Biologia molecular de

Plasmodium falciparum um
curso prtico

Gerhard Wunderlich & Carsten Wrenger

So Paulo 2014

Departamento de Parasitologia Instituto de Cincias Biomdicas Universidade

de So Paulo

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Objetivo do curso

Estudantes de cursos de Cincias da vida (Biologia, Bioqumica, Farmcia,

Cincias Biomdicas, etc.) muitas vezes tem pouca oportunidade de conhecer o
lado prtico de trabalhos de biologia molecular. Neste curso pretendemos ensinar
tcnicas essenciais da biologia molecular com seus truques e detalhes, e em
paralelo mostrar alguns aspectos do ciclo de vida e do manuseio de parasitas do
ciclo sanguneo de Plasmodium falciparum. O aluno egresso deve ser capaz de
planejar, conduzir e avaliar de forma autnoma os experimentos aqui mostrados.

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Mapa de atividades do curso

Dia 1: Introduo no organismo Plasmodium falciparum. Formao dos

grupos experimentais 1-7. Extrao de DNA genmico do parasita.
Princpios da preparao de solues e discusso do protocolo da extrao
de gDNA. Semear bactrias E. coli DH10B, XL1 blue e BL21 RIL.
Dia 2: Introduo no cultivo de parasitas. Experimento demonstrativo:
Sincronizao de parasitas para formas trofozoitas/esquizontes.
Quantificao de gDNA de P. falciparum. Introduo na reao em cadeia
da polimerase (PCR). Setup e incio das reaes de PCR com gDNA de P.
falciparum. Inoculao de LB com cultivo pr-inculo E. coli DH10B, XL1
blue MRF-, BL21 RIL
Dia 3: Manh: Experimento demonstrativo: Recolhimento de parasitas em
forma anel. Anlise da reao PCR e purificao de fragmentos do gel:
grupos 1-2 glassmilk, 3-4 kit PCR clean, 5-7 Glassmilk com gel violeta
cristalina. Grupos 1-2 bactrias qumiocompetentes DH10B, grupos 3,4
bactrias qumiocompetentes BL21 RIL, grupos 5-7 qumiocompetentes
XL1 blue. Setup de ligao de fragmentos em pGEM T easy e
transformao (plus controles). Recolhimento de formas trofozoita.
Dia 4: Recolhimento de formas esquizonte tardio. Clculo de eficincia de
bactrias competentes. Anlise de eficincia atravs das placas.
Preparao de RNAs do parasita 3 grupos (anel 1,2 trofo 3,4 e esquizonte
5-7). Quantificao de RNAs. Inoculao de minipreps dos clones pGEM.
Preparao de cDNA: DNAse1, cDNA. PCR controle de qualidade.
Dia 5: Minipreps e anlise rpida de inserto, (cortar pGEX2T em paralelo)
escolha dos clones, restrio quantitativa, purificao de produo e
ligao em pGEX2T, transformao. Background terico de clonagens
(como clonar corretamente genes fusionados)

FIM DA SEMANA
Dia 6: Minipreps e anlise dos clones pGEX2T recombinantes. Setup da
reao de sequenciamento. Seminrios sobre sequenciamento da prxima
gerao (Plataforma SOLiD, grupos 1-2, Plataforma 454, grupos 3-4, e
IonTorrent 5-7), Retransformao de clones recombinantes pGEX2T em E.
coli BL21 RIL.
Dia 7: Inocular pr-inculo e inculo principal em LB-amp-cam, induzir
bactrias e recolher. Anlise de sequncias no computador, montagem de
plasmdeo in silico no programa APE. Seminrios temticos grupos 1,2.
Dia 8: Purificao das protenas recombinantes. Preparao de gis SDS
poliacrilamida. Coomassie staining e transferncia. Quantificao de
protenas por teste de Bradford. Seminrios temticos grupos 3,4.
Dia 9: Western blot, ELISA, elaborao e avaliao de resultados.
Seminrios temticos 5-7.
Dia 10: Help Desk. Seminrios: Produo de protenas em sistema
Baculovirus (grupos 1-3) ou em Pichia Pastoris (4-6). Avaliao escrita
sobre assuntos do curso.

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Introduo

Malaria e Plasmodium
A malaria humana continua sendo uma grande ameaa a sade de populaes
do planeta e especificamente em reas pobres e tropicais o parasita da forma
mais perigosa, Plasmodium falciparum ainda mata em torno de 800 mi pessoas
anuais [1,2]. Entretanto, recentes sucessos na diminuio de mortes por medidas
de preveno ou acelerao do tratamento e no sucesso considervel em termos
de desenvolvimento de vacinas, como testes com RTS/S-AS01 [3], MSP3 [4] ou
alvos novos como o antgeno PfRh5 [5] contracenam com a observao de casos
de infeces graves com Plasmodium vivax [6] ou a ocorrncia de falhas no
tratamento/resistncias de cepas de P. falciparum contra artemisinina [7].

A malria inicia-se em indivduos pela deposio de esporozoitas na pele durante

o repasto sanguneo de anofelinos infectados. Os esporozoitas migram com o
fluxo sanguneo at o fgado onde invadem hepatcitos e se transformam em
esquizontes hepticos e depois 6-14 dias em at 40.000 merozoitas que - saindo
do hepatcito infectado - comeam a infectar hemcias. O processo da infeco
da hemcia um processo de mltiplos passos nitidamente coordenados e
ocorre dentro de aproximadamente 2 min (revisado em [8]), sob formao de um
vacolo parasitforo (Figura 1). A fase de multiplicao na hemcia
(esquizognia) demora 48 h (72 h no caso de P. malariae) e a malria percebida
como tal no momento quando ocorrem as primeiras ondas de lise de hemcias
liberando novamente 16-32 merozoitas novos juntamente com toxinas. Durante
sua fase intraeritroctica, o parasita modifica grandemente a hemcia, colocando
transportadores e antgenos muitas vezes de funo ainda desconhecida no
citossol ou na superfcie da hemcia. Uma parte dos parasitas reinvadidos vai
seguir outro programa celular e se desenvolver para o gamonto ou gametcito,
que uma forma no proliferativa. Esta forma infecciosa para o mosquito vetor
(hospedeiro definitivo) e ao ser sugado e mediante sinalizao trmica e qumica
percebe a transmisso ao mosquito onde se desenvolve para 8 gametas
masculinas flagelados (microgametas) ou um gameta feminino (macrogametas).
Estas formas vo formar, dentro do bolo de hemcias dentro do intestino do
mosquito, uma forma diploide aps fecundao que possui mobilidade e
atravessa a membrana peritrfica do material ingerido pelo mosquito e tambm
a membrana das clulas epiteliais e se instala no lado distal do epitlio como
oocisto. L ocorre a meiose e multiplicao macia (esporogonia). Aps uns dias
o oocisto se rompe e libera milhares de esporozoitas para a hemolinfa do
mosquito. Estes esporozoitas migram por quimiotaxia e interao receptor-
ligante para a glndula salivar do mosquito onde invadem e ficam inativos at o
prximo repasto sanguneo quando so injetados juntamente com a saliva para
dentro da pele do prximo hospedeiro intermedirio. O ciclo de vida resumido
em Figura 1. Neste curso amplificamos e clonamos vrios antgenos importantes
do merozoita que infecta hemcias, na sua totalidade estes antgenos so
candidatos ou j partes de vacinas anti-malricas em teste e no destaque da
Figura 1 a localizao subcelular destes antgenos mostrado.
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Figura 1: Ciclo de vida e o merozoita de Plasmodium. RBCs so hemcias.
Na parte abaixo, as diferentes fases da invaso da hemcia so destacados. A:
associao "frouxa" do merozoita a hemcia. B: Reorientao para aproximar o
complexo apical a membrana da hemcia. C: Formao complexo de invaso,
interao comprometida de receptores ligantes, "tight junction". D, E: Injeo de
fatores para dentro da hemcia (contedo de rptrias) e invaso ativa da
hemcia (interao de protenas secretadas das micronemas e ligantes da
hemcia). F: Resselamento da hemcia. G: O parasita comea se desenvolver
dentro da hemcia, a membrana do vacolo parasitforo permevel para
molculas abaixo de ~1000 Daltons.

Biologia molecular neste curso

A biologia molecular compreende per definitionem aspectos biolgicos relativos
molcula de DNA. Desde sua descoberta por James Watson, Francis Crick,
Maurice Wilkins e Rosalind Franklin esta rea de conhecimento continua em
expanso e com ela o grau de complexidade que claramente ultrapassa a
quantidade de matrias que podem ser ensinadas em graduaes mesmo
focalizadas no assunto. Entretanto, existem alguns princpios bsicos e
experimentais que esto contidos na maioria de trabalhos na rea. Neste curso
conheceremos uma parte destes princpios bsicos e tentamos ensinar tcnicas
importantes do laboratrio de biologia molecular. Estas tcnicas so
essencialmente as mesmas em laboratrios que estudam os mais diversos
sistemas e organismos em consequncia, biologistas moleculares que ontem
trabalharam no sistema Anas patyrhynchos (pato) facilmente se adaptaro hoje
em laboratrios com biologia molecular de Drosophila, Homo sapiens ou
Plasmodium.

Neste curso, seguimos uma parte do caminho percorrido do nosso laboratrio

que busca analisar genes de protenas expressas por um parasita de seres
humanos (P. falciparum) com o intuito de analisar a resposta imunolgica
humoral contra essas protenas em questo, muitas delas so alvos de vacinas. O
procedimento o mais straight forward possvel.

Dia 1
Metas do dia: Preparao de solues bsicas, meios e extrao de DNA
genmico do parasita Plasmodium falciparum cepa 3D7, fazer placas de LB(-
amp), semear bactrias

O preparo de solues exatas e limpas primordial no trabalho com DNA. A

pipetagem segura e exata importantssimo considerando que muitas reaes
so em volumes mnimos de alguns microlitros. essencial neste ponto que o
participante do curso tem uma noo dos conceitos de molaridade e

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porcentagem de solues. As primeiras solues a serem preparadas so as
solues de lise de parasitas P. falciparum.

1x PBS de 10x PBS

Solues concentradas so utilizadas em muitos laboratrios porque elas

permitem ter solues de uso rapidamente por mistura de solues concentradas
com gua. Para facilitar, muitas vezes usamos solues 10 vezes concentradas
de estoque, mas importante lembrar que o conceito 1x relativo! Uma
soluo 1x para um experimento pode ser chamado 3x para outro - dependendo
do experimentador e experimento.

Para diluio de solues n vezes concentradas vale para obteno de solues

uma vez concentradas ("1x", soluo de uso):

Volumesol. conc * n = Volumesol de uso * 1 ,

onde Volumesol de uso obviamente inclui Volumesol. conc plus gua. Vamos a um
exemplo: Teremos uma soluo 5x (cinco vezes concentrada) e queramos fazer
300 ml de uma soluo de uso (1x). A equao acima fica:

Volumesol. conc * 5 = 300 ml * 1 Volumesol. conc = 300 ml * 1 / 5

Volumesol. conc= 60 ml.

Desta maneira, cada grupo deve preparar 20 ml de PBS 1x em tubos Falcon 50

ml, atravs da soluo 10x fornecida.

No prximo passo, precisamos fazer a soluo para lise de parasitas. Esta soluo
tem como papel solubilizar qualquer estrutura membranosa (por detergentes
inicos fortes) do parasita e liberar os cidos nucleicos do mesmo. Para eficiente
separao dos cidos nucleicos dos demais componentes celulares (lipdeos,
aminocidos, protenas) tambm necessrio degradar protenas associadas ao
DNA genmico do parasita (histonas, fatores de transcrio, etc.) que ocorre por
aplicao de proteinases, neste caso a Proteinase K do fungo Tritirachium album.

A preparao da soluo de lise ocorre da mesma forma como a preparao de

solues diludas a partir de solues n*x concentradas. No prximo exemplo
preparamos 10 ml Tris/HCl pH 8 200 mM de uma soluo Tris/HCl pH 8, 1 M.

Est valendo:

Volumesol. conc * Concentraosol. conc = Volumesol de uso * Concentraosol de uso

que fica:

Volumesol. conc*1 M = 10 ml * 0.2 M, ou Volume sol. conc = 10 ml * 0.2, ou

Volumesol. conc= 2 ml

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Note que as unidades foram adequadas para molar (M) e se eliminam. Faa agora
1 ml do tampo 4x de lise de Plasmodium:

Tampo lise 4X Soluo

estoque
40 mM Tris/HCl pH 8 1 M Tris/ Tris/HCl
pH 8
4 mM EDTA pH 8 0,5 M EDTA pH 8
0,8 M NaCl 5 M NaCl
4% SDS 20% SDS

Agora prepare ainda uma soluo TE (1 ml)

TE Soluo estoque
10 mM Tris/HCl pH 8 1 M Tris/ Tris/HCl
pH 8
1 mM EDTA pH 8 0,5 M EDTA pH 8

Cada grupo deve buscar um isopor com gelo neste momento.

Os grupos 1-7 recebem um tubo com 100 l de sangue compactado com

parasitas P. falciparum cada um. Cuidado: nesta forma o parasita ainda est
vivo e pode infectar no caso da injeo ou aplicao do material em
mucosas! Primeiramente, liberamos o parasita de forma suave da hemcia
infectada utilizando uma soluo de saponina que interage com o colesterol da
membrana plasmtica da hemcia mas no do parasita (que no contem
colesterol).

Acrescente 1,25 ml de 1xPBS ao pellet de hemcias infectadas e

misture suavemente por inverso do tubo fechado
acrescente 150 l de 1% Saponina (fornecida).
incubar por 5 min no gelo, invertendo o tubo de vez em quando. A
soluo deve ficar transparente (suco de groselha).
centrifugar por 5 min a 12000 rpm na centrifuga Eppendorf.
Visualize o pellet preto e retire cuidadosamente o sobrenadante sem
mexer no pellet preto (mas retirando a fase branca de membranas
no topo do pellet)
Resuspende o pellet uma vez com 1 ml 1x PBS.
centrifugar por 5 min a 12000 rpm na centrifuga Eppendorf.
Retirar o sobrenadante e dissolva o pellet (~50 l) com 250 l TE.
Acrescente 100 l tampo de lise 4x, preparado acima.
Acrescente 20 l soluo Proteinase K (10 mg/ml, fornecida)
incubar 3 h ou o/n a 37C

Durante esta incubao as membranas do parasita esto sendo solubilizadas

pelo SDS (detergente inico) e protenas esto sendo degradadas pela Proteinase
K que possui seu timo de funcionamento em pH 8 e 1% SDS. No prximo passo
eliminamos lipdeos e protenas por extrao sequencial com fenol, fenol-
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clorofrmio e clorofrmio (cuidado: fenol txico, cancergeno e causa
queimadas na pele. Use luvas e no contamine os tubos por fora!).

acrescentar 400 l de fenol e incubar na gangorra por 10 min

centrifugar por 5 min a 8000 rpm na centrifuga Eppendorf.
transferir sobrenadante aquoso (no mexer na interfase branca) em
tubo novo e acrescente 400 l fenol-clorofrmio
incubar na gangorra por 10 min
centrifugar por 5 min a 8000 rpm na centrifuga Eppendorf.
transferir sobrenadante aquoso em tubo novo e acrescente 400 l
clorofrmio
incubar na gangorra por 10 min
centrifugar por 5 min a 8000 rpm na centrifuga Eppendorf.
acrescentar 800 l de Etanol 100%, inverter o tubo e observar a soluo:
um material transparente gosmento (gDNA) deve se transformar em
alguns fios, deixar incubar por 15 min no gelo.
centrifugar por 10 min a 8000 rpm e 4C na centrifuga Eppendorf
refrigerada. Verifique a posio da tampa do tubo no rotor para saber a
posio onde estar um pellet
Localizar o pellet minsculo retirar cuidadosamente o sobrenadante
Acrescentar 1 ml Etanol 70% e inverter o tubo 5 vezes, incubar 5 min a TA
na bancada

Neste ponto, o pellet de gDNA est sendo dessalinizado e descontaminado, isso

, impurezas como aminocidos e sal entram em soluo e apenas cidos
nucleicos maiores (gDNA e RNA) permanecem no pellet e no entram em
soluo.

centrifugar por 5 min a 8000 rpm na centrifuga Eppendorf.

retirar cuidadosamente o sobrenadante na sua totalidade (isso pipetar
embora com pipeta P1000 e recentrifugar -short spin- e retirar o restante
do liquido com a P20.
deixar secar brevemente na bancada com tampa aberta at no mais
haver cheiro de etanol ou fenol
acrescentar 50 l de TE, estocar na geladeira a 4C. O pellet est
dissolvendo lentamente.

Semear bactrias E. coli DH10 B, BL21 DE3 pLys RIL e XL1

blue MRF-(repique)
Uma das ferramentas mais importantes nos passos que seguem a obteno de
bactrias competentes. Para isso, de suma importncia ter de fato as bactrias
de forma pura e limpa e no eventuais cepas contaminantes que dificilmente se
tornaro competentes. Uma medida importante neste quesito semear as
bactrias de forma correta para obteno de colnias separadas que permitem
verificar eventuais contaminantes. A melhor forma para conseguir isso o
mtodo 3-streak ou das trs linhas, usando uma ala bacteriolgica de fio de
platino (Figura 2).
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Antes de poder semear bactrias precisaremos de placas LB com e sem
antibiticos. Prepararemos 1 litro de agar em dois Erlenmeyers de 1 l.

Meio LB - agar pr-misturado: 35 g em 1 Litro de agua deionizada, autoclavar por

20 min a 121C.

depois de esfriar at ~45C, acrescentar 500 l ampicilina 100 mg/ml

(1000X) em um Erlenmeyer com 500 ml do LB-agar liquido, mexer sem
fazer muita bolha.
fazer 8 placas LB sem antibiticos (escrever sempre no fundo da placa o
que ), depois acrescentar 300 l de ampicilina 100 mg/ml.
deixar esfriar no escuro (muitos antibiticos so instveis na luz)
guardar na geladeira, empilhado e embrulhado com vitafilme.

Figura 2: Esquema do modo de semear corretamente bactrias. Note que

entre cada 3 linhas paralelas a ala esterilizada na chama. Assim, garantido
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que ocorre uma diluio seriada na superfcie da placa LB-agar e a obteno de
colnias separadas nas ltimas diluies.

Outro critrio importante o uso adequado de mtodos que selecionam a cepa

bacteriana em uso. No caso de E. coli DH10B (ou DH5), est sendo aplicado
estreptomicina (50 g/ml). No caso da cepa BL21 DE3 pLys RIL usado nos
prximos dias, usaremos LB-agar suplementado com cloranfenicol (34 g/ml).
XL1 blue MRF- e E. coli SURE devem ser crescidas na presena de 12.5 g/ml
Tetraciclina.

Procedimento:

Inicialmente, aplicamos 10 l de uma soluo 100 mg/ml estreptomicina, 20 l de

34 mg/ml Cloranfenicol, e 20 l de Tetraciclina (12.5 mg/ml) em trs placas LB-
agar (uma placa para cada par de grupos) e espalhamos mediante a esptula
Drigalski, esterilizada mediante lcool 70% e chama. A queima do lcool na
esptula evita que a mesma esquente (no segurar a esptula na chama, deixar
queimar sozinho). Incube as placas por 15 min a 37C.

A partir de uma suspenso feita em 1 ml PBS a partir de uma colnia de placas

antigas, semeie a placa LB-strep com DH10B, depois a LB-cloranfenicol com BL21
RIL e a placa LB-tet com XL1blue conforme indicado em figura 2.

1. Escreva no fundo da placa o que ser semeado e a data. Evite

escrever na tampa porque esta pode ser trocada.
2. Primeiro, esterilize a ala na chama. Depois, esfrie a mesma colocando-
a no meio da placa a semear.
3. Mergulhe a ala na soluo bacteriana contendo E. coli
DH10B/BL21/XL1blue. Verifique se h um fio de liquido na ala.
4. Passe este liquido suavemente na placa sem arar o agar, fazendo 3
linhas.
5. Esterilize a ala, vire placa em 90, e repita o processo em passo 3. A
primeira linha cruza as 3 linhas anteriores, a segunda, duas, e a
terceira apenas uma linha antes feita.
6. Repita passo 4.
7. Feche a placa e incube-a a 37C por 12-16 h (at o dia seguinte).

No dia seguinte, precisamos de meios de cultura para crescer as bactrias para o

procedimento de torn-las competentes. Grupos 1 e 2 devem crescer E. coli
DH10B, 3 e 4 devem crescer E. coli BL21 RIL e os grupos 5 e 6 devem crescer
XL1 blue MRF-. Assim cada grupo deve preparar 100 ml de SOB liquido em
erlenmeyers de 500 ml (a partir dos componentes fornecidos) e colocar para
autoclavar (20 min, 121 C). Vamos usar muitas placas LB agar tambm. Um
grupo deve preparar ainda um litro de LB agar em dois frascos de 1 l.

Receita para 1 litro de SOB: 5 g extrato de levedura, 20 g triptona, 10 mM NaCl,

2,5 mM KCl, dissolver em 900 ml gua deionizada, ajustar pH para 7.5 (papel pH)
com aprox. 2,5 ml 10 M NaOH, autoclavar 20 min a 121C, depois acrescentar
at MgSO4 at 20 mM final.

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Receita para 1 litro de LB-Agar (Lysogeny broth, mais conhecido como Luria
broth, Luria Bertani broth ou Lennox broth): 10 g Triptona, 5 g Extrato de
levedura, 10 g NaCl, 15 g Agar. Deixar esfriar para <50C, acrescentar antibitico
estoque na concentrao certa e despejar aprox. 20 ml por placa Petri. Deixar no
escuro a temperatura ambiente at o dia seguinte, depois guarde na geladeira.

Cheque sua bancada e limpe-a antes de sair. Guarde os produtos e solues na

geladeira ou no freezer e descarte seu banho de gelo. At amanh!

Dia 2

Metas do dia: Quantificar gDNA, organizar e pipetar PCR com os diversos Oligos,
anlise do resultado, conhecer cultivo in vitro de P. falciparum separando formas
trofozoitas/esquizontes, inocular bactrias em minicultivos de 5 ml (pr-inculos).
Busque um isopor de gelo por grupo.

cidos nucleicos consistem de pentoses (ribose) ligados a grupos pirimidinas e

purinas (Figura 3). Os grupos pirimidinas e purinas possuem um espectro de
absoro de luz que permite a medio da sua concentrao em solues
aquosas. Entretanto, importante considerar que tanto RNA quanto DNA
absorvem luz no comprimento de onda de 260/280 nm, tornando difcil medir a
quantidade de DNA numa mistura de RNA e DNA, como ocorre por exemplo na
nossa preparao de gDNA. Por isso, tentaremos visualizar o gDNA por separao
eletrofortica em gis de agarose corados com brometo de etdio.

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 Figura 3: cidos
nucleicos que formam RNA e DNA. Note que as bases (purinas e pirimidinas)
esto conectadas via o nitrognio na molcula de acar, l na posio 1. Os
aucares so acopladas por ligaes di-ester (asterisks, oriundo da reao de
grupo alcolico com um cido) entre si, formando polmeros. Note que DNA
consiste de deoxi-ribose, que significa que o grupo hidroxila no C2 da ribose
apenas um hidrognio. Origem das imagens: no sentido horrio: uic.edu,
Absoluteastronomy.com, knowledgeclass.blogspot.com.

Para fazer um gel de agarose, apenas um grupo deve preparar uma soluo de
40 ml de 1x TAE (fornecido) contendo 0,4 g de agarose num Erlenmeyer de 250
ml. Esta soluo colocada na microonda e fervida por 1 min ou at a total
dissoluo de cristais de agarose. Use a luva trmica para mexer a soluo e
assim dissolver a agarose.

Enquanto a soluo de agarose esfria at ~50C, o caminha a forma que

conter o gel preparada. Use o pente fornecido e coloque em posio para
permitir o mximo caminho possvel para a amostra migrar no gel (Figura 4).

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Figura 4: Montagem do tray ("caminha") para fazer gel de agarose.Tome
cuidado para a fita adesiva fechar perfeitamente os lados. Nunca coloque
soluo acima de 50C para gelificar porque o acrlico comea a rachar e a fita
vai soltar e despejar gel com brometo na bancada.

Quando esfriado, acrescente 1 l de soluo de brometo de etdeo no gel.

Cuidado! Brometo de etdeo cancergeno e permeia a pele e possui
volatilidade em soluo aquecida. Assim, no toque no gel sem luvas e
no respire os vapores logo aps despejar o gel na forma. Depois de
colocado a agarose com o brometo de etdeo, tire as luvas e deixe-as no lugar do
gel.

Neste momento, cada grupo deve preparar um tubo Eppendorf com 5 l da

soluo de gDNA e misturando com a quantidade correta de 6x gel loading buffer
(fornecido). Quanto seria esta quantidade certa para ficar 1x concentrado na
final?

Soluo estoque de 50x TAE: 242 g Tris Base (MW=121.1), 57.1 mL cido
actico glacial, 100 mL 0.5 M EDTA pH 8. 6X gel loading buffer: 6X TAE, 50%
(v/v) glicerol, 0,01% azul de bromofenol.
Aps o gel gelificar, o pente retirado e as amostras so colocadas nos pocinhos
formados. Como controle do tamanho das molculas, colocaremos um marcador
de peso molecular que consiste de molculas de DNA de tamanho conhecido. Em
seguida, aplicamos por 20 min um campo eltrico de 120 V para forar a
migrao das molculas de DNA pelo gel. As molculas separadas so
visualizadas no fotodocumentador (eagle eye).

PCR (polymerase chain reaction)

Aps confirmao da existncia de gDNA nas solues dos grupos, procedemos

para a amplificao seletiva de fragmentos de DNA mediante a reao em cadeia
da polimerase. Prepare para isso primeiramente um banho de gelo e uma soluo
de tampo PCR 10x a partir das solues estoque fornecidos. Quem no tiver
certeza da pureza do gDNA, pode receber gDNA 3D7 feito e testado.
16
10x PCR buffer (escreva as quantidades aqui) Solues
estoque

100 mM TrisCl pH 8.8 1 M TrisCl pH 8.8.

25 mM MgCl2 500 mM MgCl2

500 mM KCl 3 M KCl

Acrescente gua milliQ para um volume final de 0.5 ml.

Localize os oligonucleotdeos, cada grupo amplificar um fragmento de um gene

diferente. Os oligos so concentrados em 5 pmol/l. Misture-os, aplique um short
spin para coletar o liquido no fundo do tubo e devolva-os ao gelo. Prepare dois
tubinhos 0.2 ml escrevendo na lateral (no na tampa vai apagar durante a
reao no termociclador) o que contem: gDNA ou controle plus seu
nmero de grupo.

Pipete a reao desta maneira, acrescentando na sequencia indicada (use

apenas a pipeta P20) no tubo marcado como controle/grupo No. XY:

gua milliQ 22.4 l

10x PCR buffer 4 l

dNTPs (2.5 mM cada) 4 l

Oligo forward (5pmol/l) 4 l

Oligo reverse (5pmol/l) 4 l

Taq Polimerase (5U/l) 0.2 l

Ajuste agora a pipeta para 19.5 l, misture a soluo pipetando sem fazer bolhas
ou gotculas na parede do tubo e transfira 19.5 l para o tubo gDNA/grupo No.
XY. Acrescente neste tubo 0,5 l do seu gDNA e feche os tubinhos. Se usar em
paralelo o gDNA 3D7 backup, ter que preparar soluo para 3 reaes.

Aps todo mundo tiver pipetado a reao, os tubos so colocados no

termociclador. O programa foi pr-testado para amplificar todos os fragmentos
(94C, 40 s, 53C, 40 s, 65C, 2 min). No prximo passo os fragmentos de PCR
so visualizados novamente em gel de agarose. Ao contrrio do primeiro gel com
gDNA, esta vez vamos retirar o fragmento formado do gel de agarose para
purificao do produto de PCR. Neste passo vamos comparar a eficincia da
posterior clonagem utilizando mtodos de purificao diferentes. Um dos
mtodos envolve a utilizao de gel de TAE agarose que dispensa brometo de
etdeo e luz UV para visualizar o DNA: o gel corado com Crystal Violet (utilizado
tambm na microbiologia na colorao segundo Gram). Grupos 5 e 6 fazem o gel
com Crystal Violet (um gel para os dois grupos).

Grupos 1-4 preparam um gel 1% TAE-agarose comum, enquanto 5 e 6 preparam

um gel 1% CV-TAE. Acrescente as amostras do PCR agora o 6x TAE loading buffer
17
correto (Tampo normal para gel de brometo e 6x CV-TAE loading buffer para o
gel CV-TAE). Quanto tampo 6x para acrescentar aos 20 l de reao?

Gel de Crystal violet

Soluo estoque: 2 mg/ml Crystal violet em metanol puro (geladeira).

6x CV-TAE loading buffer (0,1 mg/ml Crystal Violet in 6xTAE): 100 l 6x TAE
loading buffer sem azul bromofenol (fornecido) + 5 l Crystal Violet estoque

6x CV-TAE.

1% CV-TAE gel: 40 ml TAE + 0,4 g agarose "cloning grade", aquecer, esfriar at

Corra o gel por 20 min a 120 V. Grupos 5-6 devem observar o gel durante a
corrida porque bandas fracas podem ficar invisveis rapidamente, a sensibilidade
do CV 10 vezes menor que de gis corados com brometo. Aps corrida as
bandas so visualizadas (gis de brometo) e as bandas so excisadas com
bisturi. Tente no superar 1-2 mm de espessura do pedao de gel cortado. O
fragmento de agarose colocado num tubo eppendorf identificado com o nome
do gene que est amplificando/o nmero do seu grupo.

Neste momento os grupos 1,2 e 5,6 seguem o protocolo abaixo, enquanto grupos
3 e 4 devem consultar a bula do kit de purificao de fragmentos. Grupos 1,2,5,6
devem preparar juntos antes 20 ml de NEW wash buffer: 20 mM Tris/Cl pH7.5,
0,01 M NaCl, 2 mM EDTA, 55% (v/v) EtOH em H 2O milliQ e deix-lo no gelo.
(estoques: 1 M Tris pH 7.5, 0.5 M EDTA, pH8, 5 M NaCl, 100% EtOH)

Purificao de fragmentos de DNA com Glassmilk

- cortar banda do gel (evitar muita exposio luz UV) e colocar no
eppendorf 1.5 ml

- adicionar 3 volumes NaI (6 M) e incubar a 37C at dissolver

completamente o agarose

- adicionar 5 l Glassmilk (100 mg/ml em 3 M NaI)

- incubar 5 min a TA, mexer de vez em quando

- centrifugar 1 min full speed, jogar o sobrenadante (tirar com pipeta)

- lavar o pellet branco 1x com 1 ml NEW wash buffer (-> ressuspender

(vortex), centrifugar, jogar sobrenadante), re-centrifugar 10 s e tirar todo
liquido com a P200, deixar secar 5 min a TA na bancada (para evaporar o
lcool)

- Adicionar 15-20 l TE, LoTE ou H 2O, misturar bem e incubar 10 min a TA (o

pH certo para soltar o DNA do glassmilk entre pH 6 e 8)

- centrifugar, 1 min full speed

18
- Pipetar o sobrenadante para um tubo novo com identificao sem
transferir glassmilk

- O fragmento purificado est pronto para uso. Mantenha-o no 20C

(meses-anos?) ou no gelo (uso ~ imediato).

Purificao de parasitas na fase de trofozoita/esquizonte

Este experimento deve ser conduzido por um voluntrio com orientao de um

experimentador experiente em cultivo de P. falciparum. Uso de luvas e
conscincia que o procedimento tem que ser conduzido de forma estril
so essencial. Localize antes de comear: 1 tubo 15 ml fresco estril,
meio RPMI completo, meio RPMI incompleto, "Amido", 2 garrafas de
cultivo celular 75cm2, Etanol 70% para lavar, lminas de vidro e
"carrinho", pipetador motorizado, pipetas pasteur estreis, pipetas de
vidro estreis e contineres para descarte dos mesmos, e uma caneta
prova de gua, um lpis, e um isqueiro. Parasitas em cultivo misto (1
garrafa 75cm2) tem seu meio aspirado. Faa-se um esfregao do material. Logo
depois, os parasitas so ressuspendidos em 10 ml de meio RPMI puro e a soluo
transferida de forma estril para um tubo falcon 15 ml e centrifugado a 1500
rpm na centrifuga Sorvall com rotor swing-out.

Depois de voltar ao fluxo laminar, o meio aspirado e o volume das

hemcias compactadas medido na escala do tubo.
Acrescente agora 1.4 deste volume com meio RPMI completo (com plasma
e bicarbonato) e misture suavemente.
Acrescente agora 2.4 volumes Voluven 6% ("Amido", "Plasmagel") e
misture sem fazer bolhas.
Feche o tubo e incube-o na posio vertical por aprox. 30 min na estufa a
37C. Aps este tempo, visualize as hemcias que foram para o fundo do
tubo formando uma linha ntida para o sobrenadante turvo. Este
sobrenadante possui os trofozoitas e esquizontes. Esquizontes tardios e
formas anis no so recuperados (estouram ou ficam no pellet,
respectivamente).
Recolhe cuidadosamente o sobrenadante e pipete-o para a mesma garrafa
75cm2.
Identifique mais duas garrafas 75cm2 e coloque 10 ml de RPMI completo
em cada uma.
Acrescente 2.1 ml sangue fresco soluo de trofozoitas purificados
Acrescente meio completo para alcanar 15 ml na mesma garrafa com
parasitas e sangue fresco.
Aliquote com a mesma pipeta 5 ml em cada uma das 3 garrafas.
Acrescente 10 ml de meio completo que apenas contm os 5 ml parasitas
ressuspendidos.
Feche as tampas sem apertar: essencial que haja troca de gases entre o
ambiente dentro e fora da garrafa.
19
 Coloque as garrafas cuidadosamente na caixa 100% prova de ar e ascenda
as velas. Feche a tampa em seguida espere as velas apagarem sem fazer
fumaa. Se ocorrer um burn-out do pavio, abra o box novamente e repita
o fechamento com velas acesas.
Coloque a caixa sem tombar na estufa. As tampas no devem molhar
neste passo.
Deixe o fluxo como o encontrou: limpo e sem lixo, coloque as
pipetas pasteur para lavar e remova qualquer item descartvel
que utilizou.

Depois de tudo, os pr-inculos das bactrias tem que ser lanadas. Para isso 5
ml de SOB so tirados dos 100 ml preparados e colocados num Erlenmeyer 50
ml. Acrescente a quantidade correta de estreptomicina (soluo estoque 2000X)
na garrafa para DH10B, tetraciclina (estoque 1000X), e cloranfenicol (1000X)
para as bactrias DH10B, BL21 RIL e XL1 blue, respectivamente. Com a ala
bacteriolgica esterilizada na chama, inocule uma nica colnia de cada
linhagem bacteriana por garrafa no meio. Coloque os inculos no shaker orbital a
temperatura ambiente, a 100 rpm.

Cheque sua bancada e limpe-a antes de sair. Guarde os produtos e solues na

geladeira ou no freezer e descarte seu banho de gelo. At amanh!

Dia 3
Metas do dia: Preparao de clulas competentes: DH10B, BL21 RIL, XL1blue.
Recolher parasitas anel (cedinho), trofozoita (mais tarde possvel). Ligar
fragmento amplificado em pGEM T easy, transformar em DH10B e XL1blue.
Busque um isopor com bastante gelo por grupo.

A primeira atividade inocular 2 ml do pre-inculo crescido no restante (95 ml)

do meio SOB (aps colocar os antibiticos necessrios), que deve estar a
temperatura ambiente. Coloque o cultivo no shaker orbital a 100 rpm e
temperatura ambiente. Assegure que a soluo CCMB80 est no gelo.

Recolhimento de parasitas em forma anel

Um voluntrio/a deve preparar o fluxo laminar como descrito anteriormente, sem
as garrafas novas. Em vez dos meios, coloque uma garrafa com 1xPBS, no
precisa esquentar para usar. Coloque tambm um tubo 15 ml estril no fluxo.
Verifique se h Trizol LS perto do fluxo/na bancada. O fluxo laminar deve estar
ligado com luz UV por uns 20 min at podermos trabalhar com segurana
biolgica l dentro (ambiente estril). Depois deste prazo, o voluntrio/a deve
retirar a caixa com os cultivos da estufa e abrir no fluxo retirando uma garrafa
com cautela para no molhar a tampa dela. As demais garrafas permanecem na
caixa; a mesma fechada com vela acesa. Verifique se no forma fumaa ao
apagar. Retorne os cultivos para a estufa. Depois:

Aspire o meio de cultura.

faa um esfregao, core-o, analise o se h predominantemente formas
anel.
20
 Retire os parasitas lavando com 12 ml 1x PBS e coloque dentro do tubo 15
ml.
Acrescente 1,5 ml Saponina 1%.
Incube 10 min no gelo, virando o tubo de vez em quando.
Quando a soluo estiver com cor de suco de groselha, centrifuge o tubo
10 min na velocidade 2800 rpm (Sorvall) ou 4000 rpm (Eppendorf) no rotor
swing out.
Aspire e descarte o sobrenadante, mas visualize antes o pellet de parasitas
e as membranas acima do pellet. Deixe aprox. 500 l no tubo. Os prximos
passos devem ocorrer fora do fluxo.
Lave o pellet uma vez com 1 ml 1x PBS e transfira a soluo para um tubo
Eppendorf identificado como 3D7 ANEL, data. Centrifuge-o a 12000
rpm,4 C, 5 min.
Retire o sobrenadante e acrescente at 100 l 1x PBS, resuspenda o pellet
at a homogeneidade (sem grumos).
Acrescente 750 l Trizol. Misture vortexando por 15-30 segundos, no pode
sobrar nenhum grumo de pellet.
Guarde esta soluo no freezer -20C.

Arrume o fluxo laminar como descrito anteriormente.

Setup de uma ligao

No prximo passo, ligamos os fragmentos de PCR purificados em um vetor de
clonagem de produtos PCR (A/T cloning vector). O vetor escolhido pGEM T
easy (Promega). Coloque seu fragmento purificado no gelo. Na figura 5 est
mostrado o mapa do plasmdeo com os stios de restrio e os elementos
contidos nele.

21
Localize no gelo central os componentes do kit: vetor pGEM T easy (tampa
amarela), 2x tampo de ligao (tampa branca) e a enzima T4 DNA ligase (tampa
verde). O kit caro e normalmente suficiente fazer reaes de ligao de 2.5
l, desde bem pipetados. Prepare dois tubos com a identificao: pGEM -
Nmero do grupo ou gene amplificado. Coloque 0,75 l do fragmento purificado
num dos tubos e escreva L na tampa, isso identificar que essa a ligao.
Utilize a pipeta P10.

Um voluntrio/a preparar a soluo master mix. Utilize a pipeta P10.

Ligao:

1x 7x

0.25 l 1.75 l Vetor pGEM T easy

1.25 l 8.75 l 2x Ligation buffer

0.25 l 1.75 l T4 Ligase

Cada grupo deve pipetar imediatamente 1.75 l (Utilize a pipeta P10) da soluo
master em cima do seu fragmento no tubo
22 marcado com L na tampa. Misture a
minigotcula por flicking e aplique um short spin para coletar todo liquido no
fundo do tubo. Incube o ensaio num banho de gua a aprox. 10 C. Em princpio,
90% dos fragmentos que podem ser ligados, estaro ligados dentro de ~15 min.
Ns esperamos mais tempo para aproveitar as clulas competentes que esto
crescendo para fazer a transformao.

Preparao de clulas E. coli competentes

Para a preparao de clulas competentes essencial possuir vidraria livre de
sabo de qualquer tipo e plasmdeo. Isso significa que a vidraria deve ser
fornada tempo suficiente para eliminar qualquer resduo 2 h a 180 C. O segundo
ponto essencial que a partir do momento quando a densidade tica ideal
alcanada, todas as manipulaes devem ser no gelo (0-4 C). As solues devem
estar pr-geladas para 0 C. As centrifugas devem estar geladas e os tubos e
ponteiras P200 de aliquotar utilizados tambm. O terceiro ponto que as
bactrias devem estar crescendo de forma logartmica. Se achar que o inoculo
no vai bem, prepare outro. Se a bactria centrifugada possui muito material
preto (bactria morta) no fundo do tubo aps centrifugao, descarte. Procure
sempre fazer clulas competentes a partir de uma placa fresca (< 1 semana na
geladeira). Nunca perca ou contamine sua cepa de bactrias, e tenha
sempre um backup no nitrognio liquido.

Prepare os tubos eppendorf onde vai congelar as bactrias depois com

antecedncia e guarde os no freezer -20 C. Assim, os tubos das clulas DH10B
devem ter uma 10 na tampa, as BL21 RIL um RIL e as XL1 blue MRF - um XL.
Quando o cultivo chega a uma densidade tica (600 nm) de 0.4, o cultivo
transferido para tubos Falcon 50 e colocado no gelo.

Centrifuge o cultivo por 10 min a 3500 rpm na centrifuga Eppendorf

gelada, a 0 C.
descarte o sobrenadante ao mximo possvel sem perder o pellet,
invertendo o tubo para o frasco do lixo liquido contaminado (pode ser um
dos erlenmeyers do cultivo)
devolve os tubos para o gelo. Resuspende o pellet com 1 ml CCMB80
buffer de forma suave.
Acrescenta mais 15 ml em um tubo (pipeta descartvel 10 ml) e 15 no
outro tubo com uma pipeta. No contamine o tampo CCMB80.
Transfira tudo ara um dos tubos, juntando os volumes com a mesma
pipeta. Depois, descarte-a.
Incube por 20 min no gelo.
centrifuge 10 min a 3000 rpm e 0 C, depois descarte o sobrenadante.
resuspende as clulas em 2 ml CCMB80 suavemente e sem esquent-las,
as clulas esto fragilizadas neste ponto.
retire 50 l da soluo e acrescente 200 l LB e mea a DO 600nm, a soluo
deve dar uma DO de 1 a 1,5. Se estiver mais alto, acrescente CCMB80 na
soluo estoque at chegar neste valor.
Incube mais 20 min no gelo.
Sempre no gelo, aliquote com as ponteiras P200 geladas 125 l da soluo
nos eppendorfs gelados e previamente identificados na tampa.
No final, os tubos com as bactrias so congelados por >30 min no -80 C.
23
 Tampo CCMB80: 10 mM KOAc pH 7.0 (10 ml de um estoque 1M), 80 mM
CaCl2.2H2O (11.8 g/L) 20 mM MnCl 2.4H2O (4.0 g/L), 10 mM MgCl2.6H2O (2.0
g/L), 10% glicerol (100 ml/L) ajuste o pH para baixo at 6.4 com 0.1 M HCl se
necessrio. Esteril-filtrar e guardar no escuro a 4C (pode formar um pouco de
precipitado preto que no tem problema).

Calculando competncia das bactrias competentes

A unidade que descreve a competncia de bactrias e nmero de colnias
formadas a partir de um g de plasmdeo transformado, em ingls colony
forming units per g of plasmid (cfu/g). Figura 6 ilustra de forma ldica qual
competncia desejvel e qual insuficiente.

Figura 6: Classificao de qualidade de clulas competentes. A partir de

105 cfu/g as bactrias podem ser utilizadas para retransformao de plasmdeos
prontos. Bactrias com 106 cfu/g podem ser utilizadas para clonagens simples
(fins coesivos). Bactrias com 10 7 cfu/g podem ser utilizadas para A/T cloning e
clonagens envolvendo fins blunt, e a partir de 10 8 cfu/g as bactrias servem
para construo de bibliotecas onde o nmero de clones tem que ser grande.

Para medir competncia de clulas necessrio ter um plasmdeo quantificado e

puro. O plasmdeo diludo para quantidades por l que resultaro em nmeros
contveis temos que estabelecer um valor de competncia que esperamos e
transformar tanto plasmdeo para que tenhamos um nmero representativo
(entre 20 e 100) de colnias com o valor estimado de competncia.

Calcule como tem que diluir um plasmdeo de 1.5 g/l para obter 30 colnias,
assumindo que tem clulas com eficincia 10 6 cfu/g. Transformamos 1 l da
soluo contendo plasmdeo.

Transformao
Prepare dois tubos Eppendorf escrevendo o nome do plasmdeo a ser
transformado/clonado na parede e coloque 1 l da ligao ou do plasmdeo
teste diludo (por lote de bactrias, um tubo teste deve ser transformado),
coloque no gelo.
Para todos os grupos: Descongele no gelo duas alquotas de bactrias
DH10B e duas alquotas de XL1 blue.
Acrescente 25 l de DH10B aos tubos com ligao e ao tubo teste. Repita
isso com 25 l XL1 blue nos demais tubos. No final, cada grupo deve ter 2

24
 tubos: 1 l de cada ensaio de ligao transformando em DH10B e em
paralelo em XL1 blue.
Um grupo deve diluir o plasmdeo teste (fornecido no ato) e transformar 1
l diludo em DH10B e 1 l em XL1 blue, para clculo da competncia.
Incube os tubos 30 min no gelo.
Prepare placas com 4 l 1 M IPTG e 20mg/ml X-gal (pode preparar um
mastermix destas solues, espalhando com esptula Drigalski)
Escreva em cada placa (no fundo) qual antibitico tem (ex. LB-amp, LB-
amp-tet, LB-amp-cam) e qual bactria transformada com qual plasmdeo
est plaqueado.
Depois transfira os tubos rapidamente para um banho Maria a 42C, por
exatos 60s. Retorne os tubos ao gelo.
Aps 1-2 min, acrescente 125 l de LB,feche o tubo e coloque o na estufa.
Incube por 20min.
Mediante esptula Drigalski, semeie as bactrias nas placas e coloque as
na estufa 37C.

Recolhimento de formas trofozoita

Um voluntrio deve repetir exatamente o que foi feito com as formas anel de
manh. No final, deve se obter um pellet de parasitas maior que o de anel (o
parasita aumentou seu volume) que ressuspendido em PBS/Trizol LS.

Cheque sua bancada e limpe-a antes de sair. Guarde os produtos e solues na

geladeira ou no freezer e descarte seu banho de gelo. At amanh!

Dia 4
Metas do dia: Recolhimento de formas esquizonte, clculo de eficincia de
bactrias competentes atravs das placas com plasmdeo controle. Preparao
de RNAs das trs formas sanguneas. Gel de RNA. Sntese de cDNA. Setup de PCR
controle de qualidade e contaminao de cDNA. Inculo de minipreps pGEM.
Pegue um banho de gelo.

Recolhimento de formas esquizonte

Um voluntrio deve repetir exatamente o que foi feito com as formas anel de
manh. No final, deve se obter um pellet de parasitas maior que o de trofozoita e
bem mais preto devido a hemozoina que ressuspendido em PBS/Trizol LS.

Clculo de competncia das bactrias

Conte o nmero de colnias na placa. Considere a quantidade de DNA em g na
placa. Divide o nmero de colnias por g e compare o resultado com a escala da
Figura 6. Na placa com transformaes com pGEM, observe a aparncia de
colnias: Elas esto uniformes ou polimrficos em tamanho? Quais cores
observa?

Depois guarde as placas na geladeira (ou deixe na bancada se o tamanho das

colnias for ainda inferior a 1 mm em dimetro).

25
Purificao de RNA de parasitas
Neste procedimento necessrio ter total ateno a partir do momento quando a
primeira precipitao de RNA ocorre, porque o ambiente est repleto de RNAse.
Todas as partes de dentro do tubo eppendorf incluindo a borda e a parte interna
da tampa no devem ser tocados direto com o dedo. Quem no estiver seguro,
deve usar luvas.

Descongele o RNA no banho seco a 37 C ou temperatura ambiente

Vortexar 15 segundos
deixar 15 min de repouso
acrescentar 200 l de clorofrmio RNAse free, fechar tubo
misturar mexendo por 30 segundos, deixar repousar 15 min
centrifugar a 4C, 12000 rpm, 15 min
transferir o sobrenadante para um tubo identificado "RNA 3D7
trofo/anel/esquizonte", acrescente 500 l Isopropanol 100 % RNAse free
deixar repousar 45 min a temperatura ambiente ~20-25C.
centrifugar 60 min ("over lunch") a 12000 rpm, 4C, oriente o flap da
tampa do tubo para fora (para depois saber onde para esperar o pellet!)
Remove o sobrenadante, virando o tubo em cima do lixo liquido.
Acrescente 500 l EtOH 75% RNAse free, no precisa misturar
Centrifuge novamente 5 min 12000 rpm, 4 C depois descarte o
sobrenadante por completo (short spin e tirar o resto do liquido com P200)
deixe o pellet secar a TA.
Ressuspenda o pellet em 20 l de gua MilliQ fresca e RNAse free (direto
do aparelho MilliQ).
Neste ponto, pode congelar o RNA a -80 C. Como procedemos direto para
sntese de cDNA, amarre o tubo no vortex e deixe rodar por 10 min a
mdia fora (regule para que a gotcula permanea mais ou menos no
fundo do tubo). Depois guarde o tubo no gelo.

Teste de qualidade do RNA em gel TBE

Para averiguar que no ocorreu nenhuma degradao precoce do RNA por
RNAses contidas na amostras ou introduzidas no meio da purificao, 2 l do RNA
so misturados com 3 l de gua milliQ limpo em um tubo novo com 1 l tampo
de corrida especial para gis TBE (6x loading buffer apenas com glicerol e azul de
bromofenol). Um voluntrio deve preparar o gel de 1x TBE igual 0,8% a um gel
de TAE agarose (com brometo), mas deve usar a cuba especial de RNA que
manuseada apenas com luvas. O tampo de corrida e 1x TBE. Carregue e corra o
gel 30 min e documente o resultado no eagle eye.

Sntese de cDNA
No prximo passo, sintetizamos a fita complementar ao RNA (complementary
DNA, cDNA) mediante a enzima transcriptase reversa (RT), uma enzima
encontrada em retrotransposons e alguns vrus com genoma RNA, como por
exemplo HIV, HTLV1, Rous Sarcoma vrus e o Moloney Murine Leucemia vrus
(MMuLV). A ltima foi otimizada para fins de Biologia Molecular. Transcriptases
reversas possuem comumente duas atividades: A funo DNA - polimerase 5-3
26
RNA-dependente e a funo RNAse H, que RNAse 5-3 DNA-dependente (Figura
7).

Figura 7: Atividades da RT (RNAse H+). Note que a enzima necessita de um

primer de DNA para iniciar a sntese de DNA. Neste caso o primer um oligo dT
que hibrida em todos os RNAs com um longo trecho de As, como comumente
encontrado em transcritos (RNA mensageiro).

Existem no mercado enzimas RT com e sem funo RNAse H. Nos utilizamos a

verso com RNAse H. A funo da RNAse H importante para posterior
amplificao por PCR de fragmentos acima de 1000 nt. Tambm existem vrios
mtodos para sntese da primeira fita de DNA, no exemplo em figura 7 usa-se um
oligonucleotdeo oligo dT (dT18). Quando necessrio analisar qualquer RNA
contido na clula, utiliza se DNA hexamrico randmico (dNdNdNdNdNdN = dN 6).
Em casos onde a quantidade de RNA muito limitada e/ou existe muito RNA no
relevante (organismos intracelulares, recolhidos com muito RNA do organismo
hospedeiro), pode-se usar oligos especficos antisense ao gene que para ser
testado. Em nosso caso utilizamos DNA hexamrico randmico.

Cada RNA recolhido por Trizol LS no mtodo batch como utilizado aqui pode
resultar em contaminao com DNA que pode posteriormente atrapalhar ou
falsificar (contaminar como substrato) anlises do cDNA por PCR. Por isso,
inclumos um passo onde o RNA tratado com uma DNAse 1 que degrada
seletivamente DNA contaminante na nossa preparao de RNA.

Tratamento de DNAse1 e transcrio reversa

Localize tampo DNAse1 e EDTA 50 mM, coloque-os no gelo.
Prepare um banho de gua a 20C num isopor com tampa, tenha um
flutuador para colocar tubos
ligue o banho seco a 65C.
Pipete com a P20 num tubo fresquinho:
o X l da preparao RNA (julgar a partir do resultado do gel TBE)
o Y l gua milliQ 27
 o 1 l DNAse buffer
o 1 l DNAse 1 (direto do freezer, no mantenha a enzima no gelo),
short spin.
o incube por 15 min a 20C.
o aps 14 min, prepare num tubo adicional 4 l de gua milliQ, 0.5 l
DNAse 1 buffer e 0.5 l de DNAse 1, acrescente isso no ensaio
(Vtotal= 15 l), short spin.
o incube por mais 15 min a 20C.
o aps 14 min, prepare num tubo adicional 4 l de gua milliQ, 0.5 l
DNAse 1 buffer e 0.5 l de DNAse 1, acrescente isso no ensaio
(Vtotal= 20 l), short spin.
o incube por mais 15 min a 20C, depois transfira para o gelo.
o acrescente 2 l da soluo de EDTA, short spin.
o aquece a soluo por 10 min a 65C, depois coloque no gelo.

Enquanto a DNAse 1 est sendo desnaturada, prepare dois tubos novos por RNA,
identificando Anel +RT, anel RT, trofo +RT, trofo RT, esquiz +RT, esquiz RT.
Descongele/localize os tubos 5X RevertAid buffer, 10 mM dNTPs. Pipete nos tubos
marcados com RT-:

10l DNAse1 RNA

2 l random oligos (10 pmol/l)
12,5 l H2O
aquece por 5 min a 65C
coloque no gelo, depois short spin.
acrescente 4l dNTPs 10 mM (no confunda com os dNTPs do PCR que so
2.5 mM)
acrescente 8 l reaction buffer 5X
acrescente 2l RNAse inhibitor
transfira 28.5 l em tubo marcado RT+.
acrescente neste tubo 1.5 l RevertAid, misture por flicking, short spin, e
incube 5 min a temperatura ambiente.
transfira o tubo para um banho seco ou Maria a 42C e incube por 50 min.

Quando terminada a reao, os ensaios podem ser congelados ou utilizados para

testar a viabilidade do cDNA e a ausncia de contaminao do RNA com gDNA
aps tratamento com DNAse 1. Para facilidade, o laboratrio possui um kit
teste para cDNA de P. falciparum que consiste de um PCR mix pronto e para
completar a reao necessrio apenas acrescentar cDNA e Taq Polimerase. O
gene amplificado, seryl-tRNA synthetase, tambm ser utilizado como calibrador
interno na posterior reao de PCR em tempo real. Localize o tubo 1x K1 Mix.
Um voluntrio deve pipetar esta reao. So trs cDNA a serem testados (3 tubos
cDNA RT+, e 3 controles RT-) plus um controle positivo (gDNA de P. falciparum
3D7) e um controle negativo (gua).

Prepare um strip tube com 8 tubinhos e escreva aos lados de cada tubo na
sequencia o que pipetar l dentro: a(nel RT)+, a(nel RT)- etc.
coloque 8x 15 l 1x K1 mix = 120 l no tubo con(trole)-
acrescente neste tubo 8x 0.08 l = 0.64 l (P20! no P10) Taq Pol, fique
com a ponteira.
28
 regule o volume para 15 l e aliquote 15 l em cada tubo.
acrescente 1 l de cada substrato (cDNAs ou RT- controle, gDNA) nos tubos
individuais.
feche os tubos com tampa strip
insere no termociclador, programa:
o 94C 40 s
o 54C 40 s
o 72C 40 s
29 repeties (30 ciclos).

A reao vai ser analisada no dia seguinte e pode permanecer no termociclador

sem refrigerao durante a noite. Inocule agora os minipreps para amanha dos
clones pGEM recombinante com seu gene amplificado, faa 6 clones por placa
(assim cada grupo tem 6 minipreps).

Utilize 1.5 ml TB amp liquido para crescer os minipreps em tubos 15 ml

previamente identificados (podem ser tubos usados limpos). Utilize a ala
microbiolgica para inocular os cultivos. Incube os cultivos inoculados com tampa
no totalmente fechada no shaker orbital a 37C.

Cheque sua bancada e limpe-a antes de sair. Guarde os produtos e solues na

geladeira ou no freezer e descarte seu banho de gelo. At amanh!

Dia 5
Metas do dia: Fazer minipreps, correr gel analtico do PCR com cDNA. Preparao
quantitativa de pGEX2T BamH1/EcoR1, anlise e restrio quantitativa
BamH1/EcoR1 dos minipreps pGEM, purificao e ligao em pGEX2T,
transformao em DH10B/XL1 blue.

Minipreparao de DNA plasmidial (segundo Sambrook et al.

1991, [9])
A minipreparao de plasmdeos uma tarefa essencial e importante em cada
laboratrio de Biologia Molecular e deve ser conduzida com boa qualidade para
que haja facilidade no manuseio dos plasmdeos depois (subclonagem,
sequenciamento etc.). O procedimento consiste da troca de solvente das
bactrias para um tampo isotnico e posterior lise com sabo e lcali para
desnaturao parcial de plasmdeos e total de gDNA e depois precipitao de
complexos sabo/gDNA e renaturao dos plasmdeos. Depois h eliminao de
sais e contaminantes por precipitao com isopropanol e Etanol a 70%.

- Inocular de uma placa LB-amp Agar, contendo colnias de bactrias

transformadas com seu plasmdeo, uma colnia em 1,5 ml LB-amp ou LB-
amp/tet (Bactrias Sure, XL1 blue MRF -), e incubar no shaker deitado com
tampa semi-aberta por 10-16 h (150-200 rpm).

- Peletar 1.5 ml de cultura (12000 rpm, 1 min), descartar sobrenadante

- Dissolver pellet em 200 l tampo 1 (vortex)

29
- Lisar as bactrias adicionando 400 l tp. 2 (10 min RT, mexer gentilmente
invertendo o tubo)

- Precipitar protenas adicionando 300 l tp. 3 (mexer forte, depois 5 min no

gelo)

- Peletar protenas 5 min 12000 rpm, 4C

- Retirar sobrenadante para novo tubo e precipitar adicionando 600 l

Isopropanol, inverter o tubo umas 5 vezes para misturar (opcional deixar 10
min a RT)

- Peletar (5 min, 12000 rpm, 4C ou TA)

- Lavar o pellet com 1 ml EtOH 70%, centrifugar 2 min 12000 rpm, TA.

- Secar pellet a TA, ressuspender com 50 l TE/RNAse 10 g/ml

- Analisar 2-4 l por restrio e/ou gel de agarose com fragmentos esperados
acima de 1000 nt, e 4-6 l abaixo de 1000 nt.

Tampo 1 miniprep: 10 mM Tris/HCl pH 7,5 ou 8, 1% Glicose (w/v), 25

mM EDTA pH 8,

Tampo 2: 0,2 M NaOH, 1% SDS.

Tampo 3: 3 M Acetato de potssio, 5 M Acido actico

Anlise de restrio de plasmdeos

No prximo passo tentamos verificar se o fragmento desejado de fato foi inserido
no vetor pGEM T easy. Observe novamente o mapa do plasmdeo nas paginas
anteriores e desenhe como seria o plasmdeo com o seu inserto, no esquea
que seu inserto introduz no 5' dele uma sitio BamH1 (GGATCC).

Vamos analisar os clones obtidos no miniprep da forma que j podemos excisar

do gel o pedao de DNA de interesse para subclonagem no vetor de expresso de
protena recombinante em bactrias E. coli. excisar o fragmento contendo o
fragmento do gene respectivo de cada grupo da maneira como segue (por
reao):

6 l Miniprep DNA Mastermix?

1.5 l tampo "3" l

0.4 l EcoR1 l

0.4 l BamH1 l

6.7 l H2O l

incubar o ensaio por 2 h a 37C (estufa).

30
Cada grupo deve analisar seus 6 minipreps desta maneira. Use o princpio
mastermix para pipetar as digestes. Depois corra um gel 1% agarose TAE e
excise de uma das digestes a banda que corresponde ao seu fragmento (400-
1000 bp) e purifique com Glassmilk como descrito anteriormente (captulo PCR).
O grupo 4 deve digerir em paralelo o vetor vazio pGEX2T (crescido na placa teste
de competncia) com as mesmas enzimas e deve purificar a banda nica
formada (em torno de 5 kB).

Ligao de fragmentos com sticky ends (finais coesivos)

Aps a purificao de vetor e inserto vamos proceder para ligao do fragmento
excisado do gel com o vetor pGEX2T. Em figura 8, a regio polylinker deste
plasmdeo est destacado.

Figura 8: Mapa do plasmdeo pGEX2T. LacI codifica o repressor lac que

reprime o tac promoter.

A ligao de fragmentos com finais coesivos (Sticky ends) ocorre num tampo de
ligase levemente diferente da ligao de fragmentos PCR (vide anterior). O
tampo consiste de Tris/Cl a pH8, ATP, MgCl 2 e Ditiotreitol, mas no contem
polietilenglicol que condensam molculas DNA (como o tampo da ligao em
pGEM T easy). Antes da ligao, os fragmentos mantidos no gelo so aquecidos

31
por 3 min a 42C para desfazer quaisquer dmeros/oligomeros de molculas
interagindo consigo formando concatmeros no ligados. Pipete:

tubo "Lig +" "Lig

controle"

vetor pGEX2T digerido com BamH1/EcoR1 0.5 l 0.5 l

Inserto digerido com BamH1/EcoR1 1.5 l --

_______________________ aquece a 42C por 3 min e retorne os tubos ao gelo.

Acrescente:

gua milliQ 2.3 l 3.8 l

Tampo ligase 10x 0.5 l 0.5 l

Ligase 0.2 l 0.2 l

Aplique um short spin e coloque os ensaios num banho de gua fria (10C) num
isopor. Incube por 30 min. Depois, transforme 1 l de cada ensaio em bactrias
competentes DH10B ou XL1 blue MRF- como descrito acima. As placas sero
recolhidas no sbado de manh e colnias sero inoculadas no domingo a noite.

Anlise de viabilidade do cDNA produzido

Neste passo, olhamos se o cDNA est de boa qualidade. Prepare um gel de TAE
Agarose 1.5%. Carregue o gel com os produtos de PCR da reao do cDNA com
oligomix K1. Verifique tamanho e intensidade de bandas formadas. Verifique se
no h produtos nas canaletas com produtos das reaes "-RT".

Cheque sua bancada e limpe-a antes de sair. Guarde os produtos e solues na

geladeira ou no freezer e descarte seu banho de gelo. At segunda feira!

Dia 6
Metas do dia: Minipreps e anlise dos clones pGEX2T recombinantes. Setup da
reao de sequenciamento. Seminrios sobre sequenciamento da prxima
gerao (Plataforma SOLiD, grupos 1-2, Plataforma 454, grupos 3-4, e IonTorrent
5-6), Retransformao de clones recombinantes pGEX2T em E. coli BL21 RIL.

Minipreps dos pGEX2T recombinantes

Analise o desempenho dos minipreps atravs da contagem de colnias na placa
com controle negativo (pGEX2T sem inserto) e na placa com plasmdeos
recombinantes (pGEX2T + inserto). Recolhe os minipreps que foram crescidos e
purifique os plasmdeos pGEX2T recombinantes conforme o protocolo anterior.
Analise a presena de inserto mediante teste de restrio (clivagem com BamH1
e EcoR1) conforme feito com os clones pGEM recombinantes, descrito
anteriormente. Quando pronto, escolha dois clones para retransformao em E.
coli BL21 RIL e sequenciamento.

32
Sequenciamento de plasmdeos pelo mtodo de Sanger
(dideoxy)
Para averiguar se no houve a introduo indevida de mutaes nos fragmentos
amplificados por PCR (a Taq Polimerase introduz 1 erro por 1000 bp
sintetizados), checamos a integridade do fragmento clonado por sequenciamento
semi-automtico na plataforma ABI 3100. O sequenciamento de DNA pelo
mtodo de Sanger, desenvolvido em 1976, inclui a sntese de DNA a partir de um
primer e uma moldura (fita simples) usando uma DNA polimerase e a presena
de nucleotdeos dideoxy que so randomicamente incorporados. No caso do
sequenciamento no ABI 3100, estes nucleotdeos dideoxi so marcados com
fluoroforos que emitem luz de quatro cores diferentes dependendo do
nucleotdeo dideoxi. Por exemplo dideoxi As emitem luz verde, dideoxi Cs
emitem luz amarela etc., e a emisso de luz destas cores diferentes medida e
computada no aparelho para gerar a sequencia do DNA analisado. Na figura 9, o
princpio do sequenciamento segundo Sanger mostrado.

Figura 9: Princpio de
sequenciamento dideoxi. Note que a incorporao randmica de terminadores
(nucleotdeos dideoxi marcados) leva a produo de vrios tamanhos de
fragmentos de DNA marcados com cores correspondentes ao seu ltimo
nucleotdeo. Estes fragmentos so separados em matrizes adequados (gis de
poliacrilamida, resina especifica etc.) e analisados por lasers e leitores de luz.

Para conduzir um sequenciamento, utilizamos o protocolo dos componentes do

kit de sequenciamento (BigDye 3.1, Applied Biosystems). A reao pipetada
desta maneira em tubos de PCR 0.2 ml:
33
Miniprep pGEX2T recombinante 2 l

Mix primer pGEX seq (1,25 pmol/l) 4 l

BigDye Mix (fornecido) 4 l

O ensaio submetido a uma reao de PCR no termociclador da sala de

sequenciamento do Dep. Parasitologia no ICB2. Aps a reao, so acrescidos 90
l de Isopropanol 66% e o ensaio e centrifugado a 12000 rpm por 20 min a TA.
Use caapas para centrifugar os tubinhos (tubo 0.5ml em tubo 1.5 ml com
tampas cortadas). Aps a centrifugao, descarte o sobrenadante (virando o tubo
no descarte liquido) e acrescente 100 l de Isopropanol 75%. Centrifuge mais 10
min a 12000 rpm e TA. Posteriormente, o sobrenadante descartado (pode
retirar o liquido com uma ponteira P20 sem perturbar o pellet invisvel) e o pellet
seco no escuro (o cromforo instvel na luz) e entregue ao tcnico que opera
o sequenciador.

Retransforma agora os dois plasmdeos (0.5 l) que so sequenciados em E. coli

BL21 conforme feito anteriormente. Marcando no fundo da placa, divide-a em
duas metades e plaqueie as duas transformaes na mesma placa nas metades
separadas. No esquea colocar cloranfenicol (34 ug/ml final) e ampicilina (100
g/ml) na placa. Coloque as placas na estufa 37C.

Cheque sua bancada e limpe-a antes de sair. Guarde os produtos e solues na

geladeira ou no freezer e descarte seu banho de gelo. At amanh!

Dia 7
Metas dos dia: Inocular pr-inculo e inculo principal em LB-amp-cam, induzir
bactrias e recolher. Anlise de sequncias no computador, montagem de
plasmideo in silico no programa APE.

Produo de protenas recombinantes com GST 1.

crescimento
A partir das placas feitas no dia anterior, inocule uma colnia de uma das
metades em Erlenmeyer 50 ml com 5 ml de LB-amp-cam liquido (preaquecido
para 37C) suplementado com 100 l de Glicose 40% e transfira o cultivo no
shaker 37C. Cresa por 2 h. Aps este perodo, cheque se o meio ficou
levemente turvo e transfira para um Erlenmeyer 500 ml com 50 ml LB-amp-cam
(preaquecido) e continue crescendo a 37C. Quando o cultivo chegar numa
densidade tica (600 nm) de 0.6, acrescente 10 l IPTG 1 M (fornecido) e
transfira o cultivo para o shaker orbital temperatura ambiente. Continue
crescendo por 3 h. Depois deste tempo, recolha as bactrias por centrifugao
em tubos Falcon 50 ml por 15 min a 2800 rpm. Acrescente 2 ml tampo PBS-1%
Triton suplementado com lisozima (100 g/ml), incube 5 min na bancada
mexendo periodicamente e depois congele a -20C no freezer.

34
Anlise de sequncias no computador
As sequncias dos plasmdeos so entregues em formato *.ab1 que podem ser
abertos em programas que leem este formato. Para facilitar, as sequncias so
analisadas pelo supervisor do curso pelo programa DNAstar que inclui uma
avaliao da qualidade da sequncia. Depois as sequncias so entregues aos
grupos (email) e analisados individualmente, usando os sites do PlasmoDB e do
NCBI. Grupos com resultado ruim no sequenciamento devem copiar a sequncia
correta a partir da sequencias dos oligos utilizados da internet (plasmoDB). A
partir das sequncias de cada grupo, prosseguimos a montagem do plasmdeo no
programa APE (download da internet).

Cheque sua bancada e limpe-a antes de sair. Guarde os produtos e solues na

geladeira ou no freezer e descarte seu banho de gelo. At amanh!

Dia 8
Metas do dia: Purificao das protenas recombinantes. Preparao de gis SDS
poliacrilamida. Coomassie staining e transferncia. Quantificao de protenas
por teste de Bradford.

Produo de protenas recombinantes com GST 2.

purificao
A partir dos pellets lisados das bactrias que produziram protenas
recombinantes, purificaremos num procedimento one-step as protenas que
contem o domnio GST. Aproveitamos neste contexto o fato que este domnio
possui uma grande afinidade para glutationa reduzida. Desta maneira, protenas
solveis so expostas glutationa reduzida imobilizada numa resina que depois
lavada exaustivamente para retirar protenas que no interagiram. O
procedimento como segue:

Descongele a soluo de bactrias congeladas do dia anterior, banho

Maria
verifique se a soluo est muito viscosa (DNA genmico da bactria) e
em princpio transparente
Utilizando uma seringa 5 ml com agulha G21, passe a soluo 10 vezes
pela agulha sem fazer espuma, assim aplicando um shearing na gDNA
bacteriano. A soluo no pode mais estar viscosa.
Acrescente mais 3 ml de PBS-Triton 1% e centrifuge por 15 min a 4C e
2800 rpm (Sorvall).
Transfira o sobrenadante para um tubo 15 ml novo.
Acrescente 200 l slurry (50% em PBS, fornecida) de glutationa sepharose.
incube na gangorra por 1 h. Feche bem o tubo para isso.
depois centrifuge a 1500 rpm na Sorvall por 1 min descarte o
sobrenadante com a pipeta P1000. Suas protenas esto associadas a
resina neste momento.
Acrescente 15 ml PBS-Triton X100 e ressuspenda a resina, invertendo o
tubo uma vezes.

35
 depois centrifuge a 2000 rpm na Sorvall por 1 min descarte o
sobrenadante virando o tubo cuidadosamente - no perca resina.
Acrescente 15 ml PBS e ressuspenda a resina, invertendo o tubo uma
vezes.
depois centrifuge a 2000 rpm na Sorvall por 1 min descarte o
sobrenadante virando o tubo cuidadosamente - no perca resina.
repita os ltimos dois passos mais uma vez.
Tente ficar com apenas 200 l resina compactada.
Acrescente 500 l de elution buffer (50 mM Tris pH 7.5, 10 mM Glutationa
reduzida) e misture com a P1000, transferindo para um tubo Eppendorf,
levando toda resina junto.
Incube mais 30 min a TA, mexendo de vez em quando (vortex lento)
Depois, precipite a resina centrifugando a 12000 rpm, 1 min a TA. Transfira
o sobrenadante para um tubo novo marcado GST<sua protena> e
guarde a protena no gelo.

Preparao de gel SDS-PAGE (SDS polyacrylamid gel

electrophoresis)
Um passo importante aps a purificao das protenas recombinantes o
controle se h impureza na preparao e se a protenas desejada foi produzida
com protena completa ou truncada o que frequente para protenas de P.
falciparum. Vamos fazer 3 gis com o mesmo contedo (6 protenas
recombinantes produzidas, GST pura (fornecida) e peso molecular): Um ser
corado para visualizar as protenas, e as outras sero transferidas para
membranas de nitrocelulose para posteriormente verificar se elas so
reconhecidas por anticorpos em plasmas de i) pessoas infectadas ou ii) nunca
infectadas. O sistema de gel ser o descontinuo proposto por Laemmli [10] e
consiste de um gel de baixa porcentagem de acrilamida e baixo pH (6.8, stacking
gel) para concentrao de protenas e um gel de alto pH (8.8) e mais alta
porcentagem de acrilamida (6-15%, running gel) para separao ntida de
protenas. Como as protenas aqui purificadas tero um peso entre 30 e 60 kDa,
uma porcentagem do running gel de 10% adequada.

Antes de comear, familiarize se com o aparelho que conter os gis (sistema

Mini Protean BioRad) e monte as placas. Marque at onde tem que encher com
running gel. Depois prepare as duas solues do running e do stacking gel.

(Um voluntrio para todos os grupos) Use luvas. Pipete num tubo 50 ml:

4x Running gel buffer 3.75 ml (1.5 M TrisCl pH 8.8, 0.4%

SDS)

Acrilamida 40% 3.75 ml

gua MilliQ 7.5 ml

TEMED 90 l

Acrescente 120 l de uma soluo fresca de 10% persulfato de amnio e despeje

imediatamente o liquido entre as placas at a marca. Depois acrescente devagar
36
1 ml de 20% metanol/azul bromofenol acima do gel. Deixe polimerizar monitore
a polimerizao no restante da soluo running gel.

(Um voluntrio para todos os grupos) Use luvas. Pipete num tubo 15 ml:

4x Stacking gel buffer 1.5 ml (0,5 M TrisCl pH 6.8, 0.4% SDS)

Acrilamida 40% 0.7 ml

gua milliQ 3.7 ml

TEMED 60 l

Acrescente 60 l da soluo fresca de 10% persulfato de amnio e despeje

imediatamente o liquido entre as placas at a 1 mm abaixo da borda das placas.
Insere o pente. Deixe polimerizar monitore a polimerizao no restante da
soluo stacking gel.

Prepare 2 litros de 1x Running buffer (0.192 M glicina, 0.025 M Tris, 0,1% SDS) do
10x Running buffer que no contem SDS. Aliquote 45 l da sua protena
recombinante em um tubo Eppendorf e acrescente 15 l 4x Loading buffer
(fornecido, 0,25 M TrisCl pH6.8, 6% SDS, 20% glicerol). Aquece esta mistura em
banho seco a 95C por 5 min. Depois de retornar a TA, aplique um short spin.

Coloque os gis no aparelho e acrescente 1x running buffer nos reservatrios: Os

eletrodos tem que estar cobertos por liquido e o gel deve ter contato com liquido
na parte de cima. Observe o tampo do reservatrio do meio: no pode vazar.
Agora tire o pente com cuidado e lave os buracos com uma seringa de 2 ml
armado com agulha fina. Depois aplique as amostras previamente aquecidas,
mas anote antes a posio de cada protena aplicada em relao ao peso
molecular (fornecido) num papel. Deixe os gis correrem a 120 Volts e desligue
quando o azul bromofenol acaba de sair do gel (1-1.5 h).

Depois da corrida, usando luvas retire inicialmente 1 gel das placas, cobra-o
com soluo Coomassie brilliant blue (1% Coomassie brilliant blue, 50% metanol,
7.5% cido actico - in gua) e coloque tudo por 15 seg na microonda e depois
incube no shaker orbital por 15 min a TA. Depois, coloque no tampo de descorar
(20% metanol, 10% cido actico, in gua). Enquanto este gel incuba, os outros
dois gis so preparados para transferncia para uma membrana de nitrocelulose
reforada (Hybond C). O setup para esta transferncia como segue em Figura
10. Este procedimento ser supervisionado.

37
Figura 10: Montagem de gel SDS-PAGE para transferncia em
membrana. Note que o gel deve estar ENTRE o eletrodo "preto" e a membrana.
Inverter significa transferir as protenas para o tampo e perder.

Por favor, todo mundo que pode observar deve prestar ateno se a pessoa que
manipula molhou a membrana em tampo de transferncia (1x running buffer
sem SDS + 10% metanol) no i) introduz bolhas de ar entre membrana e gel ii)
transfere as protenas para o tampo/papel de filtro. Quando montado o
sandwich, o mesmo transferido para o modulo do aparelho e o tanque
enchido com 1x Running buffer/metanol. Como regra para o campo eltrico sob
qual protenas em gel deve ser transferidas vale: 1 V por cm 2 de gel.
Normalmente, transferncias a 80 Volts por 1 h so suficientes.

Depois de transferir, o aparelho desmontado e lavado em gua deionizada e a

membrana e brevemente banhada no corante Poinceau (0.2 g Poinceau, 1 %
cido actico em gua). As protenas transferidas devem aparecer coradas.
Depois as membranas so exaustivamente lavadas com gua deionizada,
colocadas midas em vitafilme e congeladas at o dia seguinte.

Teste de Bradford
Para medir a quantidade de protena obtida na expresso, conduzido o teste de
Bradford em microplaca de 96 pocinhos. Para isso, cada grupo deve fazer uma
diluio seriada de 20 l de 0,1% BSA (1 g/l) com 5 pontos (Isso : 1 poo 40 l
de BSA 0.1%, segundo a sexto poo 20 l de PBS). Depois 20 l so pipetados
com a P20 para o segundo poo, misturados (pipetar 5 vezes) e a mistura
levada para o terceiro poo, misturado, em assim seguindo at o quinto poo do
qual 20 l afinal so descartados. O sexto poo apenas conter PBS. Coloque
agora 20 l da sua protena e uma diluio 1:2 da mesma em poos ao lado da
38
diluio seriada de BSA. Acrescente a cada poo 180 l de uma soluo de
Bradford (BCA reagent) diluida 1:4 em PBS (1 parte BCA + 3 partes de PBS). Mea
o resultado no fotometro de placas a 595 nm. Analise o resultado fazendo um
grfico em Excel com os valores da curva padro (valores de BSA) e determine
assim a quantidade da sua protena.

ELISA, 1: Coating
Com o resultado em mos prossiga agora para colocar em 11 pocinhos
(horizontal) de uma microplaca 0.2 g por pocinho (em 50 l) diluido em coating
buffer (tampo carbonato de sdio 50 mM, pH 9.6). Da mesma maneira, coloque
na ltima coluna 0.2 g/pocinho de GST recombinante (fornecido). Depois de
todo mundo ter colocado a respectiva protena, a placa tampada e colocada na
geladeira.

Cheque sua bancada e limpe-a antes de sair. Guarde os produtos e solues na

geladeira ou no freezer e descarte seu banho de gelo. At amanh!

Dia 9
Metas do dia: Conduzir e revelar o imunoblot, medir a reao de plasmas de
indivduos infectados e no infectados em ELISA.

Westernblot
Neste experimento checamos se um indivduo exposto e um individuo no
exposto possuem anticorpos contra especificamente as protenas recombinantes
transferidas para as membranas. O principio o seguinte: Aps bloqueio de stios
de ligao da membrana por incubao com uma soluo proteica (neste caso
leite desnatado 4% em PBS com 0.1% Tween20 - um detergente no-inico) por 1
h, depois o antissoro colocado e os anticorpos l contidos reconhecem as
protenas ou no, e depois lavagens um anticorpo anti-IgG humano conjugado a uma
enzima capaz de uma reao colorimtrica ou luminescente aplicado. Em
Figura 11 mostrado esquematicamente como o imuno (Western) blot funciona.

39
Figura 11: Principio do Western blot. Os conjugados podem ser fosfatase
alcalina, peroxidase ou cromforos como por exemplo Cy5 ou GFP.

Manipule as membranas que saram da transferncia apenas com pina ou luvas.

Tendo as duas membranas com as diferentes protenas, colocamos nas duas
primeiramente uma soluo de 4% de leite desnatado ("Molico") em PBS/Tween
20 0.1% (PBS-T, fornecido). As membranas devem estar cobertas com lquido (20
ml por membrana, em duas caixas).

Incube as membranas por 1 h a TA na gangorra

Lave as duas membranas com 30 ml PBS-T, 5 min na gangorra.
Aplique 10 ml de PBS-T 1% leite numa membrana (marque na caixa "AS") e
10 ml PBS-T 1% leite na outra membrana (marque "neg" na caixa).
Acrescente 5 l de plasma "AS" na caixa AS e 5 l de plasma "neg" na
caixa neg. Incube 1 h a TA na gangorra.
Descarte o liquido com anticorpo num tubo falcon 15 ml e guarde-o no
gelo.
Lave a membrana 3 vezes como no segundo passo, descartando o PBS-T
toda vez.
Aplique 10 ml de PBS-T 1% leite na membrana, e acrescente 5 l de
antiHuman IgG peroxidase
Incube 1 h na gangorra, depois descarte a soluo.
Lave a membrana 3 vezes como no segundo passo, descartando o PBS-T
toda vez. Uma pessoa deve se dirigir ao fotodocumentador e ligar a
cmera para esfriar.
Tire a membrana da caixa e coloque num pedao de vitafilme ~4 vezes o
tamanho da membrana (tem que ser possvel dobrar o vitafilme em cima
do gel) e embrulhe a membrana molhada.
Prepare a soluo de revelador: 1 ml Luminol + 1 ml de agua oxigenada
em tubo eppendorf de 2 ml.
Junta as membranas empacotadas, uma P1000 com ponteiras, luvas, um
velho recibo de supermercado, e a soluo reveladora misturada no
eppendorf 2 ml, e um pendrive e se dirige ao fotodocumentador.
Tire a foto da membrana (supervisionado pelo tcnico/assistente), e grave
a srie no pendrive.
de volta no lab limpe as caixas com gua deionizada.

ELISA 2. revelar
As protenas colocadas nos pocinhos aderiram fortemente ao plstico da placas
96. Neste momento vamos detectar se h anticorpos num nmero de soros de
pessoas expostas a malria (ou se nossas protenas so de fato reconhecidas por
plasmas ou no). Localize na mesa central: Plasmas no gelo, PBS-T 4% (mesmo
do western blot), PBS-T 1%. PBS-T na pisseta, Eppendorfs, papel toalha.

Inicialmente jogue a soluo do coating fora (na pia) e lave os pcinhos uma
vez com PBS-T da pisseta.
Bate a placa no papel toalha na mesa para retirar o resto do liquido.
Coloque 50 l de PBS-T 4% leite por pocinho que recebeu alguma protena
e incube coberto a TA por ao menos 30 min.
40
Devemos ter 7 protenas na placa (6 de cada grupo plus GST puro). Cada pocinho
carregado com 50 l de soluo de anticorpos durante o ensaio, calcule quanta
soluo de anticorpo em PBS-1% tem que usar se o anticorpo para diluir 1:500.
Faa essa diluio calculando um pocinho a mais (compensar erro da pipetagem.)

Lave os pocinhos uma vez com a pisseta com PBS-T

Aplique os plasmas diluidos 1:500 em PBS-T leite em colunas (lembrando
que as linhas horizontais contm as protenas diferentes - assim cada
plasma reage com cada protena)
Incube coberto por 1 h a TA.
Prepare o conjugado anti-human IgG -mesmo do Western blot- numa
diluio 1:1500 em 15 leite PBS-T e guarde no gelo, volume para 90
pocinhos
Descarte o liquido virando a placa na pia e lave os pocinhos com PBS-T
como anterior.
Lave mais 4 vezes, depois da ultima lavagem, bate a placa no papel toalha
no final.
Aplique 50 l da soluo do conjugado em leite PBS-T e incube por 1 h.
Descarte o liquido virando a placa na pia e lave os pocinhos com PBS-T
como anterior.
Lave mais 4 vezes, depois da ultima lavagem, bate a placa no papel toalha
no final.
Prepare o revelador: soluo TMB e soluo gua oxigenada 2.5 ml de cada
num recipiente banquinho limpo.
Prepare outro recipiente banquinho com 1 M HCl CUIDADO
Usando a pipeta multicanal, aplique 50 l do substrato, ligue o timer
"countdown" em 5 min antes de aplicar na primeira fileira. No precisa
trocar as ponteiras.
Depois de aplicar em todos os pocinhos, descarte as ponteiras.
Arme imediatamente a multicanal com novas ponteiras.
Observe a formao de cor azul. Quando pocinhos ameaam entrar em
saturao antes dos 5 min, pare a reao aplicando 50 l de HCl.
Com a placa revelada se dirige a um fotmetro de placa para medir o
resultado.

Mostre os resultados num grfico 3D em Excel descontando de cada valor obtido

em protena recombinante do valor obtido em GST.

Cheque sua bancada e limpe-a antes de sair. Guarde os produtos e solues na

geladeira ou no freezer e descarte seu banho de gelo. At amanh!

Dia 10

Atividades do dia: Seminrio grupos 1-3: Sistema de expresso em baculovirus -

tcnica, Grupos 4-6: Sistema de expresso em Pichia pastoris - tcnica.

Help desk - questes e respostas sobre os experimentos.

41
Avaliao escrita

Avaliao do curso: o que pode ser melhorado?

Anexo: Oligos utilizados para amplificar genes MSP3, MSP4,

MSP9, MSP10, EBA175 EBA140 e PfD0020c de P. falciparum.
Immun
Expres Peptide
e
Genes Proteins sed characterist Primers pairs
epitop
parts ics
es
F_GGATCCGGGGAAGAAAAACCAAATGTGG
PFB0310c MSP4 Exon 1 C B and T
R_CTACCTTTTTAGGGATAGCTTC
C--
F_GGATCCACTGGTAATGATTTTAGTGGTGG
PF10_0345 MSP3 termina C B
R_AACGCCTCCTCCAAATTCCCAAC
l
N--
F_GGATCCACATCCCAGAAGAAAATTACATATG
PFF0995c MSP10 termina P absent
R_CTGAATTCATGATAGATGAATTTTC
l
N-- Duffy-like
B F_GGATCCTGTGAGAAGGAATGTATTGATCC
MAL7P1.176 EBA175 termina domains
(NKND R_GTTTCCAAGACATAATTCTTGCC
l F1and F2
N-
PfEMP1se CIDR domain F_ggatccCCCGATTGTGTAGTTGAATGTG
PFD0020c termina ?
vere (C) ACAGGGGTTTGGTGTGGGG
l
F_ GGATCCCAGTGAGAAAATTACTGTATGTG
MAL13P1.60 EBA140 meio P B
ACATGTACCAGGAAATTTGTTCG
F_ GGATCCGCTACCTACTCTTTTGTTAATAC
PFL1385c MSP9 meio C ?
TCATCCATACCAGATACAGTTTC
C, conservado; P, polimrfico. Sitios de restrio inseridos so mostrados em
negrito. F, primer forward e R, primer reverse.

Bibliografia
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world malaria map: Plasmodium falciparum endemicity in 2010. Malaria
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the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680685.

Anexo

Diretrizes para mostrar figuras no relatrio (vale depois para

mestrados, doutorados e publicao em revistas cientficas
tambm).
A Figura tem que mostrar o resultado de forma mais completa possvel. Fotos
com gis grandes da qual apenas uma parte importante ser mostrada, podem
ser cortadas ("crop tool"). A legenda deve ser completa e deve tornar a figura
autoexplicativa. Note a partir do exemplo abaixo como deve ser feito:

Imagem crua com marcao qual parte ser utilizada:

43
44
Aqui a imagem editada:

Referncias
As referncias devem ser inseridas utilizando um programa adequado.
Recomendo o programa Mendeley que pode ser carregado gratuitamente da
internet e cria um plug-in para Word e OpenOffice writer. Sempre quando um
dado da literatura citado, a referncia deve ser colocada.

45