ISSN 0102-5716 Veterinria e Zootecna 39

ASSOCIAO ENTRE RESULTADOS SOROLGICOS NO DIAGNSTICO DA

LEISHMANIOSE E DA TRIP ANOSSOMASE CANINA, PELA TCNICA DE
IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA

Marcella Zampoli Troncarelli 1

Juliana Giantomassi Machad02
Luciana Bonato de Camargo '
Juliano Lenidas Hoilmann4
Lucilene Camossi5
Haroldo Greca5
Patrcia Yoshida Faccioli1
Helio Langoni".

RESUMO

A leishmaniose visceral (L V) uma zoonose causada por protozorio do gnero Leishmania,

sendo o co a principal fonte de infeco para o homem, especialmente em reas urbanas. Na
tripanossomase, o co considerado o principal reservatrio domstico, principalmente
devido a sua proximidade com o homem. Um dos mtodos de diagnstico soro lgico
empregado para detectar a leishmaniose a reao de imunofluorescncia indireta (RlFI),
embora possam ocorrer reaes cruzadas com Trypanosoma cruzi. Com o objetivo de avaliar
as reaes cruzadas entre Leishmania e Trypanosoma, foram analisadas amostras de 826 soros
de ces, submetidas rotina diagnostica pela RlFI no Laboratrio do Servio de Diagnstico
de Zoonoses da FMVZ, UNESP, Botucatu, SP, durante o perodo de janeiro de 2005 a
setembro de 2006. Utilizaram-se lminas de imunofluorescncia impregnadas com os
antgenos de Leishmania major e de Tcruzi (cepa Y). Foram considerados positivos os ttulos
com fluorescncia a partir da diluio 1:40 para Leishmania spp e 1:20 para Tcruzi. Do total
de amostras analisadas, 656 (79,4%) foram negativas, tanto para Leishmania spp quanto para
T cruzi e 15 amostras (1,8%) resultaram positivas para ambos parasitas, com ttulos idnticos.
Observou-se que 113 amostras (13,7%) resultaram positivas para ambos parasitas, porm com
ttulos para Leishmania spp maiores do que aqueles apresentados para T cruzi. Em apenas
sete amostras (0,85%), o resultado foi positivo para Leishmania spp e T cruzi, porm com os
ttulos para T cruzi superiores queles apresentados para Leishmania spp. Em 21 amostras de
soros (2,5%), os resultados foram positivos para Leishmania spp e negativos para T cruzi e
em 14 soros (1,7%), os resultados foram positivos para T cruzi e negativos para Leishmania
spp. Os resultados apresentados apontam para a importncia da vigilncia epidemiolgica de
ambas enfermidades, sendo que, nos casos de provveis reaes cruzadas, so necessrias
outras tcnicas laboratoriais, como a reao em cadeia da polimerase (PrR), para a
confirmao diagnstica.

Mestranda da rea de Sade Animal, Sade Pblica Veterinria e Segurana Alimentar, da Faculdade de
Medicina Veterinria e Zootecnia -- UNESP- Botucatu. e-mail: matroncarelli(alyahoo.com.br
2 Doutoranda da rea de Sade Animal. Sade Pblica Veterinria e Segurana Alimentar, da Faculdade de
Medicina Veterinria e Zootecnia - UNESP- Botucatu.
3 Mdica Veterinria
4 Mestrando do Programa de Doenas Tropicais da Faculdade de Medicina de Botucatu _. UNESP.
) Aprimorandos do Servio de Diagnstico de Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia -
UNESP- Botucatu.
(, Professor Titular do Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica da FMVZ-1Jl\;ESP-Botucatu.
Distrito de Rubio Junor, s/no CEP: 18.618-000. e-mail: hlangoni@t1nvz.unesp.br o
Troncarelli, M.Z. et. al. Associao entre resultados soro lgicos no diagnstico da leishmaniose e da
tripanossomase canina, pela tcnica de imunofluorescncia indireta. Vet. e Zootec. v.l S, 11.1, abr., p.39-46,
2008.
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Palavras-chave: Leishmaniose, doena de Chagas, soroIogia, imunofluorescncia indireta,

ces.

SEROLOGIC RESUL TS CORRELATION IN CANINE LEISHMANIASIS AND

TRIPANOSOMIASIS DIAGNOSIS, BY INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCE
TECHNIQUE

ABSTRACT

Visceral Leishmaniasis (VL) is a zoonosis caused by Leishmania genus protozoan, being the
dog the main source of infection for human, especially in urban areas. In case of
tripanossomiasis, dogs are considered lhe most important domestic reservoirs, due its
proximity to humans. One of the serologic diagnosis methods used to detect leishmaniasis is
the indirect immunofluorescence antibody test (IF AT). However, cross-reactions with
Trypanosoma cruzi can be observed. In order to evaluate the cross-reactioris between
Leishmania spp and Trypanosoma, 826 dog s serum samples were submitted to the IFAT
diagnostic routine in the Servio de Diagnstico de Zoonoses laboratory of FMVZ, UNESP.
Botucatu, SP, during the period of January 2005 to September 2006. Irnmunofluorescence
slides were impregnated with Leishmania major antigens for leishmaniasis diagnosis and
another were impregnated with 'Lcruzi (Y strain) for tripanossomiasis diagnosis. The titles
higher than or equal to 40 for Leishmania spp and titles higher than or equaI to 20 for Tal/zi
were considered positive. From the total of analyzed samples, 656 (79.4%) were negative for
Leishmania and also for T cruzi and 15 samples (1.8%) were positive for both parasites. with
identical titles. It was observed that 113 samples (13.7%) were positive for both parasites,
however with higher titles for Leishmania spp when cornpared with those presented for T
cruzi. 111 only seven samples (0.85%). lhe results were positive for Leishmania spp and T.
ctu:i, however with lhe T cruzi titles higher than those presented for Leishmania spp. Twenty
one serum samples (2.5%), were positive for Leishmania spp and negative for T cruzi and 14
samples (1.7%) were positive for T. cruzi and negatives for Leishmania spp. These results
reinforce the irnportance of thc epidemiological vigilance for these two diseases, and
determine that otber laboratorial techniques. such as polimerase chain reaction (PCR). are
necessary for diagnostic confirrnation, if probable cross-reactions occur.

Key words: Leishrnaniasis, Chagas Disease, serology, indirect imrnunofluorescence, dogs.

ASSOCIACIN ENTRE RESULTADOS SOROLGICOS EN EL DIAGNSTICO

DE LA LElSHMANIASIS Y DE LA TRIPANOSOMASlS CANINA, POR LA
TCNICA DE IMUNOFLUORESCNCIA JNDIRECTA

RESllMEN

La Leishmaniasis VisceraI (LV) es una zoonosis causada por eI protozoario deI gnero
Leishmania, siendo el peno Ia principal fuente de infeccin para el hombre, especialmente cn
reas urbanas. En caso de Ias tripanossomasis, los perros son los animales domsticos
considerados como principales reservrios, principalmente por su proximidad ai hombre. Uno
de los mtodos sorolgicos usados para el diagnstico de Ia leishrnaniasis es Ia reaccin de
imunofluorescncia indirecta (RIFI), tambin reacciones cruzadas con el Trypanosoma cruz;
pueden ser observadas. Con el objetivo de evaluar Ias reacciones cruzadas entre Leishmania
spp y Trypanosomu, fueron cvaluadas 826 muestras de suero de perros, sometidos a Ia rutina

Troncarelii, rvf.z. ct. al . Associao entre resultados soro lgicos no diagnstico da leishrnaniose e da
tripanossomase canina, pela tcnica de imunofluorescncia indireta. Veto e Zootec. v.15, n.l , abr., p.39-4G,
2008.
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diagnostica de Ia RIFI en el Laboratorio de Servio de Diagnstico de Zoonoses de Ia FMVZ.

UNESP, Botucatu, SP, durante el perodo de enero de 2005 a septiembre de 2006. Fueron
utilizadas lminas de imunofluorescncia impregnadas con los antgenos Leishtnania major
para el diagnstico de leishrnaniasis y Ia cepa Y de Trypanosoma cruzi para Ia diagnosis de
tripanossorniasis. Los ttulos con fluorescencia arriba de 40 para Leishinania spp ueran
considerados positivos y los ttulos arriba de 20 para Tcnci fueron considerados positivos.
DeI total de muestras analizadas. 656 (79.4%) fucron negativas. tanto para Leishmania spp
cunto para el Ticruzi y 15 muestras (1.8%) ucron positivas para ambos parasitos. con los
ttulos idnticos. Fue observado que 113 muestras (13.7%) fueron positivas para ambos
parasitos, pero con ttulos superiores para Leishmania spp que para cl T cruzi. E11 solamente
sicte mucstras (0.85%). cl resultado fue positivo para cl T'cruzi y para Lcishmania spp. con
los ttulos para el T cruzi superiores a Ias que se preseniaran para Leishmania spp. En 21
muestras de sueros (2.5Ir,). los resultados fueran positivos para Leishmania spp y negativas
para el T'cruzi y en 14 sucros (1.7%), los resultados ueran positivos para el 'Lcruzi y
negativos para Leishmania spp. Estos resultados scnalan Ia importancia de Ia vigilancia
epidemiolgica de arnbas enferrnedades, siendo que, en los casos de reacciones cruzadas
probables, otras tcnicas laboratoriales son necesarias, como Ia reaccin en cadena de
polimerase (PCR). para Ia confirmacin diagnstica.

Palabras-clavc: Leishmaniasis, Mal de Chagas, serologa. imunofluorescncia indirecta.

perros.

INTRODUO

A leishmaniose visceral (LV) uma zoonose causada por protozorio do gnero

Lcishniania. sendo o co a principal fonte de infeco para o homem. especialmente em reas
urbanas. Alm da importncia da infeco canina por Leishmania spp. deve-se atentar
tambm para a infeco dos ces por Trypanosoma cruzi. pois, dentre os animais domsticos.
os ces so considerados os principais reservatrios para tripanossomatdeos. principalmente
devido a sua proximidade com o homem.
A prcvalncia de lcishmaniose canina em reas endrnicas do Brasil bastante
elevada. Um exemplo importante o municpio de Bauru-SP onde. entre janeiro a novembro
de 2007, 3.596 ces foram cuianasiados no Centro de Controle de Zoonoses. scndo 835
(23.2%) animais soropositivos rara leishmaniose (Cludia Gornieri. comunicao pessoal).
Estudo de prevalncia canina foi realizado em Uberlndia e Corornandel. municpios
de Minas Gerais. Em Uberlndia foram examinados pela R1FI os soros de 230 ces, sendo
200 da rea urbana. com 4.5% de positividade e 30 da rea rural. dos quais 6,6% foram
positivos. Em Corornandcl. 89 soros foram examinados. resultando em 5,6% de positividade
(MAYW ALD et al.. 1996).
Em estudo realizado pelo Centro de Pesquisa Aggeu Magalhes, unidade da
FIOCRUZ em Pernambuco, foram avaliados 322 ces no municpio de Paulista (PE).
localizado no litoral norte da regio metropolitana de Recife. Foram identificados 40,3% de
ces sorologicamenle positivos para leishmaniose e, desses, 11,51yo apresentavam sinais
clnicos sugestivos (FIOCRUZ. 2007).
No se deve descartar, no entanto. a possibilidade de infeco canina por 'Lcruzi, pois
apesar de existirem escassos estudos de soroprevalncia no Brasil. a infeco de ces por este
agente possvel. Em estudo realizado por Reycs c colaboradores (2002). verificou-se que. de
61 ces dorniciliados de reas endrnicas para Tcnl?. na Costa Rica. 5,2% foram
soropositivos para este agente C. em 55 ces errantes, a soroposiiividade foi de 12l%. Em outro
._-------------------------------------
Troncarclli, M_Z. d_ al, Associao entre resultados soro lgicos nu diagnstico da lcishmaniosc e da
tripanossomase canina, pela tcnica de imunofluorescncia indireta. Vet. e Zootec. v.15, 11.1, abr., p.39-46,
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estudo realizado no mesmo pas, de 54 ces, 15 (27,7%) foram soropositivos para este parasita
(MONTENEGRO et al., 2002).
Lucheis et al. (2005) estudaram cinqenta ces pertencentes a 30 indivduos com
doena de Chagas crnica, provenientes de 15 diferentes municpios da regio oeste do
Estado de So Paulo. Realizou-se o xenodiagnstico artificial, hemo cultura e PCR para
Tcruzi/T.rangeli. Quarenta e trs soros de ces (86%) foram positivos em pelo menos um dos
testes realizados.
Ressalta-se ainda que existem reas de sobreposio no Brasil, tanto de leishmaniose
quanto de tripanossomase, sendo que o co pode apresentar esta co-infeco, como j
verificado por Savani e colaboradores (2005). Em outros pases este fato tambm tem sido
demonstrado. Em muitas regies da Amrica do Sul, como a Provncia de Salta (Argentina),
h uma sobreposio de reas endrnicas para tri panossomase americana (doena de Chagas)
e para leishmaniose.
Um dos mtodos de diagnstico sorolgico empregado para detectar a leishmaniose
a reao de imunof1uorescncia indireta (RIFI). Apesar desta tcnica apresentar elevada
sensibilidade e especificidade, podem ocorrer reaes cruzadas com Trypanosoma cruzi e
outros antgenos (VERCAMMEN et al., 1997; ROSRIO, 2002; ZANETTE, 2006;
FERREIRA et aI., 2007), principalmente se forem utilizados antgenos no purificados
(BRENER et al.. 2000). A reao cruzada entre T cruzi e Leishmania spp em exames
sorolgicos j havia sido descrita por Camargo e Rebonato (1969), e justificada, pois ambos
parasitas compartilham vrios antgenos (CHIARAMONTE et a1., 1996).
Um estudo bastante especfico sobre este tema foi realizado no Brasil por Vexenat e
colaboradores (1996), e a ocorrncia de reaes cruzadas entre Trypanosoma cruzi,
Leishmania chagasi e Leishmania (Viannia) braziliensis foi demonstrada. importante
ressaltar que as tcnicas que utilizam antgenos totais so limitadas em termos de
especificidade, apresentando reaes cruzadas no somente com outras espcies da famlia
Trypanosomatidae, mas tambm com outros organismos filogeneticamente distantes
(RACHAMIN et aI., 1991; GONTIJO & MELO. 2004).
Em artigo de reviso sobre mtodos de diagnstico da leishmaniose visceral canina
realizado por IKEDA-GARCIA e MARCONDES (2007), relata-se tambm a possibilidade de
ocorrncia de reaes cruzadas entre Leishmania e Tcruzi em diagnsticos soro lgicos. Com
efeito, os resultados da RIF] no devem ser utilizados como indicadores de infeco
leishmanitica especfica (COSTA et al., 1991; AL VES & BEVILACQUA, 2004).
Portanto, no caso de haver reaes cruzadas entre Tcruzi e Leishmania spp, deve-se
levar em considerao o resultado sorolgico associado aos fatores clnicos e
epidemiolgicos, bem como utilizar tcnicas associadas para se chegar ao diagnstico
diferencial. Deve-se atentar para os sinais clnicos do animal, se este os apresentar, e
procedncia do mesmo (rea endmica ou no para leishmaniose e doena de Chagas),
presena de vetores (flebotomneos, no caso da Ieishmaniose e triatornneos, para a doena de
Chagas) e o contato do co com animais silvestres, j que estes tambm so reservatrios
importantes, tanto de Leishmania spp quanto de 'Lcruzi.
Com o objetivo de avaliar as reaes cruzadas entre estas duas espcies de
protozorios, foram analisadas amostras de 826 soros de ces, submetidas rotina diagnstica
pela RTFI no Laboratrio do Servio de Diagnstico de Zoonoses da FMVZ, UNESP,
Botucatu-SP, durante o perodo de janeiro de 2005 a setembro de 2006.

Troncarelli, M.l. ct. ai. Associao entre resultados soro lgicos no diagnstico da leishmaniose e da
tripanossomase canina, pela tcnica de imunofluorescncia indireta. Veto e Zootec. v.15, n.l , abr., p.39-46,
2008.
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MATERIAL E MTODOS
A tcnica de RIFI foi realizada de acordo com Camargo (1966). As lminas com o
antgeno Leishmania major foram preparadas pipetando-se 10/lL da suspenso de
promastigotas em cada um dos orifcios, retirando-se em seguida por aspirao, restando
somente uma fina pelcula. As lminas foram secas em temperatura ambiente e mantidas em
laminrio a -20C. at o momento do uso. por perodo mximo de duas semanas.
Foram utilizadas microplacas para a diluio dos soros. pipetando-se 190/lL de PBS
0.01 M. pH 7.2 e 1O~lL do soro a ser testado no primeiro orifcio, homogeneizando-se,
perfazendo a diluio 1:20. Foram distribudos 100/lL de PBS O.OlM, pH 7,2 em outras cinco
cavidades e a partir da primeira diluio, transferindo-se 1OO~lL para o orifcio seguinte,
homogeneizando-se, repetindo at a quinta cavidade, desprezando-se os ltimos. Essas
diluies forneceram ttulos 20, 40, 80, 160, 320 e 640. Da mesma forma, foram diludas
amostras de soros controles positivo e negativo. A diluio inicial utilizada foi 1:40. Em
lminas fixadas com o antgeno de L. major, foram distribudos 10~lL de cada diluio nos
orifcios, incubando-se a 37C por 30 minutos em cmara mida. A seguir, foram lavadas em
jarras de coplin com PBS 7,2 por 10 minutos, por duas vezes consecutivas e secas em estufa.
O conjugado espcie-especfico foi diludo, segundo seu ttulo pr-estabelecido, em soluo
de Azul de Evans a 20 mg% a qual foi previamente diluda em PBS 0,01M, pH 7,2 na
proporo de 1:5. Foram distribudos 1O~lL de conjugado para cada diluio, incubando-se
novamente a 37C por 30 minutos em cmara mida. Procedeu-se nova lavagem em jarra de
coplin com PBS 0,01 M. pH 7,2 por 10 minutos, duas vezes consecutivas, secando-se em
estufa. As lminas foram montadas com glicerina tarnponada pH 8,5, cobrindo-se com
larninula 24x60mm, examinando-se em microscpio de imunofluorescncia, no aumento 40
vezes. Aps a leitura dos controles. foi procedido o exame das amostras em teste.
considerando-se como ttulo final a maior diluio do soro em que ainda ocorresse
fluorescncia completa na borda de pelo menos 50% das promastigotas.
A RIFI para a deteco de anticorpos anti-Tcruzi foi realizada da mesma forma que a
tcnica de RIFI descrita para Leishmania spp. porm a diluio inicial utilizada foi de 1:20,
em soluo salina tamponada O,OlM pH 7,2. como triagem da reao, e os soros foram
testados para pesquisa de anticorpos IgG anti-Tcruzi, como descrito por CAMARGO (1966).
utilizando lminas de irnunofluorescncia impregnadas com antgenos de Ticruzi (cepa Y). O
soro foi considerado como positivo a partir do ttulo 20, pesquisando-se outras diluies
sucessivamente, at onde se observasse fluorescncia, obtendo-se o ttulo final.

RESULTADOS

Como representado na Tabela I verifica-se que, do total de amostras analisadas, 656

(79,4%) foram negativas, tanto para Leishmania quanto para T cruzi e 15 amostras (1.8%)
resultaram positivas para ambos parasitas, com ttulos idnticos. Observou-se que 113
amostras (13,7%) resultaram positivas para ambos parasitas, porm com ttulos para
Leishmania maiores do que aqueles apresentados para T cruzi. Em apenas sete amostras
(0,85%), o resultado foi positivo para Lcishmania e T cruzi, porm com os ttulos para T
cruzi superiores queles apresentados para Leishmania. Em 21 amostras (2,5%), os resultados
foram positivos para Leishmania e negativos para T cruzi e em 14 (1,7%), os resultados
foram positivos para T cruzi e negativos para Leishmania. A maioria das amostras positivas
para Leishmania spp e Trypanosoma cruzi foi obtida de ces provenientes de regio endrnica
(Bauru-Sl") para lcishrnaniose visccral canina, sugerindo assim reao cruzada ou co-infeco
destas duas enfermidades. Sendo assim, para a confirmao diagnstica, torna-se necessria a
avaliao cpidemiolgica e testes diagnsticos complementares mais precisos.

Troncarelli, M.I. et. al . Associao entre resultados soro lgicos no diagnstico da lcishrnaniose e da
tripanossorniase canina, pela tcnica de irnunofluorescncia indireta. Veto e Zootec. v.15, n.l , abr., p.39-46,
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Tabela 1. Resultados da pesquisa de anticorpos anti-Leishmania spp e anti-Trypanosoma

cruzi em amostras de soros caninos examinados no Servio de Diagnstico de Zoonoses,
DHVSP, FMVZ, UNESP - Botucatu-SP, 2007.
Leishmania sp~ (A) Trypanosoma cruzi (B) Nmero de amostras %
+ + 113(A>B) 13,7
+ + 7 (B > A) 0,8
+ + 15 (A=B) ] ,8
+ 21 2,5
+ 14 1,7
656 79,5
TOTAL 826 100

A - Ttulo da RIFT para Leishmania spp.

B - Ttulo da RTFI para Trypanosoma cruzi

DISCUSSO E CONCLUSES
OS resultados do presente estudo sugerem a ocorrncia de reaes cruzadas
sorolgicas entre Leishtnania e T cruzi pela tcnica de RTFI em soros caninos, j que houve
um nmero elevado de amostras positivas onde se detectou a presena de anticorpos contra
ambos parasitas. importante ressaltar que, neste caso, os ttulos de anticorpos anti-
Leishmania foram quase sempre superiores aos ttulos anti- T cruzi, sendo que em somente
sete amostras ocorreu o contrrio. Alm disso, em somente 15 amostras os ttulos contra
ambos parasitas foram idnticos. Este um indicador importante que pode auxiliar os
clnicos, que devem tambm considerar os aspectos epidemiolgicos envolvidos, alm de
realizar diagnsticos complementares nos animais, a fim de obter o diagnstico definitivo.
Estes resultados corroboram os apresentados em outros estudos realizados. como o de
Lauricella et al. (1998) que. comparando o imunodiagnstico da infeco por T criei em 182
ces naturalmente infectados na Argentina, por meio das tcnicas de hcmaglutinao indireta
(HAl), RTFl e Ensaio Tmunoenzimtico (ELTSA), verificaram que o teste de ELISA
apresentou 96,2% de espccificidade e 94% de sensibilidade. porm constatou-se que
Leishmania spp e Tcruzi produziram reaes cruzadas. Costa e colaboradores (2003), durante
estudo de padronizao da tcnica de imunocromatografia para () diagnstico de leishmaniose
canina e comparao com a RIFI, verificaram que 100% dos 14 animais experimentalmente
infectados com 'Lcruzi apresentaram sorologia positiva pela RTFT, tanto para Trypanosotna
quanto para Leishmania, o que no ocorreu pelo mtodo imunocromatogrfico.
Padilla e colaboradores (2002), em estudo sorolgico para tripanossomase e
leishmaniose canina na Argentina, verificaram que dos soros de 208 ces, 62 (29.8%) foram
positivos para Leishmania e 50 (24%) foram positivos para Ticruzi. Somente nove ces
(4,3%) foram soropositivos para Ticruzi, quando se utilizou antgeno especfico e purificado,
o que sugere que exclusivamente estes animais estavam realmente infectados pelo
Trypanosoma.
Conclui-se, com base na literatura e nos resultados apresentados no presente estudo,
que reaes cruzadas para Leishmania spp e 'Lcruzi podem ocorrer sorologia de amostras
caninas. Com isso, se faz necessria a avaliao dos aspectos epidemiolgicos envolvidos.
alm do uso de tcnicas laboratoriais complementares, como a Reao em Cadeia pela
Polimerase (PCR), para a confirmao diagnstica. Ressalta-se ainda que a vigilncia
epidemiolgica, tanto da Ieishmaniose corno da doena de Chagas extremamente importante

Troncarelli, M.Z. et. alo Associao entre resultados soro lgicos no diagnstico da leishmaniose e da
tripanossomase canina, pela tcnica de imunofluorescncia indireta. Vet. e Zootec. v.15, n. I, abr., p.39-46,
2008.
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e deve ser permanentemente realizada, j que o co um importante reservatrio para estas

zoonoses.

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Recebido em: ] 2/06/2007

Aceito em: 03/0112008

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