Metodos Generales de Analisis Microbiologico

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO
FACULTAD DE INGENIERAPESQUERAY DE ALIMENTOS

ESCUELAPROFESIONAL DE INGENIERADE ALIMENTOS
METODOS GENERALES DE ANALISIS MICROBIOLOGICO
DE LOS ALIMENTOS
Principios de garanta de la calidad microbiolgica de los alimentos. Generalidades sobre la toma de

muestras y el anlisis microbiolgico de los productos finales: Principios ecolgicos, Fundamentos de los
procedimientos analticos (heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos, transporte
de muestras, confianza en los procedimientos, dao o lesin subletal, evaluacin sistemtica de los medios
de cultivo): Necesidad de valores de referencia. Muestreo: muestra nica, toma de muestras
representativas. Utilizacin de microorganismos como marcadores (ndices e indicadores).
1. Principios de garanta de la calidad microbiolgica de los alimentos.
El anlisis microbiolgico de alimentos no tiene carcter preventivo sino que simplemente es una
inspeccin que permite valorar la carga microbiana. Por tanto, no se puede lograr un aumento de la calidad
microbiolgica mediante el anlisis microbiolgico sino que lo que hay que hacer es determinar en la
Industria cules son los puntos de riesgo de contaminacin o multiplicacin microbiana (los llamados
Puntos Crticos del proceso) y evitarlos siguiendo un cdigo estricto de Buenas Prcticas de Elaboracin y
Distribuccin del alimento (BPE).
La prevencin, por tanto, est en evitar manufacturar productos de baja calidad microbiolgica y no en
comprobar la calidad microbiolgica de los ya elaborados (lo que, por otra parte, presenta una relacin
coste - beneficio muy baja por la gran cantidad de muestras que es necesario analizar).
En el dasarrollo de las BPE hay que hacer un anlisis del riesgo consistente en determinar el peligro para la
salud humana de un factor patgeno presente en un alimento y el medio como puede reducirse ese riesgo
hasta valores infinitesimales por medios tecnolgicos. Este riesgo depede de de la DMI (Dosis Mnima
Infectiva) del microorganismo y de los valores del mismo que se encuentren en el alimento; asmismo hay
que valorar la carga inicial de microorganismos en cada una de las raciones del alimento, y el nmero de
raciones o partes consumidas por la poblacin en un determinado tiempo.
La letalidad del tratamiento a aplicar viene dada por la frmula l = log 10(N0/Nc) donde Nc son los valores
aceptables del microorganismo a controlar y N0 la carga microbiana inicial para dicho microorganismo.
Aplicando estas BPE las oscilaciones en la calidad microbiolgica del producto disminuyen y el anlisis
microbiolgico es ms consistente puesto que permite detectar alejamientos de las BPE.
2. Generalidades sobre la toma de muestras y el anlisis microbiolgico de los

productos finales.
A.- Principios ecolgicos: Es necesario considerar la distribucin desigual de los microorganismos en los
alimentos, lo que hace necesario seguir un esquema de toma de muestras para obtener resultados
representativos.
El nmero de criterios utilizados a la hora de juzgar la calidad microbiolgica de los alimentos debe
limitarse al mnimo necesario para as poder aumentar el nmero de anlisis.
Los criterios de anlisis aplicados han de ser especficos de cada alimento poque son diferentes los
microorganismos patgenos y alterantes de cada tipo de alimento.
B.- Fundamentos de los procedimientos analticos:

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Blgo.-Mblgo.: ARTURO GARCIA MERINO
B.1.- Heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos: El factor ms
importante en el anlisis es el muestreo, que incluye: (a) Evaluacin de la muestra
necesaria para evitar la distorsin producida por los microorganismo que se encuentran en
diferentes partes de las superficies, por ejemplo de las canales o de las mquinas,
sistemas de alimentos heterogneos (ensaladas, platos congelados, etc.); (b)
Determinacin del modo ptimo de remocin del micoorganismo de la muestra o lugar de
muestreo y (c) La evitacin de la contaminacin ambiental durante la toma o transporte de
muestras.
B.2.- Transporte de muestras: Es importante evitar que durante el transporte de las

muestras se produzca: (a) Multiplicacin de los microorganismos presentes y (b)
Inactivacin de algn microorganismo.
En general es conveniente hacer el transporte a temperaturas del entorne de 0 C por un

tiempo no superior a las 24 horas, excepto en el caso de grmenes termotrofos.
B.3.- Confianza en los procedimientos: Normalmente es necesario detectar bacterias que

suponen entre 10-4 y 10-7 de la flora normal del alimento, flora sta inocua. Es necesario
utilizar medios selectivos para detectar estos microorganismos presentes en proporciones
tan bajas.
Como norma general conviene probar experimentalmente los medios usados para
determinar su selectividad y su productividad; as como no debe usarse un medio diseado
para un producto en otro producto diferente porque las condiciones ecolgicas pueden ser
diferentes dando lugar a una distorisin de los resultados.
B.4.- Dao o lesin subletal: Tratamientos tecnolgicos pueden producir daos subletales
en los microorganismos que no pueden, en esas condiciones, ser sometidos rigurosamente
a medios selctivos. Son necesarios medios de recupe-racin en los que hay que
considerar: (a) El tipo de microorganismo a recuperar (G+, G-, hongo...), (b) El carcter y la
intensidad del dao infligido, (c) El tipo de alimento en el que est el microorganismo y (d)
El medio selectivo final.
Una vez considerado esto puede decidirse el tratamiento a seguir. De una forma general,
hay dos tipos de tratamiento de recuperacin: recuperacin en lquido (2 h. 25 en agua
peptona) o en slido (>6 h. en agua LB o similar, incubando luego 4 - 6 h. a 25 C) seguido
del tratamiento selectivo (siembra en medio selectivo o recubrimiento con agar blando
selectivo).
B.5.- Evaluacin siotemtica de los medios de cultivo: Dada la variabilidad debida a

pequeos errores en la preparacin de los medios de cultivo, tanto los generales como los
selectivos, es necesario hacer controles peridicos que permitan comprobar tanto que las
bacterias buscadas crecen incluso a partir de clulas aisladas (colonias aisladas) como que
las bacterias de la flora general son satisfactoriamente inhibidas (no crecen salvo cuando
se siembra un gran volumen). Este tipo de control de los medios de cultivo se denomina
ecomtrico.
C. Necesidad de valores de referencia.

Es necesario comparar los resultados con valores microbiolgicos de referencia. Estos valores de
referencia no son formulaciones tericas de la carga microbiana aceptable, sino los valores obtenidos
cuando la produccin del alimento se ha ajustado a las BPE (Buenas Prcticas de Elaboracin).
La Microbiologa de alimentos puede evaluar el riesgo asociado a estos valores de referencia y cuantificar
los valores asociados a un alimento concreto para medir su alejamiento de la referencia (y por tanto de las
BPE).
3. Muestreo.
El muestreo consiste en separa una serie de muestras representativas del lote para someterlas al anlisis
microbiolgico.
A. Muestreo nico
Cuando hay que hacer un muestreo de una partida nica de alimento hay que considerar que los
datos de mayor importancia los proporcionan las normas de elaboracin y conservacin del
alimento. Esto es especialmente importante en partidas de alimentos importados, sobre todo los
enlatados.
Ningn muestreo nico puede dar una garanta total de calidad microbiolgica del alimento; si se
analizan 30 muestras de una partida suficientemente grande y no aparece ninguna en malas
condiciones microbiolgicas, an hay una probabilidad razonable de que el 10% del lote sea
microbiolgicamente defectuoso.
Como norma general, si se trata de un lote desconocido es conveniente analizar un nmero de

muestras equivalente al 1% si el lote es grande y al 10% si es pequeo. Aunque estos valores hay
que adecuarlos a las condiciones reales.
Cuando se analiza una muestra nica el mejor criterio de seguimiento son las especificaciones del
fabricante. Las muestras nicas estn siempre sometidas a una gran probabilidad de falsos
negativos.
B. Analisis repetido.
Se pueden definir dos tipos de riesgomicrobiolgico: (a) el riesgo del consumidor: probabilidad de
aceptacin de lotes substndard y (b) el riesgo del fabricante: probabilidad de rechazo de lotes
substndard.
Un sistema de muestras basado en el anlisis de 10 muestras al azar y rechazo del lote cuando se
detecte una defectuosa obligar al fabricante a establecer medidas de seguridad suficientes para
proteger adecuadamente al consumidor.
C Planes de muestreo de tres categoras.
Se aceptan con condiciones algunos alimentos que sobrepasen la norma microbiolgica

establecida conforme a los valores microbiolgicos de referencia. Clase: aceptable, grado
intermedio, inaceptable. [En aquellos casos en que el obtener valores ms altos que los de
referencia no hace inaceptable el alimento].
D. Toma de muestras representativas.

Una vez decidido el nmero de muestras que hay que tomar, han de seleccionarse stas de forma
estadsticamente representativa utilizando tablas de nmero al azar. Dentro de cada unidad hay
que tomar muestras representativas de todos los constituyentes del alimento, para ello se debe
homogeniezar la muestra usando batidoras o stomacher.
4. Utilizacion de los microorganismos como marcadores (indices e indicadores).
A. Introduccin histrica, terminologa y bases de su utilizacin.
Historicamente, desde hace un siglo se estudia la deteccin de, primero, E. coli y posteriormente, el
grupo coli-aerogenes (enterobacteriaceas) como ndice de contaminacin final en lugar de
investigar la presencia de Salmonella typhi.
B. Terminologa
Microorganismo ndice: aqul cuya presencia aletar de la posible presencia de un microorganismo

patgeno relacionado ecolgicamente con l. (Ej.: E. col ndice de S. typhi).
Microorganismo indicador: aquel cuyo mumero indica un tratamiento inadecuado o una

contaminacin posterior del alimento analizado.
Un microorganismo dado puede actuar como ndice e indicador simultaneamente, incluso en un

mismo alimento. A pesar de que actualmente es posible detectar casi cualquier tipo de
microorganismo patgeno, se siguen llevando a cabo anlisis de microorganismo determinados
como marcadores por razones de economa, rapidez y sensibilidad.
Los princiaples marcadores son: grupo coli-aerogenes, E. coli, y estreptococos del grupo D de
Lancefield.
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MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
Tema 12
METODOS GENERALES DE ANALISIS
MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS. II.
ANALISIS DE LOS MICROORGANISMOS TOTALES
Recuento de microorganismos viables totales. Mtodos fsicos para la deteccin de microorganismos.

Mtodos qumicos para la deteccin de microorganismos. Mtodos inmunolgicos. Exmen de superficies.
Recuentos de mohos y levaduras.
1. Recuento de microorganismos viables totales. (Muestras lquidas u homogeneizadas).

- Se trata de conocer el nmero total de microorganismos presentes en el alimento. Este nmero no guarda
relacin con el de microorganismos patgenos por lo que no puede usarse como ndice de su presencia y
slo debe considerarse un indicador de las caractersticas higinicas generales del alimento.
- Dependiendo de las caractersticas del medio utilizado (medio rico, medio limitado en nutrientes para
medida de la flora no lctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de incubacin (mesfilos,
psicrfilos) los microorganismos analizados sern miembros de poblaciones diferentes. En general se
investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en
ciertas situaciones (alimentos envasados al vaco), puede ser de inters hacer recuentos de anaerobios
totales.
- Se han desarrollado tcnicas que hacen posible la automatizacin del proceso.
- Hay cuatro tcnicas biolgicas bsicas tcnicas de recuento de viables:.
1.- Contaje en Placa Standard (Standard Plate Count).
2.- Determinacin del nmero ms probable.
3.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes por viables.
4.- Contaje microscpico directo.
1.- Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se
analiza. El resultado es funcin de una serie de factores como son el mtodo de muestreo, el tipo de
microorganismo, el tipo de alimento y las caractersticas del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse
tanto en masa como en superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la
flora psicotrofa. Cada bacteria viable formar una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o
por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente ms diludas
de la muestra.
2.- Filtros de membrana: utilizados cuando el nmero de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45
mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de
cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que
facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tie especficamente
los cidos nucleicos).
3.- Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en ingls de Direct Epifluorescence Filter Technique
(tcnica deepifluorescencia directa en filtro). En esta tcnica las bacterias se filtran para retenerlas en una
membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina)
para teir las clulas bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para
destruir las clulas somticas). La deteccin de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopa
de fluorescencia o por cualquier otro mtodo de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las
membranas se incuban para producir colonias que son ms fcilmente dtectables.
4. Contaje de microcolonias al microscopio: Se aade un pequeo volumen de agar-cultivo a un porta y se

incuba para seguir la formacin de microcolonias al microscopio.
5.- Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solucin madre) y se depositan gotitas de 10 ml en
una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la
incubacin.
6.- Films secos (Petrifilm): Son pelculas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las
que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubacin se hace el recuento.
7.- Mtodo del nmero ms probable: Basado en series de diluciones y clculo estadstico del nmero de
bacterias presentes en las diluciones ms altas. Se puede hacer con 3 5 tubos. El mtodo es popular
aunque poco excto.
8.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes: Usando azul de metileno o resazurina. Colorantes
reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es medible. Usado en medios lquidos
(lcteos).
9.- Tubos rodantes: son tubos hermticamente cerrados en los que hacindolos girar se forma una fina
capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios.
10.- Contaje microscpico directo: Usando cmaras de cuenta, se coloca un volumen determinado y se
recuentan las bacterias.
---------------- X ----------------
- Adems de las tcnicas de recuento basadas en la formacin de colonias observable (tcnicas biolgicas)
hay una serie de procedimientos de recuento basado en tcnicas qumicas, fsicas e inmunolgicas.
2. Mtodos fsicos para la detencin de microorganismos.
A) Impedancia: Es la resistencia aparente presentada a la corriente alterna. En un cultivo los

microorganismos alteran las substratos cambiando su conductividad elctrica y esto vara la impedancia. El
mtodo se basa en detectar estos cambios y la cantidad de microorganismos se expresa como funcin del
tiempo que tarda el cultivo en alcanzar unos valores de impedancia correspondientes a 10 6 - 107 clulas por
ml-1. (IDT: Imdepedance Detection Time). Es necesario que el medio de cultivo permite un crecimiento
homogneo sin escalones.
B) Microcalorimetria: Estudio de los pequeos cambios de calor producidos como consecuencia del
antabolismo de nutrientes. Los diferentes tipos de microorganismos metabolizan los substratos de forma
diferente y, por ello, se ha usado la microcalorimetra para poder identificar las especies presentes en un
alimento: usando un medio de cultivo con una composicin definida de azcares pueden llegar a
identificarse diferentes tipos de bacterias lcticas mediante los termogramas de su metabolizacin de los
azcares presentes en el medio.
C) Citometria de flujo: Mtodo basado en hacer pasar una a una las clulas de una suspensin por un
sistema de deteccin; este sistema puede contener un detector capaz de medir diferentes parmetros
(diferentes tipos de fluorescencia, absobancia, dispersin de luz, etc.) lo que permite identificar las
bacterias durante su paso por el detector.
3. Mtodos qumicos de deteccin de microorganismos.
A) Nucleasa Termoestable: S. aureus produce una nucleasa termoestable con mayor rapidez y en mayor
cantidad que la enterotoxina responsable de la intoxicacin. La endonucleasa puede detectarse
experimentalmente como un ndice de la presencia de S. aureus incluso en concentraciones demasiado
bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de enterotoxina.
B) Lisado de Limulus: Usado para deteccin de endotoxinas (derivadas del lipopolisacrido LPS de las
bacterias Gram negativas). Se basa en la aglutinacin de extractos de amebocito de sangre de Limulus
(cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos de LPS. Puede detectar 300 clulas
de E. coli. El mtodo detecta clulas viables y no-viables. Es muy rpido.
C) Sondas de cidos nucleicos: Sirven para identificar microorganismo desconocidos por medio de
Southern.
D) PCR: Mtodo para detectar nmero extremadamente bajos de microorganismos con una cierta rapidez
basado de la produccin de copias de genes especficos de un microorganismo en cuestin.
E) Medida de ATP-: Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa, aunque hay algunos problemas
experimentales que hacen que la tcnica sea controvertida.
F) Radiometria: Medida de la transformacin de un substrato con 14C en 14CO2: el tiempo necesario para
detectar el 14CO2 es inversamente proporcional a la cantidad de microorganismos presente.
G) Substratos Fluoro y Cromognicos: Se aaden como aditivos a los medios de cultivos para facilitar y
acelerar la deteccin de los microorganismos.
4. Mtodos inmunolgicos.
Normalmente se usan antisueros que detectan flagelos (responsables de las formas mviles de Salmonella
y otras bacterias)
A) Anticuerpo fluorescentes: Se utiliza anticuerpo marcado con una molcula fluorescente o un segundo
anticuerpo que reconozca el primero. Se pueden usar antisueros complejos en el primer anticuerpo y de
esta forma detectar cualquier tipo de Salmonella sin necesidad de aislarlas. El mtodo tambin se ha usado
para Clostridios aunque su mayor aplicacin ha sido en Salmonella donde es muy conveniente por la
sensibilidad y rapidez.
B) Serologia de enriquecimiento: En este procedimiento especialmente desarrollado para la deteccin de

Salmonella, el antisuero no se aade al alimento sino que se efecta un paso previo de enriquecimiento del
cultivo y de seleccin para evitar falsos positivos.
C) Test 1 - 2 de Salmonella: Sistema con dos cmaras de agar blando. Una de las cmaras (la de siembra)
contiene un medio selectivo para Salmonella, las bacterias mviles de este gnero atraviesan la cmara
selectiva y pasan a la no selectiva pero portadora de un anticuerpo especfico por lo que se forma una
banda de aglutinacin cuando entre Salmonella.
D) Radioinmunoensayo: se basa en el marcaje con un radioistopo de un antgeno determinado (toxina

producida por una bactera patgena) y su posterior deteccin por anticuerpos especficos fijados sobre un
soporte slido.

E) ELISA: El mtodo es similar al radioinmunoensayo: el antgeno se fija en un soporte slido, se trata con
el antisuero correspondiente y la interaccin se detecta mediante una actividad marcadora (peroxidesa)
unida al anticuerpo en cuestin o a un segundo anticuerpo de revelado.
El mtodo se ha usado para deteccin de Salmonellas. Toxinas de S aureus, micotoxinas, toxinas de C.

botulinum, enterotoxinas de E. coli.
F) Difusin en gel: Mtodo de Ouchterlony para deteccin de antgenos.
5. Examen de superficies.
- Mtodos dirigidos a detectar y medir los nmeros de microorganismos presentes en superficies

contaminadas.
- Algunas veces es necesario aadir agentes neutralizantes para eliminar el efecto de detergentes que han
sido utilizados para limpiar la superficie.
- El mtodo ms clsico de obtencin de muestra es el uso de torundas de algodn o de alginato clcico.

Las muestras se recogen en seco o en hmedo y se depositan sobre medios de cultivo lquido (generales o
de enriquecimiento).
- En algunos casos se usan otros metodos como el contacto con placa o la jeringa de agar.
6. Recuento de mohos y levaduras.
Se realiza o bien directamente en el alimento humedecido e incubado a 22C o bien mediante diluciones
sucesivas y siembra en placa en superficie. Es necesario aadir agentes antibacterianos al medio de cultivo
para evitar el crecimiento de las bacterias, que es ms rpido que el de los mohos.
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Valores microbiolgicos de referencia para los alimentos
Principios. Estudios exploratorios. Anlisis de puntos crticos. Deduccin de los valores de referencia.
Fundamentos ecolgicos de la eleccin de criterios microbiolgicos y de la fijacin de valores de
referencias: alimentos proteicos, alimentos de pH cido, alimentos emulsionados, alimentos con actividad
de agua reducida, alimentos precederos pasterizados pero no envasados, alimentos congelados,
semiconservas envasadas, alimentos tratados trmicamente. Concordancia entre los valores y los
mtodos.
1.- Principios.
El anlisis microbiolgico de los alimentos tiene dos finalidades:
(1) la comprobacin de la calidad de las prcticas de elaboracin del alimento
(2) la comprobacin de la calidad aceptable de los alimentos en el mercado

internacional.

Los valores de referencia son aqullos que indican los lmites mximos de
microorganismos presentes en los alimentos elaborados de acuerdo a las buenas
prcticas de elaboracin (BPE).
Para decidir el nmero y los criterios que se usen como valores de referencia ha de
seguirse una serie de principios:
(1) El nmero de criterios a valorar ha de limitarse de modo estricto para poder

incrementar el nmero de muestras analizadas por un laboratorio.
(2) Los criterios han de escogerse atendiendo a consideraciones ecolgicas: han

de referirse a microorganismos que interfieren con la salubridad del alimento
(microorganismos ndices) o que indiquen falta de seguridad o perjudiquen su
inocuidad (microorganismos indicadores).
(3) Los criterios han de formularse con sumo cuidado en trminos cuantitativos
(considerando los errores de la medida y la distribucin de los microorganismos en
el alimento).
(4) Los microorganismos han de denominarse de forma taxonmicamente

correcta.
(5) Los mtodos han de ensayarse, de describirse con todo detalle para que
puedan repetirse en diferentes laboratorios con resultados coherentes entre s.
(6) Los valores de referencia numricos han de deducirse de muestras obtenidas

despus de tratamiento siguiendo las BPE.
2.- Procedimiento de determinacin de los valores de referencia.
2.1.- Sondeos o estudios exploratorios.
En primer lugar seleccionar ms de 10 industrias y valorar sus BPE corrigindolas si es

necesario. Cuando se han corregido errores se toman alrededor de 10 muestras por
empresa y se valoran los criterios seleccionados y con los datos obtenidos se confeccionan
curvas de distribucin (Fig. 1), en las que se calcula el percentil 95% ( ) que suele estar 1
2 rdenes de magnitud por debajo de los valores mximos aceptables (DMI o NMA nivel
mnimo de alteracin). Si los valores de se aproximan a los DMI o a los NMA hay que
revisar las tcnicas de elaboracin y distribucin de los alimentos antes de proceder a una
nueva estimacin de los valores de referencia.
2.2.- Deduccin de los valores de referencia a partir de datos de sondeos.
Normalmente se adopta un valor algo por encima del valor (el valor m en la Figura 1),
cuando se trata de microorganismos no patgenos se suele aceptar una cierta tolerancia.
en el valor.
Se establece un valor M, nunca esperado si se cumplen las BPE. La diferencia entre M - m

es la llamada Zona de alerta cuya amplitud se establece atendiendo a la variabilidad del
mtodo de recuento, tipo de alimento, modo de preparacin y poblacin de riesgo. Este
valor M ha de establecerse tericamente y la relacin M/m vera entre 3 y 10 3 dependiendo
del tipo de alimento.
En el caso de microorganismos patgenos se acepta la medida de muestras agrupadas (x

muestras de y gramos o una muestra de xy gramos) en las que los valores de patgenos
se ajusten a los criterios de referencia aunque, en grandes cantidades dealimento, puedan
aparecer algunos microorganismos patgenos.
3.- Fundamentos ecolgicos de la eleccin de criterios microbiolgicos y de la

fijacin de valores de referencia.
4.1.- Generalidades.
Los criterios microbiolgicos han de establecerse despus de un cuidadoso estudio

ecolgico de la asociacin de microorganismos con cada alimento particular. En los
criterios para microorganismos no patgenos la tolerancia que se acepta es: si el valor de
referencia es 10S no se aceptan ms de 2 muestras de 10 que tengan entre 10 S y 10S+1 y
ninguna que supere el nivel de 10S+2.
En los ejemplos siguientes se indican ms criterios de los estrictamente necesarios, esto

es debido a regulaciones locales y a exigencias de los consumidores; en cualquier caso, lo
ms conveniente es hacer una sleccin adecuada de los criterios atendiendo a
consideraciones ecolgicas.
Los productos que presenten pequeas deficiencias pueden destinarse al

reprocesamiento, eliminacin de las partes afectadas o alimentacin animal.
4.2.- Alimentos proteicos.
a) Leche, crema, queso y helados:
La leche cruda es un alimento peligroso (Tabla 1) en que deben realizarse

recuentos de aerobios totales y Gram-negativos y sobre todo cuando se destina a
la produccin de alimentos para poblacin de riesgo.
La leche pasteurizada tiene una alta calidad microbiologca y los valores de

enterobacterias y aerobios estn ampliamente aceptados (Tabla 2), en ciertos
casos es necesario hacer un recuento de Gram-positivo psicrotrofos (Bacillus) para
valorar la posibilidad de deterioro debido a proteasas y lecitinasas.
Queso: en aquellas zonas donde se prepara a partir de leche cruda de oveja o

cabra es especialmente importante valorar la presencia de Brucella; y en los
quesos salazonados, de S. aureus que se selecciona en el proceso. El queso
elaborado a partir de leche pasteurizada es ms seguro y el criterio es valorar
enterobacterias y S. auerus.

Helados: presentan un problema particular por su alta posibilidad de
contaminacin con microorganismos de origen entrico (tabla 3) debido a la alta
manipulacin de la materia prima.
b) Carne fresca:
En zonas en que el tratamiento trmico de las canales no es adecuado pueden

haber una proliferacin en profundidad de C. perfringens de origen intestinal. Si el
tratamiento es adecuado la flora ms importante es la Gran-negativa no
fermentadora (Pseudomonas, por ejemplo) que hay que determinar en superficie.
En carnes es especialmente importante prevenir la transmisin de las zoonosis

mediante la observacin ante morten y post-mortem de los animales; aunque la
eliminacin de las enfermedades se fundamenta en la prevencin en el ganado y
en el tratamiento trmico de los alimentos.
En carnes deshuesadas es importante valorar enterobacterias para determinar las

condiciones higinicas del proceso.
Las carnes picadas, debido a su procesamiento, tienen ttulos bacterianos

mayores. No deben consumirse crudas, y los valores de referencia rondan 10 5
aerobios/gr.
La carne de pollo no se consume nunca cruda y por tanto la contaminacin es

posterior a la preparacin. El criterio es el anlisis de enterobacterias en superficie
para valorar los riesgos posteriores.
c) Alimentos de origen marino:
Las diferencias en el pH de la carne y del pescado y marisco hacen que stos sean
ms susceptibles al deterioro microbiolgico.
El pescado de alta mar est notablemente limpio de microorganismos, no as el de

zonas costeras para el que se han descrito valores de referencia (tabla 4).
En el caso de los moluscos la situacin es ms delicada porque a veces se

consumen crudos. Se han descrito lmites de enterobacterias y E. coli, as como
para las aguas en las que se cultivan. (Es importante la transmisibilidad de
hepatitis A, a travs de los moloscos).
Es importante el control de aminas vasopresoras.
d) Huevos y derivados:
Los huevos enteros no tienen carga microbiolgica (salvo excepciones y en los

casos de huevos de pata o de oca) y por tanto no tiene sentido establecer criterios.
En el caso de los productos es importante el momento de la rotura y separacin de
la cscara que, si se hace de forma higinicamente correcta permite recuentos
totales del orden de 106 cfu/ml y E. coli inferior a 102/ml.
e) Hortalizas y verduras y tubrculos:

Las asociaciones microbianas son similares a las de los alimentos crnicos aunque
aqu toman ms importancia los microorganismos capaces de hidrolizar
carbohidratos de alto pero molecular (Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia y
Corynebacterium) que, junto a los mohos son causantes de podredumbres
(tabla 5).
En estos alimentos no son de utilidad los recuentos microbiolgicos y slo las

propias alteraciones macroscpicas constituyen criterios vlidos de la prdida de
calidad.
En el caso de hortalizas es importante considerar la posible contaminacin con

microorganismos derivados del estircol o del agua de riego. Por consiguiente es
importante lavar las hortalizas para arrastrar microorganismos, huevos y virus y
usar como valores de referencia 10 E. coli/gr y 10 estreptococos grupo D/gr con
valores de los microorganismos psicotrofos del orden de 10 5 cfu/ml (para los que
se consumen crudos).
4.3.- Alimentos de pH cido.
En ellos slo pueden crecer acidotolerantes: mohos, levaduras, bacterias lcticas y acetobacterias.
a) Frutas, zumos y refrescos:
Las frutas se conservan en atmsferas especiales y los zumos y refrescos se

suplementan con conservante que unidos a la baja temperatura de conservacin
por razones organolpticas hace que el recuento sea innecesario.
b) Alimentos a los que se aade vinagre: (encurtidos)
En general el control microbiolgicas es innecesario siempre que los valores pH

sean suficientemente bajos: el control del pH permite valorar las BPE.
4.4.- Alimentos emulsionados.
Los alimentos de este tipo deben su estabilidad al efecto combinado de la dispersin de la fase ocuosa
junto a su proteccin con valores subinhibidores de a w pH.
a) Mantequilla:
Los riesgos sanitarios son prcticamente nulos cuando se ha elaborado a partir de

leche pasteurizada. En cualquier caso, la valoracin de microorganismos lipolticos
puede permitir evaluar el riesgo de enranciamiento.
b) Margarina:

La discusin es similar al caso de la mantequilla. Aqu se adiciona conservante. El
mayor riesgo est en la fase acuosa contaminante. El criterio ms sencillo es la
medida del pH de esta fase acuosa, y si hay alteraciones en el mismo el recuento
de microorganismos lipolticos.
4.5.- Alimentos con actividad de agua reducida.
a) Alimentos con humedad intermedia:( aw= 0,7-0,85) (son salazones, leche condensada,
mermeladas).
Las asociaciones de microorganismos que se forman dependen del valor concreto

de aw y del pH del alimento. En estos casos los controles del alimento recin
preparado son de poca utilidad y las muestras han de someterse a incubaciones
cclicas para detectar luego los microorganismos.
b) Alimentos completamente estabilizados: (aw <0,6).
Estos alimentos estn perfectamente protegidos frente al deterioro microbiano;

pero los microorganismos no esporulantes pueden conservarse en un estado de
baja actividad metablica por lo que es necesario un control microbiolgico de los
mismos. Este control es mucho ms importante cuando el alimento va a usarse en
poblaciones de riesgo.
Tambin es importante valorar la calidad microbiolgica del agua empleada en la

rehidratacin del alimento.
4.6.- Alimentos perecederos pasterizados no envasados.
a) Productos de pastelera:
La contaminacin con E. coli es indicativa de las condiciones de conservacin que

siempre ha de hacerse en fro por la cualidad perecedera de su interior.
b) Empanadas de carne:
La corteza y la presencia de conservantes protege el interior, aunque en ocasiones

se han roto estas barreras y se han producido contaminaciones. Deben vigilarse
enterobacterias, S. aureus y C. pefringens.
c) Pan:
El mayor problema es el enmohecimiento que es facilmente detectable por lo que

en condiciones normales no es necesario un control microbiolgico especial.
4.7.- Alimentos congelados.
Durante la congelacin no hay desarrollo microbiano, el problema surge durante la descongelacin que
puede no desarrollarse conforme a las BPE. El criterio suele ser el control de la calidad del producto fresco

antes de congelarse. Cuando el alimento se cocina inmediatamente antes de procederse a la congelacin,
los valores de referencia suelen ser similares a los de la leche pasterizada.
4.8.- Semiconservas envasadas.
Son aquellos productos que conservados en refrigeracin tienen una duracin de varias semanas pero que
a temperatura ambiente se alteran en pocos das.
a) Alimentos perecederos:
Embutidos: (Tabla 6) en los que se da una gran variedad de valores de referencia

aunque pueden sealarse, en conjunto, los de la tabla.
Productos crnicos en lonchas envasados al vaco: en que la alteracin se efecta

por bacterias lcticas y el criterio es incubar a temperatura de refrigeracin el
producto y valorar entonces S. aureus y enterobacterias.
b) Alimentos de gran tamao enlatados:
Las asociaciones presentes en estos microorganismos son bacterias psicrotrofas

resistentes al calor (Streptococos de grupo D y ciertos bacilos). No es til detectar
microorganismos en el producto recin preparado, es necesario hacen ensayos de
incubacin a una temperatura que permite el desarrollo mximo de los organismos
psicrotrofos sin matarlos (16 C). En la tabla 7 se muestran los valores de
referencia para estas semiconservas.
c) Semiconservas de pescado:
Las condiciones de anlisis son similares a las del apartado anterior. En aquellas
semiconservas que contienen vinagre, la medida del pH suele ser suficiente criterio
(si el pH es diferente del de referencia se destaca el producto). Para alimentos con
pH superior a 4.5 hay que analizar enterobacterias, S. aureus y Clostridium.
d) Otros productos bastante estables:
Para quesos y ambutidos se deben realizar pruebas de incubacin para

detectar Bacillus y Clostriclium. El incremento no debe ser superior a 3
veces. En pescados ahumados las estabilidad es buena y en ellos debe
controlarse Clostridium botulinum de tipo E.
4.9.- Alimentos trtados trmicamente y envasados en recipientes hermticos.
a) Conservas appertizadas:
Las conservas son muy estables y no presentan riesgos, excepto en el caso de C.

botulinum cuando el tratamiento no es el adecuado y en los casos de
contaminacin postprocesado debido a defectos en el envase. El mejor criterio es
el control de los mecanismos de produccin porque las contaminaciones son
demsiado espordicas para ser detectables por un muestreo.

Se puede valorar el poder de conservacin de la appertizacin incubando envases
durante largo tiempo a altas temperaturas (30 C) y valorando las alteraciones
organolpticas.
b) Alimentos totalmente estriles:
Estos no deben contener ningn tipo de microorganismo. El anlisis se centra en el

estudio de la presencia de esporas termoresistentes. El anlisis se hace incubando
a alta teperatura una serie de envases y detectando abombamientos, cambios
organolpticos, si no es el caso, se siembra una muestra del contenido y se incuba
en anaerobiosis a alta temperatura.
5.- Concordancia entre valores y mtodos:
Los mtodos de anlisis deben ser normalizados para que los resultados del mismo sean constantes y
reproducibles entre laboratorios. Hay una serie de organizaciones responsables de la elaboracin y
normalizacin de los mtodos de anlisis y los valores de referencia. En Espaa el cdigo alimentario y una
serie de normas publicadas en el BOE y que desarrollan definiciones, mtodos y valores de referencia,
constituyen la normativa vigente para la decisin sobre calidad microbiolgica del alimento.
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Metodos Generales de Analisis Microbiologico

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

FACULTAD DE INGENIERAPESQUERAY DE ALIMENTOS

Principios de garanta de la calidad microbiolgica de los alimentos. Generalidades sobre la toma de

1. Principios de garanta de la calidad microbiolgica de los alimentos.

2. Generalidades sobre la toma de muestras y el anlisis microbiolgico de los

B.- Fundamentos de los procedimientos analticos:

B.2.- Transporte de muestras: Es importante evitar que durante el transporte de las

En general es conveniente hacer el transporte a temperaturas del entorne de 0 C por un

B.3.- Confianza en los procedimientos: Normalmente es necesario detectar bacterias que

B.5.- Evaluacin siotemtica de los medios de cultivo: Dada la variabilidad debida a

C. Necesidad de valores de referencia.

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Blgo.-Mblgo.: ARTURO GARCIA MERINO

Como norma general, si se trata de un lote desconocido es conveniente analizar un nmero de

C Planes de muestreo de tres categoras.

Se aceptan con condiciones algunos alimentos que sobrepasen la norma microbiolgica

D. Toma de muestras representativas.

4. Utilizacion de los microorganismos como marcadores (indices e indicadores).

A. Introduccin histrica, terminologa y bases de su utilizacin.

Microorganismo ndice: aqul cuya presencia aletar de la posible presencia de un microorganismo

Microorganismo indicador: aquel cuyo mumero indica un tratamiento inadecuado o una

Un microorganismo dado puede actuar como ndice e indicador simultaneamente, incluso en un