8Il associe une base peptone riche des lments

connus pour favoriser le dveloppement des

Lactobacillus
:

Actate de sodium

Tween 80

Citrate dammonium

Sels de manganse

MagnsiumLe pouvoir inhibiteur du milieu est d son

pH acide. Il est limit certaine
souchesdentrobactries et des cocci Gram +
(Staphylocoques, microcoques).Lensemencement 1mL
de chaque dilution se fait en profondeur (double couche).
2. Rsultats
Aprs un temps dincubation de 48h 37C on obtient
les rsultats suivants :Dilutions 10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
Nombre
decoloniescaractristiques>300 >300 >300 >300 >300
>300 29
Observation
: aux dilutions autres que 10

-7
, on ne peut pas dnombrer les bactries, car elles
forment un tapis bactrien.
D. Gram
A partir de la suspension bactrienne, on ralise une
coloration de GRAM. Ce test permet de caractriser la
paroi bactrienne. On fixe laliquote sur une lame et on
effectue lesmanipulations suivantes :

Coloration au Violet de gentiane : Tous les lments sont

colors en Violet.

Lavage

Fixation au lugol : le Lugol fixe le Violet sur les structures

membranaire des bactriesGram+.Tous les lments
sont colors en noir.

Lavage

Dcoloration lalcool : Les bactries Gram + sont

colors en violet fonc, les autreslments sont
incolores.

Lavage

Recoloration du fond la Fuchsine. Les lments

tissulaires et les bactries Gram-sont colors en rose. Les
Bactries Gram+ sont toujours colores en violet.
Rsultats
: Les
Streptococus salivarius, subsp. Thermophilus
sont des bactries gram

+alors que les

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
sont des bactries Gram -.
E.
Catalase

On dpose sur une lame quelques gouttes de suspension

bactrienne puis on rajoute delH
2
O
2
. Lapparition dun dgagement gazeux tmoigne de la
prsence de la catalase dans lemtabolisme bactrien.
Observation :
Les
Streptococus salivarius, subsp. Thermophilus
et les
Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus
sont des bactries catalases -.
9
V. Recherche et dnombrement de Staphylocoques
coagulase positive sur un milieu au plasma
fibrinognedans du lait en poudre
La production de poudre de lait se fait partir de lait
pasteuris et concentr jusqu40-55% de matire
sche.Le lait en poudre est largement utilis pour
lalimentation des enfants en bas ge. La poudre de lait
crm est employe comme ingrdient riche en
protines dans la prparationindustrielle de nombreux
aliments.
A. Recherche de Staphylocoques coagulase positive
1. Milieux utiliss
Le milieu d'enrichissement est employ dans le cas
d'aliments susceptibles de nerenfermer qu'un petit
nombre de S. aureus, plus ou moins stresses. On utilise
le milieu deGIOLITTI et CANTONI additionn de TWEEN
80.
a)

Bouillon de Giolitti et cantoni

Le bouillon de Giolitti-Cantoni, qui est un milieu
denrichissement tellurite-mannitol-glycocolle, est bas
sur la formule de Giolitti et Cantoni. Il est utilis pour
lenrichissement deStaphylococcus aureus dans les
produits alimentaires.

Le mannitol et le pyruvate de sodium sont des facteurs

de croissance pour lesstaphylocoques, et permettent la
dtection de ce germe quand il est prsent en
petitnombre seulement.


Les bacilles Gram fermentant le lactose sont inhibs

par le chlorure de lithium et les bacilles Gram + par le
tellurite de potassium et le glycocolle.Le bouillon de
Giolitti-Cantoni est recommand pour la recherche de
Staphylococcusaureus dans les laits en poudre pour
bbs et autres aliments de sevrage dans lesquels
cegerme doit tre absent dans un gramme de produit.En
labsence de
Staphylococcus aureus
, on nobserve pas de noircissement du milieu.Si un
noircissement apparat au fond des tubes ou dans tout le
milieu, ensemencer le bouillon par stries sur un milieu
disolement pour staphylocoques, comme le milieu de
Baird Parker.
Ensemencement
: on ajoute 10mL laide dune pipette dans le tube de
milieu.
b)

Milieu Baird Parker

Cest un milieu slectif des staphylococcus coagulase
positive et en particulier de
Staphylococcus aureus
. Le milieu est constitu de :

Peptone et dextrait de viandes : comme sources azots.

Extraits de levures : pour les facteurs de croissance.

Glycocolle et pyruvate de sodium : pour acclrer la

croissance.


Tellurite de potassium : le milieu Baird Parker met en

vidence les colonies noires de
Staphylococcus aureus
de part la rduction de la tellurite en tellure (Fe
3+
en Fe
2+
).

Jaune duf : les colonies

S. aureus
sont entoures dun halo de prcipitationtmoignant de
la dgradation de la lcithine du jaune duf par la
lcithinase produite.

Sulfamthazine : inhibe la croissance de

Proteus
.

10
B. Dnombrement de Staphylocoques coagulase
positive
1. Milieu utilis : glose au plasma de
lapin fibrinogne
Ce milieu pour base le milieu Baird Parker, que lon
supplmente en plasma de lapin.Linconvnient du milieu
de Baird-Parker additionn dmulsion de jaunes
dufsavec tellurite est quil faut confirmer lidentit des
staphylocoques isols en tant que
S.aureus

par le test de la coagulase . Certaines souches de

S. aureus

donnent une raction ngative avecle jaune duf ; il est

donc ncessaire de confirmer lidentit de toutes les
colonies suspectes.

Le jaune duf a donc t remplac par du plasma de

porc dans le milieu de Baird-Parker pour obtenir un test
de coagulase in situ. Hauschild a amlior la fiabilit de
la raction decoagulase en ajoutant au plasma de porc
du fibrinogne de buf et un inhibiteur de latrypsine.
Beckers et coll.

ont montr que lutilisation de plasma de lapin la place

du plasmade porc permet dliminer les ractions
faussement ngatives ou faussement positivesobtenues
avec ce milieu. Ceux-ci ont mis au point un supplment
(plasma de lapin +fibrinogne + inhibiteur de la trypsine
+ tellurite ) qui donne des rsultats de coagulase
fiablesavec
S. aureus
.
Sawhney
16
a observ des variations dans le rendement des cultures
de
S.aureus

en comparant le supplment RPF avec le supplment au

jaune dufs. Il a montrquil tait ncessaire de rduire
le taux de tellurite dans le supplment RPF parce
quilmanque des facteurs protecteurs prsents dans le
jaune doeuf. Le supplment RPF contient laquantit de
tellurite optimale recommande. Laddition de
supplment RPF au milieu deBaird-Parker donne une
glose translucide sur laquelle les zones opaques dues
la raction decoagulase sont bien visibles. Ceci constitue
une raction didentification. Il ne faut pas
ajouter dmulsion de jaunes dufs avec tellurite.
Remarque :
Lors de ce TP le milieux Baird Parker ne contenait, de
tellurite.
Lecture :
Les colonies de
S. aureus
sont alors blanches entoures dun halo de prcipitation
de la fibrine d la coagulase

Universit Paris 12IUP SIALMlle ROUX17/11/03 NOVELLO

CliaTAP Julien
TTPPddeemmiiccr r oo b biioollooggiiee:: AA N NAALLYYS
SEESSDDEEPPR R OODDUUIITTSSLLAAIITTIIEER R SS

Sommaire
I.

INTRODUCTION.....................................................
.......................................................3

II.

ANALYSE DUN LAIT

UHT......................................................................
...............3
A. I
NCUBATION
...........................................................................................
.........................3B. T
EST DE STABILITE A L

EBULLITION
................................................................................3C. M
ESURE DU P
H.........................................................................................
.......................3D. D
ENOMBREMENT DES MICROORGANISMES AEROBIE A
30C
ET A
55C...........................4
1.

Milieu
utilis : PCA........................................................................
............................4
2.

Ensemencement...............................................................
...........................................4

3.

Rsultats...........................................................................
..........................................4
E. R
ECHERCHE D

ANTIBIOTIQUES
........................................................................................4
1.

Mthode par
acidification.......................................................................
...................4

2.

Mthode par diffusion sur

glose...............................................................................
5

III.

ANALYSE DUN
BEURRE................................................................
........................6
A. M
ODE OPERATOIRE
...........................................................................................
..............6B. M
ILIEU UTILISE
VRBL

(V
IOLET CRISTAL
/
ROUGE NEUTRE
/
SELS
B
ILIAIRES
/
GELOSE
L
ACTOSE
) :........................................................................................
......................................6C. R
ESULTATS ET DISCUSSION
...........................................................................................
..6
IV.

ANALYSE
DUN YAOURT .......................................................
................................6
A. M
ODE OPERATOIRE
:

D
ILUTION EN CASCADE
..................................................................6B. D
ENOMBREMENT
S
TREPTOCOCCUS SALIVARIUS SUBSPO THERMOPHILUS
.......................7
1.

Milieu utilis
:M17...................................................................................
..................7

2.

Rsultat.............................................................................
..........................................7
C. D
ENOMBREMENT
L
ACTOBACILLUS DELBRUECKI SUBSP BULGARICUS
.............................7
1.

Milieu utilis
:MRS...................................................................................
..................7

2.

Rsultats...........................................................................
..........................................8

3.

Gram..................................................................................
.........................................8

4.

Catalase.............................................................................
.........................................8
V.

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DE
STAPHYLOCOQUES ACOAGULASE POSITIVE SUR UN
MILIEU AU PLASMA FIBRINOGENE DANS
DULAIT EN POUDRE...............................................
...................................................................9
A. R
ECHERCHE DE
S
TAPHYLOCOQUES A COAGULASE POSITIVE
...........................................9
1.

Milieux utiliss ..................................................................

.........................................9
B. D
ENOMBREMENT DE
S
TAPHYLOCOQUES A COAGULASE POSITIVE
.................................10
1.

Milieu utilis : glose au plasma de lapin

fibrinogne............................................10

3
I. Introduction
Le mot lait, sans indication de lespce, dsigne en
France le lait de vache ; il est le produit intgral de la
traite totale et ininterrompue dune femelle laitire bien
portante, biennourrie et non surmen.Le lait est un
aliment complet, ce qui signifie qu'il sera galement un
bon milieu pour les microorganismes, c'est ce qui fait
qu'il ne se conserve pas. Un des moyens dcouvert
par l'homme pour augmenter sa conservation est de le
faire transformer de faon plus ou moinscontrle par
certains microorganismes de faon viter toute autre
altration. En gros, cetteconservation repose sur
l'limination d'une grande partie de l'eau et sur
l'acidification.dfavorise le dveloppement des
microorganismes.
II. Analyse dun lait UHT
D'une manire gnrale, les hautes tempratures
appliques pendant un temps trscourt ont un effet plus
puissant sur la destruction des microorganismes et
des enzymes que sur les modifications des constituants
du lait, ce qui justifie l'intrt des traitements UHT.
De plus, en assurant une monte en temprature et un
refroidissement rapides, les procds UHTvitent les
effets cumulatifs des traitements thermiques et rduisent
ainsi les modifications physico-chimiques du lait.
A. IncubationB. Test de stabilit lbullition
Les bactries lactiques ont une grande importance en
laiterie. Leur principale propritest de produire de
l'acide lactique par fermentation du lactose; certaines
produisent en outredu gaz carbonique et divers
composs, dont certains contribuent l'arme des
produitslaitiers. Dans du lait non rfrigr, elles tendent
prdominer, donnant celui-ci une certaine protection
vis--vis de germes indsirables.Cependant, la
production d'acide lactique, en faisant baisser le pH,
provoque unedstabilisation progressive de la dispersion
micellaire, ce qui rend le lait de moins en moinsstable
aux traitements thermiques et peut entraner sa
coagulation, mme tempratureambiante.Donc le test
de stabilit lbullition permet de vrifier quil ny a pas
eu productiond'acide lactique, et donc que tout les
microorganismes ont bien t dtruits durant le
procdUHT.
Observation : Interprtation :
C. Mesure du pH
30=6.63temoin=6.6655=6.39

4
D. Dnombrement des microorganismes arobie 30C
et 55C
1. Milieu utilis : PCA
Cest une glose standard universelle utilise pour le
dnombrement desmicroorganismes saprophytes. En
effet, le milieu contient des peptones comme
sourcesdazotes et du glucose comme source de
carbones, les extrait de levures apportant tous
lesfacteurs de croissance ncessaire la croissance des
microorganismes.
2. Ensemencement
Pour chacun des 3 pack de lait, on ensemence en surface
deux boites de ptri. Pour permettrele dnombrement
des microorganismes on procde comme suit :

A partir du pack incub 30C, on ensemence 2 boites

de ptri que lon met incuber pendant 72 heures
30C

A partir du pack incub 55C, on ensemence 2 boites

de ptri que lon met incuber pendant 48 heures
55C

A partir du pack tmoin, on incube une boite que lon

place pendant 72 heures 30Cet une boite que lon
place pendant 48 heures 55C
3. Rsultats
Aprs incubation, on nobserve aucun de dveloppement
de microorganismes. Donc le procd de pasteurisation
UHT a bien t effectu.
E. Recherche dantibiotiques
Un lait normalement ne doit pas contenir dantibiotiques.
En effet la prsencedantibiotiques, en gnral la
pnicilline, traduit un traitement de la vache qui est ou a
tmalade. Lantibiotique peut masquer ou cacher la
prsence de bactries pathognes, entraner chez le
consommateur des ractions allergiques lantibiotique,
modifier les floressaprophytes du lait, ou slectionner
des souches rsistantes.Dautre part, un lait contenant
des concentrations trop importantes dantibiotiques
estimpropre la fabrication des drivs du lait dans
laquelle une fermentation intervient :yaourt,fromages,
beurre, car ils peuvent inhiber le dveloppement des
bactries, lactiquesnotamment.
1. Mthode par acidification
Pour cette mthode on utilise une culture dpreuve qui
contient :

10mL de culture de rserve, qui contient des bactries

capable de dgrader le lactoseen acide lactique.

5mL dextrait de levures :source de vitamine

10mL de solution de pourpre ce bromocrsol, cet

indicateur va nous permettre desavoir sil y a eu
acidification du milieu.Si le lait analys contient des
antibiotiques alors les bactries ne dgraderont pas le
lactose, lacouleur du milieu sera donc inchange.
Observation
: Les tubes qui taient bleus au dpart virent au jaune, il
y doncacidification. Ce qui traduit une absence
d'antibiotique

5
2. Mthode par diffusion sur glose
a)

Principe
Une souche sensible aux antibiotiques est ensemence
dans le milieu Mueller-Hintoncoul en boite de ptri. Sur
cette glose , des disques imprgns dantibiotique ou du
lait examiner sont dposs. Aprs incubation, une zone
dinhibition apparat autour du disquecontenant un
antibiotique en quantit suffisante pour tre actif sur la
souche.La mthode est base sur la diffusion de
substances antibiotiques imprgnes sur desdisques en
papier pralablement schs qui doivent tre dposs
la surface de la glose. Lesdisques appliqus sur lagar
absorbent une quantit deau suffisante pour
dissoudrelantibiotique qui diffuse ainsi progressivement
dans le milieu, suivant les lois physiques dediffusion des
molcules travers un gel.On utilise comme souche le
Bacillus stearothermophilus
(souche sensible la pnicilline).Pour permettre de
valider les rsultats, on effectue un contrle positif (Le
disquecontient un antibiotique auquel la souche utilise
est sensible) et un contrle ngatif (rien a trajout au
disque)
b)

Milieu utilis : Mueller-Hinton

Ce milieu est reconnu comme tant le milieu de
rfrence le plus satisfaisant grce :

Sa faible teneur en thymine-thymidine ( lments

inhibiteurs de lactivit antibiotiquedu trimthoprime)
diminue les phnomnes de repousse autour de ces
disques et permet une dtermination prcise des
diamtres dinhibition .

Sa concentration en Ca
2+
et Mg
2+
, qui assure une meilleur prcision pour ladtermination
de la sensibilit des
Pseudomonas
aux aminosides, colistine etttracyclines.
c)

Rsultats
On peut dduire de cet antibiogramme que les 3 pack de
lait tests ne contiennent pasdantibactrien actif sur la
souche testeContrle positif Contrle ngatif Pastille de
lait tmoinLait 30CLait 55C