Ils proposent que le signal
passe par le systme deux composants PhoQP, connu pour rpondre aux cations divalents
tels que le Mg2+ ou le Ca2+ (Vscovi et al., 1997). En effet, en prsence de Zn2+, lexpression
dune fusion cps::lacZ nest plus active dans un mutant phoQP ou en prsence de Mg2+,
condition rpressive du phosphorelais PhoQP. Ainsi, PhoQP pourrait tre activ par de fortes
concentrations en Zn2+ et transmettre le signal au systme Rcs. En accord avec cette
hypothse, nous avons vu en premire partie dintroduction que le systme PhoQP de S.
enterica pouvait tablir une rgulation croise avec le systme PmrBA via la protine

76
connectrice PmrD (Kato & Groisman 2004). Toujours chez Salmonella, plusieurs tudes ont
montr un lien troit entre le systme PhoQP et RcsCDB/FA dans le contrle de la virulence.
Tout dabord, le systme Rcs doit tre rprim par IgaA pour que le systme PhoQP puisse
transcrire son rgulon, impliqu notamment dans les tapes prcoces de la virulence (Tierrez
& Garca-del Portillo 2004). De plus, les rgulons PhoQP et Rcs se recoupent (Garca-
Caldern et al., 2007).
Nanmoins, aucune tude na encore dmontr que le senseur PhoQ pouvait percevoir le
signal Zn2+ . De plus, ce serait la premire condition activatrice du systme Rcs nayant
aucun rapport avec le stress denveloppe. Enfin, nous navons pas russi reproduire cette
activation au laboratoire, mais cela peut sexpliquer par une diffrence dans les souches dE.
coli utilises.

En conclusion, le phosphorelais Rcs CDB/FA dE. coli est un systme de transduction du

signal complexe, atypique par le nombre, lorganisation et la structure de ses protines. Il est
conserv chez les Entrobactries et est impliqu dans de nombreux processus cellulaires
diffrents tels que la synthse de la capsule, la mobilit, la division cellulaire, la formation des
biofilms et la pathognicit. Les nombreuses conditions activatrices du systme dcrites dans
la littrature suggrent que le phosphorelais Rcs soit induit en rponse des altrations de
lenveloppe bactrienne dans sa globalit. On ne connat pas encore la nature molculaire
exacte des signaux activant le systme mais il apparat clairement que la perception de la
grande majorit dentre eux dpend du senseur RcsC avec ou sans lintervention de la
lipoprotine RcsF en amont. Le fait que RcsA puisse activer le rgulateur de rponse RcsB
indpendamment du phosphorelais RcsCD indique lexistence dune deuxime voie dentre
des signaux activateurs du systme. Enfin, tant donne la nature complexe du phosphorelais,
on ne peut pas exclure limplication de RcsD ou IgaA dans la perception dautres types de
signaux.

77
Rsultats

78
 CHAPITRE 1. Le systme Rcs est essentiel la rsistance lacidit chez
Escherichia coli

I. La rsistance lacidit chez E. coli

Lestomac, avec des pH compris entre 1.5 et 2.5, est sans doute le milieu le plus
inhospitalier de lanatomie des mammifres. Toutes les bactries alimentaires (pathognes ou
commensales) se retrouvent donc confrontes au mme problme : le passage de la barrire
gastrique.
E. coli, bactrie intestinale se dveloppant prfrentiellement des pH proches de 7, est
pourtant capable de survivre des pH trs acides (~2) pendant plusieurs heures (Gorden &
Small 1993; Small et al., 1994). Cette capacit survivre pH acide dpend du milieu de
croissance utilis avant le stress acide (Small et al., 1994; Lin et al., 1995; 1996). En effet, les
souches cultives en milieu riche en acides amins tels que le LB (Luria-Bertani) prsentent
une rsistance de plusieurs heures des pH ~2.5 contrairement des souches cultives en
milieu minimum glucose. Cette observation a permis la dcouverte de quatre systmes de
rsistance lacidit (AR, pour Acid Resistance) (Gorden & Small 1993; Hersh et al., 1996;
Foster & Moreno 1999; Iyer et al., 2003; Richard & Foster 2003).
Le premier systme (AR1), appel aussi systme oxydatif, est le moins bien caractris. Il
rentre en jeu en phase stationnaire de croissance et implique le facteur sigma alternatif RpoS
(S) et le rgulateur global CRP (cAMP receptor protein) (Castanie-Cornet et al., 1999).
Comme le suggre limplication de CRP, ce systme est rprimable par le glucose, ce qui a
permis la dcouverte de trois autres systmes, tous dpendants dacides amins spcifiques.
En effet, des cellules cultives en milieu LB additionn de glucose ne survivent pas au
passage dans un milieu minimum pH 2.5 moins quon y ajoute du glutamate (AR2), de
larginine (AR3) ou de la lysine (AR4) (Castanie-Cornet et al., 1999; Lin et al., 1995; Gong et
al., 2003; Iyer et al., 2003). Ces quatre systmes AR induisent un niveau diffrent de
protection envers les pH acides, les systmes AR1 et AR4 offrant un niveau de protection
minimal et AR3 une rsistance moyenne. Le systme glutamate-dpendant qui est le plus
efficace, a t le plus tudi.

79
 Figure 39. -dcarboxylation du glutamate en GABA. Les chiffres
entre parenthses reprsentent les charges. Daprs Foster 2004.

Glutamate GABA

pHext 2.5

GadC
pHint 4.5

GadA ou
GadB
Glutamate GABA

H+ CO2 CO2

Cytoplasme

Priplasme

Figure 40. La rsistance acide glutamate-dpendante chez E. coli. La dcarboxylation du

glutamate par les isoenzymes GadA et GadB consomme un proton intracellulaire et produit du
GABA et du CO2, rsultant en une augmentation du pH intracellulaire. Les deux molcules sont
exportes hors de la cellule. Le GABA est pris en charge par lantiporteur glutamate/GABA GadC.

80
 I.1 Le systme AR2 glutamate-dpendant de rsistance lacidit

Le systme AR2 est constitu dune glutamate dcarboxylase, code par les gnes gadA et
gabB et dun antiporteur associ, cod par le gne gadC (Hersh et al., 1996; Malashkevich et
al., 1998; De Biase et al., 1996, 1999; Castanie-Cornet et al., 1999; Richard & Foster 2003).
Les gnes gadA et gadB sont situs des loci diffrents sur le chromosome. (78.98 et 33.8
minutes, respectivement). Ils codent pour des isoformes de la glutamate dcarboxylase. Les
protines GadA et GadB, prsentent une grande similarit de squence (Smith et al., 1992;
Blattner et al., 1997) et ne sont pas biochimiquement distinguables (De Biase et al., 1996).
Les gnes gadB et gadC sont organiss en opron (De Biase et al., 1999). Lorsque le pH
interne devient acide, la glutamate dcarboxylase catalyse l-dcarboxylation de lacide L-
glutamique en acide gamma aminobutyrique (GABA). Cette raction consomme un proton
recrut dans le cytoplasme et relargue de lanhydride carbonique (CO2) (figure 39).
HOOC-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH HOOC-CH2-CH2-CH2NH2 + CO2
Le GABA est export hors de la cellule par lantiporteur GadC, en change de glutamate
extracellulaire (figure 40). La consommation continue de protons intracellulaires au cours des
cycles successifs de dcarboxylation entrane une augmentation du pH (Castanie-Cornet et al.,
1999; Foster & Moreno 1999; Richard & Foster 2004). Une des premires hypothses
formules sur le mcanisme de rsistance lacidit tait que la consommation de protons
intracellulaires permettait llvation du pH intracellulaire jusqu des niveaux compatibles
avec le maintien des fonctions cellulaires. En ralit, AR2 augmente le pH intracellulaire
jusqu la valeur optimale pour son propre fonctionnement (~4) grce un quilibre entre
lentre de protons et la dcarboxylation (Capitani et al., 2003). Par exemple, si le pH dpasse
cet optimum, la dcarboxylation sera moins efficace, entranant une augmentation du nombre
de protons intracellulaires et donc une diminution du pH. A ct de son action sur le pH, AR2
semble avoir un deuxime rle. En effet, des cellules dE. coli dont le pH intracellulaire est
maintenu 4 indpendamment de la prsence de glutamate survivent mieux pH acide
lorsque du glutamate est rajout au milieu (Richard & Foster 2004), suggrant que le maintien
du pH au dessus dun certain seuil nest pas le seul facteur important pour la survie en
conditions acides. Ainsi, la description des mcanismes par lequel AR2 protge E. coli des pH
acides reste incomplte.

81
Figure 41. Rseau de rgulation gnique du systme AR2. c.f texte. Les flches pleines
reprsentent les gnes, les gnes rgulateurs tant colors en bleu. Le gne gadE codant pour
le rgulateur central est reprsent en orange. Les flches minces rouges indiquent les
rgulations positives; les lignes noires, les inhibitions. Daprs Foster 2004.

82
 I.2 Rgulation gnique du systme AR2

Ce systme apparemment simple puisquil ne compte que trois gnes, prsente pourtant
une rgulation trs complexe. Les signaux environnementaux tels que le stress osmotique ou
acide, ainsi que les signaux de phase stationnaire sont impliqus dans linduction de
lexpression des gnes gadA/BC (Castanie-Cornet et al., 1999; De Biase et al., 1999;
Castanie-Cornet & Foster 2001). On compte lheure actuelle plus de 10 protines
intervenant dans linduction du systme AR2 (Foster 2004). GadE, lactivateur central du
systme AR2, appartient la famille LuxR. Cest une protine de 175 acides amins
possdant un domaine HTH putatif entre les rsidus 133 et 152 (SWISSPROT). GadE se lie
une squence ADN de 20 paires de bases appele bote Gad , situe 63 paires de bases en
amont de gadA et gadBC (Castanie-Cornet & Foster 2001; Ma et al., 2003). La bote Gad
ainsi que lactivateur GadE sont absolument ncessaires lexpression des loci gadA et
gadBC, donc essentiels pour la rsistance lacidit. Les autres protines forment un rseau
de rgulation complexe centr sur la rgulation de lexpression de GadE (figure 41). Leur
implication et donc leur importance varient avec les conditions de culture. GadE est
galement rgul par H-NS au niveau transcriptionnel (Hommais et al., 2001) et par la
protase Lon au niveau post-traductionnel (Heuveling et al., 2008). Comme le suggrent ces
nombreuses rgulations de GadE, la rsistance glutamate-dpendante lacidit peut-tre
induite par un vaste panel de conditions environnementales diffrentes. Par exemple, les
gnes gadA/BC peuvent tre induits en phase exponentielle de croissance en milieu minimum
acide (pH5.5) ou en phase stationnaire indpendamment du pH. Nanmoins, en milieu riche
comme le LB, aucun des locus nest activ avant lentre en phase stationnaire. Pour rpondre
ces diffrents besoins physiologiques, certains circuits de rgulation de GadE vont
fonctionner en milieu minimum alors que dautres seront ddis la rgulation de la
production de GadE en LB.
Comme le montre la figure 41, il existe plusieurs circuits dactivation de GadE. Le
premier implique un systme deux composants EvgSA qui est capable dactiver GadE
directement ou indirectement via la protine YdeO (AraC-like) (Masuda & Church 2003).
Paralllement, GadE rprime lexpression de ydeO et active sa propre transcription (figure
41), fermant ce circuit de rgulation. Les effets de EvgA et YdeO sont mis en jeu uniquement
en phase exponentielle de croissance lors dune culture en milieu minimum pH 5.5 et ne
sont pas requis en phase stationnaire (Ma et al., 2004). Un deuxime circuit, mal connu, est

83
responsable de linduction des gnes gadA/BC en phase stationnaire de croissance en milieu
LB supplment en glucose. Il implique la GTPase MnmE (ou TrmE) qui semble influencer
la fois la transcription et la traduction de GadE (Gong et al., 2004). Le dernier circuit
dactivation de GadE implique CRP, RpoS (S) et deux rgulateurs transcriptionnels de type
AraC : GadX et GadW (figure 41) (Ma et al., 2002; Tramonti et al., 2002; 2006). Il est mis en
jeu lors dune croissance en milieu riche sans glucose mais aussi en milieu minimum. Une
tude rcente montre que GadX et GadW activent lexpression des gnes gadA/BC via
lactivation de gadE et quen absence de glucose, RpoS active la transcription de gadX (Sayed
et al., 2007).
Lexistence de ces nombreux niveaux de rgulation de lexpression du gne gadE dE.
coli souligne limportance pour cet organisme dtre rsistant aux pH acides. Cependant, la
fonction de GadE semble aller au-del de la rponse acide. En effet, il inhibe la formation des
biofilms chez K12 ainsi que lattachement lpithlium intestinal chez les EHEC (Entero
hemorrhagic Escherichia coli) (Tatsuno et al., 2003; Dahan et al., 2004; Hommais et al.,
2004) et active de nombreux gnes autres que gadA/BC. Parmi ces cibles, lquipe de P.
Bertin a dmontr que GadE rgulait directement le gne rcsA (Hommais et al., 2004). Afin
de dterminer le rle de GadE dans la rsistance lacidit chez E. coli, les auteurs ont ralis
une approche transcriptomique par macro-arrays. Parmi les gnes induits lors de la
surexpression de GadE, ils ont mis en vidence des gnes impliqus dans la rsistance
lacidit (gadA, gadX) ou dans la synthse du glutamate (gltD) mais aussi des gnes impliqus
dans la biosynthse des composants de la membrane dont rcsA. Par la suite, des expriences
de retard sur gel ont dmontr la fixation de GadE au promoteur de rcsA, suggrant que la
rgulation de rcsA par GadE visualise en macro-arrays tait directe. Cette observation nous a
conduit tester limplication du systme Rcs dans la rponse acide. Les rsultats obtenus ont
fait lobjet dune publication, prsente ci-aprs.

84
II. Article

Bien que trs conserv chez les Entrobactries, le rle physiologique du systme de
transduction du signal RcsCDB/AF et notamment son implication dans ladaptation aux stress
environnementaux sont encore mconnus. Ce travail dmontre le rle essentiel du systme
Rcs dans la rsistance glutamate-dpendante lacidit, constituant la premire description
dun rle physiologique du systme Rcs pertinent pour le style de vie de la bactrie tudie, E.
coli. Cette implication du phosphorelais Rcs dans la rsistance lacidit est originale
plusieurs titres : (i) seule lactivit basale de RcsB est essentielle la rsistance acide,
indpendamment des autres protines du phosphorelais Rcs. (ii) Lactivit de RcsB est
absolument dpendante dun nouveau partenaire, le rgulateur central de la rsistance
lacide glutamate-dpendante, GadE. De mme, lactivit de GadE est strictement dpendante
de celle de RcsB. (iii) Lactivation de RcsB, via le phosphorelais RcsFCD ou par son
cofacteur accessoire RcsA, diminue les capacits de rsistance lacide, dmontrant
lexistence de deux rles antagonistes du systme Rcs sur la rponse acide.

Castani-Cornet MP.*, Treffandier H.*, Francez-Charlot A., Gutierrez C., Cam K.

(2007) The glutamate-dependent acid resistance system in Escherichia coli: essential and dual
role of the His-Asp phosphorelay RcsCDB/AF. Microbiology 153(Pt 1):238-46

* These authors contributed equally to this work.

85
Microbiology (2007), 153, 238246 DOI 10.1099/mic.0.29278-0

The glutamate-dependent acid resistance system

in Escherichia coli: essential and dual role of the
HisAsp phosphorelay RcsCDB/AF
Marie-Pierre Castanie-Cornet,3 Hele`ne Treffandier,3
Anne Francez-Charlot,4 Claude Gutierrez and Kaymeuang Cam
Correspondence Laboratoire de Microbiologie et de Genetique Moleculaire, Centre National de la Recherche
Kaymeuang Cam Scientifique, Universite Paul Sabatier, 118 Route de Narbonne, 31062 Toulouse, France
cam@ibcg.biotoul.fr

Received 3 July 2006
Revised 2 October 2006
Accepted 19 October 2006
The RcsCDB signal transduction system is an atypical HisAsp phosphorelay. Notably, the
response regulator RcsB can be activated either by phosphorylation through the RcsCD pathway or
by an accessory cofactor RcsA. Although conserved in Enterobacteriaceae, the role of this system
in adaptation to environmental stress conditions is largely unknown. This study reveals that the
response regulator RcsB is essential to glutamate-dependent acid resistance, a condition pertinent
to the lifestyle of Escherichia coli. The requirement for RcsB is independent of its activation by
either the RcsCD or the RcsA pathway. The basal activity of RcsB appears to be necessary and
sufficient for acid resistance. The sensitivity of the rcsB strain to low pH is correlated to a strong
reduction of the expression of the glutamate decarboxylase genes, gadA and gadB, during the
stationary phase of growth. This effect on gadA/B expression is not mediated by the general stress
sigma factor RpoS, but does require a functional gadE allele and the previously identified GadE
box. Therefore activation of gadAB expression and acid resistance absolutely requires both GadE
and RcsB. In contrast, an increase in RcsB activity through the activation of the RcsCD
phosphorelay or the RcsA pathway or through overproduction of the protein leads to general
repression of the expression of the gad genes and a corresponding reduction in acid resistance.

INTRODUCTION Transcriptome analyses indicated that up to 2.5 % of the

The RcsCDB system belongs to the minority of complex
HisAsp phosphorelays that use more than one phosphor-
ylation step to transduce signals (Zhang & Shi, 2005).
Following an intramolecular phosphorylation step, the
sensor RcsC transfers the phosphoryl group to its cognate
response regulator RcsB, via a histidine-containing phos-
photransmitter (Hpt) domain protein, RcsD/YojN (Takeda
et al., 2001). The Rcs system is activated by alterations of the
envelope (for reviews see Majdalani & Gottesman, 2005;
Francez-Charlot et al., 2005a). Most of the signalling to RcsC
is mediated by the outer membrane lipoprotein RcsF with a
few exceptions such as the overproduction of the mem-
brane-associated chaperone-like protein DjlA (Castanie-
Cornet et al., 2006). RcsB can be activated independently of
the RcsFCD phosphorelay by interacting with an accessory
cofactor, RcsA. This activation pathway allows the regula-
tion of a subset of RcsB targets (see Majdalani & Gottesman,
2005; Francez-Charlot et al., 2005a).
3These authors contributed equally to this work.
4Present address: Department of Microbiology, University
Massachusetts, Amherst, MA 01003, USA.
Abbreviation: GABA, c-aminobutyric acid.
Escherichia coli genome might be regulated by the Rcs system
(Ferrie`res & Clarke, 2003; Hagiwara et al., 2003; our
unpublished results). Approximately half of the putative
targets have no defined function. The vast majority of the
remaining targets are involved in envelope composition or
trafficking. The system is conserved in members of the
Enterobacteriaceae, including animal and plant pathogens
(see Huang et al., 2006). It has been shown to be involved in
pathogenesis (Dominguez-Bernal et al., 2004; Mouslim et al.,
2004; Garcia-Calderon et al., 2005; Detweiler et al., 2003;
Bereswill & Geider, 1997; Tobe et al., 2005) and in the
development of biofilms (Ferrie`res & Clarke, 2003).
Although reported to be essential for recovery from
chlorpromazine-induced stress (Conter et al., 2002), no
role of the Rcs system in adaptation to natural environ-
mental stress has been described yet.
E. coli, while preferring neutral pH for growth, is able to
resist the extreme acidic conditions that it might encounter,
for instance, while passing through the stomach. Three acid
resistance (AR) systems have been identified in this
of organism: the AR1 system, which relies on the general
stress sigma factor RpoS, the arginine-dependent acid
resistance system (AR3) and the glutamate-dependent

238 0002-9278 G 2007 SGM Printed in Great Britain


acid resistance (AR2) system, the latter being the most
effective. Highlighting the importance of the AR2 system is
the plethora of regulators involved in its regulation, the
relative importance of each regulator depending on
environmental pH and growth phase. These regulators
include: two phosphorelays, EvgAS (Masuda & Church,
2002) and TorRS (Bordi et al., 2003), the stationary phase
ss-factor (De Biase et al., 1999), the global regulators Crp
(Castanie-Cornet & Foster, 2001) and H-NS (Hommais
et al., 2001), three AraC-like regulators, GadW (Ma et al.,
2002), GadX (Shin et al., 2001) and YdeO (Masuda &
Church, 2003), and the Era-like GTPase TrmE (Gong et al.,
2004). Central to the AR2 system is the activity of the LuxR-
like transcription regulator GadE, as most of the regulators
listed target gadE expression. The purpose of this complex
regulatory network is the regulation of the glutamate
decarboxylase genes gadA and gadB and the glutamate : c-
aminobutyric acid (GABA) antiporter gene gadC. The
combined activity of these three enzymes increases the
intracellular pH to levels compatible with E. coli survival (see
Foster, 2004 for a review).
This work shows that the basal activity of the response
regulator RcsB is essential for glutamate-dependent acid
resistance and reveals an intriguing relationship between the
activities of GadE and RcsB. In contrast, stimulation of
RcsB activity through either the RcsFCD phosphorelay
pathway or the RcsA pathway lowers the acid resistance. The
opposing effects of RcsB on acid resistance are both
mediated through the regulation of the gadA and gadBC
operons.
METHODS
Bacterial strains, plasmids and bacteriophages. Strains, plas-
mids and bacteriophages used in this study are described in Table 1.
The lgad transcriptional fusions were constructed in the cloning
vector pRS550, rescued in the phage lRS45 and installed as a single
copy on the chromosome by lysogenization to create strains
SK1593 (gadWlacZ), SK2306 (gadAwtlacZ) and SK2321 (gadAM
lacZ) (Simons et al., 1987). Cloning fragments were generated by
PCR and cloned in the BamHI and EcoRI sites of pRS550. The
gadW moiety in the lgadW construct extended from 2400 to +30
relative to the ATG of the gadW gene. Limits for lgadAwt/M are
shown in Fig. 3(a). The gadA, gadB, gadX and gadE fusions were
described by Castanie-Cornet & Foster (2001) and Ma et al. (2002,
2003); the limits for gadA and gadB are shown in Fig. 3(a). The
DrcsA : : cat, DrcsC : : cat and DrcsF : : cat mutations were constructed
as described by Datsenko & Wanner (2000). The whole ORFs were
deleted and replaced by the chloramphenicol resistance (cat) gene.
The constructs were checked by PCR and P1 transduced into the
appropriate strains.
Glutamate-dependent acid resistance assay. This assay was
described by Castanie-Cornet et al. (1999). Cells were grown over-
night at 37 uC in LuriaBertani rich medium supplemented with
0.4 % glucose (LBG), then diluted 1000-fold in pre-warmed, pH 2.5,
M9 medium salts containing 0.4 % glucose, supplemented or not
with 1.5 mM glutamate. After 0, 2 and 4 h, serial dilutions of the
cultures were spotted on regular LuriaBertani broth (LB) plates.
After overnight growth at 37 uC, survival rates were determined as
http://mic.sgmjournals.org
RcsB is required for acid resistance
the ratio between c.f.u. ml21 at 2 or 4 h and c.f.u. ml21 at 0 h. For
each assay, control experiments (acid sensitive) were performed by
challenging at pH 2.5 without glutamate (data not shown).
b-Galactosidase assay. Cells were grown in LBG at 37 uC. Unless
specified, overnight cultures were diluted 1000-fold and grown for
510 generations, prior to addition of 500 mM IPTG. The cultures
were sampled at different intervals for assay of b-galactosidase activ-
ities (Miller, 1992). For the experiment presented in Table 3, over-
night cultures were diluted 1 : 20 000 in fresh LBG and cultured at
37 uC with agitation until OD600 reached 0.3; they were then diluted
1 : 20 in LBG with or without 0.5 mM IPTG and after 2 h (OD600
~0.5), b-galactosidase activities were measured.
RESULTS
The response regulator RcsB is essential for
glutamate-dependent acid resistance
A possible relation between the Rcs phosphorelay and acid
resistance emerged from the observation that rcsA, the gene
encoding the accessory cofactor of the response regulator
RcsB, was directly regulated by GadE (Hommais et al.,
2004). As GadE is central to glutamate-dependent acid
resistance, we investigated a possible role of the Rcs system
in resistance to low pH. As shown in Fig. 1(a), the survival
rate of an rcsB mutant was three orders of magnitude lower
than that of the wild-type strain after 2 h of acid challenge
and no surviving cells (<0.001 %) were detected after 4 h,
indicating that a functional rcsB allele is required for
glutamate-dependent acid resistance. The implication of
RcsB in the AR2 system is specific since no effect of the rcsB
mutation was observed in acid resistance assays involving
the AR1 and AR3 systems (data not shown).
The contribution of RcsA to acid resistance was then tested
using a strain in which rcsA was deleted. No effect of this
mutation was observed (Fig. 1a), indicating that the
requirement for RcsB in acid resistance is not mediated
by RcsA and that under these experimental conditions, the
regulation of rcsA by GadE is not pertinent. We also tested
the contribution of the RcsB phosphorylation pathway
(RcsFCD). As shown in Fig. 1(a), the absence of any of the
genes of the phosphorelay did not affect acid resistance.
Therefore, either a third RcsB activation pathway is involved
or only basal RcsB activity is required for resistance to low
pH.
The basal RcsB activity is required for
glutamate-dependent acid resistance
To evaluate the RcsB activity under these experimental
conditions, the expression of two targets of RcsB, the cps and
bdm genes, was measured using lacZ transcriptional fusions
with their promoters. Regulation of the cps genes by RcsB is
modulated by the accessory factor RcsA (Stout et al., 1991)
whereas that of the bdm gene is not (Francez-Charlot et al.,
2005b). Each fusion was installed into the chromosome of
the strains tested as a single copy (Simons et al., 1987). The
b-galactosidase activity of the fusions was monitored after
overnight growth in glucose-supplemented LB broth. As
239
M.-P. Castanie-Cornet and others

Table 1. Bacterial strains, plasmids and phages used in this study

Relevant genotype Comment(s) or reference

Strains
MG1655 F2 l2 rph-1 Bachmann (1996)
CF6343 MG1655 DlacIZ(MluI) Parental to all SK/MPC strains
EF832 K-12 lac : : cat trpDC : : putPA1303-Km-gadB : : lacZ (2203 to +788) Castanie-Cornet & Foster (2001)
EF833 K-12 lac : : cat trpDC : : putPA1303-Km-gadA : : lacZ (2165 to +788) Ma et al. (2002)
EF1106 K-12 DgadE : : Kn/pGadE Ma et al. (2003)
EF1334 K-12 lac : : cat gadXlacZ J. W. Foster*
EF1357 K-12 lac : : cat trpDC : : putPA1303-Km-gadElacZ (2804 to +331) Ma et al. (2004)
DH339 DrcsD : : Kan Majdalani et al. (2005)
RH90 MC4100 rpoS-359 : : Tn10 Lange & Hengge-Aronis (1991)
SK2012 DrcsA : : cat This study
SK1898 DrcsB : : cat Francez-Charlot et al. (2005b)
SK1769 DrcsC : : cat This study
SK1938 W(wzalacZ) Davalos-Garcia et al. (2001)
SK1940 W(bdmlacZ) Francez-Charlot et al. (2005b)
SK1941 DrcsB : : cat W(wzalacZ) SK1938+P1(SK1898)
SK1943 DrcsB : : cat W(bdmlacZ) SK1940+P1(SK1898)
SK1593 W(gadWlacZ) This study
SK2306 W(gadAwtlacZ) (271 to +1) This study
SK2321 W(gadAMlacZ) (271 to +1) This study
MPC104 DrcsD : : Kn CF6343+P1(DH339)
MPC173 DrcsF : : cat This study
MPC295 trpDC : : putPA1303-Km-gadA : : lacZ (2165 to +788) CF6343+P1(EF833)
MPC297 trpDC : : putPA1303-Km-gadB : : lacZ (2203 to +788) CF6343+P1(EF832)
MPC299 trpDC : : putPA1303-Km-gadE : : lacZ (2804 to +331) CF6343+P1(EF1357)
MPC301 trpDC : : putPA1303-Km-gadXlacZ CF6343+P1(EF1334)
MPC303 DrcsB : : cat trpDC : : putPA1303-Km-gadA : : lacZ SK1898+P1(EF833)
MPC305 DrcsB : : cat trpDC : : putPA1303-Km-gadB : : lacZ SK1898+P1(EF832)
MPC307 DrcsB : : cat trpDC : : putPA1303-Km-gadE : : lacZ SK1898+P1(EF1357)
MPC309 DrcsB : : cat trpDC : : putPA1303-Km-gadX : : lacZ SK1898+P1(EF1334)
MPC321 rpoS : : Tn10 trpDC : : putPA1303-Km-gadA : : lacZ MPC295+P1(RH90)
MPC322 DrcsB : : cat rpoS : : Tn10 trpDC : : putPA1303-Km-gadA : : lacZ MPC303+P1(RH90)
MPC323 rpoS : : Tn10 trpDC : : putPA1303-Km-gadB : : lacZ MPC297+P1(RH90)
MPC324 DrcsB : : cat rpoS : : Tn10 trpDC : : putPA1303-Km-gadB : : lacZ MPC305+P1(RH90)
MPC344 DrcsB : : cat gadWlacZ SK1593+P1(SK1898)
MPC325 DgadE : : Kn CF6343+P1(EF1106)
MPC327 DrcsB : : cat DgadE : : Kn SK1898+P1(EF1106)
Plasmids
pHRcsB pFAB1, W(PlacUV5rcsB) in p15A vector, KnR SpR Carballes et al. (1999)
pHRcsA W(placUV5rcsA) in p15A vector KnR SpR Davalos-Garcia et al. (2001)
pRS550 ColE1 derived cloning vector, ApR KnR Simons et al. (1987)
pGadE pQEgadE (plasmid expressing gadE under the control of Ma et al. (2003); Masuda & Church (2003)
the IPTG-regulated phage T5 promoter), ApR
pPSG958 pTRC99A-6His PtacdjlA Clarke et al. (1997)
Phages
lRS45 limm21 to rescue cloned fragments from pRS550 Simons et al. (1987)
lbdm1 W(bdmlacZ) fusion in lRS45, KnR Francez-Charlot et al. (2005b)
lcps W(wzalacZ) fusion in lRS45, KnR Davalos-Garcia et al. (2001)
lgadAwt and lgadAM W(gadAlacZ) fusion in lRS45, KnR This study

*University of South Alabama College of Medicine, Mobile, Alabama 36695, USA.

240 Microbiology 153

 RcsB is required for acid resistance

(a) Fig. 1. Glutamate-dependent acid resistance tests. The

100 meansSD of at least three independent assays are presented.
Overnight cultures in LBG medium were diluted 1000-fold in
Survival (%) at pH 2.5

10 M9 medium (pH 2.5) supplemented with 1.5 mM glutamate

then spotted on LB plates after 0, 2 and 4 h. Percentage survi-
1 val is calculated as the ratio between c.f.u. ml1 remaining after
2 h (light grey bars) or 4 h (dark grey bars) and c.f.u. ml1 at
0.1
time zero. (a) Effect of rcs mutations on glutamate-dependent
0.01 acid resistance. Strains tested were CF6343 (wild-type),
SK1898 (rcsB), SK1769 (rcsC), MPC173 (rcsF), MPC104
<0.001 (rcsD) and SK2012 (rcsA). (b) GadE and RcsB are both
WT rcsB rcsC rcsF rcsD rcsA
required for glutamate-dependant acid resistance. Overnight
(b)
cultures in LBG medium with (black bars) or without (grey
100
Survival (%) after 2 h at pH 2.5

bars) 0.5 mM IPTG, were acid challenged. Percentage survival

is calculated as the ratio between c.f.u. ml1 remaining after
10 2 h and c.f.u. ml1 at time zero. Strains tested and relevant
genotypes are indicated below the graph. The presence in the
1 strain of plasmids expressing either RcsB (pHrcsB) or GadE
(pGadE) is indicated below the graph. (c) Activation of RcsB
0.1 negatively affects glutamate-dependant acid resistance. The
wild-type strain, CF6343, with or without pHRcsB, pPSG958
or pHRcsA, was cultured in LBG with (+) or without ()
<0.01 0.5 mM IPTG.
WT rcsB gadE rcsB gadE
Host: (CF6343) (SK1898) (MPC325) (MPC327)
pHRcsB: ++ + + + + ++ ++
pGadE: ++ + + +++ contribution of RcsB to the constitutive expression of bdm
in the wild type strain. Altogether, these results suggest that
(c) 100 the basal RcsB activity, i.e. the activity in uninduced growth
conditions, is necessary and sufficient for development of
Survival (%) at pH 2.5

10 resistance to low pH.

RcsB is required for the activation of gadA and

1 gadBC during the stationary phase of growth
0.1 The glutamate-dependent acid resistance AR2 system relies
on the glutamate decarboxylase activity encoded by either
0.01 gadA or gadB and on the glutamate : GABA antiporter
_ _ _
IPTG:
+ + + encoded by gadC. The decarboxylation of glutamate leads to
pHRcsB pPSG958 pHRcsA the production of CO2 and GABA, which are then expelled
from the cytoplasm. The reaction, by consuming H+ ions,
(DjlA)

results in the elevation of the intracellular pH to a level

shown in Fig. 2a, when the Rcs phosphorelay was activated
by expression of djlA from the pSG958 plasmid, strong
induction of the expression of the cpslacZ was observed and
this effect was strictly dependent on having a functional rcsB
allele. A similar induction was also observed when RcsB
activity was increased through the overproduction of RcsB
from the pHRcsB plasmid. In contrast, in the absence of
djlA- or rcsB-expressing plasmids, the activities in the wild-
type and rcsB backgrounds for the cpslacZ fusion were low
(51 and 38 units, respectively) and not significantly different
(P>0.05), indicating that in the wild-type strain under
those growth conditions there was no significant induction
of RcsB activity. The expression of the bdmlacZ fusion was
also stimulated by expressing either djlA or rcsB from
plasmids, although to a lesser extent with djlA (Fig. 2a). In
contrast, without these plasmids the expression of the fusion
remained low, and the observation that this expression was
twofold lower in the rcsB than in the wild-type backgrounds
(20 and 40 units, respectively) has to be interpreted as the
compatible with cell metabolism (see Foster, 2004). Since
the gadA and gadBC operons play a crucial role in this
process, we tested the expression of chromosome-inserted
gadA and gadBlacZ fusions in the rcsB background.
Table 2 and Fig. 2(b) show that the transcription of both
operons is dramatically reduced at the stationary phase of
growth in the rcsB mutant. This effect was complemented by
a plasmid expressing a functional rcsB allele through the
leaky activity of the placUV5 promoter (rcsB/pHRcsB strain
in Table 2). These results indicate that the basal RcsB activity
positively regulates gadA and gadBC transcription. Therefore
the essential role of RcsB in acid resistance is probably the
maintenance of an appropriate level of GadA and GadBC.
The data in Table 2 also show that the increase in gadA
expression during the stationary phase of growth is still
observed in the rpoS background: the magnitude of the effect
was in the same order as that in the wild-type background
(46-fold and 100-fold in early stationary phase, and 88-fold

http://mic.sgmjournals.org 241
M.-P. Castanie-Cornet and others

(a) of chromosomal lacZ fusions to the promoters of gadE,

1600 gadW and gadX was monitored. As shown in Fig. 2(b),
cps _lacZ bdm _ lacZ whereas the activation of gadA and gadB is lost in the rcsB
b-Galactosidase activity

background, no effect of this mutation on the expression of

1200
gadE and gadXlacZ was seen. A 25 % reduction of gadW
(Miller units)

lacZ fusion expression was observed in the rcsB strain,

800
leaving the possibility that RcsB might activate gadAB
expression through gadW. This is however unlikely, as
400 GadW was reported to be a negative regulator of gadAB
expression (Ma et al., 2002, 2003; Tucker et al., 2003). In
addition, a gadW mutant was reported to resist acid as well
pPSG958: + + + +
pHRcsB: + + + + as a wild-type strain (Tucker et al., 2003). Altogether these
results indicate that the regulation of gadABC by RcsB is not
(b)
mediated through the modulation of the transcription of
12 000
gadE, gadX or gadW.
b-Galactosidase activity

10 000
(Miller units)

8 000
6 000
4 000
2 000
gadA _lacZ gadB _lacZ
WT background: MPC295 MPC297
rcsB background: MPC303 MPC305
Fig. 2. (a) Expression of cpslacZ and bdmlacZ fusions after
overnight growth in LBG. The meansSD of at least three
independent b-galactosidase assays are presented. Strains
tested for cps fusions were SK1938 (wild-type) and SK1941
(rcsB), and for bdm fusions SK1940 (wild-type) and SK1943
(rcsB). These strains did or did not contain rcsB- or djlA-
expressing plasmids (pHRcsB or pPSG958 respectively) as
indicated below the graph. (b) Effect of rcsB mutation on
gadA, gadBC, gadE, gadX and gadW transcription. b-
Galactosidase activities were measured after overnight growth
in LBG. The meansSD of at least three independent assays
are presented. In both panels, wild-type background is indi-
cated by open bars and rcsB background by grey bars.
Both RcsB and GadE are required for acid
resistance
Although GadE, GadX and GadW are together involved in
glutamate-dependent acid resistance, the requirement for
GadX or GadW can be overcome by overproduction of
gadE _lacZ gadX _lacZ gadW _lacZ GadE, whereas the opposite is not true. In addition, the acid
MPC299 MPC301 SK1593 induction of gadABC expression is primarily due to the acid
MPC307 MPC309 MPC344
induction of gadE transcription (Ma et al., 2003). Therefore
GadE appears to be the key player in acid resistance.
Strengthening the central role of GadE, Fig. 1(b) shows that
the low survival rate of the gadE mutant cannot be overcome
by the production of RcsB from plasmid pHRcsB. More
importantly, the acid sensitivity of the rcsB mutant cannot
be suppressed by overproduction of GadE from a plasmid-
borne gene. Therefore both GadE and RcsB are absolutely
required for glutamate-dependent acid resistance. As
expected, the rcsB gadE double mutant was sensitive to
acid. This sensitivity can only be suppressed when both
regulators are overproduced (Fig. 1b).
Both RcsB and GadE are required for activation
of gadABC expression

and 172-fold in late stationary phase, respectively). Similar
results were obtained with the gadB fusion (Table 2).
Therefore the dramatic activation of gadAB expression is
only modestly mediated by RpoS. We note that this increase
during the transition from exponential to late stationary
phase was significantly reduced in the rpoS rcsB double
mutant (sixfold) but not totally abolished. This result
indicates that, under these conditions, other factors
contribute to the regulation of the gad genes.
RcsB-dependent regulation of gadABC is not
mediated by the regulation of gadEWX genes
The expression of gadA and gadBC is regulated by a complex
network involving notably the GadE, GadW and GadX
regulators (Ma et al., 2003; see Foster, 2004). It was
conceivable that the RcsB effect was mediated by one of
these regulators. In order to test this possibility, the activity
The expression of gadE from pGadE strongly stimulates the
transcription of gadA and gadBC operons in the wild-type
background, as expected from previous reports (Table 3a,
MPC295 and 297). The GadE-dependent regulation
requires a 20 bp GadE box located upstream of the gadA/
B promoters (Castanie-Cornet & Foster, 2001, Fig. 3a). As
expected, gadA and gadBlacZ fusions lacking sequences
upstream of the GadE box were still regulated by GadE
(Table 3b, SK2306), whereas the same constructs in which a
single substitution was introduced into the GadE box
displayed dramatically lower activity and no longer
responded to GadE overproduction (gadAlacZ fusion in
Table 3b, SK2321). Interestingly, expression of the wild-
type gadA/BlacZ fusions was also lower in the rcsB
background and was also unaffected by the overproduction
of GadE (Table 3a, MPC303 and 305). Therefore activation
of gadA/BC expression by GadE requires both the GadE box
and a functional rcsB allele. This result agrees with the

242 Microbiology 153

 RcsB is required for acid resistance

Fig. 3. gadA and gadB regulatory region. (a) Sequences of the gadAB regulatory regions and limits of the gadlacZ fusions
are shown. The single substitution from G to C in the 20 nucleotide GadE box is indicated. (b) Alignment of the sequence of
the GadE box to that of the RcsAB box of the rcsA regulatory region (Wehland & Bernhard, 2000; our unpublished results).
Conserved bases are boxed.

absence of suppression of the sensitivity of the rcsB mutant
to acid by the overproduction of GadE.
Activation of the RcsCDB phosphorelay
represses gadABC genes and lowers acid
resistance
If RcsB positively contributes to the basal level of gadABC, one
might expect that increased activity of RcsB would stimulate
the expression of those genes. However, unexpectedly,
expression of gadA/BlacZ fusions in strains overproducing
RcsB from plasmid pHRcsB, after addition of IPTG
(0.5 mM), was dramatically lower than in the wild-type
control sample, 11.2-fold and 11.6-fold for gadAlacZ and
gadBlacZ fusions, respectively (Table 2). In addition,
expression of gadE, gadW and gadX fusions was also
negatively affected by the overproduction of RcsB, although
to a minor extent (data not shown). Therefore the activation
of RcsB has a general negative effect on the expression of the
gad genes. Accordingly, under those conditions, the

Table 2. Effect of rcsB and rpoS on gadA and gadBC transcription

gadA and gadB transcriptional fusions in wild-type (WT) (MPC295 and MPC297), in rcsB (MPC303 and MPC305), in rpoS (MPC321 and
MPC323) and in rpoS rcsB background (MPC322 and MPC324) were used (see Table 1). Cultures were grown in LBG medium.
Exponential phase, OD600 ~0.5; early stationary phase, OD600 ~2.5; late stationary phase, after overnight growth. Experiments were done
in triplicate; the means expressed in Miller units are presented. ND, Not determined.

Growth phase gadAlacZ fusion gadBlacZ fusion

wt rcsB rcsB+pHRcsB rpoS rpoS rcsB wt rcsB rcsB +pHRcsB rpoS rpoSrcsB

Exponential 47 17 39* 43 14 24 25 28* 49 23

Early stationary 4657 88 2247* 1969 49 1777 139 1637* 1031 68
Late stationary 8187 172 6950* 3806 87 4119 270 3394* 2112 105
Late stationary 0.5 mM IPTG ND ND 730D ND ND ND ND 354D ND ND

*Expression of rcsB from the leaky activity of lacUV5p promoter in pHRcsB.

DExpression of rcsB after induction of the lacUV5p promoter in pHRcsB with 0.5 mM IPTG.

http://mic.sgmjournals.org 243
M.-P. Castanie-Cornet and others
Table 3. RcsB (a) and the GadE box (b) are required for the regulation of gadAB by GadE
See Table 1 for description of the strains. Experiments were done in triplicate (a) or duplicate (b) and the means expressed in Miller units
are presented with standard deviations. In (b) a plasmid expressing gadE from the IPTG-regulated phage T5 promoter was used.
(a) MPC295 MPC303
gadAlacZ gadAlacZ(165 to +788)
(165 to +788)+pGad DrcsB : : Cm+pGadE
2IPTG 741 271
+IPTG 7999305 120
(b) SK2306
lgadAwtlacZ (71 to +1)+pGadE
2IPTG 7114
+IPTG 52625
glutamate-dependent acid resistance of a wild-type strain
decreased by 1.5 log following 4 hours of acid challenge
(Fig. 1c, dark grey bars). Because this effect could be
misleading due to the overproduction of RcsB beyond a
physiological range, the same test was performed by
activating the RcsCDB phosphorelay through the expression
of djlA: an even stronger reduction of acid resistance was
observed (Fig. 1c, dark grey bars). We therefore conclude
that the activation of RcsB has a negative effect on acid
resistance. Overproduction of the RcsB accessory cofactor
RcsA also represses the expression of gadA/B, although
modestly (approximately twofold; data not shown).
Accordingly, under those conditions, the resistance of the
strain to acid was slightly lower than that of the wild-type
(50 % versus 100 %, Fig. 1c).
DISCUSSION
Although conserved in enterobacterial species and involved
in the regulation of potentially 2.5 % of the genome of E. coli,
clues as to the role of the Rcs system in adaptation to the
environment are limited. To elucidate these roles we took
advantage of known information on the regulation of the
Rcs system. The report that RcsB accessory factor gene rcsA
was positively regulated by GadE, a key transcription
regulator for the glutamate-dependent acid resistance AR2
system (Hommais et al., 2004), led us to investigate a
potential role of the Rcs system in acid resistance. This study
has brought to light the opposing dual roles of the Rcs
system in acid resistance: the basal activity of the response
regulator RcsB (due to the unphosphorylated form of the
protein, to the basal pool of phosphorylated forms, or to a
combination of both) is absolutely required for the
glutamate-dependent acid resistance system, whereas the
activation of RcsB, either through the RcsCD phosphorelay
or through RcsA, reduces the cells potential to resist low
pH. Both activities are mediated by the activation and
repression of the expression of the glutamate decarboxylase
isoenzyme genes gadA/gadB and the glutamate : GABA
antiporter gene gadC. Enterobacteria such as E. coli have
to cope with low pH in the gastrointestinal tract. To the best
244
MPC297 MPC305
gadBlacZ gadBlacZ(203 to +788)
(203 to +788)+pGadE DrcsB : : Cm+pGadE
871 331
284532 331
SK2321
lgadAMlacZ (71 to +1)+pGadE
373
304
of our knowledge, this is the first report of an essential role
for the Rcs system in adaptation to a pertinent environ-
mental condition.
The stationary phase and the acid induction of gadA/B
expression are primarily due to the increase in gadE
expression under both conditions. Accordingly, a gadE
mutant is sensitive to low pH (Ma et al., 2003; Weber et al.,
2005; this study). This work shows that the activity of GadE
in acid resistance is absolutely dependent on a functional
rcsB allele. Since the acid sensitivity of either gadE or rcsB
mutants cannot be cross-suppressed by plasmids expressing
either rcsB or gadE, it is likely that GadE and RcsB act at the
same step in the pathway leading to acid resistance. Acid
resistance is correlated with the ability of both regulators to
activate the expression of the gadA and gadBC operons
during the stationary phase of growth. The activation of
gadA/B expression by GadE requires a GadE-binding box
upstream of the promoter (Castanie-Cornet & Foster, 2001;
Ma et al., 2003). Deletion and mutation analyses of gadA/BC
regulatory regions did not reveal a motif that would
specifically affect RcsB-dependent activation without affect-
ing that of GadE. This result could suggest that GadE- and
RcsB-activating motifs are intimately overlapping, prevent-
ing their dissection by mutations. The observation of
similarities at the sequence level between the left part of the
gadA/gadB GadE boxes and the RcsAB box in the regulatory
region of rcsA (Fig. 3b) might support this hypothesis.
Although the functional significance of this sequence
similarity needs to be experimentally tested, the observation
that the GadE regulon (Hommais et al., 2004) and the RcsB
regulon do not significantly overlap (Ferrie`res & Clarke,
2003; Hagiwara et al., 2003) nevertheless indicates that GadE
does not regulate all RcsB-dependent promoters and vice
versa.
This study shows that only the basal RcsB activity is essential
to acid resistance. The form of the protein that contributes
to this basal activity is an open issue. In Salmonella enterica
serovar Typhimurium, the response regulator OmpR,
independently of its cognate kinase EnvZ, is required for
Microbiology 153

the stationary-phase acid tolerance response. However,
OmpR still needs to be activated, probably by receiving a
phosphoryl group from acetyl phosphate (Bang et al., 2000).
Evidence exists that RcsB can also be activated through
phosphorylation by acetyl phosphate, notably when the
phosphatase activity of the sensor RcsC is missing
(Fredericks et al., 2006; Majdalani et al., 2005; our
unpublished data). However, in the ackA pta strain, where
there is no production of acetyl phosphate, or in the rcsC ack
pta triple mutant, acid resistance is maintained (data not
shown). If the basal RcsB activity depends on the
phosphorylated form of the protein, then a third phosphor-
ylation pathway (parallel to those of RcsC and acetyl
phosphate) must exist as already suggested by Majdalani
et al. (2005) and Fredericks et al. (2006). Alternatively, the
unphosphorylated form of RcsB might have a regulatory
activity on its own.
The increased activity of RcsB, either by the activation of the
RcsCD phosphorelay or by the overproduction of the
accessory cofactor RcsA, diminishes resistance to acid. This
effect is through a general negative regulation of the
expression of the gad genes. While still an open issue, the
role of this negative regulation might be to prevent costly
runaway expression of the gad genes, or to shut off the
response, once the acid stress is over. This could be crucial
for the bacteria, for instance, once the gastric acid barrier is
passed, in order to efficiently settle into the less acidic
intestinal environment. Any of these hypotheses might then
explain the reported activation of rcsA expression by GadE
that leads to the activation of RcsB activity, and conse-
quently, via a feedback loop, to the repression of the gad
genes.
ACKNOWLEDGEMENTS
We are grateful to A. Wolfe for sharing data before publication, and to
J. W. Foster, N. Majdalani and F. Hommais for gifts of strains and/or
plasmids. We thank Leonora Poljak and Jean-Paul Fensch for helpful
discussions on the manuscript. This work was supported in part by the
Universite Paul Sabatier and the French Ministe`re de lEnseignement
Superieur et de la Recherche (Programme de Recherche Fondamentale
en Microbiologie, Maladies Infectieuses et Parasitaires).
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 Chapitre 2. Rgulation du gne rcsA

Une originalit du systme Rcs est la protine RcsA, co-facteur accessoire instable du
rgulateur de rponse RcsB. RcsA active spcifiquement RcsB pour la transcription de
certains gnes. Au sein du rgulon Rcs, on distingue donc des cibles RcsA-indpendantes et
des cibles RcsA-dpendantes. A ce jour, les cibles RcsA-dpendantes identifies chez E. coli
sont : les gnes de synthse de lacide colanique cps (Stout & Gottesman 1990), lopron
yjbEFGH responsable de la synthse dexopolysaccharide (EPS) (Ferrires et al., 2007),
lopron flhDC, codant pour le rgulateur matre de la synthse des flagelles (Francez-
Charlot et al., 2003 ; pour revue, voir Francez-Charlot et al.,, 2005), les deux oprons de
synthse des curli csgBA et csgDEFG (Vianney et al., 2005) et enfin, le gne rcsA, qui
sautorgule positivement (Ebel & Trempy 1999). Les oprons flhDC et csgBA/DEFG sont
les seuls exemples de rgulation ngative par le systme Rcs. Le mcanisme daction du
cofacteur RcsA sur ses cibles est encore mal compris. Les donnes de la littrature suggrent
quil agisse avec RcsB sous forme dhtrodimre (Kelm et al., 1997). Sa fixation directe
lADN reste nanmoins dmontrer. De mme, son rle biologique nest pas clair. Il
semblerait quil soit impliqu dans la survie de la bactrie hors de lhte (i.e des
tempratures infrieures 37C) (Kelm et al., 1997) et quil soit, au contraire, un handicap
la virulence chez lhte (Lopez-Torres & Stout 1996; Hanna et al., 2003; Sun et al., 2008).
Le rle de RcsA au sein du systme Rcs reste peu document. Sa capacit activer
RcsB indpendamment de la voie RcsFCD pourrait permettre dintgrer des signaux
diffrents de ceux perus par le phosphorelais, comme les tempratures faibles. Cela pourrait
tre un moyen conomique de rpondre des stress en utilisant une protine (RcsB) dun
systme dj existant (le phosphorelais Rcs). Cette vision opportuniste de RcsA est taye par
lanalyse, dans lquipe, de lhistoire volutive des protines Rcs, qui semble indiquer que
RcsA a eu une histoire volutive diffrente de celle du phosphorelais (Darbo et al.,, donnes
non publies). Un autre intrt de RcsA serait de connecter le systme Rcs dautres systme
de rgulation comme celui de la rponse acide contrle par GadE. Dun point de vue
dynamique, il pourrait moduler le dveloppement de la rponse Rcs par sa capacit activer
prfrentiellement la forme phosphoryle de RcsB et maintenir une activit RcsB aprs la
disparition du signal. Cette dernire hypothse a fait lobjet dune partie de mes travaux de
thse, prsents dans ce chapitre.

95
 A.

1 25 50 75 100 125 150 175 207

RcsA
HTH_LUXR

1 25 50 75 100 125 150 175 200 216

RcsB
REC HTH_LUXR

B.
10 20 30 40 50
RcsA MSTIIMDLCSYTRLGLTGYLLSRGVKKRE-INDI-ETVDDLAIACDSQRPSVVFINEDCF
:... . . . . : : . ..... : .: . : :. :. . . .. . :
RcsB MNNMNVIIADDHPIVLFG--IRKSLEQIEWVNVVGEFEDSTALINNLPKLDAHVLITDLS
10 20 30 40 50

60 70 80 90 100 110
RcsA IHDASNSQRIKLI--INQHPNTLFIVFMAIANVHFDEYLLVRKNLLISSKSIK---PESL
. . .. : :: :..: .: :. ... : : . .: : . .: : .:
RcsB MPGDKYGDGITLIKYIKRHFPSLSIIVLTMNNN--PAILSAVLDLDIEGIVLKQGAPTDL
60 70 80 90 100 110

120 130 140 150 160

RcsA DDILGDILK-KETT---ITSFLNMPTLS------LSRTESSMLRMWMAGQGTIQISDQMN
:. . : :. : .. .:. . . :: :: .::.. : . .:. ..:
RcsB PKALAALQKGKKFTPESVSRLLEKISAGGYGDKRLSPKESEVLRLFAEGFLVTEIAKKLN
120 130 140 150 160 170
8
170 180 190 200
RcsA IKAKTVSSHKGNIKRKIKTHNKQVIYHVVRLTDNVTNGIFVNMR
. ::.::.: . :. ..: .. . . ..:: . ..
RcsB RSIKTISSQKKSAMMKLGVENDIALLNYL---SSVTLSP-ADKD
180 190 200 210
9

Figure 42. Comparaison entre RcsA et RcsB. A. Localisation des motifs HTH de RcsA et RcsB ainsi
que du domaine receveur (REC) de RcsB (BlastP, NCBI). B. Alignement des squences protiques de
RcsA et RcsB (AlignP, Infobiogen). Les acides amins D56 et K109 de RcsB conservs chez RcsA sont
en gras. Les deux hlices formant le motif HTH sont encadres en vert et les acides amins de RcsB
importants pour la reconnaissance de la bote RcsAB sont souligns (Pristovsek et al., 2003).

96
I. La protine RcsA

I.1 RcsA a un rle accessoire potentialisant lactivit de RcsB

RcsA a t initialement identifie comme un activateur transcriptionnel des gnes cps

de synthse de la capsule chez Escherichia coli. En effet, une mutation rcsA, comme une
mutation rcsB, diminue lexpression dune fusion cps::lacZ (Gottesman et al., 1985). La
dltion du gne rcsA peut tre compense par la surproduction de protine RcsB, indiquant
que RcsB peut activer la transcription des gnes cps indpendamment de RcsA. Par contre, la
surexpression de RcsA dans une souche mute pour rcsB ne restaure pas la synthse de la
capsule (Brill et al., 1988). Lactivit de RcsA est donc strictement dpendante de celle de
RcsB. Les mmes rsultats ont t obtenus pour la rgulation de lopron flhDC (Francez-
Charlot et al., 2003) et de rcsA (Francez-Charlot, thse 2005). RcsA est donc considre
comme un cofacteur accessoire de RcsB. Cependant en conditions de non surexpression de
RcsB, la prsence de RcsA potentialise lactivit de RcsB in vivo. Ceci a t confirm in vitro
par une analyse par Surface Plasmon Resonance (SPR) sur les promoteurs des gnes cps de
synthse de la capsule chez E. coli et leurs quivalents chez les phytopathognes Erwinia
amylovora et Pantoea stewartii. Le KD du complexe ADN-RcsB diminue dun facteur ~10 et
sa demi-vie passe dune seconde plusieurs minutes lorsque RcsA est ajout dans la raction
en concentration quimolaire RcsB (Pristovsek et al., 2003)

I.2 RcsA, description et mode daction

Le gne rcsA code pour une protine cytoplasmique de 207 acides amins et de poids
molculaire 23,5 kDa. RcsA ne prsente aucune homologie avec les protines des bases de
donnes (BlastP). Cependant 3 lments suggrent que RcsA soit un rgulateur de rponse
dgnr: une taille de lordre de 200 acides amins, une structure secondaire constitue,
dans son domaine N-terminal, dune alternance dhlices alpha et de feuillets bta typique du
domaine receveur des rgulateurs de rponse (c.f introduction) et la prsence de deux des
cinq acides amins critiques pour la phosphorylation (D56, site de phosphorylation et K109,
implique dans le changement de conformation induit par la phosphorylation) (figure 42)

97
 ftsAZ gaaGAtt/catCtgg
A. osmC tcgGAat/atcCtgc
RcsA- tgaGAcg/aatCtga
rprA
indpendants
bdm cagGAct/aatCtta
rcsC tcaGAta/agaCtgc

B. cps aaaGAaa/ctcCtaa
RcsA-
rcsA aagGAtt/atcCgaa
dpendants
flhD tagGAaa/aatCtta

Gnes RcsA-indpendants: gaaGAtt/catCtgg ftsAZ

(botes RcsB)
tcgGAat/atcCtgc osmC
tgaGAcg/aatCtga rprA +
cagGAct/aatCtta bdm
tcaGAta/agaCtgc rcsC

Gnes RcsA-dpendants:
(botes RcsAB)
flhD 10N tagGAaa/aatCtta
aaaGAaa/ctcCtaa 62N cps
aagGAtt/atcCgaa 83N rcsA +

Figure 43. Les botes RcsB et RcsAB dE. coli. A. Alignement des botes RcsB et RcsAB
identifies chez E. coli. Les trois nuclotides conservs sont surligns. B. Positionnement des botes
RcsB et RcsAB par rapport aux promoteurs. Rectangle vert fonc, hexamre -35; rectangle vert
clair, hexamre -10.

98
(West & Stock 2001). De plus, sa partie C-terminale possde un motif HTH putatif de liaison
lADN de la famille FixJ/LuxR (Stout et al., 1991). RcsA et RcsB semblent reconnatre le
mme motif ADN. En effet lactivit de rgulation de RcsA associ RcsB ncessite une
squence dADN spcifique dnomme bote RcsAB. Des expriences in vitro avec des
matrices mutagnises menes chez E. amylovora ont permis de dfinir cette bote et de
montrer que seule la prsence simultane des deux protines permet la formation dun
complexe avec lADN (visualis par retard sur gel) (Wehland et al., 1999). La structure de la
bote RcsAB (14 nuclotides en deux demi sites inverss) suggre la fixation dun
htrodimre RcsB-RcsA, avec chaque monomre reconnaissant un des demi-sites de la bote
RcsAB. Un travail ultrieur sur la rpression du promoteur de lopron flhDC par RcsB et
RcsA suggre que les dterminants ncessaires lactivit RcsA sont situs sur la partie
droite de la bote RcsAB. En effet, la dltion de la partie droite de la bote RcsAB rend une
fusion flhD ::lacZ insensible la surproduction de RcsA alors quelle rpond toujours RcsB
(Francez-Charlot et al., 2003). Pourtant, bien que la participation de RcsA au complexe
tripartite (RcsA-RcsB-ADN) ait t prouve, il existe un doute quant la fixation directe de
RcsA lADN. Tout dabord, le motif HTH putatif de RcsA (figure 42) ne prsente pas les
acides amins qui, dans le cas de celui de RcsB, sont supposs contacter lADN (Pristovsek
et al., 2003). De plus, la fixation de RcsA seule la bote RcsAB na jamais t observe in
vitro, que ce soit lors dexpriences de retard sur gel ou dempreinte la DNaseI
contrairement celle de RcsB (Kelm et al., 1997; Davalos-Garcia et al., 2001; Francez-
Charlot et al., 2003), donnes du laboratoire). Dautre part, la taille des empreintes obtenues
lors dexprience de protection avec His(6)-RcsB seule, ou avec un mlange His(6)-RcsB +
Mal-RcsA est la mme, bien quun homodimre RcsB2 ait un PM ~ 46 kDa contre ~ 80 kDa
pour lhtrodimre RcsA-RcsB. Cette observation pourrait suggrer que RcsA ne contacte
pas directement lADN (Francez-Charlot et al., 2003). Enfin, le dernier argument remettant
en cause la fixation directe de RcsA lADN est labsence de diffrence notable dans la
squence des botes RcsAB et les botes strictement RcsB. En effet, ces deux types de botes
sont composs de 14 nuclotides (riches en AT) rpartis en deux hmi sites imparfaitement
rpts inverss avec un mme consensus GA(5N)C (figure 43). Leur seule diffrence
semble rsider dans leur positionnement par rapport au promoteur du gne concern. Les
botes RcsAB se situent plusieurs dizaines de nuclotides en amont du promoteur
(exception faite pour la seule rpression connue, i.e sur le gne flhD, cas o la bote RcsAB
se situe en aval) alors que les botes RcsB se positionnent immdiatement en amont de la
bote -35. Des expriences prliminaires du laboratoire ont montr que le dplacement dune

99
Figure 44. Prdiction de structure secondaire du petit ARN non codant DsrA. La
rgion complmentaire de lARNm de hns est entoure en vert. M-Fold (M. Zucker).

100
bote RcsAB lemplacement dune bote RcsB la rend strictement RcsB dpendante mais
RcsA-indpendante, soulignant effectivement limportance du positionnement plus que la
squence dans la discrimination entre botes RcsAB et RcsB.

I.3 Rle biologique de RcsA

La protine RcsA est instable (demi-vie infrieure 1 minute), notamment due sa

protolyse par Lon (demi-vie de 30 minutes dans une souche lon) (Torres-Cabassa &
Gottesman 1987; Stout et al., 1991) et, dans une moindre mesure, par ClpYQ (Kuo et al.,
2004). La dgradation de RcsA par la protase ATP-dpendante Lon serait stimule par la
chaperonne de choc thermique DnaJ (Jubete et al., 1996). En se basant sur lobservation que
dans un mutant dnaJ la demie vie de RcsA augmente, et quelle saccumule sous forme
dagrgats, les auteurs proposent un modle selon lequel DnaJ aiderait Lon dgrader RcsA
en maintenant cette dernire dans une conformation soluble. Dun autre ct, en fixant RcsA,
ces chaperonnes lui permettent de garder une conformation active quelle perd lors de
lagrgation. Notons que RcsA na besoin des chaperonnes quen absence de RcsB,
suggrant que le maintien dune conformation active de RcsA require lassociation un
partenaire protique, soit les chaperonnes, soit RcsB (voir Gottesman 1995).
Lanalyse de linteraction de RcsA et RcsB sur le promoteur ams de synthse de
lamylovoran (polysaccharide de capsule) de E. amylovora, ralise en condition htrologue
chez E. coli, montre une activit accrue de RcsA basse temprature. En effet, RcsA purifie
28C prsente plus daffinit pour lADN que la mme protine purifie 37C (Kelm et
al., 1997). Les auteurs suggrent qu une temprature leve, RcsA serait moins active du
fait de labsence de certains liens covalents temprature-dpendants et/ou en raison dune
conformation non optimale.
Enfin, il est noter que la transcription du gne rcsA est rgule ngativement par H-NS
(Histone-like Nucleoid Structuring protein), rgulateur global qui teint lexpression de
nombreux gnes bactriens. Cette rgulation ngative de rcsA est antagonise basse
temprature par le produit du gne dsrA (Sledjeski & Gottesman 1995). Celui-ci
(downstream region) est situ juste en aval de rcsA et est transcrit de manire convergente
lui. Il code pour un petit ARN non traduit de 85 nuclotides structur en trois tige-boucles
(figure44). La tige-boucle centrale interagit avec lARNm de hns, acclrant sa dgradation
avec pour consquence la diminution de la concentration intracellulaire de H-NS (Lease &

101
Belfort 2000). Lactivit de DsrA basse temprature est due la fois une plus forte
expression et une plus grande stabilit. La demie-vie de DsrA 25C est de lordre de 23
minutes contre 4 minutes 37C ou 42C (Repoila & Gottesman 2001; 2003).
Les lments de rgulation transcriptionnels et post-traductionnels convergent vers une
activit de RcsA plus importante basse temprature et concordent avec le fait quen
conditions standards, mais aussi dans une souche lon-, la production de la capsule nest
observable quen dessous de 30C (Kelm et al., 1997). Ces donnes runies suggrent un rle
de RcsA dans la protection de la bactrie en dehors de lorganisme hte (mammifre,
gnralement autour de 37C). Cette hypothse semble confirme par le fait que la capsule
dacide colanique nest pas indispensable, voire attnue la pathognicit chez les E. coli
uropathognes (Lopez-Torres & Stout 1996; Hanna et al., 2003) et que RcsA nintervient pas
dans la survie de Salmonella enterica serovar Typhimurium chez la souris (Erickson &
Detweiler 2006). Rcemment, il a t montr que la perte de rcsA par slection ngative tait
ncessaire au pouvoir infectieux de Y. pestis (Sun et al., 2008). Y. pestis a rcemment volu
partir de Y. pseudotuberculosis. Chez cette dernire, Y. pseudotuberculosis, RcsA et RcsB
sont fonctionnels et rgulent ngativement la formation des biofilms. Or, chez Y. pestis,
bactrie hautement pathogne, la formation de biofilms est importante pour la dissmination.
En effet, Y. pestis utilise la puce pour vecteur dinfection et dveloppe, au sein de son tractus
digestif, un biofilm qui empche le sang datteindre son estomac, poussant la puce piquer
de plus en plus danimaux pour assouvir sa faim, propageant linfection.

I.4 RcsA exemple unique ?

Les systmes deux composants utilisant des co-facteurs sont rares. A ma connaissance,
hormis le systme Rcs, on ne connat que trois exemples : le systme BvgAS impliqu dans
la transcription des gnes de virulence de Bordetella pertussis, le systme TorSR permettant
la respiration anarobie dE.coli en prsence de TMAO ou encore le systme ComPA
responsable du dveloppement de la comptence chez B. subtilis. Nanmoins, aucun de ces
co-facteurs ne prsente un mode daction identique celui de RcsA envers RcsB.
Le locus bvgAS de B. pertussis code pour un systme deux composants compos dun
senseur, BvgS et dun rgulateur de rponse, BvgA. Ce locus est impliqu dans lactivation
de nombreux gnes de virulence chez B. pertussis, agent tiologique de la coqueluche (e.g
fha, bvg, ptx, cya). Dans les mmes conditions dactivation, le systme BvgAS rprime des

102
gnes de fonction inconnue, les gnes vrg (vir-repressed genes). Cette rpression est
strictement dpendante de BvgAS mais ncessite un co-facteur BvgR (Bordetella virulence
gene Repression). Celui-ci fixerait un motif ADN en aval de lATG, diffrent de celui de
BvgA. Le gne bvgR est situ immdiatement en aval du locus bvgAS et est transcrit de
manire convergente. Sa transcription est positivement rgule par BvgA (Merkel & Stibitz
1995; Merkel et al., 1998; 2003). Contrairement RcsA, BvgR est indispensable la
rpression des gnes bvg et nagit que dans le cadre dune rpression.
En conditions danarobiose, E. coli peut utiliser le TMAO comme accepteur final
dlectrons. La rduction du TMAO en trimethylamine (TMA) est principalement ralise
par la rductase TMAO. Ce systme est cod par lopron torCAD qui est activ en prsence
de TMAO. Cette rgulation implique un systme deux composants complexe comprenant
TorS, un senseur HK non orthodoxe, et TorR, un rgulateur de rponse activateur
transcriptionnel de la famille OmpR. En prsence de TMAO dans lenvironnement, le
senseur TorS sautophosphoryle et transfre ce groupement phosphoryle TorR via un
phosphorelais complexe His-Asp-His-Asp. Ainsi activ, TorR peut se fixer sur les botes Tor
situes en amont de lopron torCAD induisant son expression par recrutement de lARN
polymrase. M. Ansaldi et ses collaborateurs (2004) ont mis en vidence un nouveau type
dinhibiteur de rgulateur de rponse. TorI est une protine dorigine phagique qui est
capable de se lier au domaine effecteur (C-terminal) de TorR pour rprimer lexpression de
lopron torCAD. Linteraction de TorI avec TorR nentrave pas la fixation de ce dernier
lADN mais empche le recrutement de lARN Polymrase. TorI nest pas seulement un
rgulateur transcriptionnel ddi rprimer TorR mais appartient galement une famille
atypique dexcisionases de phages (Elantak et al., 2005). Dans cet exemple, le cofacteur du
rgulateur de rponse inhibe son action en lempchant de recruter lARN Polymrase sur le
promoteur de ses gnes cibles. De nouveau, contrairement RcsA, le cofacteur prsent
antagonise fonctionnellement le rgulateur de rponse TorR.
La famille des protines Rap de B. subtilis est caractrise par des modules dinteraction
protine-protine contenant des tetratricopeptides rpts (TPR). Les TPR de RapC, RapF et
RapH mdient leur interaction avec des pentapeptides inhibiteurs qui leur sont spcifiques :
PhrC, PhrF et PhrH. Mais, comme nous lavons vu en introduction, les TPR de ces protines
Rap peuvent aussi lier le rgulateur de rponse ComA responsable du dveloppement de
ltat de comptence. En fixant ComA, RapC, RapF et RapH empchent le rgulateur de
rponse de se lier lADN de sa cible. La liaison Rap-ComA peut tre spcifiquement
inhibe par le pentapeptide correspondant (Core & Perego 2003; Bongiorni et al., 2005;

103
Smits et al., 2007). Dans cet exemple, le cofacteur du rgulateur de rponse inhibe sa fixation
aux gnes cibles, permettant dempcher le dveloppement de la comptence lorsque quelle
nest pas requise. A nouveau, comme TorI et contrairement RcsA, ces cofacteurs
antagonisent lactivit du rgulateur de rponse.

Avec RcsA, deux autres protines ont t dcrites comme interagissant avec RcsB: TviA
chez Salmonella enterica serovar Thyphi et RmpA chez Klebsiella pneumoniae. Leur rle
positif dans la virulence laisse entrevoir un modle selon lequel RcsB utiliserait des co-
facteurs diffrents selon que la virulence doit tre mise en place ou non. Chez S. enterica
serovar Typhi, lexpression de lantigne Vi de capsule est indispensable la survie des
cellules dans les macrophages humains. La synthse de cet antigne est rgie par le cluster de
gnes viaB. Chez Salmonella, RcsB vraisemblablement associe TviA, active la
transcription du cluster indpendamment de RcsA. Contrairement RcsA, TviA nest pas
dgrade par Lon (Virlogeux et al., 1996). Plus rcemment, il a t dmontr que le couple
RcsB-TviA active la transcription du cluster pil, responsable de la synthse des pili de type
IVB indispensables la virulence (Lee et al., 2006). Chez K. pneumoniae, naturellement
mucode, la capsule est ncessaire la virulence. Lexpression de cette capsule est sous
contrle dun plasmide. La protine RmpA code par un gne de ce plasmide est suffisante
pour permettre la synthse dacide colanique chez E. coli via lactivation de RcsB, suggrant
que RmpA peut se substituer RcsA (Nassif, Fournier et al., 1989; Nassif, Honor et al.,
1989; Vasselon et al., 1991; Wacharotayankun et al., 1992). La comparaison des squences
protiques de RcsA, TviA et RmpA ne montre aucune similarit significative de squence
(Blastp NCBI & Clustal W).
Au vu des donnes de la littrature, le modle qui se dgage est que RcsA est utilis en
association avec RcsB dans les cas o la virulence nest pas ncessaire (voire quand il faut la
diminuer) alors que la mise en place des dterminants de virulence fait appel dautres co-
facteurs tels que TviA ou RmpA. Ainsi, un mme rgulateur de rponse pourrait sassocier
diffrents co-facteurs en fonction des besoins de la cellule, vitant la ncessit dune protine
ddie chaque stimulus.

I.5 Conservation

Les protines principales du systme, i.e RcsCDB, ainsi que RcsF sont conserves chez
E. coli, Shigella spp, S. Typhi et Typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Photorhabdus

104
luminescens, Proteus mirabilis, Yersinia spp et Erwinia spp. (Darbo et al.,, donnes non
publies). RcsA en revanche, nest pas retrouv chez E. carotovora. Chez Shigella
dysenteriae, une Squence dInsertion interrompt lORF rcsA juste en amont de ses 77
codons terminaux, remettant en cause la fonctionnalit de la protine. Chez dautres
organismes comme P. luminescens et Y. spp, certaines protines annotes RcsA prsentent un
taux de similarit trs faible (< 25%) remettant en cause leur appartenance la famille RcsA.
Nanmoins, il a rcemment t montr que le gne rcsA de Y. pseudotuberculosis est
fonctionnel (Sun et al., 2008).
La raison pour laquelle RcsA nest pas conserv chez certaines Entrobactries nest pas
claire mais la rponse est sans doute lie au style de vie de ces organismes. Cest le cas de
Yersinia pestis dans lexemple cit prcdemment (paragraphe I.3 Rle biologique de RcsA).

I.6 Rle du cofacteur RcsA dans le dveloppement de la rponse Rcs

La rponse Rcs est active par des stress de lenveloppe travers le phosphorelais
RcsFCD (c.f introduction). La voie dactivation par RcsA permettrait lutilisation de
lactivit RcsB suite des stress diffrents de ceux perus par le phosphorelais. Par exemple,
RcsA, via son activit temprature-dpendante agirait comme un thermomtre activant
RcsB basse temprature afin de moduler lexpression des gnes RcsA-dpendants (cps et
flhDC), notamment dans la situation o la bactrie se trouverait hors de lhte. Un autre
signal intgrable via RcsA a t dcouvert chez le phytopathogne Pantoea stewartii o la
rponse est mdie par la densit cellulaire. Cette rgulation rpond une AHL (acyl
homosrine lactone) qui module lactivit du gne esaR, rgulateur ngatif de rcsA. En
condition de forte densit cellulaire, lAHL empche EsaR de se fixer au promoteur de rcsA,
permettant la production dEPS (Minogue et al., 2005). Un autre type de signal perceptible
par RcsA a dj t cit dans le chapitre prcdent. Il sagit de la rponse aux bas pHs. En
effet, le promoteur rcsA est activ par GadE, le rgulateur central de la rsistance acide
glutamate-dpendante chez E. coli (Hommais et al., 2004). Cependant, bien que cette
observation ait t lorigine de mon travail de thse, le rle de rcsA dans la rponse acide
nest pas clairement tabli (c.f Rsultats chapitre 1).
Diffrentes donnes de la littrature suggrent que RcsA appartienne dautres
rgulons que celui du systme Rcs. Une analyse in silico du promoteur rcsA a permis
didentifier, deux sites de fixation potentiels pour CpxR, rgulateur de rponse du systme

105
deux composants CpxAR (De Wulf et al., 2002). De manire intressante, ce phosphorelais
est lui aussi impliqu dans la rponse aux stress denveloppe, dans la formation des biofilms,
dans la mobilit et la synthse des flagelles ainsi que dans la virulence. On peut donc se
demander si le systme CpxAR agit sur ces aspects du mtabolisme cellulaires via RcsA.
Le gne rcsA est galement rgul par le diGMPc. Cest un second messager contrlant la
mobilit et ladhsion des bactries. En prsence dune forte concentration de diGMPc, le
gne rcsA est trs fortement exprim, conduisant lactivation des gnes de synthse de la
capsule (cps) et la rpression de la synthse des flagelles (via lopron matre de leur
synthse, flhDC) (Mndez-Ortiz et al., 2006). Son lien avec RcsA, mme sil reste tudier
plus profondment, connecte le systme Rcs au mtabolisme cellulaire dans sa globalit.

Une dernire possibilit quant au rle de RcsA au sein du systme Rcs serait quil
module la ractivit, lamplitude et la dure de la rponse Rcs. En effet, la capacit de RcsA
potentialiser RcsB pourrait permettre de rguler spcifiquement les cibles RcsA-
dpendantes pour des signaux de faible intensit. Dautre part, rcsA tant rgul positivement
par RcsB, laugmentation dexpression de RcsA suite la perception dun signal par le
phosphorelais RcsCD pourrait maintenir RcsB actif sur les cibles RcsA-dpendantes et ce,
mme si le signal initial nactive plus le phosphorelais. Dun autre ct, cette interaction de
RcsA surnumraire avec RcsB pourrait mettre fin plus rapidement la rponse des cibles
RcsB strictement dpendantes, RcsA titrant RcsB.
Un des objectifs de mes travaux de thse, a t danalyser limpact de RcsA et de son
autorgulation, via RcsB, sur la dynamique de la rponse Rcs.

II. Rsultats

II.1 Identification des dterminants ncessaires la rgulation de rcsA

Pour comprendre le rle de RcsA et de sa rgulation sur le dveloppement de la rponse

Rcs, la stratgie exprimentale envisage tait dinactiver les dterminants ncessaires ces
rgulations et den analyser les consquences sur lexpression de cibles RcsA-dpendantes et
indpendantes lors de linduction du systme Rcs.
Au dbut de ce travail, les donnes concernant la localisation des dterminants
ncessaires lautorgulation de rcsA taient contradictoires. Lautorgulation de rcsA a t

106
initialement mise en vidence par W. Ebel et J. Trempy (Ebel & Trempy 1999). Dans une
souche lon, lexpression dune fusion rcsA::lacZ est 100 fois plus forte que dans une souche
sauvage. Ce rsultat est corrl une stabilisation de la protine en absence de la protase,
suggrant la possibilit dune autorgulation de rcsA. En accord avec cette hypothse, dans
les souches rcsA ou lon rcsA, le niveau dexpression de la fusion rcsA::lacZ est faible et
identique dans les deux souches. RcsA avait t initialement identifie comme un activateur
transcriptionnel des gnes cps de synthse de la capsule (Stout et al., 1991). En analysant
cette rgulation sur les gnes quivalent (gnes ams) chez E. amylovora par gels retards, le
dterminant ncessaire cette rgulation, dnomm bote RcsAB, a t cartographi dans la
rgion promotrice (Kelm et al., 1997). Par alignement entre les rgions promotrices des
gnes cps, ams et rcsA, Ebel et Trempy ont propos une bote RcsAB (CTTAAT-A-
TAATTC), 117 pb en amont du -35 de rcsA. En accord avec ce rsultat, les dltions peu
rsolutives incluant cette bote rendaient les fusions transcriptionnelles correspondantes
insensibles une mutation lon. Dans ce mme travail, sur la base darguments extrmement
indirects, les auteurs ont propos un rle accessoire RcsB dans cette autorgulation. Ce
dernier rsultat a t invalid par notre groupe qui a montr, par des approches gntiques,
que RcsB tait absolument ncessaire cette rgulation, RcsA gardant son statut de protine
accessoire (A. Francez-Charlot, thse 2005).
Dans un travail ultrieur bas sur de la mutagense dirige et des analyses en gels retard,
une localisation diffrente de la bote RcsAB a t propose (TAAGGAT::TATCCGA) 85
pb en amont du -35 de rcsA (Wehland & Bernhard 2000). En accord avec cette localisation,
in vivo, des mutations introduites dans cette bote diminuaient dramatiquement la synthse de
la capsule, suggrant quen absence dune bote optimale, lexpression de rcsA tait plus
faible. Enfin, sur la base dun alignement des botes RcsAB des gnes rcsA (E. coli, S. Typhi,
Klebsiella pneumoniae, E. amylovora), cps (E. coli), ams (E. amylovora), cpsA (P. stewartii),
les auteurs ont propos un consensus pour la bote RcsAB, une squence rpte inverse de
14pb TaAGaat::atTCctA.
Il est noter que cette squence est diffrente de celle propose prcdemment par Ebel
et Trempy, mais proche de la squence de la bote RcsB, TTGAAGATT::CATCTGGTTG en
amont des gnes de division ftsAZ que notre groupe avait propose (Carballs et al., 1999).

Afin de caractriser dfinitivement la bote RcsAB du gne rcsA, jai ralis des
empreintes la DNaseI sur un fragment allant de -258 +198 par rapport au +1 de
transcription avec les protines Mal-RcsA - une fusion traductionnelle fonctionnelle entre la

107
 RcsB - -
RcsA (2M) - - - - - - - - + + + + + + + +
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 A T G C

+10
+1

-20

-40

-60

-80

-100

-110

-120

-130

-140

-150

-160

-160 -150 -140 -130 -120 -110

5- cattaatataattccgtaacgtttatcatgttatcctaaggattatccgaaaaataatacc - 3
3- gtaattatattaaggcattgcaaatagtacaataggattcctaataggctttttattatgg - 5

-100 -90 -80 -70 -60 -50

5- tacgaacatcttccaggatactcctgcagcgaaatatttgttttaagctcactcacatatc - 3
3- atgcttgtagaaggtcctatgaggacgtctctttataaacaaaattcgagtgagtgtatag - 5

-40 -30 -20 -10 +1 +10

5- gcaacatttactttactttaagacaattccaggcaaattatacaacactttacgggatagt - 3
3- cgttgtaaatgaaatgaaattctgttaaggtccgtttaatatgttgtgaaatgccctatca - 5

Figure 45. Protection la DNaseI par RcsB et RcsA sur la rgion promotrice sauvage du gne rcsA.
A. La sonde ADN radiomarque correspondant au brin sens a t incube seule (1), avec RcsBD56E (1 8),
Mal-RcsA (16) ou un mlange des deux protines (9 15). RcsBD56E a t utilise aux concentrations
finales de 0,03 M (2 et 9), 0,06 M (3 et 10), 0,3 M (4 et 11), 0,6 M (5 et 12), 3 M (6 et 13), 6 M (7
et 14) et 30 M (8 et 15).Mal-RcsA a t utilise la concentration finale de 2 M (9 16). Les
coordonnes se rfrent au point +1 de transcription. La ligne verticale indique la rgion protge.
A,T,G,C indique la squence ADN obtenue avec les oligonuclotides radiomarqus spcifiques du brin
sens. B. Squence de la rgion promotrice de rcsA. La bote RcsAB identifie par Wehland and Bernhard
(2000) est indique en rouge. La rgion protge est dlimite par un trait horizontal. Les botes -10 et -35
sont encadres en vert et le point +1 de transcription en gras.

108
protine MalE et RcsA (Kelm et al., 1997) - et/ou His-RcsBD56E. Cette dernire porte une
tiquette de 6 rsidus histidine place en N-terminal pour faciliter sa purification et une
substitution du glutamate en position 56 par un aspartate, gnrant une protine beaucoup plus
active en mimant probablement ltat de phosphorylation de RcsB (Gupte et al., 1997;
Davalos-Garcia et al., 2001). Comme indiqu sur la figure 45 piste 8, la protine His-
RcsBD56E seule partir de 30 M engendre une empreinte. La zone protge stend de -138
-110 pb (ttatccTAAGGATTATCCGAAaaataat) et confirme par consquent lidentit de la
boite RcsAB propose par Wehland et Berhnard (Wehland & Bernhard 2000). De plus la
taille de lempreinte ( 19pb) suggre la fixation dun dimre de RcsB cette rgion. RcsA
seule est incapable de donner une empreinte (piste 16), alors que le mlange des deux
protines gnre une empreinte pour des concentrations de RcsBD56E 10 fois plus faibles (
partir de 3 M, pistes 13 15) confirmant ainsi les donnes antrieures du groupe (Anne
Francez-Charlot, thse 2005) quant au rle essentiel de RcsB dans la rgulation de rcsA mais
galement quant au rle stimulateur accessoire exerc par RcsA sur lactivit de RcsB.
Remarquablement, la taille de lempreinte en prsence de Mal-RcsA, une protine denviron
60 KD (contre ~23.5 KD pour RcsA et RcsB) nest pas plus importante que celle due RcsB
seule. Ce rsultat semble aller lencontre dun modle de fixation dun htrodimre RcsAB.
Un modle alternatif serait la fixation dun dimre RcsB2 en sandwich entre lADN et
RcsA. Un rsultat similaire a t obtenu sur la bote RcsAB de flhDC (Francez-Charlot et al.,
2003).

II.2 La bote RcsAB est responsable de lautorgulation de rcsA mais nest pas le

seul dterminant impliqu dans la rgulation de rcsA par RcsB

Dans lobjectif dtudier le rle de rcsA et de sa rgulation sur le dveloppement de la

rponse Rcs, jai introduit des mutations ponctuelles dans la bote RcsAB afin den liminer
lautorgulation (par RcsA et RcsB). Pour ce faire, les bases les plus conserves de la bote
RcsAB ont t substitues, approche dj utilise avec succs sur lopron flhDC (Francez-
Charlot et al., 2003).
Les botes Rcs sont constitues de deux demi-sites AT-riches de 7 nuclotides avec un
cur portant 3 bases invariantes G-4A-3N-2N-1::N+1N+2N+3C+4. (c.f figure 43). Dans le cadre
de lhypothse de la fixation dun htrodimre RcsAB, les travaux de Francez-Charlot et

109
A.
Bote RcsAB
taagGAttatcCgaa -35 -10 rcsA
-132 -117 +1 +133 +168

rcsA wt
GA
rcsA 2M CT

gGA
rcsA 3M cCT

gGA C
rcsA 4M cCT G

B.
pHRcsA pHRcsB

- IPTG + IPTG Facteur - IPTG + IPTG Facteur

dinduction dinduction
rcsA wt 210 453 2.2 205 1343 6.5

rcsA 2M 94 242 2.5 70 413 5.9

rcsA 3M 151 183 1.2 105 583 5.5

rcsA 4M 170 173 1 308 1231 4

Figure 46. Recherche des dterminants de la rgulation de rcsA par mutations ponctuelles.
A. Mutations ponctuelles dans la bote RcsAB. Les diffrents fragments du promoteur rcsA clons
en amont de lacZ sont reprsents. Les coordonnes font rfrence au point de dmarrage de
transcription (+1). Les mutations sont reprsentes en rouge et les transitions indiques. B.
Dosages de lactivit -galactosidase: effet de la surexpression de RcsA ou RcsB. Les dosages ont
t raliss en cintique selon le protocole standard. Seules les valeurs obtenues T90min sont
prsentes. Pour chaque protine surexprime, le facteur dinduction (+IPTG/-IPTG) est not dans
la colonne de droite.

110
collaborateurs (Francez-Charlot et al., 2003) sur lopron flhDC suggrent que les
dterminants spcifiques ncessaires lactivit RcsA seraient situs dans le site droit de
la bote RcsAB, impliquant que RcsB se fixerait sur la partie gauche. Jai par consquent
substitu le di-nuclotide GA du site gauche par le di-nuclotide CT, ce qui devait avoir
pour effet dliminer la fois lautorgulation par RcsA (puisque celle-ci est strictement
dpendante de lactivit RcsB) et la rgulation par RcsB.
Les effets des mutations sur la rponse du gne rcsA aux activits RcsA et RcsB ont t
tests laide de fusions transcriptionnelles (rcsAp-lacZ) installes au site sattachement
(attB) du bactriophage sur le chromosome (figure 46A, voir Matriels & Mthodes).
Lexpression des fusions a t analyse aprs surproduction des protines fonctionnelles
(His6)-RcsA et (His6)-RcsB partir des plasmides pHRcsA ou pHRcsB. Ces plasmides
transcrivent rcsA et rcsB sous contrle du promoteur lacUV5.
Les rsultats sont prsents dans le tableau (figure 46B). La surproduction de RcsB a
stimul lexpression de la fusion sauvage environ 6 fois, contre 2 lors de la surproduction de
RcsA. Lintroduction de la substitution GA/CT (fusion 2M) a provoqu une diminution de
lexpression basale de rcsA dun facteur ~2.5 (de 200 80 UM) et, de manire inattendue,
na aboli ni la rponse RcsB ni la rponse RcsA (facteurs dinduction de 6 et 2,
respectivement).
Le nuclotide immdiatement en amont du GA en position -4 tant relativement bien
conserv (G ou A, c.f figure 43), jai introduit la triple mutation CCT la place de GGA
(fusion 3M), esprant abolir lautorgulation de rcsA. Comme indiqu dans la figure 46B,
cette fusion est galement reste sensible lactivit RcsB, avec un facteur dinduction
similaire (~6) et un niveau basal divis par deux par rapport la souche sauvage. En
revanche, la fusion ne rpondait plus la surexpression de RcsA (le facteur dinduction par
RcsA dans la souche 3M nest plus que de 1,2), ce qui pouvait suggrer que les dterminants
permettant lactivit de RcsA taient non seulement localiss dans le site droit (Carballs
et al., 1999), mais galement prsents dans le site gauche des botes RcsAB. Cette fusion
tait cependant intressante car elle devenait insensible lautorgulation par RcsA.
Nanmoins, la fusion 3M rpondait encore RcsB. De mme la fusion 4M portant la
substitution supplmentaire du C+4 en G dans le site droit ne rpondait plus RcsA mais
restait tonnamment sensible RcsB (activation dun facteur 4).
Cette impossibilit dabolir la rgulation de rcsA par RcsB en mutant les bases conserves
de la bote RcsAB suggrait une situation plus complexe pour la rgulation de rcsA par le
systme Rcs. Que la bote RcsAB identifie par Wehland & Berhnard (2000) contribuait

111
A.

Bote RcsAB
rcsA wt taagGAttatcCgaa ccagGAtactcCtgc -35 -10 rcsA
-132 -117 -95 -80 +1 +133

rcsA ABbox
-117 +168
rcsA box2min
-95 +168
rcsA box2
-80 +168
rcsA -35min
-40 +168

B.
1200,00

1000,00

800,00
U.M

pAPT110+IPTG
U.M

600,00 pHRcsA+IPTG
pHRcsB+IPTG

400,00

200,00

0,00
wt ABbox box2min box2 35min

Figure 47. Approche par dltion en 5 de la rgion promotrice du gne rcsA. A. Schma des
diffrentes fusions transcriptionnelles rcsA::lacZ dltes en 5. B. Dosage de lactivit -
galactosidase lors de la surexpression de RcsA ou RcsB par lIPTG (tmoin ngatif, pAPT110 +
IPTG). Les rsultats prsents sont une moyenne de trois expriences indpendantes, seuls les rsultats
obtenus T90min sont indiqus (les dosages avaient t raliss en cintique). U.M, Units Miller.

112
cette rgulation semblait correct, car dune part jai confirm lidentit de la bote par
lexprience de protection la DNase I et, dautre part, jai montr que cette bote tait
ncessaire lactivit de RcsA. Cependant pour rendre compte du maintien dune activit
RcsB malgr llimination des bases critiques de la bote, dautres explications devaient tre
proposes. A ce stade, au moins deux hypothses pouvaient tre avances : (i) RcsB
reconnaissait encore la bote mute, RcsA ne contribuant plus lactivit RcsB, (ii) Il existait
une deuxime voie, RcsA-indpendante, pour la rgulation de rcsA par RcsB. Cette deuxime
voie devait tre majeure puisque llimination de la premire, la bote RcsAB, affectait peu
lamplitude de la rgulation.

II.3 Mise en vidence dune deuxime voie majeure pour la rgulation de rcsA

Pour identifier les dterminants de cette deuxime voie de rgulation, jai effectu une
analyse par dltion en 5 des fusions (rcsAp-lacZ) (c.f Matriels & Mthodes). Les donnes
sont prsentes dans la figure 47. Lexpression de la fusion dlte de la bote RcsAB (rcsA
ABbox), tait insensible la surproduction de RcsA, mais est reste sensible celle de RcsB.
Ces rsultats taient qualitativement similaires ceux obtenus avec les constructions portant
des mutations dans la bote RcsAB (fusions 3M et 4M). Par consquent ils signalaient
lexistence dune deuxime voie pour la rgulation de rcsA par RcsB et confirmaient que la
bote RcsAB tait implique dans lautorgulation (de rcsA par RcsA). Quantitativement,
lamplitude de lactivation de lexpression de rcsA dans la fusion dlte tait lgrement
infrieure celle observe pour la fusion sauvage (facteur 4 vs facteur 6). Ce rsultat indiquait
donc, que dans ces conditions exprimentales, rcsA tait essentiellement rgul par RcsB
travers cette deuxime voie.
Afin didentifier cette deuxime voie de rgulation lanalyse en 5 de la rgion amont du
promoteur de rcsA a t poursuivie. (figure 47). Comme le montre le rsultat des dosages -
galactosidase, aucune dltion en amont de la bote -35 na aboli la rgulation de rcsA par
RcsB. Le gne rcsA possdant une squence leader de 133 nuclotides suggrant lventuelle
prsence de motifs rgulateurs (Sledjeski & Gottesman 1995), jai effectu une analyse par
dltion en 3 du promoteur.
Comme lindique la figure 48, la dltion de la squence leader entre les nuclotides +113
et +133 na pas entran la perte de rgulation de rcsA par RcsB (voir fusions rcsA ABbox

113
A.
Bote RcsAB
rcsA wt taagGAttatcCgaa ccagGAtactcCtgc -35 -10 rcsA
-132 -117 -95 -80 +1 +133

rcsA ABbox
-117 +168
rcsA box2min
-95 +168
rcsA box2
-80 +168
rcsA -35min
-40 +168
rcsA ABbox - ATG
-117 +133
rcsA ABbox - +113
-117 +113
rcsA ABbox - +66
-117 +66
rcsA ABbox - +1
-117 +1
rcsA ABboxwt - ATG
-132 +133
rcsA ABboxwt - +66
-132 +66

B. 1800,00

1600,00

1400,00

1200,00

1000,00 pAPT110+IPTG
U.M

pHRcsA+IPTG
800,00 pHRcsB+IPTG

600,00

400,00

200,00

0,00
ABbox ABbox ABbox ABbox +1 ABboxwt ABboxwt
ATG +113 +66 ATG +66

Figure 48. Approche par dltion en 3 de la rgion promotrice du gne rcsA. A. Schma des
diffrentes fusions rcsA::lacZ dltes en 3 (les fusions dltes en 5 prsentes dans la figure
prcdente sont rappeles en gris clair) B. Dosage de lactivit -galactosidase lors de la surexpression de
RcsA ou RcsB par lIPTG (tmoin ngatif, pAPT110 + IPTG). Les rsultats prsents sont une moyenne
de trois expriences indpendantes, seuls les rsultats obtenus T90min sont indiqus (les dosages avaient
t raliss en cintique). U.M, Units Miller.

114
ATG et rcsA ABbox - +113). En revanche, toute fusion portant des dltions au del de la
position +66 est devenue insensible la surproduction de RcsB (fusions rcsA ABbox - +66
et rcsA ABbox - +1). Ce rsultat a permis de conclure que les dterminants impliqus dans
cette deuxime voie de rgulation de rcsA par RcsB se situaient entre les nuclotides +66 et
+113 de la squence leader de rcsA. Notons que dans les fusions possdant une bote RcsAB
sauvage, le niveau dexpression basal des fusions ne rpondant plus RcsB tait du mme
ordre de grandeur que le niveau dexpression des fusions rpondant toujours la
surproduction de RcsB (fusions rcsA ABboxwt ATG et rcsA ABboxwt - +66). Cette
observation suggrait un modle selon lequel lactivit de RcsB au niveau de la squence
leader antagoniserait la rpression de lexpression de rcsA par un lment X impliquant la
rgion +66/+113.

II.4 Rle de RcsA dans la rponse Rcs

Ce projet avait pour objectif danalyser de manire fine la contribution du cofacteur RcsA
dans la cintique de rponse des cibles rgules par RcsB, la fois louverture du systme
Rcs (tat ON) et sa fermeture (tat OFF). Pour cette tude, nous avons construit des fusions
transcriptionnelles plasmidiques entre les rgions promotrices des gnes RcsA-dpendants
(cps) ou -indpendants (bdm) et le gne codant pour la GFP (Green Fluorescent Protein).
Lactivit des fusions a t suivie en cintique en microplaque 96 puits dans un fluorimtre
30C en milieu minimum additionn de casaminoacides aprs activation du systme Rcs par
surexpression de RcsF (ouverture) et en conditions de fermeture, i.e aprs arrt de la
surexpression, en contexte sauvage ou rcsA (c.f Matriels & Mthodes).
Les rsultats sont prsents sur la figure 49. En conditions douverture, la cintique
dinduction de la fusion cps::gfp tait plus faible dans la souche rcsA que dans la souche
sauvage (figure 49A). Ce rsultat tait en accord avec le rle positif de RcsA sur les cibles
RcsA-dpendantes. Au contraire, la cintique dinduction du gne bdm tait plus forte en
contexte rcsA quen contexte sauvage. Par consquent, RcsA avait un effet ngatif sur
linduction des cibles RcsA-indpendantes. Ce rsultat, bien que nous layons anticip, tait
novateur et soulevait de nouvelles questions sur la manire dont RcsA et RcsB rgulent les
cibles Rcs.
En condition de fermeture lexpression de la fusion cps::gfp a continu daugmenter pour
se stabiliser aprs environ trois heures dans la souche sauvage (figure 49B). Au contraire,

115
 A.
18

16

14

12
pbdm_wt
F/DO normT0

10 pbdm_rcsA
8 pcps_wt
pcps_rcsA
6

0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180
min

B. C.

4,5 3

4
2,5
3,5
F/DO normT0
F/DO normT0

3 2

2,5 pcps_wt pbdm_wt

1,5
2 pcps_rcsA pbdm_rcsA

1,5 1

1
0,5
0,5

0 0
0

17,5

35

52,5

70
87,5

105

123
140
158

175

193

210

228
245

17,5
35

52,5

70
87,5

105

123
140

158

175
193

210

228
245

min min

Figure 49. Cintiques dinduction ou de fermeture des cibles Rcs. Les rapports dintensit de
fluorescence sur la DO600nm normaliss au mme rapport T0 sont prsents en fonction du temps
pour les fusions transcriptionnelles plasmidiques cps::gfp (pcps) et bdm::gfp (pbdm) dans une
souche sauvage ou rcsA. A. Ouverture du systme par surexpression de RcsF (pHRcsF) partir de
500M dIPTG. B et C. Fermeture du systme par limination de lIPTG pour les fusions
cps::gfp (pcps) et bdm::gfp (pbdm), respectivement.

116
dans la souche rcsA, cette expression sest immdiatement stabilise (figure 49B). Ces
rsultats indiquaient que RcsA permettait de maintenir une activit RcsB aux cibles RcsA-
dpendantes aprs la disparition du signal. En revanche, les profils dexpression de la cible
RcsA-indpendante bdm (figure 49C) taient similaires pour les deux souches, suggrant que
lors de la fermeture, RcsA ne contribuait pas lexpression des cibles RcsA-indpendantes.
Ces rsultats sont trs prliminaires et demandent tre confirms sur dautres cibles
RcsA-dpendantes et -indpendantes. Cependant, ils semblent indiquer que RcsA contribue
de manire sensible la qualit de la rponse Rcs sur lensemble des gnes du rgulon RcsB,
nous obligeant moduler la dfinition que nous avions de la notion de cibles RcsA-
dpendantes et -indpendantes.

En conclusion de ce chapitre sur la rgulation du gne rcsA, faute de temps et cause

dune situation relativement complexe pour la rgulation de rcsA, mon travail na pas permis
davoir une image complte de limpact de RcsA sur la dynamique du systme. Il a
nanmoins apport des lments nouveaux sur la rgulation de rcsA et, sur la contribution de
RcsA lexpression des gnes cibles. Ces diffrents lments seront discuts dans le chapitre
Discussions et perspectives.

117
D.

Figure 50. Principe du BACTH. Daprs Karimova et al., 1998

118
 CHAPITRE 3. Identification des partenaires protiques du systme Rcs
chez E. coli.

Lobjectif principal de ma thse, tait dobtenir une vision intgre du systme Rcs,
c'est--dire didentifier tous ces partenaires cellulaires. Les rsultats attendus taient (i) une
meilleure comprhension du fonctionnement du systme Rcs et au-del des systmes
complexes de transduction du signal, en rvlant le rle respectif des diffrents modules qui
les constituent, (ii) de renseigner de manire exhaustive sur lexistence de rgulation(s)
croise(s) en prenant comme modle le systme Rcs et, dun point de vue volutif,
damliorer notre comprhension de lavantage dun systme complexe, (iii) lutilisation du
systme Rcs comme modle intgr pour ltude de la dynamique des rseaux de rgulation
(une rponse adaptative est en effet le rsultat du fonctionnement intgr des diffrents
facteurs qui participent au rseau). (iv) En terme de valorisation potentielle, une telle
approche pouvait conduire lidentification de drogues affectant le fonctionnement gnral
des phosphorelais His-Asp et donc ladaptabilit des bactries (lintrt rsidant dans
lobservation que ces systmes nexistent pas chez les eucaryotes suprieurs en dehors des
plantes ou que ces systmes contribuent la formation de communauts bactriennes
(biofilms) extrmement rsistantes divers traitements, reprsentant donc un problme
majeur la fois pour lindustrie et la sant publique).

Pour identifier les partenaires protiques du systme Rcs, jai choisi dutiliser une
technique de double hybride bactrien mise au point dans lquipe de D. Ladant lInstitut
Pasteur de Paris (Karimova et al., 1998).

I. La technique de BACTH (Bacterial Adenylate Cyclase Two Hybrid).

Cette technique de Double Hybride est base sur la complmentation fonctionnelle chez
E. coli de fragments de ladnylate cyclase de Bordetella pertussis, CyaA (Karimova et al.,
1998). Elle exploite le fait que ladnylate cyclase de B. pertussis soit clivable par protolyse
en deux fragments complmentaires, T25 et T18 (figure 50A et B) (Karimova et al., 1998;
pour revue, voir Ladant & Ullmann 1999). La rassociation de ces deux fragments reconstitue
une protine active. En conditions standard, cette association est assure par la Calmoduline
qui forme un complexe ternaire avec les deux fragments. La technique de BACTH repose sur

119
A. B.
RcsBxRcsB
T+ AxB

RcsBxRcsA

RcsAxRcsB

pKT25xPUT18C

T- BxB zip x zip

Figure 51. Exemples de croisement entre les

C.
protines RcsA et RcsB entires. A. Test
10000
dinteraction sur milieu LA-XGal-IPTG. Trois
clones de chaque double transformation ont t
1000 tals en patch. Seules les interactions pKT25RcsA
x pUT18CRcsB (AxB) et pKT25RcsB x
pUT18CRcsB (BxB) sont montres ici. Tmoin
U.M

100

positif (T+), pKT15zip x pUT18Czip (avec zip =

10
leucine zipper de GCN4); tmoin ngatif (T-),
pKT25 x pUT18C. B. Test dinteraction sur milieu
LA-XGal IPTG avec talement en spots de dilutions
1
dcimales. C. Dosage -galactosidase sur les
pUT18C x pKT25
RcsB x RcsB

pUT18Czip x
RcsA x RcsB

pKT25zip
(143x149)

(24x149)

croisements obtenus. Les activits des croisements

pUT18CRcsA x pKT25RcsB et RcsB x RcsB sont
identiques celle du tmoin ngatif (~170 U.M,
contre 8000 U.M pour le tmoin positif).

Figure 52. Croisement des sous-domaines des

protines Rcs. Seuls les croisements les plus
pertinents (en accord avec les donnes de la
littrature) ont t effectus. Exemple
dtalement en patch sur milieu LA-XGal IPTG
des croisements pKT25-RcsBD2 x pUT18C-
RcsDHPt et pKT25RcsDHPt x pUT18C-RcsBD2.
T+, tmoin positif (pKT25zip x pUT18Czip); T-,
tmoin ngatif (pKT25 x pUT18C).

120
cette ncessit dassociation pour dtecter dventuelles interactions entre deux protines. En
effet, chez E. coli (qui ne possde pas de Calmoduline ou autre protine associe), dans une
souche dficiente pour ladnylate cyclase (cya-) les fragments T25 et T18 fusionns des
protines (X et Y) ne peuvent restaurer la synthse dAMPc que si ces protines sont capables
dinteragir entre elles (Figure 49C). LAMPc ainsi produit se fixe alors la protine CAP
(Catabolite Activator Protein), formant un complexe capable de rguler de nombreux gnes
(Ulmann & Danchin 1983). Il permet notamment lactivation des gnes des oprons lac et mal
impliqus dans le catabolisme du lactose et du maltose, respectivement (figure 50D). La
bactrie redevient ainsi capable dutiliser lun ou lautre de ces sucres comme source de
carbone, permettant un crible ais bas sur lutilisation, soit dun milieu slectif (milieu
minimum + maltose par exemple), soit dun milieu complet permettant un reprage color des
interactants potentiels (Mac Conkey + maltose ou Luria-Bertani Agar + X-gal).

II. Rsultats

Avant de crer une banque pour la recherche des partenaires du systme Rcs, nous avons
cherch mettre en vidence les interactions lintrieur du systme. Pour cela, les gnes ou
des fragments de gnes codant pour les protines entires ou les diffrents modules du
systme Rcs ( lexception de la lipoprotine de la membrane externe RcsF) ont t fusionns
traductionnellement en aval des fragments T25 (dans pKT25) et T18 (dans pUT18C) de
CyaA, et exprims par le promoteur lacUV5. Toutes les constructions ont t squences et
pour certaines la fonctionnalit a t teste par complmentation (voir Matriels et Mthodes).
Le test dinteraction est ralis par la double transformation des drivs de pKT25/pUT18BC
dans une souche cya- dE. coli. Malgr diffrentes conditions exprimentales utilises, aucune
interaction protique au sein du systme Rcs na pu tre mise en vidence mme entre
partenaires pour lesquels des interactions avaient t rapports dans la littrature : entre
RcsCD1/RcsDHPt et RcsDHPt/RcsBD2 (Rogov et al., 2004; Rogov et al., 2008), RcsA/RcsA et
RcsB/RcsB (Butland et al., 2005) (voir figures 51 et 52).
Nous navons pas dexplication satisfaisante quant ces rsultats ngatifs. Soit nous
navons pas su trouver les bonnes conditions pour effectuer le test, soit ce test nest pas adapt
au systme Rcs car les interactions sont trop faibles. Dans le cas de RcsB, un des problmes
pouvant expliquer labsence de rsultats est la toxicit des constructions.

121
Discussion et
perspectives

122
 La complexit du systme de transduction du signal RcsCDB/FA pose la question de
lavantage volutif des phosphorelais His-Asp-His-Asp par rapport aux systmes deux
composants simples. Tout au long de ce manuscrit, jai voqu les hypothses suivantes
quant au rle de cette complexit : (i) elle permettrait lintgration de signaux de nature
diffrente en offrant plusieurs voies dentre dans le systme Rcs, (ii) elle intgrerait la
rponse Rcs une rponse cellulaire plus globale impliquant dautres systmes de rgulation.
Jai galement mentionn le peu de donnes disponibles au dbut de ce travail quant au rle
du phosphorelais Rcs dans ladaptation des cellules leur environnement. Cest sur la base
de ces hypothses et dans le but dlargir nos connaissances sur les rles de ce systme dans
la physiologie cellulaire que je me suis principalement intresse lune des originalits du
phosphorelais Rcs : le co-facteur RcsA. Mon intrt pour cette protine nous a dabord
permis de mettre en vidence, pour la premire fois, un rle de ce systme Rcs dans
ladaptation un stress environnemental pertinent pour E. coli, la rsistance lacidit (bien
que finalement, la participation de RcsA ce phnomne ne soit pas clairement tablie).
Dans un deuxime temps, ltude de lautorgulation du gne rcsA nous a men remettre en
question la mcanistique daction des protines RcsA et RcsB sur sa transcription, ainsi qu
une meilleure dfinition des cibles RcsA-dpendantes et indpendantes. Enfin et de manire
plus globale, une approche par double hybride bactrien devait nous permettre didentifier le
maximum de partenaires protiques du systme, nous fournissant de nouveaux indices quant
ses rles biologiques. Malheureusement, cette partie de mon travail na pas abouti.

I. Le systme Rcs et la rsistance lacidit.

En partant de donnes prouvant la rgulation de rcsA par GadE, le rgulateur central de la

rponse acide glutamate-dpendante chez E. coli (Hommais et al., 2004), jai test
limplication du systme Rcs dans la rponse acide. Ce travail a abouti au rsultat majeur de
mon travail de thse, la dmonstration du rle essentiel du rgulateur de rponse RcsB dans
la rsistance au stress acide. Cest la premire vidence dun rle de ce systme Rcs dans
ladaptation un stress environnemental pertinent pour E. coli, entrobactrie confronte
un environnement acide au niveau de lestomac. Loriginalit de ce rsultat rside dans le fait
que parmi les protines Rcs, seul RcsB est indispensable la rsistance au stress acide,
indiquant la capacit du rgulateur de rponse intgrer des signaux indpendamment du

123
phosphorelais RcsFCD ou de son co-facteur RcsA. Lactivit de RcsB pour la rponse acide
est strictement dpendante de lactivit de GadE, le rgulateur central de la rsistance acide
glutamate-dpendante, de mme que lactivit de GadE est strictement dpendante de celle
de RcsB. Donc au cours de ce travail jai identifi un nouveau partenaire RcsB, GadE. La
prsence dune bote RcsB potentielle lintrieur de la bote GadE en amont des gnes
rguls par GadE et RcsB, essentiels la rsistance acide, suggre une rgulation directe de
RcsB et la formation dun complexe GadE-RcsB sur lADN. Le travail en cours dans le
groupe, par des approches in vitro, semble confirmer cette hypothse (Marie-Pierre Castani-
Cornet, communication personnelle). Il est intressant dobserver que GadE nest trouv que
chez E. coli, contrairement au systme Rcs rpandu chez les entrobactries. Donc comme
nous lavions suggr pour RcsA, GadE, le rgulateur central de la rsistance acide, de
manire opportuniste semble avoir su utiliser une protine appartenant un autre systme de
rgulation pour ses propres besoins. Mais contrairement au couple RcsA/RcsB, dans lequel
RcsA est accessoire, chaque lment du couple GadE/RcsB est essentiel et complmentaire
de lautre.
Un autre aspect novateur est lattribution dun rle essentiel lactivit basale RcsB.
Cest le maintien de cette activit basale qui est important pour la rsistance et non la
stimulation dune activit RcsB plus importante. Lactivit basale de RcsB peut avoir comme
origine une faible activit intrinsque de la forme non phosphoryle de RcsB ou la
persistance dun pool de RcsB sous forme phosphoryle. Nous navons pas dlment
pour trancher entre ces deux possibilits. Les expriences en cours dans le groupe avec des
variants de RcsB constitutivement active (RcsBD56E) ou inactive (RcsBD56N) visent
claircir ce point. Chez Salmonella, le rgulateur de rponse OmpR, indpendamment de son
HK partenaire EnvZ, est ncessaire la tolrance lacide. Mais contrairement RcsB,
OmpR a besoin dtre activ par phosphorylation, probablement par lactyl-phosphate
(Bang et al., 2000).
En revanche, si lactivit basale de RcsB est essentielle la rsistance lacide,
lactivation de RcsB soit par le phosphorelais RcsCD, soit par RcsA la diminue et cette perte
partielle de rsistance est corrle une diminution gnrale de la transcription des gnes
gad. Sur la base de cette observation, lactivation de lexpression de rcsA par GadE,
rapporte par F. Hommais et ses collaborateurs (Hommais et al., 2004) pourrait avoir pour
rle de mettre fin la rponse acide une fois la barrire gastrique franchie.

124
II. Autorgulation du gne rcsA, mcanistique de la rgulation par RcsB
et dfinition des cibles RcsA-dpendantes et indpendantes.

Autorgulation de rcsA et dfinition des botes RcsB et RcsAB.

Les cibles rgules par RcsB indpendamment de RcsA prsentent une squence de
reconnaissance pour RcsB dsigne bote RcsB (Carballs et al., 1999). Celle-ci est organise
en deux demi-sites constitus dune squence imparfaitement rpte et inverse et est situe
immdiatement en amont de llment -35 du promoteur (c.f figure 43). Cette organisation de
la bote RcsB, la taille des rgions protges lors dexprience de protection la DNaseI
(Sturny et al., 2003), ainsi que lappartenance de RcsB la famille NarL pour lequel la
structure du co-cristal NarL-DNA est connue (Maris et al., 2002), suggrent la fixation dun
homodimre de RcsB la bote RcsB. Les cibles RcsA-dpendantes utilisent probablement un
htrodimre RcsAB et une bote RcsAB situe plus de 65 pb en amont du -35 ou en de
du +1 (dans le cas de la rpression de lopron flhDC) mais dont la squence ne rvle pas de
diffrence vidente de celle des botes RcsB. Cependant des donnes sur la rgulation de
flhDC suggraient que RcsA reconnatrait le site droit puisquune altration de ce site
rendait la rgulation insensible RcsA tout en conservant la sensibilit RcsB (Francez-
Charlot et al., 2003). Cette conclusion pourrait tre module par mes rsultats. En effet
lintroduction de mutations dans le demi-site gauche de la bote RcsAB de rcsA a rendu le
promoteur rsistant RcsA. Par consquent, les dterminants ncessaires la rgulation de
rcsA seraient rpartis sur lensemble de la bote RcsAB. Cette observation renforce lide que
la distinction entre botes RcsAB et RcsB nest pas due la squence mais la position des
botes par rapport au promoteur.
Cependant, la question de la fixation de RcsA aux botes RcsAB reste toujours dactualit
dans la mesure o mes rsultats donnent une image plus floue quant la discrimination au
niveau squence entre les dterminants spcifiques RcsA et RcsB. La pertinence de cette
question est appuye par le fait que le motif HTH de RcsA est sensiblement diffrent de celui
de RcsB, notamment pour les acides amins qui chez RcsB contactent spcifiquement lADN
(figure 42), que RcsA seul ne se fixe pas lADN et quen foot-print, la zone de protection
nest pas plus tendue en prsence de RcsA (une forme hybride fonctionnelle de haut poids
molculaire, Mal-RcsA) quavec RcsB seul (Francez-Charlot et al., 2003 ; ce travail). En
tenant compte de ces lments, on ne peut pas exclure un modle stipulant que les botes
RcsAB et RcsB soit reconnues uniquement par RcsB. Le rle de RcsA serait alors de

125
 A A A A

ARN Polymrase ARN Polymrase

B B B B
-35 -10 -35 -10
Bote RcsB Bote RcsAB
-43 -126

Figure 53: Modle dactivation transcriptionnelle des cibles du systme Rcs.

A. Dans le cas dune bote RcsB dpendante, RcsB serait assez proche de lARN-Polymrase pour former
avec elle et lADN un complexe ternaire. Dans ce cas, RcsB pourrait interagir la fois avec lCTD de
lARN polymrase (cercle noir) mais aussi avec les autres domaines (par exemple l-NTD, cercle gris).
Ces diffrentes interactions stabiliseraient le complexe RcsB-ARN polymrase-ADN ne ncessitant pas
lintervention de RcsA. Ici, on pourrait supposer que RcsA soit chass par lARN-polymrase. B.
Dans le cas dune bote RcsAB, RcsB tant beaucoup plus loign de lARN polymrase, l-CTD de
celle-ci viendrait se fixer juste en aval de la protine. Dans ce cas, RcsB ninteragissant quavec l CTD
de lARN polymrase, il aurait besoin dtre stabilis par RcsA qui peut ici accder au complexe.

126
stabiliser lhomodimre RcsB sur lADN par une interaction protine/protine quand la bote
Rcs est trop loigne du promoteur, ce rle de stabilisation tant jou par lARN polymrase
pour les botes Rcs proches du -35 (figure 53). Ce modle implique que lintroduction de
mutations dans la bote RcsAB naffecte que la fixation de RcsB. Lactivit RcsB la bote
RcsAB tant pistasique sur lactivit RcsA, la perte de la rgulation par RcsA associe la
diminution de lactivation par RcsB visualise dans le cas des fusions 3M et 4M
sexpliquerait par la perte de lactivit RcsB ce niveau. Cependant, ces fusions ne nous
permettent pas de faire la distinction entre la perte de lactivit RcsB la bote RcsAB et la
perte dune activit RcsA avec le maintien de celle de RcsB. Dans ce dernier cas, nous ne
pourrions exclure que RcsA doit avoir une certaine spcificit pour la bote RcsAB. Pour
trancher, il suffira de tester les mmes fusions dltes du deuxime site de rgulation par
RcsB localis dans la squence leader.
Des expriences de permutation des motifs HTH de RcsA et RcsB ( domain
swapping ) sont envisageables. Bien quil soit difficile de prdire les rsultats de telles
expriences, elles devraient fournir des indices quant la fixation de RcsA la bote RcsAB
et, dune manire plus gnrale, sur la mcanistique des rgulations exerces par RcsB et
RcsA.

Rgulation du gne rcsA par RcsB seul.

La dltion de la bote RcsAB affecte peu lactivation de lexpression de rcsA par la

surexpression de RcsB. Ce rsultat est en contradiction avec lobservation que la perte de
lautorgulation par RcsA est suffisante pour abolir la synthse de la capsule (Wehland &
Bernhard 2000). En effet, lintroduction chez E. coli dun plasmide haut nombre de copies
portant rcsA et sa rgion promotrice engendre un phnotype mucode par expression des
gnes cps. Une rgion quivalente portant la bote RcsAB mute sur les nuclotides G4A3A2
et le premier T (remplacs par CCT A) nengendre pas de mucodie et une baisse dun facteur
5 de lexpression dune fusion (cps::lacZ) est observe. Ce rsultat dmontre limportance
de la bote RcsAB pour lexpression basale de rcsA. En contradiction avec ce travail, mes
rsultats montrent que la dltion de la bote RcsAB ne diminue que faiblement lexpression
de rcsA (facteur 2) et que celle-ci est majoritairement due la rgulation par RcsB seul
(facteur 4) au niveau de la squence leader. Une explication possible de cette diffrence de
rsultat rside dans le fait que jai travaill en conditions de surexpression de RcsB alors que
Wehland et Bernhard avaient travaill en condition de surexpression de RcsA (qui nagit en

127
A B

? Rcs

G = - G = -

Figure 54. Prdiction de structure secondaire ARN de la squence leader du gne rcsA et du petit
ARN DsrA (M-fold). Deux structures secondaires alternatives sont possibles pour la squence leader
de rcsA (A et B). Les nuclotides composant la squence Shine-Dalgarno putative sont entours en
rouge. X symbolise un facteur putatif rprimant lexpression de rcsA. C. Structure secondaire de DsrA.
Les bases complmentaires entre DsrA et la structure B sont entoures en vert. (c.f texte)

128
effet quau niveau de la bote RcsAB) mais en conservant un niveau sauvage de RcsB.
Alternativement lintroduction des quatre mutations dans la bote RcsAB dans leurs travaux a
pu avoir diminu de manire constitutive et importante lactivit du promoteur avec pour
consquence de ne plus permettre une synthse suffisante de RcsA pour la synthse de la
capsule. Enfin, cette contradiction pourrait provenir du fait de lutilisation de deux souches
diffrentes, MG1655 pour mes travaux et DH5 pour les leurs.
La prsence dune squence leader dans le transcrit de rcsA suggrait la possibilit dune
rgulation post-initiation de la transcription du gne. En accord avec cette possibilit, jai mis
en vidence une rgulation RcsB-dpendante utilisant un dterminant dans cette squence
leader entre +66 et +113. La dltion de cette rgion rendant le niveau dexpression de la
fusion lacZ quivalente une fusion sauvage lors de la surexpression de RcsB, suggre un
modle de rgulation impliquant une rpression de lexpression de rcsA par un lment
inconnu X, dont lactivit serait antagonise par RcsB.
Les prdictions de structure secondaire ARN de la squence leader (M-Fold, dvelopp
par le Dr. Michael Zuker) indiquent deux structures possibles A et B de -G proches (figure
54). Dans la structure B, les nuclotides +75 +100 forment une boucle protubrante dont la
formation est indpendante des squences amont, renforant la possibilit de sa formation. La
rgion dlimite par cette boucle inclut la rgion +66 et +113 ncessaire la rgulation des
fusions transcriptionnelles par RcsB. Cette observation suggre un modle selon lequel le
facteur putatif X se fixerait cette boucle avec pour consquence daffecter llongation de la
transcription et donc de rprimer lexpression de rcsA. RcsB en empchant directement, ou
indirectement, lactivit du facteur X lverait cette inhibition.
De manire intrigante, nous avons not que la rgion +75 +100 formant la boucle
visualise dans la structure B tait partiellement complmentaire la squence dun petit
ARN non codant DsrA. Cet ARN est cod par un gne situ proximit et en aval de rcsA.
DsrA stimule la traduction du facteur gnral de stress RpoS (Majdalani et al., 1998) et
rprime celle du facteur global de rgulation H-NS (Lease et al., 1998). Lexpression de dsrA
est positivement rgule par des tempratures faibles (Repoila & Gottesman 2001; 2003).
DsrA est indirectement impliqu dans la rgulation de rcsA en antagonisant la rpression de
H-NS sur la transcription du gne (Sledjeski & Gottesman 1995); voir le paragraphe I.3 Rle
biologique de RcsA, Rsultats Chapitre 2). Cette complmentarit partielle de DsrA avec la
squence leader soulve cependant la possibilit que DsrA rgule rcsA un deuxime niveau,
en tant le facteur putatif X ou du moins en tant directement impliqu dans la rgulation
post-transcriptionnelle de rcsA. Cette possibilit est actuellement teste dans le groupe.

129
 De manire intressante, dans la structure A, la squence Shine Dalgarno est situe au
niveau dune boucle, donc potentiellement accessible alors que dans la structure B, elle est
engage dans des appariements la rendant probablement inaccessible. Ces prdictions
suggraient la possibilit dune rgulation traductionnelle du gne. Cette hypothse a t
renforce par des expriences prliminaires du groupe utilisant des fusions traductionnelles
rcsA::lacZ. Lactivit de ces fusions est non seulement dpendante de RcsB, mais avec une
amplitude dans la rgulation beaucoup plus importante que celle avec des fusions
transcriptionnelles, suggrant que la rgulation de lexpression de rcsA par RcsB soit
essentiellement traductionnelle. Pour linstant nous ne savons pas encore si la rgion +66
+113 est galement ncessaire cette rgulation traductionnelle

Mes rsultats suggrent que lessentiel de la rgulation de rcsA par RcsB semble se situer
deux niveaux, traductionnel et post-transcriptionnel, ces deux niveaux de rgulation
impliquant la squence leader de rcsA. Nos hypothses qui sappuient sur des donnes encore
prliminaires devront tre confirmes Notamment, la ralit des structures alternatives du
leader devra tre dmontre. Cela pourra tre fait par des approches gntiques, par exemple
par lintroduction de mutations dstabilisant la structure et de mutations compensatrices
restaurant cette structure. Les structures pourront tre directement testes in vitro par
lutilisation de ribonuclases spcifiques. Il faudra ensuite comprendre comment RcsB peut
favoriser la structure permissive. A moins de considrer que RcsB puisse fixer lARN, il
parat vraisemblable que lactivit de RcsB soit indirecte, en antagonisant lactivit dun
lment rpresseur. Une approche gntique devrait permettre didentifier cet lment. La
rgulation post-transcriptionnelle implique une rgion comprise entre le +66 et +113 de la
squence leader. Nous avons suggr que cette rgion tait ncessaire lactivit dun
rpresseur de lexpression de rcsA. Ce facteur X, en stabilisant une structure en tige boucle de
lARN pourrait conduire un arrt prmatur de la transcription, une inhibition leve par
RcsB. Il est noter que cette structure permissive pour la formation de la tige boucle lest
galement pour la squestration du Shine-Dalgarno. En consquence, il est envisageable de
considrer que le facteur responsable de la rgulation traductionnelle soit le mme que celui
responsable de la rpression post-transcriptionnelle et que les effets observs procdent du
mme mcanisme, la stabilisation dune structure inhibitrice de lARN leader (structure B sur
la figure 54).
Lautorgulation du gne rcsA par lui-mme et par RcsB nayant quune part modeste
dans sa rgulation par le systme Rcs, on peut se demander quel est rellement son rle. Le

130
fait que la transcription de rcsA soit ngativement rgule par H-NS (Sledjeski & Gottesman
1995) pourrait tre un indice. Au vu des diffrents mcanismes de silencing du rgulateur
global H-NS (pour revue, voir Stoebel et al., 2008), je propose un modle o la fixation de
RcsAB (ou RcsB seul, aid par RcsA, en accord avec le modle propos prcdemment) sur
la bote RcsAB aurait pour effet de minimiser leffet inhibiteur dH-NS en lempchant de
restreindre laccs au promoteur pour lARN-Polymrase. Afin de tester cette hypothse, nous
envisageons des expriences de transcription in vitro sur rcsA, en prsence de RcsA et/ou
RcsB et/ ou H-NS. Paralllement, des expriences dempreinte la DNaseI pourraient
permettre de voir si la bote RcsAB se situe au niveau de la zone couverte par H-NS et si la
prsence de lhtrodimre diminue ltendue de la protection par H-NS. On pourrait
galement suivre lactivit dune fusion rcsA::lacZ en contexte sauvage ou hns, en prsence
ou non de RcsA et/ou RcsB. Enfin, il serait intressant de savoir si dautres cibles RcsA-
dpendantes ou indpendantes sont inhibes par H-NS et tester le rle de RcsAB/RcsB dans
ce cas.

Impact de RcsA sur la cintique dexpression des gnes cibles.

Lanalyse dynamique de lexpression de cibles du rgulon, travers des fusions

transcriptionnelles avec la GFP, a montr, lors de lactivation du systme Rcs (tat ON) non
seulement un effet positif de RcsA sur lexpression des cibles RcsA-dpendantes, mais
galement un effet ngatif sur celle des cibles dites RcsA-indpendantes. Ce dernier rsultat
suggre que la quantit de RcsB~P est limitante et que laffinit prfrentielle de RcsA pour
RcsB~P est suffisante pour diriger RcsB en priorit vers les cibles RcsA-dpendantes au
dtriment des autres. La question souleve ici est le rle de cet effet ngatif envers les cibles
RcsA-indpendantes. Est-ce simplement un compromis pour une rgulation plus efficace des
cibles les plus importantes pour une premire ligne de dfense (synthse dexopolysaccharide
et rpression de la synthse du flagelle) ou est-ce que le retard de lexpression des cibles
RcsA-indpendantes contribue directement lefficacit de la rponse ? Lors de la fermeture
du systme (tat OFF), nos donnes indiquent que RcsA permet de maintenir lexpression des
cibles RcsA-dpendantes un niveau lev dans le temps. Cette observation donne peut-tre
un sens la rgulation positive de lexpression de rcsA par RcsB. En effet laugmentation de
la concentration cellulaire de RcsA du fait de cette rgulation pourrait compenser la
disparition des formes RcsB~P du fait de la disparition du signal, en permettant RcsA dagir
galement avec les formes non phosphoryles de RcsB par action de la loi de masse.

131
Alternativement ou additionnellement, la prsence dun niveau plus lev de RcsA pourrait
stabiliser la forme RcsB~P. Au contraire des cibles RcsA-dpendantes, la prsence ou
labsence de RcsA na pas de consquence visible sur lexpression des cibles RcsA-
indpendantes dans nos conditions exprimentales, celles-ci arrtant dvoluer lors du retour
ltat OFF. Ces rsultats nous obligent prciser la notion de cibles RcsA-dpendantes et -
indpendantes. Cette dfinition sous-entend la capacit de RcsA potentialiser directement
lactivit RcsB au travers des botes RcsAB. Les rsultats prsents ici sont nanmoins
prliminaires et mritent dtre confirms.

III. Recherche des partenaires protiques du systme Rcs.

Cette approche devait nous permettre de mettre en vidence les interactions des protines
Rcs au sein mme du phosphorelais, de connatre de manire relativement exhaustive les
partenaires cellulaires du systme afin dobtenir une vision globale du rle du systme et den
modliser son fonctionnement.
Malheureusement, malgr un investissement important, cette partie de mon travail na pas
permis de rvler dinteraction entre partenaires du systme, le systme Rcs stant rvl
jusqu prsent rfractaire au systme double-hybride bactrien utilis. Les raisons ce cette
absence de rsultats peuvent tre varies mais peuvent inciter utiliser dautres approches
pour la recherche des partenaires du systme Rcs.

IV. Conclusion

Lobjectif principal de ce travail de thse tait de contribuer la comprhension du

systme au travers de lidentification et de lanalyse des partenaires du systme. La notion de
partenaire nest pas restreinte des partenaires dinteraction protine-protine mais est largie
des partenaires de rgulation. Cest dans ce cadre, que sur la base de la description dans la
littrature de la rgulation de lexpression de rcsA par le rgulateur central de la rponse acide
GadE, que nous avons dmontr le rle essentiel de RcsB dans la rponse acide, et identifi
un nouveau partenaire protique RcsB. Le fait que RcsB ait de si nombreux partenaires
RcsA, RcsD, lui-mme, GadE, lARN-Polymrase soulve un certain nombre de questions

132
quant aux mcanismes de reconnaissance de RcsB envers ses partenaires et ses cibles, et
souligne la capacit de la cellule rentabiliser un rgulateur et connecter diffrents
systmes de rgulation. Les rsultats obtenus au cours de ma thse justifient donc la poursuite
de cette stratgie pour la comprhension du rle biologique du systme Rcs, c'est--dire la
recherche des partenaires dinteractions protine-protine et de rgulation, la fois par la mise
en place de stratgie de recherche globale et par le suivi de la littrature.

133
Matriels et
Mthodes

134
 Tableau 2 : Souches, bactriophages et plasmides utiliss dans ltude de la rgulation de rcsA.

Souche, Rfrence ou
phage ou Gnotype provenance:
plasmide

SK683 F- - rph-1 (= MG1655) lacIZ (MluI), souche de rfrence du M. Cashel

laboratoire
SK2366 BW29427 thrB1004 pro thi rpsL hsdS lacZM15 RP4-1360 Goulian & Van der Woude
(araBAD)567 dapA1341 ::[erm pir(wt)] 2006
SK2368 PIR2/pMar2Mar2, pour la conversion des fusions ::lacZ en Goulian & Van der Woude
fusions ::gfp (pir+ApR) 2006
SK2372 PIR2/pMar4Mar4, pour la conversion des fusions ::lacZ en Goulian & Van der Woude
fusions ::gfp (pir+CmR) 2006
SK2378 SK2366/pMar2Mar2 laboratoire
SK2380 SK2366/pMar4Mar4 laboratoire
SK1988 SK683 (RS rcsA wt) ce travail
SK1989 SK683 (RS rcsA 2M) ce travail
SK2036 SK683 (RS rcsA 3M) ce travail
SK2078 SK683 (RS rcsA 4M) ce travail
SK2439 SK683 (RS rcsA ABbox) ce travail
SK2571 SK683 (RS rcsA box2min) ce travail
SK2665 SK683 (RS rcsA box2) ce travail
SK2816 SK683 (RS rcsA -35min) ce travail
SK3020 SK683 (RS rcsA ABbox ATG) ce travail
SK2922 SK683 (RS rcsA ABbox +113) ce travail
SK2879 SK683 (RS rcsA ABbox +66) ce travail
SK2867 SK683 (RS rcsA ABbox +1) ce travail
SK2923 SK683 (RS rcsA ABboxwt ATG) ce travail
SK2917 SK683 (RS rcsA ABboxwt +66) ce travail
SK2675 SK683/pRS bdm::gfp laboratoire
SK2670 SK683/pRS cps::gfp laboratoire
SK2681 SK683 rcsA::Cm/pRS bdm::gfp laboratoire
SK2680 SK683 rcsA::Cm/pRS cps::gfp laboratoire
pHRcsF vecteur driv de p15A portant la fusion (lacpUV5-his6-rcsF)
(KnR, SpR) Catani-Cornet et al.,, 2006
pHRcsA vecteur driv de p15A portant la fusion (lacpUV5-his6-rcsA)
(KnR, SpR) Davallos-Garcia et al.,,
2001
pHRcsB pFAB1. vecteur driv de p15A portant la fusion (lacpUV5-his6-
rcsB) (KnR, SpR) Carballes et al.,, 1999
pRS550 vecteur de clonage driv de ColE1 (KnR, AmpR) Simons et al.,, 1987
RS45 imm21, pour rcuprer les fragments clons dans pRS550 Simons et al.,, 1987

135
 Ce chapitre vient complter les mthodes dcrites dans larticle du chapitre 1.

I. Souches, plasmides, bactriophages et milieux de culture.

Sauf indication contraire (chapitre 3), toutes les souches utilises dans ce travail sont de
srotype K12 et isogniques MG1655.
Les souches bactriennes, plasmides et bactriophages utilises dans le chapitre 1
Rsistance lacidit sont dcrits dans larticle correspondant.
Les souches bactriennes, plasmides et bactriophages utiliss dans le chapitre 2 sont
lists dans le tableau 2 en annexe. Pour ces expriences, les cultures bactriennes ont t
ralises 37C en milieu LB (Luria-Bertani broth) IPTG 0,5mM final (Isopropyl--D-
Thiogalactopyranoside).
Les souches bactriennes, plasmides et bactriophages utiliss dans le chapitre 3 sont
lists dans le tableau 3 en annexe.
Les antibiotiques ont t utiliss aux concentrations suivantes : Ampicilline, 100g/ml ;
Kanamycine, 50g/ml ; Chloramphnicol, 20g/ml ; Spectinomycine, 75g/ml et
Ttracycline 10g/ml.

II. Manipulation de lADN.

Lextraction dADN plasmidique ou chromosomique a t ralise laide de kit Qiagen
(QIAprep Miniprep Kit, QIAGEN Plasmid Midiprep Kit et DNeasy Tissue Kit). Les PCR ont
t faites avec les enzymes Taq DNA Polymerase (New England Biolabs) ou Phusion
(Finnzymes) selon quelles avaient un but de vrification ou de clonage, rciproquement. Si
ncessaire, les produits PCR ont t purifis avec le kit Qiagen ddi (QIAquick Gel
Extraction Kit) ou sur S200 (Amersham) pour les PCR chaudes, selon les protocoles fournis
par les fabriquant.

III. Construction des fusions transcriptionnelles ::lacZ.

Les fragments utiliss pour les clonages ont t gnrs par PCR et clons aux sites
BamHI et EcoRI du vecteur pRS550. Ces constructions sont intgres au chromosome par
lysognisation par le phage RS45 (Simons et al., 1987). Brivement : plusieurs dilutions
dcimales du phage sont dposes sur un tapis cellulaire de la souche portant la fusion
dintrt sur plasmide. Le lysat est ensuite rcupr et utilis pour infecter la souche rceptrice

136
 Tableau 3 : Souches, bactriophages et plasmides utiliss dans le double hybride bactrien.

Souche, Rfrence ou
phage ou Gnotype provenance:
plasmide

BTH101 F-, cya-99, araD139, galE15, galK16, rpsL1 (Str r), hsdR2, D. Ladant
mcrA1, mcrB1
DHM1 F-, cya-854, recA1, endA1, gyrA96 (Nal r), thi1, hsdR17, spoT1, D. Ladant
rfbD1, glnV44(AS)
DH5 F- endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 deoR nupG lacZdeltaM15 Invitrogen
hsdR17
pKT25 vecteur driv de pSU40 (KnR), pour clonage en aval de T25 D. Ladant
pUT18C vecteur driv de pUC19 (ApR), pour clonage en aval de T18 D. Ladant
pKT25-zip driv de pKT25 portant la fusion (lacpUV5-T25-leucine
zipper de GCN4) (KnR) D. Ladant
pUT18C-zip driv de pUT18C portant la fusion (lacpUV5-T18-leucine
zipper de GCN4) (ApR) D. Ladant
SK2389 pKT25 - RcsC ce travail
SK2391 pKT25 - RcsD ce travail
SK2452 pKT25 - RcsB ce travail
SK2375 pKT25 - RcsA ce travail
SK2510 pKT25 - RcsBD56E ce travail
SK2456 pKT25 - RcsCD1 ce travail
SK2454 pKT25 - RcsDHPt ce travail
SK2509 pKT25 - RcsBD2 ce travail
SK2393 pUT18C - RcsD ce travail
SK2451 pUT18C - RcsB ce travail
SK2377 pUT18C - RcsA ce travail
SK2511 pUT18C - RcsBD56E ce travail
SK2522 pUT18C - RcsBD2 ce travail
SK2507 pUT18C - RcsBHTH ce travail

137
 de la mme manire. Enfin, plusieurs sous-clonages de la souche lysogne sont raliss
afin de sassurer dune couleur bleue stable, reprsentative dun tat monolysogne.

IV. Construction des fusions transcriptionnelles ::gfp.

Les conversions des fusions ::lacZ en fusions ::gfp ont t adaptes partir du protocole
dcrit par Goulian & Van der Woude (2006). Toutes les tapes sont ralises 30C. La
souche donatrice SK2378 (ApR, DAP-) contenant le plasmide portant la cassette gfp et les
souches rceptrices KnR contenant la fusion ::lacZ dintrt sont mlanges et cultives dans
un milieu riche avec DAP pour la conjugaison. Aprs repiquage sur milieu riche LA Kn Ap
permettant la slection des souches rceptrices ayant intgr le plasmide et aprs culture en
milieu LB Kn, les cellules sont tales sur LA sucrose 5% afin de slectionner les cellules
ayant perdu le plasmide (SacR). Les clones sont alors stris sur LA Ap et LA Kn X-gal pour
reprer les colonies blanches ApS. La prsence de la GFP est vrifie par PCR avec la Taq
Polymrase.

V. Mesure de la fluorescence.
Lactivit de la GFP est quantifie dans des cultures liquides laide dun fluorimtre
pour microplaque (VICTOR3 PerL EL).
Les cultures de nuit 30C en milieu TB (Terrific Broth) sont dilues au 1/400eme en
milieu M9casa (M9 1X, casaminoacides 0.05%, glucose 0.2%, CaCl2 0.1mM, MgSO4 2mM,
thiamine (vit B1) 10g/ml + antibiotiques) et laisses sous agitation pendant 6 heures
(DO~0,3). Pour les conditions douverture du systme (tat ON), de lIPTG est ajout
0.5mM final pour surexprimer le gne rcsF plac sous contrle du promoteur placUV5. Pour
les conditions de fermeture (tat OFF), de lIPTG est ajout 0.5mM final pendant 15min, les
cellules laves deux fois et reprises dans le mme milieu avant dosage. La fluorescence et la
DO600nm est mesure en microplaques (200l/puit) toutes les 15minutes pendant au moins
trois heures (excitation 485nm, mission 535nm). Les cultures ont t ralises oit
directement en microplaques, soit en Erlenmeyer et dans ce cas, seul le dosage est effectu en
microplaque.

VI. Dosage de lactivit -galactosidasique.

Les cultures de nuit 37C en LB sont dilues 1000 fois dans du milieu LB prchauff.
Les cellules sont cultives pendant 5 ou 6 gnrations puis dilues au 20me dans du LB

138
prchauff. Si ncessaire, de IPTG (0,5mM final) est ajout au milieu afin dinduire la
surexpression de protine partir du pRS550 qui possde un promoteur lacUV5. Des aliquots
sont prlevs diffrents intervalles de temps et lactivit -galactosidase est dose suivant le
protocole de Miller (1992). Lactivit -galactosidase spcifique est exprime en units
Miller. Pour le test dexpression de fusions en milieu acide, les dosages sont effectus
directement sur les cultures de nuit en LB glucose 0,4%.

VII. Empreinte la DNaseI.

La sonde a t synthtise par PCR avec une des deux amorces marque en 5 par de
lATP33P. Cette sonde (50 000 cpm) a t incube avec diffrentes concentrations de
protines dans le tampon (20mM HEPES pH8.0, 1mM EDTA, 7mM MgCl2, 3mM CaCl2,
50mM NaCl, 7mM -mercaptoethanol, 10% v/v glycrol, et 1g poly (dI-dC)/poly(dI-dC)
pour un volume final de15l. Aprs 20min dincubation 28C, la DNase I (Appligene) est
ajoute en quantit voulue (dtermine lors dune premire exprience de calibration ). La
raction de digestion est arrte aprs 3min 28C par lajout de tampon Stop (1.5M
COONH4, 0.25M EDTA et 250g/ml glycogne) puis prcipite lthanol. Le culot est
resuspendu dans 5l de tampon de charge avant dtre charg pour analyse sur un gel
dacrylamide 6%. Les squences correspondantes ont t faites en parallle laide du kit
Thermo Sequenase Cycle Sequencing (USB).

VIII. Test de survie pH acide.

Le protocole est celui dcrit dans Castani-Cornet et al., (1999). Les souches sont
cultives 37C sur la nuit en milieu complet LB supplment en glucose 0,4% (tape de
pr-adaptation pH acide modr de ~ 5). Elles sont ensuite dilues 1000 fois dans du milieu
M9 prchauff, tamponn pH 2,5 et supplment en glutamate de sodium 1,5 mM. A t0, t2h
et t4h, 10l de dilutions en sries de chaque culture (dilution 100 10-3) sont dposes sur
bote de milieu complet LB glos. Les colonies sont dnombres (CFU) aprs une nuit
dincubation 37C. Le taux de survie est valu en calculant le ratio entre les CFUs.ml-1 aux
temps t2h ou t4h et les CFUs.ml-1 au temps t0.

139
IX. Construction des fusions traductionnelles pour le double hybride
bactrien.
Chaque ORF pleine taille Rcs a t amplifie par PCR puis insre aux sites EcoRI et
BamHI des vecteurs pUT18C ou pKT25, en aval et en phase des fragments T18 ou T25 de
ladnylate cyclase, respectivement. Ces vecteurs sont clons 30C dans une souche DH5
puis slectionns pour la prsence dun insert de taille attendue. Les clones retenus seront
alors squencs et la fonctionnalit des protines exprimes vrifie par complmentation
(lorsque le phnotype nest pas vident).

X. Test BACTH (Bacterial Adenylate Cyclase Two hybrid)

Les souches cya- BTH101 ou DHM1, rendues lectrocomptentes sont transformes par
un couple de plasmides pKT25-ORFRcs / pUT18C-ORFRcs. Aprs une expression
phnotypique de 2 heures 30C, les transformants sont tals sur diffrents milieux : LB-
Xgal-IPTG 0,5mM ou Mac Conkey maltose 1% ou milieu minimum maltose 0.2%.
Ltalement est ralis en patch, en spot de dilutions ou avec des billes (50l de la
transformation et dune dilution au 10me) ; les botes sont incubes plusieurs jours 30C.
Lorsquaucune coloration napparat, labsence dinteraction est vrifie par dosage -
galactosidase (Miller 1992).

140
 Rfrences
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