La deteccin de clulas en acero inoxidable utilizando los mtodos

industriales y de alimentos: UV iluminacin y bioluminiscencia de

ATP
Kathryn A. Whitehead Lindsay A. Smith, Joanna Verran
Escuela de biologa, qumica y Ciencias de la salud, Universidad
Metropolitana de Manchester, Chester St, Manchester M1 5GD, Reino
Unido
Palabras clave:
Suelo
Alimentos
Pelcula de acondicionado
Bioluminiscencia de ATP
Luz UV
Superficie

RESUMEN
Las superficies abiertas de contacto con los alimentos,fueron sometidas a
suciedad orgnica para proporcionar una fuente para la transferencia de
las clulas microbianas. Mtodos industriales rapidos utilizados para la
deteccin de clulas residuales y suelo e.g. bioluminiscencia de ATP
(trifosfato de adenosina) y un mtodo de deteccin de luz ultravioleta (UV)
fueron evaluados por su capacidad para detectar suelos orgnicos,o
mezcla de suelo clula orgnica en las superficies.
Una gama de suelos (complejo [Extracto de carne, pescado, queso cottage
Extracto]; aceites [colesterol, aceite de pescado, mezclada de cidos
grasos] protenas [albmina srica bovina, pescado peptonas casena];
carbohidratos [glucgeno, almidn, lactosa]); fue utilizado. Bajo UV, suelos
grasos, mezcla de cidos grasos, colesterol y casena fueron detectados
en bajas concentraciones, con niveles de deteccin que van desde 1% a
0,001% de diversas sustancias. Glucgeno es la sustancia ms difcil de
detectar en concentraciones ms bajas. Bandas de longitud de onda de UV
() 330-380 nm, 510-560 nm y 590-650 nm, bandas de longitud de onda
de 330 380 nm,,iluminola mayora de los suelos bien , mientras que la
banda de longitud de onda de 510-560 nm ilumina el extracto de pescado,
colesterol y cidos grasos; la banda de longitud de onda de 590-650 nm
ilumina la lactosa. Suelos en todas las concentraciones fueron detectados
por el mtodo de bioluminiscencia de ATP; los suelos complejos dieron las
lecturas ms elevadas. Cuando suelos complejos fueron combinados con
Listeria monocytogenes Scott A o un no patgenos Escherichia coli O157:
H7, ATP aumentada en registros 1 2. Para la iluminacin de la UV, la
combinacin de L. monocytogenes y queso era ms intensamente
iluminado, con e. coli y carne menos. Iluminacin UV es un mtodo bien
simple para la deteccin de restos de alimentos, con muy pocos cambios
en los resultados cuando los microorganismos estn incluidos. Resultados
pueden mejorarse en algunos casos alterando la longitud de
onda. Bioluminiscencia de ATP es un sistema probado para la evaluacin
higinica siendo especialmente til en presencia de microorganismos en
lugar de suelo orgnico solo
INTRODUCCIN
La mayora del equipo utilizado para la preparacin de alimentos en la
industria alimenticia est construido de acero inoxidable. Se requiere una
limpieza regular del equipo para evitar la acumulacin de material
orgnico adsorbido y microorganismos. El material presente en una
determinada superficie higinica de contacto con los alimentos puede
contener material orgnico (tierra alimentaria), material inorgnico
(residuo de agente limpiador) y microorganismos. La naturaleza de esta
mezcla (biolgica y qumica) de componentes viables e inertes variar
dependiendo del ambiente (Verran y Whitehead, 2006). En este trabajo se
compararon kits comerciales para la deteccin de suelos.
El desarrollo de capas adsorbidas, denominadas pelculas
acondicionadoras, en una superficie se considera como la primera etapa
en la formacin de biofilm (Chamberlain, 1992). Las superficies abiertas de
contacto con los alimentos normalmente no proporcionan una interfaz
slido-lquido para la fijacin microbiana, por lo que es poco probable que
se desarrolle un biofilm "verdadero" (Verran et al., 2002). Sin embargo, los
materiales orgnicos en presencia o ausencia de microorganismos se
transferirn sobre las superficies; Un proceso conocido como suciedad. El
ensuciamiento orgnico de una superficie afectar las interacciones
clula-sustrato, e introducir interacciones celula-suelo y suelo-sustrato
adicionales (Verran y Whitehead, 2006). La influencia del material orgnico
sobre las propiedades del sustrato y la fijacin y retencin de las clulas
tendr un impacto en el ensuciamiento superficial y en los regmenes de
limpieza.
Existen varios mtodos disponibles (in situ e in vitro) que pueden usarse
para detectar y / o cuantificar la suciedad de los alimentos en las
superficies, pero hasta la fecha los mritos de una Nmero de estos
mtodos para su uso en la industria alimentaria no se han comparado
directamente (Davidson et al., 1997, Verran et al., 2002). Los mtodos
utilizados para detectar los suelos incluyen el uso de yodo para la
deteccin de almidn, el azul de Nilo para la grasa (Verran et al., 2002),
una evaluacin visual de la margarina utilizando beta caroteno (Anderson
et al., 1986) y la leche y el suelo de casena Mediante el mtodo de Lowry
(Bohner et al., 1991). Los mtodos industriales in situ rpidos incluyen la
bioluminiscencia de ATP o un mtodo de deteccin de luz UV. Los mtodos
in vitro de microscopa incluyen Microscopa Electrnica de Barrido (SEM)
(Gounga et al., 2007) y microscopa epifluorescente (Whitehead et al.,
2005). Los mtodos utilizados para detectar cambios en la fisicoqumica
superficial debido a la suciedad superficial incluyen el ngulo de contacto
(van der Mei et al., 2002), energa libre de superficie, medidas dispersivas
y polares (Briandet et al., 2001), mientras que los mtodos qumicos
usados para determinar La contaminacin superficial incluye mtodos
tales como rayos X de dispersin de energa (EDX) (Reid et al., 1994) y
espectroscopa infrarroja por transformacin de Fourier (FTIR) (Koca et al.,
2007). Es evidente que algunas de estas tcnicas son menos adecuadas
para el uso in situ en la industria alimentaria, pero los datos de apoyo
generados pueden ayudar a identificar el mtodo ms adecuado de los
ms simples. Esto y el trabajo actual en nuestros laboratorios comparan
una serie de estos mtodos para determinar sus mritos, deficiencias y
relaciones en trminos de deteccin de suelos.
la bioluminiscencia de ATP ha sido ampliamente utilizada para la deteccin
de contaminacin microbiana y residuos de alimentos en la industria
alimentaria (Griffith et al., 1994), proporcionando una estimacin en
tiempo real de la limpieza total de la superficie incluyendo la presencia de
desechos orgnicos Y la contaminacin microbiana (Davidson et al., 1999).
Se ha utilizado con xito para determinar el nmero de clulas en las
fbricas de procesamiento de pescado (Miettinen et al., 2001) y la
industria lechera (Oulahal-Lagsir et al., 2000). Los resultados de la
muestra se muestran en unidades de luz relativa (RLU). Cuando se
compar con el mtodo de agar-agar-slide, los resultados para la
bioluminiscencia de ATP mostraron una correlacin pobre con el nmero
total de bacterias utilizadas para evaluar la contaminacin superficial en
fbricas de procesamiento de pescado (Miettinen et al., 2001). Adems, el
mtodo ATP no detecta todos los componentes de un suelo dado
(Lappalainen et al., 2000). Claramente si el ATP est ausente uno
especulara que la superficie est limpia, pero algunos tipos de suelo
residual no se detectan. La luz UV (353 nm) tambin puede usarse para la
deteccin de clulas residuales y suciedad en superficies industriales
(Pedersen, 2007) aunque (al igual que con ATP) no se hace distincin entre
los dos componentes. La configuracin molecular del material orgnico
permite que algunos residuos orgnicos fluorescen cuando se iluminan con
luz UV (Adhikari y Tappel, 1975). Por lo tanto, la luz UV se puede utilizar
para detectar el suelo residual cuando las superficies de trabajo se
iluminan a 350 nm apropiadamente destacando reas en una planta
industrial que necesitan una limpieza ms intensiva. Este mtodo es
ventajoso porque no requiere contacto directo con la superficie (que la
bioluminiscencia de ATP y los recuentos totales viables requieren). La
capacidad de diferentes longitudes de onda para detectar componentes
separados no se ha explorado previamente.
Aunque la presencia de suelo por s solo proporciona una indicacin de la
efectividad de los procedimientos de limpieza e higiene, son los
microorganismos presentes los que inciden significativamente en la salud
pblica. Los brotes altamente publicitados de enfermedades transmitidas
por alimentos causadas por patgenos como Escherichia coli O157: H7 y
Listeria monocytogenes Scott A han aumentado las preocupaciones de los
consumidores y su inters por la inocuidad de los alimentos (Sofos y
Smith, 1993). L. monocytogenes se encuentra comnmente aislado de las
plantas de produccin de alimentos, incluyendo los mataderos de peces y
los humeros de pescado donde algunos subtipos pueden persistir durante
meses o incluso aos (Wulff et al., 2006). El potencial de los alimentos
listos para el consumo para contaminarse cruzadamente con L.
monocytogenes se reconoce bien directamente oa travs de superficies y
equipos que han estado en contacto con materias primas (Mena et al.,
2004). E. coli O157: H7 se puede transmitir a los seres humanos a travs
de la contaminacin indirecta o directa de los alimentos (Bouvet et al.,
2001). La carne de res molida cruda y la leche cruda han sido implicadas
en la infeccin transmitida por los alimentos (Armstrong et al., 1996).
Muchas cepas de E. coli toxignica de Shiga son patgenos humanos que
causan enfermedades que varan en severidad desde diarrea leve hasta
complicaciones renales severas que pueden resultar en muerte (Rivas et
al., 2007). La contaminacin cruzada durante el procesamiento y la
posterior manipulacin y preparacin de alimentos conduce a la entrada
de estos patgenos en la cadena alimenticia (Hood y Zottola, 1997; Kumar
y Arand, 1998). Con la creciente preocupacin por el potencial de
biotransferencia y con las dosis infecciosas mnimas bajas para patgenos
como E. coli O157: H7, la deteccin de bajos niveles de contaminacin es
cada vez ms importante (Davidson et al., 1999).
El objetivo de este trabajo fue comparar dos mtodos comercialmente
disponibles, la bioluminiscencia ATP y un mtodo de luz UV para
determinar la naturaleza y el lmite de deteccin cuando se usa para
detectar material orgnico (suelos alimentarios) y el ensuciamiento de
suelos celulares en sustratos de acero inoxidable.

2. MATERIALES Y MTODOS
En este trabajo se compararon los kits comerciales utilizados para la
deteccin de suelos. La naturaleza del material orgnico que ensucia la
superficie estar relacionada con los materiales alimenticios presentes.
As, en este estudio se utiliz una seleccin de suelos complejos (queso,
pescado y carne). Estos suelos orgnicos complejos son una mezcla
heterognea mal definida de molculas, por lo que en estos estudios
tambin se incluyeron en el estudio una gama de componentes del suelo
definidos qumicamente (aceites, protenas e hidratos de carbono).
En este trabajo (carne, pescado y queso) se utilizaron tres suelos
complejos, al igual que una gama de suelos qumicamente definidos,
incluyendo protenas (albmina de suero bovino (BSA), peptonas de
pescado, casena), aceites (colesterol, aceite de pescado y una mezcla de
Tres cidos grasos, [21,79%] palmitico [58,29%] esterico [19,93%], y
carbohidratos (glucgeno, almidn y lactosa). Cada suelo se hizo en
soluciones de 10%, 5%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, 0,01%, 0,005% y 0,001%.
La carne, el queso y el cido mirstico se almacenaron a -20C y se
descongelaron a temperatura ambiente antes de su uso. El extracto de
pescado, BSA, aceite de pescado se almacen a 4 C, mientras que el
colesterol, los cidos palmtico y esterico, peptona de pescado, casena y
carbohidratos se almacenaron a temperatura ambiente. Los suelos se
componan de los siguientes componentes.
2.1. Componentes de suciedad
2.1.1. Extraccin de exudados de carne (mtodo amablemente
proporcionado por Brigitte Carpentier AFSSA, Francia)
Se cort un kilo de carne fresca de carne de res rodada (CO-OP, UK) en
trozos de 10 mm x 10 mm. Las piezas de carne se pusieron en una
bandeja de acero inoxidable y se cubrieron con papel de aluminio. La
carne se cubri con otra bandeja y se pes con 8,4 kg de chapas de acero
inoxidable y se congel a -20C durante 24 h. La carne se descongel a
temperatura ambiente y los exudados de carne se vertieron y la carne se
exprimi para recuperar exudados sobrantes. Los exudados de carne se
almacenaron en alcuotas de 20 ml al
-20 C hasta que sea necesario.
2.1.2. Extracto de pescado (mtodo amablemente proporcionado
por Lone Gram, DIFRES, Dinamarca)
Se cortaron filetes de pescado (bacalao) en cubos y se aadieron 500 ml
de agua del grifo kg-1 de pescado. El pescado se hirvi durante 5 min. El
jugo se prens de la carne de pescado y la solucin resultante se dren. El
lquido se hirvi durante 5 min sin agitacin y se dej durante 5 min hasta
que se observaron flculos en el lquido. El lquido se filtr a travs de
doble
Pulpa de madera (tamao 4) filtros de caf (CO CO-OP, Manchester, Reino
Unido). Entonces Se aadi tampn fosfato 0,1 M (7,62 g de KH _ {2} (PO)
_ {4} y 7,66 g de K _ {2} H (PO) _ {4} L_ {1}). El pH se ajust a 6,6. La
densidad ptica (DO) (600 nm) y se ajust a 0,21. El lquido se esteriliz
Por autoclave a 100 C durante 30 min. El extracto se enfri a 0C - 5 C,
lo que dio lugar a la limpieza del lquido. El lquido se almacen a 5 C.
2.1.3. Extracto de queso
Extracto de queso (Queso cottage natural bajo en grasa Langley Farm,
Holmforth, W. Yorkshire) se hizo drenando el residuo lquido del queso
cottage. El queso cottage restante se coloc en un tamiz metlico de
acero inoxidable con un tamao de poro de 2 mm y se presion
suavemente para eliminar todo el lquido. El lquido se almacen a -20C
hasta su uso cuando se descongel a temperatura ambiente.
2.1.4. Productos qumicos
El colesterol, BSA, glicgeno, aceite de pescado, almidn, mirstico,
palmtico, esterico, casena y lactosa se obtuvieron todos de Sigma
Aldrich (Dorset, UK). La peptona de pescado se obtuvo de Fluka
Biochemika (Suiza). Para la lactosa, peptona de pescado, BSA, almidn y
glicgeno se prepararon 1 ml de solucin al 10% en un tubo Eppendorf
usando agua destilada estril. Las muestras que eran difciles de obtener
en solucin se sometieron a vrtice durante 5 min. El aceite de pescado,
los cidos grasos mixtos y el colesterol se hicieron por separado en
soluciones al 10% en tubos Eppendorf usando cloroformo. Los cidos
grasos mirstico (21,79%), palmtico (58,29%) y esterico (19,93%) se
mezclaron en una solucin porcentual para representar los principales
aceites encontrados en el queso (www.foodcomp.dk).
2.2. Microbiologa
El Scott A. de L. monocytogenes era un regalo amable del profesor Lone
Gram (Instituto Dans de Investigaciones Pesqueras (DIFRES), Universidad
Tcnica de Dinamarca). Una cepa no patgena de E. coli O157: H7 fue un
regalo amable de la Dra. Brigitte Carpentier (AFSSA), Maisons-Alfort,
Francia). Los cultivos de reserva se almacenaron a -80C. Para almacenar
a -80 C, los cultivos madre se cultivaron durante la noche en caldo de
triptona soja (TSB) (Oxoid, Hampshire, UK) a 30 C para L.
monocytogenes o para E. coli en caldo de infusin de calor cerebral (BHIB)
(Lab M, Bury, UK) a 37C. Se aadieron cantidades iguales de cultivo y
mezcla de congelacin y se incubaron a las temperaturas anteriores
durante al menos 30 min a 1 h. Las muestras se dispensaron en tubos de
plstico estriles de 1,5 ml tapados con tornillo y se congelaron. Para
resuscitar, se descongel el cultivo a temperatura ambiente y se tom un
bucle de lquido y se extendi por rayos sobre medio o caldo preferido y se
incub a la temperatura apropiada durante la noche. El resto del cultivo
fue devuelto al congelador para uso futuro. La mezcla de congelacin se
hizo de dos soluciones. La disolucin A contena fosfato de hidrgeno di-
potsico (K2HPO4) 12,6 g L-1, dihidrogenofosfato de potasio (KH2PO4) 3,6
g L-1 citrato trisdico (Na3C6H5O7 x 2H2O) 0,9 g L-1, sulfato de amonio
(NH4) 2SO _ {4}) 1,8 g L - 1 y glicerol 300 g L - 1. Esta mezcla se
autoclav a 121 C durante 15 min. La solucin B constaba de 1,8 g de
sulfato de magnesio L-1 (MgSO4 x 7H2O). La solucin se esteriliz por
filtracin utilizando una jeringa Luer-LokTM de 10 ml (BDH, Poole, UK) y un
filtro Acrodisc (32 mm con membrana supar no pirognica de 0,2 m,
Pall
Corporation, Cornwall, Reino Unido). A continuacin se aadieron 1 ml de
solucin B a 100 ml de solucin A para producir la mezcla final de
congelador. Todos los productos qumicos utilizados en la mezcla de
congelacin se obtuvieron de BDH (Poole, UK). En la preparacin de los
ensayos de retencin, se inocularon cultivos madre de L. monocytogenes
sobre agar triptona soja (TSA) (Oxoid, Hampshire, UK), y se incubaron a 30
C durante la noche. Los cultivos se almacenaron a 4C. Se inocularon
diez mililitros de TSB con una nica colonia de L. monocytogenes y se
incubaron a 30 C durante la noche. Se utilizaron cien microlitros de este
cultivo para inocular 100 ml de TSB, que se incub a 30 C durante 18 h.
E. coli se inocul sobre agar de infusin de calor cerebral (BHIA, Lab M,
Bury, UK). La E. coli se cultiv a 37 C durante 24 h. Los cultivos se
almacenaron a 4C. Se inocularon 10 mililitros de BHIB con una nica
colonia de E. coli y se incubaron a 37 C durante la noche. Se utilizaron
cien microlitros de este cultivo para inocular 100 ml de BHIB, que se
incub a 37 C durante 18 h.
Despus de la incubacin, se recolectaron las clulas a 716 xg durante 10
min y se lavaron una vez, mediante resuspensin en agua destilada
estril, agitando vorticialmente durante 1 minuto, y despus
centrifugacin a 716 xg durante 10 min. Las clulas se resuspendieron a
una OD de 1,0 a 540 nm en agua destilada estril. Las unidades
formadoras de colonias ml-1 (cfu ml-1) se determinaron por dilucin en
serie y fueron de 1,62 0,92 x 108 cfu ml-1 para L. monocytogenes y
1,38 0,68 108 cfu ml-1 para E. coli.
2.3. Preparacin de la superficie
2.3.1. Suciedad de acero inoxidable
Se aadieron cien microlitros de material orgnico a una placa de acero
inoxidable de 50 mm x 40 mm 304 2B de acabado de 2 mm de espesor. El
material orgnico se extendi a travs de la superficie usando un
esparcidor de plstico estril. Las muestras se secaron a temperatura
ambiente en una campana de flujo de clase 2. Los 10 mm de la placa se
utilizaron para el etiquetado y la manipulacin.
Cuando se aadieron tambin clulas a la muestra, se mezclaron 50 l de
clulas y 50 l de suelo en un tubo Eppendorf y se aplicaron a la superficie
como anteriormente. L. monocytogenes se mezcl con el queso o el
extracto de pescado, mientras que E. coli se mezcl con el exudado de
carne. Para visualizar clulas solas sobre acero inoxidable, se aadieron
100 l de las suspensiones celulares preparadas a la superficie y se
dejaron secar a temperatura ambiente durante 2 horas en un armario de
seguridad de clase 2. Todas las muestras se almacenaron a 4C.
2.3.2. Preparacin de las probetas para SEM
Las muestras con suelos clulas fueron sumergidas en 4% v / v de
glutaraldehdo (Agar, Essex, UK) durante 24 h a 4 C. Las muestras se
enjuagaron completamente con 100 cm3 de H2O destilada usando una
botella de agua destilada a un ngulo de 45 , con una boquilla de 3 mm.
Las muestras se secaron a continuacin en una campana de flujo de clase
2. Las muestras se almacenaron a temperatura ambiente en un desecador
de pentxido de fsforo (Sigma Aldrich, Dorset, UK). Las muestras se
fijaron a trozos para el revestimiento por pulverizacin de oro, que se llev
a cabo usando un recubridor de pulverizacin por pulverizacin SEM
Polaron E5100 (Milton Keynes, UK). Las muestras se recubrieron por
pulverizacin catdica a un vaco de 0,0921 mbar, durante 3 min, a 2500
V, en gas argn a una potencia de 18-20 mA. Las imgenes de sustratos
se obtuvieron usando una microscopa electrnica de exploracin JEOL JSM
5600LV (Jeol Ltd., Herts, UK).
2.4. Mtodos de deteccin 2.4.1. Mtodo de deteccin UV Eigil Appel
Pedersen fundador de la Bactoforce Company (Silkeborg, Dinamarca)
proporcion amablemente una lmpara UV (paquete Labino trac) con una
gama de lmparas de 353 nm. Cuando la lmpara Bactoforce no estaba
disponible, una lmpara UV estndar (lmpara de banco de 15 W, 365 nm,
1680 W cm-2 a 305 mm, 115 VCA 60 Hz, Cole-Parmer, London, UK) con
una longitud de onda ptima de 350 nm. 2.4.2. Longitudes de onda UV
Con el fin de determinar las longitudes de onda ptimas de la luz UV para
iluminar los diferentes suelos, las muestras sucias se visualizaron
utilizando una microscopa de epifluorescencia (Nikon Eclipse E600,
Surrey, Reino Unido). Se utilizaron diferentes filtros, 330-380 nm, 510-560
nm y 590-650 nm para seleccionar bandas de longitud de onda especficas
de luz UV. El microscopio se mont con una cmara digital en blanco y
negro F-View II (Soft Imaging System Ltd., Helperby, Reino Unido,
suministrado por Olympus, Hertfordshire UK). Este sistema utiliz un
paquete de anlisis de imagen de Cell F (Olympus, Hertfordshire, Reino
Unido). Se visualizaron muestras secas pero sin teir bajo las bandas de
longitud de onda UV filtradas de forma diferente y se formaron imgenes.
2.4.3. Bioluminiscencia ATP Las mediciones de bioluminiscencia de ATP
(Hygiena, Herts, UK) se llevaron a cabo como instrucciones del fabricante
permanente (Hygeina, 2007); Sin embargo, el fabricante recomienda
limpiar una rea de 100 mm x 100 mm, pero en este estudio, un 40 mm x
40 mm se limpi para comparabilidad con los otros experimentos
realizados en este trabajo. La superficie de 40 mm 40 mm de acero
inoxidable se limpi con el dispositivo de muestreo ATP de Ultrasnap
(Herts, Reino Unido) y se coloc en el dispositivo de muestreo de ATP
(Herts, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Resultados
Algunos materiales fluorescan ms brillantemente que otros (Fig. 1). A
una concentracin de 10% p / v v / v el aceite de pescado (figura 1a) y la
protena de pescado fluorescan intensamente y mientras que el queso, los
cidos grasos, la casena, el glicgeno(Figura 1b), almidn y lactosa (figura
1c), no fluorescan. Los exudados de carne, colesterol, BSA y extracto de
pescado fueron difciles de detectar utilizando este mtodo. Los niveles de
deteccin variaron con los diferentes componentes (Tabla 1). Los niveles
de deteccin variaron de 1% a un nivel bajo de 0,001%. El colesterol, los
cidos grasos mixtos y la casena se detectaron fcilmente con las
cantidades ms bajas de suciedad orgnica (0,001%), aunque no fueron
las ms fluorescentes. El glucgeno fue difcil de detectar a bajas
concentraciones (b1%). Ningn tipo de material (es decir, carbohidratos
complejos, protenas u aceites) fue ms fcilmente detectable en
comparacin con otros grupos, aunque hubo variacin entre los
componentes dentro de los grupos.
Se utiliz una gama de longitudes de onda UV para identificar si los
diferentes componentes del suelo podran ser mejor iluminados en
longitudes de onda particulares en el espectro UV. Se usaron bloques de
filtros que se seleccionaron para las bandas de longitud de onda 330 - 380
nm, 510 - 560 nm y 590 - 650 nm. En algunos casos, las diferentes
longitudes de onda de la luz iluminaron ms claramente algunos suelos:
aceites y protenas (Cuadro 2). Por ejemplo, la banda de longitudes de
onda de 330-380 nm ilumin el aceite de pescado mejor que las otras
bandas de longitudes de onda probadas (Fig. 2). Esta longitud de onda
tambin fue mejor para las protenas (Tabla 2]. La banda de longitud de
onda 330-380 nm ilumin la mayora de los suelos ensayados y fue
especialmente buena para la deteccin de aceites.
La bioluminiscencia de ATP se utiliz para detectar la presencia de
pelculas de suciedad sobre superficies en ausencia de clulas. El sistema
de monitoreo higinico de ATP proporcion un anlisis higinico rpido de
superficies contaminadas con materia biolgica a medida que el sistema
de monitoreo detect trifosfato de adenosina (ATP). Los resultados de la
muestra sucia se mostraron en unidades de luz relativa (RLU), que era la
cantidad de luz producida en base a la cantidad de contaminacin de la
muestra. La ratiowas aproximadamente 1 1 RLU a cada 1 1 fmol de ATP
segn lo determinado por el fabricante (Hygiena, 2007). Hay niveles de
deteccin donde b10 fue considerado un pase, 11-29 una precaucin y
N30 fue un fracaso. El 10% de suelo de carne se detect en un grado
mucho mayor que los otros materiales complejos, y como se esperaba, la
seal disminuy con la disminucin de la concentracin de suelo. Todos los
suelos dieron una lectura de ATP en todos los niveles; Sin embargo, los
materiales complejos dieron las lecturas ms altas, especialmente a
concentraciones ms altas. De los suelos complejos, la carne y los
extractos de queso fueron las nicas superficies sucias que fallaron en
concentraciones de 10% y 5% (Figura 3).
Cuando los suelos en las superficies se combinaron con L. monocytogenes
Scott A o con una E. coli O157: H7 no patognica, las clulas de E. coli se
incrustaron en el suelo (Figura 4b) cuando se compararon con las clulas
aplicadas a su superficie por su cuenta (Figura 4a). Las clulas de L.
monocytogenes aplicadas a la superficie desnuda de acero inoxidable
(Figura 4c) mostraron poca diferencia en la distribucin celular (Figura 4d)
en comparacin con las clulas mezcladas con el extracto de pescado. Sin
embargo, las clulas de L. monocytogenes se incrustaron en el suelo de
queso (Figura 4e); Este suelo era muy grueso y hace la diferenciacin
entre las clulas y el suelo difcil a travs de la mayora de la superficie.
Cuando se observaron superficies de clulas-suelo usando una lmpara UV
normal ( 350 nm), el E. coli y el extracto de carne (Figura 5a) estaban
mal iluminados, el L. monocytogenes y el extracto de pescado (Figura 5b)
eran visibles, Mientras que el L. monocytogenes y el queso fue ms
claramente evidente (Fig. 5c]. La bioluminiscencia de ATP para las mezclas
de clulas-suelo revel que cuando se tom como promedio no se
encontr diferencia entre los resultados para diferentes suelos y muestras
(Figura 6); Sin embargo, el intervalo de valores para cada una de las
diferentes muestras era grande. La presencia de microorganismos elev
las lecturas en 1-2 registros, pero las muestras se haban cargado con un
alto nmero de clulas aproximadamente
6,25 x 105 cfu cm ^ {- 2}.

4. Discusin
Los suelos fueron seleccionados para representar los encontrados en las
industrias de carne, pescado y lcteos. Se seleccionaron tres componentes
del suelo definidos para cada "industria", lpidos, protenas e hidratos de
carbono para evaluar su deteccin por los dos mtodos. El colesterol es un
lpido que se encuentra en las membranas celulares, los cidos grasos
mixtos representan los que se encuentran en el queso y los aceites
animales, el aceite de pescado se explica por s mismo. Para las protenas,
BSA se utiliz ya que es una protena de la albmina srica que se
encuentra en la sangre y por lo tanto, la carne, la peptona de pescado se
utiliza para representar las protenas de los peces, y la casena es la
fosfoprotena ms predominante en el queso. Los carbohidratos
seleccionados fueron glucgeno, encontrado en clulas animales, almidn
compuesto de amilasa y amilopectina, y lactosa, que se encuentra en la
leche.
Todos los componentes del suelo fueron detectados en todas las
concentraciones, sin embargo los suelos definidos y el extracto de
pescado dieron una lectura de paso. Estos resultados apoyan el uso del
mtodo de bioluminiscencia de ATP, pero la importancia higinica del
aumento del suelo que pasara en ausencia de microorganismos (y su ATP)
requiere algn pensamiento. En esta investigacin, el mtodo de
bioluminiscencia de ATP detect suelos en las concentraciones ms altas
probadas, pero la presencia de un contaminante microbiano alto (6,25 x
105 cfu cm2) mejor el rendimiento. Se seleccion una concentracin de
microorganismos, ya que el objetivo de este trabajo fue la deteccin de
suelos y su impacto en la deteccin de microorganismos. Sin embargo,
dado que la concentracin de clulas presentes en la superficie es
importante y que afectar invariablemente a la fiabilidad de los
resultados, el trabajo futuro evaluar la sensibilidad de estos mtodos
utilizando diferentes concentraciones de microorganismos y diferentes
proporciones de microorganismos y suelo. Las concentraciones
seleccionadas se basarn en los niveles de microorganismos detectados
en las superficies de los alimentos in situ.

La deteccin UV proporcion un mtodo simple, no invasivo, no

cuantificable que no poda discriminar entre el ensuciamiento de clulas y
el suelo. De los diferentes componentes de los alimentos examinados, los
aceites se detectaron particularmente bien. La banda de longitudes de
onda UV de 330-380 nm fue adecuada para la deteccin de suelos
residuales en la industria de la carne y el queso, pero una banda de
longitud de onda UV de 510-560 nm podra ser considerada para la
deteccin mejorada de suelos en la industria pesquera. Por lo tanto, el
rendimiento de la deteccin UV podra ser optimizado mediante el uso de
fuentes de luz con diferentes longitudes de onda en el espectro UV para
iluminar altamente los suelos objetivo en equipos de procesamiento de
alimentos en diferentes entornos. Sera interesante probar estas bandas
de luz de longitud de onda UV en suelos retenidos in vitro e in situ sobre
otras superficies encontradas en la industria alimenticia tales como
caucho y plsticos para determinar si ciertas longitudes de onda UV de luz
pueden detectar superficies sucias, Autofluorescencia de las superficies
sobre las que se conservan.
La necesidad de mtodos rpidos de deteccin industrial tales como estos
es importante para determinar la eficacia de la limpieza y desinfeccin
contra el suelo orgnico y la retencin celular. Tambin se podra
considerar la naturaleza de la retencin del suelo en el substrato. La clave
para la seleccin del suelo para este trabajo fue la retencin de suelos
especficos a un sustrato definido. Wildbrett y Sauerer (1989) mostraron
que el principal componente de ensuciamiento para el acero inoxidable
eran las protenas, mientras que la grasa era el principal componente de
incrustacin de los plsticos. Por lo tanto, en trminos de higiene de la
superficie, a partir de nuestros resultados, el trabajo adicional podra ser
prudente a fin de determinar si podra ser ms apropiado utilizar acero
inoxidable en lugar de materiales polimricos en un entorno alimentario
que es rica en grasa.
Dado que es probable que cada ambiente de procesamiento de alimentos
tenga una ecologa microbiana particular que refleje las condiciones de
conservacin de los alimentos (Bagge-Ravn et al., 2003), la mezcla de
microorganismos y suelos seleccionados al probar in vitro los agentes de
limpieza y desinfeccin debe ser apropiada a la Ambiente de uso. Adems,
el comportamiento de microorganismos como L. monocytogenes est
fuertemente influenciado por la matriz alimentaria (Gram et al., 2007).
Para las impurezas orgnicas complejas, el trabajo de Gram et al. (2007)
demostraron que los desinfectantes eran extremadamente eficientes
contra L. monocytogenes unidos a una emulsin de pescado, mientras que
solo se observ un efecto marginal cuando se us el mismo desinfectante
contra el organismo unido a una emulsin de carne.

La deteccin de material orgnico es importante ya que los suelos de los

alimentos influyen en la retencin de las clulas en una superficie y
tambin inhiben los procesos de limpieza y desinfeccin. Se ha llevado a
cabo mucho trabajo sobre el efecto de las protenas en la fijacin celular,
pero se ha tenido menos en cuenta el efecto de los lpidos y los
carbohidratos en la retencin celular. Nuestro trabajo sugiere que aunque
una lectura higinica puede darse para una superficie (por ejemplo las
protenas), la superficie puede todava retener una capa de
acondicionamiento de material que slo es detectable por otros mtodos.
Esto obviamente cambiar las propiedades del sustrato. Aunque se ha
sugerido que las protenas generalmente adsorbidas reducen el apego
bacteriano
(Meadows, 1971, Fletcher, 1976, Orstavik, 1977, Fletcher y Marshall, 1982,
Helke et al., 1993, Hood y Zottola, 1997, Barnes et al., 1999), se ha
observado un mayor apego , Almakhlafi et al., 1994, Verran y Whitehead,
2006). La inhibicin de la unin celular a las superficies podra deberse al
enmascaramiento de los grupos qumicos superficiales, lo cual detendra
las interacciones adhesivas con las bacterias, o debido a la estabilizacin
esterica (Rutter y Vincent, 1984).
La reduccin de la unin de las clulas a las superficies tambin puede
deberse a que las protenas en la fase fluida a granel compiten por los
sitios de unin en la superficie del acero inoxidable (Flint et al., 2007). Sin
embargo, hay que recordar que la naturaleza del efecto de la pelcula
acondicionadora pareca variar con el organismo, sustrato y protena bajo
investigacin (Barnes et al., 1999). Se ha demostrado el aumento de la
unin de las clulas al caucho y al acero inoxidable con protenas de
lactosuero o lactosa (Speers y Gilmour, 1985). Los lipopolisacridos
inhiban la unin de las clulas a los sustratos si estaban en presencia de
clulas o adsorbidos a los sustratos antes de la unin, mientras que los
dextranos slo demostraron inhibicin cuando estaban en presencia de las
clulas (Pringle y Fletcher, 1986).
Ambos mtodos implementados en este estudio se utilizan para la
deteccin solamente, y no indican la naturaleza del material (o
microorganismos) presentes. Bajo UV, los suelos aceitosos, se detectaron
cidos grasos mixtos, colesterol y casena a concentraciones bajas, con
niveles de deteccin que oscilaban entre 1% y 0,001% para diferentes
sustancias. Una banda de longitud de onda de 330-
380 nm, iluminado la mayora de los suelos. Para las superficies
combinadas de la tierra de la clula, la combinacin de L. monocytogenes
y queso fue la ms intensamente iluminada. Los suelos en todas las
concentraciones fueron detectados por el mtodo de bioluminiscencia ATP;
Los suelos complejos dieron las lecturas ms altas. Las deficiencias con
estos mtodos incluyen la deteccin del rea ensuciada una vez que la luz
se ha retirado o el rea se ha limpiado (ATP), no hay ninguna indicacin en
cuanto a donde ocurrieron las reas problemticas del ensuciamiento. Sin
embargo, estos mtodos proporcionan una pantalla muy til para
procedimientos de limpieza y resaltan reas difciles de limpiar. Las
interacciones entre sustratos, componentes del suelo y mtodos de
deteccin merecen trabajo adicional.