Fraccionamiento subcelular

El fraccionamiento subcelular es un conjunto de mtodos y tcnicas que tienen como

objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas en un determinado componente celular,
ya sea ste un orgnulo (mitocondrias, ncleos, peroxisomas) una fraccin de membrana
(membrana total, plasmtica, dominio basolateral, dominio apical), complejos
multiproteicos (citoesqueleto de actina, microtbulos, poros nucleares, etc.), etc...

Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene dos etapas:

Rotura de las clulas o tejidos para obtener un lisado celular (proceso de

ruptura de la membrana celular de clulas o bacterias que produce la salida del
material intracelular,) o tisular en el que la fraccin deseada se encuentre en
condiciones adecuadas para su purificacin.

Separacin de la fraccin deseada del resto de componentes de la clula o del

tejido mediante algn criterio como puede ser una diferencia de densidad
(centrifugacin en gradientes o centrifugacin diferencial), la presencia de algn
antgeno (cromatografa de inmunoafinidad, inmunoprecipitacin, ...), etc...

Tcnicas de rotura de clulas y tejidos

El primer paso en la purificacin de la mayora de las protenas y estructuras

subcelulares es la rotura de los tejidos o de las clulas para obtener un lisado celular
en el que la protena, el complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentre
en condiciones que permitan su aislamiento. Esto se consigue empleando
procedimientos mecnicos suaves conocidos generalmente como homogenizacin.
Estos mtodos producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo
que se libera el contenido celular.

Los procedimientos de homogenizacin ms comunes son:

Molienda: mortero, machaca las sustancias y las mezclas; Potter-Elvehjem,

homogeneizadores de tejidos se usan para la reduccin controlada del tamao
de partcula y la homogenizacin de diversas sustancias, especialmente
material biolgico. Las fuerzas de cizallamiento (fuerza aplicada contra la
superficie) generadas por el movimiento de rotacin del mbolo en un tubo de
precisin provoca la reduccin del tamao. .

Cortes: licuadora, las cuchillas o aspas cortan y mezclan las clulas o tejidos.

Sonicacin: Consiste en la aplicacin de ultrasonidos a una suspensin celular.

La intensa agitacin producida destruye las membranas celulares.
Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energa aplicada se pueden
destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos
proteicos. Se suele aplicar en frio para evitar el sobrecalentamiento de las
muestras que podra provocar la desnaturalizacin de las protenas
 Shock osmtico: solucin hipotnica, 1. Las clulas se colocan en una volumen
de agua 2 veces mayor que el volumen de clulas. 2. Bajo estas condiciones
las clulas se hinchan, debido a un simple flujo osmtico que se produce
debido a que las clulas contienen solutos (los causantes del flujo osmtico de
agua al interior de la clula). 3. Las clulas se hinchan y algunas llegan a
reventarse. La susceptibilidad de las clulas es relativa depende fuertemente
de su tipo.

Altas presiones: prensas, la ruptura celular se produce cuando pasan a travs

de un pequeo orificio. Su uso est restringido al tamao de la muestra. Las
clulas deben estar previamente re suspendidas en un pequeo volumen

La solucin se homogeneza en una solucin isotnica para detener el dao

osmtico, con una solucin tampn para regular el pH, y a una temperatura muy baja
para evitar daos enzimticos. Los orgnulos se mantienen en fro, en un medio
isotnico y tamponado.

El resultado ahora es una pasta fina de lquido, el homogenato de clulas, que consta
de clulas intactas y componentes celulares. Con un cuidadoso trabajo se mantienen
intactos los orgnulos celulares, siendo funcionales en gran medida.

Los mecanismos de homogeneizacin:

- Mtodos qumicos y bioqumicos: como el empleo de un medio hipotnico o la

hidrlisis enzimtica mediada por la lisozima. Se utiliza para clulas sanguneas y
para hidrolizar la pared bacteriana.

- Fuerza producida por mecanismos de cavitacin gaseosa: como el empleo del

Sonicador o la bomba de nitrgenos que se utilizan para orgnulos y clulas.

- Fuerza cizalladora producida por slidos: que se realiza con la ayuda de un

mortero con mazo o de una prensa hugens y es utilizado para vegetales y
bacterias.

-Fuerza cizalladora producida por lquidos: como el empleo del homogeneizador

Potter-Elvehjem, polytron y prensa de french que se utilizan parar tejido blando, tejido
duro y bacterias

1) Filtracin: Se realiza con succin por un filtro de cermica con un tamao de poro
adecuado. Este paso en muchas oportunidades no es necesario, todo depende la
fuente de la clula, ya que algunos tejidos y elementos liberan tejido conectivo,
para estos casos se hace necesaria la filtracin.

2) Purificacin de los componentes celulares: se realiza con un aparato llamado

centrfuga es conocido tambin como, fraccionamiento celular propiamente
dicho, que se realiza por centrifugacin aumentando secuencialmente la
velocidad de giro y la fuerza gravitacional, dando como resultado una separacin
secuencial de los orgnulos de acuerdo a su densidad.
 Centrifugacin

Una vez obtenido el lisado o homogenado celular se ha de proceder a su fraccionamiento.

Una de las tcnicas ms empleadas es la centrifugacin. Esta es una tcnica basada en
el movimiento de las partculas, suspendida en un medio lquido especfico, impulsada
por una fuerza denominada centrifuga, que tiende a desplazarlas hacia fuera del centro de
rotacin. Tanto la viscosidad de la disolucin-muestran como las propiedades fsicas de
las partculas afectaran a la sedimentacin individual de las mismas.

Es un mtodo en el que se pueden separar slidos de los lquidos de diferente densidad.

La centrifugacin imprime un movimiento rotatorio con una fuerza mayor a la fuerza de
gravedad, provocando la sedimentacin de las partculas ms densas. Este
procedimiento separa fundamentalmente las partculas de acuerdo a su masa y su forma.

Debido a las diferencias en tamao y densidad cada componente celular est sujeto a
una fuerza centrifuga. La fuerza generada por la centrifuga se expresa como fuerza
centrifuga relativa en unidades de g.

FUNCIONAMIENTO DE LA CENTRIFUGA

Debido al movimiento de la centrifuga se forma un campo centrifugo del cual surge un

sedimentacin.
NOTA : SEDIMENTACION Es el proceso de transporte donde la fuerza que acta es la
gravedad, lo que determina el comportamiento de una estructura es su masa de modo
que , cuanto menor sea esta , menor ser el flujo de sedimentacin, por el contrario si su
masa es el elevada la sedimentacin sera preponderante

El Percoll es una herramienta para realizar separaciones por densidad de forma ms

eficiente. Se emplea para el aislamiento
de clulas, orgnulos y/o virus mediante centrifugacin en gradiente de densidad.

Instrumentos.

Tubos. Vidrio o plstico. Resistente qumicamente y fsicamente.

Centrifugas. Se puede regular velocidad, tiempo y temperatura.

La centrifugacin se puede llevar a cabo a escala preparativa o escala analtica. La

primera se utiliza para aislar partculas para su aprovechamiento posterior y la segunda
permite determinar propiedades fsicas.

Analtica

Mide las propiedades fsicas de las partculas que sedimentan tales como su coeficiente
de sedimentacin o su masa molecular. Las molculas se observan mediante un sistema
ptico durante la centrifugacin.

Preparativa

Su objetivo es aislar partculas, clulas o molculas para su anlisis o utilizacin posterior.

En general se emplea mayor cantidad de muestra que en la analtica. Se utiliza para
separar partculas segn la velocidad de sedimentacin (diferencial), la masa (zonal) o la
densidad (isopicnica).

En el primer caso se obtiene lquido sobrenadante y un material sedimentado. En los otros

dos casos las partculas se distribuyen en fracciones de diferentes densidades de un
fluido lquido.

Centrifugas de mesa: Para la simple separacin del material precipitado. Alcanzan

velocidades de giro del orden 5000rpm
Centrifuga de alta velocidad: Alcanzan velocidades entre 18000 y 25000 rpm. Son
refrigeradas y algunas tienen sistemas de vacio para evitar el calentamiento del
rotor a causa del rozamiento con el aire. Son tiles en la separacin de fracciones
 celulares, pero insuficientes para la separacin de os ribosomas, virus o
macromolculas en general.
Centrifuga clnica: (baja velocidad) Son usadas en el laboratorio de qumica clnica
principalmente para separar la sangre coagulada o clulas del suero o del plasma,
as como para aclarar lquidos orgnicos (orina LCR etc.). Una fuerza de 1000 a
2500 rpm durante unos 10min aproximadamente es suficiente para una buena
separacin.
Ultracentrfugas: Se utiliza para la separacin de biopolmeros y orgnulos
subcelulares, Permite procesar grandes cantidades de muestra

TIPOS DE ROTORES

ROTORES FLOTANTES: Su forma bien pudiera sugerir la de una seta, de

modo que el rotor se enroscara en el vstago de la centrifugacin a travs
del pie. Del sombrerillo colgaran unas carcasas metlicas en cuyo interior
se van a alojar los tubos que contendrn a la muestra. En el momento en el
que comienza a actuar el campo centrifugo, las carcasas flotan como
consecuencia de este campo, es lo que le da el nombre a estos rotores.
La caracterstica principal de estos rotores es la reducida cantidad de
muestras que se pueden transportar (pueden llegar a transportar, segn el
modelo hasta unos 200ml).

ROTADORES ANGULARES: Su forma se asemeja a la de un tronco de

cono, en el que hay una serie de perforaciones que alojaran a los tubos de
la muestra. Estos se dispondrn formando un cierto ngulo, tampoco en
este caso es uniforme el campo centrfugo que acta sobre la muestra.
Estos rotores admiten un gran volumen de muestra (segn el modelo
pueden superar 5 litros).
ROTADORES VERTICALES: Su forma es la de un cilindro, en cuya
periferia hay unas perforaciones para contener a los tubos de la muestra.
Estos se encuentran en disposicin vertical, y de ah su nombre. En ellos el
campo centrfugo es ms uniforme que en otros rotores. El campo que
acta sobre un tubo en cada tipo de rotor no es homogneo, ya que la
distancia al eje de giro no es la misma en todas las zonas de recipiente.
Permite el anlisis de un mayor volumen de muestra
Los rotores verticales son los que permiten una sedimentacin de las
muestras ms rpida ya que para que esta ocurra las partculas solo han
de recorrer una distancia igual al dimetro del tubo

Nota; PUEDEN PRESENTAR EL INCONVENIENTE DE QUE SI EL MATERIAL

SEDIMENTADO NO ESTA MUY COMPACTADO SOBRE LA PARED DEL TUBO,
PUEDE DESPRENDERSE HACIA EL FONDO DE STE AL DETENERSE EL
ROTOR, Y ELLO DISTORSIONARA EL RESULTADO DE LA CENTRIFUGACION

Fuerza centrfuga relativa

Se abrevia F.C.R, es la fuerza requerida para que se produzca la separacin de los
orgnulos de la mezcla heterognea. Las unidades de esta fuerza se expresan en el
nmero de veces el valor de la gravedad, o sea x.g, y se calcula as

F.C.R = 1,118 . 10-5 . r . n2

Dnde, 1,118 . 10-5 es una constante y r es el radio de giro o distancia

horizontal en centmetros desde el eje de rotacin hasta el fondo del tubo, y n2 es la
velocidad de rotacin que se expresa en rpm (revoluciones por minuto).

Coeficiente de sedimentacin
Se calcula dividiendo la velocidad constante de sedimentacin en (m/s) por la aceleracin
aplicada a (m/s)2.. La velocidad es constante porque la aceleracin aplicada por la
centrfuga es compensada por la resistencia viscosa del medio a travs del cual se
desplaza la partcula (normalmente agua), el coeficiente de sedimentacin tiene
dimensiones de tiempo y por eso se expresa es svedberg (S). El Coeficiente de
sedimentacin no es aditivo porque depende tanto de la forma como de la masa de la
molcula.

Theodor (The) Svedberg (30 de agosto de 1884, Valbo - 25 de febrero de 1971) fue un
qumico sueco y profesor universitario, ganador del Premio Nobel de Qumica en 1926.
Durante su investigacin, desarroll la tcnica de ultracentrifugacin analtica

CENTRIFUGACION DIFERENCIAL

En este tipo de centrifugacin, la muestra ocupa la totalidad del tubo de tal forma que
al concluir se podr separar en 2 fracciones el llamado sedimento y el denominado sobre
nadante.

Es un proceso de separacin de los componentes celulares por centrifugacin repetida a

velocidades cada vez mayores, los componentes de las clulas se separan en funcin de
su tamao y densidad, los componentes de gran tamao y mas densos migran al fondo a
velocidades relativamente bajas formando un sedimento, o sea se centrifuga a baja
velocidad quedando un precipitado resultante de elementos grandes y pesados, entonces
se elimina el sobrante y se centrifuga a una velocidad mayor. El proceso se repite tantas
veces sea necesario como para aislar el orgnulo deseado, siempre tomando en cuenta
que en cada etapa debe aumentarse la velocidad.

CENTRIFUGACION ZONAL

Se separan en bandas segn sus coeficientes de sedimentacin.

Se procesa volmenes pequeos.
El medio sobre el cual se deposite la muestra debe ser de mayor
densidad que el de la muestra.

Las partculas se separan por la diferencia en la velocidad de sedimentacin a

causa de la diferencia de masa de cada una. La muestra se coloca encima de
un gradiente de densidad preformado. Debido a la fuerza centrfuga las
partculas sedimentan a distinta velocidad a travs del gradiente de densidad
ya que se mueven a velocidades que dependen de la masa y por esto
sedimentan en diferentes zonas del gradiente. Es importante tener en cuenta
el tiempo de centrifugacin ya que si se excede, todas las molculas podran
sedimentarse en el fondo del tubo de ensayo. La densidad mxima del
gradiente no ha de exceder a las partculas a separar.

CENTRIFUGACION ZONAL EN UN GRADIENTE DE DENSIDAD

Es el medio donde se deposita la muestra va a presentar un densidad variable.

Sales de metales alcalinos

Cloruro de Cesio
Sulfato de Cesio
Bromuro de Litio
Hidratos de Carbono
Sacarosa
Glucgeno

Polialcoholes
Sorbitol
Glicerol
Coloides Derivados
De Silice

CENTRIFUGACION ISOPICNICA

Separa partculas en un gradiente de densidad en funcin de la densidad de

las mismas, las partculas se mueven en el gradiente y llegan al punto donde la
densidad de la partcula y de la de la gradiente es la misma, este es el motivo
por el cual se llama isopcnica. Esta tcnica se utiliza para separar partculas
cuyo tamao es similar pero tienen diferente densidad, por esto es un mtodo
 adecuado para cidos nucleicos (ADN). O sea partculas con el mismo
coeficiente de sedimentacin se separan al usar medios de diferente densidad.
La densidad mxima del gradiente final excede a la densidad de las partculas,
por esto no hay sedimentacin.

CENTRIFUGACION Hay dos tipos de gradientes de densidad

Discontinuos: Deposito escalonado de diferentes densidad.

Continuos: La densidad ya no vara de forma escalonada sino continua

CROMATOGRAFIA

Proceso que se caracteriza por el paso uniforme de una mezcla diluida (fase
mvil) a travs de otra sustancia relativamente inmovilizada (fase
estacionaria).

Es un mtodo para separar mezclas complejas, se basa en la retencin

selectiva, permitiendo identificar y determinar las cantidades de una mezcla.
Posee dos fases una llamada estacionaria en la que se utiliza generalmente un
gel de slice o almina y una fase mvil o tambin llamada eluyente que puede
ser agua o un disolvente adecuado a la polaridad de los componentes de la
mezcla que se desea separar, aunque habitualmente es una mezcla de
disolvente.

Coeficiente de particin: llamado tambin coeficiente de distribucin, es la

razn por la que la mezcla formada por dos disolventes inmiscibles estn en
equilibrio y por tanto mide la solubilidad diferencial de una sustancia en esos
dos disolventes. Puede indicar el carcter hidrofbico e hidroflico de una
sustancia, es decir su mayor o menor tendencia a disolverse en disolventes
polares o apolares, a esto se llama coeficiente de reparto.

Cromatografa de intercambio inico

Es un proceso que permite la separacin de iones y molculas polares basados

en las propiedades de carga de la molcula, se puede utilizar cualquier
molcula cargada incluyendo grandes protenas o hasta aminocidos. Se
clasifica en:

Cromatografa de intercambio catinico: retiene cationes cargados

positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo
funcional cargado negativamente como cido fosfrico
 Cromatografa de intercambio aninico: retiene aniones usando
grupos funcionales cargador positivamente como cationes de amonio
cuaternario.

La fase estacionaria muestra que en la superficie los grupos funcionales inicos

interactan con iones de carga opuesta del analito (componentes separados),
esto es importante porque las protenas tienen numerosas cargas positivas y
negativas, as que la cromatografa de intercambio inico las separa de
acuerdo a su carga neta (todo depende de la composicin de la fase mvil). La
muestra se introduce con una solucin buffer acuosa (fase mvil), y como fase
estacionaria se utiliza una resina o matriz de gel que consiste en celulosa
unidos por grupos funcionales cargados de analitos objetivos (cationes y
aniones).

Cromatografa de exclusin molecular

La cromatografa de exclusin molecular (a menudo tambin llamada filtracin

en gel o de tamiz molecular) es una de las tcnicas ms sencillas de las
empleadas en la separacin de protenas y cidos nucleicos. Este tipo de
cromatografa se realiza en columnas cilndricas rellenas con algunos de los
geles que se fabrican con este fin y que pueden ser de varios tipos: dextranos
con enlaces cruzados, agarosa, poliacrilamida. Todos estos geles (fase
estacionaria) se hallan constituidos por grnulos (partculas) de un material
esponjoso hidratado, que contiene poros con un tamao de dimetro
determinado.

Cuando se hace pasar una mezcla de molculas de distinto tamao, a travs

de una columna de filtracin en gel; aquellas molculas con un tamao mayor
que el dimetro de los poros de las partculas, slo podrn moverse en su
camino, a travs de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las
partculas; y por lo tanto, no se vern retrasadas en su descenso. En cambio
aquellas molculas capaces de penetrar en las partculas se vern retrasadas
por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamao. Por lo
tanto, las molculas eluyen en este tipo de cromatografa por orden
decreciente de tamao molecular.

Cromatografa de afinidad

Permite la separacin de mezclas proteicas gracias a su afinidad o capacidad

de unin a un determinado sustrato. En este caso, las protenas que se
retienen en la columna son aquellas que se unen especficamente a un sustrato
que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna.
Despus de que las protenas que no se unen al sustrato son lavadas o eluidas
a travs de la columna, la protena de inters que ha quedado retenida en la
columna se eluye o libera mediante el empleo de una solucin que contiene
bien sustrato libre u otro compuesto que rompa la interaccin entre el ligando y
la protena.

LIGANDO: Es aquella molcula que se une al centro activo de la protena para

que sta pueda realizar su funcin (transportar, o inhibir una reaccin
metablica)