LP7 Studiul celulelor vii

-------STUDIUL PROCESELOR CELULARE

2 provocri:
a. Dezvoltarea unor tehnici i metode adecvate de urmrire a fenomenelor celulare
b. Modelarea experimental adecvat a fenomenelor celulare

-------MODALITI DE STUDIU
1. in vivo
2. in situ
3. in vitro

-------MODALITI DE STUDIU
in vivo cnd celulele sau organele ale cror celule dorim s le studiem sunt abordate n
organismul intact
Avantaje: rezultatele obinute sunt edificatoare pentru procesul studiat la nivel de organism
Limitri: rezultatele experimentelor sunt dificil de interpretat, din cauza influenelor
celorlalte componente ale organismului
in situ cnd organul de interes este meninut la locul su n organism, dar sunt controlate unele
influene, cum sunt cele nervoase sau endocrine
Avantaje: se pot studia variaiile procesului n condiii controlate
Limitri: nu se poate idenRfica rezultatul cu cel in vivo
in vitro cnd organul, esutul sau celulele sunt izolate din organism
Avantaje: se permite un control riguros al experimentului
Limitri: nu se poate garanta obinerea acelorai rezultate in vivo

-------Tehnici in vitro
Baia de organ
Cultura de celule

-------Baia de organ
permite meninerea viabilitii unor fragmente de organ sau esuturi
variante n funcie de organul supus experimentului
asigur o temperatur constant, oxig e na r ea ma t e rial ul ui bi ol ogi c, posibilitatea controlrii
compoziiei mediului din baie i culegerea de date funcionale i eanRoane de material biologic

-------Cultura de celule
Tehnic prin care populaii omogene de celule sunt meninute n via n incubatoare special
desRnate, cu atmosfer controlat (temperatur, amestec de gaze, umiditate), n medii de cultur
propice

-------Cultura de celule
Etape de obinere a unei culturi celulare
- Digestia enzimatic a esutului, cu obinerea unei suspensii de celule
- Izolarea unei populaii celulare pure
- nsmnarea n flacoane de cultur sau plci Petri (cultur primar)
- Pasarea resuspendarea celulelor din cultura primar urmat de rensmnarea, la densiti mai
mici, n noi flacoane de cultur sau plci Petri (culturi secundare)

-------Culturi celulare Evoluie

1.Faza de lag sau de inducie celulele i refac componentele suprafeei (componentele
membranare) i se acomodeaz cu mediul de cultur
2.Faza exponenial celulele se divid rapid, exponenial
3.Faza staionar numrul de celule rmne constant; n aceast faz se efectueaz pasarea
4.Faza de declin scderea nr. de celule din cauza mbtrnirii i morii

-------Medii de cultur componente

1. Aminoacizi i vitamine
2. Sruri necesare meninerii echilibrului ionic i pH-ului mediului de cultur
3. Glucoz pentru necesarul energeRc
4. Ser fetal (factori de cretere)
5. AnRbioRce
6. Rou fenol, ca indicator de pH

-------Citometria n flux
Permite analiza i separarea celulelor (vii sau fixate) pe baza unor caractere morfologice i
biochimice
Ofer informaii asupra:
1. mrimii relative a celulelor
2. granularitii interne relative (neomogenitatea intern, citoplasmatic)
3. intensitii relative a fluorescenei

-------Citometria n flux utilitate

1. msurarea caracteristicilor fizice ale celulei
2. identificarea i separarea populaiilor de celule sanguine (granulocite, monocite, limfocite T sau
B)
3. msurarea cantitii de ADN din celul
4. msurarea cantitii intracelulare de Ca2+
5. msurarea pH-ului intracelular

-------Citometria n flux principiu

Celulele dintr-o suspensie trec una cte una prin faa unui fascicul luminos. Modul n care lumina
este dispersat va furniza informaii despre proprietile celulei respective.

-------Animale transgenice
Animale de laborator crora li se inser gene mutante, pentru a studia efectul acestora asupra
organismului gazd
Mediu de studiu pentru evoluia unor boli cu determinism genic i a opiunilor terapeutice

------ Animale knockout

nlocuirea genei de interes cu o gen inactiv sau o alel mutat
Animalul purttor nu va exprima aceast gen, putndu-se studia efectul absenei sale n organism

-------Videomicroscopia
Urmrirea comportamentului celular n timp real n mini-incubatoare cu sistem microscopic
ncorporat

-------Ce nlesnete?
Urmrirea celulelor timp ndelungat (ore, zile) n modelri experimentale (adeziune, etalare,
stimulri, inhibri, stres hipoxic, stres oxidativ)
Stabilirea momentelor criRce n comportarea celulelor n modelul experimental
Msurtori morfologice
 Msurtori de mobilitate celular
Traiectorii ale dinamicii celulare
Migrri individuale, migrri de grup
Dezvoltri de experimente asupra mecanismelor (prin metode alternative)

-------Monitorizarea comportamentului celular prin msurtori de impedan

Investigarea n timp real a comportamentului celular
Utilizeaz plci cu 16 godeuri, conectate cu electrozi

-------Ce nlesnete?
1. Monitorizarea celular Bmp ndelungat (ore, zile)
2. O mare diversitate de modele experimentale pentru:
Aderare i etalare celular
Proliferare sau moarte celular
Migrare i invazivitate celular

-------