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Rev.MVZ Crdoba 18(Supl):3689-3698, 2013.

ORIGINAL

Inhibicin de colonizacin intestinal por Vibrio cholerae


con Lactobacillus acidophilus1 en conejos lactantes

Lactobacillus probiotics may prevent Vibrio cholerae colonization


in rabbits newborn

Alvaro Pazos M,1* Ph.D, Milena Guerrero F,1 M.Sc.

1
Universidad de Nario, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Departamento de Biologa, Pasto,
Colombia. *Correspondencia: alpazmo@udenar.edu.co.

Recibido: Octubre de 2012; Aceptado: Mayo de 2013.

RESUMEN

Objetivo. Evaluar la capacidad in vitro e in vivo de Lactobacillus acidophilus1, aislado en este estudio,
para prevenir enfermedad diarreica causada por Vibrio cholerae 01 OGAWA, en conejos lactantes.
Materiales y mtodos. Se aisl Lactobacillus acidophilus1 a partir de heces de nios sanos, se
seleccion por su capacidad amiloltica a partir de un grupo de bacterias cido lcticas (BAL). El mejor
sustrato amilceo para el crecimiento de la BAL fue estandarizado previamente. Con L. acidophilus1
se realiz un ensayo in vitro e in vivo de inhibicin antagnica sobre el enteropatgeno y se evalu la
prevencin de la colonizacin por V. cholerae 01 OGAWA en conejos lactantes. Resultados. De acuerdo
con el anlisis de varianza L. acidophilus1 present la mejor capacidad amiloltica respecto a las otras
BAL aisladas, p<0.5. Se encontr que un inculo con una densidad celular de 35x106 bacterias/ml en el
fermento lctico es capaz de ejercer el mayor efecto antagnico in vitro sobre V. cholerae. Se demostr
el efecto probitico in vivo, ya que los conejos enfrentados con el patgeno y sin recibir probitico
tuvieron una probabilidad de sobrevida menor de 0.25 respecto al grupo de animales retados con el
patgeno y simultneamente alimentados con el probitico cuya probabilidad de sobrevida fue de
0.95. Conclusiones. L. acidophilus1 se considera un microorganismo probitico, capaz de sobrevivir
a su paso por el tracto gastrointestinal en un modelo animal y prevenir la colonizacin intestinal por
V. cholerae 01 OGAWA en conejos lactantes.

Palabras clave: Conejos, Lactobacillus acidophilus, probiticos, Vibrio cholerae, (Fuente: DeCS).

ABSCRACT

Objective. To assess the capacity in vitro and in vivo of Lactobacillus acidophilus1 isolated in this
study, capable of preventing diarrheal disease caused by Vibrio cholerae 01 OGAWA in rabbits newborn.
Materials and methods. Lactobacillus acidophilus1 was isolated from faeces of healthy children and
was selected from a group of lactic acid bacteria (LAB). The better starchy substrate for the growth of
the LAB was previously standardized. Using the L. acidophilus1, there was carried out an in vitro and
in vivo assay of antagonistic inhibition on the enteropathogen and it was evaluated the prevention
of colonization by V. cholerae 01 Ogawa in rabbits newborn. Results. L. acidophilus1 present the
better amylolytic capacity, p<0.5 in the ANDEVA. It was found that an inoculum with a cell density of

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35x106 bacteria/ml in the lactic ferment is able to exert the greatest antagonistic effect in vitro over
V. cholerae. The probiotic effect was demonstrated in vivo, since rabbits exposed to the pathogen
without having received probiotic had a lower survival probability of 0.25 regarding the group of
animals exposed with the pathogen and simultaneously fed with the probiotic whose probability of
survival was of 0.95. Conclusions. L. acidophilus1 is considered a probiotic microorganism capable of
surviving when passing through the gastrointestinal tract in an animal model and preventing intestinal
colonization by V. cholerae 01 Ogawa in rabbits newborn.

Key words: Lactobacillus acidophilus, probiotics, rabbits, Vibrio cholerae (Source: MeSH).

INTRODUCCIN

A nivel mundial las enfermedades infecciosas respectivamente (2), lo anterior sumado a que
continan siendo el principal problema por el flujo de inmigrantes y visitantes entre estos
resolver en el siglo XXI. Segn la OMS, las pases y Colombia es considerable, creemos
enfermedades diarreicas son la segunda mayor pertinente tener en cuenta el Plan Nacional para
causa de muerte en nios menores de cinco aos. el Control del Clera (PNCC) que se desarrolla
En 2012, fueron reportados por la OMS 245.393 en Colombia desde el ao 2011, en particular
casos de clera con ms del 49% de los casos con relacin al desarrollo de estrategias de
ocurridos en Amrica, principalmente en Hait y prevencin que permitan evitar la aparicin
Republica Dominicana (1). En Colombia, en el de brotes o epidemias. La creacin del PNCC
periodo Enero-Agosto de 2013 se documentaron se sustenta en epidemias que sobrevinieron
76 muertes por enfermedad diarreica aguda con el terremoto de Hait en 2009, con lo cual
(EDA) en lo corrido del ao y 1.878.989 casos, el nmero de casos en este pas y Repblica
de los cuales 25.1% en nios menores de 5 aos. Dominicana y por tanto, el riesgo de brotes en
En comparacin con el ao 2012, hasta Agosto Centroamrica y Suramrica se incrementaron
de 2013 en Colombia se registr un aumento de considerablemente en los ltimos aos. Por otro
14.4% de mortalidad por EDA (2). lado, aun cuando se establecen las medidas
sanitarias y de prevencin, la alta incidencia de
Las bacterias de los gneros Shigella, EDA se convierte en un serio problema de salud
Campylobacter y las especies V. cholerae, E. pblica a nivel mundial, por lo cual los esfuerzos
coli patognica y rotavirus, son los principales para conseguir estrategias de manejo y control
agentes causantes de muertes por EDA en de estas infecciones son de constante inters
pases emergentes. En Estados Unidos de 21 a cientfico.
37 millones de casos de EDA se producen por
ao en una poblacin de 16.5 millones de nios La microbiota gastrointestinal humana (MIH)
y en tales casos Salmonella, Campylobacter y E. juega un papel importante en la salud del
coli 0157 enterohemorrgica y enteroagregativa individuo dado que la composicin y la actividad
son las bacterias mas frecuentes de infecciones de los microorganismos son responsables de
transmitidas por alimentos (3). La alta incidencia funciones metablicas colectivas, de barrera e
de las infecciones asociadas a estos agentes se interacciones con el husped (5,6). Trillones de
debe principalmente a su fcil diseminacin, microorganismos habitan el intestino humano,
los perfiles de resistencia a los frmacos formando una comunidad ecolgica compleja
antimicrobianos y los complejos mecanismos que influencia en su normal funcionamiento y en
moleculares de patogenicidad (4). la susceptibilidad a enfermedades (7). Las BAL
autctonas del tracto gastrointestinal humano
El clera es la EDA ms grave que se conoce y (TGH) contribuyen a beneficios nutricionales
se caracteriza por su rpida diseminacin que en la salud, tales como el mejoramiento de la
conlleva a epidemias en periodos cortos de digestin de lactosa y el alivio de ciertos tipos de
tiempo. Es producida por la bacteria V. cholerae diarreas (5,8,9). La MIH es objeto de numerosas
que se encuentra en el agua o alimentos investigaciones, con especial inters en la
contaminados y puede causar la muerte de 50% secuenciacin del genoma de las bacterias que
de los infectados. la conforman (10), es as que en la actualidad se
llevan a cabo el Human Microbiome Project (HMP)
En pases como Hait y Repblica Dominicana en USA y el Metagenomics of the Human Intestine
se reporta una letalidad alta por clera; con (metaHIT) en Europa y sus investigaciones han
un nmero de casos de muertes de 8258 y reportado que el organismo humano consiste
453 casos acumulados hasta agosto de 2013 en 1013 clulas eucariotas y 1014 microbianas,
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donde las ms de 1000 especies bacterianas en el MATERIALES Y MTODOS


ambiente gastrointestinal humano (AGH) inciden
en la regulacin del equilibrio homeosttico con el Aislamiento de BAL de tracto intestinal
hospedero o en el desenlace de una enfermedad humano. Se aisl el microorganismo de muestras
(7). Estos avances describen aspectos importantes de materia fecal (MF) segn recomendaciones
de la MIH tales como su capacidad de adherirse a descritas en literatura especializada (18,19).
las protenas del hospedero (colgeno, fibringeno, Las BAL fueron aisladas de MF de cinco infantes
fibronectina) y por lo tanto, la adherencia como un (I1=tres aos de edad, I2=dos meses, I3=cuatro
prerrequisito para una persistencia de las cepas aos, I4=un ao e I5=trece aos) las cuales
bacterianas en el AGH (11). Asimismo, sealan fueron tomadas durante cinco das consecutivos
beneficios de la interaccin entre la microbiota (a,b,c,d,e) para un total de 25 muestras. Se
y el organismo hospedero, atribuidos en gran incluyeron nios con nulos antecedentes de
parte a la MIH, tales como la participacin en la diarreas y sin terapia con antibiticos.
formacin de la pared intestinal, la resistencia a la
colonizacin y la produccin de cidos grasos de Las colonias compatibles con BAL se repicaron
cadena corta. Estos metabolitos juegan un papel en agar MRS azul de anilina hasta observar
fisiolgico importante, como el cido actico en los cultivos axnicos. La conservacin se realiz en
msculos, corazn y cerebro, el cido propinico en tioglicolato ms glicerol a 25C (20).
la gluconeognesis y el cido butrico en la funcin
de los enterocitos (11,12). La MIH es capaz de Capacidad amiloltica de BAL. Los cultivos en
mejorar las interacciones con el sistema inmune agar MRS-almidn fueron expuestos a vapores
de las mucosas y la degradacin de xenobiticos de iodo bisublimado que ante el almidn vir su
(6,11,13). La inmensa diversidad de la MIH, la color a un complejo cafazulado diferenciando
variacin interpersonal y fluctuaciones temporales sus lmites con halos de hidrlisis del almidn.
en la composicin, especialmente durante la Al cabo de 2 min de exposicin se tomaron las
enfermedad y su desarrollo temprano son retos mediciones (21). Los resultados del dimetro del
que impactarn en el control de EDAs (5,7,11). halo de hidrlisis en mm se estudiaron mediante
anlisis de varianza y posterior prueba de Tukey.
Los probiticos definidos por la FAO/WHO Se seleccion la bacteria con mejor capacidad
(2011), como microorganismos vivos que amiloltica y el mejor sustrato amilceo que
confieren beneficios a la salud del hospedero, permiti el crecimiento ptimo de la BAL fue
incluyen Lactobacillus sp. y Bifidobacterium sp., estandarizado en un trabajo previo (20).
microorganismos comnmente utilizados como
probiticos junto con ciertos tipos de levaduras Identificacin de BAL con mejor capacidad
y otras BAL (12,14). Las caractersticas de un amiloltica. Se realiz mediante claves
probitico fueron definidas por Kamlesh et al taxonmicas descritas en Bergeys Manual of
(2011) (14). L. acidophilus se encuentra en el Determinative Bacteriology (22) y pruebas
TGI y en ese nicho resiste la accin de cidos bioqumicas de degradacin de carbohidratos y
orgnicos, sales biliares, la acidez y puede utilizacin de aminocidos en galeras API CH50
competir por nutrientes con microorganismos (biomrieux, Marcy lEtoile, France).
patgenos. Un estudio reporta el potencial
probitico de L. acidophilus en el control de Evaluacin de parmetros de fermentacin.
Salmonella (15). Otro reporta su capacidad Para estimar la produccin de biomasa se utiliz
para estimular la produccin de IgA en TGI, el mtodo de recuento en placa en agar MRS.
la produccin de linfocitos e inhibicin de La determinacin de protenas se realiz por el
la adhesin e invasin de patgenos (13). mtodo de Lowry. La determinacin de azcares
Actualmente se estudia el efecto antioxidante de y cido lctico se realiz por cromatografa lquida
L. acidophilus y en modelos in vivo se encontr de alta eficiencia (HPLC) (20).
una disminucin en los niveles de glucosa en la
sangre de pacientes con diabetes tipo 2 (16). Ensayo de antagonismo in vitro del
probitico sobre V. cholerae 01 OGAWA. Se
En este escenario, los probiticos se constituyen aplic el mtodo de difusin en pocillos descrito
en una potencial herramienta para estimular por Alvarado et al (23). A la BAL en el sustrato
la salud humana y animal (17-19). Por tanto, amilceo elegido se le realizaron 3 diluciones
esta investigacin tuvo como objetivo evaluar (10-1,10-2,10-3) en SSF y en cada una de ellas se
el efecto inhibitorio in vitro e in vivo de L. ajust la densidad celular del inculo en cmara
acidophilus1 aislado de TIH, sobre la cepa de Neubauer. Posteriormente, se vertieron 40 l
patgena de referencia V. cholerae 01 OGAWA de cada suspensin celular en pozos de 7 mm
en conejos lactantes. de dimetro en agar MRS. Luego se cubri con
una capa de agar TCBS con 25 l de inculo de
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V. cholerae. Lo anterior se incub a 35C por animales se realiz con una dosis previamente
48 h, tiempo en el cual se midieron los halos estandarizada del patgeno (0.5x108 bact/ml) siete
de inhibicin del probitico sobre el patgeno das despus de su nacimiento. Esta cantidad fue
(20). Se aplic un diseo irrestrictamente al distribuida a su vez en 4 dosis de 250 l cada 6 h
azar con arreglo bifactorial combinatorio y 10 con cnula esofgica de 1.0 mm de dimetro til.
replicas, donde el factor A correspondi a dos
niveles de sustrato: a1=melaza con leche en El poder de colonizacin del lactobacilo y la
polvo y a2=MRS; y el factor B correspondi a inhibicin de la colonizacin del patgeno se
cuatro niveles de dilucin del sustrato, a saber: evalo indirectamente, practicando recuentos de
b1=sustrato puro, b2=10-1, b3=10-2 y b4=10-3. colonias de bacterias lcticas y V. cholerae de
La unidad experimental estuvo representada heces de conejos lactantes, tanto de retados como
por una caja petri y un total de 80 unidades no retados. Las muestras se tomaron diariamente
experimentales. Con el objeto de uniformizar las durante los 13 das del ensayo pos infeccin.
observaciones, previo anlisis del Test de Bartley
y Harley, estas se transformaron mediante raz Los datos se analizaron con el programa STATA
cuadrada de X, donde X fue la observacin. Los 10.0. El plan de anlisis requiri de una base de
datos se sometieron a ANDEVA y prueba de Tukey datos con las medidas de peso diario de los conejos,
para comparar las medias de los tratamientos sobrevida y cuantificacin del nmero de UFC de
en aquellas fuentes de variacin que resultaron L. acidophilus1 y V. cholerae 01 OGAWA, e incluy
estadsticamente significativas, p<0.1. el test de anlisis de variantes de una va, prueba
de rangos mltiples DUNCAN y un anlisis de
Ensayo de proteccin del probitico contra estimacin de sobrevida por Kaplan-Meier. Se utiliz
V. cholerae 01 Ogawa en conejos lactantes. el test de ANOVA, para evaluar la significancia de
El ensayo in vivo se realiz tomando como modelo los resultados de proteccin en el modelo animal.
animal, conejos lactantes. Luego de administrar Esta investigacin fue avalada por el Comit de
una dosis de 0.5x108 bact/ml ms del 95% de tica en Investigacin de la Universidad de Nario.
los conejos desarrollaron enfermedad diarrica
y la sobrevida promedio despus de ser retados
con el enteropatgeno fue de 13 das, tiempo RESULTADOS
de seguimiento para el ensayo de proteccin. Se
analizaron cuatro grupos con 60 conejos lactantes
cada uno. Tres grupos recibieron tratamiento para Aislamiento de BAL. Se obtuvieron 75 aislados en
evaluar el efecto protector y en el cuarto se evalu agar MRS-azul de anilina compatibles con BAL. La
el efecto teraputico del producto alimenticio. El pureza de los cultivos se verific con la coloracin
grupo 1 recibi el fermento lctico como parte de Gram encontrando bacilos Gram positivos y
suplementaria de su dieta: nicamente leche catalasa negativos (20).
materna; como primer control, el grupo 2 recibi
el sustrato amilceo elegido, sin fermentar; como Capacidad amiloltica. 8 de los 75 aislados
segundo control, el grupo 3 no recibi ningn fueron positivos en la prueba de hidrlisis del
suplemento, solo fueron lactados por sus madres; almidn. La BAL con mejor capacidad amiloltica fue
y el grupo 4 recibi el fermento lctico luego de seleccionada luego de analizar el dimetro de los
ser retado con el patgeno, para observar el efecto halos (en mm) de degradacin de almidn mediante
teraputico del probitico. Todos los animales anlisis de varianza y prueba de Tukey, p<0.5. As,
fueron lactados por sus madres durante los 21 das de los 8 fue seleccionado el aislado del individuo (I)
del ensayo. Para el ensayo de proteccin se utiliz de dos meses de edad (2), de la primera y quinta
L. acidophilus1, cultivado en el sustrato amilceo muestra (a) y (e), purificado a partir de la dilucin
elegido hasta el tiempo de cosecha. El patgeno 10-5 (5), identificados como I2a5 e I2e5 (Figura 1).
para el reto fue V. cholerae 01 OGAWA, luego de
incubacin en caldo TCBS a 37C por 12 h (24). Identificacin del aislado. Los resultados de las
pruebas microbiolgicas, fisiolgicas y bioqumicas
Respecto a la alimentacin con el probitico, el realizadas, permitieron identificar el aislado como
grupo 1 de conejos se aliment con ste desde el Lactobacillus acidophilus1 (Tabla 1).
da del nacimiento hasta el da 21, con un volumen
de 50 l que contena 1x105 bacterias durante 3 Eleccin del sustrato. Se seleccion el
veces al da. El grupo 2 se aliment con el sustrato medio de melaza-leche para el cultivo de L.
amilceo elegido en iguales dosis; el grupo 3 no acidophilus1, teniendo en cuenta las condiciones
recibi ningn suplemento alimenticio y el grupo 4 de crecimiento recomendadas por Heczko et al
se aliment con el producto probitico a partir del (8). Las condiciones de fermentacin fueron
mismo da que aparecieron los sntomas de diarrea, estandarizadas previamente (20).
en iguales dosis que los anteriores. El reto de los
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Figura 1. Promedios (en mm) de los halos de hidrlisis


del almidn para BAL y resultados de la prueba
de Tukey. Las barras con los promedios (mm)
y la misma letra (A, AB y B) no presentaron Figura 2. Cromatograma de produccin de cido lctico
diferencias significativas entre ellas. Individuos por HPLC. A las 24 horas de fermentacin
de dos meses de edad I2a5, I2b5, I2c5, I2e5, en el medio melaza-leche L. acidophilus1
I2e3 e I2e4, a partir de las cuales fueron aisladas produjo 67.3 g/l de cido lctico. Fuente esta
las BAL. I4c5 e I4d3 BAL aisladas a partir de investigacin.
nios de un ao de edad.

Tabla 1. Caractersticas microbiolgicas, fisiolgicas Proteccin intestinal contra V. cholerae 01


y bioqumicas de L. acidophilus1. OGAWA por cultivos probiticos en modelo
animal. El ensayo de proteccin intestinal contra
Caractersticas Bacilos Gram positivos, cortos, en empalizada, no
V. cholerae 01 OGAWA a travs de la administracin
microscpicas esporulados. oral de un fermento lctico que contuvo L.
acidophilus1 revisti la mayor relevancia del
Temperatura ptima de crecimiento 30-36C, presente estudio y condujo a probar la hiptesis de
tolerante de 18-40C.
Propiedades proteccin intestinal in vivo (Figura 3).
Fisiolgicas
Crecimiento a 45C negativo. Tolerante al rango de
pH 3.86.5.

Homofermentativa. Altamente productora de cido


lctico.

Produccin de cido actico, succnico, frmico,


propinico y ctrico.
Metabolismo
Prueba de NaCl 10% negativa; glucosa, sacarosa,
trehalosa, lactosa, manosa, esculina, maltosa y
salicina positiva; gelatina, casena, rafinosa, ramnosa,
xilosa y arabinosa negativas.

Evaluacin de parmetros de fermentacin de


L. acidophilus1 en el medio melaza-leche. En
este sustrato amilceo se obtuvo alta produccin
de cido lctico (67.3 g/l) y un alto rendimiento de
cido lctico en relacin con el consumo de azcares
(Figura 2). Al estimar la masa celular y la produccin
de protena se determin el tiempo de cosecha a
las 14 h, con 75x108 UFC de L. acidophilus1/ml y Figura 3. Ganancia de peso promedio en conejos retados
con V. cholerae segn tipo de alimento. En los
una concentracin proteica de 14.5 g/l.
tres grupos de conejos retados con el patgeno
se observan diferencias en el peso promedio.
Ensayo de inhibicin antagnica in vitro. Los El grupo con mayor ganancia en peso es el
resultados del anlisis de varianza y la prueba tratado con probiticos (cuadros rojos) 130.7
de Tukey (p<0.1) para los halos de inhibicin, g, luego el grupo tratado con sustrato amilceo
permitieron determinar que el fermento lctico sin BAL (cuadros verdes) 100.2 g y por ltimo el
inhibe el crecimiento in vitro del patgeno V. grupo control, alimentado solamente con leche
cholerae a una densidad celular de 35x106 bact/ materna (cuadros azules) con 50.3 g, al final
del ensayo, p=0.00.
ml presente en la dilucin 10-1, respecto al sustrato
puro (sin diluir) y a las diluciones 10-2 y 10-3.
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Estos resultados significaran que la administracin Anlisis de sobrevida. La proteccin


oral de probiticos est relacionada con una intestinal del probitico contra V. cholerae
mejor nutricin de los animales, evidenciado fue demostrada en el anlisis de sobrevida
por la ganancia en peso del grupo tratado con ( F i g u ra 5 ) . S e p u e d e o b s e r va r q u e l o s
el fermento lctico. conejos enfrentados con el patgeno y sin
recibir probitico (lactados) tuvieron una
Por otra parte, hubo una prdida de peso probabilidad de sobrevida menor respecto al
promedio, a los 7 das de nacidos, en dos grupo de animales retados con el patgeno y
grupos de conejos inoculados con V. cholerae 01 simultneamente alimentados con probiticos,
OGAWA, los conejos infectados con sntomas de cuya probabilidad de sobrevida fue mayor.
diarrea perdieron peso hasta un da posterior al
tratamiento con probiticos (Figura 3). As mismo,
hubo una ganancia gradual de peso promedio en
el grupo tratado con probiticos, respecto al grupo
de conejos lactados (Figura 3, 4).

Figura 5. Estimacin de sobrevida por Kaplan-Meier


en conejos retados con V. cholerae segn
Figura 4. Desviaciones estndar (DS) y diferencias tratamiento. Se observa a la derecha de la
promedio de pesos de conejos pre y post reto figura una linea escalonada que describe
con V. cholerae segn tratamientos. La DS la mortalidad de los animales retados y no
del promedio de peso de conejos alimentados alimentados con probiticos, estos tienen un
con probiticos (rojo o verde) y las DS de los probabilidad de sobrevida de 0.25 a los 21
lactados (azul o fucsia). g.=gramos. Pre reto: dias, en comparacin a 0.95 de probabilidad
Da 7 del ensayo. Pos reto: Da 21 del ensayo. de los conejos retados y alimentados con
N=nmero de individuos vivos. probiticos.

Del anlisis pre y post reto segn tratamientos, Evaluacin del poder de colonizacin de L.
se puede decir que hubo una menor ganancia acidophilus1 y V. cholerae 01 OGAWA en
promedio de peso antes del reto p<0.05 en heces. En la figura 6 se observa al da ocho o un
los grupos de animales que no recibieron da post-reto la aparicin de un pico de infeccin
probiticos (DS azul o fucsia). Las diferencias de por V. cholerae 01 OGAWA (cuadro verde, Figura
pesos promedio a los 21 das del ensayo fueron 6), coincidiendo con los sntomas de diarrea y
estadsticamente significativas, p<0.05. Despus prdida de peso observados entre el octavo y
del reto el beneficio del probitico se observ en dcimo da del ensayo (cuadros verdes y azules,
los animales protegidos y retados (DS en rojo), Figura 3).
pues tuvieron ganancia de peso similar al grupo
control (DS en fucsia), de sta manera se logr La colonizacin por V. cholerae 01 OGAWA solo se
evidenciar que la ausencia del reto y la proteccin manifest en los recuentos de colonias promedios
con probiticos favorecen el crecimiento y de las muestras de heces de los conejos retados dos
desarrollo de los animales significativamente. das post-reto (cuadro verde), sugiriendo que existe
una proteccin contra la colonizacin de V. cholerae
El efecto teraputico del probitico se manifest 01 OGAWA en los siguientes das del ensayo en el
en la recuperacin y la ganancia de peso grupo tratado con probitico, lo que no sucedi
observada luego del proceso infeccioso, en con el grupo control (lactados), en los cuales los
comparacin al grupo lactado (control). Los recuentos de UFC V. cholerae 01 OGAWA/g de
promedios de pesos al final del ensayo fueron heces en los siguientes das post inculo tuvieron
70.8 g y 50.3 g para los grupos tratados y no su expresin mxima en el da 9 con 1.2x107 UFC/g
tratados con probiticos respectivamente. de heces y cayeron gradualmente hasta el da 11.
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(5) se debe posiblemente a que con la edad


el cambio en la dieta, en el metabolismo y la
exposicin a infecciones concomitante con el
uso de antibiticos, induce un aumento en la
variabilidad del microbioma intestinal nativo
(7,12,26).

L. acidophilus1 se puede considerar un


microorganismo probitico dado que en el
presente estudio se evidenci que su consumo
puede proporcionar beneficios en la salud de los
animales, adems es resistente a la acidez del
Figura 6. Recuento de L. acidophilus y V. cholerae TGI y cuando se ingiere es capaz de sobrevivir
01 OGAWA en coprocultivos de conejos
a su paso por el TGI dado que fue recuperado
alimentados con probiticos. Los cuadros
rojos son UFC/g de heces de L. acidophilus1
a partir de heces frescas de conejos lactantes
del grupo alimentado con probitico a los 7 tratados con el alimento probitico. As, todas
das de retado con V. cholerae. Los cuadros estas caractersticas se ajustan a las descritas
azules son UFC/g de heces de L. acidophilus1 por Kamlesh et al (14) y Khani et al (19) para
del grupo alimentado con probitico pero no un microorganismo ser considerado como
retado con V. cholerae; el cuadro verde son probitico.
UFC/g de heces de V. cholerae del grupo
control a los 7 das de retado con V. cholerae
Los ensayos de fermentacin permitieron conocer
y los cuadros amarillos son UFC/g de heces de
V. cholerae del segundo grupo control lactado
la respuesta metablica de L. acidophilus1 a
pero no retado con V. cholerae. diferentes fuentes de carbono y nitrgeno (20).
Los azcares consumidos del medio de cultivo
favorecen la produccin de cido lctico en altas
concentraciones, este comportamiento permiti
determinar el carcter homofermentativo
de la bacteria L. acidophilus1 y su potencial
DISCUSIN industrial para la produccin de este metabolito.
Se encontr que L. acidophilus1 inhibe el
L o s p r o b i t i c o s s e u t i l i z a n p a ra t ra t a r crecimiento in vitro del patgeno V. cholerae a
enfermedades gastrointestinales, incluyendo una densidad celular de 35x106 bact/ml presente
enfermedades inflamatorias del intestino, en la dilucin 10-1 respecto al sustrato puro y a
sndrome del intestino irritable y EDAs (25). las diluciones 10-2 y 10-3, resultados concordantes
Los mecanismos por los cuales los probiticos con un estudio previo (16).
protegen contra las enfermedades intestinales
incluyen la optimizacin del equilibrio microbiano, La sobrevida de los conejos infectados con V.
exclusin competitiva de patgenos, promocin cholerae del grupo tratado con probitico fue
de la secrecin de moco, produccin de mayor respecto a los grupos control, pues as
bacteriocinas, mejora de la integridad de la lo confirma el anlisis de sobrevida p<0.05.
barrera y maduracin de la inmunidad intestinal Se puede concluir entonces que el probitico
(6,25). tiene un efecto protector en conejos contra el
patgeno V. cholerae 01 OGAWA. El beneficio
En humanos, la administracin del probitico del probitico se observa en forma contundente
L. acidophilus, reduce significativamente la en los animales protegidos y retados, pues
incidencia de la enterocolitis en recin nacidos tuvieron ganancia de peso similar al grupo control
(26). Un mecanismo importante incluye la funcin (lactado), lo que sugiere que la ausencia del
de barrera, garantizada por el mantenimiento y reto y la proteccin con probiticos favorecen
estabilidad de las uniones celulares. Esta BAL el crecimiento y desarrollo de los animales,
tiene efecto anti-inflamatorio y citoprotector, ms resultados que concuerdan con los hallazgos de
especficamente en EDA donde se puede constituir Ritchie et al (27). El efecto protector o profilctico
en una nueva herramienta de prevencin en la del probitico es mucho ms evidente que el
poblacin vulnerable, como recin nacidos y efecto teraputico pues luego de la estimacin
prematuros (19,26). de sobrevida por Kaplan-Meier, slo el 10% de
los conejos murieron, en comparacin del 60%
Las BAL aisladas con capacidad amiloltica se observado cuando se hizo uso del probitico
obtuvieron en mayor proporcin de nios recin pos-reto. La medida teraputica tomada en
nacidos porque en nios de ms de un ao no el estado lgido de la infeccin diarreica, se
fue posible seleccionar BAL con las caractersticas comport de manera positiva, manifestndose
requeridas. Este hallazgo segn Gibson et al
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en la inhibicin de la colonizacin de V. cholerae, fagos, islas de patogenicidad y otros elementos


similar al hallazgo de Lee et al (28) evidenciado genticos del mobiloma (10,33) como resultado
en la desaparicin de la diarrea, resolucin de de los eventos de evolucin genmica y procesos
la infeccin, ganancia promedio de peso de los de transferencia lateral, que han conllevado a
animales, ms no en la restauracin del equilibrio la emergente aparicin de variantes de ste
de la microbiota lctica endgena, en contraste patgeno con capacidad de adaptacin y poder
con la microbiota encontrada por Combes et al patognico incrementados, razn por la cual las
(34) y Chamorro et al (29) en conejos recin investigaciones destinadas al diseo y uso de
nacidos luego de la administracin de formulas microorganismos probiticos u otras herramientas
dietarias. profilcticas o teraputicas debern tener en
cuenta estos mecanismos. Los microorganismos
Nuestros hallazgos sugieren en un futuro el uso probiticos son una herramienta promisoria para
de L. acidophilus1 para restablecer o mantener el equilibrio de la MIH, permite el subyacente
el equilibrio de TGI luego del contacto con V. control de V. cholerae, pues su capacidad de
cholera y controlar la infeccin, en contraste producir enzimas y activacin de complejas vas
a los recientes reportes sobre el uso de BAL metablicas puede ayudar a generar ambientes
como L. lactis para la elaboracin de vacunas de hostiles para el patgeno.
administracin oral, que potencia la respuesta
inmune de la mucosa e inmunidad sistmica En conclusin este trabajo encontr que existe
especfica tipo IgA contra el patgeno V. cholerae una proteccin de la colonizacin de V. cholerae
01(6,30,31) y la comprensin de cmo el sistema 01 OGAWA en el grupo de conejos lactantes
inmune adaptativo hace frente al notable nmero tratados con L. acidophilus. Se pudo comprobar la
y diversidad de microbios que colonizan el hiptesis de estudio pues la sobrevida del grupo
TGI, este probitico es muy prometedor para de conejos tratado con probiticos fue mayor a
establecer nuevos enfoques de modulacin la del grupo lactado por sus madres y alimentado
de redes inmunes para tratar y prevenir la con el sustrato puro; entonces L. acidophilus
enfermedad (6). tiene un efecto protector en conejos contra la
cepa patgena de V. cholerae 01 OGAWA.
Los resultados obtenidos en ratones permiten
recomendar la administracin oral de probiticos Una perspectiva de inters es comprender cmo
en humanos en riesgo de infeccin o incluso la MIH afecta a la salud y la enfermedad y la
en situaciones de epidemias, debido al efecto biologa de sus relaciones con L. acidophilus,
altamente protector observado (30,32). de tal manera que propicie un cambio en la
concepcin de patgenos individuales como
En el futuro, si se tiene en cuenta que la interaccin nicos agentes causales, hacia un enfoque
de las toxinas bacterianas con receptores de la ecolgico teniendo en cuenta la comunidad y
superficie de las clulas hospederas (31) -tales las condiciones del micro-nicho en su conjunto
como el receptor de Lipopolisacrido LPS- es un (6,7,10).
paso indispensable en la patognesis del clera,
el bloqueo de tales interacciones es una potencial
y atractiva estrategia teraputica que conlleva Agradecimientos
al diseo y caracterizacin de la expresin de
probiticos recombinantes, simulando la unin A la Vicerrectora de Investigaciones-VIPRI,
entre el receptor GM1 (galactomansido 1) y de la Universidad de Nario por la financiar
Ctx (toxina clera) e infectando ratones para el trabajo. Al Departamento de Biologa. Al
comprobar los cambios con V. cholerae virulento. Grupo de Investigacin Salud Pblica de la
Sin embargo, es de tener en cuenta en el diseo Universidad de Nario. A las Bilogas con nfasis
y aplicacin de vacunas o mtodos profilcticos, en Microbiologa. Nubia Yandar y Sofa Guzmn
que para V. cholerae se han documentado de la Universidad de Nario. Al Profesor Luis E
elementos genticos mviles, integrones, Bravo de la Universidad del Valle.
Pazos - Inhibicin de colonizacin intestinal por vibrio cholearae 3697

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