Diversidad Genética y Estructura en Avellanos

b
Universidad Austral de Chile

Facultad de Ciencias Agrarias
DETERMINACIN DE LA DIVERSIDAD Y ESTRUCTURA

GENTICA EN POBLACIONES DE AVELLANO Gevuina avellana
Mol. MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES
TIPO MICROSATELITES DE SECUENCIAS EXPRESADAS (EST-
SSR)
TESIS DE MAGISTER
LEILA MILENA DAZ CAMACHO
Valdivia, Chile
2010
DETERMINACIN DE DIVERSIDAD Y ESTRUCTURA GENTICA
EN POBLACIONES DE AVELLANO Gevuina avellana Mol.
MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES TIPO
MICROSATELITES DE SECUENCIAS EXPRESADAS (EST-SSR)
Tesis presentada a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de

Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Grado de Magster
en Ciencias Vegetales Mencin Fisiologa Vegetal
Por
Valdivia, Chile
2010

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias Agrarias
INFORME DE APROBACIN TESIS DE MAGISTER
La Comisin Evaluadora de Tesis comunica al Director de la Escuela de

Graduados de la Facultad de Ciencias Agrarias que la Tesis de Magster
presentada por la candidata
ha sido aprobada en el examen de defensa de Tesis rendido el da 27 de Abril de

2010, como requisito para optar al grado de Magster en Ciencias Vegetales
Mencin Fisiologa Vegetal, para todos los efectos firman:
Profesor Patrocinante
Profesor: Dr. Ricardo Riegel Schlegel
__________________________
Comisin Evaluadora
Profesora: Dra. Leyla Crdenas
__________________________
Profesor: Dr. Jos Nez
___________________________

DEDICATORIA
Dedico la presente tesis a los seres que ms

amo en este mundo: A mi hermosa familia
y a mi esposo Elkin Surez, por ser la
fuente de mi inspiracin y motivacin para
superarme cada da ms y as poder luchar
para que la vida nos depare un futuro
mejor.
AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mis ms sinceros agradecimientos a las siguientes personas,

porque sin ellas no hubiera sido posible el desarrollo de este trabajo:
Al profesor Ricardo Riegel S. quien crey en m y me dio la oportunidad de hacer

parte de su grupo de trabajo y contribuyo en mi formacin desde que llegu a
Valdivia. A los profesores Leyla Crdenas y Jos Nez por aceptar ser parte de
mi comisin evaluadora y por sus consejos y directrices en el desarrollo de este
trabajo. A Manuel Ortiz por su colaboracin en la lectura de los marcadores.
A Karin Hoffens quin me brind un entrenamiento en el laboratorio lo que hizo

posible el desarrollo de este trabajo. A Judith Carrasco por su apoyo logstico en
el laboratorio y sus consejos. A mis amigos y compaeros por su compaa y
apoyo en cada momento de mi vida en Valdivia. A m amada familia quien
siempre ha estado para apoyarme en cada uno de mis sueos. A mi amado
esposo por su amor, comprensin y compaa para seguir adelante y cumplir con
este sueo. A Dios por brindarme la oportunidad de vivir esta experiencia y as
poder crecer como persona y como profesional.
A la Agencia de Cooperacin Internacional AGCI por el financiamiento de mis

estudios y manutencin durante mi estada en Chile.
Esta tesis fue financiada por el proyecto FONDECYT 1060192.
INDICE DE CONTENIDOS
RESUMEN ....................................................................................................................viii
ABSTRACT ...................................................................................................................... x
1. INTRODUCCIN .....................................................................................................1
1.1. ANTECEDENTES DE LA ESPECIE............................................................3
1.2. GENTICA DE POBLACIONES ..................................................................6
1.2.1. Diversidad gentica.........................................................................................6
1.2.2. Anlisis de la estructura poblacional..........................................................10
1.3. MARCADORES MOLECULARES ...............................................................12
1.3.1. Marcadores microsatlites (SSRs)...............................................................14
1.4. HIPTESIS .........................................................................................................22
1.5. OBJETIVOS........................................................................................................22
1.5.1. Objetivo General ..........................................................................................22
1.5.2. Objetivos Especficos ..................................................................................22
2. MATERIALES Y MTODOS...............................................................................24
2.1 MATERIAL VEGETAL....................................................................................24
2.2. MTODOS..........................................................................................................26
2.2.1. Extraccin del ADN ....................................................................................26
i
ii
2.2.2. Estrategia seguida para el aislamiento de los microsatlites de

secuencias expresadas (EST-SSRs) .......................................................................26
2.2.3. Diseo de partidores ....................................................................................27
2.2.4. Amplificacin del ADN...............................................................................28
2.2.5. Genotipificacin............................................................................................29
2.3. ANLISIS DE DATOS ....................................................................................31
2.3.1. Diversidad gentica de las poblaciones .....................................................31
2.3.2. Estructura gentica de las poblaciones.....................................................32
2.3.3. Estimacin Bayesiana de la estructura gentica entre las poblaciones .34
3. RESULTADOS..........................................................................................................36
3.1. CARACTERIZACIN Y SELECCIN DE LOS MARCADORES .....36
3.2. DIVERSIDAD GENTICA DE LAS POBLACIONES ..........................42
3.3. DIFERENCIACIN GENTICA DE LAS POBLACIONES...............44
3.3.1. Anlisis de correlacin entre distancia gentica y distancia geogrfica de

las poblaciones .........................................................................................................48
3.3.2. Anlisis de relaciones genticas de las poblaciones a travs de un rbol

Neighbor-joining (NJ) ............................................................................................50
3.3.3. Anlisis de relaciones genticas a travs de un anlisis de coordenadas

principales.................................................................................................................51
3.3.4. Distribucin de la diversidad gentica en las poblaciones......................54
3.4. ESTIMACIN BAYESIANA DE LA ESTRUCTURA GENTICA

POBLACIONAL .......................................................................................................56
4. DISCUSIN ..............................................................................................................59
ii
iii
4.1. DESARROLLO DE MARCADORES EST-SSR EN Gevuina avellana .....59
4.2. DIVERSIDAD GENTICA ...........................................................................61
4.3. ESTRUCTURA GENTICA POBLACIONAL .........................................68
5. CONCLUSIONES....................................................................................................72
6. BIBLIOGRAFIA .......................................................................................................74
ANEXOS ........................................................................................................................96
iii
iv
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Localizacin geogrfica de las poblaciones estudiadas.....24
Tabla 2. Frecuencia y tipo de motivos repetitivos encontrados en la regin
satelital...38
Tabla 3. Frecuencia de los diferentes motivos de repeticiones en la regin
satelital.......39
Tabla 4. Caracterizacin de los marcadores EST-SSR de Gevuina avellana
evaluados en 40 individuos de 10 poblaciones. ..40
Tabla 5. ndices de diversidad gentica para 11 poblaciones de avellano.......43
Tabla 6. Estadsticos F calculados para cada locus y para todos los loci (total)...46
Tabla 7. Clculo del equilibrio de HardyWeinberg en 11 poblaciones de
avellano 46
Tabla 8. Frecuencias esperadas de alelos nulos en 11 poblaciones de Gevuina
avellana...47
Tabla 9. Distancia gentica de Nei entre pares de poblaciones de Gevuina
avellana....48
iv
v
Tabla 10. Anlisis molecular de varianza (AMOVA) para 11 poblaciones de
Gevuina avellana.. .....54
Tabla 11. Anlisis molecular de varianza (AMOVA). Segn ubicacin geogrfica
en la cordillera de los Andes y la cordillera de la Costa .......55
Tabla 12. Anlisis espacial de varianza molecular (SAMOVA) de 11 poblaciones
de Gevuina avellana...56
v
vi
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Microsatlite. Ejemplo de un dinucletido (AC)n ........14
Figura 2. Localizacin geogrfica de las poblaciones estudiadas..25
Figura 3. Metodologa para el marcaje de partidores (Schuelke, 2000).....29

Figura 4. Ejemplo de algunos marcadores polimrficos seleccionados de
Gevuina avellana...38
Figura 5. Diversidad gentica de Nei segn ubicacin geogrfica en la cordillera
de los Andes y la cordillera de la Costa.......43
Figura 6. Representacin grfica de los Fst pareados para 11 poblaciones de

Gevuina avellana...47
Figura 7. Correlacin entre distancia gentica y distancia geogrfica de 11

poblaciones de Gevuina avellana en Chile......49
Figura 8. Correlacin entre distancia gentica y distancia geogrfica de acuerdo

a la ubicacin por cordilleras..49
Figura 9. rbol Neighbor-joining (NJ) construido usando distancias genticas

DA de 11 poblaciones de Gevuina avellana en Chile...........50
Figura 10. Anlisis de coordenadas principales para los individuos de Gevuina

avellana de 11 poblaciones a lo largo de Chile.52

avellana de las poblaciones de la cordillera de los Andes..53
vi
vii

avellana de las poblaciones de la cordillera de la Costa..........53
Figura 13. Representacin grfica de K (Tasa de cambio presente en los

valores de la probabilidad en funcin de K) frente al nmero de cluster posibles
(K).....................................................................................................................................57
Figura 14. Representacin grfica de la estructura gentica de las 11 poblaciones

de G. avellana estudiadas determinada con anlisis bayesiano..58
vii
viii

RESUMEN

El conocimiento de la diversidad gentica es necesario para los programas de

conservacin y mejoramiento de las especies. Es una herramienta de utilidad en
muchos aspectos, especialmente para conocer los procesos que determinan la
estructura poblacional de la especie considerada y as determinar los principales
lugares donde se encuentra la mayor diversidad para su inclusin en programas
de conservacin.
Con el fin de determinar la diversidad y estructura gentica del avellano chileno,

se desarrollaron 20 marcadores moleculares tipo microsatlites de secuencias
expresadas (EST-SSR), en base a una biblioteca de ADNc de la especie. Estos
marcadores se evaluaron en 11 individuos de 10 poblaciones para determinar el
polimorfismo de los mismos. Del total solo ocho (40%) resultaron polimrficos,
al ser caracterizados en 48 individuos de 10 poblaciones mostrando un nmero
de alelos de dos a ocho y un poder de discriminacin (Do) de 0,50 a 0,93. A
partir de esta informacin y teniendo en cuenta los rangos de amplificacin
compatibles con el desarrollo de la lectura en el genotipificador automtico en
un pseudo mltiplex se seleccionaron cinco marcadores para ser utilizados en
el estudio de la diversidad y estructura gentica de 319 individuos de 11
poblaciones.
viii
ix
Los resultados muestran una diversidad gentica para la especie de H=0,64

observndose una tendencia a la disminucin de la diversidad de norte a sur de
su rea de distribucin. Con estos marcadores (EST-SSR) se determin una baja
heterocigosidad en las poblaciones (Ho=0,32) dada por la seleccin a la cual
estn sometidos. La diferenciacin gentica entre las poblaciones fue moderada
(Fst=0,118; P<0,001). Concordante con ello el anlisis de AMOVA, mostr que
la mayor diversidad se encuentra dentro de las poblaciones (89,07%; P<0,001).
El anlisis de SAMOVA realiz una subdivisin de las poblaciones en dos
grupos, sin embargo el porcentaje de variacin entre los grupos no es
significativo (FCT=0,119; P=0,10). Los tres primeros ejes del anlisis de
coordenadas principales (PCA) explican el 27,52%, 19,83% y 18,79% de la
variacin gentica, respectivamente. Aunque el rbol de Neighbor-joining (NJ)
muestra la diferenciacin de las poblaciones de Armerillo y San Fabin con
respecto a las dems, los porcentajes de boostrap no superan el 64%. El test de
Mantel mostr una baja pero significativa correlacin (R2=0,1024; P0,01) entre
distancia gentica y distancia geogrfica para el total de las poblaciones.
Los resultados demuestran una moderada diferenciacin entre las poblaciones,

sin embargo, la zona norte del rea de distribucin de la especie presenta mayor
diversidad gentica y riqueza allica, por lo que es prioritaria en planes de
conservacin y mejoramiento gentico de G. avellana.
ix
x
ABSTRACT
Knowledge of genetic diversity is necessary for conservation and improvement

programs the species. It is a useful tool in many aspects, especially to understand
the processes that determine the population structure of the species involved and
determine the main places where the greatest diversity for incorporation in
conservation programs.
To determine the diversity and genetic structure of Chilean hazel were

developed 20 microsatellites markers expressed sequence tags (EST-SSR), based
on a cDNA library of the species. These markers were evaluated in 11 individuals
from 10 populations to determine the polymorphism of them. Of the total only
eight (40%) were polymorphic, which were characterized in 48 individuals from
10 populations showing a number of alleles from two to eight and a power of
discrimination (Do) of 0.50 to 0.93. From this information and taking into
account the amplification ranges compatible with the development of reading in
the automatic genotipificador a "pseudo multiplex" five markers were selected
for using in studying diversity and genetic structure of 319 individuals of 11
populations.
The results show a genetic diversity for the species H = 0.64 showing a
tendency to decrease in diversity from north to south of its range. With these
x
xi
markers (EST-SSR) was determined by low heterozygosity in populations (Ho =

0.32) given by the selection to which they are subjected. Genetic differentiation
among populations was moderate (Fst = 0.118, P <0.001). Concordant with this
AMOVA analysis showed that the greatest diversity is found within populations
(89.07%, P <0.001). SAMOVA analysis to split the populations into two groups,
yet the percentage of variation between groups is not significant (FCT = 0.119, P
= 0.10). The first three axes of principal coordinates analysis (PCA) account for
27.52%, 19.83% and 18.79% of genetic variation, respectively. Although the
Neighbor-joining tree (NJ) shows the differentiation of populations and San
Fabian Armerillo with respect to the other, however, the percentages of
Bootstrap not exceed 64%. The Mantel test showed a low but significant
correlation (R2 = 0.1024, P 0.01) between genetic distance and geographical
distance for all the stocks.
The results show a moderate differentiation between populations, however, the

northern range of the species shows higher genetic diversity and allelic richness,
making it a priority in conservation and breeding of G. avellana.
xi
1
1. INTRODUCCIN
La diversidad gentica es la materia prima para la evolucin adaptativa. La

disminucin de esta diversidad, ocasionada por factores inherentes a la especie o
por factores antrpicos, tiene como consecuencia la reduccin de la capacidad
adaptativa de las especies a los cambios ambientales tanto biticos como
abiticos (Jimnez y Collada, 2000, Noel y col., 2007). Al respecto, poblaciones
genticamente variables, sometidas a diferentes condiciones ambientales,
presentan respuestas ms plsticas que las poblaciones con uniformidad gentica.
Este fenmeno se traduce en que plantas provenientes de poblaciones con baja
diversidad gentica sean igualmente susceptibles ante determinadas condiciones,
aspecto que puede generar problemas de conservacin y en situaciones extremas,
puede llevar a una poblacin a la extincin (Jimnez y Collada, 2000; Faccioli y
col., 2001).
La informacin sobre la distribucin de la variacin gentica ha sido

reconocida como una herramienta til en el diseo de prcticas eficientes de
conservacin del patrimonio gentico. En especies amenazadas, esta informacin
es relevante, puesto que la permanencia a largo plazo de las especies, depende de
la preservacin de su diversidad gentica (Sosa y col., 2002; Varshney y col.,
2005). Uno de los ms recientes instrumentos utilizados para medir la variacin
gentica de poblaciones naturales son los marcadores moleculares de
microsatlites de secuencias expresadas (EST-SSRs). Estos marcadores son
particularmente atractivos pues corresponden a genes, responsables de caracteres

de inters productivo como crecimiento o resistencia a enfermedades (Li y col.,
2004; Kantety y col., 2002; Varshney y col., 2005). Este tipo de marcadores
pueden ser utilizados en anlisis de gentica de poblaciones porque ofrecen una
abundante fuente de variacin a nivel de ADN en plantas y animales (Lijavetzky
y col., 2007).
Los bosques templados nativos de Chile constituyen una reserva mundial de

biodiversidad, por poseer una biota extraordinariamente rica en endemismos,
particularmente familias y gneros monotpicos de plantas y animales (Armesto y
col., 1995). Muchas de las especies nativas de Chile, tales como el avellano
chileno (Gevuina avellana) presentan un enorme potencial productivo para el pas.
Estas plantas requieren el establecimiento de programas de mejoramiento
gentico que permitan la creacin de nuevos cultivares. Las especies sometidas a
estos procedimientos de mejora tienen mayor valor comercial y pueden ser
atractivas en diferentes mercados. El conocimiento de la variabilidad gentica de
una especie es fundamental para realizar programas eficientes de mejoramiento
gentico y de conservacin, puesto que facilita la seleccin de caracteres del pool
gnico poblacional.
El conocimiento de la diversidad y estructura gentica de las poblaciones de

avellano facilitara una futura inclusin de la especie en programas de
mejoramiento gentico y conservacin, para lo cual es importante determinar
como se encuentra organizada la diversidad gentica de la especie. Teniendo en
cuenta que el avellano chileno es una especie con un amplio rango de

distribucin continua y con un sistema de reproduccin cruzada, se espera que la
mayor diversidad se encuentre dentro de las poblaciones, con poca diferenciacin
entre las mismas. Para poner a prueba esta hiptesis, en el presente estudio se
determin la diversidad y estructura gentica de 319 individuos de 11 poblaciones
de Gevuina avellana a lo largo de Chile, mediante el uso de marcadores moleculares
tipo microsatlites de secuencias expresadas EST-SSRs.
1.1. ANTECEDENTES DE LA ESPECIE
El avellano (Gevuina avellana Mol.; Gevuin, avellano chileno, Chilean nut), es

una especie nativa de Chile perteneciente a un gnero mono-especfico de la
familia Proteaceae. Crece entre los 35 y los 44 Sur y desde el nivel del mar hasta
los 700m de altitud (Donoso, 1978), desde el norte del ro Teno por la cordillera
de los Andes y desde el sur del ro Mataquito por la cordillera de la Costa, hasta
las Islas Guaitecas. Es una especie de sotobosque que en algunas ocasiones
alcanza el dosel intermedio. Bajo condicin de clima mediterrneo se encuentra
en los faldeos cordilleranos o en quebradas. En la vertiente oriental de la
cordillera de los Andes (lago Puelo, Argentina) es una especie escasa (Hueck,
1978).
Se encuentra asociado normalmente a las especies de Fagceas, particularmente

Roble (Nothofagus obliqua) y Raul (Nothofagus alpina). Sin embargo, la plasticidad de
Gevuina avellana le permite asociarse a diferentes especies y condiciones
ambientales, encontrndose en gran parte de los tipos forestales de Chile. No es

capaz de establecerse naturalmente en el tipo forestal esclerfilo, salvo
marginalmente en los ecotonos o zonas de transicin entre el tipo forestal
esclerfilo y otros tipos forestales ms mesfitos, tanto en la cordillera como
hacia el extremo sur del esclerfilo (Medel y col., 2004).
En numerosas reas en que el bosque ha sido explotado el avellano surge

rpidamente desde los tocones, invadiendo el rea (Donoso, 1978). Siendo sta
una especie nativa abundante, con una gran variedad de ecotipos y de amplia
distribucin geogrfica, su importancia econmica ha sido slo marginal, an
cuando sus nueces tienen excelentes caractersticas frutcolas, nutricionales y
farmacolgicas, teniendo las plantas grandes posibilidades madereras,
ornamentales y paisajsticas (Medel y col., 2004).
El avellano chileno es un rbol de hasta 18 m de altura, de copa globosa

cuando crece aislado y muy ramificado. Presenta un tronco recto, cilndrico de
50-60 cm de dimetro, corteza delgada, cenicienta y ligeramente rugosa. Las hojas
que pueden presentar grandes diferencias de tamao, son perennes alternas,
compuestas, imparipinadas, de 7-35 cm de largo, fololos coriceos, glabros,
generalmente aovados, de 2-5 cm de largo, opuestos y casi ssiles. Los fololos
son agudos en el pice, desiguales en la base, notablemente aserrados en el
margen, verde brillante en la cara superior y verde plido en la inferior
(Rodrguez y col., 1985).
La inflorescencia del avellano es un racimo recto, axilar de 10-14 cm de largo,

dispuesto en los extremos de las ramas, con el raquis y pednculos florales
cubiertos de un tomento rojizo. Las flores son hermafroditas de 1-1,2 cm de
largo, asimtricas, pedunculadas, germinadas, dispuestas helicoidalmente
alrededor del raquis. Presenta cuatro tpalos libres, reflexos, pubescentes de 9-10
mm de largo, de color blanco cremoso, rojizos en la base, de forma linear
lanceolada, con el extremo superior cncavo y de color verde claro (Rodrguez y
col., 1985).
Las estructuras reproductivas masculinas estn representadas por 4 estambres,

ssiles, insertos en la concavidad de cada uno de los tpalos. Por otro lado, la
estructura reproductiva femenina est formada por un ovario spero, pubescente,
subssil, unilocular y biovulado. El fruto es una nuez de 1,5-2 cm de dimetro, de
forma globosa o levemente ovalada, pice algo protuberante, verde, rojizo o
negro-violceo segn sea el grado de madurez. Las semillas son redondas,
ligeramente arrugadas de 1-1,4cm de dimetro y de color caf rojizo (Rodrguez y
col., 1985).
Esta especie se reproduce sexualmente por semillas a travs de polinizacin

cruzada facilitada principalmente por la abeja comn Apis mellifera y las avispas
Vespula germanica, Corynura chloris y Gayella eumenoides. Esta especie arbrea tambin
es capaz de reproducirse vegetativamente por medio de estacas (Donoso, 1978).
1.2. GENTICA DE POBLACIONES
Segn Hartl y Clark (1997), en gentica poblacional el trmino poblacin

viene referido a un grupo de organismos de la misma especie que viven en un
rea geogrfica suficientemente restringida para que cada miembro tenga la
oportunidad potencial de aparearse con algn otro miembro. No obstante, la
definicin precisa de esta unidad es difcil y vara de especie en especie debido a
la presencia casi universal de algn tipo de estructuracin geogrfica en las
mismas.
Uno de los aspectos principales en gentica de poblaciones es, precisamente,

descubrir la arquitectura gentica de las poblaciones naturales e identificar las
fuerzas y factores evolutivos que expliquen dicha variacin (Noel y col., 2007).
1.2.1. Diversidad gentica
Existen diversas propuestas para definir el concepto de diversidad gentica;

Robert y Christine Prescot Allen (1986 citado por FAO/PNUMA, 1991) la
definen como la variabilidad gentica o variedad de diferentes genes en una
poblacin reproductiva, dentro de una especie o dentro de todas las especies
encontradas en un rea dada. Frankham y colaboradores (2002) la definen como
la variedad de genotipos y alelos presentes en una poblacin y la cual se refleja en
diferentes caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y del comportamiento entre
los individuos y las poblaciones. La diversidad gentica existe en tres niveles: (a)
diversidad dentro de las poblaciones reproductivas, (b) diversidad entre
poblaciones reproductivas; y (c) diversidad entre las especies (FAO/PNUMA,
1991).
Adicionalmente por diversidad gentica se entiende la variacin de los genes

dentro de cada especie. Esto abarca poblaciones determinadas de la misma
especie o la variacin gentica de una poblacin. La diversidad gentica
representa la variacin heredable dentro y entre poblaciones de organismos.
Esencialmente, depende de las variaciones en la sucesin de los cuatro pares
fundamentales (A-G-C-T) con que se constituye el cdigo gentico, teniendo en
cuenta que en los organismos avanzados slo una pequea parte (frecuentemente
menos del 1%) del material gentico se expresa exteriormente en la forma y en el
funcionamiento del organismo (Grierson y Covey, 1991).
La variabilidad gentica, se refiere a la variacin de genes o aparicin de

variantes genticas como alelos, genes o genotipos en poblaciones de organismos
y es el requisito necesario para que los individuos evolucionen y se adapten a
nuevas condiciones. Esto se debe a que la seleccin natural, mecanismo mediante
el cual los individuos se adaptan a condiciones ambientales variables, no puede
actuar si no existen variables entre las que seleccionar (Koski y col., 1997;
Jimnez y Collada, 2000). Esta variabilidad es producida por mutacin
espontnea o inducida, por recombinacin gentica y por migracin de
individuos desde una poblacin hacia otra. Lo anterior indica que los individuos
que carecen de sistemas de reproduccin sexual, presentan una menor

variabilidad gentica (Griffiths y col., 2000, Sosa y col., 2002).
Hamrick y Godt (1989), sealan que las especies vegetales que presentan una
amplia distribucin geogrfica, tienden a tener mayor variabilidad gentica que
aquellas escasamente distribuidas. Esto se debe a que al ocupar los individuos
diferentes nichos ecolgicos se encuentran obligados a adaptarse a diferentes
condiciones medioambientales. Con el tiempo, esta adaptacin se refleja en
diferencias genticas entre las poblaciones. Por lo anterior, en especies de amplia
distribucin geogrfica se espera encontrar una elevada variabilidad gentica,
porque sufriran en menor proporcin los efectos de la llamada deriva gentica,
que tiende a erosionar la variacin gentica de las poblaciones con rangos
restringidos.
La diversidad gentica dentro de una especie no est distribuida uniformemente

a travs del rango de mbitos en los que ocurre. Evidencias actuales sugieren que
la distribucin geogrfica puede tener mucho que ver en la variacin observada
en plantas silvestres (Hamrick y Godt, 1989). En los cultivos, los patrones de
distribucin geogrfica tambin reflejan el efecto de la seleccin humana en
ambientes particulares as como la historia del desarrollo del cultivo en diferentes
localizaciones (Hodgkin, 1995).
Segn la teora de Vavilov (1958), las plantas que son nativas de un lugar, y que
se encuentran habitando en su centro de origen, han tenido mucho tiempo para
acumular mutaciones y por ende, presentan una gran diversidad gentica en sus
poblaciones.
Una de las mayores limitantes de cualquier estrategia de conservacin para

salvaguardar la diversidad gentica y con ello el potencial adaptativo de una
determinada especie, es el nivel de caracterizacin de dicha diversidad, la cual se
ha basado en la mayora de los casos en rasgos morfolgicos, los cuales se limitan
al fenotipo (expresin del genotipo) que puede ser afectado por el ambiente
(Ayad y col., 1997). Por esta razn los anlisis de la diversidad gentica tratan de
utilizar marcadores moleculares neutros (no sometidos a seleccin) con los cuales
se calculan diversos ndices de diversidad; siendo los ms utilizados la diversidad
allica (A), la diversidad nucleotidica (Pi) y la heterocigosidad (He) (Hartl y Clark,
1997).
Diversidad allica (A): es el nmero medio de alelos por locus, la cual

constituye una medida de la variabilidad gentica que cuantifica el nmero total
de alelos diferentes detectados en cada uno de los loci de una poblacin (Hartl y
Clark, 1997).

10
La diversidad nucleotdica (Pi) es la proporcin promedio de diferencias

nucleotdicas entre los posibles pares de secuencias de una muestra (Hartl y
Clark, 1997).
Heterocigosidad (He): es la frecuencia media de individuos heterocigticos, la

cual se estima calculando la frecuencia de heterocigticos para cada locus y
dividiendo por el total de loci. Cuando las poblaciones estn bajo equilibrio de
Hardy-Weinberg, la heterocigosidad puede ser calculada a partir de la frecuencia
allica. Por lo tanto, la heterocigosidad esperada cuantifica la igualdad o
equitatividad de las frecuencias allicas en los loci (Sosa y col., 2002).
Adems, la comparacin entre la heterocigosidad observada (Ho) y la

heterocigosidad esperada (He) permite evaluar la estructura gentica de las
poblaciones (Nei, 1972).
1.2.2. Anlisis de la estructura poblacional
Los estudios realizados por Price y col. (2003); Pigliucci y col., (2006) y
Valladares y col., (2006) revelan que la diversidad gentica puede verse afectada
de forma diferente por distintos procesos evolutivos y ecolgicos o
reproductivos de acuerdo a la actuacin que stos tengan al nivel de las
poblaciones o de la especie. Una manera de analizar este fenmeno es
descomponer la diversidad gentica de una especie en sus componentes intra- e

11
interpoblacionales, lo cual nos permite conocer cmo se distribuye y estructura la

variabilidad gentica en las poblaciones naturales (Sosa y col., 2002; Noel y col.,
2007). Existe una estructuracin gentica dentro de una poblacin cuando las
frecuencias allicas no se distribuyen al azar, sino que siguen un determinado
patrn o arquitectura que bien puede ser espacial o temporal (Sosa y col., 2002).
Estos datos permiten determinar la existencia de diferencias significativas en la

composicin gentica de las distintas poblaciones de una especie, y describir el
nivel de diferenciacin a travs de ndices de distancia o de fijacin. La existencia
de estructura para marcadores moleculares permite descartar la panmixia e indica,
pues, un cierto grado de aislamiento gentico de las poblaciones (Godoy, 2009).
Dos de los mtodos que permiten analizar el grado de estructuracin gentica

poblacional son a travs de la existencia de autocorrelacin espacial o mediante el
coeficiente de endogamia de la poblacin (Fis) (Sosa y col., 2002). Para el anlisis
del coeficiente de endogamia uno de los principios en los que se basa el anlisis
gentico de las poblaciones naturales es la Ley de Hardy-Weinberg. Esta ley
indica que en ausencia de factores que modifiquen las frecuencias allicas de una
poblacin, las frecuencias genotpicas de esa poblacin no varan de una
generacin a otra, alcanzando el equilibrio. Aunque en la realidad existen
multitud de factores y fuerzas evolutivas que pueden hacer variar las frecuencias
allicas de una poblacin (mutaciones, seleccin natural, flujo gentico,
autofecundacin) el principio de Hardy-Weinberg es aplicable a las poblaciones
naturales (Hartl y Clark, 1997).

12
De esta forma se puede averiguar si una poblacin se encuentra en equilibrio

de Hardy-Weinberg e inferir las causas o fuerzas que han podido originar el
cambio de las frecuencias allicas, comparando el nivel de heterocigosidad
observada en la poblacin con el nivel de heterocigosidad esperado segn el
equilibrio de Hardy-Weinberg. As, se calcula el coeficiente de endogamia Fis, el
cul relaciona ambas medidas de heterocigosidad (observada y esperada) (Sosa y
col., 2002; Hartl y Clark, 1997).
Fis=1-(Ho/He)
Por otro lado el grado de diferenciacin gentica entre poblaciones naturales se

puede cuantificar a travs del coeficiente de diferenciacin gentica (Fst) (Sosa y
col., 2002; Hartl y Clark, 1997).
1.3. MARCADORES MOLECULARES
Como alternativa para superar las limitaciones en las estrategias de

conservacin de la diversidad gentica, surgen los marcadores moleculares, que
son secuencias del ADN que pueden ser usadas para analizar mnimas
variaciones genotpicas (polimorfismos) sin la intervencin de factores
ambientales. Adems, estos marcadores tienen la ventaja de poder cubrir todo el
genoma y de ser relativamente fijos o perennes. Son usados con muchos
propsitos, entre ellos estn los estudios taxonmicos, estudios de filogenia y
evolucin, para trazar rutas de domesticacin, para estudiar las relaciones entre
diversidad y ambiente y para estudiar el pool gnico completo de un cultivo o
la diversidad en una parte especfica de un pool gnico (Karp y Edwards, 1995).

13
Los marcadores moleculares han probado ser tiles en la identificacin de

fuentes de diversidad genticas en poblaciones, as como tambin en la
caracterizacin de la estructura gentica de las mismas (Davies y col., 1999).
El uso de marcadores moleculares permite evaluar y monitorear la variabilidad

gentica existente entre y dentro de poblaciones de una especie, con lo que se
puede aumentar la eficacia en el manejo y administracin de los recursos
genticos (Campos, 1995). Los marcadores moleculares presentan distintos
atributos: nivel de polimorfismo, grado de estabilidad ambiental, nmero de loci,
bases moleculares del polimorfismo, practicidad y costos, las cuales deben
considerarse a la hora de definir qu marcador utilizar para un objetivo
determinado. De acuerdo a lo anterior, para estudios de diversidad gentica son
especialmente indicados aquellos marcadores que analizan un gran nmero de
loci, logrando as una amplia cobertura del genoma (Prez de la Vega y Garca,
2000; Schulman, 2007).
Entre las tcnicas de marcadores genotpicos que se basan en la variabilidad de

las secuencias nucleotidicas (ADN), destacan los fragmentos de restriccin
polimrficos (RFLPs), amplificacin al azar de ADN (RAPDs), fragmentos
polimrficos de ADN amplificados (AFLPs) y marcadores microsatlites (SSRs)
(Campos, 1995).

14
1.3.1. Marcadores microsatlites (SSRs)
Los marcadores microsatlites son segmentos cortos de ADN de uno a seis

pares de bases, los cuales se repiten en tndem y cuya longitud generalmente es
menor a 100 pares de bases (Tautz y Renz, 1984). Estas secuencias, por lo
general, son repeticiones de dinucletidos Ej.: (CA)n; (CA)n-CCA-(CA)n (Figura
1). En el genoma de los vegetales el dinucletido ms abundante es el ATn,
(Smulders y col., 1997, citado por Garca - Mas y col., 2000; Tth y col., 2000;
Selkoe y Toonen, 2006; Muoz y col., 2008).
El polimorfismo de los microsatlites es revelado por el uso de amplificaciones

de PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) (Saiki y col., 1988) con ayuda de
dos partidores nicos, compuestos de regiones cortas de aproximadamente 20
nucletidos especficas y complementarias a las regiones flanqueantes de la regin
del microsatlite, que resultan ser especficos de la regin de inters y que
garantizan que slo esa parte, y ninguna otra, va a ser amplificada (Figura 1).
Estos productos amplificados pueden ser detectados mediante geles de
poliacrilamida de alta resolucin, con tincin en plata, radiactividad o
fluorescencia.
Primer 1
CACCTGATATCTGGTA
GTGGACTATAGACCAT----- ACACACACACACACAC-----GCTGTGATGGTCTAC
Microsatlite
CACCTGATATCTGGTA ----- TGTGTGTGTGTGTGTG-----CGACACTACCAGATG
GCTGTGATGGTC TAC
Primer 2

Figura 1. Microsatlite. Ejemplo de un dinucletido (AC)n

15
Generalmente, las repeticiones de dinucletidos que constituyen los

microsatlites ms comunes, pueden ser perfectos (Ej. (CA)n), imperfectos (Ej.
(CA)n-CCA-(CA)m) o compuestos (Ej. (CA)n (TG)m). El nmero de repeticiones
es variable, y en general, el grado de polimorfismo aumenta con la longitud total
del microsatlite que no suele superar los 0,1 Kb (Garca Mas y col., 2000). La
base molecular de estos marcadores se debe a diferencias de longitud provocadas
por un nmero distinto de repeticiones y en menor grado a la variabilidad
intrasecuencia (Selkoe y Toonen, 2006).
La alta tasa polimrfica caracterstica de los microsatlites, inclusive en

organismo con baja variabilidad gentica (Zwettler y col., 2002; Ellegren, 2004),
es debida a que en estas regiones repetitivas existen altas tasas de eventos
mutacionales debido principalmente a slipped-strand mispairing (hibridacin
errnea por deslizamiento de la hebra) lo que son errores de la ADN polimerasa
durante el proceso de replicacin del ADN (Schlotterer y Tautz, 1992). Estos
errores se deben a que una de las cadenas ya sea la nueva o la antigua se desliza o
corre sobre la otra en al menos un motivo, resultando en un mal apareamiento de
las mismas y de ese modo ocurre un cambio en el nmero de replicaciones
(Moxon y Wills, 1999).
El crecimiento de estas regiones resulta de la ganancia de unidades repetidas a

travs del tiempo, ya sea debido a eventos mutacionales ms frecuentes o a
eventos de reparacin menos frecuentes. Debido a que las mutaciones agregan o
sustraen lentamente unidades repetitivas a un arreglo de microsatlites en

16
particular, una serie de alelos de diferente tamao (nmero de repeticiones)

aparecen en la poblacin (Riaz y col., 2004; Estoup y Cournet, 1999). El nmero
de alelos es controlado por procesos genticos-poblacionales clsicos tales como
procesos de mutacin, seleccin, deriva gentica y migracin (Riaz y col., 2004;
Kriglyax y col., 1998).
Por ltimo, los procesos que hacen que una regin microsatlite desaparezca
puede deberse a que los arreglos largos son particularmente propensos a
deleciones grandes o sustituciones nucleotdicas simples. Aqu el evento podra
regenerar alelos pequeos y crear arreglos interrumpidos, los cuales pueden
reducir la base en la cual se genera el polimorfismo sirviendo como puntos de
anclaje contra los deslizamientos de la polimerasa durante la replicacin
(Hancock, 1999).
Una de las herramientas recientemente desarrolladas para el estudio de la

diversidad gentica de poblaciones son los marcadores moleculares de
microsatlites de secuencias expresadas (EST-SSRs), los cuales son secuencias de
la regin transcrita del genoma (Scariot y col., 2007; Woodhead y col., 2005). El
desarrollo de microsatlites de ESTs (secuencias expresadas), se basa en
secuencias completas o parciales de ADN complementario (ADNc). La mayora
de los ESTs-SSR estn localizados en las regiones UTRs (regiones no transcritas
del ARNm). Como el ARNm es la copia fiel de la parte codificante de un gen, un
EST es un fragmento del gen que representa un resumen de la informacin de

17
los genes expresados en un determinado tejido y/o en una etapa del desarrollo
(Mekhedov y col., 2000).
Los microsatlites de secuencias expresadas (EST-SSR) tienen una serie de

ventajas con respecto a los marcadores microsatlites tradicionales (SSR): i)
Tienden a ser transferibles entre especies e incluso gneros (Besnard y col., 2003;
Chagne y col., 2004; Boches y col., 2005; Coulibaly y col., 2005). ii) Los EST-
SSRs son tpicamente compuestos de repeticiones de trinucletidos, que son ms
fciles de evaluar que las repeticiones de dinucletidos (Morgante y col., 2002; Li
y col., 2004). iii) La secuencia expresada (EST) se puede comparar con bases de
datos sobre secuencias de protenas, posibilitando el establecimiento de la
identidad funcional de un locus particular (Bouck y Vision, 2007).
Trabajar con EST-SSRs posibilita en mayor proporcin el acceso directo a

genes candidatos, si los marcadores pueden disearse en torno a un gen de
inters (Vasemagi y Primmer 2005, citado por Bouck y Vision, 2007). Los genes
candidatos tambin pueden ser identificados mediante la realizacin de las
exploraciones de los EST-SSR en el genoma, en donde el gen afectado por
seleccin es probable que se encuentre muy cerca del marcador molecular o
quizs en la fuente propia del EST-SSR (Bouck y Vision, 2007).
La estrategia de los microsatlites de secuencias expresadas (EST-SSRs) es una

forma ms eficaz para descubrir nuevos y funcionales genes dentro de la

18
totalidad del genoma de la especie en estudio. Estas secuencias pueden

proporcionar una estimacin de la diversidad gentica en la porcin del genoma
expresado y pueden ser tiles para marcar importantes rasgos de inters, as
como para el desarrollo de nuevos mapas genticos (Scariot y col., 2007;
Woodhead y col., 2005).
La principal desventaja de los EST-SSR es que tienden a mostrar una menor

tasa de polimorfismo (en trminos de riqueza allica) que los derivados de las
bibliotecas genmicas (Woodhead y col., 2005; Bouck y Vision, 2007; Scariot y
col., 2007).
1.3.1.1. Ventajas del uso de marcadores microsatlites
Una de las ventajas de estos marcadores tipo microsatlites versus otros

marcadores (minisatlites, RFLP, RAPD, etc.) radica en que estn considerados,
por la mayora de los autores, como la ms poderosa herramienta para los
estudios de gentica de poblaciones (Selkoe y Toonen, 2006). Esto se debe a que:
son muy polimrficos, presentan herencia mendeliana simple, son codominates
(pudindose diferenciar los individuos homocigotos de los heterocigotos), son
fciles de medir y analizar, son fiables, reproducibles, automatizables y son muy
abundantes dado que estn uniformemente dispersos a travs del genoma (Zane
y col., 2002).

19
Debido a que los microsatlites son locus frecuentemente hipervariables, es

decir, revelan un gran nmero de bandas polimrficas en frecuencias
relativamente altas, ellos son ideales para la identificacin molecular de
individuos. El patrn de relaciones entre individuos puede tambin ser
determinado mediante el uso de estos marcadores. Por lo tanto, su naturaleza
altamente discriminativa y codominante, los hace ms informativos que otros
marcadores (Ferreira y Grattapaglia, 1998; Zane y col., 2002; Selkoe y Toonen,
2006).
Los microsatlites al ser marcadores codominantes permiten la rpida

identificacin de heterocigotos. La codominancia de los microsatlites
incrementa la agudeza y eficiencia de medidas gentico-poblacionales basadas en
estos marcadores en comparacin con otros marcadores dominantes tales como
AFLP y RAPD (marcadores dominantes). Adems marcadores codominantes
hacen ms simples la identidad de heterocigotos en la generacin F1, los anlisis
de flujo gnico, hibridacin y paternidad (Shlotterer y Pemberton, 1994).
El hecho de que el mtodo se base en el ADN le otorga ventajas adicionales

tales como su capacidad para trabajar con material antiguo u hojas secas en el
caso de plantas. En comparacin con las alozimas, los microsatlites parecen ser
selectivamente neutrales lo que no es esencial para estudios filogenticos pero es
una de las asunciones necesarias al usar marcadores en muchos anlisis (Jimnez
y Collada, 2000).

20
En los estudios de gentica poblacional, estos marcadores permiten la

identificacin de cada alelo por locus, obtener datos poblacionales, calcular las
frecuencias allicas, y a partir de estas estimar las distancias genticas entre las
poblaciones o individuos (Azofeifa-Delgado, 2006; Selkoe y Toonen, 2006).
Por otro lado, una de las mayores desventajas del uso de microsatlites es la
necesidad de bsqueda de estos locus en el organismo a estudiar. Hay varias vas
para la bsqueda de los microsatlites; sin embargo todas son complejas y de
elevado costo ya que generalmente involucran el desarrollo de bibliotecas
genmicas. El problema ms serio de los microsatlites lo representa la
homologa, ya que es necesario asumir que los fragmentos comigrantes son
homlogos, lo cual no necesariamente es real. Es factible que mutaciones
puntuales no afecten el largo del fragmento, impidiendo la diferenciacin de los
alelos. Esto constituye un problema, principalmente cuando se quiere realizar
estudios filogenticos (Robinson y Harris, 1999).
1.3.1.2. Aplicaciones de los marcadores tipo EST-SSRs
Los marcadores moleculares tipo EST-SSRs han sido utilizados con xito
para el estudio de la diversidad gentica y de parentesco en una gran cantidad de
especies. Algunos ejemplos son el trabajo de Da Silva (2001), quien realiz un
anlisis preliminar de EST-SSRs en caa de azcar para estimar la diversidad
entre variedades de esta especie y as poder optimizar programas de cruzamiento
y mejoramiento gentico. Ottewell y col. (2005), determinaron el parentesco

21
entre especies de Eucalyptus leucoxylon y otras especies de eucalipto. Mason y col.,

(2005) desarrollaron microsatlites altamente reproducibles para la
caracterizacin de las colecciones de quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) de
diversos pases de Sudamrica y que estn disponibles para su uso en programas
de mejoramiento gentico. Zhao y col. (2008), determinaron la diversidad
gentica dentro de poblaciones de plantas de t (Camellia sinensis) y especies
cercanas a esta. Woodhead y col. (2005) realizaron la comparacin de diferentes
tipos de marcadores moleculares como AFLP, SSR y EST-SSRs en el estudio de
la diversidad gentica en Athyrium distentifolium. En este trabajo detectaron que los
EST-SSR poseen una mayor capacidad de amplificacin, mostrando altos niveles
de diversidad allica y valores similares de Fst con respecto a los SSR. Borrone y
col. (2007) desarrollaron 70 marcadores microsatlites de secuencias expresadas
(EST-SSRs) para Persea americana (aguacate) los cuales sern utilizados en la
caracterizacin de germoplasma, determinacin de relaciones genticas entre
cultivares y la introgresin de tolerancia a la pudricin de la raz por medio de
tcnicas de seleccin asistida por marcadores.
El elevado costo que involucra el desarrollo de microsatlites ha trado consigo

que prcticamente no exista este tipo de marcadores para especies vegetales
nativas de Chile. Recientemente se han realizado esfuerzos en el extranjero para
desarrollar secuencias repetitivas simples (SSR) de zonas genmicas no
codificantes para el gnero Araucaria (Robertson y col., 2004), para el gnero
Nothofagus (Jones y col., 2004, Marchelli y col., 2008), para Chenopodium quinoa
(Mason y col., 2005), y en Chile para Ugni molinae (Ramos y col., 2009a) y Quillaja

22
saponaria (Ramos y Col., 2009b). Sin embargo, a la fecha no hay marcadores del
tipo EST-SSR disponibles para plantas nativas
1.4. HIPTESIS

Teniendo en cuenta que el avellano chileno es una especie con un amplio rango
de distribucin continua y con un sistema de reproduccin cruzada, se espera que
la mayor diversidad se encuentre dentro de las poblaciones, con poca
diferenciacin entre las mismas.
1.5. OBJETIVOS

1.5.1. Objetivo General

Determinar la diversidad y estructura gentica de las poblaciones de avellano

Gevuina avellana Mol. mediante el uso de marcadores moleculares tipo
microsatlites de secuencias expresadas (EST-SSR).
1.5.2. Objetivos Especficos

i) Identificar polimorfismos en genotipos de avellano mediante EST-SSRs.

23
ii) Estimar ndices de diversidad gentica para las poblaciones de avellano a

travs de EST-SSRs.
iii) Determinar el grado de estructuracin gentica de las poblaciones del

avellano usando los marcadores moleculares tipo EST-SSRs.

24
2. MATERIALES Y MTODOS
2.1. MATERIAL VEGETAL
Para los estudios de polimorfismo y diversidad gentica nuclear se trabaj con

material vegetal proveniente de 11 poblaciones de Gevuina avellana Mol.
distribuidas a lo largo de Chile. De cada poblacin se recolectaron hojas nuevas
de 30 individuos a excepcin de la poblacin de Isla Mocha de la cual solo fue
posible recolectar 19 individuos dado que la distancia minima entre individuos
colectados fue de 30 metros y con un dimetro a la altura del pecho (DAP)
>10cm. Esta recoleccin del material vegetal fue realizada en el marco del
proyecto Fondecyt 1060192. La localizacin geogrfica de las poblaciones
muestreadas se seala en la Tabla 1 y Figura 2.
Tabla 1. Localizacin geogrfica de las poblaciones estudiadas
Ubicacin Coordenadas
Poblacin Id Altura (msnm)
x cordillera Latitud (S) Longitud (W)
Armerillo Ar Andes 35422 71 644 680
Los Queules Lq Costa 355913 724146 500
San Fabin Sf Andes 363311 713217 500
Fundo Escuadrn Fe Costa 365651 73 622 150
Contulmo Ct Costa 380104 731022 380

25
Malleco Ma Andes 380238 714446 815
Isla Mocha Im Costa 382147 735415 100
Oncol On Costa 394133 732038 415
Huilo Huilo Hu Andes 395108 715523 480
Sajonia Sa Costa 405009 732945 207
Dalcahue - Chilo Ch Costa 421737 732711 120
Figura 2. Localizacin geogrfica de poblaciones estudiadas

26
2.2. MTODOS
2.2.1. Extraccin del ADN
Para la realizacin de esta tesis se cont con ADN de 319 plantas de avellano
de 11 poblaciones a lo largo de Chile. La extraccin de ADN fue realizada en el
Laboratorio de Biologa Molecular de la Facultad de Ciencias Agrarias. El ADN
total se obtuvo a partir de hojas nuevas de avellano utilizando el protocolo
descrito por Arismendi y col. (2010). Teniendo en cuenta la cantidad de ADN
extrado, la cual fue determinada mediante absorcin a 260 nm usando un
espectrofotmetro Spectromic GenesysTM 8, se realizaron diluciones para
utilizar el ADN a una concentracin de 5 ng/uL.
2.2.2. Estrategia seguida para el aislamiento de los microsatlites de secuencias

expresadas (EST-SSRs)

Con anterioridad al presente trabajo y en el marco del proyecto Fondecyt

1060192 fue desarrollada una biblioteca normalizada de ADNc a partir de
ARNm extrado de la nuez de G. avellana en estado de maduracin. Esta fue
construida por la empresa Vertis Biotechnologie AG considerando la clonacin
de los fragmentos de ADNc en bacterifagos. De la biblioteca, se seleccionaron
bacterifagos que contenan genes insertos con secuencias repetitivas simples
(SSR). Para ello se realiz una hibridacin con una sonda marcada con DIG que
representa un SSR de tipo (AG)8. Los insertos de los bacterifagos seleccionados

27
fueron secuenciados. Con esta estrategia se seleccionaron 20 secuencias EST

cuyo anlisis con el programa FastPCR (http://primerdigital.com/fastpcr.html)
arroj la presencia de secuencias repetitivas.
2.2.3. Diseo de partidores
Las secuencias utilizadas para el desarrollo de los partidores fueron las

obtenidas de la librera de ADNc descrita en el punto anterior. Al iniciar este
trabajo se contaba con 10 pares de partidores diseados (forward y reverse) de los
cuales cuatro tenan incluida la fluorescencia y seis an no la posean.
Adicionalmente durante el desarrollo de esta tesis se realiz el diseo de
partidores para las otras 10 secuencias existentes.
Para el diseo de partidores se tuvo en consideracin detalles como la

temperatura de apareamiento y evitar que los partidores contuvieran secuencias
complementarias para prevenir la formacin de dmeros, es decir, la hibridacin
entre el mismo o los dos partidores respectivamente. Se utiliz el programa
Primer3 que se encuentra disponible en internet (http://www.genome.wi.mit.edu
/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi) con el fin de desarrollar los partidores
flanqueantes para cada una de las secuencias repetitivas.

28
2.2.4. Amplificacin del ADN
La amplificacin de los fragmentos de ADN se realiz mediante reacciones de

PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) en un termociclador PTC-100 de MJ
Research. Dependiendo de la pareja de partidores utilizada se estandariz el
programa y las concentraciones de la solucin para la PCR.
En trminos generales la solucin PCR consisti en: 1,25uL de tampn 10X

(NH4)2SO4, 0,5uL de MgCl2 25mM; 0,75uL de dNTPs 0,12mM cada uno; 0,5uL
de cada uno de los partidores EST-SSRs (0,24pmol); 0,5uL de ADN (5ng/uL);
0,05uL de Taq polimerasa True start (5U/uL); completando a un volumen final
de 12,5uL con agua destilada estril (8,45uL) enriquecida con PVP al 2%; la
cantidad de cada reactivo se ajusto dependiendo de los partidores utilizados. El
programa del termociclador para realizar las reacciones de PCR fue el siguiente:
95C x 3 minutos - 95C x 45 segundos - T media especfica del partidor x 45
segundos (Tabla 4) - 72C x 45 segundos - repetir del paso 2 al 4, 35 veces - 2C
por 5 minutos - 4C final.
Concluida la reaccin de PCR, se procedi a verificar la correcta amplificacin

de los productos en un gel de agarosa al 1,5% teido con bromuro de etidio,
visualizado en un transiluminador Vilber Lourmat EXT-20M.

29
2.2.5. Genotipificacin
La determinacin de la variabilidad allica entre y dentro de las poblaciones se

realiz por genotipificacin, para lo cual uno de los partidores fue marcado con
fluorescencia con el fin de ser detectado por el sistema de deteccin lser de los
equipos ABI Prism 310 y ABI Prism 3130.
Para este procedimiento se utilizaron los cuatro partidores que estaban

marcados con las siguientes fluorescencias: Ga68F=6FAM; Ga90F=VIC;
Ga92F=PET y Ga94R=PET. Para el marcaje de los dems partidores
desarrollados se utiliz la tcnica descrita por Schuelke (2000 Figura 3).
Figura 3. Metodologa para el marcaje de partidores (Schuelke, 2000)

30
La tcnica para la inclusin de la fluorescencia consisti en: colocarle a uno de

los partidores una secuencia especfica M13 (-21) (TGTAAAACG
ACGGCCAGT) en su extremo 5 final (Fig. 3A), adicionalmente se coloc el
partidor reverso especfico (Fig. 3B), y el partidor universal-fluorescente
etiquetado M13 (-21) (por ejemplo con: FAM, VIC y PET) (Fig. 3C). Las
condiciones de amplificacin en el termociclador fueron elegidas de tal forma
que durante los primeros 35 ciclos, el partidor forward con su M13(-21) avance y
se incorpore en la secuencia de acumulacin de productos PCR (Fig. 3D). Ms
tarde, cuando el partidor forward M13(-21) se ha agotado, la temperatura se redujo
a 53C para facilitar la incorporacin del partidor universal M13 (-21) con
fluorescencia (Fig. 3E). Por lo tanto, el partidor universal M13 (-21) etiquetado
con fluorescencia se incorpora al producto de la PCR (Fig. 3F). Obteniendo as
los productos para la genotificacin. Estos productos se verificaron en un gel de
agarosa al 1,5% teido con bromuro de etidio, antes de realizar el anlisis en el
secuenciador (ABI Prism 310 y ABI Prism 3130) en el Centro de Inseminacin
Artificial de la UACH.
Los datos de salida fueron analizados utilizando el programa GeneMarker

versin 1.85 (ABI). El tamao de los productos se determin utilizando la
etiqueta LIZ500 (ABI).
Las 20 parejas de partidores desarrollados fueron evaluadas en 11 individuos de

10 poblaciones para determinar su polimorfismo. Posteriormente se
seleccionaron los partidores polimrficos, los cuales se caracterizaron en 40

31
individuos de 10 poblaciones. Finalmente para el estudio poblacional completo

(319 individuos de 11 poblaciones), se seleccionaron algunos marcadores
teniendo en cuenta el nmero de alelos, rango de alelos (pb) y el poder
discriminatorio (Do) segn Mathias y col. (2007) presentado por los marcadores.
2.3. ANLISIS DE DATOS
2.3.1. Diversidad gentica de las poblaciones
La estadstica elemental de variabilidad gentica: heterocigosidad

observada (Ho), heterocigosidad esperada (He), porcentaje de loci polimrfico
(P), se determinaron mediante el programa POPGENE versin 1.3.2 (Yeh y col.,
1997).
Riqueza allica de las poblaciones (Rs): el nmero de alelos en una muestra

se determin mediante la tcnica estadstica de rarefaccin para eliminar el efecto
del tamao de la muestra en el clculo del nmero de alelos de cada poblacin. Se
determin mediante el programa HP-RARE 1.0 (Kalinowski, 2005).
Nmero de alelos por locus (Na) por poblacin: Se determin por la suma
de alelos para todos los loci polimrficos y dividido por el nmero total de loci.
Se determin mediante el programa POPGENE versin 1,32 (Yeh y col., 1997).

32
Nmero efectivo de alelos por locus (Ne) por poblacin: Fue calculado
para cada locus segn la frmula: Ne= 1pi2, donde pi es la frecuencia media del
alelo i. Se determin mediante el programa POPGENE versin 1,32 (Yeh y col.,
1997).
Diversidad gentica de cada poblacin (H): Fue calculada como el

promedio aritmtico de los valores de la diversidad gentica para cada locus (H).
Se calcul segn la frmula: H=1-pi2. Se determin mediante el programa
POPGENE versin 1,32 (Yeh y col., 1997).
Estimacin de alelos nulos: se realiz usando el estimador de Brookfield

(1996, citado por Oosterhout y col., 2004) entregando la frecuencia de alelos
nulos, r = (He - Ho)/(1 + He) en una poblacin, implementado en el programa
MICRO-CHECKER versin 2.2.3 (disponible en
http://www.microchecker.hull.ac.uk). Las significancias estadsticas fueron
analizadas usando el mtodo de Fisher (Oosterhout y col., 2004).
2.3.2. Estructura gentica de las poblaciones
Las desviaciones del equilibrio de Hardy- Weinberg (HWE) dentro y entre

poblaciones, los estadgrafos-F y los valores de distancia gentica de Nei (1972).
Se calcularon mediante el programa POPGENE versin 1.3.2 (Yeh y col., 1997)

33
Anlisis de IBD (Isolated By Distance) correlacin entre distancia

gentica y distancia geogrfica: Para determinar esta correlacin se realiz un
Test de Mantel con la distancia gentica de Nei (1973) y las distancias geogrficas
lineales de las poblaciones. Adicionalmente se realiz el anlisis dividiendo las
poblaciones segn su localidad geogrfica en la cordillera de la Costa y la
cordillera de los Andes. Utilizando el programa ARLEQUIN 3.1. (Excoffier y
col., 2005).
Anlisis de relaciones genticas entre las poblaciones a travs de un

rbol Neighbor-joining (NJ): est anlisis se realiz mediante el mtodo de NJ
con 1000 bootstrap (Saitou y Nei, 1987 citados por Takezaki y col., 2009). Est
mtodo se basa en las distancias genticas DA (Nei y col., 1983) para la
construccin de un rbol filogentico del vecino ms cercano (NJ) que permite
observar grficamente las relaciones de parentesco (similitud gentica) entre
distintas poblaciones utilizando el programa POPTREE2 (Takezaki y col., 2009).
Anlisis de relaciones genticas entre individuos: Se realiz a travs de un

anlisis de coordenadas principales para todas las poblaciones y dividiendo las
poblaciones de acuerdo a su localidad geogrfica en la cordillera de la Costa y
cordillera de los Andes. Utilizando el programa GENALEX 6 (Peakall y Smouse,
2006).

34
Distribucin de la diversidad gentica en las poblaciones: se determin

mediante el anlisis de la varianza molecular (AMOVA) utilizando el programa
ARLEQUIN versin 3.1. el cual fue desarrollado considerando 9999
permutaciones.
Este anlisis permiti subdividir la variabilidad molecular observada mediante

los marcadores EST-SSR. Para lo cual inicialmente la varianza se subdividi en
intrapoblacional e interpoblacional (Excoffier y col., 2005). Adicionalmente se
realiz un anlisis jerrquico agrupando las poblaciones de acuerdo a su localidad
geogrfica en la cordillera de la Costa y la cordillera de los Andes.
Para explorar la estructura gentica poblacional se realiz el anlisis espacial de

varianza molecular (SAMOVA) con el fin de definir los grupos de poblaciones
que estn geogrficamente homogneas y determinar al mximo las diferencias
existentes entre unas y otras. Utilizando el programa SAMOVA 1.0 (Dupanloup
y col., 2002).
2.3.3. Estimacin Bayesiana de la estructura gentica entre las poblaciones
Las tcnicas de asignacin Bayesiana se utilizaron para evaluar la estructura de

las poblaciones en todo el rango de distribucin y evaluar la escala geogrfica de
la diferenciacin poblacional, utilizando el programa STRUCTURE versin 2.3.1.
(Falush y col., 2003). Este programa identifica los grupos de individuos

35
genticamente similares segn sus genotipos multilocus sin conocimiento previo

de sus afinidades en la poblacin. El modelo supone K clusters genticos, y cada
uno tiene un conjunto caracterstico de frecuencias de los alelos de cada locus.
Para la determinacin del nmero de cluster (K) basados solo en los datos
genotpicos multilocus, se realizaron 20 corridas independientes para cada K
entre uno y 20, se utiliz el modelo de mezcla, que estima probabilsticamente la
proporcin de individuos con ascendencia de cada grupo; se asumi la
independencia de los loci. Con periodos de 10,000 iteraciones en la ejecucin y
en las cadenas de Markov Montecarlo (MCMC), los cuales fueron
correlacionados (Pritchard y col., 2000). A partir de estos datos iniciales, se
determin el verdadero valor de K (la probabilidad ms alta posterior) mediante
el clculo de K (Evanno y col., 2005).

36
3. RESULTADOS
3.1. CARACTERIZACIN Y SELECCIN DE LOS MARCADORES
La frecuencia del tipo de motivo repetitivo y su distribucin fue de 18 (90%)

dinucletidos y dos (10%) trinucletidos. A su vez el 30% (seis) fueron
secuencias repetitivas perfectas y el 70% (14) imperfectas (Tabla 2). Los EST-
SSR de avellano fueron en su mayora compuestos por las repeticiones de
AG/GA (65%) coincidente con la sonda utilizada en la seleccin, mientras que
los motivos AT/CT/TT/TC/TCT/GCT fueron los menos encontrados
formando la regin satelital (Tabla 3).
Al realizar la bsqueda de posibles homologas con protenas en las bases de

datos, 12 (60%) de las secuencias presentaron homologas con protenas de
diferentes especies (Tabla 4).
A partir de las 20 parejas de partidores desarrollados, se logr una buena

amplificacin con 17 (85%) de ellos en un rango de temperatura de reasociacin
entre los 55 a los 59 C. Para tres (15%) de los EST-SSR no fue posible su
amplificacin. De los 17 marcadores que amplificaron se seleccionaron ocho

37
(40%) que presentaron polimorfismos al ser evaluados en 11 individuos de 10

poblaciones.
Un total de 33 alelos fueron detectados con los ocho loci polimrficos en 40

individuos de las 10 poblaciones. Presentando un rango de alelos entre dos alelos
para los marcadores Ga49-2 y Ga90 y ocho para Ga88. El promedio de
alelo/locus fue de 4,25. No se encontr relacin entre el motivo repetitivo y el
nmero de los alelos encontrados (Tabla 4).
De los ocho EST-SSR polimrficos, se seleccionaron los cinco que presentaron

rangos de amplificacin compatibles con el desarrollo de la lectura en el
genotipificador automtico en un pseudo mltiplex (Figura 4) y que
presentaron un alto poder discriminatorio (Do). El poder discriminatorio (Do)
vari en un rango de 0,50 a 0,93 para los loci Ga36 y Ga88 respectivamente
(Tabla 4, el locus Ga7d se excluy por presentar alelos nulos).
Estos cinco loci seleccionados fueron utilizados para la caracterizacin de la

diversidad gentica y estructura gentica del total de los individuos (319) de las 11
poblaciones de avellano. Al evaluar las frecuencias genotpicas en los cinco loci
utilizados para el estudio de la diversidad gentica de G. avellana el locus Ga88
con ocho alelos fue el ms polimorfico y el Ga49-2 con dos alelos fue el menos
polimorfico.

38
A Marcador Ga68 Fluorescencia FAM
Oncol - 10
San Fabin 21
B Ga94 - PET Ga92 - PET
Oncol - 10
San Fabin 21
Figura 4. Ejemplo de algunos marcadores polimrficos seleccionados de Gevuina avellana. A)

Marcador Ga68 con fluorescencia FAM (azul) y B) marcadores Ga94 y Ga92 con fluorescencia
PET (roja)
Tabla 2. Frecuencia y tipo de motivos repetitivos encontrados en la regin satelital
Tipo de Motivo Nmero secuencias Frecuencia (%)

Perfectas
Dinucletido 5 25%
Trinucletido 1 5%
Total 6 30%
Imperfectas
Dinucletido 13 65%
Trinucletido 1 5%
Total 14 70%

39
Tabla 3. Frecuencia de los diferentes motivos de repeticiones en la regin satelital

Tipo de Frecuencia
Motivo No.
Motivo (%)
AT 1 5%
TC/CT 3 15%
Dinucletido
AG/GA 13 65%
TT 1 5%
TCT 1 5%
Trinucletido
GAT 1 5%

40
Tabla 4. Caracterizacin de los marcadores EST-SSR de Gevuina avellana evaluados en 40 individuos de 10 poblaciones
No. Tamao
No. Ta Rango
Accesin Secuencia Repetitiva Secuencia del Partidor 5 3 fragmento BlastX Amplificacin N Do PHW
Partidor (C) alelo(pb)
GenBank (bp)
Ga7dF: GGAAACTGGATTGTCGTCGT 165-168/ unknown [Glycine
Ga7d GT632077 (AT)9 57 216 Polimrfico 5 0,88 0,00
Ga7dR: ATCGAACCAACAACCCAAAG 213-215 max]
hypothetical
Ga36F2: CACCAGAGGCAGAGAGAGAGA
Ga36 GT632078 (AG)2GC(AG)10AAAA(AG)7 59 150 144-148 protein [Vitis Polimrfico 4 0,50 0,00
Ga36R: GCTCGTGGGCTACTCACTTC
vinifera]
Ga38F1: GGGAGGTCTGCGACTAAAAA
Ga38 GT632079 (GA)2A(GA)2A(GA)AAA(GA)A 59 204 unknown protein Monomrfico
Ga38R1: CGGCTTTCTTCCTTCTTCCT
hypothetical
Ga49F2: GTCAAACAGGTCGGTTGCTT
Ga49-2 GT632081 (TCT)5 (CT) 57 217 172-236 protein [Vitis Polimrfico 2 0,67 0,01
Ga49R2: CGACCCATGGAGTTACAACA
vinifera]
hypothetical
F: GGTCTCTTTCGTGCTGTTCA
Ga53 GT632099 (TC)18 57 159 protein isoform 1 No amplifico
R:GGGGGAGAGAGAGAGAGAGAG
[Vitis vinifera]
hypothetical
Ga67bF: CCCTTTCACGGTTCACCTAA
Ga67b GT632083 (TC)5 TTCCTTTCCC(TC)2 57 154 protein [Entamoeba Monomrfico
Ga67bR: CTGCCGATCGTTTTGATTTT
dispar SAW760]
Ga67dF: GAGCGACGAGGGTAGAGAGA unknown [Glycine
Ga67d GT632084 (AG)12 GG(AG)3 57 175 Monomrfico
Ga67dR: GTTGGTCCACCATACCGAGT max]
(AG)3 GG(AG)4 GG(AG)8 Ga68F: AGTGCTTGCTTCCCTCTCTG unknown
Ga68 GT632085 59 180 163-190 Polimrfico 4 0,67 0,00
AT(AG)8 Ga68R: CTGCTGAGGGTAGGTCTTGG [Glycine max]
unnamed protein
GG(AG)CC(AG)2CC(AG)2CCGG( Ga78F. GCCTACCATGAGGGAAGTTG
Ga78 GT632087 59 245 product [Vitis Monomrfico
AG)CAA Ga78R: ACATTGCTTCCACACAGCAC
vinifera]
Alcohol
Ga82aF: TCAGAGAGCAAGAGAGCAAAAG dehydrogenase
Ga82a GT632088 (AG)3 CA(AG)3 CAAA(AG)8 55 177 No amplific
Ga82aR: TTAATCCGAACTTCCCAAGC ADH [Lycopersicon
esculentum]
Full=Chalcone--
flavonone
Ga86F1: AGGGATTAGAGATGGCAGCTA
Ga86 GT632089 (GAT)3GGAT(GAT)2 59 183 isomerase; Monomrfico
Ga86R1: TGTCCCTATGGCTTTCCAGT
Short=Chalcone
isomerase
Ga88F: AGCAAACCCGAAGTGCTTG L-asparaginase
Ga88 GT632090 (GA)12 AA(GA)4 57 181 175-254 Polimrfico 8 0,93 0,00
Ga88R: TAAATTGAGGCAGCGAGTGA [Glycine max]
hypothetical
Ga90F: CCTTCCTGCAGTCCTGTTTC
Ga90 GT632091 (GA)2 GG(GA)4 GG(GA)9 59 218 185-215 protein [Populus Polimrfico 2 0,66 0,01
Ga90R: AACAATGGCGCTAATTCTGG
trichocarpa]

41
Ga91F: ACCCTGCCATTGTCATTTGT
Ga91 GT632092 (AG)11 55 211 unknown protein No amplific
Ga91R: CCCTCCCAAAACCCAAAA
conserved
(GA)2 AAAA(GA)4 ACT(GA)2 Ga92F: AATTAGCTGTGGAGGCTTGG hypothetical
Ga92 GT632093 59 240 233-260 Polimrfico 5 0,90 0,06
A(GA)8 Ga92R: TGAAGATCAAACGGAGAGCA protein [Culex
quinquefasciatus]
Ga94F: GACGAAACAATAGAGATACAGAAAAA
Ga94 GT632094 (AG)6 ACAT(AG)4 59 180 173-188 unknown protein Polimrfico 3 0,73 0,00
Ga94R: GCGAAGAAATAACCCAGTCC
hypothetical
Ga95F: ATACTTTGGTGGTTTGTTGCAG
Ga95 GT632095 (CT)9 59 180 protein [Plantago Monomrfico
Ga95R: TCGCTTTATCAATCTCGTCGT
major]
hypothetical
Ga97F: AGTGACGGATTGAAGCGAAG
Ga97 GT632096 (AG)2 GG(AG)13 59 151 protein [Vitis Monomrfico
Ga97R: GCTCCTTTGCTAGGATCGAA
vinifera]
Ga98F1: AGTCAATGAGGGGCGAAGAG
Ga98 GT632097 (AG)3A(TT)4TC(TT)3 59 152 unknown protein Monomrfico
Ga98R1: CCAAGAAGAAAGTGGGTGCA
Ga108F1: TGGTGACGAATTTCCTTTGA
Ga108 GT632098 (GA)10 55 191 unknown protein Monomrfico
Ga108R1: CCTTCTCCTTCTCCCTCTCC
Ta, Temperatura de reasociacin; N, nmero de alelos; Do, Poder de discriminacin; PHW, Probabilidad de Equilibrio HardyWeinberg. Resaltados se
encuentran los 8 loci polimrficos y en negrita se encuentran los 5 loci utilizados para el estudio de la diversidad y estructura gentica de los 319
individuos de las 11 poblaciones de Gevuina avellana.

42
3.2. DIVERSIDAD GENTICA DE LAS POBLACIONES
El valor de diversidad gentica de Nei (H) para todas las poblaciones fue de
0,64 siendo la poblacin de Sajonia la que presento la menor diversidad gentica
(0,48) y la poblacin de Fundo Escuadrn la mayor (0,64). En la diversidad
gentica se observa una tendencia a disminuir de norte a sur. Este efecto es
posible apreciarlo en las poblaciones de la cordillera de los Andes y de la
cordillera de la Costa (Figura 5). La heterocigosidad observada para el total de las
poblaciones fue baja (0,32) con un rango que va desde 0,24 (Armerillo y Huilo
Huilo) a 0,42 (Contulmo). Los valores de heterocigosidad esperada para el total
de las poblaciones fue media (0,63) y su rango fue desde 0,50 (Sajonia) a 0,65
(Fundo Escuadrn). Es importante resaltar que la poblacin de Isla Mocha a
pesar de tener menor nmero de individuos muestreados (19) y representar una
poblacin finita, presenta un valor de diversidad gentica (H), de heterocigosidad
esperada y de riqueza allica (Rs) similares a los encontrados en las dems
poblaciones trabajadas (Tabla 5).
El nmero de alelos por locus (Na) para todas las poblaciones analizadas fue
de 4,6 y su rango fue de 3,2 (poblaciones de Malleco e Isla Mocha) a 4,4
(Armerillo, San Fabin y Sajonia). Por otro lado el nmero efectivo de alelos por
locus (Ne) para el total de las poblaciones fue de 3,04 con un rango entre 2,13
(Chilo) y 3,19 (Fundo Escuadrn). La media para la riqueza allica (Rs) fue de
2,42 con un rango entre 2,24 (Sajonia) y 2,67 (Fundo Escuadrn) (Tabla 5).

43
Tabla 5. ndices de diversidad gentica para 11 poblaciones de avellano
Poblacin Ubicacin x cordillera N Na Ne H Ho He Rs
Armerillo (Ar) Andes 30 4,4 2,45 0,56 0,24 0,57 2,46

Los Queules (Lq) Costa 30 4,2 2,94 0,61 0,30 0,62 2,66
San Fabin (Sf) Andes 30 4,4 2,99 0,62 0,37 0,63 2,60
Fundo Escuadrn (Fe) Costa 30 4,2 3,19 0,64 0,35 0,65 2,67
Contulmo (Ct) Costa 30 4,0 2,74 0,59 0,42 0,59 2,52
Malleco (Ma) Andes 30 3,2 2,22 0,52 0,34 0,53 2,27
Isla Mocha (Im) Costa 19 3,2 2,36 0,55 0,30 0,56 2,32
Oncol (On) Costa 30 4,0 2,48 0,57 0,37 0,58 2,36
Huilo Huilo (Hu) Andes 30 3,4 2,46 0,51 0,24 0,52 2,29
Sajonia (Sa) Costa 30 4,4 2,53 0,49 0,29 0,50 2,24
Chilo (Ch) Costa 30 4,0 2,13 0,52 0,25 0,53 2,27
Global 319 4,60 3,04 0,64 0,32 0,64 2,42
Heterocigosidad observada (Ho), Heterocigosidad esperada (He), Nmero de alelos por locus (Na), Nmero
efectivo de alelos por locus (Ne), Diversidad Gentica de Nei's (H, 1973), Riqueza allica (Rs) de cada poblacin
de Gevuina avellana
Figura 5. Diversidad gentica de Nei segn ubicacin geogrfica en la cordillera de los Andes
y la cordillera de la Costa. Siendo la poblacin de Armerillo la ms al norte del rango de
distribucin

44
3.3. DIFERENCIACIN GENTICA DE LAS POBLACIONES
El coeficiente de consanguinidad o endogamia dentro de las poblaciones (Fis),

calculado con cinco loci microsatelitales para el total de las poblaciones de
avellano es positivo (0,43) y su rango para cada locus se encuentra de 0,258
(Ga68) a 0,862 (Ga94) (Tabla 6). En general, la mayora de los loci utilizados
presentan un significativo dficit de heterocigotos (considerando el equilibrio de
HardyWeinberg), con solo algunos loci en equilibrio en algunas poblaciones
(Tabla 7). Adicionalmente, el anlisis de estimacin de alelos nulos, arroj que
podran estar presentes alelos nulos en los loci Ga94 y Ga88 para todas las
poblaciones, el locus Ga92 para las poblaciones de Armerillo, Los Queules, San
Fabin, Fundo Escuadrn, Contulmo, y Huilo Huilo, en el locus Ga49 para las
poblaciones de Armerillo, Sajonia y Chilo, en el locus Ga68 para las poblaciones
de Los Queules, San Fabin, Fundo Escuadrn, Isla Mocha y Huilo Huilo (Tabla
8).
El anlisis de la distribucin de la diversidad gentica entre las distintas

poblaciones, se realiz mediante el ndice de diferenciacin gentica (Fst), que
explica los cambios en la heterocigosidad debido a la subdivisin poblacional y
deriva gnica, estimando la diferenciacin gentica existente entre las
poblaciones. Los valores de Fst van entre el rango de 0 a 1, donde el primero,
significara frecuencias allicas idnticas entre poblaciones, representando la
inexistencia de diferenciacin gentica entre ellas y el segundo, resultara de una
diferenciacin mxima de las frecuencias gnicas, indicando fijacin de alelos

45
alternativos en las poblaciones (Hartl & Clark, 1997). Los resultados arrojan una
moderada pero significativa diferenciacin entre las poblaciones de avellano
(Fst=0,118; P<0,001). Para cada uno de los loci la mayor diferenciacin gentica
entre las poblaciones fue en el locus Ga68 con un Fst = 0,179 y el locus que
menor diferenciacin present fue el Ga92 (Fst = 0,047 - Tabla 6).
Adicionalmente al realizar el clculo de los Fst entre poblaciones (Anexo 1) se

encontr que nicamente entre las poblaciones de Los Queules y Fundo
Escuadrn el Fst multilocus no fue significativamente distinto de cero (P=0,22).
En cambio, en la poblacin de Armerillo se observa una moderada diferenciacin
respecto de las otras poblaciones estudiadas y una muy grande diferenciacin con
Malleco, Huilo-Huilo, Isla Mocha y Sajonia (Fst = 0,25; 0,23; 0,27 y 0,31
respectivamente, P0,001). Igualmente la poblacin de Sajonia mostr una gran
diferenciacin gentica, presentando valores de Fst=0,21 y 0,22 significativos
(P0,0001) al compararla con las poblaciones de San Fabin y Chilo
respectivamente (Figura 6).
Los ndices de fijacin global (Fit) para el total de las poblaciones es positivo
(0,505) y su rango para cada locus va de 0,341 (Ga92) y 0,884 (Ga94) (Tabla 6).
Con respecto al flujo gnico (Nm) para todos los loci fue de 1,87 y su rango para
cada locus va de 1,315 (Ga94) y 5,071 (Ga92) (Tabla 6).

46
Al analizar la distancia gentica de Nei entre pares de poblaciones se encontr

que la mayor distancia fue entre las poblaciones de Armerillo - Malleco (0,66) y la
menor distancia gentica se encontr entre las poblaciones de Malleco - Oncol;
Malleco Sajonia y Oncol - Chilo (0,06) (Tabla 9).
Tabla 6. Estadsticos F calculados para cada locus y para todos los loci (total)
Locus 2n Fis Fit Fst Nm

Ga94 636 0,862 0,884 0,160 1,315
Ga88 638 0,460 0,512 0,098 2,306
Ga92 638 0,309 0,341 0,047 5,071
Ga49-2 546 0,337 0,413 0,116 1,915
Ga68 638 0,258 0,383 0,179 1,145
Total 0,438 0,505 0,118 1,87
Fis= Coeficiente de consanguinidad, Fit = ndice de Fijacin global, Fst = ndice de Fijacin, Nm = Flujo
gnico estimado como Fst = 0,25 (1 - Fst)/Fst
Tabla 7. Clculo del equilibrio de HardyWeinberg en 11 poblaciones de avellano
Poblacin/Locus Ga94R Ga88 Ga92 Ga49-2 Ga68

Armerillo (Ar) *** *** *** ** ns
Los Queules (Lq) *** *** ns ns ***
San Fabin (Sf) *** *** *** ns **
Fundo Escuadrn
*** *** *** ns *
(Fe)
Contulmo (Ct) *** *** ns ns ns
Isla Mocha (Im) *** *** ns ns ***
Malleco (Ma) *** *** ns ns ns
Oncol (On) *** *** ns ns ***
Huilo Huilo (Hu) *** *** * * ***
Sajonia (Sa) *** *** ns *** ns
Chilo (Ch) *** *** ns *** ***
Grado de significancia prueba de Chi2: ns=no significativo; * P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001

47
Tabla 8. Frecuencias esperadas de alelos nulos en 11 poblaciones de Gevuina avellana
Poblacin/Locus Ga94 Ga88 Ga92 Ga49 Ga68

Armerillo 0,2849* 0,224* 0,2377* 0,2082* 0,0482
Los Queules 0,2725* 0,2471* 0,1096* 0,074 0,2082*
San Fabin 0,3081* 0,1924* 0,2186* -0.047 0,1489*
Fundo Escuadrn 0,2689* 0,1934* 0,1795* 0,0857 0,1492*
Contulmo 0,2737* 0,1778* 0,0897* 0,0746 -0.0583
Malleco 0,2347* 0,2295* 0,0622 0,0099 0,0273
Isla Mocha 0,2495* 0,2368* 0,0968 0,2591 0,1929*
Oncol 0,3469* 0,1148* 0,0636 0,0412 0,0587
Huilo Huilo 0,2753* 0,2275* 0,1266* 0,1203 0,1525*
Sajonia 0,2697* 0,0937* 0,0283 0,2846* -0.003
Chilo 0,3169* 0,1939* 0,0804 0,2678* 0,0354
Calculadas usando el primer estimador de Brookfield (1996) implementado en el programa
MICRO-CHECKER. Significancia P < 0,05 = *
Figura 6. Representacin grfica de los Fst pareados para 11 poblaciones de Gevuina avellana.
Identificacin de las poblaciones Ar: Armerillo; Lq: Los Queules; Fe: Fundo Escuadrn; Ct:
Contulmo; Ma: Malleco; Im: Isla Mocha; On: Oncol; Hu: Huilo-Huilo; Sa: Sajonia y Ch:
Chilo. Circulo verde: Fst no significativo. Crculos azules: poblaciones con mayores valores de
Fst.

48
Tabla 9. Distancia gentica de Nei entre pares de poblaciones de Gevuina avellana
Pop Ar Lq Sf Fe Ct Ma Im On Hu Sa Ch
Ar 0
Lq 0,38 0
Sf 0,20 0,24 0
Fe 0,22 0,15 0,14 0
Ct 0,19 0,14 0,11 0,08 0
Ma 0,66 0,12 0,32 0,17 0,17 0
Im 0,59 0,23 0,37 0,12 0,24 0,10 0
On 0,40 0,14 0,21 0,09 0,09 0,06 0,10 0
Hu 0,53 0,09 0,27 0,17 0,17 0,09 0,21 0,15 0
Sa 0,65 0,22 0,36 0,17 0,20 0,06 0,12 0,14 0,09 0
Ch 0,39 0,13 0,22 0,19 0,14 0,16 0,28 0,06 0,19 0,29 0
3.3.1. Anlisis de correlacin entre distancia gentica y distancia geogrfica de las

poblaciones
Al realizar el test de Mantel considerando 9999 permutaciones, el anlisis arroj

una baja (R2=0,1024) pero significativa relacin entre las distancias genticas y
las distancias geogrficas de las poblaciones (P0,01). Por lo tanto, existe un bajo
aislamiento por distancia entre las 11 poblaciones de G. avellana (Figura 7). Sin
embargo, al realizar el anlisis separando las poblaciones de acuerdo a su
ubicacin por cordillera de la Costa y cordillera de los Andes la correlacin no
fue significativa (R2=0,0245; P=0,54 Costa y R2=0,2517; P=0,31 Andes) entre las
distancias genticas y las distancias geogrficas (Figura 8).

49
Ntotal = 55
; P = 0,01
Figura 7. Correlacin entre distancia gentica y distancia geogrfica de 11 poblaciones de

Gevuina avellana en Chile
; P = 0,31 NAndes = 6
; P = 0,54 NCosts = 21
Figura 8. Correlacin entre distancia gentica y distancia geogrfica de acuerdo a la ubicacin

por cordilleras

50
3.3.2. Anlisis de relaciones genticas de las poblaciones a travs de un rbol

Neighbor-joining (NJ)
Cuando la distancia gentica DA (Nei y col., 1983) se utiliz para construir un

rbol Neighbor-joining (NJ) (Fig. 9), las poblaciones de Armerillo y San Fabin
presentaron una diferenciacin con respecto a las otras poblaciones. En general
se observa que los valores de soporte de los grupos (boostraps) son muy bajos.
(VII)
(VIII)
(VIII)
(IX)
(VII)
(XIV)
(X)
(VIII)
(IX)
(XIV)
(X)
Figura 9. rbol Neighbor-joining (NJ) construido usando distancias genticas DA de 11

poblaciones de Gevuina avellana en Chile. El nmero entre las intersecciones es el porcentaje de
veces que este grupo se mantiene (Valores de boostraps con 1000 repeticiones). El nmero
entre parntesis es la regin donde se encuentra ubicada cada poblacin.

51
3.3.3. Anlisis de relaciones genticas a travs de un anlisis de coordenadas

principales
En la Figura 10 se puede observar el anlisis de coordenadas principales entre

los individuos de avellano, en el cual los tres primeros ejes explican el 27,52%,
19,83% y 18,79% de la variacin gentica entre los individuos, respectivamente,
para un total del 66,05%. Este anlisis muestra nuevamente una baja
diferenciacin gentica entre las poblaciones de avellano, sin lograr diferencias de
agrupamiento por poblacin o ubicacin geogrfica.
Al realizar este anlisis agrupando los individuos de avellano segn su ubicacin

por cordilleras de los Andes (Figura 11) y de la Costa (Figura 12). Los tres
primeros ejes para la cordillera de los Andes explican el 32,42%, 23,22% y
14,49% de la variacin gentica, respectivamente, para un total del 70,25%. Se
observa una tendencia a encontrarse ms cercanos los individuos de la poblacin
de Armerillo con la poblacin de San Fabin y los de las poblaciones de Malleco
y Huilo Huilo. De igual manera se observa una tendencia en la distribucin de
los individuos de las poblaciones de norte a sur (derecha a izquierda) como en su
ubicacin geogrfica.
Para los individuos de las poblaciones ubicadas en la cordillera de la Costa los

tres primeros ejes explican el 27,97%, 20,72% y 17,74% de la variacin gentica
entre los individuos, respectivamente, para un total del 66,42%. Observndose

52
que la mayora de los individuos de Sajonia y Fundo Escuadrn se encuentran

cercanos y que a su vez Los Queules - Contulmo y Chilo estn relativamente
ms cercanos entre si pero sin llegar a formar grupos especficos pues hay
individuos de todas las poblaciones mezclados.
Figura 10. Anlisis de coordenadas principales para los individuos de Gevuina avellana de 11
poblaciones a lo largo de Chile

53
Figura 11. Anlisis de coordenadas principales para los individuos de Gevuina avellana de las
poblaciones de la cordillera de los Andes
Figura 12. Anlisis de coordenadas principales para los individuos de Gevuina avellana de las
poblaciones de la cordillera de la Costa

54
3.3.4. Distribucin de la diversidad gentica en las poblaciones
Los resultados del anlisis de la varianza molecular (AMOVA) para las 11

poblaciones de avellano indican que el mayor porcentaje de variacin est dentro
de las poblaciones con un 88,79%. Seguida de la diversidad gentica presente
entre las poblaciones con un 11,21% del total de la varianza observada (Tabla
10).
Al realizar otro anlisis de AMOVA, para las poblaciones divididas segn su

ubicacin en las cordilleras de los Andes y de la Costa se observa que la mayor
diversidad gentica en las poblaciones de avellano, se encontr principalmente
dentro de las poblaciones con un 89,07% del total de la varianza observada.
Luego le sigui la diversidad gentica presente entre las poblaciones dentro de los
grupos con un 11,57% del total de la varianza observada y finalmente la
variabilidad gentica presente entre los dos grupos fue negativa por tal motivo
fue convertida a cero (Tabla 11).
Tabla 10. Anlisis molecular de varianza (AMOVA) para 11 poblaciones de Gevuina avellana
% del total de
Fuente de variacin g.l. SS Varianza Valor-P
la varianza
Entre las poblaciones 10 100,227 0,15219 11,21 < 0,001
Dentro de las poblaciones 627 756,154 1,20599 88,79 < 0,001

Totales 637 856,381 1,35818
Fst = 0,11206 P<0,001
SS=Suma de cuadrados. g.l. = grados de libertad

55
Tabla 11. Anlisis molecular de varianza (AMOVA). Segn ubicacin geogrfica en la

cordillera de los Andes y la cordillera de la Costa
% del total de
Fuente de variacin g.l. SS Varianza Valor-P
la varianza
Entre los grupos* 1 7,885 0 0% 0,56
Entre poblaciones dentro de los
9 92,342 0,157 11,57% < 0,001
grupos
Dentro de las poblaciones 627 756,154 1,206 89,07% < 0,001
Totales 637 856,381 1,354
FCT: - 0,00641; P = 0,56
FSC: 0,11498; P<0,001
FST: 0,10931; P<0,001
*Dado que la varianza y su porcentaje entre los grupos fueron negativos (-0,008 y -0,64%)
fueron convertidos a cero. SS=Suma de cuadrados. g.l. = grados de libertad
Al realizar el anlisis espacial de varianza molecular (SAMOVA) para definir la

mejor divisin de la diversidad gentica. La cual es la que presenta el mximo
valor de FCT (Anexo 2). Est valor se obtuvo al subdividir las poblaciones en 2
unidades (FCT=0,11920; P=0,10 y FSC=0,053; P=<0,001): (i) Armerillo; (ii) San
Fabin, Los Queules, Fundo Escuadrn, Malleco, Contulmo, Oncol, Huilo
Huilo, Isla Mocha, Sajonia y Chilo. Estos resultados indican que la mayor
diversidad gentica en las poblaciones de avellano, se encontr principalmente
dentro de las poblaciones con un 83,33% (P<0,001) del total de la varianza
observada. Luego le sigui la diversidad gentica presente entre los grupos con
un 11,92% del total de la varianza observada pero est no fue significativa
(P=0,10) y finalmente la variabilidad gentica presente entre las poblaciones
dentro de los grupos fue 4,75% (P<0,001) (Tabla 12).

56
Tabla 12. Anlisis espacial de varianza molecular (SAMOVA) para 11 poblaciones de Gevuina
avellana
% del total de
Fuente de variacin G.l. SS Varianza Valor-P
la varianza
Entre los grupos 1 6158,654 44,13476 11,92% 0,10
Entre poblaciones dentro de

9 11905,235 17,57303 4,75% < 0,001
los grupos
Dentro de las poblaciones 627 193463,732 308,55460 83,33% < 0,001
Totales 637 211527,613 370,26239
FCT: 0,1192; P = 0,10
FSC: 0,0538; P<0,001
FST: 0,1666; P<0,001
Grupo 1 Armerillo. Grupo 2: San Fabin, Los Queules, Fundo Escuadrn, Malleco,
Contulmo, Oncol, Huilo Huilo, Isla Mocha, Sajonia y Chilo
3.4. ESTIMACIN BAYESIANA DE LA ESTRUCTURA GENTICA

POBLACIONAL
Para estudiar si las 11 poblaciones de G. avellana estn estructuradas en funcin

de los genotipos que presentan para los 5 loci evaluados, se utiliz el programa
STRUCTURE 2.3.1. (Pritchard y Wen, 2003). Siguiendo la metodologa descrita
en Evanno y col., (2005), se determin K (tasa de cambio presente en los
valores de la probabilidad en funcin de K), y se represent grficamente este
valor frente a K (Figura 13). Donde se visualiz un pico muy claro en K=3, lo
que parece indicar que los 319 individuos de las 11 poblaciones se agrupaban en
tres poblaciones hipotticas.

57
Figura 13. Representacin grfica de K (Tasa de cambio presente en los valores de la

probabilidad en funcin de K) frente al nmero de cluster posibles (K)
Una vez seleccionado el valor 3 para K, se realiz un promedio de las 20

simulaciones para presentar la combinacin ms probable de genotipos para esa
K (Figura 14). Esta figura muestra a las 11 poblaciones de G. avellana con el
porcentaje de representacin de cada cluster. As, cada poblacin se encuentra
representada por una torta, pudiendo sta mostrar un mximo de 3 fragmentos
coloreados cuyo tamao depender de la probabilidad que tenga cada genotipo
de pertenecer a uno de los 3 cluster detectados en el anlisis. Estas se encuentran
representadas por un color predominante: rojo, verde y azul, respectivamente.
Los grupos genticos identificados por STRUCTURE 2.3.1., en congruencia

con todas las otras estimaciones, apoya la poca diferenciacin gentica y alta

58
similitud entre las poblaciones por la asignacin de los individuos de forma

probabilstica a los diferentes hemisferios para los mismos grupos genticos
(Figura 14). De igual manera, se observa como la mayor parte de la poblacin de
Armerillo se encuentra formada principalmente por la mezcla gentica de la
poblacin de color blanco cluster 3 (50%), por otro lado la poblacin de
Sajonia se encuentra con mayor color rojo cluster 2 (50%) y la poblacin de
Contulmo con mayor color azul cluster 1 (39%).
Cluster 1 Cluster 2 Cluster 3
Figura 14. Representacin grfica de la estructura gentica de las 11 poblaciones de Gevuina

avellana estudiadas determinada con anlisis Bayesiano. Destacando el grado de mezcla gentica
que presenta de cada una de las 3 poblaciones hipotticas detectadas en el anlisis con el
programa STRUCTURE 2.3.1., representadas cada una por un color diferente

59
4. DISCUSIN
4.1. DESARROLLO DE MARCADORES EST-SSR EN Gevuina avellana
En el presente trabajo, la utilizacin de marcadores EST-SSR ha permitido

determinar la diversidad gentica y su distribucin dentro y entre poblaciones de
avellano, siendo esta informacin importante para el establecimiento de
estrategias de conservacin y mejoramiento gentico de esta especie.
Los marcadores tipo EST-SSR suelen ser menos polimrficos que los de tipo
SSR de ADN genmico debido a la localizacin de las secuencias en los genes
(Ellis y Burke 2007). Los datos encontrados en G. avellana apoyan esto, puesto
que ocho (40%) de 20 marcadores EST-SSR fueron polimrficos. Sin embargo,
este valor es bajo comparado con otros estudios, por ejemplo en el estudio de
Pan y col., (2009) determinaron que 20 (87%) de 23 de los marcadores EST-SSR
desarrollados para el estudio de la diversidad gentica en Nelumbo nucifera fueron
polimrficos. As como el estudio de Tang y col (2009) en diferentes especies de
Iris, donde encontraron que el 80% de los marcadores EST-SSR eran
polimrficos. En el estudio realizado por Ellis y col. (2006) en tres especies de
Helianthus encontraron que el polimorfismo de los marcadores utilizados variaba
dependiendo de la especie estudiada. Para H. verticillatus 18 de 22, para H.
angustifolius 13 de 19 y para H. grosseserratus 19 de 21 marcadores fueron
polimrficos.

60
En cuanto al nmero de alelos por locus en este estudio para los ocho loci
caracterizados con 40 individuos de 10 poblaciones de avellano fue de dos a ocho
con un promedio de 4,4. Estos valores son superiores a los encontrados en el
trabajo realizado por Pan y col. (2009), ya que ellos para los 20 loci utilizados
obtuvieron de dos a cinco alelos por locus. Sin embargo al comparar los EST-
SSR con SSR genmicos los resultados fueron similares. Por ejemplo para cuatro
especies chilenas de Nothofagus, determinaron de dos a seis alelos para tres loci
polimrficos (Azpilicueta y col., 2004); en N. nucifera determinaron un rango de
dos a cinco alelos por locus (Kubo y col., 2009) y de dos a siete alelos por locus
(Tian y col., 2008). Pinto y col. (2006) reporta que los SSR y los EST-SSR son
similares en el nmero de alelos por locus.
La frecuencia y distribucin de repeticiones de tripletes, han sido reportadas

como los motivos dominantes en muchas especies de plantas, incluyendo varios
cereales (La Rota y col., 2005), algodn (Han y col., 2006) y trigo (Peng y Lapitan
2005). En algunos estudios de animales, los SSR formados por dinucletidos han
aparecido como el principal motivo detectado (Wang y col., 2005; Yu y Li 2008
citados por Pan y col., 2009). En el presente estudio, las repeticiones de tipo
dinucletido (90%) se encontraron como el motivo ms abundante, esto dado al
uso de la sonda (AG)8 para la preseleccin de las secuencias; seguida de
repeticiones trinucletidas (10%). El motivo AG/GA es el ms frecuente
encontrado en los genomas de otras plantas (Lagercrantz y col., 1993; Kumpatla
y Mukhopadhyay, 2005), lo que se presume es la causa de la alta incidencia de Ala
(AGA) y Leu (GAG) en la composicin de los aminocidos (8% y 10%,

61
respectivamente) (Kantety y col., 2002). En G. avellana slo se encontraron dos

tipos de trinucletidos repetidos (motivo TCT y GAT).
4.2. DIVERSIDAD GENTICA
El estudio de la diversidad gentica dentro de poblaciones naturales y sus

parientes cultivados es importante para la conservacin y la explotacin de los
recursos genticos para el mejoramiento de especies con importancia econmica
(Varshney y col., 2005).
De acuerdo a una revisin realizada por Nybom (2004), para estudios de

microsatlites (SSR), encontr un promedio de diversidad gentica para plantas
perennes de corta duracin de H=0,55 y para especies de polinizacin cruzada de
H=0,65. Coincidente con ello Gevuina avellana (especie alogama) present una
diversidad relativamente alta (H=0,64) con un rango de 0,49-0,64 en las distintas
poblaciones.
La alta diversidad gentica encontrada en Gevuina avellana puede verse

influenciada por algunos rasgos de la historia de vida de la especie. Especial
importancia adquiere su tipo de reproduccin, la cual se ha demostrado afecta en
gran medida la distribucin y magnitud de la diversidad gentica en poblaciones
vegetales. Especies de polinizacin cruzada tienden a tener mayor diversidad
gentica dentro de las poblaciones, mientras que las especies de autofecundacin

62
o con un sistema de apareamiento mixto a menudo son genticamente menos

variables (Loveless y Hamrick, 1984; Nybom, 2004; Duminil y col., 2007). Tapia
y Neira (2000) determinaron que G. avellana es predominantemente de
polinizacin cruzada y al parecer ha desarrollado caractersticas morfolgicas y
estratgicas promotoras de la polinizacin cruzada, explicndose de esta forma la
alta diversidad descrita en este trabajo.
Sin embargo, se pudo establecer una disminucin de la diversidad gentica en

las poblaciones de norte a sur. Este patrn es aun ms claro en las poblaciones de
la cordillera de la Costa. Esto podra deberse a que el rea de refugio ms
importante durante la ltima glaciacin se encuentra en la cordillera de
Nahuelbuta y sectores costeros, entre los 37 - 39 Sur, generando la progresiva
expansin del bosque postglaciacin desde Chile centro - sur hasta la Tierra del
Fuego, y desde la cordillera de la Costa a la cordillera de los Andes (Armesto y
col., 1995). Est tendencia ha sido reportada en otros estudios de diversidad
gentica con diferentes marcadores moleculares. Como es el caso del Copihue
con ISSR donde se encontr una disminucin de la diversidad de norte a sur
(Hoffens, 2009). Utilizando el mismo tipo de marcador en Nothofagus obliqua en
Argentina, se determin una tendencia a la disminucin de la diversidad gentica
de norte a sur y de este a oeste, concordando con posibles refugios alejados de la
regin cubierta por los hielos en el ltimo mximo glacial (Donoso y col., 2004).
As mismo en un estudio de Austrocedrus chilensis con isoenzimas se encontr un
patrn de distribucin de la diversidad gentica con una tendencia a seguir el
gradiente latitudinal, resultando ms variables las poblaciones del norte. Estudios

63
realizados con marcadores izoenzimticos en poblaciones argentinas y chilenas

de Nothofagus nervosa describen de igual manera diferencias entre las cordilleras de
la Costa y de los Andes y en esta ltima, dos grandes grupos de poblaciones
separadas en sentido norte-sur (Carrasco y Eaton, 2002).
La tendencia general a la disminucin de la diversidad gentica de norte a sur

de las poblaciones de avellano, puede ser explicada por dos hechos. El primero
de ellos es que el avellano es una especie termfila, y por lo tanto, las poblaciones
ubicadas ms al sur presentan una mayor presin de seleccin debido a la
disminucin de las temperaturas. El segundo hecho radica en que debido a que la
recolonizacin postglacial del bosque se desarroll de norte a sur (Villagrn y
Armesto, 1993), es probable que al igual que otras especies, el avellano haya
sufrido una prdida de alelos producto de cuellos de botella ocurridos durante el
proceso migratorio (Wheeler y Guries, 1982). Debido a lo anterior, mientras ms
al sur se encuentran las poblaciones de avellano, menor sera la diversidad
gentica de stas. Por otro lado, estudios en otras especies de rboles del sur de
Sur Amrica con diferentes marcadores moleculares (Aloenzimas, RAPD e ISSR
han demostrado la influencia de las glaciaciones en la distribucin de la
diversidad gentica (Premoli 1997; Marchelli y col., 1998; Allnutt y col 1999;
Bekessy y col 2002; Torres-Daz y col., 2007). Durante los ciclos interglaciares en
el periodo cuaternario, muchos glaciares cubrieron las montaas del sur, excepto
las laderas costeras (Heusser y col 1988, citado por Garca-Gonzles y col., 2008)
y algunos parches libres de hielo sirvieron como refugios glaciares (Markgraf y
col., 1995).

64
La moderada diferenciacin gentica encontrada en las poblaciones sugiere que

no se necesita un nmero muy grande de poblaciones para conservar el pool
gentico del avellano. Adicionalmente la abundancia en su rango de distribucin,
su plasticidad fenotpica, su facilidad para regenerarse en diferentes ambientes
hace que esta especie no se encuentre amenazada de extincin. Sin embargo, el
hecho de que las reas silvestres protegidas de Chile se encuentren distribuidas en
forma desigual, concentrndose fuertemente en la zona andina de las XI y XII
regiones y escasamente entre las regiones IV y X, ha provocado la casi total
degradacin de los bosques costeros de Chile continental, especialmente en la
cordillera de la Costa de la 7 y 8 Regin (Armesto y col., 1994; Armesto y col.,
1992). Puesto que es all donde se encuentran las poblaciones de avellano con la
mayor diversidad gentica y la mayor riqueza allica, el establecimiento de
estrategias de conservacin para las poblaciones ubicadas en el centro de su
distribucin geogrfica es muy importante.
Una eficiente estrategia de conservacin requiere preservar la integridad del

acervo gentico de las especies a travs de la inclusin en reas protegidas de
poblaciones que contengan una elevada diversidad gentica o variantes genticas
nicas (Lara y Veblen, 1993). De acuerdo a los resultados encontrados en este
estudio las poblaciones de Armerillo y San Fabin deberan ser consideradas
prioritariamente en un programa de conservacin y mejoramiento gentico
debido a que presentan una alta diversidad gentica, un mayor nmero de alelos
privados y una mayor diferenciacin gentica de las restantes poblaciones.
Adicionalmente se deberan considerar las poblaciones ubicadas en el centro del

65
rango de distribucin de la especie puesto que poseen los niveles ms altos de

diversidad gentica y de riqueza allica que actualmente no se encuentran
resguardados en reas protegidas por el estado.
Por otro lado, el coeficiente de consanguinidad (Fis) fue ms alto (Fis global =
0,43) que el reportado para otras especies como el girasol (0,26; Ellis y col.,
2006); Athyrium distentifolium (0,24, Woodhead y col., 2005); Miconia calvescens (0,27;
Le Roux y col., 2008). En este estudio, la mayora de los loci estudiados se
desviaron de forma significativa del equilibrio de Hardy-Weinberg. Sin embargo,
algunos marcadores mostraron equilibrio en parte de las poblaciones. La
deficiencia de heterocigotos en las poblaciones de G. avellana puede ocurrir como
resultado de la presencia de alelos nulos, la seleccin en contra de los
heterocigotos, el efecto Wahlund (reduccin de heterocigosis en una poblacin
causado por la estructura de la subpoblacin) y de la endogamia.
Los marcadores EST-SSR pueden presentar alelos nulos, los cuales no se

amplifican debido a variaciones en la secuencia del partidor, y por lo tanto no
producen un amplicn visible, de acuerdo a lo observado en este estudio para
algunos marcadores en algunas poblaciones. Es por esto que individuos que son
heterocigotos para un alelo nulo pueden aparecer como homocigotos para el
alelo visibles, mientras que homocigotos para el alelo nulo no generan
amplificacin. Cuando estn presentes en una poblacin, los alelos nulos generan
sesgo en las frecuencias allicas, reduciendo la heterocigosidad observada, y por
lo tanto aumentando los niveles aparentes de endogamia (DeWoody y col., 2006).

66
En su tendencia a dispersarse ampliando sus reas de distribucin, las especies

se encuentran con cambios muy severos del medio ambiente y frente a ellos
adquieren adaptaciones que los pueden conducir a variaciones genticas a travs
del mecanismo de seleccin (Donoso, 1993). Sin embargo, ante ciertas presiones
ambientales severas es posible que la variacin gentica se vea limitada y que la
especie se adapte a la severidad de un factor mediante plasticidad. Una situacin
de este tipo se puede observar en G. avellana, donde segn Steubing y col. (1983,
citado por Donoso, 1993), existe una clara adaptacin al fro, con un rango
definido de tolerancia a la baja temperatura a travs de sus estadios de
crecimiento.
Otra manera en que virtualmente todas las especies y poblaciones fallan en

tener cruzamientos al azar es debido al efecto Wahlund. Los individuos tienden a
cruzarse con aquellos que estn cerca y que son genticamente similares
produciendo endogamia biparental. Incluso dentro de un rea bastante pequea,
la polinizacin con el vecino ms cercano en las plantas con flores puede causar
que los cruzamientos sean seleccionados geogrficamente de manera no al azar.
Los efectos de los cruzamientos locales imitarn aquellos de la endogamia dentro
de una poblacin panmctica causando reducida heterocigosis e ndices de
fijacin de Wright significativamente diferentes de cero debido a la estructura
sub-poblacional (Hartl y Clark, 1997).
El alto dficit de heterocigotos encontrado en este estudio en algunas

poblaciones tambin puede estar relacionado con la capacidad de esta especie de

67
aparearse con un medio-hermano. Este comportamiento se ve favorecido ya que

en un individuo existe una maduracin gradual de sus flores y de los primordios
seminales, lo que hace posible la fecundacin de los vulos con polen transferido
al estigma desde rboles cercanos, por las sucesivas visitas de la entomofauna
asociada a esta especie (Vera y Rivero, 2002). En especies que ocurren en parches
y/o poseen limitada dispersin de semillas, el flujo gnico va polen tendr un
papel vital en mantener la diversidad dentro de las poblaciones. La reducida
dispersin del polen y de las semillas puede dar lugar al agrupamiento espacial de
individuos emparentados (Linhart y Grant, 1996), lo que permite cierta
endogamia que conduce a ms homocigotos de lo esperado.
Debido a que los marcadores de tipo EST-SSR estn asociados a las regiones
transcritas del genoma, pueden estar sujetos a seleccin, ya que estn
directamente relacionados con la sobrevivencia de las especies a diversos
ambientes (Frankham y col., 2002). Los resultados encontrados en el avellano
pueden estar dados a que en especies ampliamente distribuidas las diferencias
fenotpicas y genotpicas son frecuentemente el resultado de la seleccin natural,
que define ecotipos respecto a gradientes ambientales de humedad y/o
temperatura (Abrams y col., 1992). Esto permite pensar en la existencia de
diferenciacin genecolgica (variacin gentica de las poblaciones de una especie
en relacin o determinada, por la variacin del hbitat) en algunos locus
estudiados, puesto que no todos presentan la desviacin del equilibrio de Hardy-
Weinberg en las poblaciones.

68
Este ltimo caso podra verse reflejado en el locus Ga49-2. Sin considerar la
poblacin de Armerillo, que en muchos parmetros presenta diferencias claras
con las restantes poblaciones. Se aprecia que para este locus existe equilibrio en
las poblaciones ms septentrionales y solo existe una deficiencia de heterocigotos
en las tres poblaciones ms australes (Sajonia, Chilo y Huilo Huilo).
4.3. ESTRUCTURA GENTICA POBLACIONAL
Los valores de diferenciacin gentica de Gevuina avellana en este estudio fueron

moderados con un valor de Fst=0,118. Est valor de diferenciacin poblacional
es similar a los reportados en otros estudios de poblaciones de plantas (Petit y
col., 2005). Lo anterior puede deberse a que a pesar de los eventos glaciares, el
cambio climtico post-glacial y el impacto humano reciente, el flujo de genes
aparentemente ha sido fuerte entre las poblaciones. Este hecho tambin es
apoyado por los resultados obtenidos en el test de Mantel, con el cual se detect
una baja pero significativa correlacin (R2=0,1024; P0,01) entre la distancia
gentica y la distancia geogrfica entre las poblaciones (Fig. 7). Esto concuerda
parcialmente con lo expuesto por Solbrig (1970), quien seala que en general, si
existe una distribucin continua de la especie, como lo es para el avellano, se
espera que a una menor distancia geogrfica entre las poblaciones, menor debera
ser la distancia gentica entre ellas, puesto que habra un mayor flujo de genes. Lo
anterior se debe a que el flujo gnico es un componente principal de la estructura
poblacional porque determina hasta qu punto cada poblacin local de una
especie es una unidad evolutiva independiente (Slatkin 1985; 1987; 1994).

69
Sin embargo, los resultados obtenidos en el test de Mantel separando entre

poblaciones de ambas cordilleras (Figura 8) muestran que la correlacin entre
distancias genticas y distancias geogrficas no son significativas, lo cual se puede
interpretar como que el flujo de genes ha sido constante. La alta diferenciacin y
distancia gentica reflejadas en el rbol Neighbor-joining (NJ) presentada entre
Armerillo, San Fabin y las dems poblaciones, podra ser explicada a que estas
poblaciones por su ubicacin geogrfica pueden verse afectadas en la
conectividad gentica con las dems poblaciones, lo que conllevara a un aparente
aislamiento y por ende a un menor flujo de genes hacia ellas, diferencindolas
genticamente de las otras, sin embargo el porcentaje de Boostrap es del 64%.
De igual forma, el anlisis de coordenadas principales (PCA) no agrupa a los

individuos por localizacin geogrfica en un grupo definido, sin ninguna
definicin de subgrupos asociados a distribucin geogrfica. La presencia de
individuos de todas las poblaciones dispersos puede sugerir la conexin gentica
entre las poblaciones sin importar los lmites geogrficos y/o la migracin de los
individuos de una poblacin a otra.
Estos resultados tambin son avalados por los anlisis AMOVA realizados para
el total de las poblaciones. La descomposicin de la varianza muestra un bajo
porcentaje (11,21%) de ella entre las poblaciones y un alto porcentaje (88,79%)
dentro de estas. De igual forma al organizar las poblaciones segn su localizacin
en la cordillera de la Costa o de los Andes. Esta descomposicin de la varianza
muestra un bajo porcentaje (11,57%) de ella entre las poblaciones y un alto

70
porcentaje dentro de estas (89,07%), no existiendo diferencia entre la cordillera

de la Costa y la cordillera de los Andes.
As mismo, al agrupar las poblaciones en 2 conjuntos segn los resultados del

anlisis de SAMOVA, el porcentaje de variacin sigue siendo mayor dentro de las
poblaciones, y la diferencia entre los grupos no es significativa (11,92%; P=0,10).
La distribucin de la diversidad gentica de las poblaciones de G. avellana

encontrada en este estudio, es decir, alta dentro y baja entre poblaciones; se
podra explicar por dos razones: En primer lugar, puede estar dada por su ciclo
de floracin y reproduccin. Su floracin varia entre 30 y 45 das desde el inicio
de la formacin de yemas o flores hasta que el 50% de las flores estn en antesis,
es decir, totalmente desarrolladas o en fertilizacin (Medel y col., 2004) lo que
conllevara a una sobreposicin de la floracin en los diferentes sectores y
poblaciones. Esto permite que los polinizadores tengan un mayor tiempo en el
cual pueden realizar la polinizacin y una mayor zona para su dispersin
disminuyendo as la subdivisin dentro de las poblaciones y prevendra la
divergencia entre las poblaciones. En segundo lugar, a excepcin de la zona
donde se encuentra ubicada la poblacin de Armerillo, no hay barreras fsicas
aparentes (cadenas montaosas, corrientes de agua, desiertos) para la migracin
de los individuos entre las poblaciones. De hecho, las especies de rboles con
reproduccin cruzada y distribucin continua tienden a presentar una alta
diversidad dentro de las poblaciones y una baja a moderada diferenciacin de las
poblaciones (Hamrick y Nason, 2000), como una consecuencia del alto flujo de

71
genes entre las poblaciones. Este efecto ha sido comprobado en algunos estudios
realizados con diversos marcadores moleculares y genticos en poblaciones de
especies chilenas que se encuentran en los bosques formando parte de la
comunidad arbrea donde habita el avellano. Por ejemplo, el Raul - Nothofagus
nervosa (Aloenzimas - Carrasco y Eaton, 2002; RAPD Carrasco y col., 2009); el
Alerce - Fitzroya cupressoides (RAPD - Allnutt y col., 1999); el Queule - Gomortega
keule (ISSR Herrera y col., 2005).
Adicionalmente, es de destacar que los roedores del campo se alimentan de las

avellanas desde el suelo. Se ha observado en la cordillera de Nahuelbuta, en
algunos bosques de G. avellana, que los roedores, actan como eficientes
diseminadores de semillas. Al transportar frutos a sus madrigueras ms alejadas y
dejando caer algunos en el camino, los cuales logran germinar y establecerse
(Donoso y col., 2006). Por lo que probablemente desempean un papel eficaz en
la diseminacin de las semillas especialmente entre poblaciones cercanas,
reduciendo las diferencias genticas.

72
5. CONCLUSIONES

Los marcadores EST-SSR desarrollados para el avellano chileno (Gevuina

avellana) permitieron caracterizar la diversidad gentica y su distribucin en las
poblaciones estudiadas de esta especie.
La diversidad gentica del avellano se encuentra disminuida de norte a sur de su

rango de distribucin.
Las poblaciones de avellano presentaron altos niveles de diversidad gentica la

cual se encuentra principalmente dentro de las poblaciones mostrando una baja
estructuracin entre poblaciones.
La distancia geogrfica entre las poblaciones de avellano se encuentra poco

correlacionada con la distancia gentica de las mismas, haciendo que estn
moderadamente diferenciadas indicando que existe un alto flujo gnico sin
importar su ubicacin geogrfica.

73
El dficit de heterocigotos encontrado en las poblaciones de avellano est dado

por la presencia de alelos nulos o la seleccin a la cual estn sometidos los
marcadores del tipo EST-SSR.
La poblacin de Armerillo present un mayor grado de diferenciacin gentica

con respecto a las restantes poblaciones estudiadas.
Las poblaciones de la zona norte del rea de distribucin del avellano son
prioritarias para su inclusin en un programa de conservacin y mejoramiento
gentico.

74
6. BIBLIOGRAFIA
Abrams M.D., Kloeppel B.D. y Kubiske M.E. 1992. Ecophysiological and

morphological responses to shade and drought in two contrasting
genotypes of Prunus serotina. Tree Physiology. 10: 343-355.
Allnutt T. R., Newton A. C., Lara A.., Premoli A., Armesto J. J., Vergara R. y
Gardner M. 1999. Genetic variation in Fitzroya cupressoides (alerce), a
threatened South American conifer. Molecular Ecology. 8: 975-987.
Arismendi N., Andrade N., Riegel R., y Carrillo R. 2010. Detection and
identification of a phytoplasma associated to witches broom disease in
Ungi milinae Turcz. and Gaultheria phyllyreifolia (Pers) Sleumer by DAPI,
PCR and DNA sequencing. Chilean Journal of Agricultural Research. En
prensa.
Armesto J., Smith-Ramrez C., Len P. y Arroyo M. K. 1992. Biodiversidad y

conservacin del bosque templado en Chile. Ambiente y desarrollo.
Diciembre: 19-24.
Armesto J., Villagrn C. y Donoso C. 1994. Desde la era glacial a la industrial. La

historia del bosque templado. Ambiente y Desarrollo. 10: 66-72.

75
Armesto J., Rozzi R. y Len-Lobos P. 1995. Ecologa de los bosques chilenos:

sntesis y proyecciones. En: Ecologa de los Bosques Nativos de Chile.
Armesto, J., Villagrn, C. y Kalin, M. (Eds.). Editorial Universitaria.
Santiago, Chile. 470 Pp.
Ayad W. G., Hodgkin T., Jaradat A. y Rao V. R. 1997. Molecular genetic

techniques for plant genetic resources (report of an IPGRI workshop, 9-
11 October 1995, Rome, Italy). International Plant Resources Institute,
Rome.
Azofeifa-Delgado A. 2006. Uso de marcadores moleculares en plantas;

Aplicaciones en frutales del trpico. Agronoma Mesoamericana. 17: 221-
242.
Azpilicueta M. M.., Caron H.., Bodns C. y. Gallo L. A. 2004. SSR markers for
analysing South American Nothofagus species. Silvae Genetica. 53: 240-243.
Bekessy S. A., Allnutt T. R., Premoli A. C., Lara A., Ennos R. A., Burgman M.
A., Cortes M. y Newton A. C. 2002. Genetic variation in the vulnerable
and endemic Monkey Puzzle tree, detected using RAPDs. Heredity. 88:
243-249.
Besnard G., Achere V., Rampant P.F., Favre J.M. y Jeandroz S. 2003. A set of
cross-species amplifying microsatellite markers developed from DNA
sequence databanks in Picea (Pinaceae). Molecular Ecology Notes. 380-383.

76
Boches P.S., Bassil N.V. y Rowland L.J. 2005. Microsatellite markers for
Vaccinium from EST and genomic libraries. Molecular Ecology Notes. 657-
660.
Borrone J. W., Schnell R. J., Violi H. A. y Ploetz R. C. 2007. Seventy

microsatellite markers from Persea Americana Miller (avocado) expressed
sequence tags. Molecular Ecology Notes. 7: 439-444.
Bouck A y Vision T. 2007. The molecular ecologists guide to expressed

sequence tags. Molecular Ecology. 16: 907-924.
Campos H. 1995. Molecular markers: concepts. Agro-Sur. 23: 68-75.
Carrasco B. y Eaton L. 2002. Natural history and genetic structure of Raul

(Nothofagus nervosa (Phil.) Dim. Et Mil.). Forest Genetics 9: 275-284.
Carrasco B., Garnier M., Eaton L., Guevara R., y Car M. 2009. Proximal causes
of genetic variation between and within populations of raul (Nothofagus
nervosa). Ciencia e Investigacin Agraria. 36: 229-238.
Chagne D., Chaumeil P., Ramboer A., et al. 2004. Cross-species transferability
and mapping of genomic and cDNA SSRs in pines. Theoretical and
Applied Genetics. 109: 1204-1214.

77
Coulibaly I., Gharbi K., Danzmann R.G., Yao J. y Rexroad C.E. 2005.
Characterization and comparison of microsatellites derived from repeat-
enriched libraries and expressed sequence tags. Animal Genetics. 36: 309-
315.
Da Silva J. 2001. Preliminary analysis of microsatellite markers derived from

sugarcane expressed sequence tags (ESTs). Genetics and Molecular
Biology. 24: 155-159.
Davies N., Villablanca F.X., Roderick G.K. 1999. Determining the source of
individuals: multilocus genotyping in nonequilibrium population genetics.
Trends Ecology Evolution. 14: 17-21.
DeWoody J, Nason J. D, Hipkins V. D. 2006. Mitigating scoring errors in

microsatellite data from wild populations. Molecular Ecology Notes. 6:
951-957.
Donoso C. 1978. Antecedentes sobre la produccin de avellanas. Bosque. 2: 105-

109.
Donoso C. 1993. Bosques Templados de Chile y Argentina. Variacin,

Estructura y Dinmica. Editorial Universitaria. Santiago, Chile.
Donoso, C., Gallo, L, Donoso, P. y Azpilicueta, M. 2004. Variacin en Nothofagus

obliqua (Mirb.) Oerst. En: Variacin intraespecfica en las especies arbreas

78
de los bosques templados de Chile y Argentina. Donoso, C., Premoli, A.,

Gallo, L. e Lipinza, R. (Eds.). Editorial Universitaria. Santiago-Chile. 420
Pp.
Donoso C., Escobar B. y Medel F. 2006. Gevuina avellana Moll. avellano, Gevin,
Ngefu. En: Las especies arbreas de los bosques templados de Chile y
Argentina. Autoecologa. Marisa Cuneo ediciones. 264-276.
Duminil J., Fineschi S., Hampe A., y col. 2007. Can population genetic structure
be predicted from life-history traits? The American Naturalist. 169: 662-
672.
Dupanloup I., Schneider S. y Excoffier L. 2002. A simulated annealing approach
to define the genetic structure of populations. Molecular Ecology. 11:
2571-2581.
Ellegren H. 2004. Microsatellites: simple sequences with complex evolution.

Nature Review Genetics. 5: 435-445.
Ellis J. R. y Burke J. M. 2007. EST-SSRs as a resource for population genetic

analyses. Heredity. 99: 125-132.
Ellis J. R., Pashley C. H., Burke J. M. y Cauley D. E. M. C. 2006. High genetic

diversity in a rare and endangered sunflower as compared to a common
congener . Molecular Ecology, 10.1111/j.1365-294X.2006.02937.x.

79
Estoup A. y Cournet J. M. 1999. Microsatellite evolution: differences from

populations data. En: Goldstein D. B., Schlotterer, C. (eds),
Microsatellites: Evolution and Applications. Oxford University Press
Oxford. 49-65.
Evanno, G., Regnaut, S. y Goudet, J. 2005. Detecting the number of clusters of

individuals using the software Structure: a simulation study. Molecular
Ecology. 14: 2611-2620.
Excoffier, L., Laval, G. & Schneider, S. 2005. ARLEQUIN ver. 3. 0: an

integrated software package for population genetics data analysis.
Evolutionary Bioinformatics Online. 1: 47-50.
Faccioli P., Pecchioni N., Cattivelli L., Stanca A. M. y Terzi V. 2001. Expressed
sequence tags from cold-acclimatized barley can identify novel plant genes.
Plant Breeding. 120: 497-502.
Falush D., Stephens M. y Pitchard J. K. 2003. Inference of population structure

using multilocus genotype data: Linked loci and correlated allele
frecuencies. Genetics. 164: 1567-1587.
FAO/PNUMA. 1991. Conservacin in situ de recursos genticos. Proyecto

sobre Manejo de Areas Silvestres, Areas Protegidas y Vida Silvestre en
Amrica Latina y el Caribe. http://iufro-
archive.boku.ac.at/iufro/silvavoc/glossary/7_0es.html.

80
Ferreira M. y Grattapaglia D. 1998. Introduccin al uso de marcadores

moleculares en el anlisis gentico. 1ed. EMBRAPA-CENARGEN.
Brasilia, DF. Pg.: 55-62, 121-139.
Frankham R, Ballou J.D. y Briscoe D. 2002. Introduction to Conservation

Genetics, Cambridge University Press, Cambridge.
Garca-Gonzles R., Carrasco B., Peailillo P., Letelier L., Herrera R., Lavandero
B., Moya M. y Caligari D.S.P. 2008.Genetic variability and structure of
Gomortega keule (Molina) Baillon (Gomortegaceae) relict populations:
geographical and genetic fragmentation and its implications for
conservation. Botany. 86: 1299-1310.
Garca-Mas J., Graciano E., Aranzana M., Monforte A., Oliver M., Ballester J.,
Viruel M. y Arus P. 2000. Marcadores de ADN: Concepto, Tipos,
Protocolos. In: Nuez, F. y Carrillo, J. (eds). Los marcadores genticos en la
mejora vegetal. Universidad Politcnica de Valencia, Espaa. 93-151.
Grierson D. y Covey S. N. 1991. Biologa Molecular de las Plantas. Editorial

Acribia, S.A. 243 Pp.
Griffiths A., Gelbart W., Miller J. y Lewontin R. 2000. Gentica Moderna.

Editorial McGraw - Hill - Interamericana. Espaa. 676 Pp.

81
Godoy J.A. 2009. La gentica, los marcadores moleculares y la conservacin de

especies. Ecosistemas. 18: 23-33.
Hamrick J. y Godt M. 1989. Allozyme diversity in plants. In: Population genetics,

breeding and genetic resources. Brown, A., Cleegg, A. y Weir, B. (Eds.).
Sinacur Press, Sunderland, Mass. 43-63.
Hamrick J.L. y Nason J. D. 2000. Gene flow in forest trees. En: Young A, D
Boshier, T Boyle eds. Forest conservation genetics. Principles and practice.
CSIRO-CABI publishing. 81-90.
Han Z, Wang C, Song X, Guo W, Gou J, Li C, Chen X. y Zhang T. 2006.

Characteristics, development and mapping of Gossypium hirsutum derived
ESTSSRs in allotetraploid cotton. Theoretical and Applied Genetics.
112:430-439.
Hancock J. M. 1999. Microsatellites and other simple sequences: genomic context

and mutational mechanisms. En: Goldstein D.B. And Schloeterer, C (eds).
Microsatellites: Evolution and applications. Oxford University Press.
Oxford. 1-9.
Hartl D.L. y Clark A.G. 1997. Principles of Population Genetics. Third Edition.
Sinauer Associates, Inc. Publishers. Massachusetts, USA. 542 Pp.

82
Herrera R., Arias M., Moya-Leon M., Peailillo P., Wilkinson M. J. Y Caligar P.
2005. Genetic variation in a chilean endangered endemic: Gomortega keule
(Molina) Baillon. Biodiversity and Conservation. 14: 2871-2881.
Hodgkin T. 1995. Some current issues in the conservation and use of plant
Genetic Resources. In: Molecular Genetic Techniques for Plant Genetic
Resources. Report of IPGRI workshop 9-11. W.G.Ayad, T. Hodgkin, A.
Jaradat y V.R. Rao, (Eds). October 1995. Rome, Italy. 3-22.
Hoffens, K. 2009. Diversidad gentica en poblaciones de copihue (Lapageria rosea

Ruiz et Pav.) Determinada a travs de marcadores moleculares. Tesis
Doctorado en Ciencias Agrarias. Universidad Austral de Chile. 107 Pp.
Hueck K. 1978. Los bosques de Sudamrica: Ecologa, Composicin e

Importancia Econmica. Sociedad alemana de cooperacin tcnica.
Repblica Federal de Alemania. 478 Pp.
Jimnez P. y Collada C. 2000. Tcnicas para la evaluacin de la diversidad

gentica y su uso en los programas de conservacin. Investigacin Agraria.
2: 237-248.
Jones R., Vaillancourt R. y Jordan G. 2004. Microsatellites for use in Nothofagus

cunninghamii (Nothofagaceae) and related species. Molecular Ecology
Notes. 4: 14-16.

83
Kalinowski S. T. 2005. HP RARE 1.0: a computer program for performing

rarefaction on measures of allelic richness. Molecular Ecology Notes. 5:
187-189.
Kantety R.V., La Rota M., Matthews D.E. y Sorrells M.E. 2002. Data mining for
simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley, maize,
rice, sorghum and wheat. Plant Molecular Biology. 48: 501-510.
Karp A. y Edwards K. J. 1995. Techniques for the analysis, characterization and

conservation of plant genetic resources. In: Molecular Genetic techniques
for plant genetic resources. Report of IPGRI workshop 9-11. W.G.Ayad,
T. Hodgkin, A. Jaradat y V.R. Rao, (Eds).October 1995. Rome, Italy. 3-22.
Koski V., Skroppa T., Paule L., Wolf H. y Turok J. 1997. Technical guidelines for
genetic conservation of Norway spruce (Picea abies L.). European Forest
Genetic Resources Programme (EUFORGEN). International Plant
Genetic Resources Institute (IPGRI).
Kriglyax S., Durret R.T., Schug M. D. y Aquadro C. F. 1998. Equilibrium

distributions of microsatellite repeat length resulting from a balance
between slippage events and point mutations. Proceedings of the National
Academy Sciences. 95: 10774-10778.

84
Kubo N, Hirai M, Kaneko A, Tanaka D, Kasumi K. 2009. Development and

characterization of simple sequence repeat (SSR) markers in the water
lotus (Nelumbo nucifera). Aquatic Botany. 90: 191-194.
Kumpatla S. P. y Mukhopadhyay S. 2005. Mining and survey of simple sequence

repeats in expressed sequence tags of dicotyledonous species. Genome. 48:
985-998.
Lara A. y Veblen T. 1993. Forest plantations in Chile: a succesful model? In

afforestation policies, planning and progress. Mather, A. (Ed.) Belhaven Press.
London. 118-139.
Lagercrantz U., Ellegren H. y Andersson L. 1993. The abundante of various

polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates.
Nucleic Acids Research. 21: 1111-1115.
La Rota M, Kantety RV, Yu JK, Sorrells ME. 2005. Nonrandom distribution and
frequencies of genomic and EST-derived microsatellite markers in rice,
wheat, and barley. BMC Genomics. 6:23.
Le Roux J. J., Wieczorek A. M. y Meyer. J. 2008. Genetic diversity and structure

of the invasive tree Miconia calvescens in Pacific islands. Diversity and
Distributions. 14: 935-948

85
Li Y.C., Korol A.B., Fahima T. y Nevo E. 2004. Microsatellites within genes:

structure, function, and evolution. Molecular Biology and Evolution. 21:
991-1007.
Lijavetzky D., Cabezas J.A., Ibez A., Rodrguez Martnez - Zapater J.M. 2007.
High throughput SNP discovery and genotyping in grapevine (Vitis vinifera
L.) by combing a re-sequencing approach and SNPlex technology. BMC
Genomics. 8: 424.
Linhart, Y.B., & Grant, M.C. 1996. Evolutionary significance of local genetic
differentiation in plants. Annual Review of Ecology and Systematics. 27:
237-277.
Loveless M.D. y Hamrick J.L. 1984. Ecological determinants of genetic structure

in plant populations. Annual Review of Ecology and Systematics. 15: 65-
95.
Marchelli P., Gallo L., Scholz F. y Ziegenhagen B. 1998. Chloroplast DNA

markers reveal a geographical divide across Angentinean Southern beech
Nothofagus nervosa (Phil.) Dim. Et Mil. distribution area. Theoretical and
Applied Genetics. 97: 642-646.
Marchelli P, Caron H, Azpilicueta M.M. y Gallo A. 2008. Primer Note: A New

Set of Highly Polymorphic Nuclear Microsatellite Markers for Nothofagus
nervosa and Related South American Species. Silvae Genetica. 57: 82-85.

86
Markgraf V., Mc Globe M. y Hope G. 1995. Neogene paleoenvironmental and

paleoclimatic change in southern temperate ecosystems a southern
perspective. Trends Ecology Evolution. 10: 143-147.
Mason S. L., Stevens M. R., Jellen E. N., Bonifacio A., Fairbanks D. J., et al.
2005. Development and use of microsatellite markers for germplasm
characterization in Quinoa (Chenopodium quinoa Willd.). Crop Science. 45:
1618-1630.
Mathias R.M., Sagredo D. B. y Kalazich B. J. 2007. Uso de marcadores SSR para
identificacin de germoplasma de papa en el programa de mejoramiento
de INIA de Chile. Agricultura Tcnica. 67: 3-15.
Medel F., Donoso C. y Halloy S. 2004. Variacin en Gevuina avellana Mol. En:
Variacin intraespecfica en las especies arbreas de los bosques templados
de Chile y Argentina. Donoso, C., Premoli, A., Gallo, L. eI pinza, R. (Eds.)
Editorial Universitaria. Santiago-Chile. 420 Pp.
Mekhedov S., Martnez O. y Ohlrogge J. 2000. Towards a functional catalog of

the plant genome: a survey of genes for lipido biosynthesis. Plant
Physiology. 122:389-401.
Morgante M., Hanafey M. y Powell W. 2002. Microsatellites are preferentially

associated with nonrepetitive DNA in plant genomes. Nature Genetics.
30: 194-200.

87
Moxon E. R. y Wills C. 1999. DNA microsatellites: agents of evolution?

Scientific American. 72-77.
Muoz F. J., Morillo C. A. C. y Morillo C. Y. 2008. Microstelites Amplificados al

Azar (RAM) en estudios de diversidad gentica vegetal. Acta Agronmica
(Palmira). 57: 219-226.
Nei M. 1972. Genetic Distance between Populations. American Naturalist. 106:

283-292.
Nei M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings

of the National Academy of Sciences. USA. 70: 3321-3323.
Nei M., Tajima F. y Tateno Y. 1983. Accuracy of estimated phylogenetic trees

from molecular data. II. Gene frequency data. Journal of Molecular
Evolution. 19: 153170.
Noel F., Machon N. y Porcher E. 2007. No Genetic Diversity at Molecular

Markers and Strong Phenotypic Plasticity in Populations of Ranunculus
nodiflorus, an Endangered Plant Species in France. Annals of Botany. 99:
1203-1212.
Nybom H. 2004. Comparison of different nuclear DNA markers for estimating

genetic diversity in plants. Molecular Ecology. 13: 1143-1155.

88
Oosterhout C. V., Hutchinson W. F., Wills D. P.M. y Shipley P. 2004. MICRO-

CHECKER: software for identifying and correcting genotyping errors in
microsatellite data. Molecular Ecology Notes. 4: 535-538.
Ottewell K. M., Donnellan S. C., Moran G. F. y Paton D. C. 2005. Multiplexed
microsatellite markers for the genetic analysis of Eucalyptus leucoxylon
(Myrtaceae) and their utility for ecological and breeding studies in other
Eucalyptus species. Journal of Heredity. 96:445-451.
Pan L., Xia Q., Quan Z., Liu H., Ke W. y Ding Y. 2009. Development of novel
ESTSSRs from sacred lotus (Nelumbo nucifera Gaertn) and their utilization
for the genetic diversity analysis of N. nucifera. Journal of Heredity.
doi:10.1093/jhered/esp070.
Peakall R. y Smouse P. 2006. Genalex 6: genetic analysis in Excel Population

genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes. 6:
288-295.
Peng J. H. y Lapitan N.L. 2005. Characterization of EST-derived microsatellites

in the wheat genome and development of eSSR markers. Funct. Integr.
Genomics. 5:80-96.
Prez de la Vega P. y Garca P. 2000. Anlisis de la variacin gentica en las

poblaciones. En: Los marcadores genticos en la mejora vegetal. Nuez, F.
y Carrillo, J. (Eds.). Universidad Politcnica de Valencia. Valencia, Espaa.
579 Pp.

89
Petit R. J., Duminil J., Fineschi S., Hampe A., Salvini D. y Vendramin G. G.
2005. Comparative organization of chloroplast, mitochondrial and nuclear
diversity in plant populations. Molecular Ecology. 14: 689-701.
Pigliucci M., Murren C.J. y Schlichting C.D. 2006. Phenotypic plasticity and
evolution by genetic assimilation. Journal of Experimental Biology. 209:
2362-2367.
Pinto L. R., Oliveira K. M., Marconi T., Garcia A. A. F., Ulian E. C. y De Souza
A. P. 2006. Characterization of novel sugarcane expressed sequence tag
microsatellites and their comparison with genomic SSRs. Plant Breeding.
125: 378-384.
Premoli AC. 1997. Genetic variation in a geographically restricted and two

widespread species of South American Nothofagus. Journal of
Biogeography. 24: 883-892.
Pritchard J.K. y Wen W. 2003. Documentation for structure software: version

2.3.1. Available from http://pritch.bsd.uchicago.edu.
Price T.D., Qvarnstrom A. y Irwin D.E. 2003. The role of phenotypic plasticity
in driving genetic evolution. Proceedings of the Royal Society of London
B 270: 1433-1440.
Pritchard JK, Stephens M, Donnelly P. 2000. Inference of population structure

using multilocus genotype data. Genetics. 155: 945-959.

90
Ramos R., Seguel I. y Hinrichsen P. 2009a. Desarrollo de marcadores de

microsatlite altamente polimrficos para murtilla (Ugni molinae Turcz.), un
arbusto nativo de Chile. Memorias VII Simposio de recursos genticos
para Amrica Latina y el Caribe. Pucn Chile. Tomo I. Recursos
Fitogenticos. 385-386.
Ramos R., Velozo J. y Hinrichsen P. 2009b. Baja diversidad gentica en una

especie forestal endmica de Chile (Quillaja saponaria Mol.) revelada por
marcadores AFLP y SSR. Memorias VII Simposio de recursos genticos
para Amrica Latina y el Caribe. Pucn Chile. Tomo I. Recursos
Fitogenticos. 387-388.
Riaz S., Dangl G.S., Edwards K.J. y Meredith C.P. 2004. A microsatellite marker
based framework linkage map of Vitis vinifera L. Theoretical and Applied
Genetics. 108: 864-872.
Robertson A., Hollingsworth P. M., Kettle, C.J., Ennos R.A. y Gardner M.F.
2004. Characterization of nuclear microsatellites in New Caledonian
Araucaria species. Molecular Ecology Notes. 4: 62-63.
Robinson J. P. y Harris S. A. 1999. Amplified fragment length polymorphisms

and microsatellites: A phylogenetic perspective. Chapter 12 en: Which
DNA marker for which purpose? Final compendium of the research

91
project development, optimization and validation of molecular tools

assessment of biodiversity in forest trees. Gillet, E. M. (eds), URL.
Rodrguez R., Matthei O. y Quezada M. 1985. Flora Arbrea de Chile. Editorial

Universidad de Concepcin. Santiago - Chile. 408 Pp.
Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S., Scharf., S. Higuchi., R. et al. 1988. Primer
directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA
polymerase. Science. 239:487-491.
Scariot V., De Keyser E., Handa T. y De Riek J. 2007. Comparative study of the
discriminating capacity and effectiveness of AFLP, STMS and EST
markers in assessing genetic relationships among evergreen azaleas. Plant
Breeding. 126: 207-212
Schuelke M. 2000. An economic method for the fluorescent labeling of PCR

fragments. Nature Biotechnology. 18: 233-234.
Schulman A. H. 2007. Molecular markers to assess genetic diversity. Euphytica.

158: 313-321.
Selkoe K. A. y Toonen R. J. 2006. Microsatellites for ecologists: a practical guide

to using and evaluating microsatellite markers. Ecology Letters. 9: 615-629.

92
Schlotterer C. y Tautz D. 1992. Slippage synthesis of simple squence DNA.

Nucleic Acids Research. 20: 211-215.
Shlotterer C. y Pemberton J. 1994. The use of microsatellites for genetic analysis

of natural populations. En : Schierwater B, Streit B, Wagner GP and De
Salle R (eds). Molecular Ecology and Evolution. Approaches and
Applications. Birkhouse Verlag Basel. Switzerland. 203-214.
Slatkin M. 1985. Gene flow in natural populations. Annual Review of Ecology

and Systematics. 16: 393-430.
Slatkin M. 1987. Gene flow and the geographic structure of natural populations.
Science. 236: 787-792.
Slatkin, M. 1994. Gene flow and population structure. En Ecological Genetics,

Editado por L. Real. Princeton.
Solbrig, O. 1970. Principles and Methods of plant biosystematics. The Macmillan

Biology Series. Giles and Torrey, J.D. (Eds). USA.
Sosa P., Batista F., Gonzlez M.A. y Bouza N. 2002. La conservacin gentica de
las especies amenazadas en: Biologa de la conservacin de plantas
amenazadas: Tcnicas de diagnstico del estado de conservacin. Baares,
A. (Ed.). Organismo autnomo de parques nacionales. Espaa. 133-160.

93
Takezaki N. Nei M. y Tamura K. 2009. POPTREE2: Software for constructing

population trees from allele frequency data and computing other
population statistics with Windows-interface. Molecular Biology and
Evolution. doi:10.1093/molbev/msp312.
Tang S., Okashah R. A., Cordonnier-Pratt M. M., Pratt L. H., Johnson V. E.,
Taylor C. A., Arnold M. L. y Knapp S. J. 2009. EST and EST-SSR marker
resources for Iris. BMC Plant Biology. 9:72.
Tapia C y Neira C. M. 2000. Caracterizacin de la entomofauna asociada a flores

de avellano chileno (Gevuina avellana Mol.) y Algunos Aspectos de su
Biologa Reproductiva. Tesis Lic. Agr. Valdivia. Universidad Austral de
Chile., Facultad de Ciencias Agrarias. 115p.
Tautz D. y Renz M. 1984. Simple sequences are ubiquitous repetitive

components of eukaryotic genomes. Nucleic Acids Research 12: 4127-
4138.
Tian HL, Chen XQ, Wang JX, Xue JH, Wen J, Mitchell G, Zhou SL. 2008.
Development and characterization of microsatellite loci for lotus (Nelumbo
nucifera). Conservation Genetics. 9:1385-1388.
Torres-Daz C., Ruiz E., Gonzlez F., Fuentes G. y Cavieres L. A. 2007. Genetic
Diversity in Nothofagus alessandrii (Fagaceae), an endangered endemic tree

94
species of the Coastal Maulino Forest of Central Chile. Ann. Bot. (Lond).
100: 75-82.
Tth G., Gspri Z. y Jurka J. 2000. Microsatellites in different eukaryotic

genomes: survey and analysis. Genome Research. 10: 967-981.
Valladares F., Snchez-Gmez D. y Zavala M.A. 2006. Quantitative estimation of

phenotypic plasticity: bridging the gap between the evolutionary concept
and its ecological applications. Journal of Ecology. 94: 1103-1116.
Varshney R.K., Graner A. y Sorrells M.E. 2005. Genic microsatellite markers in

plants: features and applications. Trends Biotechnology. 23: 48-55.
Vavilov N. 1958. Estudios Sobre el Origen de las Plantas Cultivadas. Acme

Agency, Soc. Resp. Ltda. Buenos Aires. 185 Pp.
Vera A. M. y Rivero G. M. 2002. Aspectos de biologa reproductiva en avellano

chileno (Gevuina avellana Mol.). Tesis Lic. Agr. Valdivia. Universidad
Austral de Chile., Facultad de Ciencias Agrarias.
Villagrn C. y Armesto J. 1993. Full and late glacial paleoenvironmental scenarios

for the west coast of southern South America. Earth systems responses to
global change. Contrasts between North and South America. Mooney, H.,
Fuentes, E. y Kronberg, B. (Eds.). Academic Press. New York. 95-207.

95
Wheeler N. y Guries R. 1982. Biogeography of lodgepole pine. Canadian Journal

of Botany. 60: 1805-1814.
Woodhead M., Russell J., Squirrell J., Hollingsworth P. M., Mackenzie K. et al.
2005. Comparative analysis of population genetic structure in Athyrium
distentifolium (Pteridophyta) using AFLPs and SSRs from anonymous and
transcribed gene regions. Molecular Ecology. 14: 16811695.
Yeh F., Yang R. y Boyle T. 1997. Population genetic analysis of codominant and
dominant markers and cuantitative traits. Belgain Journal of Botany. 129-
157.
Zane L., Bargelloni L. y Patarnello T. 2002. Strategies for microsatellite isolation:

a review. Molecular Ecology. 11: 1-16.
Zhao L., Zhen L., Liang C., Ming-Zhe Y. y Xin-Chao W. 2008. Generation and
characterization of 24 novel EST derived microsatellites from tea plant
(Camellia sinensis) and cross-species amplification in its closely related
species and varieties. Conservation Genetics. 9:1327-1331.
Zwettler D., Viera C. P. y Schlotterer C. 2002. Polymorphic microsatellite in

Antirrhinum (Scrophulariaceae), a genus with low levels of nuclear sequence
variability. Journal of Heredity. 93:217-221.

96
ANEXOS

Anexo 1. ndices de fijacin (Fst) entre pares de poblaciones de Gevuina avellana.
Pop Ar Lq Sf Fe Ct Ma Im On Hu Sa Ch
Ar 0
Lq 0,10** 0
Sf 0,11** 0,06** 0
Fe 0,11** 0,01NS 0,06** 0
Ct 0,10** 0,03* 0,06** 0,04* 0
Ma 0,25** 0,08** 0,15** 0,07** 0,08** 0
Im 0,27** 0,09** 0,19** 0,06* 0,14** 0,05* 0
On 0,19** 0,06* 0,11** 0,04* 0,05* 0,03* 0,06* 0
Hu 0,23** 0,06* 0,13** 0,08** 0,10** 0,07* 0,14** 0,11** 0
Sa 0,31** 0,14** 0,21** 0,11** 0,14** 0,03* 0,10** 0,11** 0,07** 0
Ch 0,18** 0,08** 0,11** 0,10** 0,08** 0,12** 0,18** 0,04* 0,15** 0,22** 0
Nivel de significancia = *0.05; **0.001 NS=No significativo.

97
Anexo 2. Grfica valores FSC; FST y FCT calculados en el anlisis espacial de

varianza molecular (SAMOVA) de 11 poblaciones de Gevuina avellana

Diversidad Genética y Estructura en Avellanos

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Diversidad Genética y Estructura en Avellanos

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

b

Universidad Austral de Chile

DETERMINACIN DE LA DIVERSIDAD Y ESTRUCTURA

LEILA MILENA DAZ CAMACHO

Tesis presentada a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de

LEILA MILENA DAZ CAMACHO

INFORME DE APROBACIN TESIS DE MAGISTER

La Comisin Evaluadora de Tesis comunica al Director de la Escuela de

LEILA MILENA DAZ CAMACHO

ha sido aprobada en el examen de defensa de Tesis rendido el da 27 de Abril de

Profesor: Dr. Ricardo Riegel Schlegel

Profesora: Dra. Leyla Crdenas

Profesor: Dr. Jos Nez

Dedico la presente tesis a los seres que ms

Deseo expresar mis ms sinceros agradecimientos a las siguientes personas,

Al profesor Ricardo Riegel S. quien crey en m y me dio la oportunidad de hacer

A Karin Hoffens quin me brind un entrenamiento en el laboratorio lo que hizo

A la Agencia de Cooperacin Internacional AGCI por el financiamiento de mis

Esta tesis fue financiada por el proyecto FONDECYT 1060192.

1.2. GENTICA DE POBLACIONES ..................................................................6

1.2.1. Diversidad gentica.........................................................................................6

1.2.2. Anlisis de la estructura poblacional..........................................................10

1.3. MARCADORES MOLECULARES ...............................................................12

1.3.1. Marcadores microsatlites (SSRs)...............................................................14

1.4. HIPTESIS .........................................................................................................22

1.5.1. Objetivo General ..........................................................................................22

1.5.2. Objetivos Especficos ..................................................................................22

2.2.1. Extraccin del ADN ....................................................................................26

2.2.2. Estrategia seguida para el aislamiento de los microsatlites de

2.2.3. Diseo de partidores ....................................................................................27

2.2.4. Amplificacin del ADN...............................................................................28

2.3. ANLISIS DE DATOS ....................................................................................31

2.3.1. Diversidad gentica de las poblaciones .....................................................31

2.3.2. Estructura gentica de las poblaciones.....................................................32

2.3.3. Estimacin Bayesiana de la estructura gentica entre las poblaciones .34

3.2. DIVERSIDAD GENTICA DE LAS POBLACIONES ..........................42

3.3. DIFERENCIACIN GENTICA DE LAS POBLACIONES...............44

3.3.1. Anlisis de correlacin entre distancia gentica y distancia geogrfica de

3.3.2. Anlisis de relaciones genticas de las poblaciones a travs de un rbol

3.3.3. Anlisis de relaciones genticas a travs de un anlisis de coordenadas

3.3.4. Distribucin de la diversidad gentica en las poblaciones......................54

3.4. ESTIMACIN BAYESIANA DE LA ESTRUCTURA GENTICA

4.1. DESARROLLO DE MARCADORES EST-SSR EN Gevuina avellana .....59

4.2. DIVERSIDAD GENTICA ...........................................................................61

4.3. ESTRUCTURA GENTICA POBLACIONAL .........................................68

Tabla 1. Localizacin geogrfica de las poblaciones estudiadas.....24

Tabla 2. Frecuencia y tipo de motivos repetitivos encontrados en la regin

Tabla 3. Frecuencia de los diferentes motivos de repeticiones en la regin

Tabla 4. Caracterizacin de los marcadores EST-SSR de Gevuina avellana

evaluados en 40 individuos de 10 poblaciones. ..40

Tabla 5. ndices de diversidad gentica para 11 poblaciones de avellano.......43

Tabla 7. Clculo del equilibrio de HardyWeinberg en 11 poblaciones de

Tabla 8. Frecuencias esperadas de alelos nulos en 11 poblaciones de Gevuina

Tabla 9. Distancia gentica de Nei entre pares de poblaciones de Gevuina

Tabla 10. Anlisis molecular de varianza (AMOVA) para 11 poblaciones de

Gevuina avellana.. .....54

Tabla 11. Anlisis molecular de varianza (AMOVA). Segn ubicacin geogrfica

en la cordillera de los Andes y la cordillera de la Costa .......55

Tabla 12. Anlisis espacial de varianza molecular (SAMOVA) de 11 poblaciones

Figura 1. Microsatlite. Ejemplo de un dinucletido (AC)n ........14

Figura 2. Localizacin geogrfica de las poblaciones estudiadas..25

Figura 3. Metodologa para el marcaje de partidores (Schuelke, 2000).....29

Figura 6. Representacin grfica de los Fst pareados para 11 poblaciones de

Figura 7. Correlacin entre distancia gentica y distancia geogrfica de 11