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FACULTAD DE QUMICA
TESIS
PRESENTA
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Agradecimientos
Durante la realizacin de este trabajo de tesis Ariadna Gonzlez Sols recibi una beca de PAPIIT
DGAPA UNAM IN207806 y particip en el Subprograma 127 de Formacin Bsica en
Investigacin, Facultad de Qumica, UNAM.
Esta tesis se llev a cabo gracias al financiamiento de los Proyectos PAPIIT DGAPA, UNAM
IN207806 e IN211409 y del proyecto de CONACYT 55610.
Agradecemos al Dr. Edgar B. Cahoon del Center for Plant Science Innovation & Department of
Biochemistry, University of Nebraska-Lincoln, USA, por haber proporcionado las semillas de
Arabidopsis thaliana de las lneas silvestre, Atlcb2a-1 y Atlcb2b-hp/Atlcb2a para la realizacin de
este trabajo de tesis. As mismo agradecemos su asesora, supervisin y el acceso a su laboratorio
y a las instalaciones del Donald Danforth Plant Science Center, St. Louis MO, EE.UU., durante mi
estancia para llevar a cabo el anlisis de bases de cadena larga por HPLC/ESI-MS/MS.
Agradecemos al Dr. Jonathan E. Markham y al Dr. Jan G. Jaworsky del Donald Danforth Plant
Science Center, St. Louis MO, EE.UU., por la realizacin de las ltimas fases del anlisis de bases
de cadena larga por HPLC/ESI-MS/MS.
Agradecemos a la Dra. Sonia Vzquez Santana del Laboratorio de Desarrollo en Plantas, Facultad
de Ciencias, UNAM, por su apoyo y asesora tcnica en los anlisis de microscopa ptica.
Agradecemos a la Q. Laurel Fabila Ibarra por su apoyo tcnico en el manejo de los cultivos en
invernadero.
A mis paps, por su ejemplo y su cario
A mis hermanos Dafne y Memo, por creer en mi
A Sergio, por acompaarme en este camino
Muchas gracias!
A mi familia por todo su apoyo.
Al Dr. Felipe Cruz Garca por sus comentarios y propuestas para el enriquecimiento de
este proyecto.
ABREVIATURAS
I. RESUMEN
La produccin de especies reactivas de oxgeno (ERO) es una caracterstica del patrn de defensa
contra patgenos en plantas. Estudios realizados en nuestro laboratorio y datos recientes indican
que la acumulacin de bases de cadena larga (BCL) precede a la formacin de ERO en una va
conducente a la muerte celular programada (MCP). En este proyecto se estudi la relacin entre
las BCL y la produccin in situ de H2O2 que conduce a la MCP como respuesta de defensa contra
patgenos. Para ello, se utilizaron dos estrategias que alteran la acumulacin de BCL. Una de
ellas est enfocada en disminuir la sntesis de BCL a travs de la modificacin de la actividad de la
serina palmitoiltransferasa (SPT) en mutantes de Arabidopsis thaliana. La segunda aproximacin
consisti en favorecer la acumulacin de BCL utilizando a la FB1 (inhibidor de la ceramida sintasa)
o bien exponiendo las plantas a Pseudomonas syringae avrRPM1, un patgeno no hospedero para
Phaseolus vulgaris o avirulento para A. thaliana. Los experimentos se realizaron tanto en A.
thaliana como en P. vulgaris. Los resultados en P. vulgaris indican que la acumulacin de BCL a
tiempos muy tempranos (1 h) precedi a la formacin de H2O2 en la regin infiltrada. Adems, en
este sitio se desarroll progresivamente la MCP de defensa conocida como respuesta de
hipersensibilidad (HR). En la mutante de A. thaliana Atlcb2b-hp/Atlcb2a con LCB2B silenciado, no
se observ la generacin de H2O2 ni a las 4 ni a las 12 h, en el sitio de la infiltracin con patgeno
avirulento, a diferencia de los controles. A nivel de plntula, la mutante nula Atlcb2a-1 de A.
thaliana acumul menores cantidades de BCL, en comparacin con las plntulas silvestres
tratadas con FB1. La magnitud de la produccin de H2O2 a tiempos intermedios se present en
relacin directa a la acumulacin de las BCL. Para dilucidar si la produccin de H2O2 dispara una
cascada de sealizacin mediada por la MAP cinasa 6 (MPK6) que se activa en vas de defensa, a
la mutante nula AtMPK6 de A. thaliana se le evalu la capacidad de producir H2O2 como respuesta
al ataque del patgeno o a la FB1. Los resultados mostraron que en este entorno gentico la
produccin de H2O2 no se alter, aunque si result mas sensible al patgeno bacteriano. El H2O2
se localiza mayoritariamente en los cloroplastos alrededor de las 18 h, en condiciones en las que
se estaba iniciando la manifestacin de la HR. Los resultados de los tres modelos experimentales
sealan que hay una asociacin entre la acumulacin de BCL endgenas y la formacin in situ de
H2O2. Esta relacin podra suceder en dos etapas. La primera relacionada con el papel sealizador
de los ERO y la segunda probablemente asociada con un estrs oxidativo dentro del proceso de la
MCP. Nuestra conclusin es que tanto las BCL como la formacin de ERO inducida por BCL es
importante en la inmunidad mediada por la interaccin gen por gen y confirman que la primera
etapa de produccin de ERO, posterior a un aumento en las BCL, se produce en la inmunidad a
patgenos no hospederos.
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INTRODUCCIN
II. INTRODUCCIN
1. RESPUESTAS DE DEFENSA CONTRA PATGENOS EN LAS PLANTAS.
En general, las plantas pueden ser atacadas por muchos tipos de patgenos como hongos,
bacterias, virus, nemtodos e insectos que invaden el tejido vegetal para explotarlo como una
fuente de energa (Dangl y Jones, 2001; Bonfig et al., 2006). No todos los ataques resultan
exitosos, ya que las especies vegetales desarrollaron sofisticados mecanismos que permiten
percibir el ataque de un patgeno y desencadenar respuestas de defensa (Dangl y Jones, 2001;
Wouter et al., 2005). En las plantas, los mecanismos de defensa contra el ataque de patgenos se
dividen en dos clases: aquellos que estn presentes constitutivamente y los que se inducen por la
exposicin al patgeno. En ambos contextos, las plantas combaten a los patgenos con
caractersticas estructurales que actan como barreras fsicas que dificultan la entrada del agente
invasor y evitan su expansin a travs de la planta, o bien, a travs de reacciones bioqumicas en
las clulas hospederas que producen sustancias que pueden ser txicas para el patgeno o crean
condiciones que inhiben su crecimiento.
En la interaccin planta-patgeno la manifestacin de la enfermedad ocurre cuando hay
compatibilidad entre el agente invasor y el hospedero1 (susceptibilidad), mientras que cuando la
planta combate de forma exitosa la infeccin ocurre una relacin incompatible o de resistencia.
Los patgenos pueden ser clasificados de acuerdo a sus caractersticas y a los efectos en la
planta hospedera (Wit, 2007). Existen patgenos intra y extracelulares; necrtrofos, hemibitrofos
o bitrofos; avirulentos o virulentos (Greenberg, 1997; Dangl y Jones, 2001, Wit, 2007). Los
patgenos necrtrofos son aquellos que se benefician de los nutrimentos de clulas sin requerir
una activa participacin del hospedero, comnmente proliferan en tejidos vegetales senescentes o
que presentan heridas (Morel, 1997). Adems, estos patgenos frecuentemente producen toxinas
para destruir el tejido vegetal antes de la colonizacin (Wit, 2007). Por su parte, los patgenos
bitrofos requieren de la planta viva para completar su ciclo de vida dependiendo de la planta
hospedera (Dangl y Jones, 2001).
De acuerdo a la interaccin con la planta hospedera se puede diferenciar entre patgenos
avirulentos y virulentos. Se conoce como patgeno avirulento aquel que presenta una interaccin
incompatible (no enfermedad) con una planta resistente, mientras que los patgenos virulentos
establecen una relacin compatible que se manifiesta con sntomas de enfermedad en el
hospedero susceptible (Flor, 1971; Keen, 1990; Agrios, 1997).
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Una especie vegetal susceptible a una especie o subespecie de un patgeno se denomina
hospedero de este parsito (Zimmerli et al., 2004).
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INTRODUCCIN
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INTRODUCCIN
En las plantas, la MCP es esencial para el desarrollo y la sobrevivencia (Greenberg, 1996). Por
ejemplo, durante el desarrollo de plantas monocotiledneas las clulas de la aleurona, forman un
tejido que secreta hidrolasas para digerir al endospermo y alimentar el embrin. Estas clulas
resultan innecesarias despus del desarrollo embrionario y mueren cuando la germinacin se ha
completado (Pennell et al., 1997). Por otro lado, la senescencia que se presenta como la fase final
del desarrollo vegetativo tambin es un proceso de MCP que involucra vas de sealizacin
coordinadas (Pennell et al., 1997). La senescencia est asociada a niveles decrecientes de
fitohormonas que estn naturalmente presentes en las plantas como reguladores de crecimiento y
desarrollo. Aunque an no se conocen con certeza los cambios bioqumicos que se presentan
durante el proceso de senescencia, se sabe que hay alteraciones importantes a nivel del
cloroplasto, en donde se modifican los grana (Nooden, 2004). Uno de los ejemplos ms conocidos
en plantas en el que se expresa la MCP, es en las respuestas de defensa contra patgenos. En
este caso, la MCP tiene como funcin restringir el avance del organismo invasor y se conoce como
Respuesta de Hipersensibilidad (HR) (Reape et al., 2008) como se detalla en una seccin
posterior.
El estudio de la MCP comenz en 1972 cuando se introdujo el trmino de apoptosis que describa
el proceso de cada de los ptalos de las flores o las hojas de los rboles (Kerr et al., 1972).
Posteriormente, se reconoci la existencia de una serie de alteraciones tanto morfolgicas como
bioqumicas durante la apoptosis en animales, que comprenden encogimiento celular, prdida del
contacto celular de los tejidos, fragmentacin del ADN y la formacin de cuerpos apoptticos
(Gilchrist, 1998).
En contraste con la apoptosis en animales, en la MCP que ocurre en plantas no se ha podido
establecer una secuencia de eventos celulares y moleculares. Sin embargo, algunas respuestas
comunes que se presentan en las plantas durante la muerte celular son: desarreglo del
citoesqueleto, condensacin de la cromatina, fragmentacin del ADN y generacin de ERO (Balk
et al., 2003). Al final del proceso se presentan alteraciones tanto en el tonoplasto como en la
membrana plasmtica que conllevan a un colapso celular. La liberacin de enzimas hidrolticas
vacuolares determina un importante papel en la degradacin de componentes celulares (Nooden,
2004).
La necrosis, a diferencia de la MCP, es la muerte que se presenta tras la exposicin a compuestos
altamente txicos, estrs por intenso calor o fro o heridas traumticas que causan un dao
inmediato en la membrana u organelos celulares (Gilchrist, 1998).
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INTRODUCCIN
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INTRODUCCIN
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INTRODUCCIN
El poder oxidante convierte a estas ERO en agentes potencialmente dainos para la clula. El O2.-
puede inactivar o alterar la actividad cataltica de enzimas que contengan sitios Fe-S. La forma
protonada, HO2, puede atravesar membranas biolgicas e iniciar oxidacin lipdica mediante la
extraccin de protones de cidos grasos poliinsaturados. En cuanto al H2O2, ste puede inactivar
enzimas mediante la oxidacin de los grupos tiol. El radical hidroxilo .OH, es altamente reactivo,
por lo cual las clulas poseen mecanismos para prevenir su formacin (Gechev et al., 2006).
En altas concentraciones, las ERO pueden provocar una oxidacin no controlada de diversas
estructuras celulares como son: DNA, protenas y lpidos membranales. Sin embargo, debido a
que en las plantas se producen continuamente estas especies como producto normal del
metabolismo aerbico, se cuenta con mecanismos antioxidantes y de detoxificacin para mantener
un balance celular inocuo de xido-reduccin (Smirnoff, 2005). Los diferentes sistemas de
detoxificacin de ERO incluyen: ascorbato peroxidasas, glutatin, superxido dismutasas y
catalasas que mantienen la homeostasis de ERO en diferentes compartimentos de la clula
vegetal (Torres et al., 2006).
Sin embargo, las ERO no slo son metabolitos txicos y agentes de dao celular, sino que tambin
cumplen una importante funcin como molculas sealizadoras que coordinan las respuestas
celulares ante numerosos tipos de estmulos ambientales y durante el desarrollo (Smirnoff, 2005).
La funcin de sealizacin se produce en respuesta a un estmulo que favorece la produccin de
ERO, generando un incremento de estas especies por arriba del nivel basal.
La accin de las ERO en la clula depender de su concentracin, de la rapidez con la que se
forman, de su sitio de produccin, de su accesibilidad a blancos de accin y de su manejo por los
sistemas celulares detoxificadores (Gechev et al., 2006).
Las plantas, as como los animales, producen ERO va enzimas de la clase de las oxidoreductasas
(Smirnoff, 2005).
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INTRODUCCIN
En los ltimos aos, se ha encontrado que las ERO desempean una funcin importante durante
las respuestas de defensa de las plantas contra el ataque de patgenos. Se han propuesto
numerosos mecanismos para tratar de elucidar cual es el papel que desempean. Actualmente
existen evidencias de que las ERO tienen un efecto antimicrobiano directo, que ocurre cuando
causan un dao al patgeno e inhabilitan la unin peroxidativa de las protenas de la pared celular
con los polisacridos del patgeno, impidiendo su invasin (Smirnoff, 2005). Asimismo, las ERO
pueden actuar como mensajeros para la activacin de genes de defensa (Thordal-Christensen et
al., 1997) y actan orquestando el establecimiento de la reaccin de defensa a travs del
fortalecimiento de la pared celular va el entrecruzamiento de protenas de la pared (Brisson et al.,
1994).
La doble mutante de Arabidopsis thaliana en los genes AtRBOHF y AtRBOHF, que codifican a
protenas ortlogas de la subunidad cataltica gp91phox de la NADPH oxidasa, produce menos ERO
y disminuye la muerte celular. Estos resultados evidencian la participacin de la NADPH oxidasa
en la respuesta contra patgenos (Torres et al., 2002).
Dependiendo de los diferentes sistemas planta-patgeno, la acumulacin de ERO puede tener
diferentes funciones. Por ejemplo, los patgenos necrtrofos producen ERO para inducir la muerte
celular en la planta y de esta manera facilitar la infeccin (Torres et al., 2006; Wang et al., 2007).
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INTRODUCCIN
A nivel del fotosistema II, se produce oxgeno singulete (1O2) como consecuencia del estado
excitado de la clorofila, especialmente debido a elevadas intensidades de luz (Gechev et al., 2006).
Los peroxisomas y glioxisomas son otras fuentes de ERO durante la foto-respiracin y la oxidacin
de cidos grasos, respectivamente (Gechev et al., 2006).
Por otra parte, la mitocondria es una fuente de formacin de O2.- y H2O2 durante la respiracin. Las
principales fuentes de ERO en la mitocondria son la NADH deshidrogenasa, el radical ubiquinona y
el complejo III (Moller, 2001). Aunque hay una menor produccin de ERO en mitocondrias que en
cloroplastos, las especies generadas en las mitocondrias cumplen funciones reguladoras en
mltiples procesos celulares incluyendo la adaptacin y la MCP (Fleury et al. 2002).
Las principales ERO detectadas en respuesta contra patgenos son el anin superxido y el
perxido de hidrgeno. El superxido es producido de manera caracterstica en el apoplasto por la
enzima NADPH oxidasa, localizada en la membrana plasmtica (Torres et al., 2005). La NADPH
oxidasa (NOX) es un complejo de enzimas membranales y citoslicas que cataliza la produccin
del ion superxido a travs de la subunidad enzimtica gp91phox que trasfiere electrones al oxgeno
molecular. En una reaccin subsecuente catalizada por la enzima superxido dismutasa, el in
superxido dismuta a perxido de hidrgeno.
Las peroxidasas asociadas a la pared celular tambin contribuyen a la produccin apoplstica de
ERO durante la interaccin planta-patgeno (Bolwell et al., 1995; Bindschedler, 2006; Choi, 2007).
La xantina oxidasa tambin es una enzima generadora de ERO durante el catabolismo de purinas.
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INTRODUCCIN
Figura 3. Cintica de la acumulacin de ERO en clulas vegetales despus de la inoculacin con patgenos
bacterianos virulentos y avirulentos (Torres, Biojournal; Adaptado de Orlandi et al., 1992).
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INTRODUCCIN
La segunda fase, o fase persistente, es considerada como propia de una interaccin incompatible
(Wojtaszek, 1997), en donde las clulas inoculadas con el patgeno avirulento presentan un
masivo y prolongado pico de acumulacin de ERO que corresponde a la fase II de la explosin
oxidativa. Como se observa en la Figura 3, esta segunda fase no se presenta para el patgeno
virulento, debido a que la fase II depende de la expresin de genes de avirulencia (AVR) (Lamb y
Dixon, 1997). Cabe destacar que los tiempos especficos en que se presentan las dos fases de
produccin de ERO dependen tanto de la planta de estudio como del patgeno.
2.7. Relacin de las ERO con mecanismos de sealizacin como el cido saliclico y las
MAP cinasas en la defensa contra patgenos.
La infeccin por patgenos como hongos y bacterias, provoca la acumulacin de cido benzoico
(AB) y cido saliclico (AS) con sus respectivos glucsidos conjugados (Hammond-Kosack y
Jones, 1996).
El AS es un inductor de resistencia a la enfermedad en diferentes especies y se acumula en tejidos
vegetales, induciendo la Respuesta Sistmica Adquirida (RSA) que permite a las plantas
responder ms rpida, integral y eficientemente al ataque de un patgeno (Hammond-Kosack y
Jones, 1996).
La RSA es un mecanismo de defensa inducida que se presenta en partes distales de la planta que
no fueron expuestas al patgeno (Wojtaszek, 1997) y debido a que las infecciones son eventos
locales, esta respuesta es relevante para establecer un sistema de inmunidad en toda la planta.
Se le atribuyen varios papeles tanto al AS como al AB en las respuestas de defensa de las plantas,
pues ambos compuestos son antimicrobianos y su aplicacin exgena induce la expresin de
genes PR (genes de protenas relacionadas a patgenos) (Uknes et al., 1992; Hammond-Kosack y
Jones, 1996).
Se ha documentado el sinergismo entre ERO y AS en la regulacin de la HR y en el
establecimiento de las respuestas sistmicas (Torres et al., 2006). Altas concentraciones de AS
inhiben la actividad de la catalasa (enzima que cataliza la descomposicin de H2O2 en H2O y O2),
lo que exacerba el estrs oxidativo (Hammond-Kosack y Jones, 1996).
Por otra parte, las MAP cinasas son enzimas citoslicas que participan en la transduccin de
seales en clulas eucariticas (Ichimura et al., 2006). Su funcin consiste en transducir estmulos
externos percibidos por receptores membranales mediante una serie de reacciones de fosforilacin
(Gechev y Hille, 2005).
Las cascadas de MAP cinasas son sistemas comunes de transduccin de seales, que se
conforman de tres elementos: la MAPKKK (cinasa de la cinasa de la MAPK), MAPKK (cinasa de la
MAPK) y la MAPK (MAPK); la secuencia indica el orden en que los componentes se van activando
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INTRODUCCIN
consecutivamente mediante las reacciones de fosforilacin (Zhang et al., 2001). Existen mltiples
miembros de cada uno de los tres elementos de estas cinasas en la clula que contribuyen de
manera especfica a la transduccin de seales (Zhang et al., 2001). En el genoma de Arabidopsis
se han identificado aproximadamente 20 MAPKs diferentes (Ichimura et al., 2002).
Adems de la produccin de ERO, durante la interaccin incompatible entre clulas vegetales y
patgenos, se activan las cascadas de MAP cinasas, sin embargo, no se sabe con certeza si la
activacin de MAPKs precede o se da de manera paralela a la produccin de H2O2 (Zhang et al.,
2001).
Se ha reportado la activacin de algunos componentes de cascadas de MAP cinasas en plantas
estimuladas con algunos evocadores fngicos y bacterianos. Asimismo, se sabe que la muerte
celular que se presenta durante la HR inducida tanto por patgenos avirulentos como por
evocadores puede ser bloqueada por la inhibicin de cinasas, lo que sugiere la participacin de
estas enzimas en el proceso. La activacin por patgenos de la cascada de MAPKs en tabaco
SIPK/Ntf4/WIPK, activa la produccin de ERO en cloroplastos en condiciones de iluminacin,
mientras que plantas que se mantienen en oscuridad no acumulan H2O2 despus de la activacin
de MAPK y presentan un fenotipo atenuado de muerte (Liu et al., 2007).
En el trabajo de Romeis et al. (1999), se demostr que la interaccin gen-por-gen activa a dos
MAPKs de Nicotiana tabacum: la SIPK (cinasa de protena inducida por cido saliclico) y la WIPK
(cinasa de protena inducida por herida).
3. ESFINGOLPIDOS EN PLANTAS.
Los esfingolpidos constituyen una clase de lpidos que se encuentra distribuida en membranas
celulares, lipoprotenas (particularmente de baja densidad) y otras estructuras lipdicas de las
clulas eucariticas (Sperling y Heinz, 2003).
Los esfingolpidos en mamferos desempean un papel importante en el desarrollo de los
organismos, ya que estn involucrados en procesos como la proliferacin celular, la diferenciacin
y la apoptosis (Dunn et al., 2004). En mamferos, se encuentran predominantemente esfingolpidos
como la esfingomielina, mientras que en levadura estn en mayor proporcin las
inositolfosforilceramidas. En algunos tejidos vegetales, las glucosilceramidas parecen ser los
esfingolpidos complejos que se encuentran en mayor proporcin (Lynch et al., 1993), aunque los
glicofosfoesfingolpidos tambin son abundantes (Dunn et al., 2004). Sin embargo, las
proporciones de estos dos tipos de esfingolpidos complejos han sido ms precisamente
cuantificados recientemente gracias al desarrollo de nuevos procedimientos de extraccin y
anlisis. De esta manera, en Arabidopsis se determin que las glucosilinositolfosforilceramidas
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INTRODUCCIN
(GIPC) son las especies predominantes, siendo su contenido de 64.4 % en hojas, en contraste con
el contenido de glucosilceramidas que representa un 30 % de los esfingolpidos totales (Markham
et al., 2006).
En plantas, el estudio de los esfingolpidos, en particular el de las bases de cadena larga (BCL)
que son las precursoras de los esfingolpidos complejos, ha cobrado mayor importancia debido a
que se han identificado como molculas sealizadoras en la respuesta de las plantas ante la
sequa y como reguladores de la MCP (Ng et.al., 2001; Shi et al., 2007).
Los precursores metablicos de la sntesis de los esfingolpidos son las BCL o bases esfingoideas,
cuyas estructuras constan de largas cadenas alqulicas de longitud variable (14-22 tomos de
+
carbono) y de una regin polar constituida por substituyentes OH (en el C1 y C3) y NH (en el C2).
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INTRODUCCIN
Las bases pueden presentar dobles enlaces en los carbonos en posicin 4 u 8 y algunas de ellas
contienen grupos hidroxilo en las posiciones 4 y grupos metilo en las posiciones -1 (iso), -2
(anti-iso) (Karlsson, 1970). Las BCL que predominan en las plantas tienen una cadena
hidrocarbonada de 18 tomos de carbono y difieren en el nmero de hidroxilaciones, y en el
nmero, posicin y configuracin estereoqumica de los dobles enlaces (Figura 5).
Entre las BCL presentes en mayor proporcin en plantas estn la esfinganina (dihidroesfingosina;
d18:0), 4-hidroxiesfinganina (fitoesfingosina; t18:0), (8E/Z)-4-hidroxi-8-esfingeninas (t18:18), (E/Z)-
esfing-8-enina (d18:18), (4E, 8E/Z)-esfinga-4,8-dienina (d18:24,8) (Lynch y Dunn, 2004).
Otras BCL con diferente nmero de carbonos estn presentes, pero en menores proporciones
(Sperling y Heinz, 2003). Para formar la ceramida, ms de 10 diferentes cidos grasos pueden ser
N-acilados a las diferentes BCL mencionadas anteriormente. Estos cidos grasos varan en la
longitud de la cadena de C14 a C26, siendo los cidos grasos saturados de C16, C20 y C24 los ms
abundantes (Sperling y Heinz, 2003). En Arabidopsis, alrededor del 90 % de los esfingolpidos
estn conformados por bases de BCL trihidroxiladas, y la fitoesfingosina (t18:0) representa el 65 %
de los esfingolpidos neutros (Markham et al., 2006).
Esfinganina d18:0
(dihidroesfingosina)
(E)-4-esfingenina d18:1(4E)
(esfingosina)
(E)-8-esfingenina d18:1(8E)
(Z)-8-esfingenina d18:1Z
(4E,8Z)-4,8-esfingadienina d18:24E,8Z
4-hidroxiesfinganina t18:0
(fitoesfingosina)
Figura 5. Estructuras de bases de cadena larga presentes en plantas (Sperling y Heinz, 2003).
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INTRODUCCIN
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INTRODUCCIN
Por otro lado, se ha demostrado la importancia de los esfingolpidos en las etapas de crecimiento
de plantas, ya que se ha probado que la supresin parcial de gen AtLCB1 por RNAi da como
resultado reduccin de tamao en las plantas y alteraciones en la morfologa (Chen et al., 2006).
En la doble mutante sbh1-1 sbh2-1 que no expresa los genes que codifican para las hidroxilasas
de BCL, la ausencia de BCL trihidroxiladas provoca una reduccin de tamao debida a defectos en
la divisin celular (Chen et al., 2008).
3-cetoesfinganina
NADPH
3-cetoesfinganina reductasa
Esfinganina cinasa
Esfinganina Esfinganina-1-fosfato
Acil-CoA
Esfinganina-N-aciltransferasa
(Ceramida sintasa)
Ceramida
Glucosilceramida sintasa
Inositolfosforilceramida sintasa
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INTRODUCCIN
Existen evidencias que sostienen este modelo, la primera se refiere a que la potencia con la cual la
FB1 inhibe a la ceramida sintasa es sensible a las concentraciones tanto de las bases esfingoideas
como del cido graso acil-CoA (Merrill et al., 1993). La segunda evidencia se refiere a que la
remocin de los cidos tricarballicos disminuye la potencia de la inhibicin (Humpf et al., 1998).
La tercera contempla que con la remocin de los cidos tricarballicos, la FB1 no es slo un
inhibidor, sino que tambin es sustrato para la acilacin por la ceramida sintasa (Humpf et al.,
1998).
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defensa, ya que se detectaron en las plantas eventos como deposicin de callosa, produccin de
ERO, acumulacin de fitoalexinas y la expresin del gen de defensa PR-1.
En particular, se estableci que la MCP inducida por la FB1 dependa de mltiples vas de
sealizacin como la del cido saliclico, el jasmonato y el etileno (Asai et al., 2000).
Independientemente, se saba que la FB1 al inhibir la ceramida sintasa de la va de sntesis de
novo de esfingolpidos provocaba una acumulacin de BCL (Abbas et al., 1994). Con todos estos
resultados se fue conociendo que la toxina poda estar activando respuestas de defensa. Por lo
tanto, resultaba interesante analizar si exista una relacin entre la acumulacin de BCL y un
parmetro de defensa particular como son las ERO.
En el 2007, se report que al ser expuesta la mutante Atfbr11-1 a la FB1 no se producan ERO y
no se presentaba una MCP (Shi et al., 2007). FBR11-1 codifica para la subunidad LCB1 de la SPT
de la va de sntesis de novo de esfingolpidos, por lo tanto, con la mutacin de este gen la planta
presentaba una atenuada formacin de BCL en respuesta a la exposicin a la toxina. En este
reporte se sugiri que la alteracin en la sntesis de BCL llevaba a la disminucin de produccin de
ERO y finalmente a evitar la muerte celular en la mutante fbr11-1 despus de la exposicin a la
FB1. Hasta este punto las observaciones indicaban que la acumulacin de BCL desencadenaba la
MCP. Adems, en este reporte tambin se dilucid la importancia del balance entre BCL
fosforiladas y no fosforiladas en el proceso de MCP. Los resultados apuntaron a que la
dihidroesfingosina-1-fosfato (dh-S1P) bloquea la generacin de ERO y la muerte celular inducida
por la forma no fosforilada de la BCL (dihidroesfingosina).
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ANTECEDENTES INMEDIATOS
Existen evidencias experimentales por parte de nuestro grupo de trabajo que demuestran la
relacin entre los esfingolpidos y las respuestas de defensa contra patgenos en tres especies de
plantas.
Sabemos que la exposicin in vivo de los embriones de maz a la fumonisina B1 y a la BCL
esfinganina es capaz de estimular la formacin del radical superxido en las condiciones
experimentales en las que los embriones de maz expresan respuestas de defensa contra
patgenos (Rodrguez, 2006). Tambin se sabe que cuando se presenta la Respuesta de
Hipersensibilidad en frijol, sta se acompaa de la acumulacin de la base de cadena larga
fitoesfingosina y concomitantemente a sta, la aparicin de inmunidad contra un patgeno
(Palacios, 2008). Paralelamente, los resultados en maz y frijol sugieren que las MAP cinasas que
se activan por BCL son las mismas inducidas por patgenos en otras especies vegetales
(Saucedo, 2007). Estos resultados junto con los obtenidos por el grupo del Dr. Plasencia que
muestran que la fumonisina B1 desencadena eventos de defensa contra patgenos como son la
prdida de la integridad del DNA genmico, la activacin de nucleasas especficas (de la Torre,
datos no publicados) y la elevacin de los niveles de cido saliclico (Rivas, 2004), son relevantes
para el entendimiento de los procesos de defensa contra patgenos que se presentan en las
plantas.
20
JUSTIFICACIN
IV. JUSTIFICACIN
Las evidencias tanto en la literatura como en nuestro grupo sealan una relacin entre los
esfingolpidos y las respuestas de defensa contra patgenos en plantas y adems postulan a las
especies reactivas de oxgeno como un intermediario entre estos dos parmetros. Por ello, es
necesario obtener ms informacin sobre la generacin de estas especies en el contexto de
defensa mediado por compuestos esfingoideos y as contribuir al entendimiento de cmo los
procesos de defensa contra patgenos pueden ser exitosos a travs de la utilizacin de lpidos
sealizadores que involucran la participacin de especies reactivas de oxgeno.
En este estudio se caracteriz con ms detalle la relacin entre la acumulacin de bases de
cadena larga, la formacin de especies reactivas de oxgeno y la muerte celular programada
involucrada en la respuesta de defensa contra patgenos.
21
JUSTIFICACIN
V. HIPTESIS
La acumulacin de BCL induce la produccin temprana de H2O2 tanto en una respuesta de
inmunidad producida ante un patgeno no-hospedero como en la de interaccin gen por gen.
VI. OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluar el papel de las BCL en la produccin in situ de H2O2 en especies de plantas en las que la
muerte celular programada se presenta como mecanismo de defensa contra patgenos.
Objetivos particulares
Evaluar la produccin temporal in situ de H2O2 de las plantas de Phaseolus vulgaris (frijol)
tras la exposicin a fumonisina B1 (FB1) y al patgeno no hospedero Pseudomonas
syringae DC3000 avrRPM1.
Evaluar la produccin in situ de H2O2 en lneas de Arabidopsis thaliana modificadas
genticamente que expresan menores niveles de BCL, tras la exposicin a la cepas
virulenta y avirulenta de Pseudomonas syringae.
Evaluar la produccin in situ de H2O2, tras la exposicin a la cepas virulenta y avirulenta de
Pseudomonas syringae, en la mutante nula de A. thaliana Atmpk6.
Determinar los niveles de BCL en plntulas de A. thaliana (genotipo silvestre Col-0 y
Atlcb2a-1) con y sin tratamiento con FB1 por HPLC/ESI-MS/MS.
Evaluar la produccin in situ de H2O2 en plntulas de A. thaliana (genotipo silvestre Col-0 y
Atlcb2a-1) con y sin tratamiento con FB1.
Determinar la localizacin subcelular del H2O2 en algunas de las condiciones estudiadas
22
MATERIALES Y MTODOS
I. MATERIALES Y MTODOS
1. Material biolgico.
Diferentes tejidos de dos especies vegetales fueron utilizadas en este estudio: hojas adultas de
Phaseolus vulgaris var. Canario y hojas adultas y plntulas de Arabidopsis thaliana (Figura 8).
A B C
Figura 8. Especies vegetales usadas en este estudio. A, Hoja adulta de Phaseolus vulgaris var.
Canario. B, Hojas de Arabidopsis thaliana de 10 semanas de edad. C, Plntulas de Arabidopsis
thaliana de 3 semanas de edad.
De la especie Arabidopsis thaliana, se emplearon cuatro lneas: una que es la lnea silvestre
(ecotipo Col-0), y otras tres lneas genticamente modificadas de la silvestre: lneas Atlcb2a-1,
Atlcb2b-hp/Atlcb2a y Atmpk6. Estas lneas de Arabidopsis thaliana expresan defectos en la va de
sntesis de esfingolpidos y en la expresin de MAP cinasas (Tabla 1). En el caso de la lnea
Atlcb2a-1, se trata de una mutante en el gen LCB2A, que codifica para la subunidad LCB2A de la
serina palmitoiltransferasa (SPT). La SPT es la enzima que cataliza la primera reaccin de la va
de sntesis de esfingolpidos en plantas (Tamura et al., 2001). En esta lnea, el gen LCB2A ha
sufrido una interrupcin a partir de la insercin de un transposn, dando un gen inactivo que no se
transcribe y que por lo tanto no produce la protena. Sin embargo, en esta lnea, la SPT es an
activa, ya que las funciones de la subunidad LCB2A, que ya no est producida a partir del gen
LCB2A, son suplidas por la subunidad LCB2B, cuyo gen est intacto. La lnea Atlcb2b-hp/Atlcb2a,
se gener a partir de la lnea Atlcb2a, slo que esta lnea adicionalmente tiene la construccin de
una horquilla inducible de RNA para que se aparee con el transcrito del gen LCB2B, anulando as
su funcin de ser traducido a la protena correspondiente. La expresin de esta horquilla
corresponde a un diseo molecular que es inducible por exposicin a la metoxifenozida (MTF).
Este compuesto es el principio activo del insecticida Intrepid, mismo que se aplica por aspersin a
las plantas para que as se induzca la formacin de la horquilla de RNA y con ello, quede tambin
23
MATERIALES Y MTODOS
suprimida la expresin del gen de la subunidad LCB2B (Dietrich, et al., 2008). En el caso de la
lnea Atmpk6, el gen correspondiente a la protena MAP cinasa 6 se ha silenciado por un RNA de
interferencia, de manera que esta lnea no expresa a esta protena (Tabla 1).
Homciga de la lnea de
Niveles normales de
Atlcb2a-1 insercin de T-DNA Salk- LCB2A
esfingolpidos complejos
061472
- Metoxifenozida
LCB2A Niveles normales de
esfingolpidos complejos
Homciga de la mutante + Metoxifenozida
Atlcb2b-hp/Atlcb2a Atlcb2a transformada con la Disminucin en la sntesis
construccin lcb2b-hairpin LCB2A de esfingolpidos. (A los 7
LCB2B post-induccin las BCL se
reducen 36 %)
(Dietrich et al., 2008)
Niveles normales de BCL
Atmpk6 SALK-127507-35.X MPK6
Niveles nulos de AtMPK6
24
MATERIALES Y MTODOS
25
MATERIALES Y MTODOS
4.1. Infiltracin de las hojas de Frijol con MgCl2, FB1 y el patgeno no hospedero (Pst
DC3000 avrRPM1).
Se tomaron plantas de frijol (Phaseolus vulgaris) de 4 a 5 semanas de edad que tuvieran de 3 a 4
trifolios totalmente extendidos con un color verde homogneo y apariencia sana. Para cada
condicin de estudio se seleccionaron dos trifolios provenientes de diferentes plantas y se
realizaron cuatro infiltraciones por hoja.
Reactivos
Solucin de MgCl2 10 mM estril
Solucin de FB1 (Sigma Chemical Co, St Louis, MO) 10 M disuelta en agua estril.
Suspensin de bacterias. Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000 avrRPM1 (Pst DC3000
avrRPM1) 1 x 108 UFC/mL.
26
MATERIALES Y MTODOS
Procedimiento
1. Se limpi la superficie de las hojas a infiltrar.
2. Se realizaron las infiltraciones con jeringas de plstico de 1 mL sin aguja. Para ello se aplic
presin con la jeringa sobre la hoja en la superficie abaxial infiltrando aproximadamente 20 L de
la solucin de estudio en los intersticios celulares del tejido. Se procur realizar las infiltraciones en
la parte central de la hoja evitando tocar las nervaduras principales. Para cada tratamiento se
realizaron cuatro infiltraciones por hoja, en cada hoja de dos trifolios de plantas independientes.
3. Se sec la superficie donde se infiltr para eliminar el excedente.
Fumonisina B1 (FB1) 10 M.
4.2. Infiltracin de las hojas adultas de Arabidopsis thaliana con MgCl2, FB1, el patgeno
avirulento (Pst DC3000 avrRPM1) y el patgeno virulento (Pst DC3000 vir).
1. Se seleccionaron plantas de A. thaliana de 10 semanas de edad con apariencia sana. Se
utilizaron diferentes lneas con y sin tratamiento con el inductor MTF, como se puede
apreciar en la Tabla 3. La induccin con la MTF se realiz asperjando el Intrepid disuelto
en agua estril (1/5000, v/v) en la superficie de todas las hojas. Cuatro das despus de la
induccin se realiz la infiltracin.
27
MATERIALES Y MTODOS
Tabla 3. Das post-induccin con MTF en las tres diferentes lneas de Arabidopsis
thaliana.
Das post-induccin
Lnea de Arabidopsis thaliana
con MTF
WT Col-0 0
Atlcb2a-1 4
Atlcb2b-hp/Atlcb2a 0
Atlcb2b-hp/Atlcb2a 4
Atmpk6 0
2. Se infiltraron las hojas en el envs con 20 L del tratamiento deseado (Tabla 4), utilizando una
jeringa de insulina graduada y sin aguja. Se aplic una ligera presin sobre la hoja de tal manera
que sta no se rompiera y para que la solucin penetrara en los intersticios intercelulares del
tejido. Se realiz un punto de infiltracin en la parte lateral de cada una de las hojas.
Tratamiento Concentracin
Control (MgCl2) 10 mM
3. Por tratamiento se recolectaron 3 hojas (cada una de una planta independiente) a los siguientes
tiempos post infiltracin: 0+ (justo despus de la infiltracin), 4, 12, 24, 48, 72, 96 h y 7 das.
4. Posteriormente se realiz la deteccin de perxido de hidrgeno in situ con DAB.
28
MATERIALES Y MTODOS
Reactivos
Solucin 3,3-diaminobencidina DAB 1 mg/mL (Sigma-Aldrich D5637-1G) pH 3.8. Ajustar el pH con
NaOH (utilizar este reactivo fresco).
Etanol grado industrial.
Medio de hidratacin Glicerol/H2O/cido actico (70/20/10 v/v/v).
Procedimiento
1. Se seleccionaron hojas o plntulas de A. thaliana o P. vulgaris que fueron tratadas de acuerdo a
las condiciones que se describieron anteriormente. Posteriormente:
a) Las hojas adultas de A. thaliana se cortaron e inmediatamente se introdujeron cada una en un
tubo eppendorf de 2 mL con la solucin de DAB, procurando que toda la hoja quedara inmersa en
la solucin. Se realiz este tratamiento durante 2 h.
b) Las plntulas de A. thaliana se transfirieron a una caja de Petri de 4 cm de dimetro y se
sumergieron totalmente en la solucin de DAB por 2 h.
29
MATERIALES Y MTODOS
HIPERTINCIN. Despus del tratamiento con DAB durante 2 h, las plntulas se transfirieron a un
vaso de precipitados con 20 mL de etanol + 1 mL de DAB. Se mantuvieron en estas condiciones
durante 48 h.
c) Los discos de P. vulgaris fueron sumergidos completamente en la solucin de DAB por 2 h.
2. Al terminar el tratamiento con DAB, los tejidos vegetales se sumergieron en etanol al 96 % en
ebullicin (74 C), hasta que quedaran completamente decolorados. Las plntulas se decoloraron
en aprox. 10 min, las hojas de Arabidopsis en 10 min y los discos de frijol en 20 min.
3. Una vez que los tejidos fueron decolorados completamente se sacaron del etanol y se colocaron
en una caja de petri con el medio de hidratacin. En la Figura 9 se observan los controles
negativos de los tejidos utilizados en este estudio, es decir, los tejidos que no tuvieron tratamiento
de infiltracin con los patgenos o la FB1 antes de la deteccin de H2O2 con DAB.
4. En todos los casos de exposicin a las diferentes condiciones experimentales, se llev un
registro fotogrfico de los tejidos tratados. Este registro de imgenes se realiz con una cmara
Moticam 352 acoplada a un microscopio de diseccin Zeigen. El procesamiento de las imgenes
se realiz con el programa Motic Images Plus 2.0 ML, Image J y iPhoto Plus.
A B C D E
Figura 9. Controles negativos de los tejidos vegetales utilizados en este trabajo. Se muestran los tejidos
vegetales utilizados en este trabajo despus del tratamiento de deteccin de H2O2 con DAB sin
infiltracin previa. (A) Disco de P. vulgaris, (B) Hoja silvestre Arabidopsis, (C) Hoja Atlcb2a-1, (D) Hoja
Atmpk6, (E) Hoja Atlbc2b-hp/Atlcb2a.
30
MATERIALES Y MTODOS
7. Deteccin y cuantificacin de bases de cadena larga por HPLC fase reversa acoplada a
espectrometra de masas con ionizacin por electroaspersin.
31
MATERIALES Y MTODOS
La deteccin y cuantificacin de bases de cadena larga por HPLC fase reversa acoplada a
espectrometra de masas con ionizacin por electroaspersin fue llevada a cabo en el Donald
Danforth Plant Science Center por el Dr. J. Markham segn el procedimiento descrito en Markham
et al. (2006) y Markham y Jaworsky (2007).
32
RESULTADOS
I. RESULTADOS
33
RESULTADOS
0+ h 1h 4h 8h 24 h 48 h 6d 11 d
MgCl2
FB1
DC3000 avrRPM1
Figura 10. Efecto de la FB1 y del patgeno Pst DC3000 avrRPM1 en la produccin de H2O2 en hojas de P. vulgaris. Para cada condicin se infiltraron
dos trifolios provenientes de plantas independientes y se realiz la infiltracin en cuatro puntos por hoja con MgCl2 10 mM como control, FB1 10 M y Pst
8
DC3000 avrRpm1 1 x 10 UFC/mL. En los tiempos indicados se realiz la deteccin in situ de H2O2 con DAB en discos cortados de las hojas expuestas
a los tratamientos. Se muestra un resultado representativo de 16 discos analizados en 2 experimentos independientes. Todas las imgenes de los
discos decolorados fueron contrastadas por igual al 0.05 % con el programa Image J.
34
RESULTADOS
En las fotografas que corresponden al fenotipo de cada condicin se puede observar que al tiempo
de 0+hpi la zona del tejido recin infiltrado con la FB1 se present translcida y posteriormente el
tejido no mostr dao evidente hasta las 48 hpi, cuando se observ muerte celular en el contorno de
la zona infiltrada. En los tiempos de 6 y 11 dpi se observ una zona necrtica localizada y restringida
al sitio de infiltracin con la FB1 y que coincidi con el rea de tincin positiva al DAB.
Con respecto a lo ocurrido con la infiltracin del patgeno no hospedero P. syringae DC3000
avrRPM1, en la Figura 10 se muestra la presencia de H2O2 en el rea del tejido que fue daada al
momento de la infiltracin con la jeringa. Al tiempo de 1 hpi, la formacin del precipitado en la zona de
infiltracin se redujo, mientras que en los tiempos de 4, 8 y 24 hpi se detect la formacin del
precipitado, que corresponde a la presencia de H2O2 en la zona que fue infiltrada con el patgeno. De
manera ms evidente, a tiempos largos de 48 hpi, 6 y 11 dpi se detect la tincin positiva al DAB
justamente en la zona que corresponda a la lesin. En las fotografas que presentan el fenotipo a los
diferentes tiempos de tratamiento con la bacteria se puede observar que inicialmente la zona del
disco recin infiltrada se present translcida y que despus de 1 hpi el tejido se recuper y no
mostr seal de dao en los tiempos posteriores de 4 y 8 hpi. A las 24 hpi con el patgeno, se
observ una lesin en el tejido y la tincin correspondiente a la formacin de H2O2 en la zona daada.
A los tiempos largos de 48 hpi, 6 y 11 dpi, donde la tincin con DAB fue muy intensa, se observ
muerte celular localizada en los sitios de infiltracin en los discos de las hojas.
Al comparar el fenotipo con ambos tratamientos se encontraron similitudes hasta las 8 h, pues a las
24 h se observ una lesin causada por la inoculacin del patgeno y no por la FB1. Al tiempo de 48
h aunque la lesin fue evidente con el tratamiento de FB1, la que present el disco inoculado con el
patgeno fue una muerte ms avanzada que persiste en los tiempos posteriores. A los 6 y 11 d la
progresin de la lesin fue similar para ambos tratamientos.
En cuanto a la generacin de H2O2, tambin se encontraron comportamientos semejantes. En los
tiempos iniciales de 0+ y 1 hpi, los discos infiltrados con ambos tratamientos se comportaron igual
que el control (MgCl2). Posteriormente, en los tiempos de 4, 8 y 24 hpi la generacin de H2O2 en los
discos expuestos a la FB1 fue menor que con la infeccin bacteriana a estos mismos tiempos Sin
embargo, a partir de las 48 hpi la magnitud de la tincin fue semejante y la zona teida se present
consistentemente en el rea afectada por los tratamientos.
35
RESULTADOS
36
RESULTADOS
MgCl2 DC3000 avrRpm1 DC3000 vir MgCl2 DC3000 avrRpm1 DC3000 vir
48 h
0h+
72 h
4h
12 h 96 h
7d
24 h
Figura 11. Efecto del patgeno avirulento (Pst DC3000 avrRPM1) y del patgeno
virulento (Pst DC3000 vir) en la produccin de H2O2 en hojas de A. thaliana
silvestres (Col-0). Todas las imgenes de la tincin con DAB fueron contrastadas
por igual al 0.05 % con el programa Image J. 37
RESULTADOS
En los tiempos de 48, 72 y 96 hpi las hojas con el tratamiento control mostraron una apariencia fsica
sana, en contraste, se apreci una lesin en el rea afectada tanto por el patgeno avirulento como
con el virulento. Esta lesin se intensific gradualmente en transcurso de estos tiempos largos
analizados hasta llegar al tiempo final estudiado de 7 dpi, cuando se observ un rea de muerte del
tejido vegetal en el tratamiento con ambos patgenos. En los tiempos de 48, 72 y 96 hpi, una intensa
tincin en presencia de DAB se detect consistentemente en la zona que present muerte. En el
tiempo correspondiente a los 7dpi ya no se realiz la tincin con DAB porque nuestro inters era ver
la evolucin de la lesin causada por los patgenos.
Los mismos tratamientos (MgCl2, el patgeno avirulento Pst DC3000 avrRPM1 o el patgeno virulento
Pst DC3000 vir) fueron aplicados en hojas de las mutantes Atlcb2a-1 y Atlcb2b-hp/Atlcb2a con y sin
exposicin a la MTF, mostrndose los resultados en la Figura 12. No se muestran los resultados
obtenidos con la lnea Atlcb2a-hp/Atlcb2a sin MTF, debido a que se observ el mismo
comportamiento que en la otra lnea control, la Atlcb2a-1 con MTF. Ambas condiciones fueron los
controles del tratamiento de la lnea Atlcb2a-hp/Atlcb2a con MTF.
En todos los tratamientos explorados al tiempo inicial de 0+hpi, se observ que todas las hojas de la
mutante Atlcb2a-1 y Atlcb2b-hp/Atlcb2a a las que se les aadi el inductor del silenciamiento del gen
LCB2B, presentaban una apariencia sana y sin acumulacin de H2O2, a excepcin de una ligera
tincin en la hoja infiltrada con el patgeno avirulento en la mutante Atlcb2b-hp/Atlcb2a +MTF.
En un tiempo posterior de 4 hpi, en las lneas control Atlcb2a-1 +MTF y Atlcb2a-hp/Atlcb2 -MTF no se
detect ninguna lesin en las hojas control ni en las expuestas a los patgenos. Sin embargo, la
tincin del H2O2 en la zona de infiltracin slo fue evidente en la condicin de infiltracin con el
patgeno avirulento a este tiempo.
En cuanto a la mutante Atlcb2a-hp/Atlcb2 inducida con MTF, a las 4 hpi las hojas infiltradas con el
patgeno avirulento presentaron una notable prdida de turgencia en contraste con las hojas control y
las infectadas con el patgeno virulento. Para este tiempo no se present la formacin del precipitado
del H2O2 en el tratamiento control y con la exposicin al patgeno virulento; sin embargo, despus de
la exposicin al DAB, la hoja tratada con el patgeno avirulento mostr tincin en una zona ms
extensa al de la infiltracin.
A las 12 hpi, la mutante Atlcb2a-1 continu mostrando produccin de H2O2 tras la infiltracin del
patgeno avirulento an y cuando no se observaba una lesin fsica en la hoja ni con este patgeno
ni con MgCl2 o el patgeno virulento. En contraste, la lnea Atlcb2a-hp/Atlcb2 inducida, a las 12 hpi
present lesiones generalizadas en toda la hoja despus del tratamiento con el patgeno avirulento.
En esta condicin se observ una produccin de H2O2 en algunas zonas a lo largo de la nervadura
central. A este tiempo (12 hpi) la hoja infiltrada con el patgeno virulento mostr una lesin lejana a la
zona de infiltracin acompaada de tincin. Posteriormente, al tiempo de 24 hpi, en la lnea Atlcb2a-1
38
RESULTADOS
Atlcb2a-1 Atlcb2b hp/Atlcb2a+MTF
MgCl2 DC3000 avrRPM1 DC3000 vir
MgCl2 DC3000avrRPM1 DC3000vir
0+ h
0+ h
4h
4h
12 h
12 h
24 h
24 h
39
RESULTADOS
48 h
48 h
72 h
72 h
Figura 12. Efecto del patgeno avirulento (Pst DC3000 avrRPM1) y del
patgeno virulento (Pst DC3000 vir) en la produccin de H2O2 de hojas
mutantes Atlcb2a-1 y Atlcb2b-hp/Atlcb2a. Despus de 4 das de
exposicin a la MTF las lneas Atlcb2a-1 y Atlcb2b hp/Atlcb2a fueron
infiltradas con MgCl2 como control, Pst DC3000 avr RPM1 y Pst
DC3000 vir. En los tiempos indicados se realiz la deteccin de H2O2
con DAB. Todas las imgenes de la tincin con DAB fueron
contrastadas por igual con un 0.05 % con el programa Image J.
96 h
7d
40
RESULTADOS
el tratamiento con el patgeno avirulento provoc una lesin y esta misma zona present tincin
despus del tratamiento con DAB.
La mutante inducida Atlcb2a-hp/Atlcb2 que fue infiltrada con el patgeno avirulento mostr, a las 24
hpi, prdida de turgencia y muerte celular en la zona superior de la hoja y despus de la reaccin con
DAB, se present tincin en el rea que fenotpicamente mostr ms dao.
Las hojas de Atlcb2a-1 tratadas con MTF como control y las de Atlcb2a-hp/Atlcb2 sin MTF que
fueron infiltradas con los patgenos avirulento y virulento presentaron un comportamiento similar en
los tiempos de 48, 72 y 96 hpi, cuando se pudo observar la progresin de la muerte del tejido debido
a los tratamientos con los patgenos (se muestran slo los resultados para la lnea Atlcb2a-1). A
estos tiempos, la tincin con DAB revel que hubo presencia de H2O2 en la zona que corresponde a
la muerte del tejido. En las fotografas del tiempo de 7 dpi se muestran solamente los fenotipos de las
hojas infiltradas para ver el avance de la lesin causada tanto por el patgeno avirulento como por el
virulento. En todos estos tiempos, las hojas de las mismas lneas pero infiltradas con MgCl2
permanecieron ntegras fenotpicamente. Por otra parte, en cuanto a la lnea Atlcb2b-hp/Atlcb2
inducida, a las 48 hpi, el control infiltrado con MgCl2 s mostr lesiones, la hoja tratada con el
patgeno avirulento manifest una prdida clara de turgencia y el tratamiento con el patgeno
virulento desencaden clorosis generalizada en prcticamente toda la hoja. A este tiempo, despus
de la tincin con DAB, la hoja con el tratamiento de MgCl2 present tincin en algunas zonas. En
contraste, las hojas tratadas con los patgenos se observaron totalmente teidas. El ltimo tiempo
registrado fenotpicamente para esta mutante fue el de 72 hpi, ya que a este tiempo fue evidente la
muerte del tejido despus del tratamiento con los patgenos, y no se realiz la deteccin de perxido
a este tiempo porque las hojas presentaron un dao muy avanzado.
La Figura 13 se presentan los resultados de los experimentos realizados en la lnea Atmpk6. Es
posible observar que el estado inicial de las hojas justo despus de la infiltracin (0+h) de MgCl2, o de
los patgenos avirulento o virulento fue muy similar, ya que no hubo signos de lesin o de tincin con
DAB. A las 4 hpi, no se detect lesin en ninguna de las hojas con los tratamientos. Sin embargo, en
la hoja expuesta al patgeno avirulento se desencaden la produccin de H2O2, que se observ como
una tincin justo en la zona de infiltracin. A las 12 hpi fue evidente una ligera lesin en la hoja
infiltrada con el patgeno avirulento, y esta misma zona present el precipitado caf-rojizo. A las 24
hpi la hoja tratada con el patgeno avirulento mostr una lesin acompaada de tincin de H2O2. A
este tiempo, se detect una ligera coloracin despus de la tincin con DAB, en la hoja tratada con el
patgeno virulento sin que sta presentara lesin fenotpica. En un siguiente tiempo de 48 hpi fue
muy clara la zona de clorosis en el tejido infiltrado con el patgeno avirulento y esta misma zona
present una intensa coloracin despus del tratamiento de deteccin de H2O2. A este tiempo el
41
RESULTADOS
MgC l2 DC3000 avrRPM1 DC3000 vir MgCl2 DC3000 avrRPM1 DC3000 vir
0h
48 h
4h
72 h
12 h
96 h
7d
24 h
Figura 13. Efecto del patgeno avirulento (Pst DC3000 avrRPM1) y del
patgeno virulento (Pst DC3000 vir) en la produccin de H2O2 de hojas de la
mutante Atmpk6. Todas las imgenes de la tincin con DAB fueron
contrastadas por igual con un 0.05 % con el programa Image J. 42
RESULTADOS
patgeno virulento desencaden una tincin positiva al DAB en la zona que fenotpicamente
present prdida de turgencia y una coloracin ms oscura.
A las 72 hpi con ambos patgenos por separado, se hizo evidente en la regin foliar la clorosis y
presencia de tincin positiva de DAB. A las 96 hpi, el fenotipo de la hoja infectada con el patgeno
avirulento se observ con clorosis en la zona de infiltracin mientas que la hoja infiltrada con el
patgeno virulento present una extensa y progresiva zona de muerte celular. De nueva cuenta,
las zonas que se presentaron afectadas fueron teidas con el DAB.
En el tiempo final de 7 dpi solo se presentan las imgenes correspondientes al fenotipo ya que se
observ una muerte celular muy avanzada en los tratamientos con los patgenos.
43
RESULTADOS
WT Atlcb2a-1
72 h
6d
C FB1 C FB1
Figura 14. Efecto de la FB1 en la produccin de H2O2 en hojas de A. thaliana (silvestres y Atlcb2a-1). Hojas
de plantas silvestres y Atlcb2a-1 fueron infiltradas con H2O como control y FB1 10 M. La infiltracin se
realiz en la parte lateral izquierda de la hoja. Al tiempo de 72 h se realiz la deteccin de H2O2 mediante la
tincin con DAB. Se muestran tambin los fenotipos a los tiempos sealados. Las imgenes de la tincin con
DAB fueron contrastadas por igual al 0.05 % con el programa Image J.
A las 72 h de tratamiento con la FB1, en la mutante Atlcb2a-1 se observ que no hubo lesin en la
zona de infiltracin ni deteccin de H2O2. En esta mutante, despus de 6 d de tratamiento con la
FB1 la hoja mostr algunas zonas de muerte en el rea del tejido que fue infiltrado.
44
RESULTADOS
4. Deteccin y cuantificacin de bases de cadena larga por HPLC fase reversa acoplada a
espectrometra de masas con ionizacin por electroaspersin.
Con el objeto de asociar los niveles de BCL con la formacin in situ de H2O2 en un sistema en el
que se facilitara la identificacin y cuantificacin de las BCL, se estableci un sistema de plntulas
de A. thaliana expuestas a la FB1. Las plntulas utilizadas en este estudio fueron las silvestres
(ecotipo Col-0) y las de la lnea Atlcb2a-1, una mutante en el gen LCB2A, que codifica para una
subunidad de la SPT. La cuantificacin de BCL libres se realiz en extractos obtenidos de 5 lotes
independientes de plntulas de A. thaliana silvestres (Col-0) y mutantes Atlcb2a-1 con y sin
exposicin a FB110 M a diferentes tiempos. En el anlisis por HPLC/ESI-MS/MS se cuantificaron
en total diez BCL: esfinganina (d18:0), esfingosina (d18:1), esfingadienina (d18:2), fitoesfingosina
(hidroxiesfinganina) (t18:0), hidroxiesfingenina (t18:1) y sus derivados fosforilados respectivos
(d18:0-P; d18:1-P; d18:2-P; t18:0-P; t18:1-P). En la Figura 15 se muestran solamente los perfiles
de acumulacin de las BCL d18:0, t18:0 y sus derivados fosforilados (d18:0-P y t18.0-P), ya que
estas especies presentaron las acumulaciones ms significativas tras la exposicin a la FB1.
De acuerdo a lo que se presenta en la Figura 15A y en la Tabla 4, la acumulacin de la d18:0 se
detect desde la primera hora de tratamiento de las plntulas con la FB1 en las dos lneas
analizadas (2.1 veces en la silvestre y 1.5 veces en la lnea Atlcb2a-1) y continu con un patrn
creciente, mostrando la mxima acumulacin en el ltimo tiempo analizado (72 h).
45
RESULTADOS
Sin embargo, a partir de las 4 h de tratamiento con la toxina, la acumulacin de esta BCL fue ms
evidente en las plntulas silvestres en comparacin a lo ocurrido en la lnea mutante Atlcb2a-1.
Como se muestra en la Tabla 4, en el tiempo de 4 h, el incremento de la esfinganina en las plantas
silvestres fue de 12.1 veces mientras que para la mutante Atlcb2a-1 fue de 1.1 veces. La
acumulacin fue aumentando claramente pero fue hasta las 72 h, cuando el incremento de
esfinganina detectado fue muy notable, siendo de 346.8 veces con respecto al control en el caso
de las plntulas silvestres, y de 56.7 veces en el caso de la Atlcb2a-1.
En cuanto a la d18:0-P (Figura 15B) la temporalidad de la acumulacin de esta BCL en presencia
de la FB1, que con respecto a sus controles, sigui un patrn similar a lo ocurrido con la d18:0. Sin
embargo, el derivado fosforilado alcanz, a partir de las 4 h, niveles de acumulacin mayores que
para la d18:0 y para las otras especies analizadas, siendo las acumulaciones de 36.5, 184, 310.3
veces para la lnea silvestre a los tiempos de 4, 8 y 12 h, respectivamente. En contraste con los
resultados obtenidos en las plntulas silvestres tratadas con la FB1, las plntulas mutantes que
recibieron el mismo tratamiento, mostraron acumulaciones de d18:0-P menores a las 4, 8 y 12 h
cuando se detectaron incrementos de 13.4, 4 y 63.9 veces con respecto al control. La mxima
acumulacin de d18:0-P se present a las 72 h tanto para la silvestre (5776 veces) cmo para la
mutante Atlcb2a-1 (214 veces). Es importante destacar, como se observa en la Tabla 4, que de
todas las BCL analizadas, la d18:0-P fue la que present los mayores niveles de acumulacin a
partir de las 8 h para las plntulas silvestres y a partir de las 12 h en el caso de la lnea mutante
Atlcb2a-1. De igual manera, al comparar el contenido de t18:0 en las plntulas con y sin exposicin
a la FB1, se encontr que hubo acumulacin de esta BCL tanto en la silvestre como en la lnea
Atlcb2a-1 a partir de 1 h de tratamiento con la toxina. Como se puede observar en el panel C de la
Figura 15, la acumulacin de la t18:0 fue mayor en las plntulas silvestres expuestas a FB1 que en
las mutantes con este mismo tratamiento en todos los tiempos analizados.
Es importante mencionar que, como se observa en la grfica (Figura 15 Panel C), los valores
absolutos de contenido de t18:0 son casi de la misma magnitud a partir de las 4 h de tratamiento
con la toxina en ambos genotipos; a diferencia de lo que ocurre con la d18:0, en donde los
incrementos en el caso de las plantas silvestres son significativamente mayores. Al tomar en
cuenta los datos de la Tabla 4, se observa que los incrementos de t18:0 en las plntulas silvestres
fueron mayores al de las mutantes, ya que se alcanzaron valores de acumulacin de 31.5, 30.1 y
77.1 veces con respecto al control a los tiempos de a las 8, 12 y 72 h, respectivamente, para la
silvestre y en el caso de la mutante a estos mismos tiempos se obtuvieron valores de 8.9, 8.6 y
17.2 veces. El contenido de t18:0-P tanto en las plntulas silvestres como en las mutantes
expuestas a la FB1 fue muy similar desde la primera hora hasta el tiempo de 12 h mientras que a
46
RESULTADOS
A Esfinganina (d18:0) B Esfinganina fosfato (d18:0-P)
250
250
200 WT
200 WT
WT + FB1 WT + FB 1
150
150 Atlcb2a-1 Atlcb2a-1
Atlcb2a-1 + FB 1 100 Atlcb2a-1 + FB1
100
50
50
10 4
0.20
3 0.16
5 2 0.08
0.04
1 0.00
0 1
0 0
0 1 4 8 12 72 0 1 4 8 12 72
200 WT 200
WT + FB 1 WT
150 150 WT + FB1
Atlcb2a-1
Atlcb2a-1
Atlcb2a-1 + FB1 100
100 Atlcb2a-1 +FB 1
50
50
20
1
15
10 0
0 0
47
RESULTADOS
las 72 h la acumulacin fue mayor en las silvestres. De nueva cuenta, como se observa en la
Tabla 4, los incrementos referidos al control fueron mayores para el genotipo silvestre llegando a
una acumulacin mxima de 687.8 veces a las 72 h en contraste con 192.1 veces para el caso de
la mutante Atlcb2a-1.
A
WT Atlcb2a-1
0h
Figura 16A. Controles negativos de las plntulas de A. thaliana WT y Atlcb2a-1. Plntulas de 2-3
semanas de edad fueron teidas con DAB sin previa exposicin a la FB1, se muestran fenotipos
de cada condicin.
48
RESULTADOS
B
WT Atlcb2a-1
C FB1 C FB1
12 h
48 h
72 h
Figura 16B. Efecto de la FB1 en la produccin de H2O2 en plntulas de A. thaliana (silvestres y Atlcb2a-1).
Plntulas de 2 a 3 semanas de edad, de las lneas WT (Col-0) y Atlcb2a, se transfirieron a un medio con y
sin FB1 10 M. A las 12, 48 y 72 h de exposicin se realiz la deteccin de H2O2 por el mtodo de tincin con
DAB. Se muestra el fenotipo para cada condicin.
49
RESULTADOS
donde se observ tincin de las hojas. A este mismo tiempo de 48 h, la lnea mutante Atlcb2a-1
present un fenotipo de clorosis en algunas de las hojas de las plntulas tratadas con la FB1, y el
resultado despus de la tincin con DAB fue una ligera formacin de precipitado en algunas de las
hojas. A las 72 h se observ en las plntulas silvestres tratadas con la FB1 un fenotipo de clorosis
en las hojas y generacin de H2O2. Por otra parte, a este mismo tiempo en la mutante Atlcb2a-1
tambin se observ clorosis en algunas hojas y una ligera tincin de las hojas despus del
tratamiento de deteccin de H2O2. Con el afn de observar mejor las diferencias entre las plntulas
silvestres y Atlcb2a-1 tras el tratamiento con FB1, se procedi a realizar la tincin de H2O2
exponiendo las plntulas al reactivo DAB por ms tiempo.
WT Atlcb2a-1
C FB1 C FB1
48 h
72 h
Figura 17. Hipertincin con DAB para detectar el efecto de la FB1 en la produccin de H2O2 en plntulas
de A. thaliana (WT y Atlcb2a-1). Plntulas de 2 a 3 semanas de edad, de las lneas WT (Col-0) y
Atlcb2a, se transfirieron a un medio con y sin FB1 10 M. A las 48 y 72 h de exposicin se realiz la
deteccin de H2O2 por el mtodo de hipertincin con DAB.
50
RESULTADOS
Se trabaj de nuevo con los mismos tiempos analizados que en las condiciones normales de
tincin y de nueva cuenta no se encontraron diferencias en los tiempos iniciales. Sin embargo, en
los tiempos de 48 y 72 h, se detectaron con ms claridad las diferencias en la tincin con DAB
entre las plntulas silvestres y Atlcb2a-1 (Figura 17).
Con estas nuevas condiciones de tincin a las 48 y 72 h se observ que los controles, tanto de las
plntulas silvestres como las de la lnea Atlcb2a-1, no presentaron tincin en las hojas; sin
embargo, con esta tincin prolongada se tieron las races de estas plntulas. Despus del
tratamiento con FB1 en las plntulas silvestres se detect una coloracin homognea en las hojas
y races de estas plntulas, en ambos tiempos. En contraste, la mutante Atlcb2a-1 present
coloracin pero solamente en algunas de las hojas de las plntulas expuestas a la toxina.
A B C
D E F
Figura 18. Localizacin subcelular de H2O2 en hojas de A. thaliana. El H2O2 fue detectado con la tincin
con DAB en hojas de A. thaliana WT despus de los siguientes tratamientos: (A) 18 hpi MgCl2 10 mM,
8
(B) (C) (D) 18 hpi Pst avrRPM1 1 x 10 UFC/mL y (E) (F) 4 dpi FB1 10M.
51
RESULTADOS
A B C
Figura 19. Localizacin subcelular de H2O2 en hojas de P. vulgaris. El H2O2 fue detectado con la tincin con
DAB en hojas de P. vulgaris despus de los siguientes tratamientos: (A) 11 dpi MgCl2 10 mM, (B) (C) 11 dpi
FB1 10 M.
52
DISCUSIN
I. DISCUSIN
1. La FB y el patgeno no hospedero Pseudomonas syringae inducen en Phaseolus
vulgaris la produccin in situ de H2O2 con temporalidades semejantes y en ocasiones a
incrementos en BCL endgenas.
La FB1 induce respuestas de defensa contra patgenos que incluyen lesiones similares a las de
HR (Stone et al., 2000; Palacios, 2008). Debido a que la produccin de ERO tambin se presenta
como una de las primeras respuestas de defensa ante el ataque de patgenos (Bolwell and
Wojtaszek, 1997; Lamb and Dixon, 1997; Wojtaszek, 1997), se evalu en hojas de frijol si tanto el
patgeno Pst DC3000 (avrRPM1) como la FB1 inducan la formacin de H2O2 con un patrn
semejante, y si esta cintica estaba relacionada con el perfil de acumulacin temporal de BCL
detectada en presencia de la FB1 o del patgeno en esta misma especie vegetal (Palacios, 2008).
53
DISCUSIN
concluyeron que los aumentos tempranos de BCL eran la seal para inducir la produccin de ERO.
La cuantificacin de BCL usada por ese grupo fue mucho ms sensible (ESI-MS/MS) que la que se
utiliz en nuestro laboratorio (HPLC), por lo cual pudieron detectar incrementos ms grandes a
tiempos tempranos, identificando algunas BCL acumuladas a las 6 h despus del tratamiento con
FB1 como esfinganina, fitoesfingosina, esfinganina fosfato y fitoesfingosina fosfato, que
presentaron acumulaciones respecto al control de 162, 144, 77 y 12 veces, respectivamente.
Mientras que en el caso de frijol, los incrementos determinados fueron de 1.9 veces con respecto a
l control a las 0.5 y 1 hpi y 2.18 veces a las 4 hpi. Adems de diferencias en la sensibilidad de la
cuantificacin de BCL es posible que la magnitud de la acumulacin de BCL y su temporalidad
difieran ligeramente entre frijol y Arabidopsis por ser especies diferentes y diferentes estados de
desarrollo.
En reportes recientes en los que se ha puesto de manifiesto la asociacin BCL-defensa-MCP (HR),
las bases que se han visto acumuladas son varias especies libres que incluyen tanto a las formas
fosforiladas como a las no fosforiladas (Shi et al., 2007). A este respecto, es importante sealar
que se ha reportado que existen varias BCL que pueden actuar como sealizadores. Un ejemplo
es la participacin de la esfingosina-1-fosfato y la fitoesfingosina-1-fosfato en la regulacin de la
apertura de los estomas demostrado en Commelina communis y Arabidopsis thaliana (Ng et al.,
2001; Cursol et al., 2005).
Con respecto a la temporalidad entre la acumulacin de BCL y la generacin de ERO a tiempos
intermedios post-infiltracin, se determin la mxima acumulacin de fitoesfingosina (2.7 veces
con respecto al control) en el tiempo de 24 hpi, seguida de una disminucin a las 48 h.
Concomitantemente, se observ una intensa tincin positiva al DAB a las 24 y 48 hpi. El gran
aumento de las BCL podra llevar a una elevacin significativa de estas especies en membranas
intracelulares como las del cloroplasto y la mitocondria, perturbando en estas organelas funciones
membranales que generan ERO (Siskind, 2005; Siskind et al., 2005; Elrick et al., 2006). En este
caso, las BCL estaran participando ms que como sealizadoras, con una funcin de
desestructuracin membranal que ya sera propia de la fase ejecutora de muerte celular (Siskind,
2005; Siskind et al., 2005; Elrick et al., 2006). En apoyo a la propuesta anterior estn las
determinaciones del ndice Fotosinttico que revelaron una disminucin progresiva desde las 4
hasta las 48 hpi con la FB1 y el patgeno avirulento (Gavilanes y Zavaleta, no publicado). El
reporte de Shi et al. (2007) no da informacin sobre estos tiempos, ya que aunque determin BCL
a los tiempos de 1, 6, 12 y 24 h solamente detect ERO al tiempo de 6 h de exposicin a la FB1,
por lo cual no es posible comparar nuestros efectos con su trabajo. Sin embargo, es posible que a
54
DISCUSIN
estos tiempos intermedios aquellas pocas clulas que ya estn colapsadas puedan presentar una
tincin inespecfica (no reportada hasta nuestro conocimiento) dando una reaccin positiva al DAB.
55
DISCUSIN
provocaba la muerte celular. En dicho trabajo tambin se observ que la expresin de NbLCB2 se
induca tras la infeccin con el patgeno no hospedero Pseudomonas cichorii. Basndose en esta
evidencia y en las del trabajo presente, resulta razonable proponer que la biosntesis de
esfingolpidos es necesaria para desencadenar respuestas de defensa contra patgenos no
hospederos; y si bien el trabajo de Takahashi et al. (2009) no pudo correlacionar la manifestacin
de muerte con los niveles de BCL, pues no pudieron determinar estos compuestos, el trabajo de
Palacios (2008) logr establecer su cintica de acumulacin y los resultados de la determinacin
de H202 de esta tesis complementan la participacin de BCL en la defensa contra patgenos no
especficos de hospederos. Adems, estudios previos de nuestro laboratorio han evidenciado la
participacin de las BCL en respuestas de defensa y que han consistido en que a) plantas de frijol
infiltradas con FB1 presentaron resistencia al ataque de un patgeno (Palacios, 2008), b) cultivos
celulares de Arabidopsis thaliana mostraron una estimulacin en la formacin de 02.- y H2O2 ante la
exposicin a FB1 o a patgenos (Rodrguez, 2007) y c) una MAPK que participa en rutas de
sealizacin inducidas por patgenos es activada en presencia de FB1 (Saucedo, 2007). Los
resultados de las determinaciones de BCL y ERO que fueron realizadas por nuestro grupo de
trabajo, revelan eventos temporales secuenciales en cuanto a la acumulacin de BCL, la
produccin de H2O2 y la manifestacin de una muerte celular similar a la HR. En conjunto los
resultados apoyan la hiptesis de que la acumulacin de BCL induce la produccin de H2O2 y esta
conduce a una muerte celular manifestada en un contexto de inmunidad contra patgenos.
56
DISCUSIN
muy tempranos, casi inmediatos a la aparicin del estmulo, no pudo ser detectada debido a que
su intensidad es baja y la sensibilidad de la tcnica de formacin in situ de H2O2 no es alta.
A tiempos largos, iguales o posteriores a las 24 h, cuando fue evidente la muerte celular en el
tejido vegetal con el tratamiento tanto con el patgeno avirulento como el virulento, hubo una
generacin exacerbada de H2O2. En este caso, el H2O2 que se detect localizadamente con la
tincin puede estar relacionado con un fenmeno de estrs oxidativo que se desencadena para o
por la muerte celular que estn experimentando las clulas de la regin en colapso, misma de la
que pudieran ser responsables BCL endgenas acumuladas que perturban la estructura y la
funcin de organelas generadoras de ERO (mitocondrial, cloroplasto, peroxisomas). Otro de los
procesos que podra explicar esta aparicin de ERO sera la actividad de peroxidasas productoras
de H2O2 involucradas en la lignificacin de la pared celular, misma que puede preceder a la muerte
celular (Smirnoff, 2005). En este contexto, se puede afirmar que lo que se observ sobre la
formacin de H2O2 a los tiempos de 4 a 12 h en la lnea silvestre de Arabidopsis ilustra lo que se ha
reportado que ocurre tpicamente en la interaccin compatible y en la incompatible y que por lo
tanto, el modelo elegido de planta y patgenos es adecuado para recrear las interacciones entre
estos dos organismos y que constituye un sistema de referencia para comparar y analizar los
resultados con lneas mutantes en genes que inciden en los niveles celulares de BCL.
57
DISCUSIN
gen, por lo que estos resultados indican la implicacin de las BCL en la produccin de ERO
durante este tipo de interaccin.
Otro aspecto interesante es que en esta mutante Atlcb2b-hp/Atlcb2a, bajo condiciones de
silenciamiento se observ una aceleracin de la muerte celular, especialmente en las hojas que
fueron inoculadas con el patgeno avirulento, detectndose desde las 4 hpi la prdida de turgencia
en toda la hoja y un desarrollo rpido de la lesin hasta que a las 72 hpi se present la muerte en
toda la hoja. Estos son signos de que hay prdida de integridad membranal y prdida de solutos
intracelulares (Pike et al., 1998; 2005). El fenotipo temprano de muerte se hizo evidente en
comparacin con los controles infiltrados con MgCl2, o con el patgeno avirulento en las lneas
silvestre, Atlcb2a-1 o Atlcb2b-hp/ Atlcb2a sin induccin. Por esta razn, incluso en algunas de las
hojas infiltradas con el tratamiento control o a tiempos muy tempranos se present tincin con el
DAB en las zonas donde se observ fenotpicamente la muerte del tejido. Sin embargo, esta
tincin se present en toda la hoja y no coincidi con el sitio de infiltracin. Es presumible que en la
mutante silenciada las clulas estn experimentando un deterioro que las conduce a la muerte
celular debido a la progresiva deplecin de esfingolpidos complejos (Dietrich et al., 2008). La
seal del DAB en este caso puede deberse a un estrs oxidativo que se produce en el proceso de
muerte o bien a la generacin en estas circunstancias, de un compuesto que reaccione
inespecficamente con el DAB. Comparativamente a este resultado, la mutante acd11, que tiene
mutado el gen ACD11 codificante de una protena que transfiere esfingosina, presenta una
aceleracin de la MCP en respuesta al tratamiento con patgenos avirulentos (Brodersen et al.,
2002).
58
DISCUSIN
59
DISCUSIN
establecer cules son las BCL que se acumulaban y monitorear la cintica respectiva, ya que
como se mencion anteriormente, los resultados con frijol slo detectaban un nmero limitado de
BCL y slo cuando se incrementaban a muy altos niveles.
Debido a la complejidad estructural de los esfingolpidos, su deteccin requiere una extraccin
selectiva, una eficiente separacin cromatogrfica y un sistema sensible de deteccin, adems de
una forma confiable y poderosa de identificacin de los compuestos esfingoideos. De ah que en
este trabajo se recurri a la tcnica de HPLC en fase reversa acoplada a espectrometra de masas
con ionizacin por electroaspersin. Esta tcnica resulta muy sensible y especfica para la
medicin de estas especies lipdicas y con ella se han podido detectar y cuantificar 168
esfingolpidos de una muestra cruda de Arabidopsis thaliana (Markham y Jaworsky, 2007).
Asimismo, en nuestro sistema experimental resultaba indispensable identificar las especies
endgenas de BCL libres o fosforiladas que se acumulaban por efecto del tratamiento con la FB1
para poder evaluar su papel como molculas sealizadoras en la MCP. De ah que se hiciera un
diseo experimental que inclua el anlisis de los niveles de BCL tanto libres como fosforiladas en
plntulas de A. thaliana silvestres y mutantes en la subunidad LCB2A de la SPT (Atlcb2a-1). Estas
plntulas se expusieron a la FB1 y se incluyeron los controles respectivos.
Congruente con lo reportado por Shi et al. (2007) encontramos que desde la primera hora de
tratamiento con la toxina, se presentaban alteraciones en los niveles de la esfinganina,
fitoesfingosina y sus derivados fosforilados en las dos lneas analizadas. Si bien a este tiempo
inicial los cambios fueron menores que a tiempos posteriores, este resultado sugiere que a partir
de tiempos cortos se puede detectar la alteracin en la va de sntesis de esfingolpidos, traducida
como una acumulacin de BCL, y que estos compuestos esfingoideos tienen efectos
sealizadores para inducir reacciones posteriores como la generacin de ERO.
Considerando que la SPT es una enzima que consiste de dos subunidades: LCB1 y LCB2
(Hanada, 2003), la mutacin en el gen LCB2A altera la sntesis de esfingolpidos, sin embargo, en
la mutante an persiste la actividad de la protena gracias a la subunidad codificada por el gene
LCB2B, por lo tanto la va no se ve afectada totalmente y eso se refleja en los resultados
encontrados. Por ejemplo, al cuantificar la esfinganina y esfinganina fosfato en la mutante Atlcb2a-
1 encontramos una notable menor acumulacin en comparacin con lo que ocurri en la lnea
silvestre. Por ejemplo, en el caso particular de la esfinganina fosfato, que present la mayor
acumulacin en comparacin con las otras BCL, a las 72 horas de exposicin a la FB1, la
acumulacin para la lnea silvestre fue de 5775.6 veces con respecto al control, en contraste con
las 214.4 veces en la mutante Atlcb2a-1. A este respecto, trabajos publicados recientemente
colocan a las BCL fosforiladas como importantes molculas sealizadoras tanto en mamferos
60
DISCUSIN
como en plantas (Ng et al., 2001; Spiegel y Milstein, 2002; Coursol et al., 2005), por lo cual
resultaba interesante considerar que el aumento de las especies fosforiladas de BCL con respecto
a sus correspondientes no fosforiladas desde las 4 h de tratamiento con la toxina fueran en
particular las responsables de la sealizacin para la formacin de ERO y consecuentemente de la
muerte del tejido vegetal. Sin embargo, Shi et. al. (2007) proponen que las especies fosforiladas
son indispensables para mantener una homeostasis y para contener el efecto de las BCL no
fosforiladas, ya que a estas ltimas se les atribuye el efecto sealizador que desencadena la
progresin de la MCP. La explicacin que se ha dado ante la citotoxicidad de las BCL libres a altas
concentraciones, es que su exceso requiere que sean degradadas. Para ello, las BCL tienen que
ser fosforiladas por sus respectivas cinasas y posteriormente son descompuestas por accin de
una liasa que produce hexadecenal y fosfoetanolamina (Tsegaye et al., 2007). De esta manera, el
aumento en los niveles de las BCL fosforiladas contribuira, ms que a una sealizacin, a su
desvo hacia una ruta que las conduzca a su degradacin. La cintica de acumulacin de las BCL
obtenida en este sistema nos permiti relacionar su temporalidad con la produccin de H2O2.
Contrario a lo que Shi et al. (2007) reportaron, aunque muy escuetamente, en nuestro sistema de
plntulas no se pudo detectar el H2O2 que funciona como sealizador y que tendra que
presentarse a tiempos cortos (6 h segn Shi et al., 2007). Esto puede deberse a la tcnica
utilizada, ya que no tiene la sensibilidad necesaria para teir concentraciones pequeas de esta
ERO. Sin embargo, podemos decir que en este sistema de plntulas, la sealizacin va
acumulacin de BCL est activa, debido a que las plntulas tratadas con FB1 y que presentan la
mayor acumulacin determinada de BCL son las que tambin presentan ms indicios de muerte
celular y una mayor tincin positiva al DAB. Esta deteccin de H2O2 es congruente a lo que se
present en los otros dos sistemas de estudio, en donde lo que tenemos es una tincin en las
zonas en donde est en progreso el proceso de muerte celular. Relacionando estos resultados con
la cuantificacin de BCL podemos decir que el aumento masivo (12 y 72 h) de estas especies
esfingoideas est relacionado con la produccin de ERO en las clulas que quizs como parte de
del progreso de la muerte celular sufren un estrs oxidativo. No puede descartarse en este caso
tampoco, que las clulas en este estado crtico con las funciones vitales comprometidas, se
generen compuestos que no son H2O2 y que tienen una reaccin positiva con el DAB.
61
DISCUSIN
6. El H2O2 formado a tiempos intermedios por el tratamiento con el patgeno Pst DC3000
avrRPM1 se localiza en el cloroplasto.
Cuatro posibles fuentes celulares de generacin de H2O2 se han postulado principalmente como
parte de las respuestas de defensa contra patgenos relacionadas con la MCP en plantas: la
mitocondria (Moller, 2001), el cloroplasto (Moreno et al., 2005; Liu et al., 2007), la NADPH oxidasa
de la membrana plasmtica (Torres et al., 2002; Torres et al., 2005; Lherminier et al., 2009) y una
peroxidasa de la pared celular (Bolwell et al., 1999; Bindschedler et al., 2006; Choi et al., 2007). En
algunos casos, las evidencias experimentales que asocian alguna de estas fuentes con la MCP-
HR en defensa son muy claras, lo cual sugiere que hay ms de una fuente celular que genera
ERO y que su participacin en la MCP puede estar definida especficamente a ciertos tiempos y
adscrita a ciertos compartimentos subcelulares dependiendo del progreso de la infeccin y de los
mecanismos de transduccin inducidos por las seales producidas por el patgeno.
62
DISCUSIN
Los estudios de Torres et al. (2002) colocan a la NADPH oxidasa como una importante fuente de
ERO durante la interaccin incompatible. En cuanto a la temporalidad de este evento
recientemente se encontr a la NADPH oxidasa como principal enzima productora de ERO en los
primeros minutos despus de la elicitacin con criptogena en clulas de tabaco (Lherminier et al.,
2009).
En cuanto a la generacin de H2O2 inducida por BCL en la ruta conducente a la MCP, las fuentes
de ERO estn poco estudiadas. Las nicas evidencias que hay en la literatura de esta relacin son
el trabajo de Stone et al. (2000) y el de Shi et al. (2007). En el primero se sugiri la participacin de
la FB1 como evocador de respuestas de defensa, entre ellas la produccin de ERO, que fue
detectada como O2.- con la tincin con azul de tetrazolio; sin embargo, en este trabajo no se
atribuy a las BCL la produccin de ERO y tampoco se estudi la fuente de produccin de estas
especies. Por otra parte, el trabajo de Shi et al. (2007) en donde se detect tanto el O2.- como el
H2O2 despus de la exposicin de plntulas de Arabidopsis a la FB1 (atribuyendo este efecto a la
acumulacin de BCL), no present ninguna evidencia experimental sobre la posible fuente de
estas ERO.
En el anlisis microscpico de las regiones que presentaron la formacin del H202 precipitado con
DAB, identificamos que en Arabidopsis el H2O2 formado durante la interaccin incompatible se
sitaba en los cloroplastos a tiempos intermedios de la infeccin bacteriana (18 hpi). Estos
resultados concuerdan con los reportados por Liu et al. (2007) en donde encontraron que la
activacin de una MAPKK de Nicotiana tabacum, que a su vez activa a la SIPK y a la WIPK,
promueve la generacin de ERO en el cloroplasto. La SIPK es un ortlogo de la AtMPK6 que se
activa por FB1 (Saucedo, no publicado).
Este mismo anlisis, realizado tanto en el sistema de Arabidopsis como en el de frijol nos permiti
observar que el H2O2 que se detect a tiempos largos (48 h a 11 d) de exposicin a la FB1, se
localizaba en los espacios intercelulares, resultando plausible la explicacin de que a tiempos ms
largos donde es evidente una muerte celular avanzada en el tejido, la presencia del complejo
insoluble del DAB es debida a una reaccin inespecfica con componentes de la pared celular.
63
DISCUSIN
MAMPs H2O2
NADPH ox
SOD
O2.- H2O2
Cloroplasto
H2O2
PI, PII
BCL
O2.- Fotorrespiracin
CS
ERO
MAPK
MCP/HR
Defensa
Figura 20. Modelo de la relacin entre la acumulacin de BCL y la produccin de ERO en las respuestas de
inmunidad de las plantas. Se propone que el aumento de BCL inducido tanto por el patgeno no hospedero
(va MAMPs), por el patgeno avirulento (va interaccin gen por gen) y por la FB1 (por inhibicin de la
ceramida sintasa) desencadenan la produccin de ERO que conduce a la MCP que se presenta como HR
en la defensa contra patgenos. Entre las posibles fuentes de estas ERO se encuentran: la peroxidasa de la
pared celular, la NADPH oxidasa, y el cloroplasto. Sin embargo, otros sitios generadores posibles de ERO
son la mitocondria y el peroxisoma. (AvrRPM1, producto del gen de avirulencia del patgeno; BCL, bases de
cadena larga; CS, ceramida sintasa; ERO, especies reactivas de oxgeno; FB1, fumonisina B1; HR, respuesta
de hipersensibilidad; MAMPs, patrones moleculares asociados a microbios; MAPK, cinasa activada por
.-
mitgeno; MCP, muerte celular programada; NADPH ox, NADPH oxidasa; O2 , ion superoxido; PI,
fotosistema I; PII, fotosistema II; RPM1, producto del gen de resistencia de la plata; SOD, superxido
dismutasa).
64
CONCLUSIONES
I. CONCLUSIONES
Adems, hay una segunda etapa de formacin in situ de H2O2 a tiempos intermedios (24,
48 h) que est asociada a la elevacin masiva de BCL y que podra estar relacionada con
la perturbacin estructural de membranas de organelas productoras de ERO, como parte
del desarrollo de la muerte celular.
Conclusin General
65
PERSPECTIVAS
II. PERSPECTIVAS
Las siguientes perspectivas estn planteadas en funcin de conocer aspectos que no fueron
totalmente resueltos en el presente trabajo.
Corroborar la temporalidad de la formacin de ERO por BCL cuantificando las BCL (d18:0,
d18:0-P, t18:0, t18:0-P) en la mutante Atlcb2b-hp/Atlcb2a en ausencia y presencia de
inductor en un amplio curso de tiempo que incluya los posibles tiempos de formacin de
H2O2.
Establecer los perfiles de acumulacin de BCL tras la infiltracin del patgeno avirulento y
del virulento y relacionarlos con los tiempos en los que se detect el H2O2 en las hojas de
Arabidopsis silvestre y de las mutantes.
Determinar la formacin de H2O2 a tiempos cortos con una tcnica cuantitativa y sensible
en las plntulas silvestres y mutantes Altcb2a-1 expuestas a FB1.
Determinar la localizacin subcelular del H2O2 a todos los tiempos probados tanto con los
patgenos como con la FB1 en los modelos de frijol y de plantas adultas de Arabidopsis por
medio de anlisis microscpico de las regiones teidas con DAB.
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APNDICE
II. APNDICE
Ca(NO3)24H2O 4 mM MnCl24H2O 9 M
NH4H2PO4 1 mM H3BO3 46 M
MgSO47H2O 2 mM ZnSO4 7H2O 0.8 M
KNO3 6 mM CuSO4 5H2O 0.3 M
1mL/L de medio (1g/200 mL) Fe-EDTA* H2M6O4 H2O 0.1 M
pH final 5.2-5.5
2. Medios de cultivo para crecer Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 avrRPM1 y
Pseudomonas syringae DC3000 vir.
Medio B de King
Proteasa peptona (10 g/L)
K2HPO4 (1.5 g/L)
Glicerol (12 g/L)
Agar (15 g/L)
Para Pst DC3000 avrRPM1 agregar por cada 200 mL de medio B de King
200 L de Rifampicina (50 mg/mL)
200 L de Tetraciclina (20 mg/mL)
2 mL MgCl2 1 M
Para Pst DC3000 vir agregar por cada 200 mL de medio B de King
200 L de Rifampicina (50 mg/mL)
2 mL MgCl2 1 M
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