1.

Alcance:

Este procedimiento cubre la reconstitucin de cepas de referencia, la preparacin y el

mantenimiento de cepas de reserva y de trapajo que son usados en anlisis microbiolgicos.

2. Responsable:

El analista del laboratorio de control microbiolgico es el responsable de reconstituir, repicar,

almacenar, revisar y controlar todas las cepas de referencia, de reserva y de trabajo usadas en
anlisis microbiolgicos.

3. Procedimiento:

3.1 Reconstitucin de las cepas de Referencia:

Las Cepas de referencia adquiridas por el laboratorio de microbiologas registradas en el formato

ITR033-1.

Las Cepas de referencia son almacenadas a una temperatura entre 2C 8C hasta su uso.

En la reconstitucin y siembra de la cepa de referencia, se utiliza el medio de cultivo, las

condiciones de incubacin y el procedimiento indicado por el organismo proveedor de las cepas para
cada tipo de microorganismo de acuerdo al Anexo I

3.1.1 Rehidratacin de las cepas de referencia

De acuerdo a las instrucciones del fabricante la rehidratacin de cultivos liofilizados en viales

(KWIK- STICK) se realiza de la siguiente manera:
1. Verificar nmero ATCC y nombre del cultivo.
2. Abrir la preparacin contenida en un vial doble.
3. Sacar el sticker de la cepa donde viene toda la informacin (guardarla para fines de trazabilidad)
4. En la parte superior, apretar hasta romper la ampolla que viene adentro, para liberar el lquido
que rehidrata las cepas.
5. Dar golpes contra una superficie, de manera vertical al Kwik para que el lquido cubra todo el
liofilizado.
6. De manera asptica, sacar el hisopo para hacer la siembra en una caja de Petri, con el medio de
cultivo indicado para la cepa, segn Anexo I.
7. Hacer el repique con el hisopo impregnado de la cepa por toda la placa.
8. Incubar por el tiempo y temperatura indicados en el Anexo I.

3.1.2 Control de calidad Cepas de referencia:

Los controles de calidad de pureza y viabilidad para las cepas de referencia (depende del
microorganismo) y son los siguientes:
opia correspondiente a: Laboratorio de control Archivo Direccin
Aprobado por:
Coloracin de Gram y caractersticas de las colonias en medios selectivos.

Si en el control de calidad de la cepa de referencia se encuentra que el cultivo microbiano no es

viable o ha sido deteriorado (ej color incorrecto, morfologa, etc), debe ser descartado y un nuevo
vial liofilizado debe ser abierto.

Registrar el control de calidad realizado a las cepas de referencia en el formato ITR033-1.

Nota: Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se deben utilizar.

3.2 Metodologa para la preservacin y mantenimiento de cepas de reserva:

3.2.1 Almacenamiento Cepas de reserva (Pase 3):

Las cepas de reserva son cepas idnticas a las cepas de referencia logradas mediante un nico
subcultivo
Almacenar en crioviales para su conservacin, de la siguiente manera:
Previo a la inoculacin, se rotulan los tubos crioviales donde se almacenan las cepas de reserva,
en cada criovial se registra la siguiente informacin: Identificacin de la cepa (gnero y especie),
tipo y nmero de coleccin, N de repique, fecha de realizacin de la cepa de reserva, fecha de
vencimiento del criovial, N de criovial.
Tomar el desarrollo microbiano logrado en el proceso de reconstitucin de la cepa de referencia
mediante un asa estril.
Inocular el vial introduciendo el asa en el medio conservante.
Cerrar el vial y agitarlo suavemente para que la cepa se impregne en las crioperlas.
Realizar el procedimiento para el nmero de crioviales necesarios.
Extraer el medio conservante sobrante mediante una pipeta estril.
Cerrar el criovial y congelar a una temperatura mnima de -20C.
La conservacin puede darse a temperatura de congelacin por 2 aos.

3.2.2 Registro de las cepas de reserva:

Registrar en el formato ITR033-1 la siguiente informacin referente a las cepas de reserva:

Identificacin de la cepa
Tipo y N de coleccin
N lote cepa de referencia
N de criovial
Fecha de reconstitucin de la cepa de referencia
N de repique
opia correspondiente a: Laboratorio de control Archivo Direccin
Aprobado por:
 Frasco en uso
Fecha de baja criovial
Ubicacin de almacenamiento
Observaciones

3.2.3 Posibles inconvenientes:

Falta de suministro de energa

Avera del equipo
Problemas y perdida de las cepas por mutacin (para ello debe evitarse la descongelacin de
las cepas de reserva)

3.2.4 Factores que determinan la viabilidad de las cepas sometidas al proceso de congelacin:

El tipo de cepa: La resistencia de las bacterias gram positivas es mayor que en el caso de las
gram negativas.
Las ptimas condiciones del cultivo antes de someterse a bajas temperaturas.
La edad del cultivo: la edad idnea corresponde con el fin de la etapa logartmica, siendo el
principio de la fase estacionaria la de mayor probabilidad de recuperacin, en general es de
18 a 24 horas de incubacin a 35.0C 2.0C, igualmente se deben respetar las instrucciones
dadas por los fabricantes.
En caso de descongelamiento de la cepa de reserva, no debe volver a congelarse.
El criovial vencido debe eliminarse del cepario y se registra.

3.3 Cepas de trabajo

Las cepas de trabajo son subcultivos de microorganismos obtenidos a partir de las cepas de
reserva

3.3.1 Obtencin de cepas de trabajo

Extraer del congelador un criovial para realizar el repique de cada cepa en 4 tubos slant
con el medio y tiempo de incubacin indicados en la tabla 1. Los tubos de slant se deben
almacenar en nevera a 2 8C, y tendrn vigencia de quince das.

3.3.2 Verificacin de viabilidad de las cepas de trabajo:

opia correspondiente a: Laboratorio de control Archivo Direccin

Aprobado por:
 Semanalmente, cuando se repican las cepas de trabajo, repicar las cepas de reserva en
medios selectivos y adicionalmente realizar la coloracin de gram para verificar que las
mismas no hayan mutado y no se estn deteriorando.

3.3.3 Control de fechas de vencimiento de cepas de referencia:

Cada vez que ingrese un lote de una cepa de referencia al laboratorio, se debe registrar la
fecha de vencimiento de la misma en el formato POP024-1 (virtual), para realizar control
de vigencia. La ltima semana de cada mes, se debe realizar la verificacin en el archivo
para determinar las cepas prximas a vencer, con el fin de montar rdenes de compra en
caso de ser necesario.

ANEXO I

MEDIOS DE CULTIVO, TEMPERATURA Y TIEMPO DE INCUBACIN

ATCC Medio Tiempo

Microorganismo TemperaturaIncubacin
# Cultivo Incubacin
Pseudomonas Agar
9027 35 C 18 24 hs
Aeruginosa TSA
Agar
Escherichia Coli 8739 35 C 18 24 hs
TSA
Staphylococcus Agar
6538 35 C 18 24 hs
Aureus TSA
Agar
Aspergillus B. 16404 27 C 66 96 hs
HC
Candida Agar
10231 35 C 24 - 48 hs
Albicans TSA
Agar
Burkholderia C. 25416 35 C 18 24 hs
TSA

opia correspondiente a: Laboratorio de control Archivo Direccin

Aprobado por:
 ANEXO II

MODELO ETIQUETA IDENTIFICACIN CEPAS

CEPAS DE RESERVA XXXXX S.A.S

Cepa: ____________________________________
ATCC N: ________________________________
Lote: ____________________________________
Pase N: __________________________________
Nmero de crioviales contenidos:
O1 O2 O3 O4
Fecha de reconstitucin: ____________________
Fecha de vencimiento de cepa: _______________
Responsable:______________________________

CEPAS DE TRABAJO XXXXX S.A.S

Cepa: ___________________________________
ATCC N:_______________________________
Lote cepa referencia:_______________________
Vigencia cepa de referencia: ________________
Lote cepa de trabajo: ______________________
Fecha inicio cepa de trabajo: ________________
Vigencia cepa de trabajo: ___________________
Pase N: ________________________________
Tubo N: _______________________________
Control de calidad aprobado: _______________
Si O No O Responsable: ________________

opia correspondiente a: Laboratorio de control Archivo Direccin

Aprobado por: