Sunteți pe pagina 1din 110

20

16

Microbiologie
SUBIECTE REZOLVATE SEMESTRUL I
DIMITRI APOSTOL
Cuprins

1. CELULE EUCARIOTE I PROCARIOTE, CARACTERISTICI COMPARATIVE 7

2. CLASIFICAI BACTERIILE DUP FORM I DISPUNERE EXEMPLE 7

3. ENUMERAI COMPONENTELE CONSTANTE I FACULTATIVE ALE CELULEI BACTERIENE 8

4. STRUCTURA PERETELUI LA BACTERIILE GRAM POZITIVE I GRAM NEGATIVE 9

5. ROLUL PERETELUI BACTERIAN 10

6. COLORAIA GRAM, TIMPI INTERPRETARE EXEMPLE 10

7. PROTOPLATI SFEROPLATI FORME L 11

8. COLORAIA ZIEHL-NEELSEN, TIMPI INTERPRETARE EXEMPLE 11

9. STRUCTURA I ROLUL MEMBRANEI CITOPLASMATICE 12

10. RIBOZOMII, STRUCTUR I ROL 13

11. MEZOZOMI INCLUZII VACUOLE (N STRUCTURA CELULEI BACTERIENE) 13

12. MASA NUCLEAR BACTERIAN STRUCTUR, CARACTERISTICI 14

13. CUM ESTE NSCRIS INFORMAIA GENETIC N GENOMUL CELULEI BACTERIENE 14

14. ENUMERAI I DESCRIEI SUCCINT ETAPELE BIOSINTEZEI PROTEICE 15

15. CAPSULA BACTERIAN STRUCTUR, ROL, LOCALIZARE 15

16. FLAGELII BACTERIENI STRUCTUR, ROL, LOCALIZARE 16

17. FIMBRIILE BACTERIENE* 17

18. SPORII BACTERIENI STRUCTUR, ROL, LOCALIZARE 17

19. APA, SUBSTANELE MINERALE I PIGMENII N STRUCTURA CELULEI BACTERIENE 18


1
20. GLUCIDELE, PROTEINELE I LIPIDELE N STRUCTURA CELULEI BACTERIENE 19

21. SUBSTANE CU ACIUNE ANTIBIOTIC PRODUSE DE BACTERII* 20

22. NUTRIIA PRINCIPALELOR BACTERII STUDIATE: TIPURI DE NUTRIIE 20

23. CLASIFICAREA BACTERIILOR N FUNCIE DE TIPUL RESPIRATOR 21

24. DEFINII FACTORII DE CRETERE BACTERIENI; EXEMPLE 22

25. CLASIFICAI BACTERIILE N FUNCIE DE TEMPERATURA OPTIM DE DEZVOLTARE; EXEMPLE 22

26. STRUCTURA I SINTEZA PEPTIDOGLICANULUI 23

27. DEFINII NOIUNEA DE CULTIVARE A BACTERIILOR; ENUMERAI PE CE SUBSTRATURI SE REALIZEAZ


24

28. DEFINII NOIUNEA DE CRETERE I MULTIPLICARE BACTERIAN* 25

29. DEFINII NOIUNEA DE MEDIU SELECTIV, ELECTIV I DE MBOGIRE; EXEMPLE 25

30. DEFINII NOIUNEA DE MEDIU DIFERENIAL; EXEMPLE* 25

31. CE ESTE O COLONIE BACTERIAN ? CUM SE POT OBINE COLONII BACTERIENE IZOLATE ? 26

32. FAZELE DEZVOLTRII UNEI CULTURI BACTERIENE 27

33. ASPECTELE CULTURILOR BACTERIENE PE MEDII SOLIDE; CORELAII NTRE ACESTEA I PATOGENITATE;
EXEMPLE 28

34. ASPECTELE CULTURILOR BACTERIENE PE MEDII LICHIDE; CORELAII NTRE ACESTEA I


PATOGENITATE; EXEMPLE 29

35. SISTEME DE CULTURI CONTINUE; DEFINIII I EXEMPLE 29

36. DEFINII NOIUNILE DE ASEPSIE I ANTISEPSIE; EXEMPLE DE ANTISEPTICE; APLICAII 30

37. DEFINII NOIUNILE DE STERILIZARE I DEZINFECIE; EXEMPLE DE DEZINFECTANTE; APLICAII 30

38. ANTISEPTICE I DEZINFECTANTE. MECANISME DE ACIUNE 31

39. STERILIZAREA PRIN CLDUR UMED; METODE, PRESIUNE, TEMPERATUR, APLICAII 32

2
40. AUTOCLAVAREA PRINCIPIU, PARAMETRII TEHNICI, UTILIZRI 32

41. STERILIZAREA PRIN CLDUR USCAT; METODE, PRESIUNE, TEMPERATUR, APLICAII 33

42. CONGELAREA I LIOFILIZAREA BACTERIILOR DEFINIIE, EFECTE ASUPRA VIABILITII GERMENILOR,


APLICAII 34

43. BACTERIOFAGII DEFINIIE, STRUCTUR, TIPURI DE INTERACIUNE FAG-BACTERIE (ENUMERARE) 35

44. INTERACIUNEA FAG-BACTERIE: CICLUL LITIC (ETAPE, EVIDENIERE) 36

45. INTERACIUNEA FAG-BACTERIE: CICLUL LIZOGEN, PROPRIETILE BACTERIILOR LIZOGENE 36

46. ADN BACTERIAN; LOCALIZARE, STRUCTUR, ROL 38

47. REPLICAREA ADN BACTERIAN; MECANISM 40

48. PLASMIDELE; DEFINIRE, TIPURI, ROLURI N CELULA BACTERIAN 41

49. FACTORUL F I FACTORUL R; DEFINIIE, ROLURI 42

50. DEFINII NOIUNILE DE GENOM, GENOTIP I FENOTIP; VARIABILITATEA GENETIC I FENOTIPIC 43

51. MUTAIILE LA BACTERII; DEFINIIE, TIPURI DE MUTAII, CLASIFICARE 44

52. TRANSFORMAREA LA BACTERII; DEFINIIE, MECANISM 45

53. TRANSDUCIA; DEFINIIE, MECANISM, TIPURI DE TRANSDUCIE 45

54. CONJUGAREA BACTERIAN 46

55. SUBSTANE ANTIBIOTICE I CHIMIOTERAPICE; DEFINIIE, UTILIZRI N CLINIC I LABORATOR 46

56. ANTIBIOTICE BACTERICIDE I BACTERIOSTATICE; DEFINIII, EXEMPLE 47

57. CLASIFICAREA SUBSTANELOR ANTIMICROBIENE DUP MECANISMUL DE ACIUNE; EXEMPLE 47

58. CLASIFICAREA ANTIBIOTICELOR DUP STRUCTURA CHIMIC; CLASE PRINCIPALE, EXEMPLE 48

59. REZISTENA LA ACIUNEA ANTIBIOTICELOR; DEFINIII, TIPURI 49

60. ANTIBIOGRAMA DIFUZIMETRIC; PRINCIPIU, INTERPRETARE 50

3
61. DEFINII NOIUNEA DE CMI I CMB; CUM SE DETERMIN I CARE ESTE UTILITATEA DETERMINRII
CMI I CMB ? 51

62. DEFINII NOIUNILE DE SIMBIOZ, COMENSALISM, PARAZITISM; EXEMPLE 52

63. DEFINII PATOGENITATEA I VIRULENA; EXEMPLE DE FACTORI DE PATOGENITATE 53

64. FLORA MICROBIAN NORMAL A ORGANISMULUI UMAN 53

65. DEFINII NOIUNILE DE EXOTOXIN, ENDOTOXIN, ANATOXIN I ANTITOXIN; EXEMPLE 55

66. INFLAMAIA; DEFINIIE, FACTORI CARE DETERMIN PROCESUL INFLAMATOR 56

67. ETAPA MECANISMELOR DE DECLANARE A INFLAMAIEI 58

68. SUB-ETAPELE VASCULAR I EXSUDATIV, N CADRUL PROCESULUI INFLAMATOR 60

69. CONSECINELE ACTIVRII MECANISMELOR INFLAMATORII 61

70. DEFINII NOIUNILE DE INFECIE, INFECIE INAPARENT, STARE DE BOAL I STARE DE PURTTOR
DE GERMENI 63

71. DEFINII NOIUNEA DE RSPUNS IMUN I PRECIZAI PRINCIPALELE SALE ATRIBUTE 64

72. DEFINII RSPUNSUL IMUN UMORAL I SPECIFICAI CELULELE IMPLICATE N REALIZAREA SA 65

73. ENUMERAI TIPURILE DE IMUNITATE I DESCRIEI-LE PE SCURT 66

74. ORGANELE CENTRALE I PERIFERICE ALE SISTEMULUI IMUN; LOCALIZARE, FUNCII 67

75. ENUMERAI CELULELE IMPLICATE N RSPUNSUL IMUN 69

76. LIMFOCITELE T ORIGINE, EVOLUIE, TIPURI, FUNCII 69

77. LIMFOCITELE B ORIGINE, EVOLUIE, TIPURI, FUNCII 71

78. SISTEMUL MONONUCLEAR ORIGINE, TIPURI DE CELULE, FUNCII 72

79. GRANULOCITELE TIPURI, ROL N IMUNITATE 73

80. SISTEMUL COMPLEMENT DEFINIRE, ELEMENTE COMPONENTE, ROLURI I EFECTE BIOLOGICE 74

4
81. CALEA CLASIC DE ACTIVARE A COMPLEMENTULUI 75

82. CALEA DE ALTERNATIV DE ACTIVAREA A COMPLEMENTULUI 75

83. INTELEUKINELE ORIGINE, TIPURI, EFECTE 76

84. COOPERRI CELULARE DIRECTE, N RSPUNSUL IMUN 77

85. COOPERRI CELULARE (INDIRECTE) MEDIATE DE CITOKINE, N RSPUNSUL IMUN 77

86. PREZENTAI SCHEMATIC PRINCIPALELE COOPERRI CELULARE CE INTERVIN N RSPUNSUL IMUN 78

87. PRECIZAI SUCCESIUNEA DE EVENIMENTE DIN CADRUL RSPUNSULUI IMUN UMORAL, PN LA


SINTEZA DE ANTICORPI 79

88. EXPUNEI PRINCIPIILE TEORIEI SELECIEI CLONALE N RSPUNSUL IMUN 80

89. RSPUNSUL IMUN PRIMAR I SECUNDAR; CARACTERISTICI PRINCIPALE 80

90. VACINURI; CE SUNT I N CE SCOP SE UTILIZEAZ ? 81

91. CLASIFICAREA VACCINURILOR; EXEMPLE 82

92. DESCRIEI SCHEMATIC STRUCTURA UNEI MOLECULE DE IMUNOGLOBULIN 82

93. TIPURI DE IMUNOGLOBULINE 84

94. IGM I IG G; STRUCTUR I ROL 84

95. IGA I IG E; STRUCTUR I ROL 85

96. CE SUNT ANTIGENELE: DEFINIIE, TIPURI, EXEMPLE 85

97. ANTIGENELE; FACTORI DE CARE DEPINDE IMUNOGENITATEA 86

98. REACII ANTIGEN-ANTICORP; MECANISM GENERAL I FORME DE EVIDENIERE 87

99. REACII DE PRECIPITARE N MEDIU LICHID; EXEMPLE, UTILIZRI 88

100. REACII DE PRECIPITARE N GEL; EXEMPLE, UTILIZRI 90

101. REACII DE AGLUTINARE; PRINCIPIU, TIPURI, EXEMPLE 92

5
102. REACIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI; PRINCIPIU, ETAPE, UTILIZRI, EXEMPLE 93

103. REACIA DE SERONEUTRALIZARE; PRINCIPIU, TIPURI, UTILIZRI, EXEMPLE 95

104. REACII ANTIGEN-ANTICORP CARE UTILIZEAZ COMPONENTE MARCATE; TIPURI DE MARCARE,


UTILIZRI 98

105. HIPERSENSIBILITATEA DEFINIRE, TIPURI DE HIPERSENSIBILITATE, EXEMPLE 99

106. REACII ANAFILACTICE MECANISM, FORME DE MANIFESTARE 100

107. HIPERSENSIBILITATEA DE TIP III MECANISM, BOALA SERULUI, ALTE EXEMPLE 103

108. HIPERSENSIBILITATEA DE TIP IV MECANISM, EVIDENIERE, APLICAII PRACTICE 105

BIBLIOGRAFIE 109

6
1. Celule eucariote i procariote, caracteristici comparative
Celula bacterian este o celul procariot i are caracteristici structurale diferite n comparaie cu
celula eucariot
Tabel: Caracteristici comparative (celula eucariot / celula procariot)

Celula eucariot Celula procariot


Nucleul - prezint membran - nu prezint membrane
- are mai muli cromozomi - are un singur cromozom, circular
- prezint aparat mitotic - absena mitozei
- nucleul este tipic, prezint nucleol - nu este tipic ci apare ca nucleoid
Citoplasma prezint: nu prezint:
- reticul endoplasmic - reticul endoplasmic,
- mitocondrii - mitocondrii,
- lizozomi - lizozomi
- ribozomi 80S prezint ribozomi 70S
- membrana citoplasmatic conine membrana citoplasmatic nu
sterol conine steroli (excepie Mycoplasma)
Peretele - absent sau compus din celuloz - are structur complex,
celular sau chitin. prezentnd glicopeptid, proteine, lipide
- nu prezint glicopeptid etc.
Diviziune Mitoz diviziune direct (binar)
Capsula Absent adesea prezent

2. Clasificai bacteriile dup form i dispunere exemple


n funcie de form, bacteriile se pot grupa n mai multe categorii i pot avea:

A. form cocoidal, cu diametre egale sau inegale (coci), dispuse izolat sau grupat. Majoritarea
steptococilor i stafilococii sunt sferici, enterococii sunt ovalari, pneumococii sunt lanceolai, gonococii i
meningococii pot fi reniformi.

Dispunerea bacteriilor depinde de mediul de cultur n care se dezvolt, de vrsta culturii


bacteriene, de alte aspecte fiziologice precum i de modul n care are loc diviziunea n cursul procesului de
cretere i multiplicare (planul de diviziune).

Modul de dispunere poate fi considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru unele genuri de
bacterii, de ex.:

stafilococii sunt coci sferici dispui n grmezi (ciorchine);


pneumococii sunt coci lanceolai dispui doi cte doi, eventual nconjurai de o capsul comun (n
diplo);
streptococii sunt coci dispui n lanuri etc.;
B. form de bastona (bacili, rods), drepi cu capetele uor rotunjite (enterobacterii), drepi cu capetele
tiate drept (Bacillus anthracis), fuziformi, cu ambele capete ascuite (Fusobacterium nucleatum), dispui

7
uneori ntr-un mod caracteristic (de exemplu n palisade, ca i scndurile dintr-un gard - bacilii
pseudodifterici);
C. aspect cocobacilar (exemplu H. influenzae, B. pertussis, B. abortus);
D. actinomicete, care n culturi tinere formeaz filamente lungi, ramificate (asemntor mucegaiurilor);
aceste filamente se fragmenteaz i rezult aspecte bacilare (ex. Actinomyces israelli);
E. forma spiralat (bacili curbi - V. cholerae, spirili i spirochete - T. pallidum).

Unele bacterii, chiar i atunci cnd rezult prin multiplicarea unei singure celule mam prezint un
pleomorfism deosebit de accentuat (de exemplu Proteus spp.).

n culturi vechi sau sub influena unor factori fizici, chimici, biologici, sub tratament cu antibiotice
etc., pot aprea forme modificate: filamentoase, umflate, ramificate etc., care pot crea confuzii de diagnostic
pentru examinatorul fr experien sau care nu face o examinare innd cont de context. Dac are loc
repicarea acestora pe mediu de cultur proaspt iar examinarea ulterioar se face la timpul potrivit (avnd n
vedere durata optim de multiplicare) vor rezulta forme tipice pentru specia respectiv.

3. Enumerai componentele constante i facultative ale celulei bacteriene


Att din punct de vedere structural ct i funcional, exist o serie de asemnri ntre celula
procariot i celula eucariot. Bacteriile prezint att elemente structurale interne ct i structuri externe
care pot i merit a fi studiate avnd implicaii n relaiile dintre celula bacterian i organismul gazd. Exist
dou tipuri de elemente structurale, unele dintre acestea fiind ntlnite la toate speciile de bacterii
(constante), altele fiind ntlnite numai n anumite condiii i doar la anumite specii sau tulpini bacteriene
(facultative).

Structuri constante ale celulei bacteriene


Structurile constante ale celulei bacteriene sunt reprezentate de:

1. Peretele bacterian
2. Membrana citoplasmatic
o Mezozomii
3. Citoplasma
o Ribozomii
o Incluziile
o Vacuolele
o Plasmide
4. Nucleul

Structuri facultative
1. Capsula
2. Flagelii
3. Fimbriile (pilii)
4. Sporii

8
4. Structura peretelui la bacteriile Gram pozitive i Gram negative
Peretele bacterian nconjoar membrana citoplasmatic. Lipsete la bacteriile din
genul Mycoplasma. Are o grosime de circa 15-30 nm.

Bacteriile Gram-pozitive conin aproximativ 80-90% murein (peptidoglican, glicopeptid parietal).


Mureina este un heteropolimer al crui schelet este format din lanuri polizaharidice. Aceste lanuri sunt
formate prin polimerizarea, alternant, a 2 structuri zaharidice:

acidul N-acetil-muramic (NAM)


N-acetil-glucozamina (NAG)

Fiecare molecul de NAM


are substituit un tetrapeptid
alctuit din D i L-aminoacizi (se
consider c aminoacizii n form D
confer un grad de protecie fa
de enzimele proteolitice). ntre
tetrapeptidele substituite, la
lanurile polizaharidice alturate,
se stabilesc legturi peptidice prin gruparea terminal COOH a unui tetrapeptid i grupri terminale libere
ale tetrapeptidului vecin. Astfel se formeaz structuri bidimensionale, destul de complicate, sub forma unor
straturi care nconjoar ntreaga celul bacterian.

Bacteriile Gram-pozitive rein violetul de metil (violet de genian n coloraia clasic) i au culoare
violet pe frotiul colorat Gram. Dintre bacteriile Gram-pozitive se pot aminti stafilococul, streptococul,
enterococul, bacilul difteric, bacilul listeriozei, actinomicetele, bacilul antraxului, clostridiile etc.

n cazul bacteriilor Gram-negative se descrie un perete celular n general mai subire dar mult mai
complex. Peretele este alctuit dintr-un strat fin de peptidoglican (circa 10-20% din structura peretelui) care
9
este acoperit de o membran extern. Spaiul dintre membrana citoplasmatic i membrana extern
(include peptidoglicanul) reprezint spaiul periplasmic. Din punct de vedere chimic, membrana extern este
alctuit din fosfolipide, proteine i cantiti variabile de lipopolizaharide. Alte proteine importante care se
afl la acest nivel sunt porinele. Lipopolizaharidul (endotoxina) are n componen dou structuri eseniale:
lipidul A i polizaharidul O. Bacteriile Gram-negative se decoloreaz cu alcool-aceton i se recoloreaz cu
fucsin diluat (au culoare roie la coloraia Gram). Dintre bacteriile Gram-negative am putea aminti
meningococul, gonococul, enterobacteriile, vibrionul holeric, bacilul piocianic, cocobacilii Gram-negativi
(ex. Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella abortus) etc.

5. Rolul peretelui bacterian


Rolurile peretelui bacterian:

prin rigiditate asigur forma caracteristic bacteriei (coci, bacili etc);


asigur rezistena bacteriei (de exemplu la variaii ale presiunii osmotice i la presiuni interioare care
pot ajunge pn la 20 atm.);
flexibilitatea peretelui celular la unele bacterii (ex. spirochete) poate fi explicat att prin
flexibilitatea membranei ct i prin grosimea redus a peptidoglicanului;
are rol antigenic (carbohidratul C la streptococ, antigenul O - polizaharidic etc);
prezint receptori, de exemplu pentru bacteriofagi;
are rol n diviziunea bacterian participnd la formarea septului transversal;
la nivelul lui pot aciona unele antibiotice (exemplu beta-lactaminele, vancomicina);
la bacteriile Gram-negative este asociat cu numeroase enzime (situate n spaiul periplasmic i la
nivelul membranei externe).

6. Coloraia Gram, timpi interpretare exemple

Coloraia Gram
dilum ntr-un recipient fucsin (9 pri ap distilat / 1 parte fucsin)
acoperim frotiul cu violet de metil sau cristal violet (violet de genian din punct de vedere istoric),
pentru 1-3 minute (nu are rost s acoperim cu colorant lama n ntregime)
ndeprtm colorantul
acoperim frotiul cu lugol (mordant, fixator) pentru 1-3 minute
ndeprtm lugolul
acoperim frotiul cu un amestec de alcool-aceton (1 parte aceton / 3 pri alcool de 96) pentru
un timp foarte scurt, 7-8 secunde
splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet
acoperim frotiul cu fucsina diluat 1/10 pentru 1 minut
splm cu ap distilat sau ap de la robinet
aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ
sau hrtie de filtru
examinm la microscop, notm observaiile, interpretm

10
Frotiu colorat Gram
n cazul n care frotiul a fost realizat din cultur pur putem vizualiza microorganisme cu aceeai
form, aceleai dimensiuni (excepie Proteus spp.), o anumit dispoziie, cu sau fr capsul (halou
necolorat), gram pozitive (colorate n violet) sau gram negative (colorate n rou), levurile se coloreaz n
violet

n cazul n care frotiul a fost realizat din produs patologic putem vizualiza celule diferite (n funcie de
sediul recoltrii) i celule inflamatorii pentru care nucleul i citoplasma apar n diverse nuane de rou,
bacterii gram pozitive i / sau gram negative, fibrin i levuri care se coloreaz n violet etc

7. Protoplati Sferoplati Forme L

Protoplastul
Are form rotund nconjurat de membrana citoplasmatic i reprezint bacteria Gram-pozitiv
dup ndeprtarea complet a peretelui, de exemplu sub aciunea lizozimului care lizeaz mureina. n medii
hipotone protoplastul se lizeaz. Este o structur care nu se poate multiplica.

Sferoplastul
Reprezint bacteria Gram-negativ dup degradarea parial a peretelui (conine o cantitate mai
mic de murein). Lizozimul poate aciona asupra peptidoglicanului numai dup alterarea membranei
externe (ex. dup tratare cu EDTA). n medii hipotone sferoplastul se lizeaz. Spre deosebire de protoplast,
se poate multiplica.

Anumite bacterii produc autolizine (enzime hidrolitice care degradeaz peptidoglicanul, spre exemplu
glicozidaze, amidaze, peptidaze). Este probabil ca aceste substane s aib un rol n creterea i multiplicarea
bacterian.

Formele L
n 1935 s-a observat prezena unor germeni modificai structural. Au fost numite forme L, dup
numele Institutului Dr. Lister unde au fost descoperite. Nu sunt microorganisme noi, ci variante ale unor
microorganisme cu peretele bacterian modificat. Utilizndu-se lizozim sau penicilin ca ageni inductori s-au
putut obine forme L de la majoritatea bacteriilor. Este posibil ca aceste forme L s explice, prin prezena
lor n organism, anumite infecii cronice (de exemplu infecii ale aparatului urinar).

8. Coloraia Ziehl-Neelsen, timpi interpretare exemple


Este o coloraie util n identificarea prezenei de bacili acid-alcool rezisteni (BAAR), solubiliznd
peretele bacterian prin creterea temperaturii, facilitnd penetrarea colorantului.

punem frotiul uscat i fixat pe un suport situat deasupra tviei de colorare


acoperim complet lama cu fucsin bazic nediluat (filtrat extemporaneu)

11
trecem becul de gaz aprins pe sub lama acoperit de fucsin, pn ncepe emiterea de vapori (nu
atingem temperatura de fierbere). n cazul n care lama nu mai este acoperit complet cu fucsin,
adugm colorant. Timpul de lucru este de 10 minute, perioad n care repetm de 3 ori operaia de
nclzire a lamei pn la emiterea de vapori.
splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet
adaugm amestecul decolorant acid-alcool (3 ml acid clorhidric concentrat / 97 ml alcool etilic 90-
95), pentru 2-3 minute
splm cu ap distilat sau ap de la robinet
recolorm cu albastru de metilen, 1 minut
splm cu ap distilat sau ap de la robinet
aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ
sau hrtie de filtru
examinm la microscop, notm observaiile, interpretm

Frotiu colorat Ziehl-Neelsen - putem vizualiza: bacili de culoare roie, relativ fini (n cazul prezenei
BAAR), alte bacterii (ne-AAR), celule diferite (n funcie de sediul recoltrii) i celule inflamatorii de culoare
albastr (toate structurile ne-AAR apar colorate albastru) etc; n cazul colorrii unui frotiu din cultur pur
vom evidenia numai bacili de culoare roie.

9. Structura i rolul membranei citoplasmatice


ntre perete i citoplasm exist membrana citoplasmatic avnd grosimea de 7-10nm; poate
reprezenta circa o zecime din greutatea uscat a peretelui bacterian. Electronomicrografic apare format din
2 straturi ntunecoase separate de un strat mai clar. Este considerat un mozaic fluid, compus dintr-un
film fosfolipidic n care floteaz proteine globulare cu extremitile polare hidrofile expuse spre spaiul
intracelular, extracelular sau ambele. Aproape 10% din proteinele celulei bacteriene, peste 200 de feluri de
proteine, sunt localizate la nivelul membranei citoplasmatice. Fosfolipidele, dispuse n dublu strat, au
extremitile polare, hidrofile, expuse contactului cu apa pe ambele fee ale membranei i extremitile
nepolare, hidrofobe, orientate spre stratul mijlociu al membranei. Nu conine steroli (excepie Mycoplasma
spp).

Rolurile membranei citoplasmatice sunt:

filtru selectiv, datorit permeazelor (rol n permeabilitate i transport);


barier osmotic;
conine enzime ale metabolismului respirator (de exemplu citocromi);
este sediul majoritii activitilor enzimatice ale celulei bacteriene (de exemplu intervine activ
n procesele de biosintez);
excret unele enzime hidrolitice;
intervine activ n procese de biosintez;
contribuie la formarea septului transversal (rol n diviziunea celular);
particip la procesul de chemotaxie prin receptorii de pe suprafaa sa.

Asupra membranei pot aciona anumite antibiotice (de exemplu polimixinele).

12
10. Ribozomii, structur i rol
Ribozomii au form aproximativ sferic, pot fi vzui la microscopul electronic. Mrimea lor (circa 10-
20 nm) depinde de concentraia ionilor Mg2+ i K+. Unii ribozomi sunt liberi n citoplasm, n timp ce alii apar
legai de faa intern a membranei citoplasmatice. Din punct de vedere chimic conin circa 65% ARNr
(ribozomal). Au constanta de sedimentare de 70S (uniti Svedberg) dar sunt constituii din dou subuniti
de cte 30S (O subunitate ARN 16S legat de 21 de proteine) i respectiv 50S (ARN 5S, ARN 23S i 31
proteine). ntre cele dou subuniti se formeaz canalul prin care trec moleculele de ARNm (mesager) n
cursul sintezei proteice. Se apreciaz c ntr-o bacterie cu dimensiuni medii, aflat n faza de cretere activ,
se sintetizeaz circa 500 ribozomi / minut, metabolismul bacterian fiind foarte intens.

Ribozomii au rol esenial n procesul de biosintez proteic. Au tendina de a se grupa n polisomi


(poliribozomi) cu eficien sporit n biosinteza proteic. n aceste condiii, la un moment dat pe aceeai
molecul de ARNm se afl n scopul traducerii mesajului genetic mai muli ribozomi, care constituie un
ansamblu care poart numele de polisom.

11. Mezozomi Incluzii Vacuole (n structura celulei bacteriene)

Mezozomii
Mezozomii sunt structuri care se formeaz prin invaginarea membranei citoplasmatice de care
rmn legai. Sunt prezeni n special la bacteriile Gram-pozitive. Au structura chimic a membranei
citoplasmatice i aceleai funcii n permeabilitate i respiraie. Cu un capt se pot fixa de materialul nuclear,
favoriznd distribuirea n mod egal a genomului ntre cele dou celule fiice. Au rol i n formarea septului
transversal.

Incluziile
Incluziile sunt formaiuni care apar n citoplasm la sfritul perioadei de cretere activ.
Dimensiunea i forma incluziilor citoplasmatice pot varia n funcie de condiiile externe. Pot conine
polimeri anorganici (de exemplu, corpusculii metacromatici ai genului Corynebacterium, la a cror
descoperire a avut un rol important Profesorul Victor Babe), substane anorganice simple, polimeri organici
(rezervor energetic mai ales la germenii sporulai aerobi), lipide, cristale, granulaii de sulf etc.

Vacuolele
Vacuolele sunt formaiuni sferice care conin diferite substane n soluie apoas. Au o membran
lipoproteic numit tonoplast. Au fost descrise n mai ales la bacteriile acvatice i ar putea avea un rol n
plutirea acestora.

13
12. Masa nuclear bacterian structur, caracteristici
Masa nuclear vine n contact direct cu citoplasma. Este localizat n partea central a celulei.
Conine ADN, nu are nucleoli. Are afinitate pentru coloranii bazici, dar pe preparatele colorate uzual este
mascat de bazofilia intens a citoplasmei bogat n ARN.

Unicul cromozom bacterian este alctuit dintr-o singur molecul de ADN dublu catenar, cu aspectul
unui fir lung (1.000-2.000 m), nchis ntr-un inel i replicat pe el nsui, superspiralat. Mrimea
cromozomului poate s difere n funcie de specia bacterian (i respectiv numrul de perechi de baze); cea
mai mic celul bacterian ar fi cea de Mycoplasma spp., la care dimensiunea este de 4.700 kpb, n timp ce
cromozomul de E. coli poate avea o dimensiune de circa 3 ori mai mare. Avnd n vedere c dimensiunea
bacteriilor este de circa 1-2 mm n cazul cocilor i de cteva ori mai mare n cazul bacililor, pentru ca
materialul genetic s poat fi coninut n acest spaiu redus, acesta trebuie s fie compactat ntr-un mod
remarcabil i astfel, rezult nucleoidul bacterian care poate fi difereniat microscopic. Nucleoidul este format
din molecula de ADN asociat cu proteine i o cantitate variabil de ARN.

n 1989 s-a descoperit c exist i bacterii care dein cromozomi lineari (ex. Borrelia burgdorferi).
Toate speciile din genul Borrelia dein i plasmide lineare.

Replicarea cromozomului bacterian se face printr-un mecanism semiconservativ. Aa cum am


menionat, cromozomul este unic, ns n celula care se dezvolt rapid exist posibilitatea ca nainte ca prima
replicare s se fi ncheiat s se iniieze nc o replicare i n acest caz celula bacterian va putea fi meroploid
(doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori) sau chiar poliploid (tot cromozomul a
fost copiat de mai multe ori). Dac replicarea cromozomial nu este succedat de diviunea celulei (aa cum
se ntmpl n mod obinuit), putem remarca n celula bacterian existena mai multor cromozomi.
Cromozomii suplimentari (n total 2 sau 4) nu aduc o informaie genetic diferit pentru c ei sunt copii ale
cromozomului iniial (identici cu acesta).

13. Cum este nscris informaia genetic n genomul celulei bacteriene


Nucleul deine informaia genetic necesar proceselor vitale de cretere i multiplicare.

Codonul
Din punct de vedere funcional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de ADN formeaz
un codon. Codonii dein informaia genetic pentru a plasa ntr-o anumit secven un anumit aminoacid, n
lanul polipeptidic care va fi sintetizat la nivelul ribozomilor.

Cistronul
Cistronul reprezint o subunitate funcional a genei, capabil s determine independent sinteza
unui lan polipeptidic.

Gena
Gena structural reprezint o poriune a genomului, respectiv o anumit secven de nucleotide
dispuse liniar. Genele structurale reprezint circa 90% din ansamblul informaiei genetice. Poart nscris n
14
structura sa informaia genetic necesar pentru sinteza unei proteine specifice, structurale sau funcionale
(enzime).

14. Enumerai i descriei succint etapele biosintezei proteice


Biosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor.

Cu toate c secvena de aminoacizi din structurile proteice este dictat de secvena de baze
azotate din ADN, pentru c nu exist afinitate i posibilitate de cuplare ntre ADN i aminoacizi este necesar
ca o alt structur s permit poziionarea aminoacizilor n lanul viitoarei proteine.

Iniial are loc transcrierea informaiei genetice pe ARNm (mesager), care va transporta aceast
informaie de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare. Gena este segmentul de
ADN care deine informaia genetic pentru sinteza unei proteine. Segmentul de ADN care controleaz
sinteza unui polipeptid poart numele de cistron.

ARNm care deine informaia genetic pentu sinteza unei singure catene de polipeptid poart
numele de ARNm monocistronic.

La bacterii, de obicei, o molecul de ARNm trebuie s poarte informaia necesar pentru sinteza mai
multor catene diferite i n acest caz ARNm poart numele de ARNm policistronic. Aceast situaia
particular este datorat dimensiunii mici a acestor procariote precum i metabolismului intens care are loc
n cursul procesului de cretere i multiplicare. Spre exemplu, la E. coli, pentru metabolizarea lactozei sunt
necesare potenial 3 enzime diferite, iar mesajul genetic pentru sinteza acestora se afl deinut de o singur
molecul de ARNm policistronic.

De regul, numai o caten de ADN este folosit drept matri pentru ARNm. Transcrierea mesajului
genetic este selectiv (se desfoar ntre promotor i semnalul de terminare) i este controlat de ARN
polimeraza ADN-dependent.

Pentru traducerea mesajului genetic este necesar intervenia la nivel ribozomal a moleculelor de
ARNt (de transfer). Acestea au o dubl specificitate (pentru fiecare dintre cei 20 de aminoacizi exist una sau
mai multe molecule de ARNt; n acelai timp exist enzime specifice fiecrui tip de aminoacid care
controleaz legarea corect a aminoacizilor activai pe ARNt corespunztor). La nivelul fiecrui ARNt exist
trei nucleotide (anticodon) complementar codonului care corespunde aminoacidului.

ARNt nu are niciodat la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU i n aceste condiii ne putem
explica motivul pentru care codonii UAA, UAG i UGA sunt codoni stop.

Succesiunea specific a nucleotidelor este transpus ntr-o secven specific de aminoacizi care
intr n constituia lanului polipeptidic din proteina n curs de formare.

15. Capsula bacterian structur, rol, localizare


Numeroase bacterii sintetizeaz polimeri organici (de obicei polizaharide) care formeaz n jurul
celulei o matrice fibroas, numit glicocalix.

15
La unele bacterii glicocalixul ader strns de celula bacterian i reprezint capsula. Exist bacterii
care dein o capsul bine definit, cu structur polizaharidic (S. pneumoniae, K. pneumoniae, unele tulpini
de E. coli etc) sau cu structur polipeptidic (Bacillus anthracis etc).

La alte bacterii, glicocalixul formeaz o reea lax de fibrile care se pierde parial n mediu i poate fi
separat de corpul bacterian prin centrifugare, capsula flexibil, care nu este vizibil la microscopul optic.

Roluri:

factor de virulen, mpiedicnd fagocitarea bacteriei i favoriznd invazivitatea;


rezisten fa de surfactani, anticorpi;
permite aderarea unor bacterii (rol de adezin);
barier protectoare fa de bacteriofagi, protozoare;
conine substane cu specificitate antigenic (de specie sau de tip) - antigenul K. Spre exemplu, n
cazul S. pneumoniae exist peste 90 tipuri antigenice capsulare n timp ce la E. coli sau la Klebsiella
pneumoniae exist peste 80 tipuri antigenice capsulare.

Referitor la modalitile de evideniere ale structurilor capsulare, este de menionat c prin coloraia
cu albastru de metilen sau tu de China / India, n jurul bacteriei apare un halou necolorat. Exist i coloraii
speciale pentru capsul, de exemplu coloraia Hiss. Structura antigenic a capsulei permite identificarea
bacteriilor, spre exemplu prin reacia de umflare a capsulei (Neufeld) atunci cnd se folosesc seruri
polivalente sau monovalente anti-capsulare pentru identificarea pneumococilor.

16. Flagelii bacterieni structur, rol, localizare


Cilii sau flagelii confer mobilitate bacteriilor. Mobilitatea poate fi evideniat n preparatul proaspt
(ntre lam i lamel) sau pe anumite medii speciale (ex. MIU). Mobilitatea germenilor din genul Proteus este
observat pe orice mediu de cultur solid pe care acest microorganism foarte mobil se dezvolt (fenomenul
de invazie).

Flagelii sunt formaiuni fine, alungite, flexibile, cu origine la nivelul corpusculului bazal. Acesta este
alctuit (de ex. la majoritatea bacteriilor Gram-negative) din patru discuri aranjate ca dou perechi pe o
structur care trece prin mijlocul lor. Corpusculul bazal este plasat n perete i membrana citoplasmatic. Din
punct de vedere chimic flagelul este de natur proteic (flagelina).

Roluri:

n mobilitate (cu o vitez de circa 50 m / secund); cilul are o micare de rotaie, asemntoare
unei nurubri n mediu i ca atare corpul bacterian este mpins n direcia opus; motorul rotaiei
e reprezentat de corpusculul bazal iar energia este obinut din ATP;
antigenic (datorit structurii proteice - antigenul H, specific de tip);
n clasificarea bacteriilor (prin numr i distribuie), bacteriile putnd fi
monotriche (cu un flagel dispus la o extremitate), de exemplu Vibrio cholerae, Pseudomonas
aeruginosa;
lofotriche (cu un mnunchi de flageli dispus la o extremitate);

16
peritriche (cu mai muli flageli dispui de-a lungul suprafeei bacteriene), de exemplu E. coli, Proteus
mirabilis, Salmonella typhi.

17. Fimbriile bacteriene*


Sunt formaiuni scurte, fine, nu au rol n mobilitate. De obicei pilii sunt mai subiri dect cilii. Pot fi
foarte numeroase pe suprafaa majoritii bacteriilor; pot fi observate numai la microscopul electronic.

Exist pili comuni, cu urmtoarele roluri:

n aderena bacterian (adezine);


conin receptori specifici pentru
bacteriofagi;
antigenic (la unele bacterii), ex. N.
meningitidis i N. gonorrhoeae.

Exist pili F (sexuali), determinai


genetic de factorul de fertilitate F (episom).
Acetia ndeplinesc rolul canalului de conjugare.

18. Sporii bacterieni structur, rol,


localizare
Fenomenul de sporogenez este mai des ntlnit
la Bacillaceae (genurile Clostridium i Bacillus). Pe sol, n condiii
de uscciune, la adpost de lumina solar direct, endosporii
persist zeci i poate sute de ani.

Materialul genetic este concentrat i, mpreun cu apa


legat, lipide, Ca++, Mg++, este nconjurat de un strat protector
(membrana sporal, cortexul sporal, nveliurile sporale).
Smburele sporal mpreun cu membrana citoplasmatic
formeaz protoplastul sporal.

Roluri
form de rezisten i conservare a speciei (n condiii favorabile un spor se poate transforma ntr-o
bacterie / forma vegetativ; procesul de formare a sporului ar putea fi considerat una dintre cele
mai primitive forme de difereniere, dar nu este un proces de reproducere celular aa cum se
ntmpl la fungi sau parazii);
rezist la cldur, uscciune, la anumite substane chimice i antibiotice, raze UV etc.

Sporul poate fi localizat:


central sau subterminal, mai mic dect celula (ex. la Bacillus anthracis);
central sau subterminal, mai mare dect celula (ex. la Clostridium hystoliticum etc);

17
terminal (ex. la Clostridium tetani, cu aspectul de b de chibrit).

Poate fi evideniat prin coloraii speciale (de exemplu verde malachit) sau prin coloraia Gram (locul
sporului rmne necolorat).

Este sensibil la formol, propiolacton etc. Este distrus prin autoclavare.

19. Apa, substanele minerale i pigmenii n structura celulei bacteriene

Apa: procent, rol


Apa reprezint peste 75-85% din greutatea umed a bacteriei. Exist ap liber (mediu de dispersie)
i ap legat fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au puin ap, n special ap legat. Bacteriile sunt fiine
acvatice prin excelen. Vacuolele sunt formaiuni sferice care conin diferite substane n soluie apoas.
Au o membran lipoproteic numit tonoplast. Au fost descrise n special la bacteriile acvatice i ar putea
avea un rol n plutirea acestora.

Dintre rolurile ndeplinite am putea aminti faptul c apa reprezint un mediu de dispersie, este
reactiv n reaciile metabolice, reprezint etapa final a unor reacii oxidative etc.

Prin deshidratare (desicare) este posibil prezervarea culturilor bacteriene timp ndelungat. O
metod des utilizat datorit eficienei sale este liofilizarea (criodesicarea). Studiile tiinifice au artat c, n
general, germenii Gram-negativi rezist mai puin timp liofilizrii dect cei Gram-pozitivi, fenomen care a
fost pus pe seama stratului mai subire de peptidoglican. (1)

Substanele minerale
Substanele minerale reprezint 2-30% din greutatea uscat a bacteriei i variaz n funcie de
specie, vrsta culturii, compoziia chimic a mediului. Unele elemente intr n compoziia diferitelor structuri
(exemplu sulful intr n structura aminoacizilor, fosforul n structura fosfolipidelor etc).

Dintre rolurile ndeplinite am putea aminti urmtoarele:

favorizeaz schimburile cu mediul,


particip la reglarea presiunii osmotice,
pot stimula creterea i funcia bacteriei (de exemplu fierul n cazul bacilului difteric, care
condiioneaz i producerea de toxine),
activeaz unele sisteme enzimatice, contribuie la reglarea pH-ului i a potenialului de oxido-
reducere.

Aa cum am menionat anterior, la nivel ribozomal se gsesc Mg++ i K+.

Pigmenii
Pigmentogeneza este caracteristic bacteriilor cromogene i este dependent de condiiile de
cultivare.

18
Producerea de pigmeni poate reprezenta un criteriu de identificare (ex. n cazul tulpinilor
de Pseudomonas aeruginosa sau n cazul unor specii din genul Staphylococcus). Trebuie s reinem nc de la
nceput faptul c n cazul stafilococilor, pigmentogeneza este doar un caracter orientativ i nu vom clasifica
drept patogen o tulpin de stafilococ n funcie de culoarea coloniei. Stafilococii sunt condiionat
patogeni. Testul orientativ privind patogenitatea este testul coagulazei care ar trebui efectuat n mod
obligatoriu pentru toate tulpinile izolate de la pacieni.

Dup localizarea pigmentului, bacteriile pot fi:

cromofore (pigmentul este legat n citoplasm);


paracromofore (pigmentul este prezent n perete sau n stratul mucos, de exemplu la S. aureus sau
laStaphylococcus epidermidis);
cromopare (pigmentul este difuzibil n mediu, de exemplu la Pseudomonas aeruginosa).

n afar de faptul c datorit producerii de pigmeni (albastru, galben-verde, maro etc. n


cazul Ps. aeruginosa sau auriu, citrin, alb n cazul tulpinilor de Staphylococcus) medicul de laborator se poate
orienta n alegerea testelor de identificare ntr-un anumit context clinic i microbiologic.

Putem aminti i faptul c pigmenii pot avea o serie de roluri, de ex.: rol de protecie fa de
radiaiile UV (pigmeni carotenoizi), rol antibiotic (exemplu piocianina elaborat de P. aeruginosa fa de B.
anthracis) i rol enzimatic.

20. Glucidele, proteinele i lipidele n structura celulei bacteriene

Glucidele
n structura bacterian se pot gsi glucide simple cu rol n metabolismul intermediar glucidic, precum
i glucide complexe, de exemplu poliozide. Acestea din urm au o serie de roluri, spre ex. particip la
realizarea structurii peretelui celular, fac parte din capsula unor bacterii etc.

Exist teste biochimice n care se urmrete utilizarea sau imposibilitatea utilizrii unui anumit zahar
de ctre o bacterie. Aceste teste sunt utile pentru identificarea bacteriei respective (n special n cazul
enterobacteriilor folosind mediile TSI, MIU, sistemele API etc). Testrile biochimice sunt de mare utilitate i
n studiul fungilor (auxanogram, zimogram).

Proteinele
Exist proteine simple (cu rol n metabolismul intermediar protidic) i proteine complexe, cum ar fi:

mucoproteinele (ex. mucopolizaharidul de grup al S. pneumoniae, acidul hialuronic din structuri de


tip capsular),
cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi),
nucleoproteinele (ex. n acizii nucleici).

Este de remarcat prezena n structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul diaminopimelic,
precum i a aminoacizilor n forma D (ceea ce reprezint o adaptare biochimic a bacteriilor fa de aciunea
nociv a enzimelor proteolitice).

19
Lipidele
Reprezint mai puin de 10% din greutatea uscat a bacteriilor i variaz cantitativ n funcie de
specie, vrsta culturii (cresc n celulele mbtrnite, reprezentnd probabil un semn de degenerescen) i
compoziia mediului. La mycobacterii, sunt n cantitate mai mare (circa 20-40%), n special la nivel parietal i
determin o serie de proprieti specifice, inclusiv afinitatea tinctorial. Lipidele se pot gsi libere n vacuole,
combinate sau fcnd parte din diferite structuri ale celulei bacteriene (perete, membran, mezozomi).

Dintre lipidele bacteriene putem aminti:

acizii grai speciali (ex. acidul mycolic la mycobacterii),


cerurile (acizi grai plus alcooli monovaleni superiori), care se gsesc n cantitate mare la bacteriile
acid-alcoolo-rezistente (ex. n peretele mycobacteriilor, nocardiilor etc). Dintre acestea, ceara D pare
a fi implicat n inducerea hipersensibilitii ntrziate (de tip IV).
fosfolipidele, cum este lipoidul ubiquitar (difosfatidil glicerol) din Treponema pallidum (agentul
etiologic al sifilisului) sau lipidul A din structura lipopolizaharidului bacteriilor Gram-negative, cu
activitate toxic.

21. Substane cu aciune antibiotic produse de bacterii*


plasmidul Col codific proprietatea unor bacterii de a elabora bacteriocine, cu efect asupra altor
bacterii receptive nrudite (de exemplu colicinele elaborate de E. coli);
unele bacterii din genul Bacillus produc antibiotice polipeptidice (de exemplu, B.
licheniformis produce bacitracina, B. brevis sintetizeaz gramicidina, iar B. polymyxa sintetizeaz
polimixina; ultimele 2 specii fac parte, astzi, din alte genuri, vezi capitolul nr. 48).

22. Nutriia principalelor bacterii studiate: tipuri de nutriie


Nutriia bacterian reprezint suma proceselor metabolice care conduc la producerea de materiale
convertibile n energie i n diferite componente celulare. Nutrienii sunt substane ale cror soluii pot
traversa membrana citoplasmatic pentru a fi antrenai n reaciile metabolice care asigur creterea i
multiplicarea celular.
n raport cu sursa de energie, bacteriile se mpart n:
bacterii care folosesc energie luminoas i triesc la lumin (photobacterii) i
bacterii care i procur energia prin procese de oxidoreducere catalizate enzimatic i triesc la
ntuneric (scotobacterii, chimiosintetizante).

n raport cu sursele folosite ca material de sintez n ambele diviziuni se difereniaz:


bacterii autotrofe, capabile s-i sintetizeze toi compuii organici din materie anorganic
bacterii heterotrofe, dependente de prezena unor compui organici.

Nutriia principalelor bacterii studiate

20
Majoritatea bacteriilor comensale, condiionat patogene sau patogene importante pentru om, sunt
chimiosintetizante, heterotrofe. Se difereniaz n funcie de tipul respirator. Exist i bacteriile paratrofe, a
cror energie trebuie oferit de gazd. Bacteriile paratrofe sunt parazite strict intracelular (de exemplu
microorganismele din genurile Rickettsia i Chlamydia, care depind nutriional de o gazd vie).
Creterea microbian necesit polimerizarea unor substane mai simple pentru a forma: proteine, acizi
nucleici, polizaharide i lipide. Aceste substane se obin fie din mediul de cultur, fie sunt sintetizate de
ctre celulele n cretere (sunt necesare diferite coenzime i legturi macroergice de tipul celor din ATP).
Substanele necesare i coenzimele implicate se pot obine dintr-un numr relativ redus de precursori
metabolici.
Dac o celul bacterian primete substanele necesare, va sintetiza diferite macromolecule, iar
secvena aranjrii componentelor n aceste macromolecule este determinat fie dup un model ADN-ADN
(pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru proteine), fie cu un determinism enzimatic pentru carbohidrai
i lipide.
Dup ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansambleaz, formnd structuri supramoleculare:
ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei macromoleculelor i activitatea cilor metabolice sunt foarte
bine reglate (exist o permanent balan a biosintezei).

23. Clasificarea bacteriilor n funcie de tipul respirator


Respiraia reprezint suma reaciilor biochimice aerobe sau anaerobe productoare de
energie. Mecanismul de baz este reprezentat de oxido-reducerea biologic (pierderea ionilor de hidrogen
sau a electronilor) de ctre o substan chimic (donor) i transportul lor pe molecula unei alte substane
numit acceptor (prima se oxideaz, a doua se reduce: AH2 + B <=> A + BH2). n funcie de natura
acceptorului final, respiraia poate fi: aerob sau anaerob.

Respiraia aerob (oxibiotic)


n respiraia aerob, acceptorul final de electroni este reprezentat de oxigen. Respiraia aerob
necesit existena membranei celulare. Electronii sunt pasai de la un reductor la un oxidant prin
membran cu ajutorul unui set specific de transportori. Substratul reductor frecvent utilizat este NADPH-ul.

Respiraia anaerob (anoxibiotic)


n respiraia anaerob acceptorul final de electroni este reprezentat de orice substan anorganic
diferit de oxigen sau de orice substan organic (fermentaia); fosforilarea se face la nivelul substratului.

Tipul respirator
n raport cu utilizarea proceselor pentru obinerea
energiei i de relaia cu oxigenul din mediu, bacteriile se
pot grupa n 4 tipuri respiratorii principale:

1. strict aerob, atunci cnd bacteriile (spre


exemplu Bordetella pertussis) se dezvolt numai n
prezena unei presiuni crescute a O2, care este folosit
ca acceptor final unic. Aceste bacterii posed catalaz,

21
peroxidaz, citocromi (de exemplu catalaza desface H2O2 toxic pentru celula bacterian;) i utilizeaz
numai procese de respiraie. Unele specii aerobe (exemplu Pseudomonas aeruginosa) se pot dezvolta n
medii lipsite de oxigen, dac n mediu sunt prezeni nitratul sau nitritul;
2. strict anaerob, atunci cnd bacteriile (spre exemplu Clostridium tetani, Clostridium botulinum,
Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc) cresc numai n absena O2. Nu pot supravieui n
prezena O2, care nefiind redus are o aciune bactericid. Nu au catalaz, peroxidaz (care acioneaz
asupra ionilor de O2 sau asupra H2O2). Aceste bacterii folosesc pentru obinerea energiei numai procese
de fermentaie. Pentru cultivarea lor este necesar utilizarea unui mediu cu potenial redox foarte
sczut.
3. aerob facultativ anaerob, atunci cnd bacteriile (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc) se dezvolt mai bine
n mediile cu oxigen, prin procese de respiraie, dar pot prezenta ambele tipuri respiratorii, n funcie de
potenialul redox. Majoritatea au catalaz sau citocromoxidaz, dar nu au peroxidaze flavoproteice. n
acest tip se ncadreaz majoritatea bacteriilor studiate.
4. anaerob microaerofil, atunci cnd bacteriile (de exemplu Campylobacter) tolereaz mici cantiti de O2.
5. Tolerante aerobe, nu necesit oxigen ntruct metabolizeaz energia anaerob. Spre deosebire de cele
strict anaerobe (2), acestea nu sunt otrvite de O2. Pot fi gsite rspndite uniform n ntreaga eprubet.

24. Definii factorii de cretere bacterieni; exemple


Factorii de cretere sunt metaboliii eseniali pe care bacteria nu-i poate sintetiza pe baza
substanelor care se gsesc n mediul extern. Factorii de cretere trebuie neaprat inclui n mediul de
cultur n cazul n care dorim s izolm microorganismul respectiv, numit microorganism pretenios (ex.
factorii X i V trebuie inclui n mediul de izolare pentru Haemophilus influenzae).

Bacteriile patogene sunt heterotrofe. Adaptndu-se la viaa parazitar, devin dependente de o serie
de astfel de factori de cretere (unele sunt att de dependente nct nu pot fi cultivate in vitro, de exemplu
bacilul leprei - Mycobacterium leprae).

Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesit factori de cretere. Aceste bacterii pot sintetiza
purinele eseniale, pirimidinele, aminoacizii i vitaminele pornind de la o surs de carbon.

25. Clasificai bacteriile n funcie de temperatura optim de dezvoltare; exemple


n funcie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi:

mezofile, cu temperatura optim de 30-37C;


psichrofile, cu temperatura optim n jur de 20C (unele acceptnd temperaturi apropiate de
0C; Listeria spp. poate supravieui sau se poate chiar i multiplica la temperatura din frigider). Ele sunt
adaptate la acest mediu prin numrul mare de acizi grai nesaturai coninui de membrana plasmatic.
Gradul de nesaturare al unui acid gras se coreleaz cu timpul de solidificare sau stadiul de tranziie
termic (temperatura la care se topete sau se solidific lipidul). Acizii grai nesaturai rmn n faz
lichid la temperaturi joase, dar sunt denaturai la temperaturi moderate. Fie c acizii grai din
membran se afl n faz lichid sau solid, ei afecteaz fluiditatea membranei, care afecteaz n mod
direct capacitatea de a funciona.
22
termofile, cu temperatura optim de 50-60C (unele putnd s se multiplice i la temperaturi apropiate
de 95C, ca de ex.Thermus aquaticus). Bacteriile termofile sunt adaptate s reziste la temperaturi de
peste 60C printr-o varietate de modaliti. Acizii grai din membrana bacteriilor termofile sunt acizi
grai saturai, permind membranelor s rmn stabile i funcionale la temperaturi ridicate.
extrem termofile sau hipertermofile, cu temperatura optim de 80C sau mai mare i o temperatur de
dezvoltare maxim de 115C. (2) Nu sunt patogene.

Bacteriile studiate de microbiologia medical sunt n marea lor majoritate mezofile.

26. Structura i sinteza peptidoglicanului


Sinteza peptidoglicanului se desfoar pe parcursul mai multor etape. ncepe prin sinteza n
citoplasm a UDP-acid N-acetil muramic-pentapeptid (NAM). Aceast structur se ataeaz de bactoprenol
(un lipid din membrana celular), dup care urmeaz un lan de reacii biochimice.

Legarea ncruciat final se


realizeaz printr-o reacie de
transpeptidare n care terminaiile
amino libere ale pentaglicinei
nlocuiesc reziduurile terminale ale
D-Ala de la peptidul nvecinat.
Reacia este catalizat de
transpeptidaze, un set de enzime
numite i PBPs (penicillin binding
proteins) care au att activitate de
transpeptidaze i carboxipeptidaze,
dar controleaz i gradul de legare a
peptidoglicanului (aspect foarte
important n diviziunea celular). La
nivelul lor se pot lega penicilinele i
alte medicamente beta-lactamice.

Aceast cale de biosintez are o importan particular n medicin, oferind i baza aciunii selective
a unor antibiotice (peniciline, cefalosporine, bacitracin, vancomicin, cicloserin etc). Spre deosebire de
celulele gazdei, microorganismele sunt izotone cu fluidele organismului. n interiorul lor presiunea osmotic
este foarte mare i viabilitatea lor depinde de integritatea peretelui (peptidoglican) pe tot parcursul ciclului
celular. Orice compus care inhib o etap n biosinteza peptidoglicanului la o bacterie n cretere va putea
produce liza bacterian (efect bactericid).

23
27. Definii noiunea de cultivare a bacteriilor; enumerai pe ce substraturi se
realizeaz
Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecii, trebuie ca din produsul recoltat de la pacient s
obinem mai nti respectivul microorganism n cultur pur, pentru ca ulterior s i putem studia diferitele
caractere n vederea identificrii.

Metodele de cultivare a bacteriilor urmresc mai multe obiective:

obinerea unei populaii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaiile propuse,


prevenirea contaminrii produsului cercetat cu un microorganism strin i
izolarea fiecrei tulpini microbiene urmrite n cazul unui produs plurimicrobian n culturi
monomicrobiene denumite culturi pure.

Nu exist un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricrei bacterii. Termenul nsmnare
definete operaia de introducere a unei cantitai de germeni ntr-un mediu de cultur artificial, n timp ce
pentru culturile celulare, ou embrionate i mai ales animale de experien folosim termenul inoculare.

Cultivarea se realizeaz prin nsmnarea bacteriilor pe medii de cultur. Mediile solide sau lichide
care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice necesare creterii i multiplicrii bacteriene se
numesc medii de cultur.

Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea ntr-un mediu de cultur poart numele
de cultur bacterian.

Mediile de cultur
Microorganismele pot fi cultivate pe gazde vii i pe medii artificiale.

Exist anumite microorganisme (de exemplu virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu pot fi cultivate
dect pe gazde vii, aa cum se ntmpl n cazul virusurilor, respectiv: animale de laborator, ou de gin
embrionate sau culturi de celule.

Majoritatea bacteriilor, fungii i unele protozoare se pot cultiva i pe medii artificiale.

Mediile de cultur artificiale trebuie s fie nutritive (s conin factorii de cretere necesari), s fie
sterile, s aib un anumit pH (de obicei ntre 7,2-7,6), s aib o anumit presiune osmotic, s aib
umiditatea favorabil multiplicrii germenilor etc.

Factorii de cretere reprezint substane eseniale pe care microorganismele nu sunt capabile s le


sintetizeze din nutrienii de care pot s dispun. Ei sunt necesari n cantitai mici. ndeplinesc anumite roluri
n biosintez. Factorii de cretere pot fi grupai n:

1. Purine si pirimidine: necesare pentru sinteza acizilor nucleici (ADN i ARN);

2. Aminoacizi: necesari pentru sinteza proteinelor;

3. Vitamine: necesare n calitate de coenzime i grupri funcionale pentru enzime.

Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesit factori de cretere. Aceste bacterii pot sintetiza
purinele eseniale, pirimidinele, aminoacizii i vitaminele pornind de la o surs de carbon.

24
Alte bacterii necesit purine, pirimidine, vitamine i anumii aminoacizi pentru a crete. Aceti
compui trebuie adugai n prealabil n mediile de cultur.

Factorii de cretere nu sunt metabolizai direct ci sunt asimilai de ctre bacterii pentru a-i ndeplini
rolul n metabolism. Tulpinile mutante care necesit anumii factori de cretere ce nu sunt necesari tulpinii
din care au provenit sunt numite auxotrofe. Spre exemplu, o tulpina de E. coli care necesit triptofan pentru
dezvortare se va numi auxotrof-triptofan i va fi desemnat E. coli trp- (2).

28. Definii noiunea de cretere i multiplicare bacterian*


Creterea oricrui organism are loc prin sinteza de noi molecule. Deoarece creterea volumului
celular raportat la creterea suprafeei este mai mare, n cursul creterii se ajunge la un punct critic.
Multiplicarea celular este o consecin a creterii. Se restabilete raportul optim dintre volumul i suprafaa
celulei.

Multiplicarea majoritii bacteriilor se face prin diviziune simpl (binar). Sporii nu reprezint forme de
multiplicare (aa cum se ntmpl n cazul fungilor sau paraziilor).

29. Definii noiunea de mediu selectiv, electiv i de mbogire; exemple


Mediul electiv conine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltrii unei anumite bacterii (de
exemplu mediul Lffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric).

Prin coninutul su n substane antimicrobiene, mediul selectiv inhib dezvoltarea altor bacterii
dect cea a crei izolare se urmrete. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului
difteric sau medii n care includem antibiotice (fa de care bacteria care se dorete a fi izolat este
rezistent)

Mediul de mbogire favorizeaz nmulirea anumitor bacterii patogene, inhibnd dezvoltarea florei
de asociaie dintr-un produs patologic. Funcioneaz concomitent ca mediu selectiv i ca mediu electiv (de
exemplu, mediul hiperclorurat pentru stafilococ sau mediile de mbogire utilizate pentru
izolarea Salmonella typhi).

30. Definii noiunea de mediu


diferenial; exemple*
Mediul diferenial conine un anumit
substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate
fi sau nu metabolizat, determinnd modificarea
culorii sau aspectului culturii. De exemplu,
agarul cu albastru de brom-timol lactozat
(AABTL) care difereniaz bacteriile lactoz-
pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactoz-negative (Shigella, Salmonella). Alte exemple: ADCL (agar

25
dezoxicolat citrat lactoz), TSI (3 zaharuri i fier), MIU (mobilitate indol uree).

31. Ce este o colonie bacterian ? Cum se pot obine colonii bacteriene izolate ?
Pe medii solide, germenii nsmnai n suprafa produc colonii. Colonia este totalitatea bacteriilor
rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie este o clon bacterian.

Coloniile izolate se pot obine de exemplu prin tehnica nsmnrii prin dispersie (cu ansa
bacteriologic sau cu tamponul). Dup prelevarea cu ansa a unei poriuni din produsul patologic, inoculul
este dispersat pe latura unui viitor poligon; se resterilizeaz ansa; se verific temperatura, prin atingerea
mediului ntr-o zon nensmnat, ct mai periferic; cu ansa steril se traseaz a doua latur a poligonului;
se resterizeaz ansa i se repet procedeul descris pn la realizarea a 4-5 laturi, fr a atinge prima latur.
n acest mod, pe ultimele laturi ale poligonului se vor putea observa dup trecerea timpului necesar
multiplicrii bacteriene, colonii izolate, bine individualizate. (Schema nr. 1)

nsmnarea cu ansa calibrat


Se poate utiliza pentru urocultura i n alte scopuri n care
aproximarea numrului de microorganisme dezvoltate pe mediul
de cultur este util, n ziua urmtoare vom numra coloniile
aprute i spre exemplu vom nmuli numrul de colonii cu 1000
dac am utilizat pentru nsmnare ansa de 0,001 ml

nsmnarea cu tamponul sau cu bagheta de sticl n L

26
Descrcm tamponul ncrcat cu produs patologic (exist mai multe modaliti de descrcare a
tamponului, dintre care vom prezenta dou):

descrcm tamponul prin rulare, pe toate feele pe o raz a plcii, urmnd ca s dispersm produsul
cu o baghet de sticl n L, steril, pe toat suprafaa plcii
descrcm tamponul prin rulare, pe toate feele pe un cadran al plcii, urmnd ca s dispersm
produsul cu ansa bacteriologic n celelalte cadrane, ca n metoda pentagonului deschis (dup
nsuirea tehnicii, pentru economie, se poate realiza cultivarea pe jumtatea unei plci).

32. Fazele dezvoltrii unei culturi bacteriene


Teoretic, dinamica unei populaii bacteriene ar trebui s evolueze exponenial. Dinamica real a
populaiei bacteriene n cultur discontinu are ns o evoluie caracterizat printr-o curb la care distingem
patru faze: faza de lag; faza de multiplicare logaritmic; faza staionar i faza de declin.

Faza de lag
Numrul bacteriilor nsmnate rmne staionar sau scade; germenii se adapteaz la condiiile
mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, i consum pn la dispariie incluziile, cresc mult n
dimensiuni, sintetizeaz enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu se divid; sunt foarte sensibile la
antibiotice. Faza de lag dureaz aproximativ 2 ore. Aceast faz este aparent dependent de o varietate de
factori incluznd dimensiunea inoculului, timpul necesar pentru a-i reveni din ocul fizic datorat
transportului, timpul necesar pentru sinteza coenzimelor eseniale sau a factorilor de diviziune i timpul
necesar pentru sinteza a noi enzime ce sunt
necesare pentru a metaboliza substratul
prezent n mediu. (2)

Faza de multiplicare logaritmic


(exponenial)
Celulele bacteriene prezint
caracteristicile tipice speciei (dimensiunile
sunt ns ceva mai mari), citoplasma este
intens bazofil i omogen, lipsit de
incluzii. Bacteriile sunt foarte sensibile la
antibiotice. Aceast faz este adecvat
pentru studierea bacteriilor sau pentru recoltarea lor n vederea preparrii de vaccinuri. Faza de multiplicare
exponenial dureaz aproximativ 2-3 ore.

Faza staionar
Multiplicarea este realizat n progresie aritmetic, dar pentru c numrul bacteriilor care sunt
distruse este aproximativ egal cu numrul bacteriilor nou aprute rata de cretere devine nul.

Germenii au morfologia caracteristic speciei; n aceast faz realizm identificarea germenilor. Apar
incluziile caracteristice. La speciile sporogene ncepe formarea sporilor. Faza staionar dureaz aproximativ
2-3 zile.

27
Faza de declin
Substratul nutritiv srcete, apar metabolii toxici, bacteriile sunt distruse progresiv, se produc i
enzime autolitice, rezervele de hran din incluzii (ex. acidul poli--hidroxi butiric sau glicogenul) se consum,
pentru un timp sursa de energie rmne doar ARN-ul celular. Unele bacterii pot persista 2-3 luni. n acest
scop se pot activa mecanisme speciale de reglare i se exprim o serie de gene care duc la sinteza unor
proteine speciale care permit adaptarea pentru o durat limitat de timp. La speciile sporogene, fenomenul
de sporogenez devine foarte intens.

33. Aspectele culturilor bacteriene pe medii solide; corelaii ntre acestea i


patogenitate; exemple
Condiiile de cultivare i aspectul culturii sunt caractere cheie n identificarea bacteriilor. Aspectul
coloniilor variaz ntre diferitele bacterii, fr a permite diferenieri definitive de specie (dar au utilitate n
contextul studierii tuturor caracterelor bacteriene i n contextul general al diagnosticului de laborator, care
la rndul su trebuie s aib loc ntr-un context n care punem n balan i alte elemente, clinice,
paraclinice; colaborarea ntre medicii de diferite specialiti este esenial). Se examineaz:

dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm i mici, sub 1 mm),
conturul (circular, lobat, zimat),
relieful (plat, bombat, acuminat, papilat),
suprafaa (lucioas, granular, rugoas),
culoarea (pigmentate, nepigmentate),
opacitatea (transparente, opace),
consistena,
aderena la mediu,
prezena sau absena hemolizei (pe medii de tipul geloz-snge).

Colonia S (smooth) are suprafa bombat i neted, margini circulare i


adesea aspect strlucitor. Germenii pstreaz structura antigenic i nu aglutineaz
spontan cu soluie salin fiziologic. Germenii capsulai i pstreaz capsula.
Virulena este conservat. Majoritatea bacteriilor studiate formeaz colonii de tip S
(S. aureus, S. pyogenes, E. coli (figura) etc).

Colonia R (rough) este plat,


suprafaa ei prezint rugoziti, marginile sunt crenelate. Structura
antigenic nu este caracteristic. Nu pstreaz capsula. Virulena nu
este conservat (excepii Bacillus anthracis, Mycobacterium
tuberculosis,Corynebacterium diphteriae). O bacterie care n mod
caracteristic duce la apariia unei colonii de tip S (ex. o enterobacterie), n cazul n care testele de identificare
prin reacii antigen-anticorp (ex. aglutinare pe lam, folosind anticorpi cunoscui) nu se efectueaz la timpul
potrivit ci mai trziu, prin nbtrnire va suferi anumite modificri, coloniile vor deveni de tip R iar
identificarea pe baza caracterelor antigenice nu va mai fi posibil.

28
Colonia M (mucoid) este mare, strlucitoare,
mucoas. Este dat de exemplu de bacteriile care prezint
capsule mari (exemplu Klebsiella pneumoniae) Coloniile
de Streptococcus pneumoniae pot fi i de tip S i de tip M.

n cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus


spp.) pe mediile obinuite nu vom putea obine colonii
izolate (a fost descris fenomenul de invazie).Cultura se
ntinde pe toat suprafaa plcii n strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de invazie
poate fi inhibat prin incorporarea n mediu de acizi sau sruri biliare, tiosulfat de sodiu etc.

34. Aspectele culturilor bacteriene pe medii lichide; corelaii ntre acestea i


patogenitate; exemple
Bacteriile i fungii facultativ anaerobi se dezvolt n toat masa de lichid, tulburndu-l. Bacteriile
strict aerobe se dezvolt preponderent la suprafaa mediului. Ca un aspect particular, n apa
peptonat Vibrio cholerae se poate dezvolta i formeaz un vl la suprafaa mediului. n acest caz, pH-ul
mediului este 9-9,5.

Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbur omogen mediul
(majoritatea bacteriilor).

Variantele R realizeaz o tulburare mai puin omogen. Pot lsa mediul limpede, formnd flocoane
care se depun sau un strat (vl) la suprafaa mediului (de exemplu bacilul difteric sau bacilul tuberculos).

n urma dezvoltrii microorganismelor n medii de cultur lichide se mai pot remarca i


pigmentogeneza (ex. Pseudomonas aeruginosa) sau utiliznd simul olfactiv se poate constata apariia unui
miros caracteristic (ex. un miros de corn ars n cazul clostridiilor).

Cteva exemple, menionnd c exist i variaii de la regul:

mediul este tulburat omogen (ex. Staphylococcus spp.)


mediul este clar, cu depozit grunjos pe perei i la baza tubului (ex. S. pyogenes)
mediul este clar, cu vl la suprafa (V. cholerae n ap peptonat alcalin)
dezvoltarea culturii se realizeaz ca un inel aderent de pereii tubului, la suprafaa mediului (ex. E.
coli)
mediul este clar cu dezvoltarea unei membrane uscate, la suprafa (ex. Bacillus subtilis)
mediul este clar cu apariia unui depozit floconos aderent la baza tubului (B. anthracis)
mediul este clar, iar la suprafa se dezvolt o membran groas, plisat (M. tuberculosis).

35. Sisteme de culturi continue; definiii i exemple


Culturile bacteriene sunt discontinue cnd se realizeaz n volum limitat de mediu, care nu este
rennoit i continue atunci cnd mediul de cultur este continuu rennoit. O populaie bacterian poate fi
meninut indefinit n faza de multiplicare exponenial dac se adaug continuu mediu de cultur proaspt,
29
cu omogenizare prin curent de aer steril i evacuare a unei cantiti corespunztoare de cultur (de exemplu
n dispozitivul numit chemostat sau turbidostat).

Chemostatul utilizeaz un mediu de cultur n care unul dintre nutrieni, aflat n concentraie mai
redus dect ceilali, funcioneaz ca factor limitant al creterii. Mediul de cultur proaspt este admis n
vasul de cultur n ritmul n care este consumat factorul limitant, iar cultura este evacuat cu acelai ritm.
Cultura este meninut astfel la o valoare constant i submaximal ratei de cretere, reglat prin factorul
limitant. Chemostatele sunt foarte utile pentru obinerea de tulpini mutante pentru c dup ce rata de
multiplicare a fost determinat ansa de selectare a acestor tulpini este mai mare.

n laboratorul de microbiologie clinic, de regul se utilizeaz culturile discontinue.

Timpul de generaie
Populaia care rezult prin diviziunea unei bacterii crete n progresie geometric cu raia 2. Timpul
necesar pentru dublarea populaiei se numete timp de dublare sau timp de generaie. Timpul de generaie
n faza exponenial i n condiii optime de cultivare este determinat genetic. De exemplu, pentru E.
coli este de circa 20 minute (ca i pentru majoritatea bacteriilor studiate). Pentru Mycobacterium
tuberculosis timpul de generaie poate avea o valoare ntre 12-27 ore.

36. Definii noiunile de asepsie i antisepsie; exemple de antiseptice; aplicaii


Asepsia reprezint ansamblul de metode prin care evitm contaminarea mediului ambiant cu
germeni microbieni sau prin care putem menine sterilitatea esuturilor, mediilor de cultur,
medicamentelor injectabile etc.

Antisepsia reprezint nlturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe tegumente,


mucoase sau din plgi. Se realizeaz cu ajutorul substanelor antiseptice, netoxice pentru tegument (ex.
alcool etilic 70, tinctur de iod 5%, KMnO40,1%, detergeni cationici etc).

37. Definii noiunile de sterilizare i dezinfecie; exemple de dezinfectante; aplicaii


Sterilizarea reprezint distrugerea sau ndeprtarea tuturor microorganismelor patogene sau
nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafa sau dintr-un mediu (lichid sau solid). Toate
materialele utilizate n laboratorul de microbiologie trebuie s fie sterile nainte de utilizare. Exist o mare
diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel nct i metodele de sterilizare sunt destul de variate,
dup cum urmeaz:

Metode de sterilizare prin cldur (cldura uscat sau cldura umed);


Metode de sterilizare prin filtrare;
Metode de sterilizare utiliznd radiaiile, dar i
Metode chimice de sterilizare.

Metodele de sterilizare care utilizeaz radiaiile (cu excepia radiaiilor ultraviolete) i metodele
chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilen) sunt utilizate rareori n laboratorul de microbiologie.

30
Dezinfecia reprezint distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori i a sporilor) din anumite
medii (lichide, solide) sau de pe suprafee. Se realizeaz cu ajutorul unor ageni fizici sau cu ajutorul
substanelor dezinfectante bactericide (cu efecte negative asupra esuturilor gazdei). mpiedic rspndirea
bolilor infecioase.

Dezinfecia igienic a minilor, prin splare, reprezint utilizarea unui produs cu aciune direct
asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia, fr a aciona asupra florei rezidente.

Dezinfecia chirurgical a minilor, prin splare, reprezint utilizarea unui produs cu aciune direct
asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia i cu aciune asupra florei rezidente.

Produsul pentru dezinfecie de nivel sczut este un agent chimic care distruge bacteriile
vegetative, unii fungi (ex. Candida albicans), virusurile capsulate i virusurile mari necapsulate.

Produsul pentru dezinfecie de nivel intermediar este un agent chimic care distruge bacteriile
vegetative, fungii, virusurile capsulate, virusurile necapsulate i mycobacteriile.

Produsul pentru dezinfecie de nivel nalt este un agent chimic care, n condiii bine definite de
timp i temperatur, distruge microorganismele, are aciune sporicid i reprezint un potenial sterilizant
chimic.

38. Antiseptice i dezinfectante. Mecanisme de aciune


A. Substane care denatureaz proteinele (au n general efect bactericid): acizii, bazele, alcoolii i derivaii
lor (de exemplu alcoolul etilic, CH3-CH2OH, de 70, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor).
B. Substane care oxideaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): hipermanganatul de
potasiu, KMnO71, util n antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, H2O2, soluie 3% n ap,
utilizat n antiseptizarea plgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) i derivaii lor (hipoclorii, cloramine, soluii
iodurate etc. Exist i diferite clase de compui halogenai cu poten mai mare, cum ar fi cei care au n
componena lor radicalul benzil -C6H5. Indiferent de substana folosit este necesar realizarea
concentraiei corespunztoare.
C. Substane care blocheaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): metale grele [srurile
de mercur, preparatele organomercuriale (cum ar fi spre exemplu merthiolatul de sodiu, C9H9HgO2SNa ),
srurile de argint, compui de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide],
gruprile alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei (C9H9HgO2SNa), oxidului de etilen (C2H4O) etc.
D. Substane care lezeaz membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizri limitate datorit
proprietilor caustice i toxicitii sale; este etalonul fa de care se msoar activitatea antimicrobian
a antisepticelor i dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte
toxice mai reduse) etc], detergenii [anionici (spunuri, perlan etc), cationici (sruri cuaternare de
amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu
propilenglicolul)].
E. Substane care altereaz acizii nucleici: coloranii bazici (violet de genian, albastru de metilen, fucsin
bazic etc), derivaii de acridin, de exemplu rivanolul.

31
39. Sterilizarea prin cldur umed; metode, presiune, temperatur, aplicaii
Sterilizarea prin cldur umed este cea mai eficient metod de sterilizare i are ca mecanism
coagularea proteinelor i degradarea enzimelor. Se poate folosi pentru diferite substane n soluie, sticlrie
(cu excepia pipetelor i lamelor), instrumentar chirurgical (metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de
cultur, aparate de filtrat etc.
Tindalizarea (sterilizarea fracionat) este o metod de sterilizare prin cldur umed care evit
depirea unei temperaturi de 100C. Substanele de sterilizat se menin la 56-100C timp de 30-60 minute,
3 pn la 8 zile succesiv. Astfel, utiliznd medii care permit germinarea, dup prima nclzire timp de 30-60
minute sunt distruse formele vegetative iar dup rcire are loc germinarea sporilor. n ziua urmtoare sunt
distruse prin nclzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar dup rcire are loc germinarea
sporilor care nu au germinat n prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la care se va
menine permanent deschis robinetul de vapori (i astfel nu se va depi n interior temperatura de 100C),
bi de ap sau bi de nisip. Prin tindalizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultur etc.

Pasteurizarea i fierberea
Nu reprezint metode de sterilizare, dar sunt utilizate n anumite situaii.
Pasteurizarea folosete cldura umed i are aplicaii n conservarea pentru scurt durat a unor
alimente (lapte, bere etc). Exist o pasteurizare joas (30 minute la 56-65C), o pasteurizare medie (15
minute la 65-75C) i o pasteurizare nalt (2-5 minute la 85-90C). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile
n form vegetativ dar nu i sporii.
Fierberea poate fi utilizat atunci cnd nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare, iar
mecanismul de aciune este denaturarea proteinelor. Fierberea timp de 30 minute la 100oC, distruge
bacteriile n form vegetativ, fungii i virusurile, dar nu i sporii bacterieni. Timpul se nregistreaz dup ce
apa a nceput s fiarb. Eficiena acestei metode poate fi crescut prin adugarea de carbonat de sodiu 1-
2%.

40. Autoclavarea principiu, parametrii tehnici, utilizri


Autoclavarea este esenial att pentru laboratoarele de microbiologie ct i pentru unitile
sanitare n general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de ap realizeaz
la 0,5 atmosfere o temperatur de 115C,
la 1 atmosfer o temperatur de 121C i respectiv
134C la 2 atmosfere.

Autoclavul are ca pies principal un cazan cu perei metalici, care se nchide etan cu un capac
prevzut cu un sistem special de nchidere i n interiorul cruia, vaporii de ap sunt comprimai la presiunea
necesar n vederea sterilizrii (Schema nr. 2).
Exist mai multe tipuri de autoclave:
autoclave cu perete simplu
o verticale
o orizontale
autoclave cu manta de aburi
o verticale
32
o orizontale.

n continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, vertical, la
care vaporii provin din apa aflat n cazanul de presiune i ajung n camera de sterilizare de jos n sus.
Presiunea din interiorul cazanului este nregistrat de un manometru. Pentru punerea n funciune a
autoclavului, n dotare exist 2 robinete: unul superior (robinetul de aer i vapori, care permite legtura ntre
cazan i mediul exterior) i unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita
accidentele exist o supap de siguran care se deschide i permite evacuarea vaporilor atunci cnd,
accidental, presiunea vaporilor depete limita de siguran. n momentul de fa pentru evitarea riscului
de a veni n contact cu vapori de ap fierbini aflai sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care
nu permite deschiderea capacului pn cnd presiunea din interior nu o egalizeaz pe cea din exterior.
Cazanul de presiune este inclus ntr-un perete exterior solid care la partea inferioar are un spaiu n care se
afl sursa de cldur.
n partea inferioar a cazanului de presiune se afl un suport pe care se aeaz o plac de metal
perforat. Pe suport se aeaz materialele care trebuie sterilizate iar faptul c placa este perforat permite
trecerea vaporilor de ap produi dup nclzirea apei. n vederea sterilizrii se procedeaz astfel:
verificm nivelul apei din partea inferioar a cazanului, care trebuie s fie pn la o distan de 2-3
centimetri de suport; dac nivelul a sczut, se completeaz (recomandabil se va utiliza ap distilat);
aezm pe suport obiectele i materialele de sterilizat, ambalate corespunztor;
nchidem etan capacul, folosind sistemul special de etaneizare cu care este dotat autoclavul pe
care l avem la dispoziie;
conectm sursa de cldur;
deschidem robinetul pentru evacuarea aerului i vaporilor (dac rmne aer n cazanul cu presiune
eficiena sterilizrii va scdea considerabil; vaporii de ap fiind mai uori, vor nclzi n special partea
superioar a cazanului n timp ce aerul, care va atinge temperaturi inferioare, fiind mai greu, va
rmne n partea inferioar a cazanului) ;
nchidem robinetul dup evacuarea aerului i apariia unui jet continuu de vapori;
presiunea din cazan ncepe s creasc i este urmrit cu ajutorul manometrului; atunci cnd
presiunea atinge valoarea dorit (de ex. 1 atmosfer), reglm sursa de cldur n aa fel nct
aceast presiune s fie meninut pentru toat durata sterilizrii (de ex. 30 minute) ;
dup trecerea celor 30 minute ntrerupem sursa de cldur i lsm autoclavul s se rceasc pn
cnd presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice;
deschidem lent robinetul de vapori;
deschidem sistemul de etaneizare i capacul autoclavului;
lsm obiectele i materialele s se rceasc n autoclavul deschis;
atunci cnd temperatura scade suficient de mult putem scoate materialele sterilizate.

41. Sterilizarea prin cldur uscat; metode, presiune, temperatur, aplicaii


Sterilizarea prin cldur uscat are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor bacteriene.
Amintim cteva dintre variantele tehnice:

La incandescen

33
Sterilizarea prin nclzire la incandescen (la rou) reprezint introducerea i meninerea n flacra
becului Bunsen pn la nroire, pe toat lungimea, a obiectului care urmeaz a fi sterilizat. Se poate aplica
pentru ansa bacteriologic (cu bucl sau fir) sau pentru spatul.

Flambarea reprezint trecerea prin flacr (de cteva ori) a unui obiect, fr a se atinge temperatura de
incandescen. Flambarea se aplic pentru portans, gtul unui recipient de sticl (tub, eprubet, flacon etc)
sau pentru capilarul pipetelor Pasteur i nu reprezint sterilizare.

Cu aer cald
Sterilizarea cu aer cald se realizeaz n etuv (pupinel, cuptor Pasteur). Etuva este o cutie metalic cu
perei dubli. Cu ajutorul unor rezistene electrice i a unui termostat se obine i menine temperatura
pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii n interiorul aparatului este realizat cu ajutorul unui sistem
de ventilaie (Schema nr. 1).

Pentru majoritatea materialelor care urmeaz a fi sterilizate, temperatura din etuv trebuie s ating
180C, pentru o durat de 1 or sau 160C pentru o durat de 2 ore. Pot exista i alte variante, de exemplu n
funcie de dimensiunea obiectelor de sterilizat.

Sterilizarea cu aer cald este indicat pentru obiecte de sticl, obiecte de porelan, pulberi inerte i
termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de menionat
faptul c repetarea sterilizrii, n timp, conduce la declirea oelului) etc.

Nu se vor steriliza n etuv soluiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vat, bumbac,
fibr sintetic, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator.

Incinerarea
Reprezint arderea pn la obinerea de cenu. Exist anumite reguli stricte privind incinerarea,
pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. n cazul spitalelor, n Romnia au existat astfel de incineratoare
n structura unitii sanitare respective. Odat cu procesul de aderare la Uniunea European i respectiv
necesitatea aplicrii unor reguli impuse pentru toate rile membre, majoritatea incineratoarelor de spital au
fost nchise.

Modul n care s-a realizat n perioada 2003-2004 negocierea privind stoparea activitii acestor
incineratoare nu a inut cont de situaia real din ara noastr. n lipsa unui incinerator propriu, unitatea
sanitar trebuie s ncheie un contract de prestri servicii cu o firm de profil. Din punctul de vedere al
laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse incinerrii materiale de unic folosin din plastic, reziduuri
organice solide, gunoi, cadavrele animalelor de experien etc.

42. Congelarea i liofilizarea bacteriilor definiie, efecte asupra viabilitii


germenilor, aplicaii
Temperaturile joase (n jur de 0-4C) au n general un efect bacteriostatic. La temperaturi sczute,
reaciile biochimice ncetinesc, multiplicarea poate fi stopat. Majoritatea produselor biologice/patologice
pot fi transportate (meninnd viabilitatea germenilor i ncetinind n acelai timp multiplicarea acestora) la
o temperatur de circa 4C. O serie de culturi pot fi de asemenea meninute la temperatura frigiderului

34
pentru o durat limitat de timp n vederea prezervrii i posibilitii de a repeta anumite teste de
identificare etc.

n funcie de viteza cu care are loc rcirea, ntlnim situaii diferite, cu urmtoarele posibile efecte
asupra structurilor celulare bacteriene.

A. Congelarea lent, la temperaturi mai mici -21,3C are efecte bactericide prin formarea de cristale de
ghea i prin hiperconcentrarea salin cu denaturarea proteinelor;

B. Congelarea brusc la -70C are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea n mas a apei fr
apariia cristalelor de ghea;

C. Liofilizarea (criodesicarea) reprezint congelarea brusc concomitent cu desicaia (deshidratarea n vid).


O suspensie microbian n mediu protector, liofilizat, poate fi pstrat n fiole nchise timp ndelungat (de
exemplu vaccinul BCG).

43. Bacteriofagii definiie, structur, tipuri de interaciune fag-bacterie (enumerare)


Bacteriofagii sunt virusuri care paraziteaz bacteriile (de exemplu, bacteriofagii T1-T7 cu specificitate
pentru E. coli). Bacteriofagii (fagii) au fost descoperii n 1915. Prof. Mihai Ciuc obine n anul 1921 primele
tulpini lizogene. n 1949 se nfiineaz n Romnia un Centru naional pentru bacteriofagi. Fagii au o structur
mai complex dect cea a virusurilor obinuite. Se descriu:

1. capul fagului are form de prism hexagonal bipiramidal. Conine ADN dublu catenar helicoidal sau
ARN nconjurat de capsida format din capsomere (nveli proteic); fagii ARN pot avea un numr mic de
gene (ex. 3) n timp ce fagii ADN pot avea pn la 150 gene;
2. coada fagului are structur proteic, simetrie helicoidal; are rol de adsorbie, ajutnd fagul s penetreze
bacteria. Se descriu urmtoarele formaiuni:
cilindrul axial;
teaca cozii;
placa bazal (cu croetele de fixare);
fibrele cozii (formnd un strat n jurul tecii cozii).

Toate proteinele fagice pot conduce la apariia de


anticorpi, descoperire utilizat n studierea nrudirii dintre
diferii bacteriofagi.

Relaii bacteriofag-bacterie
ntre bacteriofag i bacteria gazd se pot stabili
dou tipuri de relaii:

de tip litic sau productiv;


de lizogenizare sau de tip reductiv.

Relaiile sunt strict specifice i sunt mediate de receptori.

35
44. Interaciunea fag-bacterie: ciclul litic (etape, evideniere)

Etape:
1. Adsorbia: Ataarea este specific. Exist receptori strict specifici la nivelul bacteriofagului, ce recunosc
receptori de la nivelul bacteriei. Fixarea pe receptori este iniial reversibil (prin fibrele cozii), apoi
ireversibil (prin croetele plcii bazale). Adsorbia fagic modific permeabilitatea membranei
citoplasmatice bacteriene.
2. Penetrarea: Fagul elibereaz muramidaza care lizeaz mureina din peretele bacterian. Teaca cozii se
contract i antreneaz cilindrul axial prin peretele bacterian, ducnd apoi la injectarea ADN-ului fagic n
citoplasma bacterian;
3. Multiplicarea: Dup aproximativ 4-5 minute, funcia ADN-ului bacterian este blocat i preluat de ADN-
ul fagic ce coordoneaz sinteza componentelor proprii. Se sintetizeaz un numr nsemnat de proteine
virale.
4. Maturarea (ansamblarea) fagului
5. Liza bacteriei (ex. datorit sintezei unor enzime asemntoare lizozimului) i eliberarea bacteriofagului
matur, virulent.

Bacteriile lizosensibile permit adsorbia, penetrarea i multiplicarea fagilor viruleni pn la


realizarea lizei celulei bacteriene.

Evidenierea ciclului litic la nivelul culturilor bacteriene:


n mediu lichid (tulbure), inocularea fagului litic corespunztor duce dup cteva zeci de minute
(uneori chiar i cteva zile) la limpezirea mediului;

Pe mediu solid, nsmnat uniform, inocularea fagului litic duce la apariia unei zone de liz, clar,
bine circumscris (spotul de bacteriofagie), metod utilizat n lizotipie;

Dac se amestec o suspensie de fagi cu o pictur de cultur (pur) bacterian, iar tulpina
respectiv are receptori potrivii bacteriofagilor i aceast suspensie se amestec cu geloz nclzit putem
transfera suspensia ntr-o plac petri;

Bacteriofagii infecteaz bacteriile; dup circa 30 minute bacteriile sunt lizate i elibereaz fagii;
acetia difuzeaz prin geloz i infecteaz bacteriile situate n apropiere i ciclul se reia;

Parte dintre bacterii (cele care nu au receptori potrivii) nu sunt infectate i n timp se multiplic iar
cultura bacterian opacizeaz mediul; dup circa 18-24 de ore putem observa arii cu celule lizate
(transparente) pe un fond produs de cultura bacterian (bacterii nelizate), aceste arii numindu-se plaje de
bacteriofagie; plajele produse de bacteriofagii viruleni sunt clare, n comparaie cu plajele mai puin clare
produse de bacteriofagii temperai (fagii viruleni sunt acei bacteriofagi care nu pot evolua dect n ciclul
litic)

45. Interaciunea fag-bacterie: ciclul lizogen, proprietile bacteriilor lizogene


Dup adsorbie i penetrare, ADN-ul fagic:

36
fie se integreaz liniar n cromozomul bacteriei gazd i se replic sincron cu aceasta,
fie se circularizeaz i ataat de membrana citoplasmatic se replic sincron cu diviziunea bacteriei.

Bacteria a devenit lizogen, se reproduce i transmite descendenilor fagul latent (profag, fag
temperat). n anumite condiii profagul poate deveni fag virulent. Fagul temperat cel mai bine studiat este
bacteriofagul Lambda specific pentru E. coli capsulat (K12).

Proprietile bacteriei lizogene:


1. este imun fa de un fag omolog profagului;
2. pot aprea fenomene importante din punct de vedere genetic:
a. transducia;
b. conversia genetic (cu producerea de exotoxine de ctre unele bacterii lizogenizate, cum ar fi toxina
difteric, toxina scarlatinoas, toxina botulinic de tip C etc);
c. recombinarea genetic (atunci cnd o bacterie parazitat de doi fagi diferii, dar nrudii, elibereaz
la sfritul ciclului litic pe lng tipurile parentale i tipuri de fagi care nsumeaz unele din
proprietile celor doi fagi parentali) etc.;
d. inducia fagic (sub influena unor ageni inductori, de ex. raze UV, sau spontan, profagul i
rectig virulena, devine fag virulent, i produce liza bacteriei respective).

Bacteriile lizorezistente nu permit infecia cu un fag fie datorit lipsei receptorilor specifici, fie
datorit unei stri de imunitate. Bacteriile lizogene sunt imune la fagii viruleni omologi profagului gzduit.

Fagul defectiv reprezint profagul care persist indefinit n stare latent (nu se reactiveaz).

37
46. ADN bacterian; localizare, structur, rol

Suportul ereditii
Genetica bacterian studiaz ereditatea i
variabilitatea la bacterii.

Suportul material al ereditii este reprezentat de


ADN (acidul dezoxiribonucleic). Molecula de ADN conine
codificat informaia ereditar, care se exprim prin sinteza
unor proteine i se transmite prin replicare i diviziune la
descendeni. Gena reprezint unitatea funcional a
ereditii iar noiunea de gen este cunoscut nc din anul
1909.

Dac nu au loc modificri genetice, toi descendenii


unei bacterii vor fi identici cu bacteria mam i identici
ntre ei. O celul bacterian inoculat pe un mediu de cultur
(avnd la dispoziie nutrimentele necesare) va produce prin
multiplicare n condiii prielnice (de pH, temperatur,
umiditate etc.) o colonie bacterian, o clon.

Structura acidului dezoxiribonucleic


ADN-ul este un macropolimer de
dezoxirbonucleotide.

Unitatea structural este format dintr-o baz


azotat purinic (adenina, A; guanina, G) sau pirimidinic
(timina, T; citozina, C), o pentoz (dezoxiriboza) i acid fosforic.

Legturi fosfodiester unesc carbonul 5 al unei molecule de dezoxiriboz cu carbonul 3 al moleculei


adiacente, formnd o caten lung polinucleotidic. Prin analiza compoziiei n baze azotate a ADN-ului
(provenit din surse diferite) s-a demonstrat c exist o anumit compoziie care difer la diversele specii.

Compoziia de nucleotide a ADN-ului este surprinztor de variabil. Suma procentual a citozinei i


guaninei variaz la bacterii de la 22% pn la 74%, n timp ce la organismele eucariote intervalul este ceva
mai restrns (28 - 58%). La om variaz ntre 39-40% n funcie de tipul de esut (timus 39%; ficat 39,4%).
Acest fapt se explic prin evoluia n decursul a mai multor mii de ani a procariotelor comparativ cu a
eucariotelor n general i a omului n particular.

Comparaiile coninutului de C+G ale diferitelor organisme i microorganisme au fost folosite drept
fundament n vederea stabilirii relaionrii/legturii genetice. Timina fiind susceptibil la alterri fotochimice
(lumin UV), bacteriile cu un coninut bogat de C+G este posibil s fi evoluat n medii supuse unei lumini
solare foarte puternice sau unor temperaturi nalte, iar cele cu coninut redus de C+G s-ar fi dezvoltat n
locuri mai protejate.

Aadar, compoziia n baze azotate, numit i procentul de C+G, este diferit n funcie de specie,
dar se pstreaz constant n cadrul unei anumite specii.
38
Procentul de C+G se calculeaz dup formula: (C+G)/ (C+G+A+T). De exemplu acest raport difer la
diferitele specii bacteriene, sper exemplu este 26,8% la Clostridium perfringens, 40% la Streptococcus
pneumoniae, 40,5% la Proteus vulgaris,51,7% la Escherichia coli, 53% la Proteus morgani i67%
la Pseudomonas aeruginosa. Aa cum a fost precizat de ctre diveri autori, compoziia de baze azotate este
un index taxonomic. (1)

La celulele procariote ADN-ul este inelar, mpachetat n nucleoidul din citoplasm. La bacteria
intestinal E. coli cele 4,7 milioane de perechi de baze alctuiesc o macromolecul de 1,4 milimetri lungime,
dar numai 2 nanometri lime. Aceasta conine 4.400 de gene deja secveniate. n ciuda lungimii sale, de
peste o mie de ori diametrul celular, ADN-ul este extrem de bine nfurat n nucleoid, n aproximativ
jumtate din diametrul celular.

ADN-ul apare ca o macromolecul format din dou catene polinucleotidice antiparalele i


complementare rsucite n dublu helix. Cele dou catene sunt unite prin puni de hidrogen formate ntre
bazele azotate opuse (A=T i GC). Modelul structural al ADN-ului a fost propus de ctre Watson i Crick n
anul 1953. Complementaritatea bazelor azotate este cea mai important proprietate a acizilor nucleici i
condiioneaz toate proprietile ADN-ului, mai ales cea de autoreplicare i cea de transfer al informaiei
genetice.

Rolul genetic al ADN-ului a fost dovedit prin experiene succesive, iniial prin cercetrile lui W.
Griffith (1928) privind fenomenul de transformare bacterian, ulterior prin experiene care au confirmat
rezultatele obinute de Griffith, dar abia n 1944 Avery, MacLeod i Mc Carthy demonstreaz faptul c ADN-
ul este substratul chimic al ereditii i reprezint materialul genetic al oricrei celule (funcie ndeplinit aa
cum tim astzi de ARN, la ribovirusuri).

La temperatura camerei ADN-ul este o structur stabil n condiii fiziologice normale, datorit
legturilor intercatenare (2 ntre A i T i 3 ntre C i G). Dac temperatura depete 65C, stabilitatea
punilor de hidrogen ncepe s cedeze, dublul helix ncepe s se desfac i rezult dou catene
complementare (proces numit denaturare termic). Denaturarea devine complet la temperaturi care
depesc valoarea de 90C.

Renaturarea (reannealing) reprezint refacerea structurii bicatenare a ADN-ului, iar prin acest
proces se poate stabili relaia filogenetic ntre dou specii (n funcie de procentul de renaturare). De
exemplu dac se utilizeaz ADN denaturat provenit de la E. coli i ADN denaturat provenit de la Salmonella
spp., fiecare marcat cu acelai izotop (ex. C14), fraciunea de ADN marcat i evaluat prin diferite tehnici va
fi fraciunea din ADN care este complementar pentru cele dou specii (aceste experiene au stat la baza
brevetrii tehnicilor de hibridare molecular). Renaturarea este un proces mai lent dect denaturarea.

Denaturarea i renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice importante, folosite fie n tehnologia
ADN-ului recombinant, fie n studierea relaiilor filogenetice ntre diferite specii. Cu ct speciile sunt mai
nrudite, cu att secvenele de baze azotate au un mai mare grad de similitudine (lanurile lor monocatenare
renatureaz mai rapid).

Funciile ADN-ului ca material genetic sunt:


conservarea informaiei genetice;

39
replicarea;
transcrierea i traducerea materialului genetic;
protejarea materialului genetic propriu (self);
reglarea i controlul activitii celulare.

47. Replicarea ADN bacterian; mecanism

Transmiterea mesajului genetic la bacteriile descendente


Transmiterea mesajului genetic se face prin dublarea cantitii de material genetic urmat de
diviziune.
Replicarea ADN const n sinteza unor
noi molecule de ADN, identice cu molecula
parental i identice ntre ele, pe baz de
complementaritate (replicare
semiconservativ). Dup ruperea legturilor de
hidrogen i separarea celor 2 catene, fiecare
caten servete drept matri pentru sinteza
unei noi catene. Replicarea ADN este una dintre
cele mai importante reacii din lumea vie.
Watson i Crick au fost primii care au propus
modelul semiconservativ de replicare a ADN.
n celula care se dezvolt rapid, exist
posibilitatea ca nainte de terminarea primei replicri s se iniieze nc o replicare. n acest caz celula
bacterian va putea fi merodiploid (doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori dect
n mod normal) sau chiar poliploid (tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori dect n mod normal).
n general, dac replicarea cromozomial nu este succedat de diviunea celulei (aa cum se ntmpl n mod
obinuit), putem remarca n celula bacterian existena cromozomilor supranumerari. Cromozomii
suplimentari (n total 2 sau 4) nu aduc o informaie genetic diferit, pentru c ei reprezint copii ale
cromozomului iniial (deci sunt identici cu acesta).

Repliconul (Jacob, Brenner, Cuzin)


In vivo se pot replica numai
moleculele de ADN constituite ntr-o
unitate de replicare independent numit
replicon. Indiferent dac celula are mai
muli cromozomi (celula eucariot este
diploid) sau un singur cromozom (celula
procariot), tot genomul trebuie s fie
replicat.

40
Repliconul bacterian este bicatenar i circular, caracterizat prin:
secven nucleotidic specific marcnd nceperea replicrii;
gene care codific sinteza unor proteine specifice numite iniiatori;
secven nucleotidic semnal pentru terminarea replicrii.

Exemple de repliconi:
cromozomul i plasmidele bacteriene;
genomul bacteriofagilor.
Cromozomul bacterian este unul dintre cele mai ilustrative exemple de repliconi. O gen structural
din cromozom are toat informaia necesar sintezei iniiatorului replicrii (o protein complex). Dup ce
replicarea a nceput, nu mai poate fi oprit pn n momentul cnd se ajunge la dedublarea cromozomului.
Cromozomul bacterian funcioneaz ca un replicon, fapt dovedit de experiena n care fragmentele
de ADN introduse ntr-o celul bacterian (de ex. prin conjugare) nu se pot replica dac rmn libere n
citoplasm, dar vor putea fi replicate odat cu ntregul cromozom n cazul n care sunt integrate n
cromozomul bacterian.
Replicarea corect este controlat de un mecanism foarte precis care identific apariia de
nucleotide libere, mperecheate eronat i n momentul apariiei unui astfel de eveniment nucleotidul este
tiat iar polimerizarea se oprete (corectitudinea citirii este realizat cu ajutorul ADN-polimerazei I).

48. Plasmidele; definire, tipuri, roluri n celula bacterian

Genomul bacterian este alctuit din dou categorii de determinani genetici:

1. genele eseniale, localizate n structura cromozomului bacterian i


2. genele accesorii extracromozomale prezente n structura:
a. plasmidelor i
b. elementelor genetice transpozabile.

Plasmidele sunt elemente genetice extracromozomiale, capabile de


replicare fizic independent de cromozom (replicon), dar
depinznd de factori codificai de nucleul bacterian. Conin
informaie genetic neesenial pentru viaa celulei
bacteriene. Sunt transmise stabil de-a lungul generaiilor.
Dimensiunea plasmidelor variaz ntre 1kb i circa 200 kb.
Majoritatea sunt alctuite din molecule de ADN circular, dar
exist i plasmide liniare (ex. la Borrelia burgdorferi). Unele
plasmide sunt ADN dublu catenar, dar exist i plasmide de
ADN monocatenar (se consider c plasmidele de ADN
monocatenar reprezint de fapt o situaie intermediar n cursul
procesului de replicare; au fost detectate de ex. la Staphylococcus
aureus).
Unele plasmide (numite i epizomi) pot exista alternativ n stare autonom (libere n citoplasm) sau
integrate n cromozomul celulei gazd (de exemplu factorul F, bacteriofagul temperat etc). Celelalte
plasmide persist indefinit numai n stare autonom (de exemplu plasmida R, Col, F etc).
41
Clasificarea plasmidelor
n raport cu caracterele exprimate fenotipic, plasmidele se pot clasifica n:
1. plasmide care codific rezistena la ageni antibacterieni:
a. factorii R (primul factor R a fost izolat de la o tulpin de Shigella dysenteriae);
b. plasmidele de rezisten la UV etc.
2. plasmide care codific sinteza unor ageni antimicrobieni:
a. factorii Col (conferind capacitatea de producere de colicine cu activitate antibiotic) etc.
3. plasmide de patogenitate care codific sinteza de:
a. hemolizine;
b. factori de colonizare;
c. enterotoxine sau alte exotoxine etc.
4. plasmide care codific enzime ale unor ci metabolice particulare:
a. n anumite condiii, unele bacterii pot utiliza ca surs de C diferite substane cu potenial
toxic, precum octanul sau toluenul, iar plasmidele care permit supravieuirea i dezvoltarea
n aceste condiii se numesc plasmide degradative;
5. plasmide care permit transferul genelor cromozomiale de la o celul care deine respectivul plasmid (F)
la alta, putnd fi transmis inclusiv plasmidul (factorul) F;
6. plasmide criptice, pentru care nu se cunosc caracterele fenotipice exprimate.

Plasmidele Col
Plasmidele Col codific proprietatea unor bacterii de a elabora substane antibiotice de tip special,
numite bacteriocine (colicine, pesticine, vibriocine, piocine etc).
Plasmidele Col sunt transferabile de la tulpinile Col+ la tulpini Col- prin transformare genetic,
transducie fagic sau prin conjugare.
Bacteriocinele sunt bactericide, au un spectru de activitate limitat (fa de specia omolog), iar
biosinteza lor nu are efect letal pentru specia productoare.

49. Factorul F i factorul R; definiie, roluri

Factorul F (factorul de sex, factorul de fertilitate)


Factorul F controleaz capacitatea unor bacterii de a aciona ca donoare de material genetic n
procesul de conjugare. Factorul F codific structurile (de exemplu pilul F) i enzimele necesare transferului
de ADN.
n funcie de prezena plasmidelor F, de raportul lor cu cromozomul bacterian i de modul n care faciliteaz
transferul de material genetic, bacteriile se pot grupa n patru categorii distincte: bacterii F -; bacterii F+;
bacterii Hfr; bacterii F.

Bacteriile F-
Bacteriile F- sunt lipsite de factorul F. Sunt echivalente unor celule femele care se comport ca
receptoare de material genetic.
Bacteriile F+
Bacteriile F+ dein factorul F autonom n citoplasm. Sunt echivalente unor celule masculine,
donoare de material genetic, capabile s transmit factorul F.
42
Bacteriile Hfr (High frequency of recombination)
Bacteriile Hfr (cu mare frecven de recombinare) dein factorul F integrat n cromozomul bacterian.
Se comport ca donoare de material genetic, au o mare frecven de conjugare i recombinare. De obicei
prezena factorului F integrat determin transferul unui numr variabil de gene cromozomale i mai rar,
chiar transferul factorului F.
Bacteriile F
Bacteriile F dein o structur plasmidic de tip special (factor de fertilitate recombinant) care a fost
anterior integrat n structura unui cromozom i s-a desprins din acesta, ncorpornd n structura sa unele
gene cromozomale. Aceste bacterii au caracter de mascul i se comport ca donoare de material genetic
(factorul F).

Plasmidele R
Plasmidele R (de rezisten la antibiotice) confer celulei purttoare rezistena la unul sau la mai
multe antibiotice. Plasmidele R au o structur genetic complex, fiind alctuite din:
gene care asigur proprietatea de rezisten la antibiotice;
gene care formeaz factorul de transfer al rezistenei (RTF).
Asigur capacitatea de replicare autonom i de transfer prin conjugare (cele dou tipuri de
elemente pot exista independent sau se pot asocia).
Transferul plasmidelor R se poate face prin conjugare bacterian sau prin transducia mediat de
bacteriofagi.

50. Definii noiunile de genom, genotip i fenotip; variabilitatea genetic i


fenotipic
Genomul reprezint suma genelor unui organism.
Totalitatea informaiei genetice a unui organism se numete genotip.
Suma caracterelor observabile, specifice unui organism, produse de genotip n interaciune cu mediul
ambiant se numete fenotip.

Bacteriile sunt microorganisme haploide (cu excepiile prezentate anterior), au un singur cromozom
iar pentru remanierea prin recombinare a genomului este necesar transferarea de material genetic de la o
tulpin (donoare) la tulpina receptor (acceptoare). n mod clasic poate avea loc un transfer pe
orizontal ntre tulpini care fie fac parte din aceeai specie fie fac parte din specii foarte nrudite, chiar dac
genotipic sunt diferite. Relativ recent a fost demonstrat posibilitatea unor schimburi genetice ntre tulpini
din specii diferite (ex. n ecosistemul intestinal). Variabilitatea bacterian presupune modificarea la un
moment dat a comportamentului celulei bacteriene sau a descendenilor ei i pot exista n principiu dou
variante:
variabilitatea fenotipic;
variabilitatea genotipic.

Variaiile fenotipice reprezint modificri morfologice sau fiziologice de tip adaptativ, care nu se
transmit ereditar. Genomul nu este afectat.
Variaiile genotipice reprezint modificri definitive ale materialului genetic (cromozomial sau
extracromozomial) care se transmit descendenilor.
43
Mecanismele variaiei genotipice sunt reprezentate de:
mutaie;
transfer genetic urmat de recombinare genetic.

51. Mutaiile la bacterii; definiie, tipuri de mutaii, clasificare


Materialul genetic al unei celule bacteriene poate fi modificat fie prin incorporarea unui fragment de
material genetic exogen (prin procesul de recombinare genetic), fie prin apariia spontan sau indus a unei
mutaii care poate consta n adugarea, pierderea, substituirea sau inversarea ordinii unor baze n secvena
ADN-ului.

Mutaia
Mutaia reprezint o modificare accidental n secvena nucleotidic a unei gene, ducnd la
modificri ale mesajului genetic. Mutaiile pot aprea la nivelul materialului genetic prin:
substituii;
inversii;
inserii;
deleii.

Mutaia spontan
Mutaiile care apar n condiii de mediu obinuite i fr intervenia unui factor decelabil se numesc
mutaii spontane.

Mutaia indus
Mutaiile care se produc sub aciunea unor factori fizici (de exemplu raze UV, radiaii ionizante etc.)
sau chimici (de exemplu agenii alchilani), care acioneaz ca ageni mutageni, se numesc mutaii induse.
Rata mutaiilor induse este semnificativ mai mare dect rata mutaiilor spontane.
Mutaia punctiform are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui singur codon.
Mutaiile extinse reprezint alterri care depesc limitele unui codon, putnd afecta secvene mai
mari ale uneia sau mai multor gene (mutaie poligenic).

Mutaiile regresive (retromutaii)


Afecteaz celule mutante, determinnd revenirea acestora la tipul iniial, restabilind secvena
nucleotidic originar.

Mutaiile supresoare
Permit exprimarea funciei anterioare a genei, dei o modificare a secvenei bazelor nucleotidice
persist.

44
52. Transformarea la bacterii; definiie, mecanism
Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o bacterie donor la o bacterie
receptor sunt:
transformarea;
transferul mediat de bacteriofagi (transducia);
conjugarea.

Transformarea
Transformarea este un transfer genetic realizat atunci cnd bacteria accept ADN liber provenit de la
o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria receptor trebuie s fie competent n a accepta ADN-ul de la
bacteria donor.
Prima transformare a fost descris n 1928 de ctre Griffith, n experimente referitoare la virulena
pneumococilor fa de oarecele alb.
Transformarea poate avea loc doar atunci cnd bacteriile intr n faza staionar a ciclului celular.
Ptruns n celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate nlocui (prin recombinare genetic) o
secven nucleotidic omolog, bacteria receptoare dobndind un caracter genetic nou (de exemplu sinteza
unei structuri capsulare/capsidice).
Unele bacterii sunt competente n mod natural. n cazul bacteriilor care nu sunt natural
competente, pentru a putea realiza fenomenul de transformare este necesar tratarea chimic a acestora,
de ex. cu ioni de calciu.

53. Transducia; definiie, mecanism, tipuri de transducie


Transferul genetic mediat de
bacteriofagi se poate realiza prin:
transducie;
conversie lizogenic.

Transducia
Reprezint transferul unui fragment
genetic (cromozomial sau extracromozomial)
de la o bacterie la alta prin intermediul unui
bacteriofag (de obicei un fag temperat). Fagul
se numete transductor. Bacteria receptoare
se numete transductant.
Transducia specializat (restrictiv)
este caracteristic fagilor transductori care au proprietatea de a transfera numai un numr restrns de gene
bacteriene situate n imediata apropiere a situsului de legare a profagului n cromozomul bacterian.
Transducia generalizat (nerestrictiv) presupune c teoretic, oricare din genele cromozomului
bacterian, indiferent de poziia lor n genom, pot fi ncorporate n mod accidental n particula viral matur
pentru a forma un fag transductor, care le poate transmite unor bacterii receptoare. Transducia

45
generalizat poate fi realizat de un mare numr de fagi neintegrai n cromozomul bacterian atunci cnd
acetia intr n ciclul litic.

Conversia lizogenic
Reprezint apariia unui caracter nou la bacteriile care gzduiesc un profag, de exemplu producerea
toxinei difterice este realizat numai de ctre C. diphtheriae purttor al fagului temperat (profagul care
deine gena tox) iar producerea toxinei scarlatinoase este posibil numai n cazul n care Streptococcus
pyogenes de grup A este lizogenizat. Exist i fagi care sunt integrai n regiuni care codific un anumit
produs din genomul bacterian (ex. fagul P4 de la E. coli se integreaz ntr-o gen care codific leucina).

54. Conjugarea bacterian


Conjugarea bacterian reprezint un proces de transfer de material genetic (cromozomial sau
extracromozomial) realizat prin intermediul unei legturi intercelulare directe. Este condiionat de prezena
factorului F n celula donoare.

Receptorii specifici
Pentru realizarea legturii intercelulare este necesar existena unor receptori de suprafa att la
celula donoare, ct i la celula receptoare. Acetia vor permite recunoaterea reciproc.

Fiziologia conjugrii bacteriene


Dup un numr de alipiri ntmpltoare, bacteriile F+ formeaz cu bacteriile F- perechi de
recombinare i ntre celulele alturate se formeaz un canal de conjugare. Prin canalul de conjugare se
realizeaz transferul unidirecional al materialului genetic. Fragmentul transferat poate fi apoi integrat
parial sau total n genomul celulei receptoare, ducnd la apariia unor proprieti noi ale acesteia, manifeste
sau nu.

55. Substane antibiotice i chimioterapice; definiie, utilizri n clinic i laborator


Antibioticele i chimioterapicele antimicrobiene reprezint un grup de substane medicamentoase
capabile s distrug sau s inhibe multiplicarea unor microorganisme implicate etiologic n bolile infecioase.
Au o aciune selectiv asupra celulelor microorganismelor, exercitnd aciuni minime asupra celulelor
organismului gazd. Aceste substane pot fi:
antibacteriene,
antivirale,
antifungice,
antiparazitare.

n mod clasic, n aceast grup de medicamente au fost incluse i antineoplazicele (ex.


dactinomycina, doxorubicina, bleomycina). Exist i antibiotice folosite ca:
inhibitori enzimatici (ex. Lipstatin, sintetizat de Streptomyces toxytricini),
imunosupresori (ex. Ciclosporina, sintetizat de Tolypocladium inflatum),
46
hipocolesterolemiante (ex. Lovastatin, sintetizat de Aspergillus terreus),
insecticide,
ierbicide etc (1).

56. Antibiotice bactericide i bacteriostatice; definiii, exemple


Un antibiotic este bacteriostatic dac efectul su se limiteaz la oprirea multiplicrii bacteriene (ex.
tetraciclinele, cloramfenicolul, eritromicina, clindamicina, sulfonamidele etc).
Un antibiotic este bactericid dac aciunea sa duce la distrugerea bacteriilor (ex. penicilinele,
cefalosporinele, polimixinele, aminoglicozidele, rifampicina, vancomicina, streptograminele etc).
Trebuie cunoscute situaiile patologice n care se poate administra un antibiotic bacteriostatic,
precum i situaiile n care este absolut necesar administrarea unui antibiotic cu efect bactericid (spre
exemplu la persoanele care prezint imunodepresie).

57. Clasificarea substanelor antimicrobiene dup mecanismul de aciune; exemple

A. ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea sintezei peretelui celular; au efect bactericid i sunt
reprezentai de antibioticele beta-lactamice (peniciline, cefalosporine, carbapeneme etc), glicopeptidele
(vancomicina, teicoplanina), bacitracina, cicloserina, fosfomicina, izoniazida etc;
B. ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea funciei membranei celulare; au efect bactericid i
sunt reprezentai de polimixine (polimixin B, colistin), gramicidin, tirocidin, imidazoli, nistatin,
amfotericin B etc (ultimele trei fiind medicamente antifungice);
C. ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea sintezei proteice la nivelul ribozomilor; de exemplu
aminoglicozidele, tetraciclinele, cloramfenicolul, macrolidele, lincosamidele (lincomicina, clindamicina),
acidul fusidic, streptograminele etc;

47
D. ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea sintezei acizilor nucleici, de exemplu rifampicina,
chinolonele, sulfonamidele, trimetoprimul, pirimetamina, novobiocina etc.

58. Clasificarea antibioticelor dup structura chimic; clase principale, exemple


1. Antibioticele betalactaminice
a. Penicilinele
penicilinele naturale (de exemplu penicilina G);
penicilinele penicilinazorezistente (de exemplu meticilina)
aminopenicilinele (de exemplu ampicilina)
b. Cefalosporinele
din generaia I (de exemplu cefalotina, cefaloridina);
din generaia a II-a (de exemplu cefamandola, cefoxitina, cefuroxima);
din generaia a III-a (de exemplu cefotaxima, ceftriaxona);
din generaia a IV-a (de exemplu cefepima, cefpiroma).
c. Alte antibiotice beta-lactaminice (aztreonamul)
d. Inhibitori de beta-lactamaze (ex. acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul).
2. Glicopeptidele (teicoplanina i vancomicina);
Vancomicina este utilizat n tratamentul infeciilor cu S. aureus meticilino-rezistent. Se administreaz
intravenos deoarece nu se absoarbe n tractul gastrointestinal. Printre reaciile adverse amintim reaciile
anafilactice, febr, eozinofilie, neutropenie, pierderea auzului.
3. Aminoglicozidele
a. streptomicina (care este de fapt un oligozaharid);
b. kanamicina, gentamicina, amikacina, spectinomicina, tobramicina, netilmicina etc.;
4. ciclinele (ex. tetraciclina, oxitetraciclina, minociclina, doxiciclina etc);
5. Ansamicinele (ex. rifampicina, rifabutina);
6. Macrolidele (ex. eritromicina, claritromicina, azitromicina, telitromicina);
7. Polipeptidele ciclice (polimixina B, colistinul);
8. Antibioticele care nu se ncadreaz n nici una din grupele de mai sus
a. cloramfenicolul;
b. lincosamidele (lincomicina i clindamicina);
c. acidul fusidic (cu o structur asemntoare steroizilor);
d. streptograminele (pristinamicin, quinupristin, dalfopristin);
e. oxazolidinonele (linezolid);
f. mupirocinul; ultimele 4 grupe de medicamente au fost descoperite n special ca rspuns la
apariia tulpinilor de stafilococ rezistente la meticilin etc.

Chimioterapicele
1. Sulfamidele (sulfonamidele) (ex. sulfadiazina, sulfafurazolul);
2. Co-trimoxazolul (asociere trimetoprin + sulfametoxazol)
3. Dapsona (diaminodifenilsulfona);
4. Ethambutolul;

48
5. Hidrazida acidului izonicotinic (HIN, izoniazida);
6. Chinolonele (ex. acidul nalidixic, ofloxacina, ciprofloxacina, norfloxacina, levofloxacina, moxifloxacina,
gatifloxacina, gemifloxacina etc);
7. Nitrofuranii (ex. furazolidonul, nitrofurantoina);
8. Nitroimidazolii (ex. metronidazolul, tinidazolul, ornidazolul) etc.

59. Rezistena la aciunea antibioticelor; definiii, tipuri


Utilizarea cu succes a oricrui agent terapeutic poate fi compromis de dezvoltarea rezistenei.
Rezistena poate s apar att pentru antibioticele utilizate n tratamentul infeciilor bacteriene ct i pentru
antifungice, antivirale, antiparazitare sau pentru medicamentele utilizate n tratamentul unor boli cronice.
Trei condiii trebuiesc ndeplinite ca un anumit antibiotic s inhibe bacteria susceptibil:
antibioticul trebuie s poat s ajung la int ntr-o concentraie suficient;
antibioticul nu trebuie s fie inactivat nainte s se lege de int;
trebuie s existe n celula bacterian o int vital susceptibil la aciunea antibioticului.

Rezistena microbian la antibiotice reprezint capacitatea unor microorganisme de a supravieui i


de a se multiplica n prezena antibioticului.
Fenomenul de rezisten la antibiotice a fost descris relativ rapid dup introducerea acestora
(ex. Streptococcus pyogenesrezistent la sulfonamide, Staphylococcus aureus rezistent la penicilin
sau Mycobacterium tuberculosis rezistent la streptomicin) n practica medical.
Pe msur ce au fost descoperite mecanismele prin care medicamentele antiinfecioase afecteaz
multiplicarea sau distrug diferitele tipuri de bacterii (ex. mecanismul de aciune al beta-lactaminelor) au fost
descoperite i mecanismele prin care bacteriile pot rezista fa de aciunea medicamentului antibacterian
(ex. producerea de enzime numite beta-lactamaze / penicilinaze, cefalosporinaze etc).
Rezistena poate fi natural sau dobndit.

Rezistena natural
Rezistena natural (intrinsec) reprezint rezistena tuturor membrilor unei specii bacteriene fa
de un antibiotic i este determinat genetic, de exemplu rezistena bacilului tuberculozei (Mycobacterium
tuberculosis) la penicilina G.

Rezistena dobndit
Rezistena dobndit este acea rezisten necaracteristic unei specii bacteriene, dar achiziionat
de anumite subpopulaii din acea specie n circumstane date; de exemplu, antibioticul acioneaz ca un
presor selectiv (pacientul are o infecie n care majoritatea populaiei bacteriene este sensibil la agentul
antimicrobian, dar exist tulpini care prezint rezisten; n aceste condiii, tulpinile sensibile vor fi inhibate
sau distruse n timp ce tulpinile rezistente vor fi selectate; aceast situaie nu poate fi detectat dect
utiliznd tehnicile de testare a sensibilitii bacteriilor la antibiotice i chimioterapice, de ex. antibiograma
difuzimetric standardizat). Rezistena dobndit poate fi cromozomial sau extra-cromozomial.

Tipuri de rezisten
1. Rezistena fa de un agent antimicrobian poate fi:
49
a. monovalent (monorezistena), atunci cnd germenii rezist la un singur antibiotic;
b. plurivalent (rezistena multipl, la mai multe antibiotice);
2. Din alt punct de vedere, rezistena se poate manifesta:
a. direct (leag o anumit bacterie de un singur anumit antibiotic);
b. ncruciat (rezistena unei bacterii fa de mai muli ageni antimicrobieni cu structur i/sau
mecanism de aciune asemntor); de ex. rezistena la o sulfonamid sau la o tetraciclin
confer rezisten la toate sulfonamidele sau la toate tetraciclinele n timp ce stafilococii
rezisteni la meticilin (MRSA) sunt rezisteni la toate medicamentele beta-lactamice;
3. Dup ritmul de instalare, rezistena poate fi:
a. cu ritm rapid de instalare (monostadial), tip streptomicin;
b. de ritm intermediar, tip eritromicin;
c. cu ritm lent de instalare (pluristadial), tip penicilin;
d. cu ritm foarte lent de instalare, tip vancomicin.

60. Antibiograma difuzimetric; principiu, interpretare


Din punct de vedere tehnic nsmnm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar Mueller-
Hinton) turnat n plci Petri. nsmnarea se poate realiza de exemplu prin inundarea plcii urmat de
aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui tampon (exist i alte variante tehnice). Dup
circa 20 minute (timp n care placa Petri se las cu capacul ntredeschis n vecintatea becului de gaz, aprins)
se aplic microcomprimatele n care sunt ncorporate antibiotice n concentraie standardizat. Aplicarea
microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, n condiii aseptice, sau cu ajutorul unui aplicator
automat (la minim 30 mm distan ntre ele i minim 15 mm de marginea plcii; vom utiliza 5 antibiotice
diferite pentru o plac Petri cu diametrul de 9 cm).

Microcomprimatele trebuie s vin n contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu ajutorul unei
pense le presm uor (dup caz). Dup nc 15-20 minute, incubm plcile peste noapte n termostat, la 28
sau 35-37C, n funcie de temperatura optim de multiplicare a microorganismului testat.

Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzeaz n mediu, realiznd zone de inhibiie n care
coloniile microbiene nu se dezvolt.

Cu ct zona de inhibiie este mai larg, cu att germenul va fi considerat mai sensibil. Dac n
interiorul zonei de inhibiie (chiar dac diametrul nregistrat este foarte mare) se dezvolt colonii, mutani
rezisteni, germenul va fi considerat rezistent.

Aceast metod, cu toate c este folosit pe scar larg n laboratoare, permite de fapt numai
eliminarea antibioticelor complet inactive i eventual selecionarea antibioticelor foarte active, pentru c
tehnica nu este standardizat.

50
Antibiograma difuzimetric standardizat
(Kirby-Bauer, NCCLS)

Din punct de vedere tehnic se realizeaz


asemntor cu prima metod prezentat, dar este
standardizat, fiind singura metod difuzimetric
recunoscut pe plan internaional, care permite
obinerea unor rezultate reproductibile i corelabile
ntre laboratoare diferite

Elementele necesare standardizrii sunt:

mediul (agar Mueller-Hinton)


pH-ul mediului (ntre 7,2 i 7,4);
grosimea mediului trebuie s fie de 4 mm
(25 ml de mediu/plac de 9 cm);
inoculul (din 5 colonii izolate - cultur
pur) cu tubiditate corespunztoare (0.5
McFarland aprox. 108 uniti/ml)
timpul, atmosfera, umiditatea de incubare;
concentraia substanelor i diametrul
interpretarea rezultatelor (se msoar diametrul zonei de inhibiie i se compar rezultatele cu
cele din tabelele puse la dispoziie de productori i/sau centrele de referin).

Metodele difuzimetrice au dezavantajul c nu permit aprecierea concentraiilor eficace ale antibioticului la


nivelul focarului infecios.

61. Definii noiunea de CMI i CMB; cum se determin i care este utilitatea
determinrii CMI i CMB ?

CMI
Acest tip de metod ofer informaii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate, fa de
microorganismul testat. CMI = concentraia minim inhibitorie, reprezint cea mai mic concentraie de
agent antimicrobian, exprimat n micrograme/ml, care mai exercit o aciune bacteriostatic asupra
germenului testat.

Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi cu bulion
Mueller-Hinton n concentraii descrescnde (diluii binare), plus 2 tuburi martor, fr antibiotic (cantitatea
final va fi de 1 ml n fiecare tub). Preparm un inocul standardizat turbidimetric i n condiii aseptice
inoculm toate cele 10 tuburi cu cte 1 ml de inocul. Agitm pentru a omogeniza. Incubm cele 8 tuburi cu
antibiotice i 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37C iar al doilea tub martor l meninem pentru aceeai
perioad la temperatura frigiderului. Pentru controlul de calitate utilizm i un ir de tuburi pe care le
inoculm cu o tulpin de referin corespunztoare. n ziua urmtoare citim i interpretm rezultatele.

51
Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egal cu
cantitatea de mediu, concentraia final de antibiotic se va
njumti (de ex. n tubul n care diluia iniial a fost de
16 mg/ml, diluia final va fi 8 mg/ml etc.). n tubul martor
meninut la +4C ar trebui s nu fie prezent creterea, n
tubul martor meninut la 35-37C creterea trebuie s fie
prezent.

n tuburile inoculate cu tulpina de referin trebuie


s avem rezultatul corespunztor datelor pe care le
cunoatem privitor la respectiva tulpin.

n tuburile cu microorganismul testat, ultima diluie care a inhibat dezvoltarea microorganismului


corespunde CMI. Se consider (n general, pentru c CMI difer n funcie de specia microbian) c
microorganismele n cazul crora CMI este = 3 mg/ml vor fi eficient inhibate de ctre antibioticul respectiv i
in vivo.

CMB
Pornind de la rezultatul obinut prin
metoda diluiilor n mediu lichid, se vor utiliza
ca surs de inocul tuburile n care
dezvoltarea microbian a fost inhibat.

Este necesar o plac Petri cu agar


Mueller-Hinton care va fi mprit n
sectoare, numrul de sectoare fiind
corespunztor numrului de tuburi fr cretere microbian. nsmnm n condiii aseptice din fiecare tub
fr cretere microbian, fiecare n sectorul de plac corespunztor. Incubm pentru 16-18 ore la 35-37C.
CMB va corespunde ultimei concentraii de antibiotic care a distrus microorganismele nsmnate (sectoare
de plac fr apariia culturii). Se consider c antibioticul va fi eficient in vivo dac n serul pacientului se
pot atinge concentraii de antibiotic care s depeasc de 4-8 ori CMB.

Determinarea CMI i CMB este extrem de important pentru aprecierea eficacitii antimicrobiene a
unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentul infeciilor severe (de exemplu endocardite,
meningite, sepsis etc), precum i la imunodeprimai, efectuarea acestei metode este indispensabil.

62. Definii noiunile de simbioz, comensalism, parazitism; exemple


Cu o parte din microorganismele ntlnite organismul stabilete relaii de simbioz, convieuirea
fiind folositoare pentru ambii parteneri (de exemplu sinteza de vitamine la care particip unii coliformi
intestinali).

Foarte multe din microorganismele care alctuiesc microflora normal se afl n relaii de
comensualism cu organismul, germenii depinznd nutriional de gazd, creia nu i creeaz prejudicii.
52
Aceast convieuire exprim ns un echilibru instabil, care poate fi uor tulburat. Diferii factori (ai gazdei,
din mediul extern sau biologici intrinseci ai germenilor) pot modifica aceste relaii, astfel nct unele
microorganisme din flora normal pot manifesta aspecte patogene - este vorba de microorganismele
condiionat patogene.

Relaia de parazitism tipic apare ns doar atunci cnd microorganismele se dezvolt n detrimentul
gazdei, cu manifestri clinice mai mult sau mai puin evidente.

Astfel, n cazuri extreme unele bacterii sunt obligatoriu parazite, nu se pot dezvolta dect n
organismul gazdei (de exemplu Mycobacterium leprae,Treponema pallidum, Chlamydia pneumoniae etc).
Alte bacterii sunt facultativ parazite, putnd tri i libere n natur, dar o dat ptrunse n organism stabilesc
cu acesta relaii de parazitism (de exemplu Clostridium tetani, Clostridiile gangrenei gazoase, Salmonella
typhi etc).

63. Definii patogenitatea i virulena; exemple de factori de patogenitate


Patogenitatea reprezint capacitatea unui germen de a declana n organismul gazd fenomene
morbide, patogene, modificri locale, generale i functio laesa. Patogenitatea este un atribut de specie i
este determinat genetic.

Virulena reprezint gradul diferit de patogenitate exprimat n cadrul unei specii. Este un atribut al
tulpinii microbiene agresoare. Variabilitatea n exprimarea patogenitii depinde de condiiile n care triete
microorganismul respectiv (de exemplu, o populaie bacterian care a pierdut virulena n condiii
nefavorabile poate redeveni virulent n anumite condiii, aa cum se ntmpl cu tulpina vaccinal BCG la
pacienii cu infecie HIV / SIDA). Virulena poate fi cuantificabil de ex. prin numrul de microorganisme
necesare n condiii standard pentru a omor 50% dintr-un grup de animale (acest numr este numit DL50,
adic doza letal 50%).

Factorii care condiioneaz patogenitatea i virulena unei specii (tulpini) microbiene pot fi:

multiplicarea i invazivitatea manifestat de germenii patogeni;


multiplicarea i elaborarea de toxine de ctre germenii toxigeni (n general exotoxine).

64. Flora microbian normal a organismului uman


Flora microbian a organismului poate fi divizat n dou grupuri:

flora normal rezident, care se gsete n mod regulat i care dac este perturbat se restabilete
prompt (sau destul de prompt)
flora tranzitorie care poate coloniza gazda pe o perioad variabil de timp, de la ore la sptmni.

Flora microbian prezint tropism pentru anumite regiuni anatomice.

La nivelul tegumentului

53
n funcie de contactul cu mediul nconjurtor, flora bacterian prezint un grad marcat de
variabilitate. Mai frecvent, la nivel tegumentar se pot gsi Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium
spp., Micrococcus spp.,dar,temporar, tegumentul poate fi contaminat cu germeni coliformi, chiar stafilococi
potenial patogeni precum Staphylococcus aureus, ns fr manifestri nete de agresivitate.

La nivelul conjunctivei oculare


Conjunctiva este puin colonizat, deoarece secreiile lacrimale conin substane bactericide (ex.
lizozim), iar clipitul asigur ndeprtarea mecanic a corpilor strini, inclusiv a bacteriilor. Pot fi totui
identificai Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium spp.

La nivelul mucoasei nazale


n mod normal se pot gsi stafilococi aurii i albi, streptococi, corynebacterii, pneumococi etc, flor
supus numeroaselor contaminri prin contacte i traumatisme locale.

La nivelul cavitii bucale


La nivelul cavitii bucale flora conine diferii coci i bacili Gram-pozitivi i Gram-negativi, aerobi i
anaerobi (de exemplu stafilococi, streptococi precum S. salivarius), de origine aerian sau alimentar. Exist
o adevrat microbiologie oral, cu diferene n funcie de localizare. Spre exemplu, pentru o celul de la
nivelul dosului limbii exist aproximativ 100-150 bacterii, ntr-un ml de saliv sunt circa 100M bacterii, iar la
nivelul plcii dentare, circa 100B bacterii (aproximativ 35 de specii, dominant fiind Streptococcus
sanguis i Streptococcus mutans). Placa dentar, cariile i boala parodontal sunt cauzate de bacteriile ce
constituie flora normal bucal.

La nivelul tractului respirator


Mucoasa nazal este ntotdeauna bogat colonizat, fiind supus unor numeroase contaminri prin
contacte i traumatisme locale. n mod normal se pot gsi Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus
aureus (la aproximativ 20% din populaie), streptococi, corynebacterii, pneumococi etc. Flora de la nivelul
faringelui se aseamn n compoziie cu flora cavitii bucale. Tractul respirator inferior este steril, fapt
datorat i clearance-ului mucociliar.

La nivelul tractului digestiv


La acest nivel exist o diferen evident n funcie de segmentele acestuia, exprimate mai ales prin
chimismul local. Lund ca exemplu colonul copilului mare i al adultului, la acest nivel se gsesc o serie de
bacili Gram-negativi (enterobacterii), precum i foarte numeroi germeni anaerobi (enterococi) etc, n total
existnd aproximativ 1011 bacterii la 1 g de materii fecale.

La nivel urogenital
Urina este n mod normal steril, iar n timpul miciunii bacteriile de pe tractul urinar inferior sunt cel
mai frecvent ndeprtate. Totui, n uretra anterioar poate exista o flor care este cel mai frecvent alctuit
din fungi, staflococi, corinebacterii i enterobacterii.

Flora vaginal este dominat de lactobacili (flora Dderlein) asociai n proporii diferite cu
mycoplasme nepatogene, stafilococi, streptococi, enterococi, clostridii, Candida spp. etc. Predominana
54
lactobacililor menine local un pH acid nefavorabil multiplicrii altor germeni (n special patogeni). Mucusul
cervical are n plus o aciune bactericid prin lizozim. La femeile fr activitate sexual predomin
lactobacilii, pe cnd la restul compoziia florei este mixt.

65. Definii noiunile de exotoxin, endotoxin, anatoxin i antitoxin; exemple


Germenii se multiplic la poarta de intrare i elaboreaz exotoxine care produc alterri celulare i
distrucii tisulare la distan, prin inhibarea metabolismului celulei eucariote i prin functio laesa (toxikon
era otrava n care erau nmuiate sgeile lupttorilor greci). Din punct de vedere didactic trebuie menionate
urmtoarele noiuni:

Exotoxinele
Exotoxinele sunt elaborate n general de microbi Gram-pozitivi
lizogenizai (de exemplu bacilul difteric, streptococul beta hemolitic de grup
A, Clostridium botulinum) sau codificat plasmidic (Clostridium tetani, Bacillus
anthracis), dar i de bacili Gram-negativi, prin mecanism cromozomial (V.
cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas aeruginosa) sau sub
control plasmidic (unele tulpini de E. coli).

Au structur proteic, fiind formate dintr-un domeniu B (bind)


obligatoriu, necesar legrii de receptorii celulei gazd i internalizrii ulterioare a
poriuni enzimatice A (active). Exotoxina nu i exercit efectele toxice dect
dup ce poriunea A este eliberat din structura iniial. Sunt secretate n timpul
vieii germenilor. Sunt difuzibile la distan. Toxicitatea lor este foarte mare,
doza letal fiind de circa 0,1 g/kg corp (pn la 1 ng/kg corp n cazul toxinei
botulinice).

Au putere antigenic mare, fa de ele aprnd anticorpi antitoxin.

Antitoxinele
Avnd structur proteic, exotoxinele sunt imunogene i determin apariia de anticorpi specifici
(antitoxine) care pot neutraliza in vitro sau in vivo activitatea toxic prin cuplare specific cu toxina. Se pot
obine astfel seruri imune utile n seroterapia specific. De regul aceste seruri sunt preparate pe cal i sunt
utile n neutralizarea exotoxinelor (ex. n tratamentul difteriei, tetanosului, botulismului).

Administrarea antitoxinelor trebuie fcut cu precauie datorit faptului c anticorpii preparai pe


cal reprezint n acelai timp i antigene pentru gazda uman, dar n acelai timp ct mai curnd posibil.

Anatoxinele
Exotoxinele pot fi detoxifiate ntr-un anumit interval de timp sub aciunea conjugat a temperaturii
i formolului. Prin acest procedeu i pierd puterea toxic, dar i menin puterea imunogen i devin
anatoxine. Anatoxinele se utilizeaz n profilaxia bolilor produse de germenii respectivi (n cadrul vaccinurilor
DTP, DT, dT, ATPA, ADPA etc), precum i pentru hiperimunizarea animalelor n scopul obinerii de seruri
antitoxice (antidifteric, antitetanic, antibotulinic etc).
55
Endotoxinele
Endotoxinele au fost evideniate la germenii Gram-negativi, la nivelul membranei externe. Sunt
elaborate de acetia i apoi incluse n peretele bacterian, eliberndu-se n urma distrugerii germenilor. Au
structur lipopolizaharidic (LPZ sau LOZ), n constituia lor intrnd acizi grai, un lipid A i lanuri de
polizaharide.

Au efecte toxice la nivelul celulelor majoritii mamiferelor; aceste efecte sunt similare indiferent de
specia bacterian care le elibereaz. Toxicitatea lor este ceva mai redus (n comparaie cu exotoxinele), dar
pot aciona la mai multe nivele inducnd apariia febrei, leucopeniei, hiperpermeabilitii vasculare,
hipotensiunii arteriale pn la colaps, sindromului de coagulare intravascular diseminat etc. Sunt implicate
ntre altele n apariia ocului endotoxic (se elibereaz o cantitate de endotoxin proporional cu numrul
germenilor distrui). Studiile arat c mortalitatea n ocul endotoxic este n relaie destul de direct cu
cantitatea de endotoxin / ml, fiind de circa 80% la cazurile la care se identific 100 uniti endotoxin / ml
de plasm.

Aa cum am menionat n capitolul


privind structura bacterian, componenta
toxic este reprezentat de lipidul A; totui,
i polizaharidul O (structur antigenic)
contribuie la patogenitate s-a dovedit c
bacteriile de la care s-a extras polizaharidul
O sunt mai uor distruse prin mecanisme
care implic sistemul complement. LPZ aflat
n circulaie se cupleaz cu proteine
plasmatice (LPS-binding plasma proteins) i
apoi este recunoscut prin intermediul receptorilor CD14 de ctre monocite i macrofage. Se activeaz
rspunsul inflamator, coagularea intravascular, apariia de hemoragii i n final poate rezulta ocul. Sunt
implicate mai multe citokine, de ex. IL-1, IL-6, IL-8 i TNF- care la rndul lor stimuleaz cutia Pandorei i
respectiv producia de leucotriene i prostaglandine (cu efect de cretere a fenomenelor inflamaiei). Sunt
activate att sistemele de coagulare ct i sistemul complement iar cascadele de reacii care apar sunt
rareori reversibile n urma tratamentului.

Puterea antigenic i imunogen este mai redus fa de exotoxine. LPZ n calitate de mitogen
stimuleaz o activare policlonal a LB, cu secreia de IgG i IgM.

66. Inflamaia; definiie, factori care determin procesul inflamator


Inflamaia este un proces fiziopatologic complex ce include: fenomene alterative, fenomene de tip
reactiv, vasculo-exudative i proliferative (este vorba despre o reacie tisular nespecific, cu caracter de
aprare local) i fenomene reparatorii. Inflamaia are drept principal scop limitarea aciunii i eventual
neutralizarea agentului agresor (indiferent de natura acestuia). Cu alte cuvinte, discutm despre
fenomenul inflamator i n cadrul unor agresiuni microbiene (bacteriene, fungice, parazitare, virale,
prionice), dar inflamaia reprezint un concept mult mai complex (apare n mult mai multe circumstane,
dect n cele infecioase).

56
Inflamaia poate interesa esuturi, organe, sisteme sau chiar
ntregul organism i are drept semne / simptome clasice, urmtoarele:
tumor (umflare, edem), rubor (eritem, nroire local), calor(temperatur
crescut n zona n care evolueaz fenomenul inflamator), dolor(durere),
nsoite sau nu de functio laesa (tulburri funcionale mai ample sau
mai puin ample, mergnd pn la impoten funcional, de ex.
imposibilitatea deplasrii membrului inferior datorit unei inflamaii la
articulaia genunchiului, n cadrul unei infecii diseminate cu Neisseria
gonorrhoeae).

Ageni determinani
Exist o mare diversitate de ageni determinani ai unui proces
inflamator, printre acetia putnd fi enumerai:

diferiii ageni fizici (radiaii, frig, cldur, curent electric,


traumatisme etc.);
microorganismele (prioni, virusuri, bacterii, fungi, parazii);
agenii chimici exogeni, unii nc necunoscui pn n acest moment,
dar exemplificarea ncearc s dea n primul rnd sensul diversitii i
s explice faptul c fenomenul inflamator poate fi determinat de
foarte multe substane dintre care vor fi enumerate doar cteva,
exogene (ex. ulei de croton, terebentin, caolin, dextran etc) i / sau
endogene (uree, acizi biliari etc.), care produc leziuni la nivelul
sediului eliminrii lor din organism pe alte ci dect cele fiziologice
(de exemplu n situaia apariiei unui reflux bilio-gastric).

Indiferent de agentul determinant, n urma aciunii acestuia va


putea aprea o afectare a vaselor mici, a esutului colagen (noiune
foarte important pe care o vom rentlni n cadrul discutrii diferitelor
maladii, cu sau fr o determinare precizat), a proteinelor interstiiale
etc., rezultnd astfel eliberarea i de cele mai multe ori activarea unor
mediatori i a unor enzime. Acestea din urm pot fi considerate mecanismelele de declanare sau trigger
pentru procesul inflamator.

n rezumat, inflamaia reprezint reactivitatea diferitelor structuri ale organismului, structuri care
aparin diferitelor reele informaionale (de exemplu reeaua imun ce include organe ale sistemului imun,
celule ale sistemului imun, substane sintetizate i eliberate n cursul reaciilor imune, inter-relaii mediate
celular sau umoral etc) ce declaneaz diferite tipuri de rspunsuri care urmresc, cel puin n stadiile
iniiale, s realizeze o reechilibrare i aducere la normal, la situaia anterioar intrrii n contact cu
agentul agresor. Dintre variantele de posibile reacii putem s amintim:

modificri la nivelul microcirculaiei, cu creterea calibrului vascular,


creterea permeabilitii vaselor mici i scderea vitezei de circulaie (staz);
modificri ale hemostazei i respectiv marginaia, diapedeza, migrarea leucocitelor.

57
Rezultatul acestei reactiviti este reprezentat de ex. de apariia exsudatului inflamator (care poate fi
examinat prin metode de laborator).

Aa cum am menionat mai sus, toate aceste fenomene sunt declanate pentru neutralizarea
activitii agentului determinant (al inflamaiei). Fenomenele vasculo-exsudative, la fel ca i exsudatul
inflamator, ncearc s limiteze efectele produse de agentul pro-inflamator i s mpiedice extinderea
procesului inflamator spre zonele nvecinate sau la nivelul ntregului organism. n cazul n care aceste
activiti au succes, alte fenomene vor conduce la asanarea focarului inflamator. Aceste fenomene, n
ansamblu, pot determina:

vindecarea anatomic n totalitate (restitutio ad integrum),


vindecarea nsoit de cicatrizare sau
cronicizarea inflamaiei.

Aa cum am aminitit, procesul inflamator este un proces fiziopatologic. Cel mai frecvent exist
tendina ctre vindecarea esuturilor lezate. Inflamaia devine un fenomen patologic n cazul n care
sistemele de control sunt dezorganizate sau atunci cnd procesul inflamator se cronicizeaz.

Modificrile fiziopatologice apar independent de cauza inflamaiei sau, cu alte cuvinte, indiferent de
agentul determinant. Chiar dac acesta este reprezentat de un traumatism prin compresiune, o neptur
sau o tietur (de ex. cu un instrument chirurgical), o arsur (indiferent de procentul de tegument afectat),
de bacterii, virusuri, parazii, sau este vorba de o necroz (mortificare) tisular care apare n cursul
dezvoltrii unui neoplasm (cancer) sau n urma apariiei metastazelor tumorii primare, n cursul procesului
inflamator va rezulta sinteza i eliberarea reactanilor de faz acut (RFA).

Diferitele particulariti structurale ale organismului gazd sau ale unui anumit esut ar putea explica
(parial) diversitatea fenomenelor inflamatorii identificate ca fiind produse de ctre acelai agent etiologic.
Spre exemplu, Salmonella enteritidis serotipul typhimurium produce inflamaii proliferative la nivelul
sistemului limfatic i respectiv inflamaii exsudative n parenchimul pulmonar. Mycobacterium tuberculosis,
agentul etiologic al tuberculozei, produce inflamaii alterative (la nivel pulmonar), inflamaii exsudative (la
nivel pleural) sau inflamaii proliferative (la nivel dermic).

67. Etapa mecanismelor de declanare a inflamaiei


Etapa de declanare, n care agentul determinant produce modificri la nivelul esutului interstiial
i n celulele parenchimatoase. Rezultatul detectabil prin metode de laborator este eliberarea unor factori
chemotactici, a unor proteaze i kinaze.

Factorii eliberai conduc la apariia rspunsului inflamator acut, respectiv:

vasodilataie capilar (eritem, nroire),


exsudare de proteine plasmatice (edem, umflare) i
acumulare de leucocite PMN.

Principalele proteine care apar n aceast etap sunt componentele sistemului complement, dar i
diferite citokine. Elementele celulare importante n realizarea procesului inflamator sunt reprezentate de

58
sistemul monocit-macrofag (sistemul mononuclear fagocitar), colagenul vascular i celulele endoteliale. Este
de menionat i subliniat rolul important al ficatului.

Acumularea de celule inflamatorii la locul unde se afl agentul determinant este esenial n
declanarea inflamaiei. Dorim s menionm c examinarea prin metode de laborator a prezenei acestor
celule (de ex. ntr-o inflamaie de natur infecioas aprut la nivel faringian, realizm un frotiu colorat i n
primul rnd cutm s identific prezena leucocitelor PMN, astfel avnd o informaie care susine ipoteza
unei infecii bacteriene) poate fi foarte util. PMN i macrofagele sunt atrase de moleculele chemotactice i
migreaz direcionat de aceste molecule prin procesul de diapedez, iar la locul inflamaiei fagociteaz,
endociteaz, secret enzime lizozomale i genereaz anioni superoxid. Pe de alt parte, leucocitele PMN i
macrofagele prezint receptori specifici de suprafa pentru componenta C5a a sistemului complement,
pentru CCF (crystal-induced chemotactic factor) i LTB4 (leucotriena B4), precum i pentru peptidele din
factorii chemotactici. Aceste peptide servesc cuplrii PMN-factor chemotactic i astfel fagocitele se
ndreapt spre locul unde acesta a fost produs. Ajungnd la nivelul respectiv, PMN sau macrofagele i pierd
configuraia rotund, devin oarecum triunghiulare, cu baza spre factorul chemotactic. Pentru ca modificarea
de form s fie posibil, are loc o rearanjare a elementelor din citoschelet, microtubulii genereaz o
polarizare fa-spate, filamentele de actin se acumuleaz n faa i n spatele celulei. Se asigur astfel
forele necesare deplasrii (motilitatea celular depinde de polimerizarea monomerilor de actin n
filamente de actin).

Fagocitarea agentului determinant al procesului inflamator (de ex. o structur bacterian) este
favorizat de opsonizare. Materialul fagocitat este inactivat la nivelul fagolizozomilor (atunci cnd acest lucru
este posibil) i / sau transformat n superantigen cu rol n declanarea unor cascade de reacii imune. Pn n
acest moment, sistemul complement a reprezentat elementul esenial, fie c a fost activat pe cale direct
sau pe cale altern. Fragmentele rezultate n cascada complementului particip la stimularea secreiei
macrofagice (mediatori ai rspunsului inflamator acut).

Activitatea leucocitelor PMN este facilitat i de prezena unei ntregi game de proteine active de
tipul moleculelor de adeziune celular (selectine, integrine, ICAM-1 (intercellular adhesion molecule), ELAM-
1 (endothelial cell leucocyte adhesion molecule), GMP-140, adezine, LECAM-1 (leucocyte endothelial cell
adhesion molecule), ISCOM (immunostimulating complex), PAF, MAC (membrane atack complex), MACIF
(MAC inhibitory factor), precum i o serie de proteine sintetizate i eliberate de ficat drept reactani de faz
acut (RFA). Dintre RFA am putea meniona: proteina C reactiv (PCR este secretat n mod predominant de
ficat i esuturile adipoase ca rspuns la stresul inflamator i este reglat, n mare parte, de interleukina-6.
Valoarea semnificativ pentru prezena inflamaiei este de 1mg/dl sau mai mult. Fiind de ncredere i uor
de dozat, este foarte utilizat n practica medical ca metod de screening i monitorizare a inflamaiei, ns
nu trebuie s uitm ca PCR poate fi crescut i n sarcin sau n arsuri etc). (1)

Ali RFA sunt:a2-macroglobulina, a1-antitripsina, a1-antichimotripsina, fibrinogenul, haptoglobina,


hemopexina, ceruloplasmina, componenta C3 i amiloidul P seric. Am subliniat cu caractere speciale RFA
care se testeaz mai frecvent n practic, n ara noastr.

Aceste proteine de faz acut mediaz procesul inflamator, n cursul cruia se i consum.
Majoritatea sunt glicoproteine sintetizate de ficat (mici cantiti sunt sintetizate i de ctre macrofage). Rolul
RFA nu este pe deplin elucidat. Se cunoate, totui, c o serie de RFA sunt implicai att n procesele de
necrobioz ct i n cele de remaniere tisular.
Informaii cu privire la existena unui proces inflamator putem obine i verificnd valoarea VSH.
59
n continuare, evoluia procesului inflamator este determinat de tipul agentului agresor,
agresivitatea acestuia i momentul declanrii conflictului imun. Acesta din urm corespunde de regul
apariiei semnelor clinice (de ex. febr).

n completare la rspunsul celular, citokinele sintetizate de ctre diferitele celule stimulate specific,
antigene, mitogeni, endotoxine etc. vor influena / stimula i activitatea celulelor productoare de citokine,
rezultnd sinteza i eliberarea de noi tipuri de citokine. Se constituie anse de tip feed-back endocrine i
autocrine, care sporesc sinteza de citokine de ctre o singur celul, n timp ce o singur citokin poate
aciona asupra mai multor celule.

Spre exemplu, IFN-g(sintetizat i eliberat de limfocitul T) are cel puin trei aciuni importante i
anume: deviaz sinteza la nivelul mduvei osoase hematopoietice spre linia monocito-macrofagic, activeaz
exprimarea Ag HLA de clasa a II-a la nivelul membranei macrofagelor i crete puterea de fagocitoz a
sistemului MM n vederea fagocitrii att a actualelor antigene, ct i a viitoarelor complexe imune ce se vor
constitui n cursul procesului inflamator.

Aproape simultan, celulele endoteliale reacioneaz elibernd diferii produi de secreie, precum
endotelinele (ET) i EDRF (endothelium-derived relaxing factor). Jocul dintre cele dou proteine vasoactive
condiioneaz pentru un timp aportul local de oxigen i nivelul acidozei. Iniial se elibereaz local factorii
vasodilatatori (EDRF) i NO, care au drept scop creterea fluxului sanguin local, cu creterea atraciei de
celule ale rspunsului imun la locul impactului cu agentul determinant al procesului inflamator. EDRF este
rapid inactivat de hemoglobin i de substane antioxidante (care apar n urma stimulrii activitii PMN
dar i datorit prezenei eritrocitelor).

Pe msur ce debitul sanguin local crete (determinat de sistemul kinin / bradikin), crete i
sinteza de EDRF (EDRF are ns o via de numai 6-10 secunde). Vasodilataia local se dezvolt pn n
momentul n care celulele endoteliale, fiind comprimate de edemul perilezional, ncep s sintetizeze i s
elibereze local endoteline (ET), n special ET1. Aceast endotelin (care are de asemenea o via foarte
scurt) induce vasoconstricie brutal i foarte intens, tocmai pentru scderea debitului sanguin i limitarea
amplitudinii rspunsului inflamator local (endotelina este considerat cel mai puternic vasoconstrictor din
organism). Rezultatul etapei de declanare este reprezentat de rspunsul inflamator acut, manifestat prin
vasodilataie capilar (eritem, nroire), exsudarea proteinelor plasmatice (edem) i acumulare de leucocite
PMN.

68. Sub-etapele vascular i exsudativ, n cadrul procesului inflamator


Etapa efectoare, care la rndul ei se submparte n trei subetape:

Subetapa molecular
n care se activeaz:

cascada complementului;
sistemul de coagulare-fibrinoliz;
diferitele ci de metabolizare ale acidului arahidonic (care provine din peretele bacterian n urma
scindrii date de fosfolipaz), respectiv:
o calea ciclooxigenazei prin care rezult prostaciclin (PGI) care determin vasodilataie, inhib
agregarea trombocitelor i aderarea PMN, prostaglandin (ex. PGE2) i tromboxan (TxA 2) care
60
determin agregare plachetar, are efect vasoconstrictor i de cretere a permeabilitii
capilare);
o calea lipooxigenazei, care duce la apariia leucotrienelor, de exemplu LTD4, LTG4(care determin
bronhoconstricie, vasoconstricie sistemic, vasodilataie la nivelul microcirculaiei) i
o calea epooxigenazei;
sistemul kinin-bradikinin;
familia citokinelor;
superfamilia interferonilor;
sistemul extracelular gunoier al actinei.

Actina este o protein care se gsete n cantiti mari i este responsabil pentru motilitatea
celular, schimbarea formei i mrimii celulelor (care depinde de proprietatea monomerilor de a polimeriza).
Dup apoptoz, actina eliberat are tendina de a polimeriza, ducnd la apariia de filamente de actin n
vase, cu un rezultat catastrofal (de exemplu n ocul septic, necroza hepatic etc). Exist ns i un mecanism
homeostatic ce are la baz dou proteine plasmatice, gelsolina i proteina Gc (care sunt depite ns din
punct de vedere funcional n distrugerile masive).

Subetapa vascular
n care au loc modificri ale calibrului vaselor mici, ale vitezei de circulaie a sngelui, ale
permeabilitii vaselor mici din aria tisular lezat. Iniial se produce vasoconstricie, n decurs de secunde /
minute (are loc un aflux masiv de celule sanguine proinflamatorii - neutrofile, monocite, eozinofile - sub
aciunea unor mediatori solubili eliberai din zona tisular afectat, care produc dou categorii de efecte:

a. vasculare (dilataie arteriolocapilar cu creterea numrului de capilare active, hiperemie,


stimularea expresiei pe celulele endoteliale din zon a unor receptori de adeziune intercelular
astfel nct celulele sangiune recrutate vor adera la endoteliul vascular prin cuplaj receptorial i
n final o faz de staz vascular pasiv, cu hipoxie i creterea permeabilitii vaselor mici) i
b. chemotactice (celulele proinflamatorii sunt atrase ctre esutul lezionat i activate metabolic)..

Subetapa exsudativ
n care se formeaz exsudatul inflamator (plasma exsudat, bogat n proteine i LDH) la care se
adaug elementele figurate extravazate, elementele celulare mobilizate local i produi rezultai din diferite
modificri locale. Prin constituenii si celulari i moleculari, exsudatul asaneaz focarul inflamator i tinde s
blocheze procesul infecios la poarta de intrare, constituind bariera fibrino-imuno-leucocitar.

69. Consecinele activrii mecanismelor inflamatorii


n funcie de cascadele activate poate rezulta un anumit tip de inflamaie. Putem lua n discuie
diferitele forme clinice evolutive (acut, subacut, cronic) precum i formele anatomoclinice.

Evoluia spre cronicizare


Se datoreaz agenilor inflamatori care au proprietatea de a stimula n special sistemul efector
timodependent, autoantigenelor sau persistenei stimulului inflamator.
61
Inflamaia cronic este din ce n ce mai mult privit nu numai ca o consecin a unui risc infecios continuu,
dar i ca o parte integrant a multor boli neinfecioase, cum ar fi disfunciile autoimune, diabetul sau bolile
cardiovasculare etc.

Astfel, nu este surprinztor c unele sisteme hormonale, cum ar fi sistemul renin-angiotensin


(SRA), care a fost descris prima dat n contextul bolilor cardiovasculare, s-a dovedit a fi factorul major de
reglare a rspunsului inflamator. (4).

Evoluia spre vindecare


Presupune:

Asanarea focarului inflamator (ncepe concomitent cu constituirea barierei fibrino-leucocitare i cu


ndeprtarea resturilor celulare i a eventualelor microorganisme care sunt ageni determinani);
devine maxim dup acumularea de leucocite PMN i macrofage.
Vindecarea propriu-zis ncepe relativ rapid n cursul procesului inflamator; vindecarea ncepe aproape
concomitent cu fenomenele distructive, pe care tinde s le nlocuiasc pentru a conduce la una dintre
variantele evolutive menionate anterior.

Varianta cea mai favorabil este reprezentat de vindecarea complet, anatomic (numit i
restitutio ad integrum). Cealalt posibilitate este reprezentat de evoluia spre apariia unei cicatrici
(cicatrizarea). Cicatrizarea apare n cazul unor inflamaii nsoite de fenomene lezionale ntinse, pierderi de
esut i eventual de infecii i cronicizarea infeciei.

Aspecte anatomo-clinice:
Inflamaii alterative n care predomin procesele distrofice i necrobiotice (de exemplu n miocardita
difteric sau n miozita produs de Clostridium spp.);
Inflamaii exsudative n care predomin procesele exsudative i care se pot submpri n inflamaii:
o seroase (3-5% proteine, numr sczut de leucocite, cu eozinofile), de exemplu n pleurezia sau
meningita produse de Mycobacterium tuberculosis;
o fibroase, destul de frecvent rezultate n urma unui proces infecios, cu acumulare de fibrinogen
care determin apariia fibrinei i formarea de depozite care se organizeaz i duc la apariia
aderenelor, care se organizeaz (de ex. n pneumonia cu Streptococcus pneumoniae, n
dizenteria bacterian, n miocardita difteric etc.);
o purulente, produse de exemplu de coci piogeni, precum Streptococcus pneumoniae,
Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis etc., de ex. cu formarea de abcese;
o hemoragice, de exemplu n cium (produs de Yersinia pestis) sau n pneumonia hemoragic
produs de Bacillus anthracis (extrem de grav, nsoit de hemoptizie i asociat frecvent cu
pleurezie hemoragic i adenopatie mediastinal important).
Inflamaii proliferative, avnd ca form particular granulomul, de aspect nodular (de ex. aprute dup
infecii cu Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, diferite specii de Brucella sau datorate
prezenei unui corp strin).

62
70. Definii noiunile de infecie, infecie inaparent, stare de boal i stare de
purttor de germeni
Infecia reprezint un tip particular de relaie ntre microorganismele condiionat patogene i
patogene pe de o parte i organismul gazd pe de alt parte. Pentru ca s se declaneze un proces infecios
i s apar infecia, microorganismele trebuie s ptrund n organismul gazd, s depeasc barierele i
mecanismele de aprare, s-l colonizeze, s se multiplice i eventual s intre ntr-un lan de transmitere prin
intermediul cruia poate contamina o nou gazd.

Procesul infecios definete ansamblul relaiilor stabilite ntre microorganism i gazd, aprute dup
infecie.

Starea de boal (manifest clinic sau fr ca modificrile aprute s fie exteriorizate i constatabile
de ctre medicul clinician) se datorete interaciunii dintre microorganism (bacterie, parazit, virus, fung,
prion) - gazd i este urmat de apariia unor simptome (de ex. temperatur peste 39C, cefalee, eliminarea
unor scaune diareice etc.) i de reacii funcionale din partea gazdei (de ex. stare general modificat,
senzaie de febr, frisoane, creterea numrului de respiraii pe minut, creterea numrului de bti
cardiace pe minut etc). Infecia nu este urmat obligatoriu de starea de boal, putnd fi inaparent,
subclinic sau latent. Poate aprea i starea de purttor i / sau eliminator de germeni.

Datorit infeciei pot aprea, sau nu, manifestri foarte variate n funcie de:

agentul infecios (factori de patogenitate, gradul de virulen);


organismul gazd (rezistena specific i nespecific);
mediul extern (factori geografici, climatici, sociali, economici etc).

Manifestri subclinice
Infecia inaparent nu se asociaz cu semne sau simptome i ar putea fi decelat numai prin
examene de laborator. Spre deosebire de infecia latent, infecia inaparent este limitat n timp i poate
contribui la crearea unei stri de imunitate (ex. infecia cu Neisseria meningitidis, infecii cu Haemophilus
influenzae etc).

Boala subclinic se deosebete de infecia inaparent prin apariia unor tulburri funcionale (febr,
transpiraii, dureri etc) i chiar a unor leziuni organice (de multe ori fr o simptomatologie distinct /
specific, dar exist i situaii n care nu este decelat nici un simptom, de exemplu n formele subclinice de
hepatit viral acut).

Infecia latent este asimptomatic, agenii patogeni putnd persista timp ndelungat n esuturile
gazdei. Dup un timp variabil, infecia latent poate deveni evident clinic, de obicei n urma aciunii unor
factori favorizani externi sau interni, proprii organismului (de exemplu infecia cu Mycobacterium
tuberculosis care este un microorganism condiionat patogen, infecteaz circa o treime din populaia
globului dar produce tuberculoz la circa 8 milioane de persoane, pe an).

Starea de purttor de germeni se refer la bolnavul cu o stare infecioas, la persoana aflat n


convalescen, nainte de eradicarea infeciei suferite dar i la persoanele aparent sntoase care
adpostesc germeni patogeni (de exemplu Salmonella typhi la nivelul veziculei biliare, microorganismul
putndu-se cantona la acest nivel dup o febr tifoid). Starea de purttor reprezint atingerea unui

63
echilibru relativ ntre cele dou verigi, de multe ori fiind nsoit de eliminarea n mediu a germenilor care au
produs infecia i se afl n diferite focare latente (precum n exemplul de mai sus, situaie n care starea de
purttor se elimin doar prin extirparea veziculei biliare). De exemplu, n ara noastr apar din cnd n cnd
izbucniri epidemice (outbreak) de febr tifoid, dup inundaii, dac n zona respectiv exist un purttor
de S. typhi, iar condiiile igienico-sanitare pentru prevenirea transmiterii pe calea fecal-oral nu sunt
respectate. n cursul strii de purttor exist teste biologice i imunologice care pot certifica prezena
microorganismelor (direct, de ex. dup cultivare sau amplificare genic i / sau indirect).

71. Definii noiunea de rspuns imun i precizai principalele sale atribute

n momentul n care un Ag ptrunde pentru prima dat n organism, sistemul imun nu posed dect
un numr redus de limfocite T sau B specifice recunoaterii poriunilor peptidice (epitopilor) acestui Ag.
Astfel, dintr-un repertoriu preexistent de limfocite, Ag le va selecta numai pe cele care sunt capabile s
recunoasc i s se combine cu Ag. n acelai timp (cu mici excepii) nu exist nici o celul sau molecul
capabil s elimine Ag sau microorganismul care l poart, motiv pentru care este necesar apariia
limfocitelor T citotoxice, secretoare de citokine (imunitate celular) sau a plasmocitelor anticorp-secretante
(imunitate umoral).

Definiia i caracteristicile rspunsului imun


Rspunsul imun (RI) include totalitatea evenimentelor care au loc dup introducerea unui Ag, i
anume:

activarea limfocitelor,
eliberarea a diverse molecule,
multiplicarea celulelor specifice,
producerea de limfocite T citotoxice sau de anticorpi capabili s se fixeze pe Ag i s participe la
eliminarea acestuia (direct sau indirect).

Dup acest prim contact (ca i n cursul imunizrii consecutive), sistemul imun produce limfocitele T
i B de memorie, capabile s reacioneze mai rapid, mai amplu, cu ocazia unei reintroduceri ulterioare a
aceluiai antigen.

Aa cum a fost menionat anterior, principala caracteristic a imunitii este specificitatea. Pentru a
sugera ct de specific este rspunsul imun, o modalitate este de a discuta despre potrivirea dintre cheie i
broasc, ntre structurile Ag i Ac. Acest exemplu are un grad de sugestivitate, dar este incomplet n
comparaie cu realitatea. O alt modalitate de a sugera specificitatea rspunsului imun ar fi potrivirea
dintre mna aezat n faa oglinzii i imaginea din oglind.

Probabil, o modalitate i mai sugestiv ar fi cea discutat la cursurile de imunologie din INCDMI
Cantacuzino: rspunsul imun este att de specific, nct dac ne-am nchipui c Ag este reprezentat de o
pagin dintr-un manual, dac am schimba nu o fraz, un rnd, un cuvnt ci chiar o singur liter ntr-un
cuvnt de pe o anumit pagin, aceast schimbare ar fi sesizat de sistemul imun iar Ac produi se vor
potrivi cu aceast pagin n care a fost schimbat o singur liter. Totui, aa cum am menionat la punctul
16. 2. 1., exist i reacii ncruciate.

64
O alt caracteristic foarte important a RI, n condiii fiziologice, este capacitatea de a discerne ntre
self i non-self i de a reaciona numai fa de moleculele care ndeplinesc definiia de antigen (vezi i
MHC/CMH).

Rspunsul imun poate fi de tip umoral, mediat prin anticorpi sau de tipcelular, mediat de ctre
celule. n cazul antigenelor timodependente (cea mai mare parte a antigenelor), se dezvolt un rspuns imun
celular specific prin LT citotoxice i unul umoral specific prin anticorpi. Diferite citokine pot activa sau inhiba,
n mod preferenial, unul sau ambele tipuri de rspuns. n cazul antigenelor timoindependente, rspunsul
imun este umoral. n continuare vor fi prezentate n mod schematic aceste dou tipuri de rspuns imun
umoral i celular.

72. Definii rspunsul imun umoral i specificai celulele implicate n realizarea sa


Rspunsul imun umoral (RIU) const n producerea de Ac specifici i este transferabil pentru o
perioad de timp (3-6 sptmni), prin ser, la un alt animal. Imunitatea umoral intervine n distrugerea
bacteriilor extracelulare, neutralizarea virusurilor, inhibarea toxinelor.

Natura antigenelor fa de care se dezvolt un rspuns imun umoral include poliozide, proteine,
substane sintetice, rareori lipide i acizi nucleici sau anticorpi (n cazul proceselor autoimune). Unele
antigene (alergenii) determin un RI cu anticorpi de tip IgE.

Introducerea antigenului pe cale subcutan, intramuscular sau intravenos determin un RIU cu


producerea de IgM i/sau IgG iar administrarea pe cale oral determin un rspuns preferenial cu IgA.

Dup o prim administrare intravenoas, la un subiect care nu a mai venit n contact cu respectivul
antigen, Ag molecular parcurge urmtoarele etape succesive:

1. descreterea cantitativ rapid, datorat difuziei n spaiile extravasculare;


2. dispariia lent, datorat catabolismului propriu al antigenului;
3. descreterea rapid dup 8-10 zile, ca urmare a eliminrii formaiunilor imune (complexele imune)
rapid fagocitate.

n cazul antigenelor particulate (celule, bacterii, virusuri) sau al antigenelor sub form de agregate,
eliminarea este mult mai rapid, prin procesul de fagocitoz (care antreneaz o imunizare mai precoce).

n cazul utilizrii cii subcutanate, antigenul rmne, n parte, la locul de inoculare. Adugarea unui
adjuvant menine antigenul n acest loc i favorizeaz o stimulare imunologic de durat (eventual i
formarea unui granulom inflamator). n urmtoarele ore, antigenul migreaz n sinusurile subcapsulare ale
ganglionilor corespunztori anatomic, apoi n zona medular i n final (24 de ore) ajunge n regiunea
cortical, la periferia foliculilor primari. n interiorul organelor limfoide, antigenul se regsete n celulele
fagocitare. n prezena anticorpilor preformai i a sistemului C', unele antigene se localizeaz la suprafaa
celulelor dendritice intrafoliculare din centrii germinativi. Contactul cu antigenul antreneaz importante
modificri histologice ale organelor limfoide: centri germinativi se dezvolt n foliculi i persist mai multe
sptmni; n paralel apar att imunoblatii i plasmocitele, ct i limfocitele de memorie; dup 3-4 zile se
pot detecta limfocite cu anticorpi membranari, apoi celule care sintetizeaz anticorpi serici.

65
73. Enumerai tipurile de imunitate i descriei-le pe scurt
Imunitatea poate fi motenit (trstur de specie, se transmite ereditar) i dobndit.

Imunitatea poate fi dobndit activ, dup contactul cu un anumit antigen (ex. bacterian).
Evenimentul imunologic poate aprea dup o infecie (natural) sau dup administrarea unor vaccinuri
(artificial). Avantajul imunitii dobndite activ este faptul c, de regul, protecia este de durat.
Dezavantajul principal este reprezentat de faptul c instalarea rspunsului imun are loc lent, mai ales n cazul
RIP.

Imunitatea poate fi dobndit i pasiv, prelund anticorpi produi de ctre o alt gazd. Spre
exemplu, administrarea de anticorpi anti toxin difteric / tetanic / botulinic (artificial) pune la dispoziia
gazdei infectate, imediat, o cantitate important de antitoxin, n vederea neutralizrii ct mai rapid a
toxinei implicate patogenic. n mod natural, ftul i nou nscutul beneficiaz de protecie prin intermediul
anticorpilor (IgG transplacentar, IgA prin colostru, lapte) provenii de la mam. Avantajul imunitii
dobndite pasiv este rapiditatea, n timp ce dezavantajul este reprezentat, pe de o parte, de timpul scurt
pentru care este oferit protecia iar pe de alt parte, de riscurile unei hipersensibilizri, atunci cnd sunt
utilizai anticorpi provenind de la o alt specie (ex. n cazul administrrii de ser recoltat de la cal
hiperimunizat).

Exist i posibilitatea dobndirii unei imuniti activ - pasiv, atunci cnd se administreaz
concomitent (dar n locuri diferite) ser imun i un vaccin (ex. n suspiciunea infeciei cu Clostridium tetani).

Mult timp s-a considerat c cele 2 tipuri de imunitate acioneaz independent, imunitatea nnscut
oferind prima linie de aprare mpotriva microbilor invadatori, iar imunitatea dobndit intervenind mai
trziu, pentru a elimina infecia. ns, interaciunea dintre cele 2 tipuri de imunitate este evident:
imunitatea adaptativ profit de abilitatea imunitii nnscute de a distinge ntre agenii patogeni, microbii
benefici i factorii de mediu.

Cele 2 tipuri de imunitate sunt complementare, n strns colaborare (un adevrat exemplu pentru
studeni, medici sau orice membru al sistemului sanitar).

Existena celulelor NK ntrete aceste considerente. Conform unor descoperiri recente, celulele NK
au o proprietate esenial, atribuit numai celulelor imunitii memoria; n plus, au fost identificate celule
NK n locuri atribuite n mod clasic imunitii adaptative: timus i ganglionii limfatici. (4)

66
74. Organele centrale i periferice ale sistemului imun; localizare, funcii

Organele limfoide primare


Organele limfoide primare, numite i
centrale, sunt situate n afara cilor de acces
i circulaie antigenic. n aceste organe
diferenierea apare precoce, n viaa
embrionar, naintea celor secundare.
Proliferarea limfocitar este intens i
independent de stimularea antigenic.

Organele limfoide primare au urmtoarele


roluri:

permit multiplicarea limfocitelor T


(timodependente) i B (dependente de
mduva roie hematogen / bone marrow -
la mamifere).

gzduiesc primele stadii de difereniere, pn la limfocitele T sau B mature, apte s recunoasc


structurile antigenice i s fie stimulate de antigene.

efectorii imuni nva la acest nivel s recunoasc i s tolereze constituenii propriului organism
(auto-recunoatere i toleran fa de self).

Un limfocit T sau B matur care a prsit timusul, respectiv mduva osoas hematogen, nu mai revine
niciodat la acest nivel, cele dou organe fiind n afara cilor de recirculare a limfocitelor antigen-specifice
din organele limfoide secundare.

Timusul
Timusul este un organ situat n mediastinul anterior i superior, retrosternal, format din doi lobi unii
printr-un istm median. Fiecare lob este format din lobuli compartimentai de septuri derivate din capsula
organului. Lobulul timic este alctuit din 2 zone: cortical (la exterior) i medular (la interior). Iniial se
dezvolt zona cortical.

Greutatea sa variaz cu vrsta (este bine dezvoltat la ft, greutatea crete pn la pubertate -
dezvoltarea maxim se realizeaz la vrsta de 10-12 ani, apoi sufer o involuie lent, fr s dispar total).

Rolul timusului se manifest local i la distan:

rolul local, const n transformarea limfocitelor nedifereniate n limfocite T mature, cu achiziia de


receptori pentru antigene (TCR).
rolul la distan se realizeaz prin factorii timici peptidici umorali (timostimulina, timopoietinele,
timozinele, factorul umoral timic etc.

Mduva osoas hematogen la mamifere


Transformarea celulei stem n limfocit B matur are loc n mduva osoas hematogen (bone
marrow, LB). La copii, rolul de organ limfoid primar este asigurat att de mduva din oasele late ct i din
oasele lungi; ulterior, mduva de la nivelul oaselor lungi este nlocuit cu esut adipos, care mai trziu se
67
fibrozeaz, iar mduva activ rmne la nivelul oaselor late (stern, coxal, coaste, vertebre). Transplantul de
mduv osoas hematogen restaureaz imunitatea umoral, ducnd la dispariia perturbrilor.

Dintre funciile mduvei osoase hematogen n imunitate amintim:

meninerea unui procent de celule stem cu difereniere spre linia limfocitar i primele stadii ale
seriei T i B;
maturarea i diferenierea complet a limfocitelor B n celule B mature, apte s colonizeze organele
limfoide secundare.

Organele limfoide secundare


Dezvoltarea organelor limfoide secundare, numite i periferice sau efectoare, este tardiv fa de
cea a organelor limfoide primare, atingnd dezvoltarea deplin numai dup stimularea antigenic. Amintim
ca exemple de organe limfoide secundare: ganglionii limfatici, splina i organele limfoide ataate sistemului
digestiv (apendice, amigdale, plci Peyer) etc. La nivelul acestor organe se cantoneaz limfocitele T provenite
din timus i limfocitele B provenite din mduva osoas hematogen, migrate pe calea torentului circulator.
n organele limfoide secundare, aceste celule se vor activa n urma contactului cu antigenele.

n anumite zone ale organelor limfoide secundare, precum cele din ganglionii limfatici sau din splin,
se gsesc grupuri de celule, constituite n special din limfocite B, denumite foliculi sau noduli limfatici.
naintea stimulrii antigenice, aceti foliculi primari sunt n repaus, cu limfocite mici apropiate unele de
altele, determinnd un aspect dens, caracteristic. Aceste limfocite mature sunt denumite naive, deoarece
nu au avut contact cu antigenul. Dup circa 3-6 zile de la stimularea antigenic, foliculii primari se transform
n foliculi secundari, cu un centru germinativ clar, nconjurat de o zon mai ntunecat. n jurul foliculului
exist o zon marginal puin vizibil, constituit din limfocite B cu memorie. Foliculul secundar persist
cteva sptmni dup care redevine folicul primar.

Ganglionii limfatici
Ganglionii limfatici (nodulii limfatici) reprezint structuri imune, organizate, situate la interseciile
traseelor limfatice. Au urmtoarele roluri:

colecteaz structurile antigenice care traverseaz teritoriul vaselor limfatice aferente (libere sau captate
de macrofage i/sau de celulele dendritice);
induc un rspuns imun fa de antigenele de tip celular, n regiunea paracortical (dnd natere la
limfocite T specifice) sau fa de antigene de tip umoral, n foliculii limfatici cu limfocite B active,
maturate n mduva osoas hematogen i
stocheaz informaiile imune datorit limfocitelor cu memorie dar au rol i n diseminarea rspunsului
imun prin circulaia limfocitelor pe calea traseelor limfatice eferente, ctre torentul circulator i ulterior
spre alte teritorii ganglionare, splenice, digestive sau respiratorii.

Splina
Splina este cel mai mare organ limfoid secundar, avnd ns i alte funcii:

joac rolul unui filtru care n mod nespecific ndeprteaz/elimin complexele antigen-anticorp
circulante, diferite microorganisme, eritrocite parazitate (ex. cu Plasmodium spp., Babesia microti);
are o eficien remarcabil n ndeprtarea/eliminarea microorganismelor slab opsonizate precum i
celor capsulate (ex. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis,
Capnocytophaga spp.);
68
eliminarea hematiilor degradate, mbtrnite;
reglarea volumului sngelui etc.

Sistemul limfoid asociat mucoaselor (MALT - mucous associated lymphoid tissue)


Cile respiratorii, tractul digestiv i cel uro-genital sunt nconjurate pe toat lungimea lor de esut
limfoid difuz (sau nodular), bogat n limfocite B i plasmocite care secret sIgA. Datorit particularitilor
funcionale, MALT se subdivide n:

Sistemul imunitar nazo-faringian (NALT - nasopharynx associated lymphoid tissue) reprezentat de inelul
lui Waldeyer cu diferitele amigdale (palatine, faringian, linguale) i structuri adenoide.
Sistemul imunitar asociat tubului digestiv (GALT - gut associated lymphoid tissue) cuprinde plcile Peyer
i formaiunile limfoide ale apendicelui (secret IgA), limfocitele intra-epiteliale i limfocitele sub-
epiteliale.
Sistemul imunitar asociat arborelui bronic (BALT - bronchus associated lymphoid tissue);
Sistemul imunitar asociat cilor uro-genitale, prezent n special la nivelul vaginului;
Sistemul imunitar asociat glandelor mamare (mammary associated lymphoid tissue).

75. Enumerai celulele implicate n rspunsul imun


Toate celulele sistemului hematopoietic intervin, n diferite msuri, n imunitate. Aa cum am
menionat anterior, aceste celule acioneaz ca nite adevrai soldai (de ex. LT citotoxice, celulele NK),
care pot avea att o activitatea efectoare ct i de control i retro-control (depindu-i condiia de simpli
ostai).

Limfocitele T i B suntelementele centrale ale rspunsului imun specific.


Celulele NK sunt celule fundamentale (alturi de fagocite) n imunitatea nnscut.
Monocitele / macrofagele, neutrofilele, eozinofilele, bazofilele i mastocitele acioneaz n diferite
momente ale rspunsului imun.
Plachetele sanguine intervin n lupta anti-parazitar iar globulele roii particip la eliminarea
complexelor imune.

Celule pot reaciona n mod nespecific, indiferent de natura agentului agresor (ex. granulocitele
PMN, eozinofilele, bazofilele, mastocitele, monocitele, macrofagele, celulele dendritice etc) sau pot participa
la o reacie specific, condiionat de structura moleculelor antigenice, prin intermediul receptorilor (ex.
limfocitele).

76. Limfocitele T origine, evoluie, tipuri, funcii


Limfocitele T sunt majoritare n circulaia sanguin, reprezentnd circa 70% din totalul limfocitelor
[2/3 sunt LT4 (CD4+) i 1/3 sunt LT8 (CD8+)].

Limfocitele T sunt localizate la nivelul organelor limfoide secundare n zone speciale: zona
paracortical a ganglionilor, manonul limfoid n jurul arterelor centrale splenice.

Limfocitele T sunt implicate n principal n imunitatea mediat celular. Pe de o parte particip la


eliminarea structurilor strine dar i a structurilor proprii modificate (prin mbtrnire, n urma unei infecii,

69
cu multiplicare neoplazic) iar pe de alt parte coopereaz cu limfocitele B n rspunsul imun umoral. De
fapt, funciile exercitate de LT sunt mult mai complexe.

Cea mai important funcie a limfocitelor T este inducerea unui rspuns sau a unei reacii imune
specifice la antigene, prin recunoaterea unor peptide antigenice fixate pe moleculele MHC (complex major
de histocompatibilitate). n acest scop pe limfocitul T exist un receptor pentru antigen (TCR), asociat
ntotdeauna cu un complex molecular transductor CD 3.

Linia limfocitar T se matureaz n dou organe: (a) mduv osoas i (b) timus.

Din celula stem


hematopoietic multipotent (CD34+,
CD38-), prima difereniere conduce la
apariia CFU-L (colony forming unit-
lymphocyte) comun limfocitelor T i
B (CD34+, CD45RA+, CD10+) din care
rezult protimocitul. Protimocitul
prsete mduva roie hematogen
i se cantoneaz n corticala timic.
Maturizarea timocitelor nu a
putut fi studiat la om, astfel nct datele
se obin prin extrapolarea informaiilor
obinute experimental, la animale de
laborator. Protimocitele i apoi timocitele
imature se gsesc n corticala timic (subcapsular), n contact cu celulele epiteliale i cu macrofagele (rare) de la acest
nivel. Aceste celule tinere au o capacitate foarte mare de multiplicare. Se deplaseaz prin cortex spre jonciunea
cortico-medular i vin n contact cu celulele dendritice i cu macrofagele. La acest nivel are loc o nou multiplicare
relativ intens. Este de remarcat faptul c n cursul acestui proces, doar 1-5% din celulele tinere ajung limfocite T
mature. Restul, de cel puin 95% din celule, mor prin apoptoz.

70
Tipuri de limfocite T
Limfocitele T ajuttoare (T helper, CD4+) (LTh/Th)
Limfocitele T citotoxice (Tc, CD8+)
Limfocitele T inductoare ale hipersensibilitii ntrziate
Limfocitele T supresoare (Ts, CD8+)
Limfocitele T ( T cells)
Limfocitele T NK (NKT cells)

77. Limfocitele B origine, evoluie, tipuri, funcii


Limfocitele B reprezint 5% pn la 15% din limfocitele din snge (300 pn la 600 elemente/mm3) i
constituie majoritatea celulelor din foliculii limfatici, ganglioni i splin. Rolul lor esenial este sinteza
anticorpilor, n cursul RIU specific. Au fost denumite astfel deoarece s-a descoperit c la psri LB se
dezvolv n bursa lui Fabricius. La om LB se dezvolt n mduva osoas hematogen (bone marrow).

Limfocitele B provin (la om i la mamifere) din celulele stem hematopoietice (CD34+, CD38-). Toat
linia limfocitar B (celule imature sau mature) are markeri specifici de suprafa CD19 i CD20, utilizai
pentru identificarea celulelor B (ex. n citometria n flux); identificarea prin aceeai metod a markerului
CD10 permite ncadrarea n stadiul de limfocit matur.

Limfocitul B prsete mduva osoas i trece n zonele B din organele limfoide secundare (ganglioni
limfatici, splin etc). LB naiv (virgin) este pregtit pentru a rspunde stimulului antigenic, dei se gsete n
stare de repaus, n ateptarea primei stimulri antigenice.

Transformarea unui LB naiv ntr-un LB activ i apoi n plasmocit necesit intervenia succesiv a
citokinelor (ca ntr-o cascad).

71
Activarea are loc datorit recunoaterii antigenice dar i datorit secreiei de IL-1 de ctre celula
prezentatoare de antigen (APC) i respectiv secreiei de IL-4 de ctre Th2.

Limfocitul B are urmtoarele funcii:

1. Prezentarea antigenelor ctre LT;


2. Sinteza imunoglobulinelor (anticorpilor).

78. Sistemul mononuclear origine, tipuri de celule, funcii


Monocitele / macrofagele reprezint o linie celular cu funcie important n imunologie, prin
intervenia lor n imunitatea natural, n prezentarea antigenic i n reacia imun specific. Principalele
funcii ale sistemului MM sunt reprezentate de:

recunoaterea structurilor strine (non-self) sau modificate,


fagocitarea, prelucrarea i prezentarea acestora (n context MHC),
citotoxicitate, citostatism,
secreie a diferitelor molecule (ex. IL-1, TNF-) i
reglarea reaciilor n cadrul rspunsului imun.

Macrofagele, alturi de celulele dendritice i celulele epiteliale, formeaz sistemul reticulo-histiocitar


(SRH).

Macrofagele pot fi observate n toate esuturile. Se formeaz n mduva osoas hematogen, dintr-
un precursor comun monoblast-mieloblast i cnd devin mature poart numele de monocite. n acest stadiu,
moleculele MHC II fie nu exist fie sunt slab exprimate, ca semn al unui status funcional redus (devin foarte
bine reprezentate dup stimulare).

Monocitele circul n snge 6-8 ore, dup care migreaz n esuturi unde iau nume diferite i
ndeplinesc funcii diferite: histiocite n esutul conjunctiv; celule gliale (microglii) n esutul nervos;
osteoclaste; macrofage alveolare pulmonare; celule Kuppfer n ficat; macrofage splenice; macrofage
peritubulare n rinichi; macrofage ganglionare, n mduva osoas i timus (macrofagele din aceste organe nu
trebuie confundate cu celulele dendritice, care pot avea, la rndul lor, o capacitate fagocitar fa de
limfocitele n apoptoz).

Monocitele / macrofagele prezint receptori pentru carbohidrai, receptori pentru M-CSF, receptori
pentru imunoglobuline i complement.
72
n cadrul procesului de recunoatere, fagocitare i prelucrare a structurilor strine sau a structurilor
proprii modificate, spre deosebire de PMN care distrug complet structurile fagocitate, sistemul MM produce
un anumit grad de distrugere, cu conservarea gruprilor specifice, necesare stimulrii rspunsului imun.

79. Granulocitele tipuri, rol n imunitate

Neutrofilele
Sunt cele mai abundente granulocite din circulaia periferic.

Neutrofilele intervin n:

imunitatea natural prin fagocitoz i


imunitatea specific, datorit receptorilor proprii pentru
imunoglobuline i complement, n colaborare cu limfocitele i alte
APC.

Eozinofilele
Eozinofilele reprezint n mod normal ntre 1% i 3-5% din
leucocitele sanguine. Procentul eozinofilelor crete n alergii sau n
infeciile parazitare.

Funcia lor fagocitar, prin receptorii de IgG i IgE i mecanismul


ADCC, este relativ limitat. Totui, eozinofilele pot fagocita fungi,
complexe Ag-Ac, bacterii. Granulele lor conin produi toxici pentru
diferii parazii.

Bazofilele i mastocitele
Conin granule
metacromatice i receptori
pentru IgE. Au rol n reacia de
hipersensibilitate mediat
umoral (tip I). Principalul
mediator n declanarea HS de
tip I este histamina.

Ambele sunt implicate


n aprarea anti-parazitar.

Mastocitele nu se gsesc n cantitate mare n snge, dar sunt ntlnite la nivelul esuturilor
conjunctive n apropierea vaselor sanguine i limfatice, aproape de sau n interiorul nervilor i sub epiteliile
organelor care vin n contact cu mediul extern (plmn, intestin, piele).

73
Bazofilele se difereniaz i matureaz n mduva osoas hematogen, apoi circul prin snge. Att
bazofilele ct i mastocitele secret citokine dar spre deosebire de mastocite, bazofilele secret i IL-4. A fost
studiat un eventual rol n diferenierea limfocitelor helper spre linia Th2 (proces care necesit IL-4).

Plachetele
Plachetele au un rol accesoriu n reacia imun. Ele conin serotonin i exprim receptori pentru IgG
i IgE. Plachetele ader la endoteliul vascular, se agreg i elibereaz substane care cresc permeabilitatea
capilar i activeaz sistemul complement.

Globulele roii
Alturi de rolul principal de a transporta oxigenul la esuturi i bioxidul de carbon la plmni,
globulele roii dein receptori pentru sistemul complement, faciliteaz transportul complexelor imune din
snge la celulele Kuppfer din ficat, prin fixarea lor pe receptorii pentru complement.

80. Sistemul complement definire,


elemente componente, roluri i efecte
biologice
Complementul, un complex multienzimatic format
din circa 30 de componente, reprezint unul dintre
principalii constitueni ai aprrii naturale, ai imunitii
umorale i respectiv un element important al reaciei
imune survenite ca urmare a formrii complexelor antigen-
anticorp (are rol esenial n rspunsul inflamator). Sistemul
complement (C') reprezint o component normal a
serului.

Sistemul complement are o serie de funcii


importante: aprarea nespecific mpotriva infeciei (liza
virusurilor, liza bacteriilor, liza celulelor strine, favorizarea
prin opsonizare a fagocitozei, chemotactism pentru PMN i
sistemul MM etc); eliminarea complexelor imune i a
celulelor apoptotice; reglarea fiziologic a RI, dar particip
i la creterea permeabilitii capilarelor, stimularea
contractilitii musculaturii netede etc. n cele mai multe mprejurri, sistemul complement are efecte
benefice; totui sunt de menionat i unele efecte negative (ex. particip la reaciile anafilactice, este
implicat n hipersensibilitatea citolitic-citotoxic etc).

Sistemul complement cuprinde circa 30 de componente celulare sau plasmatice. Componentele sale
suntsintetizate de hepatocite, macrofage, celule epiteliale intestinale etc. Substanele activatoare reprezint
5% din suma proteinelor serice (circa 3 g/l); componenta C3 este componenta care se gsete n cantitatea
cea mai mare (circa 1,3 g/l). (Tabelul nr. 1)

Sistemul C' se poate activa pe trei ci, respectiv calea clasic, calea lectinic i calea altern.

74
81. Calea clasic de activare a complementului

Activarea sistemului complement


Componentele C' se gsesc n ser, n stare inactiv. Pentru a declana activarea lor este necesar un
stimul. Pentru calea clasic, punctul de pornire este reprezentat de ctre complexele antigen-anticorp, unde
anticorpii sunt de tip IgM (domeniul CH4) sau de tip IgG (domeniul CH2) corespunznd subclaselor IgGl, IgG2
sau IgG3. Complementul poate fi activat de o singur molecul de IgM sau de ctre dou molecule de IgG
apropiate una de alta. Activarea este posibil i n cazul unor molecule de IgG agregate.

n cursul activrii intervin


urmtoarele proteine:
C1. n sngele circulant exist un
complex plurimolecular ce conine o
molecul de C1q (molecul ce aparine
familiei colectinelor, precum MBL), dou
molecule de C1r i dou molecule de C1s,
situate n jurul ionilor de calciu i asociate
inhibitorului C1, denumit C1inh.

C4 este fragmentat n C4a, molecul mic, cu activitate anafilactoid i respectiv C4b, de dimensiuni
mai mari, care se leag printr-o legtur covalent fie de fragmentul Fab al anticorpului fie la nivelul
peretelui bacterian sau la nivelul unor celule (strine, proprii modificate, infectate etc). Ansamblul formeaz
complexul C1-C4b, notat pe scurt C14b.

C2. Aceeai esteraz (C1s) mpreun cu fragmentul C4b, cliveaz o molecul de C2 n C2b (o
molecul mic, cu activitate de tip kinin) i n C2a (molecula de dimensiune mai mare, care se leag de
structura int). Ansamblul necesit prezena Mg2+ i formeaz C3 convertaza cii clasice sau C4b2a. n acest
moment, anticorpii i respectiv componenta C1 pot s se detaeze de structura int, iar procesul poate
continua.

C3 este clivat n C3a i C3b de ctre C4b2a. C3a este o molecul mai mic i are, n mod primordial,
o activitate anafilactoid i chimiotactic, n timp ce subcomponenta C3b se fixeaz pe structura int
datorit unei puni realizate ntre un radical tioester i o grupare (-OH) sau (-NH2) de pe suprafaa celular
acceptoare. C3b format permite constituirea C5 convertazei (C4b2a-C3b) pe calea clasic.

82. Calea de alternativ de activarea a complementului


Calea altern constituie una dintre primele linii de aprare a organismului fa de un agent patogen,
naintea constituirii rspunsului imun.

Calea altern poate fi activat de complexele imune care cuprind IgG sau IgA.

Printre componentele cii alterne se numr:


C3. n plasm, prin proteoliza spontan a C3, sunt formate n permanen mici cantiti de C3b.
Moleculele de C3b se fixeaz de suprafeele acceptoare, n particular de peretele microorganismelor sau de

75
celulele infectate i alterate. Cteva bacterii, a cror structur este bogat n acid sialic, pot evita aciunea
sistemului complement. La rndul su, C3b acioneaz asupra factorului B.

Factorul B. Element al cii de amplificare, factorul B este clivat n Ba i Bb. Complexul C3bBb, format
n prezena ionilor de Mg2+, constituie C3-convertaza alternativ, care cliveaz noile molecule de C3 n C3b.
Acest clivaj accelerat de C3, d natere C5-convertazei (C3bBb)n.

Factorul D, factor prezent sub form activ n ser nainte de activarea C, cliveaz factorul B, ceea ce
faciliteaz formarea complexului C3bBb.

Ansamblul factorilor activatori ai cii clasice i alternative realizeaz o bucl de amplificare, care
permite transformarea numeroaselor molecule de C3 n C3b astfel nct C3b s acopere (opsonizeze)
peretele bacterian.

83. Inteleukinele origine, tipuri, efecte


Interaciunile ntre celulele imunitare se realizeaz prin dou mecanisme complementare:

contactul celular strns, care necesit prezena moleculelor de adeziune (direct);


prezena factorilor stimulatori, citokine, secretate de una din cele dou celule aflate n contact sau,
uneori, de o celul aflat la distan (indirect).

76
Rezultatul va fi activarea sau inhibarea funciei celulare, ca urmare a transportului informaiei prin
mesagerii secunzi spre organitele intracitoplasmatice, membrana celular sau genele nucleare.

Citokinele sunt substane proteice, solubile, cu greutate molecular mic, 8-70 kDa. cel mai frecvent
sunt sintetizate de ctre celule dup activare prealabil, acionnd ca mediatori asupra altor celule sau
asupra lor nsi, n cantiti foarte mici, de ordinul pico sau nanogramelor. n momentul de fa au fost
identificate peste 100 de molecule diferite de citokine. O parte dintre citokine au n special efecte
chemotactice i din acest motiv au fost numite chemokine.

Citokine pro-inflamatorii
n cadrul procesului infecios, diferitele microorganisme care au sau dobndesc prin variabilitate un
efect de agresiune fa de organismul gazd, antreneaz un rspuns la nivelul endoteliului vascular; una
dintre primele reacii este reprezentat de mobilizarea leucocitelor polimorfonucleare neutrofile (PMN). n
aceast etap intervin i o serie de citokine.

Citokine cu aciune anti-viral i anti-proliferativ


n aceast categorie sunt cuprinse mai multe interleukine.

Spre exemplu interferonul a i . IFN-a este produs de monocite i celulele hematopoietice iar IFN-
este produs de alte celule de tipul fibroblatilor i al celulelor endoteliale.
IL-2, cu efect autocrin i paracrin, a fost prima interleukin utilizat n terapia cancerului

Citokine activatoare ale rspunsului imun celular


Citokinele cu rol n rspunsul imun celular au ca surs de provenien limfocitele Th1. n aceast categorie
sunt incluse urmtoarele citokine.

IL-2 este produs n special de LT CD4+ de tip Th0 i Th1 (cu rol n RIP de tip celular)
IFN-g este produs de limfocitele Th1; sursa esenial pentru aceast interleukin este reprezentat
de celulele NK. Rolul principal al IFN-g este activarea macrofagelor.

84. Cooperri celulare directe, n rspunsul imun


Activarea LyB prin antigene T-dependente:

o APC foliculare + LyB


o APC medulare + LyTh0 -> LyTh2 LyB + LyTh2 -> Activarea LyB

Activarea LyT:

o APC + LyTh0 -> LyTh1/2/17


o APC + LyTc-> Activare LyTc
o LyTc + Celule Infectate (Fas-FasL) -> Inducere Apoptoz

85. Cooperri celulare (indirecte) mediate de citokine, n rspunsul imun


Activarea LyTh

M + LyTh0 -> LyTh1 (IL-12, IL-18, TNFa, TNFb)

M + LyTh0 -> LyTh2 (IL-4, aciune autocrin)


77
M + LyTh0 -> LyTh17 (IL-1, IL-6, IL-23)

LyTh1 + LyTc -> Activare LyTc (IL-2)

LyTh1 + M -> Activarea M (IFN-g)

LyTh2 + LyB -> Activare LyB (IL-4)

LyTh2 + LyB -> Switch al izotipului Ac LyB (IL-6)

86. Prezentai schematic principalele cooperri celulare ce intervin n rspunsul imun

78
87. Precizai succesiunea de evenimente din cadrul rspunsului imun umoral, pn la
sinteza de anticorpi
Dup ptrunderea antigenului i recunoaterea acestuia ca non-self urmeaz fagocitarea i
prelucrarea de ctre celulele prezentatoare de antigen care sunt reprezentate n principal de celulele
dendritice foliculare, macrofage i limfocitele B.

APC, prin IgM i IgD membranar, posed tot ce este necesar pentru recunoaterea epitopilor
antigenici (diversitatea rearanjrii genice demonstreaz un repertoriu bogat de limfocite B, estimat la 10 7
posibiliti; mutaia somatic conduce la posibiliti mult mai mari de diversificare).

Pentru majoritatea antigenelor (n special cele de natur proteic), activarea i etapele urmtoare
ale RIU necesit prezena limfocitelor Th CD4+ (cu intervenia TCR, APC cu expunerea pe MHC II de peptide
antigenice, molecula CD4 i moleculele de aderen).

Dup contactul cu antigenul i activarea complet, LTh se vor numi LThp (primitive), care ulterior
vor ncepe proliferarea i sinteza de IL2. Prin stimulri autocrine repetate LThp se vor diferenia n LTh0 i
apoi n LTh1 sau LTh2 n funcie de mediul citokinic din jur i de citokinele produse (vezi i 11.3.1.).

Limfocitele Th2 sunt reprezentative pentru RIU. LTh2 secret IL-2, IL-4, IL-5 i IL-6, care activeaz LB
i stimuleaza mecanismul de switch izotipic n genomul LB. Acest switch se realizeaz prin rearanjarea
ADN-ului, pentru sinteza Ac diferii structural, dar cu aceeai specificitate pentru antigen.

Limfocitele B pot fi activate i direct, n cazul antigenelor timoindependente de origine


polizaharidic, cu epitopi repetitivi. Aceasta se realizeaz prin formarea unor puni ntre receptorii de
suprafa i determin redistribuia Ig pe suprafaa membranei celulare. n lipsa interleukinelor produse de
LT, activarea LB este limitat la sinteza de IgM, fr comutarea spre IgG.

Prima etap const n activarea limfocitelor B din stadiul G0 al ciclului celular spre stadiul G1 (celula
sintetizeaz ARN i crete n volum); stimulul este reprezentat de contactul cu antigenul.

IL-4, secretat de limfocitele Th, poate transforma limfocitele B din stadiul G0 i G1 i crete expresia
moleculelor MHC. n acest stadiu LB activat exprim molecule noi: CD23, CD34 i CD40.

Al doilea timp corespunde proliferrii policlonale a celulelor B activate, care trec din stadiul G 1 n
fazele S i M. Aceast faz necesit prezena IL-2 i IL-5.

Ultima faz const n diferenierea n celule productoare de anticorpi - plasmocite; secreia de IL-6
ajut procesului de maturizare iar diferitele interleukine permit orientarea izotipic spre sinteza unei clase
particulare de imunoglobuline.

Aadar, exist o intens colaborare ntre LB, LTh i APC att prin contact direct cu ajutorul unor
molecule de adeziune, ct mai ales prin intermediul citokinelor, adevrai mesageri (hormoni) ai imunitii.

79
88. Expunei principiile teoriei seleciei clonale n
rspunsul imun
Teoria seleciei clonale a fost propus n jurul anului 1950 de
ctre McFarlane Burnet. Aceast teorie afirm c la nivelul sistemului
imun exist un numr imens de capi de clone de limfocite, fiecare
dintre aceti capi de serie corespunznd unei structuri antigenice (unui
anume epitop); n cadrul aceleai teorii, Burnet a fcut estimarea c n
lume ar exista circa 100 de milioane de tipuri de epitopi diferii. Clona,
aa cum se cunoate, este o populaie de celule identice din punct de
vedere genetic, descendente ale unei singure celule mam.

Toate celulele unei anumite clone au la suprafa, molecule


identice cu structur imunoglobulinic; aceste imunoglobuline au rol de
receptori pentru structurile antigenice (pentru fiecare antigen diferit
exist un receptor diferit).

Structurile antigenice selecteaz din acest numr imens de


limfocite cap de serie pe acelea care au receptori complementari
(configuraie spaial etc) i astfel determin proliferarea i diferenierea
lor n celule productoare de anticorpi. Celulele unei clone au aceeai
specificitate pentru structura antigenic datorit creia au proliferat.

Clonele de limfocite care ar putea s produc anticorpi fa de


structurile proprii (self) sunt reprimate n timpul vieii intra-uterine i
numai celelalte clone pot ajunge la maturitate. n lipsa acestei represii
apar boli autoimune grave, potenial fatale.

89. Rspunsul imun primar i secundar; caracteristici


principale

Rspunsul imun primar (RIP)


naintea primului contact cu un anumit antigen, nu exist anticorpi potrivii fa de acesta.
Stimulul antigenic primar selecteaz LB care au receptori pentru respectivul Ag. Dup primul contact cu Ag
se dezvolt RIP, cu urmtoarele caracteristici:

Latena: reprezint perioada de la contactul cu Ag pn la prezentarea structurilor Ag ctre LB (n


conjuncie cu moleculele MHC); variaz n funcie de natura antigenului, calea de administrare i doza
administrat; dureaz ntre 2 i 3 zile;
Creterea logaritmic: (sintez activ de Ac, de ctre plasmocite) dureaz circa 3 zile; n timpul acestei
perioade, Ac devin decelabili prin reacii Ag-Ac; urmeaz o faz de stagnare (cteva zile), timp n care
titrul anticorpilor serici se menine relativ constant;
Ulterior are loc scderea progresiv a titrului anticorpilor serici.

De regul, tehnicile imunologice uzuale permit identificarea Ac dup 5-14 zile de la stimulul antigenic
primar.

80
Natura anticorpilor:
examinarea claselor de anticorpi produi arat c primii anticorpi care apar sunt de tip IgM (cei din clasa IgG
apar cteva zile mai trziu iar nivelul lor crete pe msur ce nivelul IgM scade);

n urmtoarele 2-3 sptmni, n ser predomin anticorpii de tip IgG;

n urmtoarele luni, eventualii anticorpi care persist sunt de tip IgG.

Rspunsul imun secundar (RIS)


Rspunsul imun secundar apare dup al doilea contact cu acelai antigen (sau dup contacte ulterioare). RIS
are urmtoarele caracteristici:

poate aprea chiar i dup administrarea unor doze destul de mici de antigen;

latena este redus la circa 24 ore; se ajunge repede, abrupt la faza de cretere logaritmic;

anticorpii sunt de tip IgG;

titrul Ac produi este mult mai nalt;

persistena acestora este mai lung (Ac produi se menin timp mai ndelungat, luni de zile).

Diferena dintre RIP i RIS este datorat n primul rnd existenei limfocitelor cu memorie. Dup eliminarea
Ag, n organism continu s circule celule cu memorie, reacia imun la al doilea contact cu acelai Ag
avnd caracteristicile de mai sus. Memoria imun se stabilete din timpul RIP i este specific.

Determinarea claselor IgM i IgG are o dubl importan practic:

face posibil distincia ntre o afeciune recent i una mai veche i

permite recunoaterea unei infecii congenitale (cu anumite excepii).

Cunoaterea caracteristicile RIP i RIS are importan practic. Ne permite s nelegem i motivul pentru
care reaciile Ag-Ac trebuie fcute, de regul, n dinamic.

90. Vacinuri; ce sunt i n ce scop se utilizeaz ?


Pornind de la observaiile i experimentele lui Edward Jenner, Louis Pasteur a fundamentat tiinific
vaccinurile alctuite din corpi microbieni. Gaston Ramon a pus la punct metodele de neutralizare a toxinelor
i a identificat utilizarea lor ca anatoxine.

Vaccinul este 1. o suspensie de microorganisme (bacterii, virusuri) vii atenuate sau inactivate sau 2.
cuprinde fraciuni din microorganisme (subuniti), n vederea stimulrii mecanismelor de rspuns imun, de
regul pentru prevenirea apariiei unor infecii.

Vaccinarea este definit drept o metod profilactic, care urmrete creterea rezistenei specifice a
unei gazde, printr-o imunizare activ, cu stimularea rspunsului umoral sau celular, dup caz. De fapt,
vaccinrile incluse n programele naionale de vaccinare (conform recomandrilor Organizaiei Mondiale a
Sntii, OMS) reprezint metodele profilactice cu cel mai bun raport ntre cost i eficien, n comparaie
cu orice alt metod cunoscut.

Strategiile de vaccinare au n vedere mai multe aspecte, inclusiv statusul imun al gazdei respective
(imunocompetent sau imunodeprimat).

81
Unele vaccinuri se pot administra i n timpul unei izbucniri epidemice (outbreak) sau a unei
epidemii, pentru prevenirea apariiei de cazuri noi i scurtarea duratei epidemiei.

Exist i posibilitatea administrrii unor vaccinuri n scop curativ, gazda fiind deja infectat n
momentul inoculrii (ex. vaccin HBV la persoanele cu hepatit cronic, cu HBV).

91. Clasificarea vaccinurilor; exemple

n funcie de infecia
care se dorete a fi prevenit, vaccinurile pot fi bacteriene sau virale.

n funcie de modul de preparare exist:


Vaccinuri corpusculare (bacteriene, virale), incluznd, dup caz, corpi vii atenuai sau distrui
(inactivai) prin aciunea unor factori fizici (ex. cldur) sau chimici (ex. mertiolat de sodiu). Vaccinul BCG
conine bacterii vii atenuate, stimuleaz RIC i se administreaz pentru a preveni tuberculoza. Vaccinurile
poliomielitic (Salk) sau hepatitic A includ virusuri omorte. Vaccinurile poliomielitic (Sabin), rujeolos,
rubeolos conin virusuri vii, atenuate i stimuleaz RIU i rspunsul imun la poarta de intrare.

Vaccinurile subunitare, preparate prin inginerie genetic, au un grad superior de siguran (vaccin
hepatitic B, vaccin pertussis acelular).

Vaccinurile care conin anatoxine bacteriene, purificate i adsorbite pe suport mineral (DTP conine
anatoxin tetanic i difteric plus corpi de Bordetella pertussis omori, DT, dT, ADPA, ATPA/VTA).

n funcie de numrul componentelor antigenice exist:


Vaccinuri monovalente (rujeolos/VVR, rubeolos, hepatitic A, hepatitic B, pertussis acelular, BCG etc),

Vaccinuri asociate, care conin amestecuri de antigene (DTP, DT, dT, rujeolos-rubeolos etc).

92. Descriei schematic structura unei molecule de imunoglobulin


Imunoglobulinele sunt glicoproteine cu rol de anticorpi. Imunoglobulinele exist n plasm, lichid
interstiial i secreii i au capacitatea de a recunoate i de a se combina specific cu antigenul inductor al
rspunsului imun. Lor li se adaug proteinele patologice cu aceeai structur dar fr activitate de anticorpi.
Termenul de imunoglobuline (Ig) l nlocuiete pe cel de gama-globuline. Acest termen nu este corect,
deoarece nu toi anticorpii migreaz electroforetic n regiunea gama.

Toi anticorpii sunt imunoglobuline. Imunoglobulinele pot fi anticorpi, dar au i alte roluri.

Denumirea de anticorp se pare c a fost dat pentru substanele mpotriva corpilor bacterieni,
ceea ce nu este corect, deoarece exist anticorpi i fa de alte structuri (inclusiv mpotriva structurilor
proprii, n bolile autoimune) sau chiar i n cazul bacteriilor, pot exista anticorpi diferii fa de structuri
diferite ale aceleai bacterii (ex. anticorpi fa de cele peste 90 de tipuri capsulare ale Streptococcus
pneumoniae).

82
Structura de baz a unei Ig monomer (ex. IgG1) cuprinde dou lanuri grele identice i dou lanuri
uoare identice, legate ntre ele prin puni disulfurice: dou puni ntre cele dou lanuri grele (n cazul IgG1)
i o singur punte ntre fiecare lan greu i uor.

Fragmentele unei Ig sunt


urmtoarele:

Fab: prima jumtate a


lanului greu i ntregul lan uor,
legate ntre ele printr-o punte
disulfuric, obinute sub aciunea
papainei, prin scindarea naintea
regiunii balama, cu un singur situs
de legare;

F(ab) 2: cele dou fragmente Fab i regiunea balama, care rezult dup aciunea pepsinei, constituie
un fragment superior celor dou fragmente Fab i conine dou situsuri de legare;

Fc: jumtile terminale ale celor dou lanuri grele unite prin puni disulfurice la nivelul regiunii
balama;

pFc: cuprinde fragmentele peptidice rezultate dup aciunea pepsinei, cu ntregul domeniu CH3
situat dup aminoacidul 333 al lanului greu;

Fd: corespunde primei pri a lanului greu dup aciunea papainei, cu formarea fragmentului Fab, i
dup reacia de reducere-alchilare, pentru a extrage lanul uor;

Fv: corespunde prilor variabile ale lanului greu i lanului uor (VH+VL).

Pentru Ig, noiunea de domeniu se regsete la lanurile grele n 4 exemplare (IgG, IgA, IgD) sau 5
exemplare (IgM, IgE) i la lanurile uoare n 2 exemplare. Terminologia utilizat este urmtoarea:

Lanurile grele:
VH - pentru fragmentul greu variabil (variable heavy), comun tuturor claselor i subclaselor cu
aceeai specificitate.

CH 1, CH 2, CH 3 i CH 4, - pentru fragmentul greu constant (constant heavy), care conine


diferenele pentru fiecare clas i subclas; de exemplu pentru IgG1 exist fragmentele Cg11 , Cg12 i Cg13 i
pentru IgM, fragmentele Cm1, Cm2, Cm3,Cm4.

Lanurile uoare:
VL pentru fragmentul uor variabil (variable light), diferit pentru lanurile kappa i lambda: Vk i Vl.

CL pentru fragmentul uor constant (constant light), cu un singur lan Ck i patru Cl funcionale.

Domeniile variabile VL i VH formeaz locul unde anticorpul se cupleaz cu determinantul antigenic


(epitop). Faa interioar a situsului anticorpului (situs combinativ) vine n contact direct cu epitopul i se
numete paratop. Faa exterioar a situsului combinativ se numete idiotip.

83
93. Tipuri de imunoglobuline

94. IgM i Ig G; structur i rol

IgM
Sunt anticorpi aglutinani i reprezint cei mai eficace activatori ai complementului. Ac IgM sunt
caracteristici pentru RI primar, producia lor fiind stimulat de ctre IL-4, care nu activeaz mecanismul de
switch izotipic.

IgM membranar (IgMm) este exprimat pe suprafaa LB. Are structur monomeric i se termin
prin aminoacizii 556-597, cuprinznd n mod particular o parte intramembranar hidrofob i 3 aminoacizi
intracitoplasmatici. Fiecare molecul de IgMm este asociat cu 2 lanuri Iga i 2 lanuri Ig. Ansamblul
formeaz BCR (B cell receptor), comparabil cu TCR-ul limfocitului T.

IgM seric (IgMs) cuprinde un lan greu cu un domeniu variabil VH, 4 domenii constante Cm1 - Cm4
i un procent ridicat de hidrai de carbon (12 %). Molecula nsi este un pentamer cu un prim inel al punii
disulfurice la sfritul lui Cm3, un al doilea la terminarea lui Cm4 i un lan J (joining chain). Masa molecular
este foarte mare (circa 970.000 D), cu un coeficient de sedimentare de 19 S. Concentraia seric este de 1,2 g
/ l. Reprezint circa 5-10% din totalul imunoglobulinelor din ser. Are 10 situsuri combinative dintre care
84
numai 5 sunt funcionale. IgM are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera
hemato-placentar. Apare n RI primar.

IgG
IgG (prototipul de Ac) reprezint circa 75% din totalul imunoglobulinelor din ser i are o distribuie
aproximativ egal n vase i esuturi. Exist patru subclase de IgG (molecule cu termorezisten mai mare),
cu structur asemntoare, o mas molecular de 146.000 (excepie fcnd IgG3 cu o mas de 170.000), 3
domenii constante pentru lanul greu i un procentaj de hidrai de carbon de 2-3 %. Concentraia sanguin a
IgG este de ordinul 11 g/l, din care IgG1 - 66 %, IgG2 - 23 %, IgG3 - 7% i IgG4 - 4 %. IgG are receptori pentru
sistemul complement. Poate trece prin bariera hemato-placentar (dup a 20-a sptmn de via intra
uterin). Apare n RI secundar.

95. IgA i Ig E; structur i rol

IgA
IgA seric. Sub forma IgA1 (80%) i IgA2 (20%), ea se gsete ca monomer (GM 160.000, 7 S) sau ca
dimer sau trimer, ultimele dou forme cu lanul J de jonciune. IgA2 are o structur original. Lanurile
uoare unite ntre ele printr-o punte disulfuric nu sunt legate printr-o legtur covalent cu lanurile grele.
Concentraia sanguin a IgA este de 2,4 g / l. Nu are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece
prin bariera hemato-placentar. Nu particip la aglutinarea, precipitarea sau liza antigenelor corpusculare.
Are activitate bactericid mai mare dect IgG i dect IgM.

IgA exocrin sau secretorie cuprinde dou subclase IgA1 i IgA2. Masa molecular este de 400.000,
cu coeficient de sedimentare de 11 S. Molecula cuprinde dou uniti de IgA reunite printr-un lan J. Acest
ansamblu este nconjurat de unitatea secretorie sintetizat de celulele epiteliale ale tubului digestiv.

Au rol important n aprarea la nivelul mucoaselor (digestiv, respiratorie etc) i n reglarea


compoziiei florei microbiene de la suprafaa acestora. Este important ca nou-nscutul s primeasc de la
mam colostrul i apoi s fie alimentat pe cale natural pentru a primi IgA (sinteza proprie ncepe dup circa
1 lun de la natere).

IgE
Dei concentraia lor seric este infim (0,0001 g/l), fixarea pe bazofile i mastocite le confer un rol
important n inflamaie i hipersensibilitatea de tip imediat. posed, ca i IgM, un al patrulea domeniu
constant, care i confer o mas molecular de 190.000 D i un coeficient de sedimentare 8S, superior IgG.
IgE se fixeaz pe receptor prin intermediul domeniilorCe2 i Ce3,ntr-o poziie aproape orizontal.

96. Ce sunt antigenele: definiie, tipuri, exemple


Antigenul se definete drept o substan recunoscut specific de ctre sistemul imun. Ali autori
consider c antigenul este o substan capabil s induc un rspuns imun (imunogenicitate) i s fie
recunoscut de ctre sistemul imun (specificitate). Rspunsul imun (RI) tinde s neutralizeze i s elimine

85
antigenul din cauza cruia s-a declanat. Antigenele (Ag) care pot declana RI sunt definite drept substane
imunogene.

Haptenele reprezint Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot declana
activarea limfocitelor (fr de care nu apare RI). Haptenele devin imunogene numai dac se combin cu
macromolecule carrier. Aadar, haptena este un antigen incomplet, are specificitate dar nu are
imunogenicitate. Spre exemplu acidul penicilinoic rezultat prin degradarea moleculei de penicilin este o
hapten. Pot aprea reacii de hipersensibilitate dup cel puin al doilea contact cu aceast structur i
numai n condiiile n care gazda ntr n categoria persoanelor atopice, avnd structura genetic de
codificare pentru o protein carrier, care cupleaz acidul penicilinoic stimulnd astfel RI.

Tolerogenele sunt Ag care declaneaz activarea limfocitelor, ns RI este inhibat activ, imediat.

Orice bacterie trebuie vzut ca un ansamblu de antigene, din care nu toate sunt imunogene (unele
pot fihaptene altele tolerogene). Mecanismele de aprare mpotriva microorganismelor sunt diferite dar pot
fi deduse n funcie de structura i caracterele de patogenitate ale respectivei bacterii. Acesta este un alt
exemplu care demonstreaz faptul c ntre capitole diferite exist legturi importante, iar noiunile citite i
nelese la timpul lor pot fi foarte utile, ulterior.

Exist 4 tipuri principale de perete bacterian (tip gram pozitiv, gram negativ, tip micobacterian i
spirochetal) iar patogenitatea poate varia ntre 2 extreme (toxicitate fr invazivitate i invazivitate fr
toxicitate).

Recunoaterea antigenului depinde de structurile complementare ale sistemului imun, preexistente


introducerii sale. Moleculele CMH clasa I sau II pot prezenta o multitudine de peptide antigenice diferite i
nu sunt specifice unui antigen n mod particular.

Moleculele simple precum apa, srurile minerale i ureea sau comune majoritii speciilor (ca acizii
grai, creatinina, mono- i dizaharidele, fibrina) nu sunt antigene. Pe de alt parte, moleculele mici de tipul
metalelor grele (crom, nichel), responsabile de apariia hipersensibilitii, sau medicamentele, pot deveni
antigene dup ce se asociaz cu diferite macromolecule.

97. Antigenele; factori de care depinde imunogenitatea

Structura chimic
Structura chimic trebuie s fie ct mai diferit (provenind de la o specie ct mai ndeprtat) fa
de structurile proprii [noiunea de structur strin este de fapt o noiune chimic; modificarea unui singur
aminoacid din structura primar a unei molecule proteice va fi sesizat ca atare i va duce la un RI, ca i
cum ar fi vorba de o structur nou (diferit, strin, modificat)]; cu ct structura chimic antigenic
provine de la o specie mai ndeprtat filogenetic, cu att RI va fi mai puternic;

Rigiditate
Structura trebuie s aib un grad de rigiditate (s se menin ca atare);

Persisten
86
Structura trebuie s persiste suficient de mult n organism (n cazul n care respectiva structur este
rapid epurat, nu va duce la apariia unui RI); n acest sens pot fi date ca exemplu anumite structuri
antigenice care sunt necesare pentru prevenirea unor mbolnviri (vaccinuri), dar care nu persist suficient
de mult n organismul gazd, motiv pentru care au fost asociate cu substane adjuvante (srurile de aluminiu
au fost folosite n calitate de adjuvani pentru prima dat n 1950, n vaccinul Salk; diferite substane
adjuvante sunt utilizate n vaccinul DTP, vaccinurile anti-HBV, anti-Haemophilus influenzae tip b etc);

Greutate
Greutatea molecular trebuie s fie ct mai mare (de regul peste 4-5.000 Da); antigenele cu
molecul mic pot stimula rspunsul imun dup cuplarea cu o protein carrier;

Complexitate structural
Structura chimic trebuie s fie ct mai complex (cele mai imunogene sunt proteinele iar cele mai
puin imunogene sunt lipidele i acizii nucleici);

Doza
Doza de antigen, calea de administrare, momentul administrrii antigenului etc. sunt ali factori de
care depinde imunogenitatea.

Toi aceti factori sunt valabili n contextul CMH al gazdei care urmeaz s reacioneze fa de
respectivul antigen.

98. Reacii antigen-anticorp; mecanism general i forme de evideniere

Mecanism general
Reacia antigen-anticorp este o reacie ntre un antigen (Ag) i un anticorp (Ac) i const n legarea
gruprii determinante de pe suprafaa antigenului (epitop - o proeminen) cu situsul de combinare de pe
suprafaa anticorpului (paratop - o adncitur).

Reacia Ag-Ac are 2 proprieti principale, specificitatea i reversibilitatea.

Specificitatea se refer la faptul c un antigen nu este recunoscut dect de anticorpii care au fost
produi n urma inoculrii respectivului antigen, iar anticorpii nu recunosc dect antigenul fa de care au
aprut. Trebuie menionat c specificitatea nu este absolut, ntruct un Ag cu reactivitate ncruciat, poate
reaciona cu un Ac format fa de un alt antigen (reacia ncruciat se explic prin aceea c anumite Ag
posed anumite grupri determinante comune).

Reversibilitatea complexului Ag-Ac se datoreaz faptului c legturile necovalente sunt reversibile la


cald sau pH acid (<3).

Legarea antigenului cu anticorpul este determinat de complementaritatea reciproc dintre conturul


suprafeei epitopului i paratopului, care apropie la civa Angstromi gruprile chimice care le alctuiesc,

87
permind stabilirea unor fore intermoleculare ntre epitop i paratop (hidrofobe ntre gruprile nepolare,
de atracie electrostatic ntre gruprile ionizate de semn contrar).

Iniial are loc cuplarea ntre Ag i Ac rezultnd complexe Ag-Ac mici, solubile, care se pot desface
relativ uor. n continuare, datorit existenei mai multor situsuri de legare, complexele Ag-Ac mici se
reunesc formnd structuri de dimensiuni mai mari, adevrate reele Ag-Ac, care pot fi evideniate fie direct,
fie dup utilizarea unor artificii tehnice.

Tipuri de reacii Ag-Ac


n funcie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul urmrit exist mai
multe tipuri de reacii Ag-Ac, dup cum urmeaz:

reacii de precipitare
o pot avea loc n gel (imunodifuzia radial simpl Mancini, dubla difuzie Ouchterlony etc) sau
o pot avea loc n mediu lichid (reacia Ramon, Ascoli etc.)
reacii de aglutinare
o se pot folosi n diagnosticul bacteriologic (ex. reacia Huddleson) sau
o se pot folosi n diagnosticul serologic (ex. reacia Wright)
reacia de fixare a complementului (RFC)
o n diagnosticul serologic al sifilisului (RBV Reacia Bordet-Wasserman), leptospirozei etc.
o n diagnosticul serologic al infeciilor virale etc.
reacii de seroneutralizare
o reacia ASLO (n diagnosticul serologic al infeciilor streptococice)
o testul plcilor semineutralizate
o diferite intradermoreacii cu mecanism imun umoral etc.
reacii n care componentele sunt marcate
o izotopic (radio immunoassay, RIA)
o enzimatic (enyzme-linked immunoassay, ELISA)
o fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA)
o chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA).

99. Reacii de precipitare n mediu lichid; exemple, utilizri

Reacii de precipitare n mediu lichid


Au la baz unirea Ag cu Ac n mediul lichid, formndu-se complexe Ag-Ac, care vor precipita atunci
cnd Ag i Ac se gsesc n anumite proporii.

Reacii de precipitare n amestec


Reacia de precipitare ntre Ag i Ac se poate cuantifica i este foarte util pentru a demonstra
prezena i respectiv absena precipitatului n funcie de concentraiile relative de Ag i Ac. Spre exemplu,
pentru titrarea toxinei difterice (metoda Ramon) se pun n contact, n amestec n tuburi, cantiti egale din
componenta care trebuie titrat (toxina difteric, Ag) cu cantiti variabile de Ac la care titrul este cunoscut.
Cantitatea maxim de precipitat se gsete n tubul unde exist raportul de echivalen. Pentru sistemul
toxin difteric - anticorpi anti-toxin difteric (ca i n cazul sistemului toxin tetanic - anticorpi anti-toxin
tetanic), raportul de echivalen se suprapune peste proporia optim, astfel nct se poate observa
relativ uor tubul n care apare cantitatea cea mai important de precipitat. Cunoscnd titrul anticorpilor, se
88
afl imediat titrul toxinei (1 Lf = 1 limes floculans = cantitatea de toxin care se combin cu o unitate de
antitoxin = 1 UA = 1 unitate antitoxic). Dac spre exemplu precipitarea maxim apare n tubul n care titrul
anticorpilor este de 10 UA, titrul toxinei este de 10 Lf.

n mod asemntor, prin metoda Dean i Web se poate determina titrul anticorpilor anti-toxici,
cunoscnd titrul toxinei.

Reacii de precipitare n inel


Reacia de precipitare n inel, const n punerea n contact a Ag i Ac astfel nct s nu se amestece;
reacia care apare la interfaa dintre Ag i Ac se concretizeaz printr-un inel de precipitare albicios. Se
utilizeaz pentru identificarea originii petelor de snge (reacia Uhlenhut, n medicina legal) i pentru
identificarea provenienei unor preparate pe baz de carne (n industria alimentar).

Demonstrativ, n cursul lucrrilor practice, reacia de precipitare n inel (reacia Ascoli) se poate
utiliza pentru identificarea prezenei antigenului crbunos (Ag obinut de la Bacillus anthracis). Istoric,
soluia de antigen se prepara pornind de la organe (de ex. splin) recoltate de la un animal care a decedat i
pentru care se suspecta c decesul a fost produs de o infecie generalizat cu Bacillus anthracis. Fragmentul
de organ se mojareaz n soluie de clorur de sodiu steril, adugndu-se ulterior cteva picturi de acid
acetic, apoi se meninea la temperatura de fierbere timp de 5-10 minute. Dup decantarea i alcalinizarea cu
NaOH, urma filtrarea i rezulta soluia antigenic. Din punct de vedere tehnic vom utiliza 3 tuburi, 1 pentru
reacie i 2 tuburi martor. n primul tub martor vom pipeta 0,5 ml ser anticrbunos i 0,5 ml soluie salin
fiziologic iar n al doilea tub martor vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal i 0,5 ml soluie de antigen. n ceea
ce privete tubul de reacie trebuie s pipetm nti 0,5 ml din serul anticrbunos, urmnd ca soluia de
antigen (n cantitate de 0,5 ml) s fie pipetat foarte lent, eventual prin scurgere pictur cu pictur pe
peretele interior al tubului, n aa fel nct cele 2 soluii s nu se amestece. n cazul reaciei pozitive
(prezena Ag crbunos n soluia antigenic), dup circa 5 minute, la interfaa dintre cei 2 reactivi apare un
inel de precipitare.

Reacia de precipitare n tub capilar a fost utilizat pentru evidenierea prezenei proteinei C
reactive (CRP).

Dozajul nefelometric
n prezena unei cantiti constante de Ag sau Ac, se formeaz complexe Ag-Ac care modific
intensitatea i dispersia luminii direct proporional cu concentraia de Ag sau Ac (principiul de msurare este
proporionalitatea dintre cantitatea de complex antigen-anticorp format i lumina mprtiat). Cu
ajutorul unui nefelometru, care utilizeaz fascicule luminoase monocromatice intense i a unei msurri a
precipitatului n mediu lichid prin difracie de raze luminoase, este posibil dozarea uoar, reproductibil a
antigenului sau a anticorpilor, folosind o curb de etalonare. Nefelometria se utilizeaz curent i determin
cantitativ proteine specifice din ser i urin (IgG, IgA, IgM, CRP, haptoglobin, orosomucoid, fibrinogen, C3,
C4, prealbumin, alfa1-antitripsin etc).

89
100. Reacii de precipitare n gel; exemple, utilizri
Utilizarea gelozei, n care pot s migreze cei doi reactivi (se va utiliza o anumit concentraie de agar
n soluie de tampon veronal, n aa fel nct porii gelului s permit migrarea), va duce la vizualizarea
reaciei Ag-Ac printr-un arc / linie de precipitare.

Imunodifuzia radial simpl (IDRS Mancini)


Imunodifuzia radial simpl (Mancini) se bazeaz pe difuzia spontan i radial a Ag din proba de
cercetat, ntr-un gel care conine o cantitate constant de anticorpi, determinnd apariia unui cerc de
precipitare al crui diametru este direct proporional cu concentraia de antigen din prob. Pentru a obine
un cerc de precipitare de mrime convenabil, concentraia Ac nglobai n gel trebuie s fie aleas n funcie
de titrul acestora i de concentraia Ag care urmeaz a fi testat. Metoda permite determinareacantitativ a
imunoglobulinelor (IgG, IgM, IgA), fraciunii C3 a complementului, alfa1-antitripsinei, siderofilinei etc.

Sunt necesare plcue (de ex. cu diametrul de 5 cm) n care se toarn un gel care include Ac fa de
structura a crei concentraie dorim s o determinm. Exist un cod al culorilor i spre exemplu, plcuele
care vor fi utilizate pentru determinarea concentraiei de IgG au culoare roie, pentru IgA culoarea este
albastr, pentru siderofilin culoarea este portocalie etc. n gel sunt perforate mici godeuri (3 mm diametru).
Sunt necesare seruri de cercetat i un ser de referin n care se cunoate concentraia diferitelor
componente (spre ex. cte 100 UI / ml pentru fiecare dintre cele 3 imunoglobuline). nainte de pipetarea
serurilor n godeuri se realizeaz diluarea acestora, diluia fiind pentru IgG, IgA i siderofilin i respectiv
pentru IgM, complement C3 i alfa1-antitripsin. Diluia serului de referin se face n funcie de proteina
care urmeaz a fi determinat. Cantitatea de ser introdus n fiecare godeu este de 5 ml (un godeu pentru
serul de referin i restul pentru serurile de cercetat).

Dup 10 minute de meninere a plcuei pe masa de lucru aceasta se incubeaz la 37C, cu stratul de
gel poziionat n sus, timp de 48 ore pentru IgA i IgM i respectiv 24 de ore pentru celelalte componente.
Citirea se realizeaz cu ajutorul unei rigle gradate, din plastic, o rigl special pentru aceast analiz
(demonstrat n cursul lucrrilor practice). Se va msura iniial diametrul cercului de precipitare din jurul
godeului n care se afl serul de referin iar rezultatul obinut trebuie s corespund ateptrilor (de ex. 6
mm pentru IgG care a fost diluat i astfel are concentraia de 25 UI / ml). n cazul c rezultatul este cel
ateptat, se poate face direct citirea diametrelor cercurilor de precipitare pentru serurile de cercetat; n caz
contrar este necesar o corecie (dac spre exemplu diametrul este 6,5 mm n loc de 6 mm, din valoarea
obinut pentru serurile de cercetat se scad 0,5 mm). Dup citirea diametrelor, se compar rezultatele cu
cele puse la dispoziie n tabele iar cifra obinut se nmulete cu diluia probei (spre ex. dac obinem o
valoare de 50 UI / ml pentru IgG, vom nmuli cu 4 pentru a obine rezultatul real).

Imunodifuzia dubl radial (Ouchterlony)


Imunodifuzia dubl se bazeaz pe difuzia Ag i Ac (unul spre cellalt) ntr-un gel. Deoarece mrimea
moleculelor de Ag i Ac este mai mic dect diametrul porilor gelului, iar distana parcurs de reactant ntr-
un anumit timp este direct proporional cu gradientul concentraiei sale i invers proporional cu
greutatea sa molecular, migrarea reactanilor unul spre cellalt determin formarea unor linii de precipitare
la locul de ntlnire Ag-Ac. n gelul transparent vor aprea linii opace, numrul lor corespunznd numrului
sistemelor Ag-Ac studiate.

90
Metoda certific prezena sau absena proteinei cercetate. Se pot evidenia alfa-fetoproteina,
proteina C reactiv, beta-2 microglobulina, proteine Bence-Jones tip kappa i lambda, produi de degradare
ai fibrinogenului (PDF) etc. n micologie, prin imunodifuzie se poate identifica prezena exoantigenelor
fungice (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatidis, Coccidioides immitis etc) sau prezena Ac fa de
Ag fungice, spre exemplu n diagnosticul serologic al unei aspergiloze invazive. Aceast metod este nc
frecvent utilizat pentru determinarea specificitii anticorpilor antinucleari sau a altor anticorpi n patologia
uman.

Sunt necesare lame de microscop pe care se toarn un gel de agar 1%, lama putnd fi folosit pe
parcursul unei zile (dac acest lucru nu se poate ndeplini, lama trebuie pstrat n camer umed, la
temperatura frigiderului, pentru maxim o sptmn). n gelul de pe lam se perforeaz 3 grupe de godeuri,
cte 7 godeuri n fiecare grup (1 godeu central i 6 godeuri periferice, fiecare cu diametrul de 3 mm). Dac
spre exemplu dorim s determinm prezena proteinei C reactiv (CRP) n seruri de cercetat, avem nevoie de
un ser cu Ac anti-CRP, seruri de cercetat i un ser de referin care conine CRP. Numerotnd godeurile
periferice, pipetm Ac anti-CRP n godeul central i ser de referin cu CRP n godeurile 1 i 4. n celelalte
godeuri pipetm serurile de cercetat. Incubm la 37C, timp de 24 de ore, n camer umed (ntr-o cutie
Petri putem pune o bucat de vat mbibat n soluie salin fiziologic, alturi de lama respectiv). Liniile de
precipitare pot deveni vizibile dup 2-4 ore dar sunt mult mai clare dup 24 de ore.

Pentru citire pot fi necesare o lup i o surs de lumin. ntre godeul central i godeurile 1 i 4
(martori pozitivi) vor aprea linii (arcuri) de precipitare. n cazul n care de ex. n godeul 2 exist CRP, va
aprea un arc de precipitare i ntre godeul central i godeul nr. 2. Este certificat prezena CRP n cazul n
care cele 2 linii de precipitare (dintre godeul central i godeurile 1 i 2) sunt una n continuarea celeilalte
(imagine de genunchi ndoit).

Dubla difuzie Elek


Aceast metod permite depistarea capacitii toxigene a unei tulpini de Corynebacterium
diphteriae. n cazul n care tulpina este toxigen, toxina va difuza n mediu iar dup unirea cu Ac anti-toxin,
complexele Ag-Ac vor da natere unor linii de precipitare.

ntr-o cutie Petri turnm mediul Elek i dup ce mediul s-a ntrit, decupm un an pe unul din
diametre. n anul respectiv pipetm 0,5 ml ser antidifteric, ser care conine Ac anti-toxin difteric n
concentraie de 1.000 UI / ml. Ac anti-toxin difteric vor difuza n mediu. Dup circa 2 ore nsmnm
perpendicular pe anul cu Ac anti-toxin, de fiecare parte a anului, o tulpin de Corynebacterium
diphteriae toxigen (martor pozitiv), o tulpin de Corynebacterium diphteriae ne-toxigen (martor negativ) i
tulpini de cercetat, cte un striu (de fiecare parte a anului) pentru fiecare tulpin. Incubm la 37C pentru
48 ore, dar urmrim zilnic apariia culturii i precipitatului (liniilor de precipitare). De-a lungul liniilor de
nsmnare apare cultur bacterian. Din cultura de Corynebacterium diphteriae toxigen, toxina (Ag)
difuzeaz n mediu. Unirea dintre Ag i Ac duce la formarea unor complexe Ag-Ac care precipit, iar n mediu
vor aprea linii de precipitare n unghiurile dintre cultur i anul cu Ac anti-toxin. n cazul n care apar linii
de precipitare n unghiul dintre una dintre tulpinile de cercetat i anul cu Ac anti-toxin, respectiva tulpin
este toxigen. Reacia va fi negativ pentru martorul negativ i pentru tulpinile de cercetat ne-toxigene.

91
101. Reacii de aglutinare; principiu, tipuri, exemple

Reacia de aglutinare
n reacia de aglutinare antigenele sunt de natur corpuscular. Reacia de aglutinare const n
reacia Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafaa unor particule (bacterii, hematii, latex, cristale de
colesterol etc), determinnd aglutinarea acestora prin scderea forelor electrostatice de repulsie dintre
particule i formarea unor puni de legtur.

Aglutinarea este mai sensibil dect precipitarea, Ag fiind o particul i nu o molecul solubil.
Anticorpii de tip IgM sunt mai aglutinani dect Ac de tip IgG (pentru c au mai multe valene). Exist i Ac
neaglutinani (incomplei / blocani) sau care aglutineaz numai la rece.

Tipuri de aglutinare
Exist mai multe variante tehnice de aglutinare. Dintre acestea vom prezenta n continuare, pe scurt,
aglutinarea direct, aglutinarea indirect, inhibarea aglutinrii, aglutinarea n coloan i aglutinarea mediat
de Ac anti-imunoglobuline. Ulterior vom discuta reaciile de aglutinare utilizate n bacteriologie i micologie.

Aglutinarea direct
Aglutinarea direct reprezint aglutinarea Ag naturale ale unor particule (bacterii, celule) de ctre Ac
specifici. Se poate utiliza n a. diagnosticul bacteriologic, de ex. pentru identificarea enterobacteriilor
(Shigella, Salmonella, E. coli etc) sau a altor germeni Gram-negativi (Vibrio cholerae) etc., pe baza structurii
antigenice, n b. diagnosticul serologic al unor boli infecioase (febr tifoid, bruceloz etc), c. pentru
determinarea grupelor sanguine (ABO) etc.

Aglutinarea indirect sau pasiv


Este o reacie n care particule artificiale (globule roii formolate, particule de latex, cristale de
colesterol, colodiu etc) sau naturale sunt ncrcate in vitro cu Ag sau Ac i sunt aglutinate de ctre Ac sau
Ag corespondente din proba de cercetat. Se utilizeaz n principal pentru decelarea factorului reumatoid,
determinarea CRP, determinarea grupului streptococic etc.

Inhibarea aglutinrii
Reacia const n inhibarea aglutinrii particulelor ncrcate cu Ag, dup ce n prealabil Ac
reacioneaz cu Ag corespondent. Se utilizeaz de ex. pentru decelarea mioglobinei sau n diagnosticul
imunologic al sarcinii.

Aglutinarea n coloan
Metoda permite o mai bun vizualizare a reaciei. Dispozitivul utilizat are 2 compartimente, partea n
care se introduc reactivii (situat superior) i o coloan situat inferior, plin cu microparticule de sticl.
Dup introducerea hematiilor i a serului de cercetat i incubarea acestora, dispozitivul este centrifugat. n
cazul unei reacii pozitive complexul Ag-Ac se va putea vizualiza la nivelul coloanei, n timp ce n cazul unei
reacii negative, hematiile se depun n poriunea inferioar a coloanei.

92
Aglutinarea mediat de Ac anti-imunoglobuline
Anticorpii anti-Ig se vor cupla cu particule ncrcate cu Ac i vor duce la apariia unor aglutinate
(prin apariia complexului imun). Se utilizeaz spre exemplu n decelarea factorului reumatoid (tehnica
Waaler-Rose).

102. Reacia de fixare a complementului; principiu, etape, utilizri, exemple


Face parte dintre reaciile al cror rezultat nu poate fi vizualizat fr un artificiu tehnic, n acest caz
utilizarea unui sistem hemolitic indicator. Motivul pentru care este necesar acest sistem indicator se
datoreaz faptului c Ag este fie sub form macromolecular fie este reprezentat de corpi microbieni de
dimensiuni foarte mici, iar complexul Ag-Ac format nu devine vizibil cu ochiul liber. RFC a fost imaginat nc
din anul 1901 de ctre Jules Bordet i s-a perfecionat destul de mult de-a lungul timpului. Aceast reacie
este utilizat n peste 100 de sisteme Ag-Ac, prin tehnici clasice sau tehnici care au suferit modificri, inclusiv
introducerea micrometodelor RFC.

Se utilizeaz de ex. Ag cunoscute, puse n contact cu serul testat (n care cutm Ac) care este
decomplementat (prin nclzire la 56C timp de 30 minute) i cu o cantitate de C' de cobai (alexin); dac n
serul cercetat exist Ac, ei se vor cupla cu Ag formndu-se complexe Ag-Ac, pe care se ataeaz C', care se va
consuma i nu va mai aciona n timpul doi (nu va mai produce hemoliza). ntr-un al doilea timp este adugat
un sistem hemolitic (substrat indicator) compus din globule roii de oaie (acoperite cu anticorpi IgG de
iepure). Dac globulele roii nu sunt hemolizate, nseamn c a fost utilizat C' n cursul primului timp i
reacia este pozitiv (Ac prezeni n serul de cercetat); dac globulele roii sunt hemolizate, nseamn c nu
s-a utilizat C' care a rmas disponibil pentru a se ataa de sistemul hemolitic, reacia este negativ (nu sunt
prezeni Ac n serul de cercetat).

Reacia de fixare a complementului se poate folosi att pentru identificarea Ag ct i n diagnosticul


serologic. Pentru c nu urmeaz s discutm pe larg prima variant, vom enumera doar cteva dintre
exemple, RFC permind identificarea unor Ag rickettsiene, chlamydiene, virale etc. n diagnosticul serologic,
cea mai cunoscut metod rmne nc RFC Bordet-Wasserman, utilizat nc n diagnosticul serologic al
sifilisului.

Subliniem faptul c RFC este o metod laborioas, n care nu se admit erori tehnice, dar fiind
executat corect este foarte exact, are o mare sensibilitate i specificitate. Este de asemenea una dintre
metodele cu un mare grad de reproductibilitate.

93
Principiul RFC:
RFC se bazeaz pe proprietatea sistemului C' de a se fixa pe
complexul imun Ag-Ac.

n prima faz a reaciei se introduce serul de cercetat iar dac


acest ser conine Ac specifici fa de Ag cunoscut se va forma un
complex Ag-Ac, urmat de fixarea C', care se va activa pe calea clasic i
nu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe sistemul hemolitic
indicator (hematii + Ac-antihematie). n cazul n care serul de cercetat
nu conine Ac specifici fa de Ag cunoscut, nu va avea loc formarea
unui complex Ag-Ac n prima etap a RFC.

Dup introducerea n reacie a sistemului hemolitic indicator,


hematiile i Ac-antihematie se vor cupla, vor forma un complex imun
iar C' liber se va fixa pe acesta. Dup fixare va urma activarea C' i
respectiv liza hematiilor, hemoliza putnd fi examinat cu ochiul liber.

Tehnica de lucru:
Aa cum am menionat, tehnica de lucru este laborioas i nu
va fi prezentat n totalitate, n cele ce urmeaz.

Serul de cercetat se va menine 30 minute la 56C, n baia de


ap, pentru inactivarea C' propriu.

Aa cum am menionat anterior, principial, RFC are loc n 2


etape:

1. n prima etap se pun n reacie C', serul de cercetat i Ag cunoscut; exist 2 posibiliti: a. n serul de
cercetat exist Ac specifici, rezultnd un complex Ag-Ac pe care se va fixa C'; b. n serul de cercetat nu
exist Ac specifici, nu se formeaz complex Ag-Ac, C' rmne liber;
2. n a doua etap se introduce n reacie sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac anti-hematie); exist 2
posibiliti: a. C' nu este liber, nu are loc hemoliza, b. C' se fixeaz pe sistemul hemolitic, lizeaz
hematiile i observm apariia hemolizei.

Exist anumite diferene ntre tehnicile cantitative i cele calitative, dar principiile sunt aceleai.

n RFC Bordet-Wasserman (RBW), metod calitativ, reacia se realizeaz n eprubete, 2 pentru


reacia propriu-zis (una cu ser diluat 1/8, cealalt cu ser diluat 1/16), 2 pentru martori sigur pozitiv i sigur
negativ i cte una pentru fiecare din ceilali martori, respectiv martor pentru serul de cercetat, martor
pentru Ag, martor pentru C', martor pentru serul hemolitic).

Interpretare:
Iniial se verific rezultatele aprute pentru martori (fie c este vorba de o metod cantitativ sau
calitativ); spre ex. n cazul metodei calitative, n tubul martor pentru serul de cercetat trebuie s fie
hemoliz, la fel ca i n tuburile martor pentru Ag, C' i ser sigur negativ. n tuburile martor sigur pozitiv i
martor pentru sistemul hemolitic, nu trebuie s fie hemoliz.

94
n tuburile cu serul de cercetat, dac apare hemoliza, nseamn c nu exist Ac iar testul este
negativ (lichidul din tub va avea un aspect rou, limpede).

Testul este pozitiv atunci cnd n tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliz, hematiile se depun
formnd un buton n partea inferioar a tubului (n serul de cercetat exist Ac). Pentru a stabili
diagnosticul final, este necesar ca RBW s fie confirmat prin reacii specifice (vezi capitolul dedicat genului
Treponema).

Control de calitate:
Cu privire la controlul de calitate am menionat utilizarea martorilor, pentru fiecare reacie.

n RFC utilizat n diagnosticul serologic, Ag cunoscut va fi ales n funcie de suspiciunea de


diagnostic. RFC cantitativ se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infeciilor produse de Mycoplasma
pneumoniae, Chlamydia spp., Rickettsia spp., Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella
spp., diferite virusuri etc.

n scopul creterii sensibilitii i specificitii se aleg proprietile Ag cunoscut, o anumit


temperatur de incubare (de ex. 4C n loc de 37C n RFC Kolmer) etc. Ac fixatori de C' apar precoce n
cursul bolii astfel nct identificarea prezenei lor poate semnifica o infecie acut sau recent.

103. Reacia de seroneutralizare; principiu, tipuri, utilizri, exemple


La fel ca i n cazul RFC, n reacia de seroneutralizare (RSN) este necesar un artificiu tehnic pentru a
permite vizualizarea rezultatelor. n cazul RSN, Ag are o anumit proprietate biologic (toxic, enzimatic)
care poate fi blocat (neutralizat) prin cuplarea cu Ac specific. Neutralizarea efectului biologic respectiv se
poate realiza doar n cazul n care determinantul pentru toxicitate sau pentru activitatea enzimatic
respectiv este acelai cu determinantul antigenic (epitop).

Reaciile de seroneutralizare ar putea fi utilizate n mai multe mprejurri, spre exemplu n:

diagnosticul microbiologic direct


o identificarea Clostridium perfringens prin metoda plcilor
o testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae
o toxinotipia n cazul suspicionrii unei toxi-infecii alimentare cu Clostridium botulinum
diagnosticul serologic
o reacia ASLO
prevenirea unor boli infecioase prevenibile prin vaccinare i evaluarea eficacitii vaccinale
o vaccinarea cu anatoxine (DTP, DT, dT, ATPA, ADPA);
o titrarea prezenei Ac anti-toxine (difteric, tetanic etc);
o testarea prin IDR (intra-dermo-reacie) a susceptibilitii fa de o anumit boal infecioas care
are la baz drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine. Intradermoreaciile Schick sau
Dick, pentru a dovedi susceptibilitatea persoanei testate fa de o infecie difteric sau
scarlatinoas au intrat n istoria medicinii.
tratamentul / profilaxia unor boli infecioase prin utilizarea de imunoglobuline specifice omologe sau
utilizarea unor seruri hiperimune heterologe.

95
Reacia ASLO
Aceast reacie poate fi utilizat n diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice sau pentru
confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice (mpreun cu criteriile minore i majore de diagnostic).
Reacia ASLO determin titrul Ac anti streptolizin O (SLO).

Principiu
Titrarea Ac anti-SLO se bazeaz pe faptul c SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau
de berbec. n cazul n care n serul de cercetat exist Ac anti-SLO, aciunea hemolitic a SLO este neutralizat.
Combinnd diluii din serul de cercetat cu o cantitate constant de SLO vom putea determina titrul ASLO.

Interpretare
Pornind de la o diluie iniial a serului de
1/10, dup adugarea tuturor reactivilor titrul
(numrul de uniti ASLO) va fi 12, 50 n tubul
urmtor, 100, 125, 166, 250, 333 etc n tuburile
urmtoare. Titrul reaciei ASLO este dat de cea mai
mare diluie de ser la care lipsete complet hemoliza. Pentru zona noastr geografic se accept ca normal
un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO. Exist teste serologice i pentru evidenierea prezenei i titrului
anticorpilor fa de alte structuri antigenice (de exemplu streptodornaz, hialuronidaz, streptokinaz).

Control de calitate
Ultimele 2 tuburi sunt reprezentate de tubul martor pentru hematii, n care se verific rezistena
hematiilor i respectiv tubul martor pentru SLO n care se pun SLO i suspensia de hematii.

Exist i posibilitatea de a realiza o micrometod ASLO, reacia efectundu-se n plci de material


plastic cu godeuri.

Utilizarea RSN n profilaxia i tratamentul unor boli infecioase

Vaccinarea n scopul obinerii unei protecii prin seroneutralizare


Vaccinul DTP include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) n faza I, combinat cu anatoxina
difteric i tetanic. Primovaccinarea se ncepe vrsta de 2 luni a nou-nscutului, administrndu-se 3 doze la
interval de 2 luni (la 2, 4, 6 luni). Pentru meninerea imunitii se practic revaccinarea I la 6 luni de la primo-
vaccinare iar revaccinarea a II-a se practic la 36 de luni de via a copilului respectiv. Datorit posibilelor
reacii adverse (fa de componenta pertussis) se recomand eliminarea acesteia la nou-nscuii cu
probleme ale sistemului nervos, la cei predispui la boal i la cei care au avut o reacie advers semnificativ
la o administrare anterioar a DTP-ului. Se studiaz posibilitatea utilizrii pe scar larg a unui vaccin acelular
n care s fie inclus toxina pertussis inactivat i care s permit obinerea unui RI eficient i de durat.
Vaccinul DTPa este deja utilizat n SUA i n ri din UE.

Evaluarea eficacitii vaccinurilor

96
Se recomand testarea strii de imunitate indus prin vaccinare, conform normativelor elaborate de
autoritile de sntate public; metodele au la baz titrarea Ac anti-toxin (difteric, tetanic etc) n seruri
prelevate de la copii vaccinai, prin diferite tehnici. Spre exemplu se consider c un copil este protejat
(prezint rezisten specific n cazul unei infecii difterice) dac titrul Ac-anti toxin difteric este mai mare
de 0,03 UAI / ml (UAI = unitate anti-toxic internaional). n mod asemntor se consider c exist
protecie fa de tetanos dac titrul Ac-anti toxin tetanic este mai mare de 0,01 UAI / ml.

Se pot face teste de susceptibilitate, in vivo, pentru a verifica dac persoana investigat este sau nu
protejat fa de o eventual infecie. n acest scop se practic IDR. n istoria medicinii au intrat IDR Dick,
care permite testarea susceptibilitii fa de scarlatin (toxina este elaborat de ctre streptococul de grup
A lizogenizat) i respectiv IDR Schick, care permite testarea susceptibilitii fa de difterie (toxina este
elaborat de ctre bacilul difteric lizogenizat).

o Ambele IDR se realizeaz similar din punct de vedere tehnic;

o Spre ex. n cazul IDR Schick se injecteaz n treimea medie a antebraului, strict intradermic o
cantitate de 0,1 ml toxin difteric diluat corespunztor. n cazul n care n sngele persoanei testate se
gsete o cantitate de Ac anti-toxin mai mare de 0,03 UAI / ml, toxina inoculat va fi neutralizat i nu va
aprea nici o modificare la locul inoculrii (lipsa eritemului semnific faptul c persoana testat nu este
susceptibil s fac difterie, n cazul n care se infecteaz cu un bacil difteric toxigen). n cazul n care
persoana respectiv nu prezint Ac anti-toxin difteric, Ag inoculat va conduce la apariia unui eritem la
locul de inoculare.

Terapia sau profilaxia specific (imunoterapie pasiv)


Administrarea de imunoglobuline specifice omologe, obinute de la persoane imunizate (natural sau
artificial) fa de o anumit maladie infecioas, de ex. n imunoterapia infeciei cu Clostridium tetani
(tetanos) se pot administra intramuscular 3-6.000 UAI.
Administrarea de seruri imune heterologe, obinute prin hiperimunizarea cailor, n tratamentul
tetanosului, difteriei, botulismului etc.
Terapia bolilor n care mecanismul patogenic implic exotoxine trebuie instituit ct mai rapid, deoarece
exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci cnd se gsesc n circulaie. Pe de alt parte, administrarea de
ser heterolog trebuie realizat numai n caz de necesitate (datorit strii de hipersensibilitate care ar putea fi
indus i care ar duce la reacii adverse).

Utilizarea RSN n profilaxia i tratamentul unor boli infecioase

Vaccinarea n scopul obinerii unei protecii prin seroneutralizare


Vaccinul DTP include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) n faza I, combinat cu anatoxina
difteric i tetanic. Primovaccinarea se ncepe vrsta de 2 luni a nou-nscutului, administrndu-se 3 doze la
interval de 2 luni (la 2, 4, 6 luni). Pentru meninerea imunitii se practic revaccinarea I la 6 luni de la primo-
vaccinare iar revaccinarea a II-a se practic la 36 de luni de via a copilului respectiv. Datorit posibilelor
reacii adverse (fa de componenta pertussis) se recomand eliminarea acesteia la nou-nscuii cu
probleme ale sistemului nervos, la cei predispui la boal i la cei care au avut o reacie advers semnificativ
la o administrare anterioar a DTP-ului. Se studiaz posibilitatea utilizrii pe scar larg a unui vaccin acelular
n care s fie inclus toxina pertussis inactivat i care s permit obinerea unui RI eficient i de durat.
Vaccinul DTPa este deja utilizat n SUA i n ri din UE.
97
Evaluarea eficacitii vaccinurilor
Se recomand testarea strii de imunitate indus prin vaccinare, conform normativelor elaborate
de autoritile de sntate public; metodele au la baz titrarea Ac anti-toxin (difteric, tetanic etc) n
seruri prelevate de la copii vaccinai, prin diferite tehnici. Spre exemplu se consider c un copil este protejat
(prezint rezisten specific n cazul unei infecii difterice) dac titrul Ac-anti toxin difteric este mai mare
de 0,03 UAI / ml (UAI = unitate anti-toxic internaional). n mod asemntor se consider c exist
protecie fa de tetanos dac titrul Ac-anti toxin tetanic este mai mare de 0,01 UAI / ml.

Se pot face teste de susceptibilitate, in vivo, pentru a verifica dac persoana investigat este sau
nu protejat fa de o eventual infecie. n acest scop se practic IDR. n istoria medicinii au intrat IDR Dick,
care permite testarea susceptibilitii fa de scarlatin (toxina este elaborat de ctre streptococul de grup
A lizogenizat) i respectiv IDR Schick, care permite testarea susceptibilitii fa de difterie (toxina este
elaborat de ctre bacilul difteric lizogenizat).

o Ambele IDR se realizeaz similar din punct de vedere tehnic;

o Spre ex. n cazul IDR Schick se injecteaz n treimea medie a antebraului, strict intradermic o
cantitate de 0,1 ml toxin difteric diluat corespunztor. n cazul n care n sngele persoanei testate se
gsete o cantitate de Ac anti-toxin mai mare de 0,03 UAI / ml, toxina inoculat va fi neutralizat i nu va
aprea nici o modificare la locul inoculrii (lipsa eritemului semnific faptul c persoana testat nu este
susceptibil s fac difterie, n cazul n care se infecteaz cu un bacil difteric toxigen). n cazul n care
persoana respectiv nu prezint Ac anti-toxin difteric, Ag inoculat va conduce la apariia unui eritem la
locul de inoculare.

Terapia sau profilaxia specific (imunoterapie pasiv)


Administrarea de imunoglobuline specifice omologe, obinute de la persoane imunizate (natural
sau artificial) fa de o anumit maladie infecioas, de ex. n imunoterapia infeciei cu Clostridium tetani
(tetanos) se pot administra intramuscular 3-6.000 UAI.

Administrarea de seruri imune heterologe, obinute prin hiperimunizarea cailor, n tratamentul


tetanosului, difteriei, botulismului etc.

Terapia bolilor n care mecanismul patogenic implic exotoxine trebuie instituit ct mai rapid,
deoarece exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci cnd se gsesc n circulaie. Pe de alt parte,
administrarea de ser heterolog trebuie realizat numai n caz de necesitate (datorit strii de
hipersensibilitate care ar putea fi indus i care ar duce la reacii adverse).

104. Reacii antigen-anticorp care utilizeaz componente marcate; tipuri de


marcare, utilizri
Reamintim c, n funcie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul urmrit
exist mai multe tipuri de reacii Ag-Ac, i anume:

reacii de precipitare
reacii de aglutinare
98
reacia de fixare a complementului (RFC)
reacii de seroneutralizare.

Dac n cazul primelor 2 tipuri de reacii vizualizarea se poate face direct (cu ochiul liber, cu ajutorul
unei lupe etc) n cazul RFC i RSN este necesar utilizarea unor sisteme indicator. n continuare vom
discuta despre reaciile Ag-Ac n care pentru interpretare este necesar marcarea reactanilor, ceea ce se
poate face:

izotopic (radio immunoassay, RIA);


enzimatic (enzyme-linked immunoassay, ELISA);
fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA);
chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA) etc.

n prezent aceste metode sunt extrem de folosite avnd avantajul unei mari sensibiliti, sunt
automatizate i adaptabile la testri utile n toate disciplinele bio-medicale.

105. Hipersensibilitatea definire, tipuri de hipersensibilitate, exemple

Definiie, clasificare
Reacia imun este un rspuns normal fiziologic fa de microorganisme sau celule tumorale.

Totui, RI poate mbrca i aspecte patologice, de tipul hipersensibilitii (HS) sau al autoimunitii.
Primele observaii privitoare la reaciile de hipersensibilitate au fost fcute de Charles Richet n urm cu un
secol, observaii care vor acoperi tipul I din clasificarea Gell i Coombs de mai trziu. Pornind de la diferite
tipuri de reacii observate, Gell i Combs (1968) au propus o clasificare folosind termenul de
hipersensibilitate de tip I-IV. n 1974, Roitt adaug hipersensibilitatea de tip V, stimulant (pornind de la
anticorpii stimulani ai funciei tiroidei, prezeni n hipertiroidia primitiv, boala Basedow).

n mod clasic, HS reprezint o stare de reactivitate crescut a organismului, pe baza unui mecanism
imunologic, indus de expunerea (repetat) la anumite structuri antigenice (sau haptene). Cuvntul alergen
a fost pentru prima oar utilizat de Riquet; desemneaz un antigen care d natere unei reacii de
hipersensibilitate.

HS este specific i include

un contact sensibilizant,
perioad de laten i
un nou contact, contactul declanator, cu acelai antigen care a fost implicat n contactul
sensibilizant.

HS se poate clasifica n funcie de tipul de rspuns imun n:

HS mediat prin mecanism imun umoral (rol primordial LB i anticorpii)


HS de tip I (anafilactic, atopic), aa cum se nregistreaz n cazul ocului anafilactic, edemului Quincke,
conjunctivitelor sau rinitelor alergice, astmului alergic, urticariei, eczemei atopice etc;

99
HS de tip II (citotoxic), aa cum se ntmpl n liza celular prin anticorpi, complement dependent sau
n citotoxicitatea anticorp dependent, complement independent (mecanisme ce pot fi implicate de ex.
n patogenia reumatismului articular acut, n anemii hemolitice inclusiv dup infecii cu Mycoplasma
pneumoniae, reacii posttransfuzionale, sindromul Goodpasture etc);
HS de tip III (prin complexe antigen-anticorp), aa cum se nregistreaz n reacia Arthus, boala serului,
boala plmnului de fermier, glomerulonefrita extramembranar, lupusul eritematos diseminat,
crioglobulinemia mixt, glomerulonefrita i periarterita poststreptococic etc.
HS de tip IV mediat prin mecanism imun celular (rol primordial LT i citokinele), spre exemplu n
o HS tuberculinic sau
o HS n testrile intradermice care utilizeaz lepromin, candidin, histoplasmin, tricofitin etc i
o HS n multe dintre infeciile virale.

106. Reacii anafilactice mecanism, forme de manifestare

Hipersensibilitatea de tip I (anafilactic)


Reacia imun anafilactic se poate instala rapid (n mai puin de 15-30 minute) dup un nou contact cu un
antigen la care organismul este sensibilizat. n aceast reacie intervin celulele (mastocite, bazofile) acoperite
de reagine (n principal IgE), care elibereaz mediatori chimici (histamina fiind cel mai important i cel mai
cunoscut dintre acetia).

Anafilaxia este un fenomen general, obinut ca rspuns la antigene variate: toxine, proteine, medicamente,
alloantigene de transplant. Codeina, morfina, vancomicina i substanele de contrast folosite n imagistic
pot determina oc anafilactoid, cu aceleai manifestri ca n ocul anafilactic, ns fr participarea IgE.

Anticorpii anafilactici (reaginele) sunt anticorpi care se fixeaz prin fragmentul lor Fc pe receptorii specifici
exprimai la suprafaa bazofilelor i mastocitelor.

Controlul producerii de IgE este realizat de LT. LTh2 stimuleaz producerea IgE (sunt implicate IL-4, IL-5, IL-
10). LTh1 inhib producerea IgE (fiind implicate IFN i IL-12).

100
Th2 are o aciune autocrin, secret IL-4 cu aciune att
asupra LB ct i asupra celulei secretoare.

Sinteza de IgG4 i sinteza de IgE se afl sub controlul


acelorai citokine i se realizeaz de aceeai populaie
celular. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulin
sunt situate foarte apropiat una de cealalt, pe
cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4
devine independent de cea de IgE nu este clar elucidat,
dar se pare c un rol l-ar putea juca Il-10.

Efectele diferite induse de cele 2 tipuri de imunoglobuline


se datoreaz structurii diferite. IgE prezint fa de IgG4
un domeniu constant suplimentar, o zon balama diferit
i zone de recunoatere pentru ambele tipuri de receptori:
FcRI (afinitate nalt) i FcRII (afinitate joas).

IgE au un timp de via mai scurt (<2 zile) comparativ cu


21-23 zile pentru IgG, iar concentraia acestora este foarte
sczut n serul individului normal.

Ataarea IgE de mastocite i bazofile (ca dimeri cuplai cu


alergenul) duce la creterea duratei de via a IgE de la
mai puin de 2 zile la 10 zile.

IgE nu trec de bariera feto-placentar datorit faptului c


placenta nu conine FcR. n sngele fetal se pot gsi IgE n
cantiti sub 1UI/ml prin ataare de FcRI de pe
macrofagele fetale. FcRI pot semnaliza pentru
degranulare i dup cuplarea cu alte molecule (ex. lectine,
Ac anti lant FcRI).

Bazofilele i mastocitele se caracterizeaz prin prezena unor granule metacromatice, roii dup coloraia cu
albastru alcyan, datorit histaminei i heparinei.

Mediatorii mastocitari sunt reprezentai de histamin, leucotriene, prostaglandine, factorul activator


plachetar (PAF), adenozin, factori chemotactici pentru eozinofile (ECF) i neutrofile (NCF) i o serie de
citokine proinflamatorii (IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, GM-CSF, TNF-a, TGF-1, IFN-g). La suprafaa bazofilelor i
mastocitelor sunt exprimai diveri receptori, dintre care cei mai importani sunt FceRI, FceRII (CD23) i C3aR
i C5aR (CD88).

Legarea reaginelor de receptorii FceRI, FceRII iniializeaz semnalizarea spre interiorul celulei, ducnd la
activarea celular.

Activarea bazofilelor i mastocitelor se realizeaz prin mecanisme mediate imun i necesit prezena unui
mesager secund intracelular (Ca2+ sau AMPc). Procesul de activare const dintr-o serie de reacii biochimice
n trepte, cu participarea fosfolipidelor membranare, activarea PKC, fosforilarea tirozinei, toate ducnd la

101
creterea influxului de Ca2+ extracelular alturi de mobilizarea rezervelor de Ca2+ intracelular. Rolul Ca2+ este
de a iniia eliberarea mediatorilor preformai i sinteza de novo a mediatorilor lipidici.

Exemplificm efectele acestor mediatori prin histamin care produce:

bronhoconstricie prin aciune direct pe receptorii H1 ai musculaturii netede traheo-bronice,

vasodilataie arterio-capilar prin contracia fibrelor musculare netede din peretele venulelor
postcapilare,

creterea permeabilitii capilare,

creterea motilitii intestinale i

reacie urticarian la nivel cutanat.

Mastocitele elibereaz histamin i LTD4, care vor determina edem, hipersecreie de mucus i
bronhoconstricie, cu scderea FEV1, ns elibereaz i IL-5, TNF, care vor atrage eozinofile, limfocite,
neutrofile i macrofage.

Aceste celule inflamatorii vor determina modificri cronice la nivelul plmnului: hiperplazie a celulelor
secretoare de mucus, depunere de colagen la nivelul membranei bazale i hiperplazie muscular neted.
Aceste modificri vor determina o hiperreactivitate bronic, dar de data aceasta, nespecific
(hiperreactivitate bronic la aer rece, efort). Activitatea inflamatorie care are loc la nivelul bronhiilor se
coreleaz cu valoarea NO expirat (inducere iNOS la nivelul macrofagelor), cu un numr crescut de eozinofile
i cu valori mari ale ECP (eozinophil cationic protein) n sputa indus. Aceste teste nu au valoare diagnostic,
nsa pot fi utilizate orientativ pentru aprecierea severitii astmului.

Faptul c mastocitele intervin n ambele faze, imediat i tardiv, o demonstreaz efectul benefic pe care l
are cromoglicatul (stabilizator de membran, se opune degranulrii) n tratamentul astmului bronic.
Corticosteroizii acioneaz numai pe rspunsul tardiv. Ei nu pot face discriminarea ntre implicarea
mastocitelor i LT n inflamaia cronic datorit faptului c inhib ambele celule.

Dintre manifestrile clinice sistemice care pot aprea n cazul unei stri de HS de tip I, sunt de reinut:

- ocul anafilactic, care la om se manifest prin colaps cardio-vascular i bronhospasm; n lipsa tratamentului
poate evolua ctre deces. Principalele antigene care pot declana ocul anafilactic sunt nepturile de
himenoptere (albine, viespii), injectarea unor medicamente (penicilina, miorelaxante, ACTH etc), latexul (la
infirmiere, chirurgi) i

- edemul Quincke care cuprinde faa, gura i uneori faringele i laringele, ducnd la asfixie i deces.

Dintre manifestrile clinice localizate ar fi de amintit:

- manifestrile localizate la nivelul mucoasei oculare sau respiratorii, avnd drept principali ageni
declanatori polenul, acarienii, praful de cas, sporii de ciuperci (conjunctivite alergice, rinite alergice inclusiv
febra de fn, traheita spasmodic i astmul alergic);

- manifestrile cutanate (urticarie, dermatite sau eczema atopic) i


102
- manifestrile digestive (diaree, vomismente n caz de alergie la laptele de vac, ou, pete, fructe, elin
etc).

107. Hipersensibilitatea de tip III mecanism, boala serului, alte exemple

Fenomene experimentale
Patologia uman

HS de tip III se poate datora:

- unei infecii persistente (ex. lepr, malarie,


hepatit viral, endocardit stafilococic);

- unei boli autoimune (ex. artrit reumatoid, lupus


eritematos sistemic, polimiozit);

- inhalrii de material antigenic (ex. actinomicete n


cazul plmnului de fermier, antigene aviare n
cazul plmnul cresctorilor de psri).

Complexele imune activeaz o serie de ci ale


rspunsului imun. Aminele vasoactive eliberate n
cadrul activrii acestor ci determin retracia
celulelor endoteliale, ceea ce are ca efect creterea
permeabilitii vasculare, depunerea complexelor
imune, dar i expunerea colagenului, care va stimula agregarea trombocitelor i formarea de microtrombi.

Se intr ntr-un cerc vicios deoarece complexele imune depuse pe membrana bazal continu s genereze
C3a i C5a (anafilatoxine). Astfel, complementul, iniial cu rol protectiv, determin ulterior creterea
suplimentar a permeabilitii capilare. Polimorfonuclearele sunt atrase i i exociteaz coninutul n loc s
endociteze complexele imune (acestea nu pot fi desprinse de pe membrana bazal vascular). Enzimele
inhibitoare serice mpiedic enzimele lizozomale s acioneze la nivel sistemic, ns nu i local, de aceea se
vor genera leziuni tisulare locale. Eritrocitele primatelor conin receptori pentru C3b, importani pentru
preluarea complexelor imune i transportul lor ctre splina i ficat, unde vor fi fagocitate. n HS de tip III,
sistemul este suprasaturat, ceea ce i scade eficiena. Complementul menine complexele Ag-Ac solubile pe
calea clasic i resolubilizeaz complexele Ag-Ac agregate pe calea altern, de aici putndu-se deduce rolul
depleiei de componente ale complementului sau a unor boli ereditare (deficit C2) n patologia HS de tip III.
Este important i dimensiunea complexelor imune. Cele mari sunt repede preluate de ficat i eliminate, n
timp ce complexele mici rmn n circulaie o perioad mai lung de timp. Un defect genetic ce determin
sinteza de Ac cu afinitate joas, va favoriza producerea de complexe Ag-Ac mici i deci, leziunile
caracteristice HS de tip III.

Depunerea complexelor imune

Administrarea de metilsergida sau clorfenilamina (antagoniti ai aminelor vasoactive) reduce considerabil


depunerea complexelor imune prin scderea permeabilitii vasculare.
103
Depunerea complexelor mai este dependent de regimul presional crescut i de prezena turbulenelor. n
capilarele glomerulare presiunea sngelui este de 4 ori mai mare dect n restul capilarelor. Turbulene se
ntlnesc n zonele de bifurcaie a arterelor i n zonele de filtru vascular (plexurile coroide i corpii ciliari).
Preferina pentru un esut sau altul poate fi dependent de sarcina electric a complexului imun, de gradul de
glicozilare a Ac.

Fenomene experimentale

Reacia Arthus a fost descris n 1903 de Maurice Arthus i Nicholas Breton, dup injectarea subcutanat de
ser de cal la un iepure hiperimunizat. Leziunile au fost maxime dup aproximativ 6 ore. Boala seric acut,
descris n 1911 de von Pirquet, a fost studiat din nou n anii 1960, descriindu-se zece modele de
glomerulonefrite experimentale (Dixon). Deoarece complexele imune circulante (CIC) se depoziteaz n
esuturi, apare conceptul de antigen in situ. Dup ce complexul imun se formeaz n locul respectiv sau este
fixat secundar, se iniiaz (aa cum am menionat anterior) o cascad de evenimente:

activarea complementului i a factorilor anafilactoizi chimiotactici C3a i C5a;

afluxul de neutrofile, care produc leziuni prin enzimele lizozomale i

afluxul de trombocite, cu generarea fenomenelor de tromboz.

Fenomenul Arthus a fost observat la iepure, cobai, oarece etc, dar i la om. Experimentul a fost efectuat pe
iepure prin injectarea de antigen netoxic (ex. albumin) de la alt specie, asociat cu un adjuvant imun. Dup
unele rapeluri, necesare uneori pentru obinerea de anticorpi circulani IgG precipitani, reacia Arthus poate
fi obinut prin injectarea subcutanat a antigenului. Manifestrile apar dup 2 ore, atingnd maximum la 6
ore i dispar dup 24-48 ore. Constau n edem, eritem indurat, peteii i uneori purpur necrotic sau chiar
necroz. Leziunile de la locul injectrii antigenului duc la fixarea de igG i C3b cu sediul perivascular sau n
peretele vascular.

Boala serului

a) Boala serului acut. naintea erei antibioticelor, multe boli infecioase erau tratate prin injectarea de ser
de cal hiperimunizat. n 1911, von Pirquet descrie complicaiile acestei terapii sub termenul de boal seric
(febr, artralgii, vasculit cutanat), survenit la unii bolnavi dup 8-12 zile de la prima injecie.

Injectarea unic, pe cale intravenoas, a unei substane netoxice, ca serumalbumina bovin (BSA), n
cantitate mare, la animalul neimunizat (iepure), este urmat de apariia bolii serice acute (experimental) cu
3 faze: 1. faza anterioar imunizrii (dureaz 5-8 zile. BSA marcat radioactiv, scade, iniial brutal prin
difuziune n spaiile extravasculare, apoi dup 24 de ore, lent, corespunztor propriului catabolism); 2. faza
complexelor imune (corespunde prezenei concomitente de BSA i a anticorpilor anti-BSA); este boala seric
cu glomerulonefrit. n jurul zilei a 5-a, concentraia sangvin de BSA scade rapid. Anticorpii anti-BSA liberi
nu sunt decelabili dect dup dispariia BSA liber. Detectarea complexelor imune corespunde acestei
perioade, ca i scderea complementului seric. Manifestrile patologice nu sunt datorate anticorpilor anti-
BSA liberi i nici complexelor imune circulante. Ca i n reacia Arthus, leziunile sunt datorate aciunii
complementului, care este urmat de un aflux de neutrofile. La animalul fr complement apare o simpl
albuminurie fr glomerulonefrit); 3. faza de restitutio ad integrum (nu mai exist antigen liber sau conjugat
decelabil; anticorpii anti-BSA sunt crescui; manifestrile clinice, n special glomerulonefrita, regreseaz
rapid).

104
b) Boala seric cronic. Este dificil de reprodus la animal. Totui administrarea repetat a antigenului (din 2
n 2 zile), permite producerea unei glomerulonefrite cronice extramembranare proliferante.

Patologia uman

Principalele afeciuni umane sunt:

bolile comparabile cu reacia Arthus (n care antigenul induce o reacie local prin difuziunea
anticorpilor IgG precipitani); un exemplu este boala plmnului de fermier [dup contactul n timpul zilei cu
fnul mucegit (Actinomyces thermophylus), apare la nceputul nopii (dup 6 ore) o stare de asfixie care
dispare n urmtoarele ore];

manifestri mai generale, cu atingerea rinichiului, articulaiilor, pielii i uneori a creierului; apar leziuni
de tipul glomerulonefritei extramembranare, uneori proliferative. Afeciunile mai frecvente sunt lupusul
eritematos diseminat, crioglobulinemia mixt, glomerulonefritele i periarteritele poststreptococice etc. n
2/3 din cazurile de anemie hemolitic imuno-alergic medicamentoas se formeaz anticorpi IgM anti-
medicament. n aceste cazuri apar adesea manifestri generale: febr, frison, mialgii cu dureri lombare i
uneori anurie tranzitorie, prin necroz tubular acut.

108. Hipersensibilitatea de tip IV mecanism, evideniere, aplicaii practice

Hipersensibilitatea de tip IV reprezint o reacie (mai) ntrziat, care apare la 48-72 de ore dup
contactul cu antigenul i se datoreaz limfocitelor Th1 specifice antigenului. HS de tip IV este un tip exagerat
de rspuns imun celular.

HS de tip IV poate fi considerat ca un martor al mecanismelor protective fa de germenii


intracelulari dar i de alte substane chimice care se leag puternic de membrana celular. Totui, corelaia
protecie-hipersensibiltate nu e perfect, n sensul c se poate ca un pacient cu HS de tip IV la un anumit
germen s dezvolte infecii progresive cu acel patogen (ex. situaia din infeciile cu M. leprae).

Au fost descrise patru tipuri diferite de hipersensibilitate (de tip IV), dintre care ultimele trei sunt
importante n patologia uman.

Hipersensibilitatea de tip Jones-Mote (nu are echivalent la om);

Hipersensibilitatea de contact
Este o reacie epidermic, care corespunde la om cu eczema de contact / dermatita de contact. n
experimentele pe animal se plaseaz pe piele diferite antigene, care penetreaz uor n epiderm i se leag
solid de celule. Cel mai frecvent se utilizeaz DNCB (dinitroclorbenzen), DNFB (dinitrofluorbenzen), Oxazolina
sau Clorura de picryl. DNCB este un exemplu de hapten care sensibilizeaz aproape toi contacii, i pe care
o putem folosi ca s stimulm imunitatea mediat celular.

Un rol important n sensibilizare l joac keratinocitele i celulele Langerhans.

105
Reacia de hipersensibilitate de contact survine dup ce animalul a fost sensibilizat n prealabil. Dup
o injecie ulterioar intradermic sau dup aplicarea antigenului pe tegument, urmeaz legarea haptenei de
un carrier, complexul antigenic este fagocitat de o
celul Langerhans care se va activa, matura i i va
ncepe migrarea spre zona paracortical a nodulilor
limfactici sub aciunea IL-1 i TNF secretai de
keratinocitele agresate.

Corespunde unei infiltrri dermice i epidermice,


edemului epidermic i eritemului aprut dup 48-72
ore, care va persista cteva zile. Absena reaciei se
datoreaz unui deficit imun celular. Sensibilizarea
prealabil cu DNCB (ex. la fotografii) poate declana
un oc anafilactic la IgE.

Primele modificri apar ncepnd cu a 6-a pn la a 8-


a or dup contactul cu alergenul; LT activate i cele
cu memorie vor ajunge n circulatie i ulterior n zona
inflamat, alturi de monocite, unde vor ndeprta
complexul hapten-carrier. Ele nconjoar vasele
sanguine, glandele sudoripare, glandele sebacee,
foliculii piloi i infiltreaz epidermul. Infiltratul
celular se accentueaz progresiv i ajunge maxim
spre a 72-a or.

Infiltratul conine celule T CD4+ (n majoritate), T


CD8+, celule Langerhans, macrofage i bazofile.

Aceleai keratinocite, dar i macrofagele, vor produce


ulterior PGE, cu rol inhibitor al reaciei inflamatorii.

LTs intervin de asemenea n terminarea reaciei de


HS (la fel ca i ultravioletele), prin scderea
producerii de IL-1. Ultravioletele inhib direct i
celulele Langerhans.

n concluzie, fenomenele apar n urmtoarea


succesiune: celulele Langherhans activeaz LT CD4+
cu memorie; acestea produc diferite citokine: IL-2, IL-3, IFN-g i GM-CSF. Celelalte celule sunt recrutate i
activeaz o reacie inflamatorie n care predomin celulele mononucleare.

Hipersensibilitatea de tip tuberculinic


Persoanele infectate cu unul din germenii (M. tuberculosis, M. leprae, Leishmania tropica etc.) / sau
care vin n contact cu substanele chimice (beriliu, zirconiu etc.) care pot provoca hipersensibilitatea de tip
tuberculinic au LT deja activate.

106
n laborator, pentru sensibilizare se injecteaz la un animal Ag mpreun cu adjuvantul complet
Freund (pregtirea animalului prin imunodepresie cu ciclofosfamid permite i utilizarea adjuvantului Freund
incomplet). Aceast faz de sensibilizare ncepe cu 2-3 sptmni nainte de testarea HS.

Dup injectarea antigenului la animalul sensibilizat, LT specific sensibilizate migreaz n jurul vaselor
sanguine (la 12 ore) iar activarea lor duce la secreia de interleukine care recruteaz alte celule
nesensibilizate. Infiltratul desparte fibrele de colagen din derm i atinge un maxim la 48-72 ore dup injecie.
Celulele observateiniial sunt LT [predomin T CD4+ (raport CD4/CD8 - 2/1)], ulterior ncep s se acumuleze
macrofagele (atingnd un maxim spre finalul celei de a treia zi de la inoculare).

Fenomenele sunt maxime la nivelul dermului dar pot atinge i epidermul; keratinocitele exprim la
suprafaa lor molecule HLA DR (la 48-96 de ore dup apariia infiltratului limfocitar, fapt care va amplifica
rspunsul imun al gazdei), circulaia aferent i eferent a celulelor imunocompetente seamn cu cea
observat n hipersensibilitatea de contact; se poate observa o infiltrare uoar cu bazofile; n timp se poate
dezvolta o reacie granulomatoas.

La om se practic intradermoreacia cu tuberculin (PPD, derivat proteic purificat, un amestec


relativ bine standardizat de antigene proteice mycobacteriene). Citirea rezultatului se face dup 72 ore,
asigurnd o bun iluminare a zonei examinate (de preferat lumina natural). Se identific existena unei
eventuale arii intens eritemato-violacee, circumscriind urma nepturii dermice. Apoi se apreciaz tactil
(prin repetate micri ntr-un sens i altul deasupra zonei de reacie) cu pulpa inelarului, limitele unei zone
de induraie (perceput ca fiind reliefat) i care corespunde histopatologic infiltraiei dermice (edem,
limfocite, macrofage, PMN), reprezentnd rspunsul imun fa de antigenul injectat. Se msoar i se
nregistreaz diametrul maxim al zonei de infiltraie (a se vedea i anexa nr. 3). Leziunile dezvoltate la
injectarea intradermic de tuberculin se rezolv n mod normal n 5-7 zile; persistena acestora face ca
leziunea s se transforme dintr-una tuberculinic ntr-una granulomatoas.

Hipersensibilitatea granulomatoas
Este o form mai grav de hipersensibilitate (ntrziat) de tip IV care survine atunci cnd antigenul
persist i nu poate fi eliminat. Se caracterizeaz printr-o acumulare i o proliferare de macrofage, care stau
la originea granulomului care apare la 21-28 zile dup sensibilizare i poate s persiste mai multe sptmni.
Hipersensibilitatea granulomatoas poate succeda diferite hipersensibiliti ntrziate precedente, n general
dup o perioad de 3 - 4 sptmni.

Elementul distinctiv al hipersensibilitii granulomatoase este formarea de celule epiteloide, celulele


derivate din macrofage, de dimensiuni mari pe seama dezvoltarii reticulului endoplasmatic, cu rolul lor de a
ntreine inflamaia prin secreia continu de TNF. Persoanele cu deficit de IFN nu dezvolt granuloame, ns
nici nu se apr eficient mpotriva tuberculozei, leprei, leishmaniozei, schistosomiazei etc. Prin fuziunea
celulelor epiteloide rezult celule gigante. Mai sunt denumite i celule Langhans. Atenie, sunt diferite de
celulele Langerhans! Aceste celule gigante au mai muli nuclei, ns periferici, reticulul endoplasmic este
puin dezvoltat, iar mitocondriile i lizozomii sunt n degradare. Se pare ca aceste celule Langhans ar
reprezenta etapa final din diferenierea macrofagelor.

Reaciile de hipersensibilitate de tip IV observate n patologia uman pot fi observate n trei grupe
principale de afeciuni:

107
1. Eczema de contact care poate aprea datorit bijuteriilor care conin nichel, produselor din piele de
animal, produselor cu sruri de crom, cremelor solare, compuilor chimici de cauciuc, produselor
farmaceutice (penicilin, streptomicin, neomicin) etc;
2. Maladii infecioase n care agenii patogeni se dezvolt intracelular (tuberculoz, lepr, leishmanioz,
listerioz, micoze profunde etc);
a. n cazul M. tuberculosis, leziunea granulomatoas conine pe lng macrofage, celule epiteloide,
celule gigante i LT dispuse centrifug, i o zon de necroz central, un fel de puroi numit
cazeum. n jurul ntregului ansamblu se afl o zon de fibroz i o cantitate crescut de colagen.
b. n cazul M. leprae, reacia granulomatoas se numete reacia Mitsuda.
c. Apariia de leziuni la injectarea de antigene splenice de la un alt pacient cu sarcoidoz unei alte
persoane cu sarcoidoz, constituie pozitivarea testului Kweim.
3. Alte maladii (sarcoidoz ciroz biliar primitiv, hepatitele cronice virale B i C, SIDA, infecia HIV,
poliartrita reumatoid, reumatismul articular acut, b. Crohn etc).

108
Bibliografie

www.microbiologie.ro
Carte curs
Carte LP

Molecular Biology of the Cell 6th Alberts

Microbiology. An Introduction Tortora

Junqueira's Basic Histology Text and Atlas, 13th Edition

Fundamental Immunology 7th - W. Paul

109