VIABILIDAD DE LA OBTENCIN DE CIDO LCTICO A PARTIR DE NARANJA

VALENCIA (Citrus Sinensis Osbeck) CON LACTOBACILLUS CASEI ATCC 393.

LAURA MILENA RIVERA GARCA

LUISA FERNANDA RINCN HERRERA

Proyecto de Grado

Director de trabajo de grado

PH. D. Henry Reyes Pineda

Docente programa de Qumica

Co director de trabajo de grado

M. Sc Lina Mara Arbelez

UNIVERSIDAD DEL QUINDIO

FACULTAD DE CIENCIAS AGROINDUSTRIALES

PROGRAMA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS

ARMENIA, QUINDIO

1-2014
1
 TABLA DE CONTENIDO.

1. Planteamiento del problema. 6

2. Justificacin.
3. Estado general del tema. 8
4. Objetivos.
4.1. Objetivo General.
4.2. Objetivos especficos.
5. Marco terico.
5.1. cido lctico.
5.2. Caractersticas de las bacterias cido lcticas.
5.3. Caractersticas de Lactobacillus casei.
5.4. Produccin de cido lctico por biotransformacin.
5.5. Caractersticas generales de la naranja valencia (citrus sinensis osbeck).
6. Metodologa.
6.1. rea de estudio.
6.2. Fases
6.2.1. Fase1: Caracterizacin fisicoqumica de los frutos y jugo de naranja valencia.
6.2.2. Fase 2: Obtencin del sustrato.
6.2.3. Fase 3: Anlisis del producto obtenido.
7. Resultados y discusin.
7.1. Caracterizacin taxonmica.
7.2. Anlisis fisicoqumico de la pulpa de naranja valencia (citrus sinensis
osbeck).
7.2.1. Anlisis de Color.
7.2.2. Anlisis Humedad y Cenizas.
7.2.3. Anlisis aw.
7.3. Anlisis fisicoqumicos para el jugo de naranja valencia (citrus siensis
osbeck).
7.3.1. Anlisis azcares reductores (mtodo DNS).
7.3.2. Caracterizacin fisicoqumica jugo de naranja valencia (citrus sinensis
osbeck.
7.3.3. Anlisis microbiolgico jugo de naranja pasteurizado.
7.3.4. Anlisis termodinmicos.
8. Reactivacin y cuantificacin de la cepa Lactobacillus casei ATCC 393.
9. Conclusiones.
10. Referencias bibliogrficas.

2
3
 NDICE DE TABLAS

Tabla 1. Propiedades fsico-qumicas de cido lctico.

Tabla 2. Composicin qumica de la naranja. (Asociacin para la promocin del consumo de

frutas y hortalizas).

Tabla 3. Estndares de McFarland.

Tabla 4. Concentracin de azcares reductores de jugo de Naranja Valencia antes y despus

de pasteurizacin.

Tabla 5. Caractersticas fisicoqumicas del jugo de Naranja Valencia (Citrus sinensis osbeck).

Tabla 6. Indicadores microbiolgicos de Naranja Valencia (citrus sinensis osbeck).

Tabla 7. Tabla de calibracin estndares de McFarland.

Tabla 8. Absorbancia Vs Concentracin de azcares reductores tras fermentacin del jugo de

naranja valencia con Lactobacillus casei ATCC 393.

Tabla 9. Cambios de pH tras fermentacin Vs temperatura.

4
 NDICE DE FIGURAS

Figura 1. Frmula estructural del cido lctico. 7

Figura 2. Estructura qumica de L (+) ismero y D (-) ismero. 15

Figura 3. Lactobacillus casei ATCC 393, tincin gram.26

Figura 4. Pasos para realizar la tincin de Gram. 27

Figura 5. Montaje de laboratorio para fermentacin batch.

Figura 6. Diagrama de flujo metodologa.

Figura 7. Anlisis de conglomerados parmetro de color.

Figura 8. Diagrama de puntos parmetro Humedad.

Figura 9. Diagrama de puntos parmetro aw.

Figura 10. Curva de calibracin azcares reductores mtodo DNS.

Figura 11. Espectro curva de calibracin estndares de McFarland.

Figura 12. Curva de calibracin estndares de McFarland.

Figura 13. Absorbancia Vs Concentracin de azcares reductores tras fermentacin del jugo
de naranja valencia con Lactobacillus casei.

Figura 14. Cambios de pH tras fermentacin Vs temperatura.

5
 NDICE DE ANEXOS.

Anexo 1. Rtulo de la cepa.

Anexo 2. Tabla de colores NTC 4086.

Anexo 3. Espectro anlisis de muestras finales.

6
 1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

En la actualidad el campo de la investigacin se desarrolla con el objetivo de disminuir los

costes de produccin de las grandes, medianas y pequeas empresas aplicando nuevas
tecnologas, con el fin de obtener nuevos sustratos, para alcanzar altos rendimientos y
productividades.

Bajo este fin, un nuevo sustrato es el cido lctico que tiene un amplio rango de aplicaciones
en la industria alimenticia, qumica, farmacutica y cosmtica. Adems, se encuentra en un
gran abanico de materias primas agrcolas ricas en carbohidratos y materiales nitrogenados
que a travs de vas fermentativas o tcnicas de separacin se puede aislar.

Utilizar los recursos de la regin como la naranja valencia, pueden generar agregados
biotecnolgicos a la industria de los alimentos; as se percibe una nueva etapa para la
transformacin de la fruta y considerarla como punto de partida en la biosntesis de cido
lctico.

Por tal razn, es la naranja valencia una alternativa potencial en la sntesis biotecnolgica
de cido lctico con el fin de obtener cido polilctico (PLA) para la industria de bio
empaques?

7
 2. JUSTIFICACIN.

El cido lctico es en el campo de la biotecnologa una nueva base de estudio e

investigacin para incluirlo en procesos desarrollados por el hombre con el fin de obtener
productos consumidos por l, y que le permiten competir con el mercado nacional a partir de
materias primas propias, de bajo costo, de fcil localizacin y con excelentes rendimientos.

Conviene tener en cuenta que la globalizacin y el desarrollo de nuevos productos en aras a

suplir una necesidad bsica del hombre, exige la disposicin total de todos los componentes
de las materias primas, es decir, el objetivo no es obtener un jugo de naranja dulce, sino
darle a ste un valor agregado en la industria, que garantice la conservacin del medio
ambiente y a su vez responda a la satisfaccin del mercado.

Los avances recientes en la ciencia y la tecnologa de materiales permiten contar con una
variedad de mtodos de sntesis de polmeros biodegradables como lo es el cido polilctico
(PLA), ste es el primer polmero sinttico biodegradable obtenido a partir de recursos
naturales renovables, que presenta caractersticas similares al clsico PET.

Figura 1. Frmula estructural del cido polilctico.

El cido polilctico es un polister, es decir, se encuentra formado por unidades de cido

lctico unidas por enlaces ster (entre el grupo carboxilo de una molcula con el grupo
hidroxilo de la vecina).

Munilla y Carracedo (2005) afirman:

El uso de polmeros de la petroqumica introdujo grandes beneficios pero cada vez es

ms evidente que su empleo ocasiona daos al ecosistema. La preocupacin por el
impacto ambiental de los desperdicios de estos plsticos es cada vez mayor y los mtodos
de disposicin son limitados, as como los recursos petroleros, por lo que es imprescindible
encontrar sustitutos. Esto ha generado investigaciones para obtener polmeros

8
biodegradables como alternativa de los convencionales no degradables. Entre los polmeros
sintticos totalmente degradables el cido polilctico (PLA) ha sido estudiado para
emplearlo en dismiles usos por su biodegradabilidad. (p.49)

La produccin de PLA comienza con la fermentacin bacteriana de la dextrosa (glucosa sin

refinar) para obtener principalmente cido L-lctico. El cido lctico se somete a una
secuencia de polimerizacin y despolimerizacin, en presencia de 2-etilhexanoato de estao
como catalizador. (Monteiro et al, 2004, p. 107).

Los microorganismos que producen cido lctico son diversos y dependen de cada industria,
en general, pertenecen al gnero Lactobacillus. Hay dos clases de bacterias, las
homofermentativas, que producen cido lctico casi exclusivamente y las
heterofermentativas, que producen subproductos en cantidades apreciables. Las empleadas
en la industria son las homofermentativas.

Lactobacillus casei ATCC 393 es una bacteria que pertenece al grupo de bacterias cido
lcticas heterofermentativas facultativas, es decir, dependiendo de las condiciones del medio,
esta puede producir cido lctico exclusivamente o como subproducto principal.

En la industria de los alimentos, lactobacillus casei ATCC 393 ha sido fuente de estudio como
componente probitico en la investigacin y desarrollo de alimentos funcionales; sin
embargo, la necesidad de bsqueda de nuevas fuentes alternativas para la generacin de
materiales renovables, ha virado la perspectiva funcional de esta bacteria hacia los
bioempaques para alimentos, ya que los procesos de obtencin de estos materiales, como la
fermentacin mediante un proceso de gliclisis, que segn Munilla y Carracedo (2005),
busca que los microorganismos fermenten rpida y completamente sustratos baratos, con
adicin mnima de nutrientes nitrogenados en condiciones de valores reducidos de pH y
elevadas, que se produzca muy poca biomasa y que la cantidad de subproductos sea
despreciable.(p.51).
En la industria de los bioempaques, las especies del gnero lactobacillus son las ms
utilizadas, en especial las que ofrecen un metabolismo homofermentativo. Para esta
investigacin, se evalu la eficiencia del lactobacillus casei ATCC 393 en la obtencin de
cido lctico como sustrato en la conversin de cido polilctco, siendo sta una bacteria de
9
metabolismo heterofermentativo facultativo y con tolerancia a condiciones fluctuantes del
medio.

10
 3. ESTADO DEL ARTE.

Araya, Rojas y Carrillo (2010) SNTESIS DE CIDO LCTICO, A TRAVS DE LA

HIDRLISIS ENZIMTICA SIMULTNEA A LA FERMENTACIN DE UN MEDIO A BASE DE
UN DESECHO DE PIA (ANANAS COMOSUS), para su uso como materia prima en la
elaboracin de cido polilctico. Se evalu el potencial de un desecho agroindustrial de pia
para su utilizacin en la produccin de cido lctico por fermentacin, utilizando Lactobacillus
casei subespecie rhamnosus. Se realizaron fermentaciones del sustrato de pia como tal e
hidrolizado enzimticamente con invertasa. El tratamiento enzimtico permiti aumentar el
rendimiento de 84 a 98% (m/m) y la concentracin de cido lctico de 64 a 75 g/L, al
obtenerse un consumo total de los azcares presentes en el medio hidrolizado, en
comparacin con la fermentacin del medio sin hidrlisis que present una concentracin
residual de sacarosa de 15 g/L. la hidrlisis enzimtica del medio es la mejor opcin para
obtener una concentracin mayor de cido lctico y para su potencial aplicacin en la
produccin de plsticos biodegradables.

Garca, Arrzola y Durango (2010) PRODUCCIN DE CIDO LCTICO POR VA

BIOTECNOLGICA. Donde se concluye que el cido lctico puede ser obtenido por va
biotecnolgica a partir de derivados de recursos renovables como azcar, melaza,
lactosuero, materiales amilceos y lignocelulsicos, almidones, yuca y licor de maz; adems
las investigaciones van dirigidas a producir cido lctico con el desarrollo de
microorganismos de alto rendimiento y la reduccin del costo de la materia prima.

Gil, Domnguez y Pacho (2008) BIOPRODUCCIN DE CIDO LCTICO A PARTIR DE

RESIDUOS DE CSCARA DE NARANJA: PROCESOS DE SEPARACIN Y
PURIFICACIN. Cuyo objetivo es la utilizacin de residuos agroindustriales como materia
prima de bajo costo, para la obtencin de productos qumicos finos por biotransformacin,
debido a que pases como Mxico, presentan un grave problema de contaminacin dados los
desechos generados como lo son las cscaras y bagazo de naranja al aire libre, tras el
consumo de jugo de la misma, situacin que hace deseable el aprovechamiento de este
recurso para la produccin de cido L (+) lctico por fermentacin con Rhizopus oryzae. El
estudio permiti identificar que una planta con capacidad de procesamiento de 400 ton/ao
de cscara de naranja con 12% p/p de humedad puede transformar los desechos de una
11
planta de jugo de tamao medio con una produccin de 5.5 ton/ao de solucin de cido
lctico al 36% en masa.

Kourkoutas, Xolias, Kallis, Beztirtzoglou y Zanellaki (2004) LACTOBACILLUS CASEI CELL

IMMOBILIZATION ON FRUIT PIECES FOR PROBIOTIC ADDITIVE, FERMENTED MILK
AND LACTIC ACID PRODUCTION. Clulas de Lactobacillus casei se inmovilizaron en trozos
de fruta (manzana y membrillo) por separado y los biocatalizadores inmovilizados se
utilizaron para 15 lotes de fermentacin sucesivas de suero de leche inmediatamente
despus de su preparacin y para las fermentaciones de la leche inmediatamente despus
de su preparacin y despus de un largo perodo de almacenamiento a baja temperatura.
Los biocatalizadores inmovilizados utilizados para los sucesivos lotes de fermentacin de
suero de leche demostraron ser muy eficaces y adecuados para la produccin de alimentos
grado cido lctico, mientras que no hay prdida de la actividad a todas las temperaturas (30,
37, 45C).

Serna-Cock L y Rodrguez de Stouvenel A. (2005).PRODUCCIN BIOTECNOLGICA DE

CIDO LCTICO: ESTADO DEL ARTE. Las nuevas aplicaciones que se le han encontrado al
cido por la posibilidad que ofrece de polimerizarse y producir plsticos biodegradables,
representan un alto costo; por tal razn los investigadores proponen disminuir los costos
mediante el empleo de sustratos ms baratos como desechos agroindustriales, a travs del
uso de microorganismos ms eficientes y mediante la configuracin de procesos integrados
de purificacin que permiten obtener L (+) cido lctico puro.

12
 4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Evaluar la viabilidad de jugo de naranja valencia como sustrato para la obtencin de cido
lctico en un proceso fisicoqumico y termodinmico con Lactobacillus casei.

4.2. Objetivos especficos

1. Caracterizar fisicoqumicamente los frutos y jugo de naranja valencia en la regin del
Quindo.
2. Analizar el hidrolizado del sustrato de jugo de naranja mediante hidrlisis por
ultrasonido.
3. Evaluar el cido lctico obtenido tras fermentacin con Lactobacillus casei.

5. MARCO TERICO
13
 5.1. Caracterizacin fisicoqumica del fruto Citrus sinensis Osbeck.

Se conoce que las matrices alimentarias son la base fundamental para el inicio de todo
proceso agroindustrial; as mismo, que la demanda de productos agrcolas entre las que se
encuentran las frutas, ha venido acrecentndose en procesos de biotecnologa ya sea, para
el diseo de nuevos productos alimentarios o productos enfocados a la reduccin de
parmetros medio ambientales. Es por tanto que el estado fsico y qumico inicial de la
materia prima se fundamenta en la necesidad de conocer las caractersticas o parmetros
propios de la misma. Dentro de los parmetros fisicoqumicos se encuentran:

- aw: el agua es el componente que se presenta en mayor proporcin en algunos

alimentos, actuando como solvente de carbohidratos y se mide en trminos de
actividad de agua (aw) (Ros, Giraldo y Duque, 2007). La medida de ste parmetro
se realiza generalmente por medio del higrmetro de punto de roco el cual se basa en
determinar el punto de temperatura a la cual ocurre la condensacin del vapor de
agua que est relacionada con la aw de la muestra. (Gmez, sin ao).

- Color: ste parmetro est fuertemente relacionado con los estados de madurez de
las frutas y verduras as como en la valoracin de caractersticas de calidad en
alimentos. La medicin se puede realizar por tcnicas como la espectrofotometra o la
colorimetra, en donde, sta ltima cuantifica los tres componentes de colores
primarios de luz observados por el ojo humano (rojo, verde y azul) citado en el espacio
cromtico CIELAB. (Konika Minolta, sin ao).

- Humedad y cenizas: la humedad es una variable que determina la calidad de los

alimentos ya sea porque afecta la estabilidad de las fruver o en la reduccin de la
misma para controles microbiolgicos, por otra parte, el anlisis de cenizas a un
alimento permite cuantificar el contenido de minerales presentes por medio de la
incineracin de la materia orgnica (anlisis de alimentos, sin ao). Ambos anlisis
van ligados dado que se requiere de una muestra seca para realizar la prueba de
cenizas.

- Slidos solubles: est dada en trminos de Brix y expresa la cantidad de azucares

presentes en la muestra. En frutas es importante dicho anlisis ya que por medio de
ste se puede estimar el grado de madurez en que se encuentran. La medicin se
14
 realiza por medio de un elemento ptico de precisin (refractmetro) el cual mide en
Brix.

- Acidez: dentro de la variedad de frutas existentes, se encuentran los ctricos que son
particularmente ricos en cidos orgnicos; stos se encuentran disueltos en la vacuola
de la clula de dos formas: libre o combinada. Los cidos orgnicos que se
encuentran libres hacen referencia a la acidez titulable (Bosquez, sin ao), siendo sta
determinada por medio de una titulacin acido-base.

- pH: hace referencia a la concentracin de iones hidronio en una solucin y expresa la

intensidad de un cido. En alimentos, el pH sugiere una clasificacin: acido, neutro o
bsico el cual se puede relacionar con factores microbiolgicos dependiendo de las
necesidades del procesamiento de los mismos. La medicin de ste parmetro se
realiza mediante el mtodo electroqumico por un sensor (pH-metro) (Serna y Lpez,
2010).

- Azcares reductores: hacen parte de este grupo, aquellos azucares que contienen en
su estructura un grupo carbonilo libre; entre estos los monosacridos y algunos
disacridos (Vaclavik, 2002). La cuantificacin de azucares reductores en alimentos es
comn entre otros casos para procesos fermentativos, ya que estos permiten conocer
la cantidad de sustrato suministrado al mosto. Se utiliza el mtodo de DNS en el cual
ocurre una reaccin de xido-reduccin entre el reactivo y los azucares reductores
(Sumner citado por Bello, Carrera y Das, 2006). Segn Martnez (sin ao) sta
tcnica se realiza a partir de una solucin que contiene NaOH, agua destilada, cido
3,5 dinitrosaliclico y tartrato de Na-K. Se realiza una curva patrn de glucosa anhidra
a diferentes concentraciones. Se evala la muestra con respecto a la curva patrn a
travs de espectrofotometra.

5.2. Caractersticas generales del cido lctico.

El cido lctico es el hidroxicido ms sencillo que existe. Su molcula contiene un tomo de

carbono asimtrico. Presenta isomera ptica: L (+) o D (-), como lo muestra la figura 2
aunque es ms comn encontrarlo como mezcla racmica. Est presente en alimentos como
15
yogurt, suero de leche, panes, queso y muchos otros alimentos fermentados y es uno de los
principales intermediarios metablicos en la mayora de los organismos vivos, desde
procariotas anaerobios hasta humanos.

Figura 2. Estructura qumica

de L (+) ismero y D (-)
ismero.

El cido lctico es ampliamente utilizado en las industrias alimentaria, mdica, farmacutica y

cosmtica, como materia prima para sntesis orgnica, como purgante en forma de lactato de
calcio o lactato de magnesio, como removedor de sales de calcio, en el curtido de pieles, en
la produccin de plsticos biodegradables, agroqumicos, etc. (Gil-Horn et al.2008, p.80). El
ismero D (-) es perjudicial al metabolismo humano y puede generar acidosis y
descalcificacin. El cido L (+) lctico es clasificado por la FDA como una sustancia GRAS,
generalmente reconocido como seguro para uso como aditivo alimenticio. Panesar et al.
(Citado por Garcia et al., 2010, p.10).

El inters en la produccin biotecnolgica de cido lctico ha incrementado debido a las

nuevas tendencias ambientalistas. Por un lado, ofrece una alternativa a la contaminacin
causada por las industrias qumicas al utilizar recursos renovables para su produccin; y por
otro, puede ser utilizado como materia prima para la produccin de plsticos biodegradables.

El cido polilctico es un polmero biodegradable derivado del cido lctico que se produce
a partir de fuentes 100% renovables. Este polmero presenta muchas propiedades iguales o
incluso mejores que algunos plsticos tradicionales, por lo que representa una alternativa
como material de empaque bastante innovadora y prometedora. Balkcokm (Citado por
Araya-Cloutier et al. 2010, p.408).

La produccin biotecnolgica est basada en la fermentacin de sustratos ricos en

carbohidratos por medio de bacterias u hongos para formar los enantimeros pticamente
activos y depende del tipo de microorganismo utilizado, la inmovilizacin o recirculacin del

16
microorganismo, el pH, la temperatura, la fuente de carbono, la fuente de nitrgeno, el
mtodo de fermentacin empleado y la formacin de los subproductos Hofvendahl y
Hagerdal (citado por Serna y Rodrguez, p.55). Dependiente del tipo de carbohidrato, el
proceso requerir de una etapa que convierta las materias primas renovables a sustratos
fermentables, sea sta por degradacin enzimtica, qumica o por adaptacin metablica del
microorganismo. (Garcia et al. 2010, p.11).

La mayora de las investigaciones se han llevado a cabo con las Bacterias cido Lcticas
(BAL). Cuando se utilizan las bacterias, se busca que stas sean preferiblemente termfilas,
que fermenten rpida y completamente los sustratos baratos, con adicin mnima de
nutrientes nitrogenados, que crezcan en valores bajos de pH, que presenten poca produccin
de biomasa y una despreciable cantidad de subproductos. (Garcia et al. 2010).

Los gneros Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus son los ms estudiados en la

produccin.

Tabla 1. Propiedades fsico-qumicas de cido lctico.

Tomado de: Dean citado por Serna y Rodrguez, 2005.

5.3. Caractersticas generales del cido polilctico.

El cido polilctico (PLA), es un biopolmero termoplstico cuya molcula precursora es el

cido lctico. Debido a su biodegradabilidad, propiedades de barrera y biocompatibilidad,
17
ste biopolmero ha encontrado numerosas aplicaciones ya que presenta un amplio rango
inusual de propiedades, desde el estado amorfo hasta el estado cristalino; propiedades que
pueden lograrse manipulando las mezclas entre los ismeros D (-) y L(+), los pesos
moleculares y la copolimerizacin.

La aplicacin ms prometedora del PLA es en envases y empaques para alimentos y

produccin de pelculas para la proteccin de cultivos en estadios primarios. Sin embargo, el
alto crecimiento fngico en los materiales obtenidos de bases biodegradables es un factor
negativo para el uso en alimentos. Por lo tanto los bioempaques son ms convenientes para
alimentos con alta respiracin y de vida de almacenamiento corto como vegetales, y para el
empaque de algunos productos de panadera. (Plsticos biogenerados, 2009)

Entre las ventajas de uso del PLA, se tiene, biodegradable y compostable, reduccin al
consumo de energa, producido con recursos renovables, posible empleo de residuos
agrcolas, aprobado para el contacto con alimentos. (Blanca, 2010)

5.4. caractersticas de las Bacterias cido lcticas.

Las bacterias del cido lctico (BAL) son unos microorganismos que participan en procesos
de elaboracin de alimentos fermentados, principalmente de origen lcteo. La principal
caracterstica metablica de las BAL es la produccin de cido lctico como resultado de la
fermentacin de carbohidratos. El cido lctico presenta varios efectos beneficiosos en la
elaboracin de un alimento fermentado: por un lado, junto al bajo pH posee efecto
bacteriosttico y bactericida sobre bacterias patgenas o alterantes, mejorando la seguridad
y alargando la vida media del producto; por otro lado, contribuye a las caractersticas
organolpticas finales, como la textura o el sabor. (Rodrguez, 2006, p.1).

La mayora de las especies pertenecientes a estos gneros tienen alta tolerancia a pH por
debajo de 5,0, lo que les da la ventaja competitiva sobre otras bacterias; la temperatura
optima de crecimiento sta en un rango de 20C a 40C y vara entre gneros. La mayora de
los Lactobacillus producen nicamente una forma isomrica de cido lctico; Sin embargo,
algunos Lactobacillus producen formas racmicas donde el ismero predominante depende
de los cambios en la aireacin, la cantidad de NaCl, el tipo de fermentacin, el incremento de
pH y la concentracin de sustrato. Las especies del gnero Lactobacillus producen adems

18
de las formas isomricas L (+) y D (-), una mezcla racmica de ambos ismeros. (Garcia et
al. 2010, p.13).

5.5. Caractersticas de Lactobacillus Casei.

Las cepas de L. casei se encuentran en vegetales, leche, carne y, por supuesto, en el

intestino y en el ambiente. El nombre de L. casei fue dado en 1919 y su nomenclatura est
relacionada con el queso (casei y casena son originarias del latn caseus, que significa
queso). Son Gram-positivas y difieren de otras Lactobacillus de diferentes maneras: Son ms
pequeas en tamao que L bulgaricus, L. acidophilus, y L. helveticus; son hetero-
fermentativas y mesoflicas, y pueden fermentar una gran cantidad de carbohidratos.

Lactobacillus casei es heterofermentativo, es decir, su producto final no es exclusivamente

cido lctico. El proceso tiene un rendimiento menor al de la fermentacin homolctica como
se desprende de la produccin de slo un mol de ATP por mol de glucosa fermentada. La
obtencin del piruvato en estas bacterias se logra mediante el catabolismo de la glucosa por
la ruta de las pentosas.

La reaccin global es:

Glucosa + ADP + Pi = Ac. Lctico + etanol + CO2 + ATP

Segn JACOBSEN et al. Citado por COBO (2001) Actualmente y debido a su carcter
beneficioso, su estudio se ha generalizado, quedando demostrados diferentes efectos sobre
el organismo: actividad antagonista contra patgenos, tratamiento de desrdenes
gastrointestinales, modulacin del sistema inmune, prevencin de la incidencia del cncer,
etc.

5.6. Produccin de cido lctico por biotransformacin.

Otras de las vas para producir cido lctico es mediante la biotransformacin de sustratos
carbonosos complejos. La forma ms rentable de obtener el ismero L (+) es por medio de la
gluclisis (transformacin de carbohidratos o hidratos de carbono a cidos). Durante estas
reacciones el pH disminuye bruscamente, por lo que para mantenerlo cercano a la
neutralidad se adicionan lcalis como: Hidrxidos, carbonatos y bicarbonatos, lo cual

19
aumenta el contenido inico en el medio biolgico. Esto es necesario porque a valores de pH
cidos disminuye la viabilidad y el desarrollo de la mayora de los microorganismos y, por
tanto, disminuye el rendimiento de cido lctico.

La mayora de los procesos utilizan carbonato de calcio para mantener el pH entre 5.5 y 6.5
mediante la formacin de una sal de lactato. Despus de la biorreaccin, el medio (el cual
contiene sales de lactato) se filtra para remover la biomasa, se trata con carbn activado, se
evapora y, finalmente, se acidifica con H2SO4 para convertir la sal en cido lctico y sulfato
de calcio insoluble, el cual es removido por filtracin. (Gil-Horn et al.2008).

El medio se inocula y se agita sin aireacin para optimizar la neutralizacin del cido
formado. La fermentacin dura entre 2 a 4 das y se termina cuando todo el azcar es
consumido, con el fin de facilitar la purificacin. Al final de la fermentacin el medio es
ajustado a pH 10 y si se utiliza carbonato de calcio, el medio es calentado para solubilizar el
lactato de calcio y coagular protenas presentes. (Serna-Cock y Rodrguez. 2005).

5.7. Caractersticas generales Naranja valencia (nombre cientifico: Citrus sinensis.

Variedad: Valencia) como materia prima.

Segn la Norma Tcnica Colombiana (NTC) 4086 sobre frutas frescas. Naranja valencia.
Especificaciones, seala las siguientes caractersticas fsicas:

Los frutos deben estar enteros.

Deben tener la forma caractersticas de la naranja valencia.
Deben presentar cliz.
Deben estar sanas (libres de ataques de insectos y/o enfermedades, que demeriten la
calidad interna del fruto).
Deben estar libres de humedad externa anormal producida por mal manejo en las
etapas pos cosecha (recoleccin, acopio, seleccin, clasificacin, adecuacin,
empaque, almacenamiento y transporte).
Deben estar exentas de cualquier olor y sabor extrao (provenientes de otros
productos, empaques o recipientes y/o agroqumicos, con los cuales hayan estado en
contacto).
Deben presentar aspecto fresco y consistencia firme.
Deben estar exentas de materiales extraas (tierra, polvo, agroqumicos y cuerpos
extraos) visibles en el producto o en su empaque.

20
La familia a la que pertenece la naranja valencia es RUTACEAE, la cual tiene
aproximadamente 140 gneros y 1.300 especies, est ampliamente distribuida por el
mundo, especialmente en los trpicos; en Venezuela, cerca de 12 especies nativas de
Asia y Malasia estn representadas por 7 especies, cultivadas por sus frutos comestibles
(Aristeguieta,1973). Las caractersticas distintivas son, (1) el olor aromtico al estrujarlas
y el sabor pungente de ctricos, (2) las hojas, flores y frutos con puntos diminutos
traslcidos y glandulares, (3) las hojas alternas o a veces opuestas, pinadas o digitadas o
simples sin estpulas, (4) las flores variables, grandes o pequeas, generalmente
regulares, a menudo blancas bisexuales o a veces masculinas y femeninas en plantas
distintas y (5) el fruto, generalmente una cpsula o baya, drupa, smara o de varios
separados.

En cuanto al gnero naranja dulce (Citrus Sinensis Osbeck), es la ms conocida y popular

entre las frutas ctricas y una de las frutas ms importantes del Ecuador; se distingue por,
(1) su fruto generalmente bien liso y redondo mayormente 5-9 cm de dimetro con pulpa
dulce y de color anaranjado; (2) flores blancas muy fragantes generalmente de 5 ptalos
de 3-3,5 cm de ancho y (3) hojas oblondas a elpticas u ovaladas, terminando en punta
corta o redondeada en ambos extremos y con pecolo de ala angosta. FAO (1969).

En la tabla 2 se pueden observar los valores de la composicin qumica de la naranja.

Cantidad (por cada

Componente 100g)
Agua (g) 86,97
Energa (Kcal) 40,37
Protena (g) 1
Hidratos de
carbono (g) 8,25
21
 lpidos (g) 0,1

Tabla 2. Composicin qumica de la naranja. (Asociacin para la promocin del consumo

de frutas y hortalizas)

5.8. Tincin de Gram.

Las tinciones diferenciales son aquellas que no tien del mismo modo todos los tipos de
clulas. Una tincin diferencial muy importante y ampliamente usada en bacteriologa es
la denominada tincin de Gram. Dependiendo del resultado de esta tincin, las bacterias
pueden dividirse en dos grandes grupos. Gram positivas y Gram negativas. Una vez
terminada la tincin de Gram, las bacterias Gram positivas aparecen de color morado
mientras que las Gram negativas presentan color rojo, estas diferencias en la tincin de
Gram se deben a diferencias en la estructura de la pared celular de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas. (Madigan, Martinko y Parker, 2006.)

Dependiendo del microorganismo de inters, en microbiologa se hace til la realizacin

de tinciones de gram con el fin de realizar la diferenciacin de bacterias gram (-) y gram
(+) adems de ser til en la identificacin de microorganismos aislados. En la fase inicial
del protocolo tanto las gram (+) como las gram (-) son coloreadas de tonalidad violeta
(cristal violeta), despus son utilizados reactivos los cuales cumplen funciones de fijar
(lugol), decolorar (alcohol-acetona) y colorear bacterias gram negativas (safranina)
(Lozano, 2011).

5.9. Cuantificacin de clulas viables (escala Mc Farland).

En procesos donde se hace uso de bacterias con un fin especfico, es necesario

determinar la cantidad de clulas viables con las que se cuenta ya sea en el inculo
inicial, en accesiones de tiempo intermedios de proceso y/o al final del mismo; dentro de
algunos mtodos de recuento se encuentra los patrones de turbidez McFarland.

La escala McFarland se basa en unas soluciones de sulfato de bario con el fin de calcular
aproximadamente el nmero de microorganismos en soluciones de turbidez equivalente
(McFarland y Forbes et al. Citado por BD, 2005). El fundamento de ste mtodo, se basa
en la formacin de un precipitado de sulfato de bario a diferentes concentraciones a partir
de cido sulfrico y cloruro de bario (BD, 2005) formando una curva patrn. Las muestras
22
son analizadas mediante espectrofotometra y comparadas con dicha curva. Los
resultados son expresados en UFC/ml.

5.10. Hidrlisis por ultrasonido.

Segn Gmez y Trespalacios, 2012, la extraccin asistida por ultrasonido utiliza sonidos
de alta frecuencia, con el fin de desprender el compuesto buscado del material vegetal.
Las partculas slidas y lquidas vibran y se aceleran ante la accin ultrasnica, como
resultado el soluto pasa en forma rpida de la fase slida al solvente.

La sonicacin causa el rompimiento de las clulas vegetales ya que tiene un efecto sobre
el aumento de la inflamacin de los tejidos, facilitando la ruptura de la pared celular y la
liberacin de componentes intracelulares en el agua durante el bao de ultrasonidos.
Adems, la extraccin por ultrasonido mejora la difusin y los procesos osmticos, con lo
que se obtiene un aumento de la eficiencia y la tasa de extraccin. Esta tcnica es la ms
econmica y tiene los requerimientos instrumentales ms bajos realizados entre las
ltimas tcnicas de extraccin desarrolladas.

Ventajas:

Menor tiempo de extraccin, comparado con otros mtodos.

Alta eficiencia en el proceso de extraccin.
Reduce al mnimo la exposicin humana y la contaminacin ambiental.
Econmico, no se requiere el uso de solventes ya que se realiza con agua y tiene
los requerimientos instrumentales ms bajos entre las ltimas tcnicas de
extraccin desarrolladas.
Posibilidad de extraccin a bajas temperaturas.
A escala industrial se requiere una instrumentacin simple y rpida, el emisor de
ultrasonidos no ocupa mucho espacio ni supone un aumento de precio muy grande
con respecto a los equipos habituales de extraccin.

5.11. Fermentacin Batch.

El crecimiento de microorganismos en batch se refiere a que las clulas se cultivan en un

recipiente con una concentracin inicial, sin que sea alterada por nutrientes adicionales o
el lavado, por lo que el volumen permanece constante y slo las condiciones ambientales
del medio (pH, temperatura, la velocidad de agitacin, etc.) son controladas por el
23
 operador. El proceso finaliza cuando todo el sustrato es consumido por la biomasa. Esta
forma de cultivo es simple y se utiliza extensamente tanto en el laboratorio como a escala
industrial. (Loera, 2003)

6. METODOLOGA.
6.1. rea de estudio.

Este proyecto se llev a cabo en los laboratorios de anlisis instrumental, ciencias

biomdicas Manuel Elkin Patarroyo y en las paltas piloto de la Universidad del Quindo.

6.2. Fases.

6.2.1. Fase 1: Caracterizacin fisicoqumica de los frutos y jugo de naranja

valencia.

24
 Se procedi a realizar un anlisis fisicoqumico inicial a la pulpa de naranja (variedad
valencia), en mediciones de:

Aw: Este parmetro se evalu con un equipo higrmetro de punto de roco.

Color: se evalu por colormetro mediante el mtodo del sistema CIELAB

Humedad y Cenizas: se realiz la cuantificacin mediante el mtodo de secado en

estufa e incinerado en mufla respectivamente.

Se procedi a realizar un anlisis fisicoqumico inicial al jugo de naranja (variedad

valencia), en mediciones de:

Slidos solubles: se realiz mediante un refractmetro, con datos expresados en Brix.

Acidez: se realiz por titulacin con NaOH 0.1 N, utilizando como indicador
fenolftalena; los datos fueron expresados como % de cido ctrico contenido en la
muestra.

pH: se realiz por medio de un potencimetro (pHmetro). Equipo marca SCHOTT.

Carbohidratos: se realiz mediante el mtodo DNS para la cuantificacin de azcares

reductores (DNS), a travs de espectrofotometra. Utilizando el equipo
espectrofotmetro UV- visible.

6.2.2. Fase 2: obtencin del sustrato.

1. Se obtiene el jugo por extraccin y filtracin mecnica el cual se pasteuriz durante

30 minutos a una temperatura entre 65-70C y se enfri a 5C. Se caracteriz con
anlisis fisicoqumicos y termodinmicos iniciales: Carbohidratos DNS, Brix, pH,
determinacin del coeficiente de calor aproximado de la naranja valencia. (FAO,
2006).

2. Se procedi a hacer la hidrlisis del sustrato mediante hidrlisis por ultrasonido,

con el fin de obtener materiales intracelulares como lo son los azcares
fermentables.

3. Se reactiv por rehidratacin en caldo MRS la cepa de Lactobacillus casei ATCC

393 (figura 3) de la casa comercial Microbiologics, inc. Rtulo que se incluye en el
anexo 1. incubado a una temperatura de 37C durante 48 horas en una
25
 incubadora. La cepa activada se incorpora en crioviales para garantizar su
conservacin. Se toma la cepa y se reactiva de acuerdo a la metodologa descrita
por Araya-cloutier et al., 2010.

3.1. Reactivacin y cuantificacin de la cepa Lactobacillus casei ATCC 393.

Para la reactivacin de la cepa de Lactobacillus casei ATCC 393 se utiliz como
medio de cultivo inicial leche descremada, como un ensayo propio de laboratorio tal
como se indica a continuacin:

1. Extraer la pajilla.
2. En un tubo de ensayo con 5 ml de leche descremada a 37C, introducir la pajilla,
agitar, esperar 20 minutos.
3. Transferir el contenido del tubo anterior a otro tubo de ensayo con 5ml de leche
descremada; agitar.
4. Vaciar el contenido del tubo de ensayo anterior a un Erlenmeyer con 25ml de
Caldo MRS. Incubar a 37C por 24 horas, segn especificaciones del fabricante.
5. Si se observa turbidez en el Erlenmeyer, la cepa esta activa.
6. Extraer un asa del Erlenmeyer y sembrar por estra en cajas de Petri con Agar
MRS. Incubar a 37C por 24 horas. Realizar esta operacin por duplicado.
7. Realizar tincin de Gram, como se indica en la figura 4 para garantizar viabilidad
de la cepa.
8. En un sistema de crioviales con caldo MRS y glicerol sembrar una asada (en una
proporcin 1:4, es decir, por cada 250l de medio hay 750l de bacterias), de las
cajas de Petri incubadas para el almacenamiento de la cepa Lactobacillus casei
ATCC 393 a -70C inmediatamente.

26
 Figura 3. Lactobacillus casei ATCC 393, tincin gram.

3.2. Cuantificacin de la cepa Lactobacillus casei ATCC 393.

Para estimar el nmero de microorganismos totales o viables en suspensiones

bacterianas, se utiliz un parmetro de comparacin llamado estndar de McFarland.
En microbiologa, los estndares de McFarland se preparan mezclando una solucin
de cloruro de bario dihidratado (BaCl2*2H2O) al 1.175% con una solucin de cido

27
sulfrico (H2SO4) al 1%, que se relacionan con las absorbancias de los cultivos
celulares a 600nm (tabla 3) (Torres, 2010), a partir de las cuales se construye una
curva de calibracin que mediante interpolacin de los valores obtenidos con el
espectrofotmetro, se puede obtener la concentracin bacteriana a inocular en el
zumo de naranja Valencia.

3.3. Preparacin del cultivo bacteriano.

Para la preparacin de ste cultivo se sigui la metodologa descrita por Araya-cloutier

et al, 2010, en la que el cultivo madre se prepar tomando 1ml del cultivo y
enriqueciendo en 100ml de caldo MRS por 24 horas a 37C. El inculo se prepar
transfiriendo 1ml de cultivo madre en 250ml de caldo MRS durante 18 horas a 37C,
para inocular el sustrato (jugo de naranja valencia) con 0,3% (v/v) del cultivo de
Lactobacillus casei ATCC 393.es decir, se inocularon 5ml de inculo en 250 ml de jugo
de naranja para fermentacin.

4. Fermentaciones y toma de muestras.

Las fermentaciones se llevaron a cabo mediante un sistema batch, pues como lo
aclaran Ishiaki y Vonktaveesuk citado por Zuluaga, 2010 El cido lctico,
por lo general, se produce en modo batch () Cuando se compara los
modos de fermentacin batch y continuo, el primero resulta en mayores
concentraciones de cido lctico y mejores rendimientos en la mayora
de estudios. Esto es debido a que todo el sustrato es usado en el modo
batch como lo describe la figura 5, ya que, como seala Hagerdal y Hofvendahl
citado por Zuluaga, 2010 debido a la tolerancia al oxgeno de las BAL la
mayor parte de las fermentaciones son llevadas a cabo sin control de
oxgeno, donde el sustrato a base de naranja se calent a 32, 37 y 42C con
agitacin constante inoculado con 5 ml del cultivo de L. casei como se describi
anteriormente, para iniciar la fermentacin.

Durante la fermentacin se midieron los cambios de pH, tomando muestras de 5ml

de cada fermentador, cada hora durante 12 horas, tiempo de fermentacin utilizado
por Jakymec, et al., 2001 con el fin de medir la concentracin de azcares
reductores por espectrofotometra en el medio. Las muestras se mantuvieron en
refrigeracin.

28
 Tabla 3. Estndares de McFarland.

Figura 5. Montaje de laboratorio para fermentacin batch.

29
 6.2.3. Fase 3: anlisis del producto obtenido.

Las muestras obtenidas tras fermentacin por Lactobacillus casei ATCC 393, se analizaron
por espectrofotometra, para determinar la reduccin de azcares presentes en el jugo; y
utilizando un pHmetro para evaluar el comportamiento del mismo cada hora durante 12
horas.

30
Figura 6. Diagrama de flujo metodologa.

31
 7. RESULTADOS Y DISCUSIN

7.1. Anlisis fisicoqumico de la pulpa de naranja valencia (citrus sinensis

osbeck).

7.1.1. Anlisis de Color.

Figura 7. Anlisis de conglomerados parmetro de color.

Como puede observarse en la figura 7 a una distancia de 2.31 equivalente al 50% relativo a
la distancia mxima (4.62), se forman tres grupos donde las observaciones 11 y 12 se
aglomeran separndose por su mxima similitud del resto. Los tres grupos se conformaron
aglomerando observaciones de caractersticas de color de mxima similitud, lo que indica
que la clasificacin de acuerdo al estado de madurez sealado en las tablas de color en la
NTC 4086, se hizo adecuadamente y seleccionando materia prima en estado madurez alto,
la cual es de inters en este estudio.

7.1.2. Anlisis Humedad y Cenizas.

Los resultados fueron obtenidos aplicando las siguientes ecuaciones:

p p
%H 2 3
* 100
p p
2 1
(1)

32
Donde, p1 peso de caja vaca; p2 peso de la caja ms la muestra antes de secado; p3 peso
de la caja ms la muestra despus de secado.

pp
%C 3 1
* 100
p p
2 1
(2)

Donde, p1 peso crisol vaco; p2 peso del crisol ms la muestra antes de incinerar; p3 peso del
crisol ms la muestra despus de incinerar.

El resultado obtenido en el anlisis de cenizas, haciendo uso de la ecuacin (2), corresponde

a un valor de %C = 7,85, comparado con el reportado en la tabla de composicin de
alimentos colombianos del ICBF para la naranja valencia, 3,50 g/100g de parte comestible,
diverge, debido a que variables como temperatura y tiempo de incineracin no se ejecutaron
a 900C y 12 horas respectivamente.

Los promedios obtenidos en el lote 2, de acuerdo a la figura 8 concuerdan con la tabla de

composicin de alimentos colombianos del ICBF, reportando un valor de 89% de humedad
para la naranja, por tanto, se puede inferir que el lote2 relativo al lote 1 y 3 es el que ms se
ajusta a lo reportado previamente. Asimismo, aun siendo dicho valor ms alto que los
obtenidos en los lotes 1 y 3, en general para todos los lotes analizados este valor es
aproximado y se encuentra dentro de los rangos de error estndar.

Figura 8. Diagrama de puntos parmetro Humedad.

33
 7.1.3. Anlisis aw.

En cuanto al parmetro aw, de acuerdo a la figura 9 las medias obtenidas estn muy
relacionadas entre s (valores de aw muy cercanos), paralelo a esto, en la consulta de
gobierno de Manitoba titulada Water Content and Water Activity: Two Factors That Affect
Food Safety, se presenta un valor de aw para frutas crudas como naranjas, manzanas y
uvas de 0,98; por lo cual los datos obtenidos estn muy cercanos a los reportados, sin
embargo el error estndar debe considerarse.

Figura 9. Diagrama de puntos parmetro aw.

7.2. Anlisis fisicoqumicos para el jugo de naranja valencia (citrus siensis

osbeck).

7.2.1. Anlisis azcares reductores (mtodo DNS).

Los resultados observados en la figura 10 de Absorbancia vs concentracin, indican que

encontrando un valor de 0,2018, que corresponde a un estado de maduracin 5 (anexo 2),
segn escala de colores de la NTC 4086, y multiplicando el valor de concentracin indicado
de sta por el factor de dilucin, seala que el estado de madurez 5, contiene la cantidad
adecuada de azcares fermentables, sustrato del microorganismo para generar cido lctico.

Adems, se observa en la tabla 4 la influencia positiva de la pasteurizacin, procedimiento

que aument la concentracin de estos azcares.

34
 Factor de Concentracin x
Absorbancia
Muestra dilucin Concentracin Factor de dilucin (g/
<540nm>
(ml) 100ml)
Estados de madurez 4 25 0,58997 1,47493 0.11746
segn carta de color 5 25 1,01340 2,53350 0,20176
6.1 25 0,75616 1,89040 0,15055
NTC 4086. Jugo no 6.2 25 0,88357 2,20893 0,17591
pasteurizado 6.3 25 0,92521 2,31303 0,1842
1 25 1,27610 3,19025 0,25406
Jugo pasteurizado 2 25 1,21050 3,02625 0,24099
3 25 1,47160 3,67900 0,29297

Tabla 4. Concentracin de azcares reductores de jugo de Naranja Valencia antes y despus

de pasteurizacin.

Figura 10. Curva de calibracin azcares reductores mtodo DNS.

7.2.2. Caracterizacin fisicoqumica del jugo de naranja valencia (citrus sinensis

osbeck)

En la tabla 5 se puede observar un paralelo entre los reportes bibliogrficos y experimentales

del jugo de naranja valencia.

Composicin fisicoqumica Naranja Valencia (Citrus

Sinensis Osbeck)

35
 Componentes Reportes Reportes
Principales Bibliogrficos Experimentales

Brix 9,75 9,71

Acidez 0,95-1,08% 0,92%

pH 3,40 4,75

Azcares Reductores 3,84 g/100ml 2,53 g/100ml

Tabla 5. Caractersticas fisicoqumicas del jugo de Naranja Valencia (Citrus sinensis osbeck).
HOURS et al., 2005 y RUSSIN, 2006.

7.2.3. Anlisis microbiolgico del jugo de naranja pasteurizado.

Se realizaron pruebas de microorganismos mesfilos, recuento de mohos y levaduras y

coliformes totales y fecales, de acuerdo a los procedimientos descritos en el manual de
procedimientos de anlisis de alimentos.

1. Microorganismos Mesfilos.

Mtodo de recuento en placa (SPC).

Es el mtodo comnmente utilizado para determinar el nmero de clulas viables o de

unidades formadoras de colonias (UFC) en un alimento. Es el indicador ms amplio en
alimentos, ya que incluye todos los gneros oxignicos y facultativos que crecen en
medios simples a una temperatura entre 20 - 45C.

2. Recuento Mohos y Levaduras.

Se estableci el mtodo general para el recuento en placa por profundidad con el fin de
determinar el nmero de mohos y levaduras viables presentes en el alimento. El mtodo
se basa inocular una alcuota de muestra de prueba en medio selectivo (Agar OGY)
incubando a temperatura de 22 +/- C (temperatura ambiente) durante 5 a 7 das

36
 obtenindose como resultado el crecimiento de colonias caractersticas de estos
microorganismos.

3. Determinacin de Coliformes en alimentos. Nmero ms probable (NMP).

Las Enterobacteriaceae lactosa / positivas, constituyen un grupo de bacterias que se

definen ms por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonmicos.
Pertenecen a la familia enterobacteriacea y se caracterizan por su capacidad para
fermentar la lactosa con produccin de gas, en un periodo de 48 horas y con una
temperatura de incubacin comprendida entre 30 37 C. La determinacin de coliformes
de origen fecal se realizan para diferenciar los coliformes de origen fecal (procedentes del
intestino del hombre y de animales de sangre caliente) de los coliformes de otros
orgenes.

En la tabla 6 se observan los resultados obtenidos de anlisis microbiolgico para zumos

(jugos), nctares, purs (pulpas) y concentrados de frutas segn la norma tcnica
colombiana NTC 5468.

Resultad
Tipo de prueba os Tcnica
350 48 horas
Mesfilos UFC/ml de
450UFC/ incubaci
Mohos y Levaduras ml n
Coliformes Totales y <3
Fecales UFC/ml NMP

Tabla 6. Indicadores microbiolgicos de Naranja Valencia (citrus sinensis osbeck).

7.2.4. Anlisis termodinmicos

Determinacin de transferencia de calor.

A travs de la ecuacin,

Q m c p T
(3)

37
Donde Q es el calor, que se refiere a la reaccin endotrmica o exotrmica de la naranja
sometida a secado; m es el peso de la muestra; cp es el calor especfico de la naranja
(Vargas, sin ao) y T es el gradiente de temperatura.

Para este comportamiento termoqumico, se pes 1g de muestra de tres naranjas diferentes,

cada una se someti, por tres (3) horas, a 70C, 90C y 110C respectivamente; la
temperatura final (T2) 600C, es la temperatura de calcinacin de la muestra para la
determinacin de cenizas; el resultado obtenido es de Q = 2,1563 kJ.

En la literatura, no se encuentran registrados valores para el coeficiente de conveccin de la

naranja (h); teniendo los datos de calor (Q), el gradiente de temperatura (T) y el rea (A)
calculada de la porcin de muestra que corresponde a el rea de la lnula (casco de naranja)
con un valor aproximado de 5,75 cm 2, se puede presumir el valor de ste: h = 0,0138 BTU/m2
C, a travs de la ecuacin nmero 4.

Q
h
AT
(4)

8. Curva de calibracin escala McFarland para el inculo del microorganismo

Lactobacillus casei ATCC 393.

En la elaboracin de la curva de calibracin para la escala McFarland se sigui el

procedimiento sealado por Torres, 2010.p. 23. Obteniendo los resultados sealados en la
tabla 7, el espectro representado en la figura 11 de absorbancia vs longitud de onda; y en la
figura 12 se presenta la curva de calibracin en la cual se seala la concentracin en UFC/ml
viables de microorganismos correspondientes a los valores de absorbancia ledas a 540nm,
a partir de la cual, mediante interpolacin, se pudo establecer la cantidad de
microorganismos presentes en el cultivo madre y en el inculo para el jugo de naranja
valencia de 3,15 x 109 UFC/ml (Abs. 1,644) y 3,86 x 10 9 UFC/ml (Abs. 1,976)
respectivamente.

38
Figura 11. Espectro curva de calibracin estndares de McFarland.

Figura 12. Curva de calibracin estndares de McFarland.

Tabla 7. Tabla de calibracin estndares de McFarland.

39
 9. Anlisis de las muestras.

A las muestras tomadas a las 5, 9 y 12 horas de fermentacin se les realiz un anlisis por
espectrofotometra, resultados promedios de acuerdo al anexo 3, que se muestran en la tabla
8,

Tiempo Temperatura Absorban

(horas) (C) cia C(mg/ml)
32 0,20759 35,7446
5
42 0,21007 36,2723
32 0,23455 40,4993
9
42 0,26479 45,7216
32 0,18881 32,6016
12
42 0,15325 26,4626

Tabla 8. Absorbancia Vs Concentracin de azcares reductores tras fermentacin del jugo de

naranja valencia con Lactobacillus casei ATCC 393.

40
 Cambios en la concentracin de azcares reductores tras fermentacin de jugo de naranja valencia con Lactobacillus casei ATCC 393
0.3

0.25

0.2
32C
absorbancia 0.15
42C
0.1

0.05

0
25 30 35 40 45 50

Concentracin (mg/ml)

Figura 13. Absorbancia Vs Concentracin de azcares reductores tras fermentacin del jugo
de naranja valencia con Lactobacillus casei.

El pH en la fermentacin puede disminuir debido a la produccin de cido, sin embargo,

Hagerdal y Hofvendahl citado por Zuluaga, 2010 indican que En todos los casos, la titulacin
a un pH constante ha resultado en concentraciones iguales o mayores, en comparacin con
los casos donde no hay control de este, como puede observarse en la tabla 9. Donde hay un
aumento de pH partiendo de un pH inicial de jugo hidrolizado de 4,56. Un aumento en el pH,
puede explicarse como lo seala Marn, Corts y Montoya, 2009 en todos los casos el pH es
mayor () lo cual se asocia por un lado con las variaciones propias de la pulpa, y por el otro,
con la influencia de las sales amortiguadoras presentes en el caldo MRS, que hacen que el
pH aumente.; sin embargo, durante algunos tiempos de fermentacin se observ una leve
disminucin del pH, lo cual puede estar asociado a que la cepa en su fase de adaptacin
disminuye el pH como respuesta a una aceptabilidad del sustrato para su crecimiento. (Marn
et. Al, 2009).

41
 Tiempo en Cambios de pH Vs temperatura
horas 32C 37C 42C
1 4,64 4,75 4,63
2 4,67 4,66 4,64
3 4,44 4,49 4,49
4 4,59 4,75 4,64
5 4,73 4,69 4,67
6 4,8 4,75 4,72
7 4,71 4,77 4,76
8 4,76 4,7 4,77
9 4,86 4,89 4,82
10 4,84 4,87 4,81
11 4,86 4,85 4,82
12 4,93 4,95 4,94

Tabla 9. Cambios de pH tras fermentacin Vs temperatura.

Cambios en el pH del jugo de Naranja valencia tras fermentacin por Lactobacillus casei.
5
4.9
4.8
4.7
32C
4.6
pH 4.5 37C
4.4 42C
4.3
4.2
4.1
25 30 35 40 45 50 55 60 65

temperatura C

Figura 14. Cambios de pH tras fermentacin Vs temperatura.

42
43
44
45
46
10. CONCLUSIONES.

47
 11. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.

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