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ORIGINAL
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Universidad de Nario, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Departamento de Biologa, Pasto,
Colombia. *Correspondencia: alpazmo@udenar.edu.co.
RESUMEN
Objetivo. Evaluar la capacidad in vitro e in vivo de Lactobacillus acidophilus1, aislado en este estudio,
para prevenir enfermedad diarreica causada por Vibrio cholerae 01 OGAWA, en conejos lactantes.
Materiales y mtodos. Se aisl Lactobacillus acidophilus1 a partir de heces de nios sanos, se
seleccion por su capacidad amiloltica a partir de un grupo de bacterias cido lcticas (BAL). El mejor
sustrato amilceo para el crecimiento de la BAL fue estandarizado previamente. Con L. acidophilus1
se realiz un ensayo in vitro e in vivo de inhibicin antagnica sobre el enteropatgeno y se evalu la
prevencin de la colonizacin por V. cholerae 01 OGAWA en conejos lactantes. Resultados. De acuerdo
con el anlisis de varianza L. acidophilus1 present la mejor capacidad amiloltica respecto a las otras
BAL aisladas, p<0.5. Se encontr que un inculo con una densidad celular de 35x106 bacterias/ml en el
fermento lctico es capaz de ejercer el mayor efecto antagnico in vitro sobre V. cholerae. Se demostr
el efecto probitico in vivo, ya que los conejos enfrentados con el patgeno y sin recibir probitico
tuvieron una probabilidad de sobrevida menor de 0.25 respecto al grupo de animales retados con el
patgeno y simultneamente alimentados con el probitico cuya probabilidad de sobrevida fue de
0.95. Conclusiones. L. acidophilus1 se considera un microorganismo probitico, capaz de sobrevivir
a su paso por el tracto gastrointestinal en un modelo animal y prevenir la colonizacin intestinal por
V. cholerae 01 OGAWA en conejos lactantes.
Palabras clave: Conejos, Lactobacillus acidophilus, probiticos, Vibrio cholerae, (Fuente: DeCS).
ABSCRACT
Objective. To assess the capacity in vitro and in vivo of Lactobacillus acidophilus1 isolated in this
study, capable of preventing diarrheal disease caused by Vibrio cholerae 01 OGAWA in rabbits newborn.
Materials and methods. Lactobacillus acidophilus1 was isolated from faeces of healthy children and
was selected from a group of lactic acid bacteria (LAB). The better starchy substrate for the growth of
the LAB was previously standardized. Using the L. acidophilus1, there was carried out an in vitro and
in vivo assay of antagonistic inhibition on the enteropathogen and it was evaluated the prevention
of colonization by V. cholerae 01 Ogawa in rabbits newborn. Results. L. acidophilus1 present the
better amylolytic capacity, p<0.5 in the ANDEVA. It was found that an inoculum with a cell density of
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35x106 bacteria/ml in the lactic ferment is able to exert the greatest antagonistic effect in vitro over
V. cholerae. The probiotic effect was demonstrated in vivo, since rabbits exposed to the pathogen
without having received probiotic had a lower survival probability of 0.25 regarding the group of
animals exposed with the pathogen and simultaneously fed with the probiotic whose probability of
survival was of 0.95. Conclusions. L. acidophilus1 is considered a probiotic microorganism capable of
surviving when passing through the gastrointestinal tract in an animal model and preventing intestinal
colonization by V. cholerae 01 Ogawa in rabbits newborn.
Key words: Lactobacillus acidophilus, probiotics, rabbits, Vibrio cholerae (Source: MeSH).
INTRODUCCIN
A nivel mundial las enfermedades infecciosas respectivamente (2), lo anterior sumado a que
continan siendo el principal problema por el flujo de inmigrantes y visitantes entre estos
resolver en el siglo XXI. Segn la OMS, las pases y Colombia es considerable, creemos
enfermedades diarreicas son la segunda mayor pertinente tener en cuenta el Plan Nacional para
causa de muerte en nios menores de cinco aos. el Control del Clera (PNCC) que se desarrolla
En 2012, fueron reportados por la OMS 245.393 en Colombia desde el ao 2011, en particular
casos de clera con ms del 49% de los casos con relacin al desarrollo de estrategias de
ocurridos en Amrica, principalmente en Hait y prevencin que permitan evitar la aparicin
Republica Dominicana (1). En Colombia, en el de brotes o epidemias. La creacin del PNCC
periodo Enero-Agosto de 2013 se documentaron se sustenta en epidemias que sobrevinieron
76 muertes por enfermedad diarreica aguda con el terremoto de Hait en 2009, con lo cual
(EDA) en lo corrido del ao y 1.878.989 casos, el nmero de casos en este pas y Repblica
de los cuales 25.1% en nios menores de 5 aos. Dominicana y por tanto, el riesgo de brotes en
En comparacin con el ao 2012, hasta Agosto Centroamrica y Suramrica se incrementaron
de 2013 en Colombia se registr un aumento de considerablemente en los ltimos aos. Por otro
14.4% de mortalidad por EDA (2). lado, aun cuando se establecen las medidas
sanitarias y de prevencin, la alta incidencia de
Las bacterias de los gneros Shigella, EDA se convierte en un serio problema de salud
Campylobacter y las especies V. cholerae, E. pblica a nivel mundial, por lo cual los esfuerzos
coli patognica y rotavirus, son los principales para conseguir estrategias de manejo y control
agentes causantes de muertes por EDA en de estas infecciones son de constante inters
pases emergentes. En Estados Unidos de 21 a cientfico.
37 millones de casos de EDA se producen por
ao en una poblacin de 16.5 millones de nios La microbiota gastrointestinal humana (MIH)
y en tales casos Salmonella, Campylobacter y E. juega un papel importante en la salud del
coli 0157 enterohemorrgica y enteroagregativa individuo dado que la composicin y la actividad
son las bacterias mas frecuentes de infecciones de los microorganismos son responsables de
transmitidas por alimentos (3). La alta incidencia funciones metablicas colectivas, de barrera e
de las infecciones asociadas a estos agentes se interacciones con el husped (5,6). Trillones de
debe principalmente a su fcil diseminacin, microorganismos habitan el intestino humano,
los perfiles de resistencia a los frmacos formando una comunidad ecolgica compleja
antimicrobianos y los complejos mecanismos que influencia en su normal funcionamiento y en
moleculares de patogenicidad (4). la susceptibilidad a enfermedades (7). Las BAL
autctonas del tracto gastrointestinal humano
El clera es la EDA ms grave que se conoce y (TGH) contribuyen a beneficios nutricionales
se caracteriza por su rpida diseminacin que en la salud, tales como el mejoramiento de la
conlleva a epidemias en periodos cortos de digestin de lactosa y el alivio de ciertos tipos de
tiempo. Es producida por la bacteria V. cholerae diarreas (5,8,9). La MIH es objeto de numerosas
que se encuentra en el agua o alimentos investigaciones, con especial inters en la
contaminados y puede causar la muerte de 50% secuenciacin del genoma de las bacterias que
de los infectados. la conforman (10), es as que en la actualidad se
llevan a cabo el Human Microbiome Project (HMP)
En pases como Hait y Repblica Dominicana en USA y el Metagenomics of the Human Intestine
se reporta una letalidad alta por clera; con (metaHIT) en Europa y sus investigaciones han
un nmero de casos de muertes de 8258 y reportado que el organismo humano consiste
453 casos acumulados hasta agosto de 2013 en 1013 clulas eucariotas y 1014 microbianas,
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V. cholerae. Lo anterior se incub a 35C por animales se realiz con una dosis previamente
48 h, tiempo en el cual se midieron los halos estandarizada del patgeno (0.5x108 bact/ml) siete
de inhibicin del probitico sobre el patgeno das despus de su nacimiento. Esta cantidad fue
(20). Se aplic un diseo irrestrictamente al distribuida a su vez en 4 dosis de 250 l cada 6 h
azar con arreglo bifactorial combinatorio y 10 con cnula esofgica de 1.0 mm de dimetro til.
replicas, donde el factor A correspondi a dos
niveles de sustrato: a1=melaza con leche en El poder de colonizacin del lactobacilo y la
polvo y a2=MRS; y el factor B correspondi a inhibicin de la colonizacin del patgeno se
cuatro niveles de dilucin del sustrato, a saber: evalo indirectamente, practicando recuentos de
b1=sustrato puro, b2=10-1, b3=10-2 y b4=10-3. colonias de bacterias lcticas y V. cholerae de
La unidad experimental estuvo representada heces de conejos lactantes, tanto de retados como
por una caja petri y un total de 80 unidades no retados. Las muestras se tomaron diariamente
experimentales. Con el objeto de uniformizar las durante los 13 das del ensayo pos infeccin.
observaciones, previo anlisis del Test de Bartley
y Harley, estas se transformaron mediante raz Los datos se analizaron con el programa STATA
cuadrada de X, donde X fue la observacin. Los 10.0. El plan de anlisis requiri de una base de
datos se sometieron a ANDEVA y prueba de Tukey datos con las medidas de peso diario de los conejos,
para comparar las medias de los tratamientos sobrevida y cuantificacin del nmero de UFC de
en aquellas fuentes de variacin que resultaron L. acidophilus1 y V. cholerae 01 OGAWA, e incluy
estadsticamente significativas, p<0.1. el test de anlisis de variantes de una va, prueba
de rangos mltiples DUNCAN y un anlisis de
Ensayo de proteccin del probitico contra estimacin de sobrevida por Kaplan-Meier. Se utiliz
V. cholerae 01 Ogawa en conejos lactantes. el test de ANOVA, para evaluar la significancia de
El ensayo in vivo se realiz tomando como modelo los resultados de proteccin en el modelo animal.
animal, conejos lactantes. Luego de administrar Esta investigacin fue avalada por el Comit de
una dosis de 0.5x108 bact/ml ms del 95% de tica en Investigacin de la Universidad de Nario.
los conejos desarrollaron enfermedad diarrica
y la sobrevida promedio despus de ser retados
con el enteropatgeno fue de 13 das, tiempo RESULTADOS
de seguimiento para el ensayo de proteccin. Se
analizaron cuatro grupos con 60 conejos lactantes
cada uno. Tres grupos recibieron tratamiento para Aislamiento de BAL. Se obtuvieron 75 aislados en
evaluar el efecto protector y en el cuarto se evalu agar MRS-azul de anilina compatibles con BAL. La
el efecto teraputico del producto alimenticio. El pureza de los cultivos se verific con la coloracin
grupo 1 recibi el fermento lctico como parte de Gram encontrando bacilos Gram positivos y
suplementaria de su dieta: nicamente leche catalasa negativos (20).
materna; como primer control, el grupo 2 recibi
el sustrato amilceo elegido, sin fermentar; como Capacidad amiloltica. 8 de los 75 aislados
segundo control, el grupo 3 no recibi ningn fueron positivos en la prueba de hidrlisis del
suplemento, solo fueron lactados por sus madres; almidn. La BAL con mejor capacidad amiloltica fue
y el grupo 4 recibi el fermento lctico luego de seleccionada luego de analizar el dimetro de los
ser retado con el patgeno, para observar el efecto halos (en mm) de degradacin de almidn mediante
teraputico del probitico. Todos los animales anlisis de varianza y prueba de Tukey, p<0.5. As,
fueron lactados por sus madres durante los 21 das de los 8 fue seleccionado el aislado del individuo (I)
del ensayo. Para el ensayo de proteccin se utiliz de dos meses de edad (2), de la primera y quinta
L. acidophilus1, cultivado en el sustrato amilceo muestra (a) y (e), purificado a partir de la dilucin
elegido hasta el tiempo de cosecha. El patgeno 10-5 (5), identificados como I2a5 e I2e5 (Figura 1).
para el reto fue V. cholerae 01 OGAWA, luego de
incubacin en caldo TCBS a 37C por 12 h (24). Identificacin del aislado. Los resultados de las
pruebas microbiolgicas, fisiolgicas y bioqumicas
Respecto a la alimentacin con el probitico, el realizadas, permitieron identificar el aislado como
grupo 1 de conejos se aliment con ste desde el Lactobacillus acidophilus1 (Tabla 1).
da del nacimiento hasta el da 21, con un volumen
de 50 l que contena 1x105 bacterias durante 3 Eleccin del sustrato. Se seleccion el
veces al da. El grupo 2 se aliment con el sustrato medio de melaza-leche para el cultivo de L.
amilceo elegido en iguales dosis; el grupo 3 no acidophilus1, teniendo en cuenta las condiciones
recibi ningn suplemento alimenticio y el grupo 4 de crecimiento recomendadas por Heczko et al
se aliment con el producto probitico a partir del (8). Las condiciones de fermentacin fueron
mismo da que aparecieron los sntomas de diarrea, estandarizadas previamente (20).
en iguales dosis que los anteriores. El reto de los
Pazos - Inhibicin de colonizacin intestinal por vibrio cholearae 3693
Del anlisis pre y post reto segn tratamientos, Evaluacin del poder de colonizacin de L.
se puede decir que hubo una menor ganancia acidophilus1 y V. cholerae 01 OGAWA en
promedio de peso antes del reto p<0.05 en heces. En la figura 6 se observa al da ocho o un
los grupos de animales que no recibieron da post-reto la aparicin de un pico de infeccin
probiticos (DS azul o fucsia). Las diferencias de por V. cholerae 01 OGAWA (cuadro verde, Figura
pesos promedio a los 21 das del ensayo fueron 6), coincidiendo con los sntomas de diarrea y
estadsticamente significativas, p<0.05. Despus prdida de peso observados entre el octavo y
del reto el beneficio del probitico se observ en dcimo da del ensayo (cuadros verdes y azules,
los animales protegidos y retados (DS en rojo), Figura 3).
pues tuvieron ganancia de peso similar al grupo
control (DS en fucsia), de sta manera se logr La colonizacin por V. cholerae 01 OGAWA solo se
evidenciar que la ausencia del reto y la proteccin manifest en los recuentos de colonias promedios
con probiticos favorecen el crecimiento y de las muestras de heces de los conejos retados dos
desarrollo de los animales significativamente. das post-reto (cuadro verde), sugiriendo que existe
una proteccin contra la colonizacin de V. cholerae
El efecto teraputico del probitico se manifest 01 OGAWA en los siguientes das del ensayo en el
en la recuperacin y la ganancia de peso grupo tratado con probitico, lo que no sucedi
observada luego del proceso infeccioso, en con el grupo control (lactados), en los cuales los
comparacin al grupo lactado (control). Los recuentos de UFC V. cholerae 01 OGAWA/g de
promedios de pesos al final del ensayo fueron heces en los siguientes das post inculo tuvieron
70.8 g y 50.3 g para los grupos tratados y no su expresin mxima en el da 9 con 1.2x107 UFC/g
tratados con probiticos respectivamente. de heces y cayeron gradualmente hasta el da 11.
Pazos - Inhibicin de colonizacin intestinal por vibrio cholearae 3695
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