Microorganismos extremfilos

Dr. J.V. Sinisterra

Biotransformations Group
Faculty of Pharmacy
Universidad Complutense
www.biotransformaciones.com
Tabla 1 Tipos de microorganismos extremfilos

AMBIENTE COMPORTAMIENTO PARMETRO EJEMPLO ORGANISMO

Temperatura Hipertermfilo Crecimiento > 80C Pyrolobus fumarii (113C)

Termfilo Crecimiento 60-80C Synechoccus lividis
Psicrfilo Crecimiento < 15C Psychrobacteria (algunos
insectos)

Radiacin Atomfilos Superior a 6000 rad/hr; 15 Mrad Deinococcus radiodurans

tot.
Presin Barfilos Por encima de los gigapascals Sh. Oneidensis, E. coli

Sequedad Xerfilos Ausencia de agua Artemia salina, hongos, etc

Salinidad Halfilos 2-5 M NaCl Halobacteriaceae, D. salina

pH Alcalfilos pH > 9 Natronbacterium, B. Firmus

(Acidez/alcalinidad) Acidfilos pH < 0 Cyanadium caldarium (pH 0)

Presin de oxgeno Anaerobio No tolera O2 Methanococcus jannaschii

Microaerfilos Tolera bajas [O2] Clostridium

Extremos qumicos Gases Atmosfera pura de CO2 Cyanidium caldarium

Metales Elevadas concentraciones de Ferroplasmic acidarmanus
metales
 BIODIVERSIDAD
Especies
Especias Conocidas %
Reino Estimadas 1995 Conocido
Virus 13 x 104 - 13 x 106 5 x 103 0,04

Archea ?? 500 ??

Bacteria 4 x 104 - 4 x 106 4,8 x 103 0,12

Hongos 1,5 x 106 69 x 103 5

Algas 6 x 104 4 x 104 67

Total 1,9 x 107 1,2 x 105 0,65

 BIODIVERSIDAD
% Microorganismos
Biotopo cultivables
Agua Marina 0,001 0,1
Agua Dulce 0,25
Lagos Mesotrpicos 0,1 1
Aguas de Estuario 0,1 15
Sedimentos 0,25
Suelo 0,30
Lodos Activos 1 15
Arqueas (Archaea)

Microorganismos primitivos cuyas biomoleculas, enzimas y

mecanismo metablicos son diferentes de los de otros
microorganismos
Suelen estar adaptadas a vivir en condiciones extremas
de T, pH, salinidad etc

Hipertermfilos
Halfilos
Metanogncios
 Diferencias con los organismos mesfilos
1) No tienen triglicridos en las membranas sino polieters
formados por uniones de glicerol y unidades de isopreno
O
O
OH

O O HO
O
O O O
O O
O O
OH

2) Microorganiosmo acidfilos
Sulfolobus sp. HO

Paredes celulares con

pseudo-peptidoglicanos de
NAG beta-1-3 y NAT beta 1,3- OH
resistentes a la lisozima
bacteriana
2)Metabolismo especial

HOH
Acetil-CoA via oxidacin y no via glicolisis normal
HO
HO
HO H OH OH
H H

CH3- tetrahidrometopterina
Lactato Acetil-CoA
CO-deshidrogenasa
(especifica de arqueas)

CO2
 Microorganismo metanognicos

CO2 + 4H2 CH4 + H2 O Go = -131 kJ/mol

CH4+ 3 CO2 Go = -220 kJ/mol

4 CO + 2 H2O

4 HCOOH CH4 + 3 CO2 + 2 H2O Go = -319 kJ/mol

CH3-NH2 +HCl
CH4 + CO2 + 4 NH4 Cl Go = -230 kJ/mol

CH4 + CO + 2H2O Go = -319 kJ/mol

2CH3OH

CH4 -COOH + H2O Go = -31 kJ/mol

CH4 + CO2
Aplicaciones industriales

1.- Arqueas metanognicas .- produccin de metano a partir de residuos urbanos

2.- DNA polimerasas termoestables de Thermus aquaticus para ensayos de PCR

3.- Alcohol deshidrogenasas resistentes a los medios orgnicos.

Sulfolobus sulfataricus
4.- Recuperacin de metales Ni, Cu, U, Au etc Sulfolobus sp.

Enzimas mas termoestables que las de los mesofilos

1.- Sustitucin aminocidos flexibles (Gly, Ser, Ala etc) por aminocidos
Rgidos (Thr, Val, Pro)

2.- Sustitucin de aminoacidos con grupos reactivos Cys (SH), Glu y Asp
(COOH), Asn (CONH2) porotros inertes Ala, Leu etc.
3.- Tiene una relacin Arg/Lys alta lo que permite fuertes interacciones
polares
Aplicaciones industriales de enzimas aisladas de microorganismos termfilos

EXTREMOFILO HABITAT ENZIMA APLICACIONES REPRESENTATIVAS

Termfilo Elevada temperatura Amilasas Glucosa, fructora para edulcorantes

Termfilos moderados (45-65C) Xilanasas Blanqueo del papel
Termfilo (65-85C) Proteasas Fermentaciones, detergentes
Hipertermfilos (< 85C) DNA polimerasas Ingeniera gentica

Psicrfilo Baja temperatura Proteasas Maduracin del queso, produccin de lcticos

Deshidrogenasas Biosensores
Amilasas Degradacin de polmeros en detergentes

ACIDFILO Bajo pH Oxidacin de sulfuros Desulfuracin del carbn

Concentrado de calcopirita Recuperacin de metales

Alcalinfilo Elevado pH Celulasas Degradacin de polmeros en detergentes

Halfilo Elevada salinidad

Barfilos Elevada presin Cualquier microorganismo Formaci de geles y almidones granulados

Metalfilo Elevada concentracin de metal Cualquier microorganismo Bioremediacin, biomineralizacin

Radifilo Elevados niveles de radiacin Cualquier microorganismo Bioremediacin contaminacin radionuclear???

Microaerofilo Crecimiento en <21% O2

Hipertermfilos

Se conocen como hipertermfilso aquellos microorganismos que crecen por encima de 80C.
Hay algunos que crecen por enzima de la temperatura de ebullicin del agua.-
Pyrolobus fumarii 113C

Muchos de ellos corresponden al dominio de las Archeas.

Los hipertermfilos se encuentran en entornos terrestres o marinos, siempre que haya agua
Caliente v.g. agua calentada por fuentes termales, geisers o volcanes.

El estudio de secuencias 16S rDNA de los hipertermfilso ha demostrado que se encuentran

en lo mas profundo de las ramas de la evolucin. Son organismos muy primitivos.
 Enzimas de hipertermfilos

Hidrolasas.- Pyrobaculum calidifontis y Sulfolobus solfataricus producen

Carboxil-esterasas y esterasas termoresistentes.
No se han descrito hasta ahora verdaderas lipasas .-selectivas hacia
esteres de cidos grasos

Pyrococcus furiosus es un excelente productor de proteasas

Su perfil de actividad es similar al de la subtilisina

P.furiosus, P.horikoskhii y S. sulfataricus producen enzimas sacarolticas

Estan descritas -amilasa, -glicosidasa, - glucosidasa, -galactosidasa y
Exo--D- glucosaminidasa
 Enzimas de hipertermfilos

Alcohol dehidrogenasas.- P. furiosus, S. solfataricus y Aeropyrum pernix

Se han descrito como productores de estas enzimas
En concreto la de P. furiosus tiene 234 aminoacidos y presenta similitudes
con las ADH de cadena corta (van der Ost ycol 2001)

Este tipo no suele tener una gran estereospecificidad

HO

O R- 21.8 U/mg

ADH P. furiosus

HO

S- 32.3 U/mg
 Enzimas de hipertermfilos

Alcohol dehidrogenasas.- S. solfataricus

Tiene 347 aminoacidos y es NADH dependiente. Muestra una buena
Enantioselectividad en la reduccin de cetonas pequeas (Esposito y col 2002)

Asi la (R,S) 3-metil-butan-2-ona da el alcohol de configuracin S, pero no

hay una marcada selectividad hacia la configuracin del centro que
lleva el metilo
HO

ADH S. solfataricus

HO
Enzimas de hipertermfilos

En la actualidad se estn identificando los genes de los hipertermfilso que producen

las enzimas de inters para expresarlas en E. coli.
 Psicrofilos. Organismos cuya T ptima de crecimiento es <15C

Psicrotrofos organismos cuya T ptima de crecimiento es de 15 <T<20C

Psicrotolerantes Organismos mesfilos que pueden adaptarse a vivir a

bajas. T
Metodologas para aumentar la actividad enzimtica en los organismos Psicrofilos

1.- aumentar la concentracin intracelular de enzimas.- Psicrotolerantes y psicrotrofos

2.- Fabricando enzimas cuya actividad es casi independiente de T. G 0

3.- Fabricando enzimas muy especficas y de elevado turnover

-amilasa T(C) K(s-1) G H S

(kJ/mol) (kJ/mol) (J/mol x
K)

A.halophantis 15 187 58 71 46
(psicrof)

B. amyloliquefaciens 15 34 62 97 122
Subtilisina

B.TA41 (psicrof) 15 25 62 36 -92

B. subtillis 15 5 66 46 -70
La diferencia fundamental es que sus protenas son muy flexibles
para que a bajas T sigan manteniendo la estructura 3D.

Por ello tienen:

1)pocos puentes salinos o pares inicos y por ello la relacin (Arg+Lys)/ Lys
es muy baja
2) posee pocos enlaces de H. esto hace que se pierdan los contactos
entre los barriles . Tienen adems pocos aminocidos tipo
Ser, Thr, Asn, Gln
3) tienen pocas interacciones de stacking entre anillos aromticos Tyr, Phe y Trp.
4) tiene pocas interacciones bipolares entre C=O y NH en las hlices
5)sus protenas tienen poca afinidad por iones estabilizadores de estructuras
tales como Ca(II)
6)sus superficies son muy hidrfobas dando valores anormales de pI
7) su interior es mas hidrfilo que en los mesofilos pro lo que hace que se
desnaturalicen por el agua.
La Ingeniera de los Procesos Enzimticos- aplicacin a enzimas de termfilos

z BSQUEDA DE NUEVAS ENZIMAS MS EFICIENTES

z CLONAJE E HIPEREXPRESIN
z MUTACIN (PURIFICACIN, PROPIEDADES)
MEJOR PROTOCOLO DE PURIFICACIN
PROTOCOLOS MUY SENCILLOS DE INMOVILIZACIN + ESTABILIZACIN
z INGENIERA MICROSCPICA DEL CATALIZADOR
z INGENIERA DE LA REACCIN
z INGENIERA DEL REACTOR

RESULTADOS PODRIAN SER ESPECTACULARES

INGENIERIA ENZIMTICA COMO INGENIERIA MULTIDISCIPLINAR Y COMPLEJA:

NUEVAS POSIBILIDADES EN TECNOLOGIAS DE ALIMENTOS
 ENZIMAS
MICROBIOLOGA
MICROBIOLOGA BIOLOGAMOLECULAR
BIOLOGA MOLECULAR

Biodiversidad Alteracin de la
Sper-produccin
secuencia
de aminocidos
3D

NUEVOS Y
NUEVOS Y
MEJORES
MEJORES
ENZIMAS
ENZIMAS

DNA RECOMBINANTE PCR

Aplicacin a la QUIMICA ORGANICA

ENZIMAS DE TERMFILOS

z criterio de seleccin natural: eficacia biolgica

a altas temperaturas
z producto de la evolucin natural: enzimas
termo-resistentes
z criterio seleccin natural = criterio seleccin industrial

enzimas muy minoritarias

los microorganismos extremfilos
crecen muy lentamente

Clonacin, sper expresin en microorganismos

hospedadores adecuados
 Microorganismos Termfilos: Viven a Altas Temperaturas

BIOLOGIA INDUSTRIA
ENZIMAS TERMORRESISTENTES

PROCESOS A ALTA TEMPERATURA

(prevencin de contaminaciones, economa del proceso)

Microorganismos termfilos Enzima minoritaria

Difcil de crecer en fermentadores
industriales

Clonacin e hiperexpresin en microorganismos mesfilos

hospedantes fciles de manejar
ENZIMAS DE MICROORGANISMOS QUE NO HAN SIDO DETECTADOS

Suelos Amplificacin
Aguas Termales DNA
Aguas de Dorsales (PCR) Biblioteca
Marinas de
Secuencias

Extraccin
DNA
mRNA
Homologa con
enzimas conocidas

Clonaje, sper-expresin

Nuevas Enzimas
z Aprovechamiento de evolucin natural TERMFILOS

z Utilizacin directa de DNA ( organismos difciles de identificar)

z Mejora por evolucin dirigida

z Estructura 3D ( Rayos X, modelos matemticos... )

z Mejora por mutagnesis dirigida

ENZIMAS INDUSTRIALES
Actividad y selectividad substratos naturales
Estabilidad
 Las enzimas deben ser purificadas

Alta actividad volumtrica

Enzimas puras

Problemas de alergenicidad (solubles)

Ausencia de reacciones laterales catalizados por otras enzimas
contaminantes (oxidaciones, hidrlisis, proteasas solubles o inmovilizadas)
Mxima capacidad de carga de los derivados inmovilizados
 Enzimas inmovilizadas y estabilizadas

Re-uso

Reactores en continuo para tratamiento de grandes volmenes de sustrato

La enzima no se libera al alimento

(posibilidad de utilizar un mayor nmero de enzimas)

Derivados inmovilizados y estabilizados para su uso por prolongados periodos de

tiempo

htecnologa y economa
Purificacin de enzimas industriales mediante procesos cromatogrficos

ESTE MTODO DE PURIFICACION PUEDE SER:

a). Muy eficiente y til a escala laboratorio

b). Deberan ser muy tiles a escala industrial pero necesitan

simplificarse y optimizarse
Adsorcin
Adsorcin Selectiva
Selectiva de
de Enzimas
Enzimas Grandes
Grandes Sobre
Sobre Soportes
Soportes Inicos
Inicos Poco
Poco Activados
Activados

Adsorcin de enzimas Adsorcin selectiva

grandes y pequeas de enzimas grandes
 Desorcin
Desorcin de
de la
la -galactosidasas
-galactosidasas de Thermus sp.
de Thermus sp. T2,
T2,
Adsorbida
Adsorbida aa Soportes
Soportes MANAE
MANAE dede Diferente
Diferente Grado
Grado de
de Activacin
Activacin

100 100

80 80

Proteinas (%)
Actividad (%)

60 60

40 40

20 20

0 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Grado de aminacin del soporte (mols)

Pessela y col. J. Chromatgr. A, 155-159.

A, 1034, (2004), 155-
 Purificacin
Purificacin de
de Enzimas
Enzimas Multimricas
Multimricas de
de Microorganismos
Microorganismos Termfilos
Termfilos Clonadas
Clonadas en
en
Mesfilos
Mesfilos por
por Adsorcin
Adsorcin Selectiva
Selectiva aa Soportes
Soportes de
de Intercambio
Intercambio Inico
Inico Poco
Poco Activados
Activados

Anlisis por filtracin en gel de las protenas del extracto crudo de E. coli
adsorbidas a soportes MANAE-agarosa con diferente grado de activacin

12

10
Protenas (g/ml)

8
Protenas adsorbidas a
MANAE altamente activado
6

4 Protenas
adsorbidas
2 a MANAE 1 mol/g

0
50 60 70 80 90 100 110
Volumen de Elucin (mL)
 Anlisis por Filtracin en Gel de PROTEINAS de Microorganismos Termfilos
Clonadas en Mesfilos por Adsorcin Selectiva a Soportes de Intercambio Inico Poco Activados

12

Proteinas (ugr /mL)

10
8
6
4
2
0
45 55 65 75 85 95 105
Volumen de elucin (mL)

- Se eliminan las protenas de elevado peso molecular del organismo mesfilo

- La protena de mayor peso molecular se mantiene intacta (nuestro inters)

Pessela y col. Biotechnol. Progr.

Progr. 20, (2004), 1507-
1507-1511
 Purificacin
Purificacin de la -galactosidasa
de la -galactosidasa de Thermus sp.
de Thermus sp. T2
T2 Clonada
Clonada en
en E.
E. coli
coli

94
67 1- Patrn de PM

-galactosidasa 2- Extracto crudo

43
3- Protenas tras choque trmico
30 4- Protenas adsorbidas a soportes
con baja densidad de grupos
20
1 2 3 4

Pessela y col. J. Chromatog. A, 1055, (2004), 93-

Chromatog. A, 93-98
 ENZIMAS DE TERMOFILOS

z Elevada estabilidad trmica

z Elevada estabilidad en presencia de codisolventes orgnicos
z Temperatura ptima elevada
z Baja actividad a temperaturas moderadas

Esterasa de Bacillus stearothermophilus

Catecol 2,3 dioxigenasa de Bacillus stearothermophilus
Alfa y beta galactosidasa de Thermus sp.
Xilanasa de Thermotoga maritima
 ESTERASA DE B. stearothermophilus

zTemperatura ptima del microorganismo: 60C

zTemperatura ptima de la enzima: 62C
zElevada actividad a temperatura moderada
zAmplia especificidad
ACTIVIDAD DE LA ESTERASA DE B. stearothermophilus
EN MEDIOS DESFAVORABLES

Efecto de co-disolventes Efecto de la fuerza inica

100 95 100 95

Actividad Residual, (%)

Actividad Residual, (%)

80 80
60
60 60

40 30 40

20 20

0 0

30% propanol 500 mM ClNa

 Catecol 2,3 dioxigenasas
zEnzimas multimricas
X X z Centro cataltico con un
grupo Fe 2+ no hemo
Y OH Y OH z Muy inestables
z Posibilidad de ser utilizadas
Z OH E Z COOH en sntesis de piridinas complejas
C O
Catecol H
Semialdehido
2- hidroximucnico

Catecol 2,3 dioxigenasa de B. stearothermophilus

Estabilidad trmica elevada ( microorganismo crece a 55C )

 EFECTO DE LA UNION COVALENTE MULTIPUNTUAL
EN LA ACTIVIDAD DE LA CATECOL 2, 3 DIOXIGENASA EN
CONDICIONES DESFAVORABLES

100 100

Actividad Residual, (%)

Actividad Residual, (%)

75 75

50
50
25
25
0
0,00001 0,001 0,1 10 1000 0
[catecol mM] 0 25 50 75 100
Temperatura

pH 7, 40C pH 7, 0.1 mM catecol

 XILANASA DE Thermotoga maritima

z Temperatura crecimiento, 80C

z Enzima muy termoestable
z Mximo de actividad 105C
z Vida Media a 100C aproximadamente 10 minutos

Un buen modelo para estudiar la degradacin qumica

de protenas correctamente plegadas
EFECTO DE LA INMOVILIZACION EN LA ESTABILIDAD
DE LA XILANASA DE T. maritima

10000

Vida media (min) 1000

100

10

0,1

0,01
95 105 115 125

T, (C)

pH 7
EFECTO DE LA INMOVILIZACION EN LA ESTABILIDAD
DE LA XILANASA DE T. maritima

10000

Vida media (min) 1000

100

10

0,1

0,01
95 105 115 125

T, (C)

pH 7
 Inmovilizacin y Estabilizacin de Enzimas Multimricas

INMOVILIZACIN Y ESTABILIZACIN DE LA -GALACTOSIDASA DE Thermus sp. T2.

z Enzima tetramrica de elevado peso molecular

z Altamente termorresistente
z Activa y estable en un amplio rango de pH.

Potencialmente til para hidrolizar lactosa en leche y en sueros de quesera a alta temperatura

INMOVILIZACIN MULTIPUNTUAL CON DIFERENTE ORIENTACIONES SOBRE SOPORTES EPXIDO

 Inmovilizacin Multipuntual de Enzimas Sobre Soportes Epxido

O
H2 N
O

O
O
HS

O
O
HO
O

Muy estables: transporte

Pueden reaccionar con distintos nucleofilos de la enzima:
inmovilizacin multipuntual muy favorable
Facilidad del bloqueo de epxidos remanentes

z Muy poco reactivos: velocidad de inmovilizacin extremadamente lenta

zPosibilidad de modular la enzima sobre el soporte
 Mecanismo de Estabilizacin de Enzimas

Detecci n de subunidades enzim

Deteccin ticas no unidas al soporte vva
enzimticas a epxido.
epxido.

SDS Mercaptoetanol,
100C

Derivado no estabilizado

derivado
estabilizado
+
SDS-PAGE
Estabilizacin del Derivado Boronato por Entrecruzamiento con Dextrano Aldehdo pH 6,5 70 C

100 derivado boronato entrecruzado 970

97000
66000 - galactosidasa
de Thermus sp. T2
80
Actividad residual,(%)

45000
60
30000
40
20100
20 -galactosidasa soluble
14400
0

0 2 4 6 8 10
1 2 3
Tiempo (horas)
1 Patr
Patrn de peso molecular
2 Derivado boronato sin entrecruzar
3 Derivado boronato entrecruzado

Pessela y col. Biotechnol. Prog. 20, (2004), 388-392

Adsorcin de protenas sin colas de Poli-His sobre soportes quelatos altamente activados

Adsorci
Adsorcin en ausencia de Imidazol Adsorci
Adsorcin en presencia de Imidazol

Las protenas de elevado peso molecular se pegan mucho mas

fuertes que las protenas de pequeo peso molecular
 Adsorcin de la -galactosidasa de Thermus sp. T2 clonada en E. coli soportes
IMAC altamente activados

Grado de activacin del soporte: 115 M de quelatos /g de soporte

Efecto del Imidazol en la adsorcin de la -galactosidasa y de otras protenas de E. coli

100 Actividad 100

-galactosidasa

Protenas adsorbidas ,%
Actividad residual ,%

80 80

60 60

40 40

20 20
Protenas totales

0 0
0 10 20 30 40 50
[Imidazol, mM]

Pessela y col. Enzyme Microbial Technol. 909-915.

Technol. 39, (2006), 909-
 Adsorcin de la - y -galactosidasas de Thermus sp. T2 clonadas en E. coli
soportes IMAC altamente activados

Purificacin de la - y -galactosidasas de Thermus sp. T2 clonadas en E. coli

1.- Choque trmico

2.- Adsorcin selectiva a soporte IMAC muy activados en presencia de 50 mM de imidazo

LMW (kDa) -galactosidasa -galactosidasa

LMW (kDa)
94
67 94
67
43
43

31 31

21
21

1 2 3 1 2 3
1- PM; 2- Extracto crudo; 3- enzima purificada

Pessela y col. Enzyme Microbial Technol.

Technol. (In press).
press).
 Purificacin-Inmovilizacin-Estabilizacin de la - y -galactosidasas
de Thermus sp. T2 sin Poli-His, adsorbidas a soportes IMAC muy activados

Inactivacin Trmica de los Derivados de la - y -galactosidasas

-galactosidasa -galactosidasa
100 100
Actividad residual, (%)

80 Sepabeads-EB-IDA-Ni 80 Sepabeads-EB-IDA-Ni
60 60

40 Soluble 40 Soluble
20 20

0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 0 10 20 30

Tiempo (h)

Condiciones de inactivacin: pH 7, 70C

Pessela y col. Enzyme Microbial Technol. press)

Technol. (In press)