06/12/2011

Anlisis microbiolgico de alimentos

Microorganismos marcadores En realidad
La mayora de los
alimentos
contienen
microorganismos.
No es posible el
anlisis de todos
los patgenos y de
Mara Marcela Martnez Miranda
Magister en Microbiologa
todos los
Departamento de Ingeniera alterantes.
Universidad de Caldas Marcela Martnez M.Sc.

Porqu buscar
Microorganismos marcadores
microorganismos marcadores?
1. La deteccin de Son organismos (o
patgenos puede ser muy grupos) que advierten:
complicada, muy lenta y/o
muy costosa. manejo inadecuado
2. La investigacin de presencia de
patgenos en alimentos microorganismos
no facilita un enfoque patgenos
preventivo.
Su deteccin en el
3. Calidad microbiolgica en
trminos de laboratorio es ms
microorganismos sencilla, rpida y/o
marcadores. econmica.
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Caractersticas de un buen ndice de

Microorganismos marcadores
Microorganismos cuya presencia
en cantidades o niveles por
encima de ciertos lmites
ndices numricos indica la posible
presencia de patgenos
ecolgicamente relacionados.
Microorganismos cuya presencia
en cantidades determinadas
indica un tratamiento o
Indicadores procesado de inocuidad
inadecuado.
contaminacin en alimentos
1. Origen especfico
2. Tcnicas de laboratorio
fiables y rpidas
3. Resistencia a
condiciones ambientales
y al procesado tanto o
ms que los patgenos a
los cuales representa.

Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

1
 06/12/2011

Un tratamiento de
La presencia posible de Los principales microorganismos
patgenos entricos, es decir,
inocuidad una funcin de ndice para
microorganismos de indicadores en alimentos son:
insuficiente importancia para la salud
cumpliendo de ese pblica, como por ejemplo las

modo una funcin

shigelas, que se pudieran
haber originado en la zona
Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de
de indicador donde fueron tratados los
camarones. proceso:
Aerobios Mesfilos
Psicrfilos y psicrotrficos
Termfilos o termodricos
Mohos y levaduras
Un microorganismo marcador dado Coliformes totales
puede funcionar a la vez como ndice y
como indicador. Indicadores de contaminacin fecal:
Por ejemplo, la presencia de cantidades
importantes de E. coli en los camarones Coliformes fecales
precocinados congelados indica:
E. coli
Enterococos
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.
Anaerobios sulfito-reductores

Otros microorganismos Mtodos de anlisis microbiolgico

indicadores Mtodo: cualitativo
PRESENCIA / AUSENCIA en
Estafilococos coagulasa positiva 25 g o mL de muestra.
(Staphylococcus aureus) Salmonella sp.
Vibrio cholerae
Recuento de Anaerobios Mesfilos Listeria monocytogenes
Mtodo: cuantitativo
Recuento de Anaerobios Esporulados Tubos mltiples: NMP/g o mL
de muestra
Recuento de Virus entricos Recuento en placa: ufc/g o mL
a. Por incorporacin
b. Por superficie
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Recuento de aerobios mesfilos

Indicadores de condiciones de
(RAM)
manejo o de eficiencia de proceso
Se desarrollan en presencia de aire
Aerobios a temperaturas medias (25-40C).

mesfilos Dan lugar a la formacin de colonias

visibles despus de 72 horas a 3O
Psicrfilos y C ( 48 horas a 37C) sobre un agar
termfilos de recuento, incubado en
condiciones de aerobiosis.
Mohos y Indican:
levaduras la calidad sanitaria de un
alimento.
Coliformes
las condiciones de manipulacin.
totales
las condiciones higinicas de la
Marcela Martnez M.Sc.
materia prima. Marcela Martnez M.Sc.

2
 06/12/2011

Aplicacin del RAM El RAM NO es til para:

Alimentos fermentados.
Col acida, queso y otros
Alimentos derivados lcteos.
frescos,
Alimentos esterilizados
refrigerados y (Recuento Microscpico
congelados. Directo).
Alimentos deshidratados y
Materias primas e congelados (Recuento
insumos. Microscpico Directo).
Alimentos refrigerados
Alimentos listos (Recuento de
para consumir. psicrotrficas).
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Existen dos mtodos clsicos para

el recuento de aerobios mesfilos RAM por el mtodo de siembra a
profundidad

Profundidad 10 -1 (48 h) 10 -2 A (48 h) 10 -2 B (48 h) 10 -3 A (48 h) 10 -3 B (48 h)

Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Un RAM elevado indica: Un RAM elevado puede significar:

1. Excesiva contaminacin
En alimentos estables
de la materia prima.
Materias primas muy contaminadas. 2. Deficiente manipulacin
Tratamiento no satisfactorio. durante el proceso de
elaboracin.
En alimentos perecederos
3. La posibilidad de que
Materias primas muy contaminadas. existan patgenos, pues
stos son mesfilos.
Tratamiento no satisfactorio.
4. La inmediata alteracin
Almacenamiento en condiciones de del producto.
temperatura inadecuadas.
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

3
 06/12/2011

Psicrotrficos Psicrotrficos
Por definicin son Incluye bacilos y cocos; formadores de esporas; gram
organismos que producen positivos y gram negativos; aerbos; anaerobios y
crecimiento visible a 7o C anaerobios facultativos.
1o C dentro de 7 a 10 Aeromonas
das, independiente de su
Bacillus
temperatura de crecimiento
ptima. Clostridium
Lactobacillus
Los organismos
mayormente asociados con Escherichia
alimentos refrigerados y Listeria
que causan dao son
Serratia, ect.
psicrotrficos y no
psicroflicos Hongos y levaduras
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Psicrotrficos
Psicotrficos patgenos Mtodos de deteccin
Patgenos
Cultivo durante 10 das
Aeromonas hydrophila
a 7oC para siembra en
Bacillus cereus (algunas profundidad.
cepas)
Clostridium botulinum type E, Cultivo durante 7-8
ByF das a 7o C para
siembra en superficie
Listeria monocytogenes
Vibrio cholerae Cultivo durante16 hr a
17O C seguido de 3
Yersinia enterocoltica
das a 7oC
Escherichia coli (algunas
cepas)
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Termodricos Termodricos
Organismos que Gnero Alimento asociado
Actinomycetes Leche
pueden tolerar calor y
Alcaligenes Leche
por consiguiente
Arthrobacter Leche
tienen la capacidad
Bacillus Leche/huevos
de sobrevivir
Clostridium Leche
pausterizacin. Son Coryneform Huevos
capaces de sobrevivir Lactobacillus Leche/carne/jugos
el calentamiento de Microbacterium Leche
un alimento a Micrococcus Leche/huevos
temperaturas de 60 a Pseudomonas Huevos
80OC. Streptococcus/ Leche/carne/huevo
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.
Enterococcus

4
 06/12/2011

Coliformes
Bacilos Gram negativos
No esporulados
Aerobios o anaerobios
facultativos
Fermentan la lactosa a 35C
con produccin de cido y
gas
Viven en el ambiente y en
animales de sangra caliente
Los coliformes totales
incluyen los fecales
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Son algunas especies que

pertenecen a los gneros:
Gnero Fuente
Heces (humanas y
Escherichia
animales)
Klebsiella Heces, ambiente

Enterobacter Heces, ambiente

Citrobacter Ambiente
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Coliformes como indicadores de Aplicacin del uso de Coliformes

contaminacin fecal
Se encuentran en el intestino del hombre y de
animales, pero tambin en otros ambientes
como: suelo, plantas, cscara de huevo, etc.
Son tiles como indicadores de contaminacin
fecal por:
Su frecuencia en heces
Su fcil deteccin en el laboratorio
Sus caractersticas semejantes a algunos miembros
patgenos de la familia Enterobacteriaceae
Marcela Martnez M.Sc.
como indicadores
1. Deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el
manejo y en la fabricacin de los alimentos.
2. Evaluacin de la calidad microbiolgica de un
producto.
3. Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias
e higinicas en el equipo.
4. Calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de
agua utilizados en las diferentes reas del
procesamiento de alimentos.
Marcela Martnez M.Sc.

5
 06/12/2011

Pruebas de determinacin de Pruebas para deteccin y

Coliformes recuento de Coliformes
1. Investigacin y recuento en 1. Prueba presuntiva
medio lquido
Se usa el Caldo
Caldo Lauril Triptosa (CLT).
lactosado biliado verde Caldo Mc. Conkey.
brillante (Brilliant Green
Bile Lactose: BGBL) Caldo lactosado bilis verde brillante.
2. Investigacin y recuento en 2. Prueba confirmativa:
medio slido
Se utiliza el medio Medio EC.
selectivo agar biliado Medio bilis lactosa (BLVB)
rojo-violeta (Violet Red
Bile Agar: VRBA)
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Investigacin y recuento en
Coliformes fecales (CF)
medio slido
Origen intestinal
Coliformes totales
en placas de agar Pertenecen a la familia
Enterobacteriaceae
bilis rojo violeta,
incubadas por 24 h Bacilos Gram negativos,
a 35 C anaerobios facultativos, no
esporulados.
UFC/g (o/mL) de
Fermentadores de lactosa a
muestra. 44.5 C con produccin de gas.

Principalmente Escherichia coli

(90%)
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Determinacin de CF Escherichia coli (coliformes

termotolerantes)
Capacidad para producir
indol a partir de triptfano

Produccin de la enzima -
glucuronidasa.

Es el ndice de
contaminacin fecal ms
adecuado.

Hay grandes cantidades de

Escherichia coli en las
Su determinacin se hace a partir de la segunda etapa heces humanas y
(confirmativa) del mtodo de NMP, cultivando en caldo animales.
lactosado con incubacin
Marcela a 44.5M.Sc.
Martnez C. Marcela Martnez M.Sc.

6
 06/12/2011

Determinacin de E. coli Recuento de Enterobacterias

Familia
Mtodos basados en: Enterobacteriaceae
Produccin de cido y gas a partir
de la lactosa.
Lactosa + y lactosa -

Produccin de la enzima - Se usan como grupo

glucuronidasa. indicador en lugar del
grupo de coliformes
Los procedimientos incluyen: totales.
Filtracin con una membrana que Son de origen fecal y
despus se incuba en medios
selectivos a 4445 C.
no fecal.

nmero ms probable
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Razones por las cuales se utilizan las enterobacterias Qu indica niveles altos de Enterobacteiras en
como indicadoras en lugar de los coliformes alimentos procesados?

1. Los coliformes son un Tratamiento inadecuado y/o

grupo mal definido contaminacin posterior al
taxonmicamente. tratamiento; ms
frecuentemente a partir de
2. Los coliformes solo materias primas, equipos
tienen en cuenta las sucios o manejo no
higinico
enterobacterias
lactosa positiva. Multiplicacin microbiana
que pudiera haber permitido
3. Las Enterobacterias el crecimiento de toda la
son mas resistentes serie de microorganismos
que los coliformes. patgenos y toxignicos.

Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Estreptococos fecales
Mtodos para el recuento de
Enterobacterias
Enterococcus
Se encuentran en las heces
Mtodo de de los humanos y animales
de sangre caliente.
recuento
Animales de produccin:
Recuento en vaca, cerdo, oveja, caballo,
placa gallina y pato.
Recuento en Son importantes en
medio lquido Confirmacin con situaciones donde se sabe
prueba de oxidasa que hay contaminacin
Mtodo de VRBG Agar
fecal y no se detectan
ausencia coliformes.
presencia
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

7
 06/12/2011

Uso de Enterococcus como

indicadores en alimentos
Especies de Enterococcus
Aunque se encuentran
Grupo Especies Hbitat
en cantidades menores
que E. coli, son mas Enterococcus faecalis
estn normalmente
resistentes. Grupo 1 Enterococcus faecium presentes en las heces de
humanos y animales
Se consideran Enterococcus durans
indicadores en alimentos Streptococcus bovis
procesados, como Streptococcus equinus no se encuentran
lcteos y crnicos, en Grupo 2 comnmente en las heces
Enterococcus avium humanas
los cuales E. coli no
puede sobrevivir.

Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Recuento de esporas de Clostridium

Clostridium sulfito reductores sulfito reductores
Se pesan 10g o ml y se homogenizan Se realizan diluciones seriadas en
Bacterias Grampositivas, con 90ml de peptona 0.1% 9ml peptona 0.1%
esporuladas, anerobias,
reductoras de sulfitos.
Se utilizan como
indicadores de
contaminacin fecal
antigua.
Clostridium perfringens es
de origen fecal y tambin se
encuentra ampliamente
distribuida en la naturaleza.
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Choque trmico para formacin de

esporas Siembra en fondo en agar SPS

Se ponen los tubos con las diluciones a sembrar en agua hirviendo por 10 Se siembra 1ml en fondo de la dilucin
minutos para hacer luego el choque trmico y activar las esporas. que ha sido sometida a choque trmico
Marcela Martnez M.Sc. Marcela
y se agrega el medio SPS Martnez M.Sc.
caliente.
Para finalizar el choque trmico, se ponen los tubos de diluciones en hielo.

8
 06/12/2011

Incubacin en anaerobiosis Mohos y levaduras

Se llevan a incubar las cajas en cmara Unicelulares hongos filamentosos
de anaerobiosis por 72 horas a 37 C,
con sobre generador de anaerobiosis e
indicador atmosfrico.

Crecen ms lentamente que las bacterias en los alimentos no cidos que

conservan humedad.
Las levaduras crecen mas rpidamente que los mohos, pero con frecuencia
junto a ellos.
Mohos son aerobios estrictos.
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.
Levaduras crecen en aerobiosis o en anaerobiosis (fermentacin).

Mohos y levaduras en alimentos Recuento de mohos y levaduras

Importantes en alimentos Se desarrollan en
cidos y en los de baja condiciones de aerobiosis.
actividad de agua:
A temperaturas que varan
Frutas frescas entre 20 y 30C.
Jugos
Vegetales Crecen ms lentamente
que las bacterias.
Quesos
Cereales Los medios de cultivo
Alimentos salazonados deben favorecer su
desarrollo pero no el de las
Encurtidos
bacterias.
Alimentos congelados y
deshidratados Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

Medios de cultivo para mohos Recuento de mohos y levaduras

Se tiene en cuenta el rango de 10 UFC 100 UFC
Agar de Sabouraud
Se reportan indistintamente mohos y levaduras
Agar papa dextrosa
Agar extracto de malta
Agar Czapek-Dox
Agar Micosel o micobitico
BHI + antibiticos
BHI
Marcela Martnez M.Sc. Marcela Martnez M.Sc.

9
 06/12/2011

La misin de la vida es descubrir la vocacin y luego

entregarse a ella con todo el corazn
Marcela Martnez M.Sc.
Buda

10