ECOLOGA MICROBIANA

DIVERSIDAD METABLICA Y ECOLOGA MICROBIANA

TEMA19. MTODOS DE LA
ECOLOGA MICROBIANA
 OBJETO DE ESTUDIO
MICROORGANISMOS AMBIENTE

POBLACIN GREMIO COMUNIDAD

MTODOS DE ESTUDIO DE LA ECOLOGA MICROBIANA

1.- RECOGIDA DE MUESTRAS MICROBIANAS REPRESENTATIVAS
2.- PROCESADO Y ANLISIS

1.- MUESTREO ADECUADO

CARACTERSTICAS A TENER EN CUENTA
- DIVERSIDAD DE MICROORGANISMOS
- DENSIDAD DE STOS EN EL AMBIENTE. EXISTENCIA DE MICROHABITAT

DIFERENTES MTODOS SEGN EL AMBIENTE

*SUELO - PALAS
- CILINDROS DE MUESTREO
- PORTAOBJETOS ENTERRADOS BAJA CONCENTRACIN DE
- REJILLAS DE MICROSC0PA ELECTRNICA MICROORGANISMOS.
- CAPILARES PLANOS.

*AGUA. DISPOSITIVOS DE CONTROL REMOTO.

*SEDIMENTOS - CONTROL REMOTO

- TOMA DIRECTA (SUMERGIBLES) FTES. HIDROTERMALES SUBMS.

*AIRE - PLACA DE PETRI ABIERTA ESPORAS FNGICAS

RECOGIDA Y - PORTAOBJETO CON FILM ADHESIVO
PROCESADO - CMARAS CON FILTROS (MUESTREADOR DE ANDERSEN)
SIMULTNEOS

*BIOLGICAS: A PARTIR DE FLUIDOS (SANGRE, LINFA, SAVIA), TEJIDOS INTERNOS, TEJS

SUPERFICIALES (FROTIS, LAVADO), PRODUCTOS DE EXCRECIN (MATERIAL FECAL).
 2.- PROCESADO Y ANLISIS
OBJETIVOS
IDENTIFICACIN DE LOS MICROORGANISMOS QUE FORMAN PARTE DE UN
AMBIENTE
DETERMINACIN DE SUS ACTIVIDADES METABLICAS Y LA IMPORTANCIA DE
STAS EN LA MODIFICACIN DEL AMBIENTE

TCNICAS DE CULTIVOS
1.- CULTIVOS DE ENRIQUECIMIENTO
AISLAMIENTO DE UN GRUPO DE MICROORGANISMOS MEDIANTE
EL ESTABLECIMIENTO DE CONDICIONES QUE PROPICIEN SU CRECIMIENTO Y DIFICULTEN
EL DESARROLLO DE OTROS QUE CONVIVEN EN EL MISMO MICROAMBIENTE
CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO DE ESPECIES FIJADORAS DE N2

AIRE
N2 O2

SUELO

COLONIAS DE
Azotobacter ALTO RIESGO DE SESGO EN CULTIVOS
SALES MINERALES MEDIO SIN NH4 DE ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO
AIRE
+ MANITOL (SIN NH4+, NO3- LQUIDO A PARTIR DE INCULOS
O NITRGENO ORGNICO)
NO DILUIDOS
SUELO SIN
CRECIMIENTO
MEDIO SIN NH4

SALES MINERALES COLONIAS DE BACTERIAS

+ MANITOL+ NH4+ NO FIJADORAS DE N2
MEDIO CON NH4

CONDICIONES DEL MICROORGANISMOS INCULO

CULTIVO ENRIQUECIDOS
AEROBIOSIS, LUZ, CO2 CIANOBACTERIAS TAPETE MICROBIANO DE
COMO FUENTE DE TERMFILAS FUENTES TERMALES
CARBONO, NO3- COMO
FUENTE DE NITRGENO,
55C.

AEROBIOSIS, CO2 COMO BACTERIAS OXIDADORAS SUELO, LODOS Y AGUAS

FUENTE DE CARBONO, NH4 DE AMONIACO RESIDUALES
COMO DONADOR DE (Nitrosomonas)
ELECTRONES, O2 COMO
ACEPTOR DE ELECTRONES

ANAEROBIOSIS, CO2 COMO Thiobacillus denitrificans LODO, SEDIMENTOS

FUENTE DE CARBONO, S0, LACUSTRES Y SUELO
S2O32-COMO DONADOR DE
ELECTRONES, NO3- COMO
ACEPTOR DE ELECTRONES

ANAEROBIOSIS, ALMIDN, ESPECIES DE Clostridium SUELO

NH4+
 COLUMNA DE WINOGRADSKY

ECOSISTEMA MICROBIANO ARTIFICIAL EN EL QUE COEXISTEN MICROORGANISMOS

AEROBIOS Y ANAEROBIOS

CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO

ALGAS Y CIANOBACTERIAS
SUSTRATOS FERMENTABLES)

PARCHES DE BACTERIAS PRPURAS Y VERDES

DEL AZUFRE
+ CaSO4 (AUSENCIA DE

DESCOMPOSICIN
LODOS + CaCO3

REDUCTORES DE SO42-
2.- CULTIVOS AXNICOS. AISLAMIENTO DE ESPECIES MICROBIANAS
DISTINTOS PROCEDIMIENTOS:
- SIEMBRA POR ESTRIAS
- POR INMERSIN EN AGAR (TUBOS Y PLACAS): MICROORGANISMOS ANAEROBIOS

DILUCIN DEL CULTIVO ENRIQUECIDO

VERIFICACIN POR DISTINTAS TCNICAS:

- MICROSCOPA
- TINCIONES
- CULTIVO EN OTROS MEDIOS Y CONDICIONES

OTRAS TCNICAS PARA OBTENER CULTIVOS AXNICOS (BASADAS EN MICROSCOPA PTICA)

- MICROMANIPULACIN CON AGUJA
- MICROMANIPULACIN CON PINZAS LSER
3.- CULTIVO EN MEDIO LQUIDO. TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE (NMP)

ANLISIS CUANTITATIVO
 TINCIONES Y USO DE ANTICUERCOS FLUORESCENTES
DIRIGIDAS A LA CUANTIFICACIN DE MICROORGANISMOS EN UN HABITAT
1.- Tincin fluorescente con DAPI (4,6-diamido-2-fenilindol, mxima absorcin a 400 nm)
o naranja de acridina (mxima absorcin a 500 nm)

2.- Tincin de viables (el yoduro de propidio tie slo clulas muertas)

3.- Deteccin de protenas especficas con anticuerpos fluorescentes: ampliamente

utilizada en la deteccin de patgenos en muestras clnicas.

DETECCIN DE CIDOS NUCLEICOS: FISH (fluorescent in situ hibridation)

PERMITE LA IDENTIFICACIN FILOGENTICA DE LOS MICROORGANISMOS AISLADOS

PROBLEMAS DEL FISH:

BAJA NMERO DE MOLCULAS DIANA
BAJA PERMEABILIDAD CELULAR
BAJA EFICIENCIA DE HIBRIDACIN

OTRAS VARIACIONES DE FISH DE UTILIDAD:

ISRT-FISH (in situ reverse transcription): APLICADO AL ESTUDIO DE LA
EXPRESIN GNICA EN UNA POBLACIN DETERMINADA.

mRNA cDNA AMPLIFICACIN POR PCR Y DETECCIN CON SONDA FLUORESCENTE

RT
CARD-FISH: TIL PARA DETERMINAR FILOGENTICAMENTE MICROORGANISMOS
DE CRECIMIENTO LENTO O MINORITARIOS. COMBINA UNA SONDA CON ACTIVIDAD PEROXIDASA
CON UN COLORANTE FLUORESCENTE (TIRAMIDA) QUE INCREMENTA SU FLUORESCENCIA AL SER
MODIFICADA POR LA PEROXIDASA.

Microbes Environ. Vol. 28, No. 1, 312, 2013

 OTRAS HERRAMIENTAS DE LA FILOGENIA UTILIZADAS EN ECOLOGA MICROBIANA

ANLISIS A NIVEL MOLECULAR

AMPLIFICACIN DE GENES ESPECFICOS POR PCR (rDNA16S, GENES METABLICOS) DNA

FINGERPRINTING (REPETICIONES, RFLP).
AISLAMIENTO DE DISTINTOS FILOTIPOS DE UN GEN POR ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE,
CLONACIN O POR T-RFLP.
SECUENCIACIN DE GENES AISLADOS CON FINES FILOGENTICOS
FILOCHIPS
METAGENMICA
SECUENCIACIN MASIVA

Amplificacin
por PCR utilizando
cebadores marcados Gel de PCR
con fluorescencia

Muestra
1 2 3 4
Anlisis Gel desnaturalizante
T-RFLP
 GENMICA MEDIOAMBIENTAL O METAGENMICA

ESQUEMA EXTRAIDO DE HERNNDEZ-LEN R. ET AL.,

YTON ISSN 0031 9457, (2010) 79: 133-139
 MEDIDAS DE LA ACTIVIDAD MICROBIANA
ANLISIS QUMICO Y SEGUIMIENTO DE ISTOPOS RADIACTIVOS

Formalin control (killed cell)

Killed cell

BROCK, Biologa de los microorganismos.

MICHEL T. MADIGAN et al.,
Killed cell

FISH-MAR (FISH-MICROAUTORRADIOGRAFA)

MEDICIN DE LA AUTOTROFA
POR LA INCORPORACIN DE 14CO2

ISTOPOS ESTABLES (12C/13C 32S/34S)

 USO DE MICROELECTRODOS (pH, O2 , N2O , CO2 , H2 , H2S)
GRAN UTILIDAD PARA MEDIR FOTOSNTESIS EN TAPETES MICROBIANOS

MICROELECTRODO DE O2 SECCIN CENTRAL DE TAPETE MICROBIANO DE UNA PERFILES DE O2, H2S Y Ph EN UN TAPETE MICROBIANO
FUENTE HIDROTERMAL DE UNA FUENTE HIDROTERMAL

MICHEL T. MADIGAN et al.,

BROCK, Biologa de los microorganismos.