Sunteți pe pagina 1din 1322

DUMITRU BUIUC MARIAN NEGU_~

EDITIA A II-A

\\

EDITURA MEDICALA
DUMITRU BUIUC MARIAN NEGUT
Membru al Academiei de Stiinte Membru al Academiei de Stiinte
Medicale Medicale
Profesor u'M.F. "Gr. T. Popa", Iai Profesor U.M.F. "Carod Davila",
Catedra de microbiologie Bucureti
Catedra de microbiologie
Director Adjunct Institutul Cantacuzino
Bucureti

TRATAT DE
MICROBIOLOGIE \J
CLINICA
EDITIA A II-A REVIZUITA SI ADAUGITA

EDITURA MEDICAL\.
BUCURE~TI 2008
CUPRINS

Partea I: GENERALIT A.TI

1. Logica Microbiologiei clinice (Dumitru Buiue) .


2. Labqratorul de microbiologie clinicii (Dumitru Buiuc) 35
3. Sterilizarea. dezinfectia ~i spiilarea in circuitnl materialelor din laboratorul de microbiologic
(Dumitru Buiue) 62
4. Microscopie (Dumitru Buiue) 80
5. Izolarea bacteriilor ~i studiul culturilor (Dumitru Buiue) n
6. Cuantificarea microorganismelor (Dumitru Buiue) 117
7. Tehnici bazate pe studiul acizilor nucleici utilizate in diagnosticul ~i supravegherea microbiolo-
gicii a bolilor infcctioase (Maria Damian) 125
8. Diagnosticul infectiilor virale. chlamidiale ~i rickcttsienc in laboratorul clinic (Dumitru Buiuc) 1SO

Partea a II-a: INVESTIGAREA ETlOLOGICA.


A PRINCIPALELOR SINDROAME INFECTIOASE

9. Hcmocultura in diagnosticul infectiei (Dumitru Buiue) . 165


10. Examenul lichidului cefalo-rahidian in diagnosticul infectiilor sistemului nervos central
(Dumitru Buiuc) . 182

II. Examenul microbiologic al pmoiului (Dumitru Buiuc) . 195

12. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului respirator superior ~i cavitiqilor concctc


(Dumitru Buiuc) . 208
13. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului respirator inferior (Dumitru Buiuc) . 224
14. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului urinar (Dumitru Buiuc) . 255
15. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului genital masculin (Dumitru Buiuc) . 278
16. Diagnosticul de laborator al infeqiilor tractusului genital feminin (Gabriela Coman) . 286
17. Diagnosticul de laborator al infectiilor oculare (Dumitru Buiuc) . 299
18. Diagnosticul de laborator al infeqiilor bacteriene in patologia gastro-duodenalii (Gabriela Coman) 317
,~~
I
19. Diagnosticul de laborator in sindromul diareic infectios (Marian Negut) . _'l..;..

20. Diagnosticul de laborator a1toxiinfeqiilor alimentare (Dumitru Buiuc, Marian Ncgut) . 363

Partea a III-a: APORTUL LABORATORULUI CLINIC LA INITIEREA


SI MONITORIZAREA TERAPIEI ANTlMICROBIENE.
REZULTATELE TESTA.RII DE RUTlNA. A REZISTENTEI
LA ANTIBIOTlCE CA TEZAUR PUBLIC PENTRU SUPRAVEGHEREA
SI CONTROLUL REZISTENTEI LA ANTlBIOTlCE

21. Elementele de standardizarc a tchnicilor de laborator pcntru orientarea ~i monitorizarea tcrapiei


antimicrobiene (Irina Coditii, Dumitru Buiuc) 387
22. Determinarea sensibilitiitii la antibiotice: tehnici cantitative (Irina Coditii, Dumitru Buiuc) 420
23. Detel111inarea sensibilitiitii la antibiotice: teste calitative (Irina Coditii, Dumitru Buiuc) 453
24. Testiiri pentlU monitorizarea tratamentului antimicrobian (Dumitru Buiuc) 483

Xl
Partea a IV-a: METODE IMUNOLOGICE. METODE ALE BIOLOGIEI
MOLECULARE. METODE CROMATOGRAFICE
~I DE DEVELOPARE ENZIMATICA
IN MICROBIOLOGIA CLINICA

25. Reaqiile antigen-anticorp pentru depistarea rapidii a antigenelor microbiene $i serodiagnosticul


infeqiilor (Luminita Smaranda lancu) 497
26. Metode moleculare utilizate in diagnosticul $i supravegherea microbiologicii a patogenilor entcrici
(Maria Damian, Codruta-Romanita Usein, Marian C\'egut) : 532
27. Identificarea rapidii a microorganismelor prin cromatografie $i testarea enzimelor prin substrate
cromogene sau fluorogene (Olivia Dorneanu) 545

Partea a V-a: IDENTIFICAREA MICROORGANISMELOR


IN LABORATORUL CLINIC

28. Identificarea cocilor gram-pozitivi aerobi $i facultativ anaerobi (Irina Coditii, Dumitru Buiuc,
Carmen Panzaru, Vasilica Ungureanu) . 562
29. Identificarea cocilor gram-negativi aerobi (Marian Negut, Ileana Levenet, Alexandru Rafilal 6m:
30. Identificarea bacililor gram-pozitivi aerobi (Angela Diaconescu, Dumitru Buiuc, Carmen
Pauzaru, Maria Damian, Dana Magdalena Caplan) . 619

31. Identificarea bacililor gram-negativi aerobi glucozo-fennentativi (Marian Negut, Dumitru Buiuc) 695
32. Identificarea bacililor gram-negativi aerobi glucozonefermentativ (Dumitru Buiuc, Marian
Negut, Gabriel lonescu) . 765
33. Identificarea bacililor gram-negativi aerobi sau facultativ anaerobi pretentio~i nutritiv (Nicolae
Mihancea, Georgeta Mihai, Veronica Alecu, Liviu A. Sicinschi, Dumitru Buiuc, Marian
Negut, Olivia Vizitiu) . 796
34. Identificarea bacililor acido-rezistenti (Lorena Gabriela Popa, Mircea loan Popa) . ~81
35. Identificarea bacteriilor anaerobe (Alexandra Macovei) . 900 j

36. Identificarea microplasmelor $i ureaplasmelor (Daniela Biidescu) . 92~


37. Identificarea spirochetelor (Nicoleta Andreescu, Maria lonescu, Dan Ionescu, Sanda Hristescu) 935
38. Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de fungi (Mihai Mare~, Olimpia Bazgan) . 953
39. Bacterii $i fungi cu perete defectiv (Maria Dan, Mihai Mare~) . 1031

Partea a VI-a: MEDII DE CULTURA. TESTE DE IDENTIFICARE.


COLORATII. DILUANTI

40. Medii de culturii, medii de transport $i conservare (Alexandru Rafila) 1045


41. Teste de identificare a microorganismelor (Dumitru Buiuc) 1085
42. Coloratii, coloranti $i reactivi pentru microscopie, micrometrie (Dumitru Buiuc, Carmel]\
Panzaru) 1173
43. Diluenti utili in microbiologia c1inica (Dumitru Buiuc) 1216

XII
Partea I

GENERALITA.TI

1. LOGICA MICROBIOLOGIEI CLINICE


(DUMITRU BUIUC)

1.1. DEFINITIE Criterii ~i proccdura dc respll1gcrc a


1.2. METODELE M1CROBIOLOG1E1 probelor
CLINICE 1.3.3.4. CO/1t1vllll \'ariatiilor analiriec
Metode directe Controlul de calitate 211reactivilor
Metode indirecte Controlul performanrei aparaturii de
Necesitatea urgentei laborator
Neccsitatea preciziei 1.3.3.5. CO/llrollli variatiilor posr-wwliticc
1.3. VARIA TII, ERORI $1 CONTROLUL 1.3A. Criterii obiectiye pentrll interpretan'a
LOR IN MICROBlOLOGIA CLlNICt,. rezultatelor in microbiologia c1inica
Variarii biologice 1.3A.1. Relatiile mieroO/;r;anism-ga::deJ [filial/II.
Varia\ii preanalitice illiel7)lIrrllnderea Cfi !lil/amica lur
Variarii analitice 1.3A.2. Arglllllenrarea semnUiea!iei clil/iee (/
Varia\ii post-analitice lIlieroo/ganislllc!or oporll/nisrc dcpisl(IIC
1.3.1. Fluxul informational c1inicii laborator /ntr-un prelevar parologie
1.3.2. Performanta testelor de laborator 1.3A.3. Arglllllentareu semnUiell!iei c/iniee II
Sensibilitatea alliicorpi/or depislaji la un paeiclII
Specificitatea 1.3.5. SlIperyizarea actiYitatii ~i pregatirea
PrediC\ia po ziti va continua a personaluilli de laborator
PrediC\ia negativa 1.3.6. Comllnicarea c1aJ'a a rezllitatclor
Eficacitatea 1.3.7. Relatiile laborator-c1inicii in controllli
Rclatii prevalentii-eflcacitate de calitate al investiga(iei micro-
Fiabilitatea biologice
Reproductibilitatea IA. UTILIZAREA ADECVATA A LARO-
1.3.3. Standardizarea ~i controlul de calitate RATORULU1 DE MICROBIOLOGIE
in microbiologia clinicii CLINICA
1.3.3.1. De/initii generale 1.4.1. Rela(ia cost-beneficiu (eficicn!a)
1.3.3.2. ReferentialI' ~'i norme de calilate IA.l.1. /ndicarea UdeCl'Ul17 ailll'csriga{iilol'
1.3.3.3. CO/llrolul variLl{iilor preanalilice lIliL'robiologice
Norme de prelevare a probelor pentru lA. I .2. Tria}u! de culirate 01 prc/eVIIle!or
exumcl1ul microbiologic IA.l.3. Programlll de Illerll u!lobor(/fol'lll"i
Transp0l1ul ~i conservarea probelor ] A.l.4. Alegerea lestc/or pel/Ii'll il/l'esrigo(io
Triajul de calitate a! probelor micmbiologieci
"""""" ~ .,7,)

1.1. DEFINITIE

Microbi%gia clinicii este a disciplina a medicinei de laborator, care trebuie sa


ofere cat mai rapid .yi precis informatiile necesare pentru decizia clinica la un pacient Cll
boala infectioasa.
AIgoritmuI investigatiei microbiologice pentru clinic. are urmatoarele faze
principale: (1) ipoteza clinica, (2) ordonanta ~i cererea de analiza, (3) pre levarea,
etichctarea, conservarea ~itransportul probelor, (4) i'nregistrarea ~iexaminarea probelor.
(5) concluziile trase, etapizat, de microbiolog din rezultatele obtinute, (6) redactarea
buletinului de analiza, (7) insu~irea concluziilor de catre medic ~i (8) efectullor asupra
deciziei clinice (fig. 1-1).

1.2. METODELE MICROBIOLOGIEI CLINICE

Metodele de investigatie i'n microbiologie clinica sunt directe ~i indirecte.


Metodele directe presupun:
I) Depistarea rapida a microorganismelor prin:
microscopie, e.g., preparate microscopice necolorate (umede, intre lama :;;i]al11ela)
sau diferit colorate;

PRE LEVARE
DE PROBE
ADECVATE:
MARCARE,
CONSERVARE,
TRAt-bPORT LA
LABORATDR

REZULTAT PREll MINAR,


DACA ESTE FDSIBIL

,\
CULTIVARE PEN-
EX"MEN DIRECT TRU IZOLARE
MA CRO sCaPI c, REZULTAT PRELIMINAP. MEDII ADECVA-
MICROSCOPIC, OAc4 ES1E FDSIBIL TE ATMOSFERA.
ALTE METDDE TEMPERA rUM,
PAPIOE TIMP

Fig. 1-1. Algoritmul investigatiei in microbiologia clinicii.

2
tehnici imunologice pentru depistarea $i identificarea antigenelor microbienc:
tehnici de depistare a unor metaboliti sau structuri moleculare specifice. e.g., a
acizilor gra$i volatili, a acidului tuberculostearic prin cromatografie gaz-lichicl: a
endotoxinei prin testul Limulus;
tehnici de biologie moleculara, e.g., sonde de acizi nucleici, reactia de amplificare
genica numita Polymerase Chain Reaction (peR).
2) ]zolarea microorganismelor in cuhura pura cu:
identificarea izolatelor;
preeizarea semnificatiei lor clinice;
antibiograma, cand terapia antimicrobiana este posibila $i necesara.
Metodele indirecte includ telmici pentru depistarea, caracterizarea $i cuantificarea
efectorilor imunitari: anticorpi (diagnosticul serologic), limfocite specific sensibilizate
(e.g., diagnostic prin reactii intradermice).
Necesitatea urgentei apare in raport cu impactul asupra deciziei clinice $i sub
rapoli economic.
In raport cu impactul asupra deciziei cfinice, informatiile furnizate de examenul
microbiologic Ie putem aprecia la trei nivele:
1) Foarte urgente. Orienteaza in 1-4 ore decizia clinic a prin rezultatele tehniciJor
rapide de depistare directa a microorganismelor in prelevatele patologice.
2) Urgente. Orienteaza decizia clinica in interval de 18-36 ore prin iclentificarca
prezumtiva a izolatelor cu semnificatie clinica, mai ales daca testuJ b-Iactamazei sau
antibiograma sunt posibile pe primoculturi.
3) Fara constrangere. Influenteaza decizia clinica abia dupa 2-5 zile saL!mai mult
prin identificarea definitiva a speciei, antibiograma pe subcultura, determinarea nivclului
de eficienta -cida a umorilor in cursul antibioticoterapiei, serodiagnosticul.
Investigatiile fomie urgent $i urgente sunt esentiale in bolile infectioase acutc grave
(e.g., septicemii, meningite, pneumonii, unele diarei acute) sau in infectii cronice grave
determinate de organisme cu cre$tere lenta (e.g., meningite tuberculoase) - tabelul 1-].
Sub raport economic investigatiile care dau mai rapid rezultate utile deciziei clinicc
sunt de preferat atat prin economia de materiale, cat $i prin scurtarea spitalizarii (e.g.,
antibiograma pe cultura primara in infectiile tractusului urinar).

Comparativ cu laboratoarele de biochimie, hematologie $. a., in laboratorul de


microbiologie clinica variatiile $i erorile au conditionare mult mai complexa, care decurge.
in principal, din interferenta $i dinamica relatiilor dintre simbiontii omului, diversitatea
agentilor infectio$i cu prevalenta in cre$tere a celor conditionat patogcni. dinall1ica
procesului infectios, diversitatea produselor patologice $i a tipurilor de prelcvatc,
fragilitatea unoI' agenti infectio$i. De aceea, in cele ce urmeaza, vom aborda separat
acestc probleme.
.j::.
robe/III 1-1

I':~lliollarcli illvcstigatiilor III microbiologia c1inica III raport cu impactul asupra dccizici c1illicc

morfi
Idcntificarea dcfinitivii a Nivelul il1lportan(ei
lade~-Iactamaza
limita
tampoaneabsen!a defercn!iere
exsuda-
sau
cuConfirmare
Antibiogral11aintravcnoase
Oiprezum(iei
granl-negativi
Antibiogram:l
angina >llcmocu
a mononucleoza
~Ipozitiva
microscopia plco- Oaea1000
Prczum( sunt
deprin:Fara2-3Ituraspeciei
3Transport
Vincent:
Exsudatul
M(hel110culturi
Nivel
Proteina
suficiente
infee!ioasii
18-24'
Antigen
idenlifi-
Antigene
IdcllliJ'
carea
organisme
eonstnlngere
tului; seroasclor
Baclerioscopie
Examen
Hcmoculturi
icdeCateterul -eid
Idcntifiearca
seric
Cultivare biochimic
CdiInainte
bactcrii
o/ re)ml
Urgent
~-lactal11azii
Antibiogral11ii
~-lactal11aza so!ubil
il1lediat
iIcucograma
b.carca
Idcnlifieare
antibioterapie
Citologie
inscqiei
Antibiogramii"1
Antibiograma
ieroscopic: -cid
solubile 0aprezumtivii
reactival)
cantitativa
lterie fara
toxigcncza dc~iInainte
Inainte
-eidserolipului
dcfinitivii
al11prenta ~idecalitativii
anti-
sel11icanlitativii
refri-
lest ba a Foarle
deinser(iei bacili
Identificarca
monitor
speCIeIurgentde C01)
croseopieii,
Idcntificare
Idcntifiearc dcfinitivii
sonde de AON,
prezul11tivii
l1licroscopicii a
(l11i-
(::: 2-3~-Iactamaza
~-lactal11azii
Prelevate zite) ~i exigen!e
(1-3 ore)
If. injllll'l1;'{{{'
dcspeciei
IItI,dllll 1(1'011111111"11')

semJ-
izolatului
hematii, foar-te
refri-curatii sauare,
dcalzolare
microscopicii
din
lobacter sauVezi ;::10-15
asociate
dehemoeulturi
HCllloculturiVezi
vibrioni Foarte
lorClel urgent
inflamatorii
Confirlllarea 0 sau+dcfinitivii NJ~~!,lillll)(lI'(;lllIC i
Entitatea
sau
probii scua-
semni-
illlediat
cantitativii
polilllorfonucIe-
jetCitobaetcrioscopie:
ldentificarea
pansalllentc
germel1l deepiteliale
Suspiciune
opace definitivii
intestinale
diagnosticului
Pune(ie-aspira(ie
mijlociu/aspirat
Prelevate
biotcrapici;
inainte 11'de:eelule-
sauholeriei
de ealitate
~iexigen(e
antibioterapie:
1:;' ficativ
Identificarea
(IX-24
zumtivii
Vezi
cOlIsln'
shigele,
aeantitativii
spc-2Urgent
1substan(e
Identificare
Antibiogramii
Inaintea
suprapubian clinic
HcmocuJturi
tului
hemoeulturi
ore)
3ldelIgl'
C?Citobacterioscopic
polilllorfonlicieare
Antigene
baetcrii
Prczen(a
exigen(e
Illobili,
prin
Idcntiticarea
Identiticarea
Antibiogralllii2)
Antibiogramii Iradio-
din
,ilt:J_
Citobacterioseopie:
aerobilor
selllnificativ
l'campi-
euprczllmtivii
anti-
solubile
identificarea
vibrioni
trans- ...aceea~i
idcntifieare
definitivii aaclinic
izola-
categorie
spirili
dcfinitivii
bacterii speeiei
pre-a Antibiograma
spe- ei ilor aerobe/anaerobe
Hemoclilturi
-Transport
Urinii:
scurt
Uriniiposibil In interval cat Illai
~i siinge
eoee (1-2 zile

II Dac;'j sunt posibilc dC1Z<lrirapidc (c.g, illlunoncfclollletric).


'JI 'I Daca cstc posibil:\ anlibiogralll:! pc cultura prilllar:l.
1.3. VARIATII, ERORI ~I CONTROLUL LOR
IN MICROBIOLOGIA CLINIC~

Ca in arice detel111inarede laborator, ~iin microbiologia clinica variatia rezultatelor


are mai multe surse: biologica, preanalitica, analitica ~i postanalitica:
1) Variatii biologice apar ca:
variafii interindividllale cum sunt cele legate de varsta (e.g., variatia titrulLli
semnificativ al ASLO de la copilulmic la adolescent ~i adult; variatii ale microbiotci
vaginale la prepubera, matura sexual, postmenopauza; colonizarea CLlbacili gram-negativi
a oro-faringelui la varstnici ~. a.);
variafii intraindividllale legate de alterarea temporara sau definitiva a mccanis-
melor de eliminare microbiana (e.g., colonizari microbiene ale traheei la pacienti cu
disfunctii ale filtmlui aerodinamic sau/~i ale transportului muco-ciliar etc.).
2) Variatii preanalitice. Unele sunt fiziologice: astfel, diureza intluenteaza intr-o
anum ita masura bacteriuria, dar cea mai importanta influenta fiziologica este cca legata
de terapia antimicrobiana, care denatureaza profund rezultatele examenului microbio-
logic, fiind 0 impOlianta sursa de eroare.
Alte variatii preanalitice sunt legate de prelevarea probelor (alegerea produsului,
momentul recoltei, modul de recoltare), etichetarea, conservarea ~i transportul lor la
laborator, intocmirea cererii de analiza.
3) Variatii analitice sunt generate de examenul de laborator prin: materialul utilizat
(medii de cultura, reactivi, instmmente, aparate), tehnica de lucm ~i perfonnantelc
individuale ale personalului implicat.
4) Variatii post-analitice survin intre momentul obtinerii rezultatului de laborator
~iinsu~irea acestuia de catre medic. Principal a lor cauza sunt erari de transcriere a datclor.
Erarile care decurg din variatiile enumerate mai sus pot fi control ate in masura in
care:
contra lam fluxul informational clinica-Iaborator;
alegem teste perfonnante;
standardizam ~i controlam calitatea activitatii;
utilizam criterii obiective pentm interpretarea rezultatelor;
supervizam activitatea ~i pregatirea continua a personalului;
asiguram comunicarea clara a rezultatelor;
atragem clinicianul in programul controlului de calitate al investigaliei
microbiologice.

1.3.1. FluxuI informational clinica-Iaborator

Intr-unmare spital, in ciclul informational, de la intrare (ordinul de analiza inscris


de medic in fi~a pacientului) pana la ie~ire (buletinul de analiza inteles ~i insu~it de
medic), sunt multe etape ~ieste antrenat numeros personal. Mai multe circuitefeed-back
previn intarzierile ~i erorile (fig. 1-2).

6
ECHIPA OC RECOLTARE PROBA ESTE TRANS-
lOENTIFICA PACIEt:!TUL PORTATA LA LABO-
SI PRELEVA PROBA RATOR

ATENTIONEAZA SORA SECRETARA LABORA-


ATENTUNEAzA SUPER-
[lACA: VIZORUL OAcA ESTE TORULUI PRIM~E ~I
NECESARA REPETA- INREGISTREAZA PROsa.
CA. NU A PUT.lJT F I
DESCIFRATA; REA RECOLTEI
RECOLTA NUA PUTUT
SECRETARA DE SAlOO
FI FACUTA TEHNICIANUL PRHi"
TRANSCRtE rnOlt-U. IN
CEREREDEANAllzA(CA.) ATENTIONEAZA ECHI- TE~TE PRa3E.l-E PEN-
PA ot RECOLTARE THU ANALIZA

[lArAEST0 NOW.
TA NECESARA
RECOL-

SUPERVIZORUL VERl-
FICA REZUl TATUL. LA
NEVOIE CONTACTEA-
7.A MEDICUL

S[CRETARA LABrnA-
MEOfCUl CLlNlcAM.,
EVALUEA7A
SI IA OECIZIA TORULUI PREGATESTE

BU1ET'(SAI
1lL NULDE ANA-

SE(RETARA OE Y\LON CURIERUL TRANSMI TE


LA SALON BA
INREGISTREAZA M.,

---J Fig. 1-2. Circuitul informational inlrc mcdic ~i lahorlltor. Ohserva!i suhcircuitclefccd-h((ck carl' asigura 0 operatic con'cla.
Fluxul datelor care intra in laborator consUi din inregistrarea informatiilor desprc
pacient ~i a cererilor de analiza. In prezent, in laboratoarele noastre informatiile desprc
pacient sunt conjugate cu cererea de analiza, iar ie~irea este rezultatul testelor inscris in
buletinul de analiza. Dar, progresiv, trebuie sa ne pregi'itim pentru integrarea cOl11unicarii
medic-laborator intr-un circuit computerizat, care permite conexiuni cu alte servicii ale
spitalului (e.g., farmacia, alte seqii ale laboratorului etc.).

1.3.2. Performanta testelor de laborator

Medicul a~teapta de la laborator a ameliorare a posibilit,''i!ilor sale de a confirma


sau infirma 0 entitate nosologica sau conditie (e.g., stare a de purtator sanatos de germcni
patogeni) vizata prin ipoteza clinica. Aceasta depinde de eficacitatea, fiabilitatea ~i
reproductibilitatea testarilor de laborator.
Eficacitatea. Obiectiv, la un grup de persoane boala sau conditia de interes pentru
medic poate fi prezenta sau absenta. Ceea ce cerem unui test este sa ne confirme sau sa
infirme corect aceste situatii. Testul poate fi pozitiv sau negativ. Relatiile intrc accstc
patru variabile (tabelull-2) hotarasc performantele testului: sensibilitatea, specificitatca,
predictia pozitiva, predictia negativa i eficacitatea.

7clhell11 1-2

Corelatiile unui test de laborator eu eireumstanta patologicii


intr-o populatie investigatii
RP+FN Prezenta balii
Absenta
FP+RN
RP
(total
(FP)
(RN)
Fals
Real +negativ
FPReal
fara RP
+boaIa)
FN
FN+RN
(total
pozitiv
Fals +FPRN = N
+observatii)
pozitiv
negativ
Rezultatele testului Totalllri

Sensibilitatea (Se) masoara proportia pacientilor cu boaUi pe care testul ii identifica


in mod corect in populatia investigata. Raspunde deci intrebarii: "Daca pacientul arc
boala, cat de verosimil este sa aiba testul pozitiv?"
RP .
Se = RP + FN (ecuatJa 1).

Spec~ficitatea (Sp) masoara proportia persoanelor fara boala pe care testul lc


identifica in mod corect in populatia investigata. Raspunde deci intrebarii: "Daca a
persoana nu are boala, cat de verosimil este sa aiba testul negativ?"

SP = ~_R~~ _ (ecuatia 2).

8
intre sensibilitate ~i speeifieitate, pe de 0 parte, ~i proportia rezultatelor fals nega-
:lye (FN) ~i fais pozitive (FP), pe de alta parte, exista 0 relatie strimsa:

proport1a. FN =RP FN
+ FN ( ecuapa. 3);
FP
proponia FP = FP + RN (ecuatia 4).

De unde rezuWi:
proportia FN = (l-Se) (ecuatia 5);

proportia FP = (l-Sp) (ecuatia 6).

Predic{ia pozitiva (PP) masoara proportia pacientilor cu boala din totalul celor ell
cestuI pozitiv. Raspunde deci Intrebarii: "Daea paeientul are un test pozitiv, cat de verosimil
este sa aiba boaIa?".

PP = RP
RP + FP (eeuatia 7).

Predic{ia negativa (PN) masoara proportia persoanelor tara boaia din totalul eelor
eu testul negativ. Raspunde deci IntreMrii: "Daca 0 persoana are un test negativ, cat de
\erosimil este sa nu aiM boaIa?".

PN= RN
FN + RN (ecuatia 8).

Eficacitatea (Ef) este indicatorul sintetic care exprima propoqia clasificarilor


diagnostice corecte printr-un test dat.
RP+RN
Ef= N (ecuatia 9).

Valoarea maxima a fiecaruia din indicatorii de performanta definiti mai sus estc
1 (100% dadi valoarea raportului 0 inmuitim eu 100) ~i este influentata semnificativ de
prevalenta bolii In colectivitate.
Prevalen{a (Pr) ullei anumite boli exprima fraetiunea persoanelor din colectivitate
care au acea boala.

Pr= RP + FN (ecuatia 10).


Rezulta de aici ca:

Numarul celor tara boala = (l-Pr) (ecuatia 11).

Dar definitia eficacitatii (Ef), ecuatia 9, poate fi formulata ~i In termeni de


sensibilitate (Se). speeifieitate (Sp) ~i prevalenta (Pr).
Daca

RP = PrNSe (ecuatia 12),

RN = (l-Pr)'N'Sp (ecuatia 13),

9
atunci, prin substitutie, obtinem:

Ef= Pr' Se + (I-Pr) . Sp (ecuatia 14).


Aceasta noua fOl111Ulare, ecuatia 14, subliniaza clar influenta prevalenrei aSllpra
eficacitatii unui test:
la prevalenta mica a bolii, specificitatea influenteaza semnificativ eficacitatea:
la prevalenta mare a bolii, sensibilitatea influenteaza semnificativ eficaciwtea:
la prevalenta in cre~tere, eficacitatea cre~te numai dad sensibilitatca tcStullli
cstc mai mare decat specificitatea.
Si definitiile prediqiei pozitive (PP) ~i negative (PN), ecuatiile 7 ~i respectiv ii, pot
fi formulate In termeni de sensibilitate, specificitate ~i prevalenta:
Pr'Se
PP = Pr. Se (l-Pr) . (1-Sp) (ecuatia 15);

PN = (l-Pr)' Sp
(l-Pr)' Sp + Pr(1-Se) (ecuatia 16).

Aceste noi fOl111Ulariindica influenta prevalentei bolii, a sensibilitatii ~i specificitarii


testului asupra capacitatilor sale predictive. Pentru test cu anumita specificitate ~i
sensibilitate:
prediqia pozitiva cre~te cu prevalenta bolii (ecuatia 15);
prediqia negativa cre~te cand scade prevalenta bolii (ecuatia ] 6).

Examinari repetate ~i asocieri de teste. Performantele examenuIui de laborator


cresc prin repetarea unui test pe noi probe sau prin asocieri de teste. Influenta asupra
perf0l111antei explorarii depinde de regula stabilita pentru pozitivitatea seriei de probe
sau combinatiei de teste.
Regula crede pozitivul considera suficient un singur rezultat pozitiv din serie
(indiferent care, cel initial sau eel repetat) ori din asociere. Cre~te sensibilitatea
investigatiei pentru ca of era bolnavilor doua sau mai l11ulte ~anse de detectare. dar sUlde
specificitatea pentru ca ~ansa persoanelor tara boala. de a fi rau clasificate, cre~te
corespunza tor.
Regula crede negativul considera necesara pozitivitatea tuturor testeIor din seric
sau din asociere. Scade sensibilitatea pentru ca of era bolnavilor doua sau mau multc
~anse de a fi rau clasificati, dar cre~te specificitatea pentru ca acei tara boala au un
numar corespunzi'itor de ~anse de a fi corect identificati.

Fiabilitatea masoara variatia rezultatelor testarii de laborator fata de valorile sau


conditiile reale. Vizeaza,
a~adar, atar testarile cantitative, cat ~i pe cele calitative:
Fiabilitatea cuantifidirilor. La dozarile care implica dilutii duble ale unui reac-
tant (e.g., titrarea anticorpilor serici, determinarea concentratiei minime inhibitoare ori
dozarea antibioticelor in umori), valoarea reala se afla cuprinsa intre plus ~i 111inus 0
dilutie fata de rezultatul obtinut.

10

-~=------=====~~~------
Fiabilitatea testiirilor calitative depinde de raportarea la standarde determinate (e.g.
antibiograma difuzimel1ica, utilizarea unormedii de cultura ~ireactivi cu proplietati verificate.
precum ~ide folosirea unei tenninologii taxonomice recunoscute (e.g. izolarea ~iidentiticarea
microorganismelor).
Reproductibilitatea sau precizia masoara gradul de asemanare Intre rczultatclc
aceleia~i testari repetate pe un e~antion sau un grup de e~antioane similare, prelevate de la
acela~i pacient. Depinde de omogenitatea ~i stabilitatea qantioanelor ~i reactivilor.
Omogenitatea e!jantioanelOl: Izolatele din prelevate contaminate (e.g. sputa. fecak)
pot varia (cantitativ ~icalitativ) daca Insamantarile se fac din zone diferite ale unei probe sau
din probe repetate.
Stabilitatea e!jantioanelor!ji reactivilOl: MOaItea unormicroorganisme, supralnmlll(irea
altora pe durata prelevare-examinare influenteaza negativ reproductibilitatea. Determinarea
repetata a antibiogramei difuzimetrice a unei tulpini bacteliene poate da rezultate diferite ciar
care trebuie sa se Incadreze Intre limite acceptate.

1.3.3. Managementul calitatii ~i standardizarea


in microbiologia clinica

1.3.3.1. Managementul calitatii. in contextul globalizarii economiei de pia(a ~i al


diversificarii ~i Innoirii din ce In ce mai rapide a produselor ~i serviciilor oferite. cslc
foarte importanta credibilitatea unui produs, a unui serviciu sau a furnizorului accstuia
~i chiar a unei persoane.
Laboratoarele medicale, inc1usiv cele cu profil de microbiologie nu fae exccp(ic
de la aceasta realitate. Pacientii, medicii dar ~ifinantatorii, se orienteaza catre acei fumizori
de servicii medicale a carol' competenta dovedita genereaza Incredere In calilatca
serviciilor prestate. De aceea, astazi, tot mai multe laboratoare medicale cioresc sa se
acrediteze. Acreditarea reprezinta de fapt 0 recunoa~tere oficiaJal a existentei unei anumitc
competente la un moment dat ~i a mentinerii In timp a acesteia.
Evaluarea competentei unui laborator se face pe baza unui anumit standard ~i a
altor documente normative, pentru un domeniu de acreditare definit ~iimplica evaluarca
tuturor activitatilor pe care acesta Ie desIa~oara, inc1usiv competenta personalului. valicii-
tate a metodologiei de testare ~i a rezultatelor. in Romania, standardulln vigoare dupa
care se face evaluarea competentei laboratoarelor medicale este SR EN ISO 15189:2007.
Laboratoare medicale. Cerinte particulare pentru calitate ~i competenta. in plus. pentrll
laboratoarele de microbiologic exista cerinte specifice precizate In ghidul "EA-04/J 0 -
Accreditation for microbiological laboratories", elaborat de European Co-operation for
Accreditation (reteua europeana a organismelor nationale de acreditare).
Laboratoarele care acced la acreditare trebuie sa documenteze ~i sa implementczc
un sistem de management al calitatii prin care sa asigure ca cerintele referitoare la calitatc

1 Organismul national de acreditare, recunoscut de Guvemul Romaniei. este RENAR (Asoeia(ia de


Acreditare din Romania), organism de drept privat, neguvemamentaL de utilitate publica. al carui obicctiv
principal este acreditarea organismelor din infrastructura de evaluare a confonnitii(ii.

11
~i competenta sunt indeplinite in confom1itate cu standardele de referinta in vigoarc.
Managementul calitatii include activitati de planificare, asigurare, control ~i imbunaU"itire
a calitatii.
Documentatia sistemului de management al calitatii este structuratii ~i ierarbizata,
documentul principal fiind Manualul calitiitii. In Manualul calitiitii sunt prezentate politica
~i obiectivele in domeniul calitatii, este descris sistemul de management al laboratorului
~i structura documentatiei utilizate, sunt definite rolul ~i respol1sabilitatea ~eful labonl-
torului ~i al managerului calitiitii pentru asigurarea .conformitiitii cu standardu\ de
acreditare. Manualul calitatii unui laborator de microbiologie contine sau face trimiteri
la celelalte documente: procedurile sistemului de management ~ila cele ajutiitoare, inclusiv
la procedunle tehlJce, lit instructiu1111ede manipulare a aparaturii din dotare, la telmicile
de lucru utilizate, eu detaliile strict necesare, la fonnularele utilizate ~i la modul de
co~letare, la specificatiile privind reactlvll ~i mediil~n1Ule, reguli de
preparare, con~~Evare~Lcontrol), la algoritmurile de izolare, identificare ~i caracterizare
--rcfilrcroorg311Tsmelor,la nomenclatorul analizelor pe care laooratorul este competent sa
Ie execute, lalibrmele de prelevare, conservare ~i transporta pieTevaTetorpTIwtugice etc.
Cerintele sfandardelor de referintii ~i docum"eilta.!l3. i";ltel'n~ a sls1e111uTllide
management al caliH"itii trebuie sa fie cunoscute ~i aplicate de intreg persona]ul
laboratorului, iar modul in care acestea sunt respectate trebuie evaluat ~i imbunatatit
continuu.
1.3.3.2. Standardizarea.
Standardizarea reprezinta un ansamblu de conventii care faciliteaza schimbul de
produse, servicii ~i informatii utile, garantate calitativ ~i care s-a extins de la domeniul
industrial ~ila cel al ingrijirilorpentru sanatate. In domeniul medical, un fenomen biologic
sau patologic este insa influentat de mai multe variabile decat a actiune tehnologica. De
aceea, poate, in medicina ar fi mai cOJ"ectsa utilizam termenul de nonne dedit cel de
standarde sensu stricto. Aplicarea acestor norme ne permite sa control am sursele de
variabilitate care influenteaza rezultatele investigatiei microbiologice (revezi 1.3.).
Pe plan mondial, activitatea de elaborare a standardelor este asiguratii de Organizalia
~tionaL:i 9g Standardizare (ISO), f~deratie mondiala constituita din organisme
f1ationale de standardizare2 din peste 140 de tari.
Vom aborda in continuare rolul standardiziirii pentru controlul variatiilorpreanalitice
~i analitice din microbiologia clinica.
1.3.3.3. Controlul variatiilor preanalitice include norme pentru alegerea.
recoltarea ~i transportul probelor, criteriile de calitate a probelor acceptate pentru
examinare, atitudinea fata de probele neadecvate.
A) Norme pentru prelevarea probelor destinate examenului microbiologic
1) Alegerea prelevatelor patologice, l1lomentul .$i ritlllul prelevclritor. Microbul
infectant il cautam in leziunile de la poarta de intrare a infectiei ~i din organele (inta sau
focare metastatice nespecifice apreciate pe baza examenului clinic. Poate fi prezent ~i in

2 Organismul national de standardizare. recunoscut de Guvemul Romaniei. este ASRO (Asociatia de


Standardizare din Romania), persoana juridica romana de drept privat, de interes public, tara scop lucrativ.
neguvernamentala ~iapolitica.

12
100

mo
7 zile 14 zile 7zIle
Ilnvazla ][ Perioada de stare 11 Oeclin H

Fig. 1-3. Dinamica izolarii bacililor tifici ~i a raspunsului imun umoral in cursul febrei tifoide.

caile de raspandire in organism (e.g., sange, ganglioni limfatici) sau la nivelul diilor dc
eliminare (e.g., intestin, cai urinare). Alegerea momentului optim al prelevarii impunc
cunoa~terea evolu!iei ~i fiziopatologiei proceselor infeqioase. Pentru ilustrare prezcntam
in figura 1-3 dinamica izolarii bacililor tifici in cursul bolii din diferitele prelevate ~i
dinamica anticorpilor.
Antigene ale microbului infectant sunt cautate 1n umori ~i exsudate din focarul
infeqios (e.g., sputa, lichid cefalo-rahidian), in sange ~i 1n urina.
Ritmul pr~or influentel-Jzi'lsensibilitatea diagnosticului (revezi 1.3.2). dar ~i
rela!ia cost-beneficiu.
MffV\oC -e Doua-trei seturi de hemoculturi in prima zi de intemare, eventual repetate a
doua zi, mai'esc-~arisa diagnosticului in septicemn ~1 bacteriemii.
)f'-\<\Y. Sputa matinala, dupa tuse spontana ~i profunda, prelevata trei zile consccutiv
ame1Joreaza sensibilitatea deplstam bacllTIor tUberculozei.------
~ffCcv\ L\ Cate 0 proba de scaun prelevata trei zile consecutiv faVOI~a depistarea
agen!ilor iiifeqio~i intestinali. Daca, in ciuda suspiciunii c1inice, rezultatul ramane negativ.
este indicata 0 noua proM prelevata dupa administrarea unui purf@tj~ali_n_.__
La pacientii pneumonici estesmicienta a singura proM de sputa eu ealitatc
eorespunziltoare.

~.~~ ... ~cult~varea. de rutina a exsudatului faringian sau urinei trebuie ,sa se rezume la 0
~~~~,
Este formal eontraindicata_colectarea sputei sau urinei din 24 ore, interval in
care conditia microbiol()g~~_il_P.rQb~Lse_mod+fiea-inacceplabil (e.-g.~-multipl icarea
contaminantiIOiT
2)Prelev-g;'ile sefac Inaintea instituirii tratamentului antimicrobian. Izolarea unor
bacterii foarte' sensibile (e.g., streptoco~ii ~-hemolitici, g0!!2c()cii,.-llleningocoeii sau
Hael7~o..pJljlJ.~~i!Jf1yel1we)
poate deveni imposibila dupa primele ore de antibloticoterapie.
el-([arineficientii. Oridt de mare ar fi urgen!a tratamentului antimicrobian 1ntr-o boala
infee!ioasa grava, intotdeauna pot fi ~i trebuie gasite cateva minute, inai nte de

13
administrarea primei doze de antibiotic, pentru prelevarea corecta a probelor destinate
examenului microbiologic.
Daca aceasta norma nu a putut fi respectata, rar se poate recurge la prelevatc alter-
native (e.g., medulocultura mai pem1ite izolarea bacililor tifici ~i dupa 24 de ore de la
negativarea hemoculturii).
Probele_Qbtinute sub antibioticoterapie nu vor fi respinse peJltru ca:
unele antibiotice sunt numai bacteriostatice ~i microorganismul poate fj izolat
dupa ce inoculul a fost diluat suficient in mediul de cultura proaspat, fara antibiotic;
uneori antibioticul nu realizeaza concentratii inhibitorii in focarul infeqios,
Oricum, un rezultat negativ va trebui comentat corespunzi'itor in buletinul de analiza.

~ , ~lJI'l0lfl;ziuni;--care
:r:::/!!'pre. levatele
vehiculeaza
exam inate
microbul
trebuie sa
infectant
contina sau
realul
antigenele
prodlls patol~)gic,
sale. In sange,
adic5in material"
lichidul
wr cef~lo_"i~ian sau in urina microbii antrenari din leziuni sunt ]=-epartTZatiuniform.
Distributia lor in probele de sputa, de materiIfeCaIe, exsudate oe pe-suprafata mucoasclOr.
din plagi $. a. nu este in mod necesar unifo~ Daca in loc de sputa se trimite spre

Jvv
~~
cu saliva, in loc de portiunile muco-sanguinolente din scaun portiuni prelevate aleator.
un raspuns util din partea laboratoruluidinpoate
e~defxsudatul foselefi a;nigdaliene
imposibi1. un tampon imbibat aleator
4) Pr!}levarile se fac aseptic. Trebuie prevenita sau redllsa contaminarea probelor
Cllmicrobiota indigena din secretii, exsudate, tesuturi ~i organe Invecino/e ~mpol1Ld
C j? endometrial, sau endocervical trebuie ferit de contaminarea cu secretiivagil1ilJe.
'COntaminarea urinei cu microbiotftLTi'etrala $i perineala trebuie redusa la maxim~~mprin
(,A,~ preleVan;; de probe ~-E~:~lPiLQ~ontaminarea ariei periuretra~)yprinse in zbor din
~jetul mijlociu $. a. m. d.).' , ~ -----.
Cand metodele curente de reducere a contaminarii nu dau rezultate concludente,
putem recurge la prelevari care :51111teaza caile naturale de eJiminare ,~icon/mllinore
(e.g., aspiratie transtraheala, aspiratie suprapubiana). Acestea sunt insa tehnici agresive
indicate $i acceptate numai cand relatia risc-beneficiu inclina in favoarea beneficiului.
5) Probele trebuie prelevate In cantitate suficienta pentru efectuarea coreeta a
examenelor microbiologice (microscopie, insamantari pe medii de cultura indicate saul
$i inoculari la gazde de laborator). Impun atentie lezil!nile sarace in ~11icrobi,cum sunt
cele din infectii --
, cronice.= ~L<VVV\ pct.~ t/Y. 'VVV\.~~ - (
Inca frecvent se primesc inlaborator tampoane a roa e uscate cu exsudatepuruleme.
care ar fi putut fi prelevate in cantitate m ] mare prin punctie $i aspirarie. Se mai primesc
probe de cca 0,5 IllI sputa ori spalatura bron$ica cu cererea de a urmari bacterii cu crqtcrc
rapida, microbactei1Gi fungi, lucru evident imposibil. Asemenea probe, daca nu pot fi
imediat repetate, vor fi examinate, dar cu comentariul de rigoare al unui rezultat negativ.
In situatii in care, prin natura leziunii, cantitatea de material prelevabil este minima.
acesta trebuie suspensionat initial intr-un bulion de transport adecvat dupa ce laboratorul
a fost prevenit.
6) Instrumente ~i recipiente pentru prelevari :ji trall!,jJortul probelor: Ull instru-
ment de'S-utilizat pentru prelevare $i transport de probe este tampo/lul de vata stel-ilizat in

14
<\F~'
-
rub inchis etan~ prin dop sau capac. Tamponul trebuie sa fie Ii sit de inhibitori microbieni
~,

ca acizi gra~i din vata, ioni metalici sau sub stante distilate din tija port-tampon 111CurSll!
sterilizarii. Recomandam ):an1ponul de vata hidrofila cu fibra lunga rulata pe port-tam-

pon dinl~ln~~3de evitat


microorganisll1e~ ae ra~inoas(n;are
lemnul plastic
material contine Cl/V~
te1111orezistent. 1
sub stante nociveMt~1f~ '-"'l..
Prelevarea ~itransp0l1ul pe tampon au 0 serie de dezavantaje care trebuie cunoscute
pentru 0 utilizare corecta:
Preleva maximum 0,1 mL produs .
Polimorfonuclearele se absorb in scurt timp pe fibra de vata. De aceea frotiul
din prelevatele pe tampon trebuie facut extemporaneu.
, Recuperarea microorganismelor de pe tampon este sub 10%; eel putin 10 bacteri i

0: .1.)\ w-LA
J.('\r.eb~e
,'.~ \f'~colo at prelevate
~--~-~----"'-----'--~---------~--~----'
Gram. Depeaceeatampon se vapentruevitaa utilizarea
Ie putea depista pe frotiul
tamponului ori efectuit extemporaneu
de cate ori sunt posibile~i
,2"-"j; prelevarnn carltrtati mai mari (aspira1ia exsudatelor fluide, produse de chiuretaj sall
~'.1iV ~ biopsii). Se VOl"preleva mai multe tampoane daca examenul presupune efectuarea de

...,....~I\\ frotiuri ~i insamantari pe mai multe medii de cultura.


:c 'prelevarea pe tampon este contraindicata pentru izolarea bacteriilot anaerobe.
Deci tamponul de vata trebuie sa ramana indicat numai pentru prelevarea ~i transportll
exsudatelor de pe suprafata mucoaselor ~i tesuturilor denudate.
Tafflpoane sterile, in tuburi etan~e de material plastic, ambalate individual in p1ic
preetichetat (vezi mai jos) sunt comercializate de diferite t11111e.
~eip~entru
--
prelevare ~i transport sunt variate ~itrebuie alese in funqie de
vo lumul, consi stent~Erobei, particulari_tJiJi_~J?rel~variL~i
.. -
aJ~_.!11icroorgarrismelor
--"--'-""'-"""-''''--''-'~''---'-'''-'-

uni1arite~-Thate trebuie sa aiba capac protector etan~. Pot fi folosite recipiente existeiifc
in laborator sau prov~ din spital (eprubete, flacoane, borcane cre~o mL dm st1Cla
etc.). Condltionarea lor presupune spiiliire foarte mgnjlta pentru inde artare ror
urll1e~~ substante antimicrobiene ~i sterilizare exelusiv prin a enti tlzici. esigur, mai
avantajoasa este folosirea reclpiente I' tipizate din material plastic, ster' lzate. care pot
fi alese din cataloagele comerciale.
7) Marearea eontainerelor ell prelevate patologiee se face vizibiL Cll etichete
autocolante pe care se consemneaza prin pix cu bila u1111atoareledate minimale: nUll1e1e
~iprenumele pacientului, prelevatul, sursa, medicul, data ~iora prelevarii, numarul cererii
de analiza.
In figura 1-4 sugeram un model de cerere ~i buletin de analiza microbiologica.
Semnificatia datelor info1111ativedin cererea de analiza se b'Tupeaza astfe1:
date necesare identificarii probei: numele, prenumele, varsta pacientu1ui. data
recoltarii, spitalul, sec1ia, salonul;
date necesare alegerii celor mai adecvate tehnici de prelucrare a probei:
diagnosticul prezumtiv, natura probei, examenul solicitat (in termeni cat mai preci~i).
precizarea faptului daca este yorba de bolnav (inclusiv data debutului bolii), convales-
cent sau purtator, prec;za1'i asupra te1'apiei antimicrobiene eventuale;

15
CERERE DE ANALIZA MICROBIOLOGICA

Spitalul / Sectia Tel.lFax _


Nr. de expediere _
Numele Prenumele Varsta _
Diagnostic prezumtiv _
Data imbolnavirii _
Proba de examinat -----------------------
Examen( e) solicitat( e) _
Vaccinari in antecedente* ---------------------
Tratament antimicrobian anterior prelevarii probei (medicament, modul ~i ora
ultimei administrari) _
Tratament imunosupresiv (medicament, doze, durata) _

Data prelevarii _____ ora _ Expediat in ziua de __ ora

Medicul solicitant
(Semnatura ~i parafa)
* Semnificative in contextul clinic

BULETIN DE ANALIZA MICROBIOLOGICA

Laboratorul Tel.lFax _
Nr. de primire din ora _
Conditiile In care a ajuns proba In laborator _
Rezultatul analizei:
Microscopia directa

AIte metode pentru depistarea rapida de microorganisme _


Cultura: ----------------------------
Teste de sensibilitate la antimicrobiene: _

Examene serologice: _

Data _ ~ef laborator


(Semnatura ~i parafa)

Fig. 1-4. Model sugerat pentru cererea ~i buletinul de analiza microbiologicii.

16
date pentru precizarea responsabilitatii prelevarii ~i transportului: ora recoltarii.
data ~i ora primirii in laborator, medicul care a recomandat analiza ~i persoana care a
facut recoltarea ~i a asigurat transportul;
date necesare pentru interpretarea de catre microbiolog a unor rezultate: vaccinari
in antecedentele recente, prelevare sub terapie antimicrobiana sau imunosupresiva etc.

B) Transportul ~i conservarea probelor

Doua obiective majore uTI1larimin intervalul dintre prelevarea probe lor ~iexamenu]
lor microbiologic, care poate varia de la cateva minute la mai multe ore sau zile, dupa cum
proba este destinata laboratorului din spital ori polielinica sau unui laborator de referinta:
1) Mentinerea cat mai mult posibil a conditiei microbiologice initiale a probei:
supravietuirea microbului infectant, inhibarea multiplicarii microbilor contaminanri pc
seama nutrientilor din prelevatul patologic; mentinerea nealterata a citologiei.
2) Prevenirea raspandirii microblllui injectant la personal ~i in colectivitatc.
M031iea microbilor infectanti din probele destinate examenului microbiologic este
o sursa de erori. Poate fi cauzata de: razele solar,: directe; deshidratare; modificari de
pH; autoliza; oxigenul atmosferic in cazul anaerobilor stricti. De aceea, odata reco]tate,
probele trebuie examinate in eel mai scurt timp posibil sau conservate prin refrigerare ~i
medii de transport adecvate.
ReJrige rarea. La ODC (container izoterm cu gheata umeda) sau la 4DC (frigider)
majoritatea microbilor patogeni supravietuiesc timp de cateva ore necesare transportului,
iar multiplicarea contaminan!ilor este oprita.
purine bacterii nu rezista la refrigerare: meningococul, gonococul, Hacmoplzilus
il\flllenzae.
M cdiil e de transport asigura supravietuirea microorganismelor prevenind desicareil,
variatiile de pH, oxidarea ~i autoliza. Cel mai frecvent utilizate in bacterio]ogia clinica
sunt mediile care contin substante stabilizatoare non-nutritive: e.g., Cary-Blair, Amies
sau Stuart. Alte medii sunt indicate pentru transportul ~i conservarea virusurilor.
Formulele acestor medii, indicatii privind modul de folosire ~i firme producatoare
sunt precizate in cap. 39. Un indicator, cum este ro~u-fenol, permite monitorizarea
vizuaHi a pH-ului cand aceasta conditie este critica pentru supraviewirea unoI' microbi
(ca virusuri, shigele etc.).
Microbii care sunt izola!i pe culturi de celule sau embrioni de gaina (ca virusuri Ie,
chlamidiile) se transporta in medii cu antibiotice (penicilina, streptomicina, nistatina).
Cand insa in acela~i prelevat urmarim atat virusuri cat ~ibacterii, proba va fi suspensionata
in mediul de transpOli lara antibiotice, umland ca acestea sa fie adaugate diferentiat ]a
prelucrarea probei in laborator. Cel mai bine insa prelevatul se suspensioneaza in cele
doua medii de transport cu precizarea elm"aa destinatiei fiecaruia.
o aten!ie aparte trebuie acordata bacteriilor anaerobe:
Daca transportul la laborator ~i examinarea se fac fara intarziere, cea mai
accesibila metoda este aspirarea probelor fluide in seringa etan~a cu indepaliarea imediata
a bulelor de aer ~i obturarea acului prin in!epare intr-un dop steril. Exista insa riscul
transmiterii prin in!epare a virusului hepatitei B sau al imunodeficien!ei umane.
Pentru probe1e biopsice ~i tampoane sau dadi interva1u1 pfl11a1a examinare se
pre1unge~te, sunt indispensabi1e containere comercia1e speciale (tuburi, flacona~e, pungi)
care con!in un sistem generator de CO2, un agent reducator ~i un indicator "redox"
(resazurina sau albastru de metilen) pentru monitorizarea vizua1a a anaerobiozei.
Containere speciale cu atmosfera imbogatita in CO, ~i me diu microaerofil sunt
avantajoase pentru probele in care urmarim Neisserici gonorrhoeae ~i respcctiv
CCilllpylobacter jej un i.
Cei interesati in expedierea de produse l11icrobiene prin po~ta trebuie sa respectc
exigen!e1e de conservare ~i siguran!a impuse de standarde recunoscute intemational.
Dintre acestea recomandam procedeul standard elaborat de National Committee.f(JlO Clini-
cal LaboratOlY Standards (NCCLS, 1980).

C) Triajul de calitate al probelor


(vezi ~i tabelul 1-1)

Triaju1 de calitate al probe1or are doua etape: controlul macroscopic ~i controlul


microscopic. Dar calitatea probelor se releva ~i in etape intermediare ale examinarii:
e.g., pril11oculturi, demonstrarea prezentei de sub stante antimicrobiene In probele culti-
vate etc.
1) Controlulmacroscopic al probelor se face in seqia de receptura a laboratorului
a data cu inscrierea date lor esen!iale in registrul de intrari sau introducerea acestor datc
in terminalul computerului. Urmarim:
consemnarea completa ~i coresponden!a datelor de identificare a probei de pc
eticheta recipientului ~i din cererea de analiza;
consemnarea diagnosticului prezumtiv ~i a datelor anamnestice esentiaJe:
probele recoltate sub terapie antimicrobiana;
formularea precisa a examenului solicitat in raport cu diagnosticul prezumtiv ~i
natura prelevatului;
intervalul dintre prelevare ~i inregistrare;
natura l11ediului de transport;
virajul indicatorilor de pH sau "redox";
tipul ~i starea ambalajului;
prezen!a exsudatului muco-purulent versus secretii contaminante de pe traiectele
de eliminare (e.g., sputa muco-purulenta versus saliva).
2) Controlul microscopic 11facem In sectoarele de investigatie, dupa caz, pc
preparate umede sau frotiuri colorate Gram. Obiectiveaza calitatea probe lor de sputa, de
urina, de aspirat duodenal etc. prin estimarea propor!iei realului produs patologic
(identificat prin prezen!a celulelor inflamatorii) fata de secretiile contaminantc
(identifieate prin prezen!a eelulelor epiteliale scuamoase, a unci abundcntc microbiote
mixte).
3) Prezellta unei abllndente microbiotice mixte eu mai mult de 1~2 bacterii
predominante este de asemenea un indicator de calitate insuficienta a prelevatelor cum
sunt: sputa, urina, prelevate endometriale ~i endocervicale, prelevate din plagi ~i arsuri.
Deficienta poate fi sesizata ocazional ~i la citobacterioscopie (e.g., urina din jet mijlociu
la femei), dar totdeauna apare in primoculturi.
18
D) Criterii ~i procedura de respingere a probelor

Deoarece unele prelevari sunt irepetabile, in aceasta etapa preanalitica trebuie sa


respectam cateva reguli precise:
1) Grice neconcordanta privind identificarea probelor, datele neconcordante sau
incomplete din cererea de analiza var fi imediat rezolvate prin cireuitelefeedback precizate
in figura 1-2. Grice modifieare a unei cereri de analiza sau etichete in eadrul acestor
circuite trebuie facuta de ci'itre 0 persoana autorizata identificabila prin consemnarea in
document.
Probele care nu pot fi identificate nu se examineaza.
2) Probele identificate, dar necorespunzatoare calitativ (vezi mai jos) se pastreaza
la 4C, iar examinarea se temporizeaza pana]a confim1area de ci'itre medicu] care a emis
ordinul de analiza dad reco]ta poate sau nu sa fie repetata:
daca recolta poate fi repetata, proba se arunca;
daca recolta nu poate fi repetata (lichid cefa]o-rahidian, aspirat bron~ic, picse
biopsice), examinarea se va face COnf011TI cererii eu atenrionarea, eonsemnata in buletinlll
de analiza, asupra posibilitatii unor rezultate fals negative sau fals pozitive cauzate de
calitatea necorespunzatoare a probelor.
Lista deficientelor calitative care due la respingerea probelor de ]a examenll] mi-
crobiologic:
a) Probe de sputa dupa 24 are de la recoltare. Inmultirea contaminanti]or face
inoperanta tentativa de detectare a conditionat patogenilor infectanti, scade drastic
sensibilitatea depistarii mieobacterii]or: refrigerarea atat de inde]ungata poate omori
patogenii sensibili.
b) Probe de urina din jet IgjjlilliuJnentinl1te nerefrigerate mai mult de ] ora dupa
reco]taf'e. Inmultlrea contaminantilor face inefici~~ta uroeultura cantltatIvK.---~ ~...~.

.-
~TampOl;
micobacte-;:ii"..
unic cu solic.it~,i mllltipJ~_Jip depistare de "aerobi, anaerobi, fungi.
_..~- ... - .. -
.. d) Probe evident contaminate cu sub stante straine, e.g., bariu, coloranti, sub stante
grase, insecte.
e) Probe autorecoltate de pacient.
f) Probe evident contaminate prin prelevare $i transpOli in containere neadecvate:
e.g., feca]e pentru coprocultura expediate in cutii de chibrituri (vezi $i Capitolul 2 -
securitatea microbiologica).
g) P]aci cu mediul de cultura uscat sau suprafata invadata prin organiSl1]~_~
contalninare . ..-- -------------- -.- ---- --.-.-.---.--
. ..-' .
h) Se exclud de la cultivarea pentru bacterii anaerobe urmatoarele categorii de
produse: sputa; spalatura gastrica; urina dinjet mijlociu: secreria prostatica prelevata
transuretral; arice prelevate de la nivelul gurii, nasului, oro- $i nazofaringelui (exceptfllld
piese biopsice profunde, intraoperatorii); prelevate cutanate superficiale; fecale
(exceptand so]icitarile pentru depistarea unor anaerobi diareigeni cum sunt Clostridium
difficile, C. perfringens, C. septicum; tampoane din orificiile de ileostomie sau
colostomie. Prezenta n01111ala,in numar enom1, a anaerobilor in aceste prelevate face
examinarea inoperanta.

19
i) Nu se cultiva probele tisulare transportate in solutii fixatoare (formol etc.). Doar
in cazul probelor cu dimensiuni mari, primite in laborator imediat dupa recoltare, se pot
incerca spalarea piesei cu solutie salina izotona sterila, sectionarea ~i prelevarea pentru
cultivare din mijloculmasei tisulare.
Ca 0 concluzie privind controlul variatiilor preanalitice, putem spune ca reZlIlw!lIl
U7111i exalllen microbiologic nil poate Ii niciodata mai bun dedit prodllSlIl potologic
exalllinat.
Tocmai pentru a tine sub control cat mai eficient calitatea prelevatelor am propus
ca prelevarile sa fie rncute de catre 0 echipa subordonata direct ~i instruita de laborator
(fig. 1-2). Acolo unde aceasta fOI111Ula nu este agreata, din diferite motive, urmeaza ca
laboratorul sa puna la dispozitia fiecarei sectii un !11Cl}zualClt tell1!icile corecte del2q:l1J' re
~isa monitorizeze prelevarile, ceea ce in final se poate dovedi mai putin econOlnlc (cfortul .
de instruire a unui personal mult mai numeros, cu mai multe subordonari; efortul dc
monitorizare ~i numarul mare de probe necorespunzatoare calitativ).

1.3.3.4. Controlul variatiilor analitice presupune alegerea celor mai performante


teste (revezi 1.3.2), controlul de calitate al reactivilor, controlul performantelor aparaturii
de laborator, controlul perfol111antelor personalului de laborator (vezi 1.3.5).

A) Controlul de calitate al reactivilor

Un tehnician anume desemnat raspunde de evidenta operativa a reactivilor utiliza!i


in laborator, urmare~te respectarea conditiilor de pastrare ~i termenele de garantie a
eficientei indicate de producatOli. Reactivii sunt dati spre con sum in ordinea termenelor
de valabilitate ~i intregul personal trebuie avertizat sa nu utilizeze reactivii decat dupa
verificarea termenului de garantie inscris pe eticheta. Aspecte specifice controlu lui de
calitate al principalilor reactivi utilizati in microbiologia clinica sunt prezentate in
tabelul 1-3.
7ilbelull-3

Aspecte specifice controlului de cali tate al reactivilor

serun
Reactivul
SteriCllIitate,
Ibidem
cu
cultura
de
antigene
de lot pH, I, lot;;arja
fiecare
Fiecare Titrul
Ibidem
comercial
Vezi comercial
Activitatea hemolitica
fiecare
sau dozare
laborator,
selectiva
$1
proprietatiFiecare
reaqii Observa\ii
cienta
pH.CapitoluJ
Conditii Fiecare
hOl11ologe
Diferentierea
nutritivel, de25referinta;
lot
Frecventa
urmarite
proprietati $i reaqie
afinitatilor
eficienta
Fiecare $aIja I,tinc-
coloratie
nutritive activi-
selectival,
preparata efi- in Capitolul4139
Capitolul
cultura lara

20
Tabe/lil ] -3 (continuarel

.;.. :~ Diameu'ul
anti-
Reaetivul
pentruzoneloreu deCMlinhibilie
Reaetia
aCondilii '),2.+
Furmarita
tuJpiniJor
Observatii
Reactia
rinta ~~.ieeare
Fieeare testare
test
lot
Freevenla
pentru
unnarite are semestrial
sau
detulpinile
referinta de refe- Fieeare lotVai Capito IeIe: ~ I
ei anti-

I Folositi tulpini proaspete, cat mai eurand dupa izolare ~i identificare.

Fiecare laborator trebuie sa intretina 0 colectie cu un minimum de tulpini microbiene


necesare controlului de calitate al colorantilor ~icoloratiilor, al medii lor de cultura (calitati
nutritive, eficacitate selectiva, reactii de identificare), al antibiogramelor, al doziiri i
antibioticelor in umori. Lista acestor tulpini ~i modul de conservare sunt prezentate in
Capit. 43.

B) Controlul performantelor aparaturii de laborator

Aspecte specifice controlului de calitate al aparaturii mai frecvent implicate in


precizia testarilor de microbiologie clinica sunt rezumate in tabelul 1-4.
In functie de marimea laboratorului, unul sau mai multi tehnicieni anume desemnati
vor tine pe fi~e evidenta controlului aparatelor ~i a reviziilor tehnice period ice sau la
cerere. Aceste fi~e trebuie pastrate impreuna cu cartea tehnica ~ide utilizare a aparatului.
1.3.3.5. Controlul variatiilor post-analitice presupune un sistem de inregistrare
~i comunicare a rezultatelor care reduce la minimum numarul transcrierilor ~i permite
controlullor in orice moment. De aceea a111sugerat utilizarea cererii ~i buletinului de
analiza cu date dactilografiate ~i0 copie care se arhiveaza la laborator (fig. 1-2). Utilizarca
unui sistem computerizat pentru inscrierea ~i c0111unicarea date lor aduce elemente
suplimentare de siguranta. Indiferent de sistemul utilizat, documentul primar este caietul
de lucru al microbiologului in care se face prima inregistrare a rezultatelor. De aceea
caietele de lucru trebuie supuse unui regim unitar de inregistrare a datelor ~ide supervizare.

1.3.4. Criterii obiective pentru interpretarea rezultatelor


in microbiologia clinica

Cat timp patologia infectioasa a fost dominata de agentii infectio~i clasici (e.g ..
difteria, febra tifoida, holera ~. a.), diagnosticul etiologic ~i interpretarea rezultatelor de
laborator erau facilitate de postulatele llli Koch-Henle care stabilesc ca un microb poate
fi incriminat drept cauza a unei boli daca:
1) este depistat in toate cazurile bolii respective, iar distributia lui in organism
corespunde leziunilor caracteristice ale bolii;

21
NN Tabelllll-4

intretincrea ~i control"1 calitativ al functioniirii aparatelor din dotarea laboratorului de microbiologie

Intretinerea curcnta
8 la -20C nominala:
Curatire
Cllra!irc
Cllra(irc
e.g.. Stergcrca Revizia -- 600
~i~idccongelarcdelalaC
Scmeslrial
.35.5"C
70' kSemestrial
Semeslrial
tehnicii
schil11barea
StergercaLil11itelctoleran!ei
prafului
Omoriirea
dccongelare
praflllui
Omorarea
Fuziune/vir~ul
Fuziune/virajul -750
pepcapei
sporilor
spori pcreti
pcrcli
lor Continuu
Continllu
Zilnic
LaLunar
~iContinull
liccarelunideschidere
Saptal11anal
culoriiLaraftllri
rafturi
Fiecarc2 ~arja
Saptamanal ~i dupa ficcarc 2-8C
cf. temperaturii nominale
fiecare Tempcratura
Aparatul __ 0-
Frecventa
intreru
fioleperecudespori
intrerupere
-- benzi curentde B. stearotherl/lophilus
stearotherl/lophillls
Tlibell/ll-4 (contil1llal\:)

ppOdupa sciizutii intrelinerea eurenta


=saujonqiunilor Curiilirea
2 spar- Vezi
Masurarea
Curalirca
Curalirea Cre~tcrea
Revizia
Limitclc Anual
5%
pptehnicii
scazuta
5-10%
36-38C
Decoloraredin
lorsatisfiiciitor
Semestrial
Incubatoare
55-57C
etan~eitatca
capacului
jonqiunilor
perelilor
Saptamanal,
ef.pereli CO2 La=aContinuu
vilcza
Lunar
SemestrialContinuu
La
tolcranlci
gerea
prin 31uni
Zilnic
LZilnic
Lunar sclcclatfi
pptiecare
ori
Saptamanal
Saptiimiina
interiori
indica
temperaturii sauIdeextrem
avarsarea
analizor
Siiptiimanal
Siiptiimiinal
interiori, cuschimbarea
pp~irafturilor
nominale
O2 zilnic
utilizare
dezinfectanl
O2 unui tubSiiptamiinal,
gaze etan~eitatea
Aparatul
reactivarea
Efieacitatea: catalizatorului Frccvcnla
- --culturii
Taholl1ctru
nivelul deapeiC. llovyi tip B
e anaerobe

l-l
,~
IV
-I>-

Tube/lfl 1-4 (continuare)

intretinerea eurenta
Aparatul Frccven\a Limitele toleran\ei Revizia tehnica
Performanta / Conditia

Rotor pentrll Eficacitatea:


serologie - nllmar de rotatii pcr minut La fjecare utilizare ISO 10 rotatii per Illinut Anual

pH-metrll Eficacitatea:
- testare prin scara CllpH cunoscul La fjecare utilizare 0,I unitati de pH Anual

Recipiente din I Variatia de pH a apei distilate dupa I Fiecare lot achizitionat Cre~tere de pH sub 0,5 unita!i
sticla autoclavare

Boxe pentru Dczinfec\ia:


securitate - suprafa!a de lucru ~i pere\ii interiori cu Zilnic
microbiologica dezinfectant necorosiv (e.g., glutar-
antiepidemica aldehida)
- interiorul ell vapori de forlllaldehida La schilllbarea filtrelor
Eficacitatea: anelllollletru Sellleslrial sau lrillleslrial Viteza curentului de aer In Semestrial
frontul de lucru (m3/s):
c1asa I 0,7-1.0
c1asa II 0,4
c1asa III 0,75
2) este izolat in cultura pura ~i subcultivat, pentru a fi studiat, pe medii artificiale;
3) cultura pura inoculata la un animal receptiv reproduce boala cu leziunile
caracteristice din care microbul poate fi reizolat.
Patologia infectioasa modern a a suferit mutatii profunde concretizate in esentii
prin regresul bolilor infectioase clasice cu prevalenta in cre~tere a infectiilor determi-
nate de microorganisme conditionat patogene, care nu se mai supun ad-literam postulatelor
lui Koch-Henle. Paralel, s-a dezvoltat ins a intelegerea relatiilor microorganism-gazda.
in special sub aspectul interpatrunderii ~idinamicii lor, iar progresele biologiei molecularc
ne ajuta sa intelegem variatiile de patogenitate ale microorganismelor.
1.3.4.1. Relatiile microorganism-gazda umana, interpatrunderea ~i dinamica
lor sunt sugerate ~i definite in figura 1-5.
Parazitismul afecteaza gazda pana la aparitia bolii infecrioase. Microorganis111c
comensale ~imutualiste colonizeaza suprafete1e gazdei Taraun prejudiciu definit. Aceste
microorganisme de colonizare forn1eaza in ansamblul lor 0 entitate ecologica numita
lllicrobiota indigena. Limitele colonizarii sunt conditionate de barierele antimicrobienc.
Astfel, in organism se delimiteaza zone normal sterile (mediul intern, tesuturile, cavitati Ie
seroase), zone normal necolonizate de:ji contaminate ocazional sau periodic (sinusurile
paranazale, urechea medie, etajul infraglotic al cailor respiratorii, caile biliare, cai Ie
genitale interne, vezica urinara, stomacul, duodenul) ~izone normal colonizatc (colol1ul
~i ileonul terminal, ciiile aero-digestive superioare, uretra distala, vaginul. tegul11entul).

ASOCIAT" SIMBI011CE

[)elo, Ambli

o ependeny.l (
partla~ Asoc"lerea
ocazlOl1a \a

Fig. 1-5. Interferenta ~i dinamiea relatiilor in simbioza


om-mieroorganisme:
___ Infeetia eu mieroorganisme oportuniste ale mierobitei
indigene poate fi repetata.
- - - - - - Eyolutia de la infeetie spre portaj de microorganisme
patogene .
............ Infeetia latenta ~i evolutia ei reversibila.
Co]onizari tranzitorii sau permanente ale unor suprafete sau cavitati Sllpuse
contaminari]or, dar nonnal neco]onizate, apar in conditii de discontinuitati accidentale
ale bariere]or antiinfectioase (p]agi, arsuri) sau de eliminare microbiana deficitara (bron~ite
cronice, viroze respiratorii, aclorhidrie gastrica, uropatii obstructive).
Perturbari in echilibru] ecologic a] microbiotei indigene, disbioze, pot fi induse de
modificari ale substratu]ui nutritiv (e.g., ten seboreic, absenta unor enzime digestive).
ale conditii]or fizico-chimice de gazduire (e.g., transpiratie excesiva), de modificare a
receptori]or pentru Iiganzii bacterieni (e.g., pierderea fibronectinei din glicocal ixul
epite]iu]ui oro-faringian reduce densitatetea streptococi]or viridans ~i favorizeaza
co]onizarea cu baci]i gram-negativi), administrare de antibiotice.
Dinamica re]atiilor microorganism-gazda este dependenta de interactiunea dintre
capacitati]e patogene ale microorganisme]or ~icapacitati]e antimicrobiene ale gazdei. in
rapolt cu capacitati]e lor patogene, l11icrobiif0l111eaZaun spectru continuu care se extinde
de ]a l11icrobii inalt patogeni ]a cei nepatogeni.
Microbii lnalt patogeni au suficiente capacitati agresive pentru a imbo]navi 0 gazda
cu aparare antiinfectioasa norma]a. Sunt agenti etio]ogici ai bolilor infeqioase clasice:
boli cu evolutie clinica, simptomatologie ~i epidemiologie bine definite. Prin vindecarea
c]inica a infectiei, unele microorganisme ina]t patogene trec de la re]atia de parazitism la
cea de comensa]ism sau de mutualism. Purtatorii sanato:ji de l11icrobipatogeni gazduiesc
aceste organisme in calitate de comensa]i pe mucoase ~i ]e pot transmite ]a persoane sau
animale receptive. In infecfiile latente relatia microbi]or "donnanti" (rickettsii, bacilii
tubercu]ozei~. a.) cu gazda este de mutua] ism: sunt adapostiti ~isllpravieruiesc in (esuturi,
dar intretin imunitatea gazdei.
Microbi nepatogeni in sens strict sunt probabi] numai ace]e organisme autotrofe
sau saprofite ale mediu]ui extern care nu gasesc in tesuturile ~iumorile noastre conditiile
fizico-chimice ~i nutritive necesare dezvoltarii.
Microbii conditionat patogeni sunt simbionti ai microbiotei indigene sau saprofi(i
ai mediu]ui extern care, de~i nepatogeni ]a gazda nonna]a, manifesta capacitati invazive
eand apar bre~e in sistemul barierelor antiinfectioase sau cand prin transfer genetic
dobandesc anumite capacitati patogene. Pentru ca ace~ti microbi i~i manifesta
patogenitatea numai in anumite circum stante, relatia lor eu gazda a fost numita oportl/nislII
(de ]a engl. opportunity = ocazie buna; imprejurare favorabi]a pentru a-~i ataea gazda).
o data cu restabilirea barierelor antiinfectioase ale gazdei ~i raspunsu] ui j mun,
mieroorganisme]e conditionat patogene revin ]a re]atia de comensa]ism sau mutualism
limitata ]a inveIi~uri.
Microbii eu potentia] invaziv redus, care se manifesta numai eand, accidental, eapata
acees in situsuri ]ipsite de aparare antiinfectioasa (depozite de fibrina de pe suprafata
va]vulelor cardiace, cavitatea meningiala) pot fi numiti lIIicrobi accidental palogcni.
Studiind variatia capacitati]or patogene ale microorganismelor, S. FALKOW ~i
eolab. (1988) au formulat postulatele moleculare ale lui Koch.
I) Fenotipu] (proprietatea, functia, structura) investigat trebuie sa fie asociat
tulpinilor patogene ale unei specii sau speciilor patogene ale unui gen.
2) lnactivarea specifica a genei (lor) care codifica structura de patogenitate
suspectata trebuie sa duca ]a 0 pierdere cuantificabila a virulentei.

26
3) Reversia sau substitutia alelidi a genei mutante trebuie sa restaureze patoge-
=-~:tatea.
Reiese, din contextul sumar prezentat mai sus, ca un acela$i microorganism depistat
:::.diferiti pacienti sau la acela$i pacient in diferite momente poate avea semnificatii
':::r'erite:infectant, de portaj, contaminant, de colonizare n0l111alasau anonnala. De unde
se degaja doua concluzii importante:
Niciodata un microb depistat nu trebuie acceptat drept cauza a bolii numai pentru
21 este un patogen recunoscut, ci numai prin argumente convingatoare .
Niciodata un microb depistat nu trebuie respins drept cauza a bolii nUl11aipentru
23 nu este un patogen recunoscut, ci nUl11aiprin argumentare convingatoare.

1.3.4.2. Argumentarea semnificatiei clinice a microorganismelor depistate


intr-un prelevat patologic 0 facem in funqie de: condi!ia microbiologica a prelevatului:
patogenitatea $i raporturile izolatelor cu microbiota indigena; contextul clinic;
reactivitatea antiinfeqioasa a pacientului.

Cazul prelevatelor necontaminate. lnsa$i prezen!a in asemenea prelevate confcn'i


microorganismelor depistate (prin microscopie, izolare) semnificatie clinica. Doar pentru
microorganisl11e accidental patogene rezidente ale tegumentului, argumente suplimentare
trebuie sa elimine suspiciunea contaminarii probe lor in cursul punqiei $i aspira~iei
transtegumentare: izolarea aceluia$i microorganism in hemoculturi repetate in conditiile
unei asepsii stricte, $i cu schimbarea venei punc!ionate; prezen!a pe frotiul direct a
unui organism cu acelea$i caract ere microscopice (e.g., in probe de puroi); contextul
clinic (e.g., Staphylococcus epidermidis capata semnifica!ie clinica in hemoculturi de la
pacienti cu endocardia subacuta $i proteza valvulara cardiaca, In aspirat din peritoneul
pacien!ilor imunocompromi$i supu$i dializei extrarenale).
Cazul prelevatelor contaminate pe traiectele de eliminare naturala. Izolarea
unor microorganisme patogene sau opOliuniste straine microbiotei indigene a traiectelor
de eliminare are semnifica!ie clinica (e.g., bacilii tuberculozei din sputa). Sel11nifica!ia
clinica a microorganisl11elor oportuniste care contamineaza uzual aceste prelevate trebuie
argul11entata prin criterii suplimentare:
Criteriul izoliirii cantitative. 0 bacterie conditionat patogena realizeaza in focarul
de infec!ie concentra!ii semnificativ mai mari decat atunci cfmd contal11ineaza probe
corect recoltate.
Criteriul confruntarii cantitative Illtre izolatele dill cultura!ji citobacterioscopio
probei examinate. Bacteria izolata in concentra!ii semnificative trebuie sa apara
semnificativ asociata celulelor inflamatorii.
Eficien!a examenului cantitativ cre$te prin: reducerea contaminarii prelevatelor
in timpul recoltarii; decontaminarea unoI' prelevate (ca spalarea sputei pentru
indepartarea salivei);. prevenirea l11ultiplicarii contaminan!ilor pana la examinarea
probei; triajul citologic de calitate a probelor. Daca prin toate aceste precautii nu reu$il11
sa ob!inem 0 proM cu calitate citologica satisrucatoare sau bacteria{iile) izolata{ e) nu
Intrune$te suficiente criterii de sel11nifica!ie clinica, ramane posibilitatea prelevari i unei
probe printr-o procedura care $unteaza caile de eliminare n01111alcolonizate (e.g., punC\ie
transtraheala, punc!ie suprapubiana, biopsie din "patul" unei plagi sau arsuri infectate).

27
Cazul prelevatelor din zone normal colonizate. ldentificarea integral a a izolatelor
din asemenea probe este inutila. In functie de sindromul clinic, un11arimnumai principalele
microorganisme patogene care II pot cauza (e.g., izolarea Streptococcus pyogenes din
exsudatul faringian, izolarea shigelelor, a salmonelelor sau vibrionilor holerici din scaunul
diareic). Absenta din proM a unei bacterii patogene, care sa explice tabloul clinic.
orienteaza investigatia spre microorganisme conditionat patogene, virusuri ~.a. lmplicarea
microorganismelor conditionat patogene depistare in aceste situatii 0 facem prin: teste
de patogenitate (e.g., izolarea din scaunul diareic a tulpinilor de Escherichia coli
enterotoxigene, el1teroil1vazive etc.); condiria pacientului (e.g., ooehi~ti i de
Cr)ptosporidiu11l au seml1ifieatie elinica in seaunul diareie al gazdei il11unoeol11promise).
Autoserodiagnosticul (del11onstrarea la pacient a unei dinamici sel11uiticative a
antieorpilor fata de izolatul eu presupusa seml1ificatie clinidi) este un argument l11airar
utilizat ~i trebuie il1terpretat prudent din cauza unor posibile inrudiri al1tigeniee intre
microbi.

1.3.4.3. Argumentarea semnificatiei cHnice a anticorpilor depistati la un


pacient. Folosim urmatoarele eriterii: seroconversia, dil1amiea sel11nificativa, titrul
semnificativ al anticorpilor sau depistarea al1umitor al1ticorpi IgM.
Seroconversia consta in pozitivarea ul1ui test serologic in cursul boIii.
Criteriul dina11liciise1l1nificativea anticorpilor este uzual ~irecomandat. ll11pune
prelevarea a doua probe de ser, ca ~i pel1tru depistarea seroconversiei. Send I sau senti
acut trebuie prelevat c:h mai curand dupa debutul bolii, iar send II sau senti de COIll'O-
lescent jj prelevam la 10-14 zile dupa primul. Al11beleprobe Ie testal11,coneomitent.
Al1ticorpii fata de un anumit microb au sel11nificatie clil1ica daea apar numai in
serul II (seroconversie) sau daca titrullor cre~te de cel putin 4 ori in sentlll fata de semi
I (dinamidi sel11nificativii).
Criteriul fifrului sellln({icafiv al anticorpilor este util cand cel al dinamicii
semnificative nu este operant. Astfel, la titruri mai mari de 200 U, antistreptolizina 0
semnifica infectia streptococica in antecedentele imediate.
Dozarea anticorpilor IgM. Criteriul este operant penru infectii in care exista 0
dinamicii bine exprimata aanticorpilor IgM ~i IgG in raspunsul imun primar (ca rubeola.
rujeola, viroze respiratorii, toxoplasmoza etc.). Nu este valabil cand anticorpii cu interes
apartin, pana la disparitie, clasei IgM.

1.3.5. Supervizarea activW'itii ~ipregatirea continua


a personalului de laborator

1.3.5.1. Controlul intern. Responsabilitatea rezultatelor pentru fiecare cerere de


analiza revine ~efului de laborator care semneazii sau contrasemneaza buletinele de
analiza. Seful laboratoarelor mari poate delega partial aceasta responsabilitate unoI'
supervizori care trebuie sa fie medici primari sau medici principali de specialitatate Cll
cel putin 4 ani de activitate in l11icrobiologia clinica.

28
Sefullaboratomlui realizeaza indmmarea ~i controlul personalului in subordine
prin mai multe metode: scrisa, orala, rondul prin laborator, verificarea performantelor
tehnice prin probe oarbe.

Metoda scrisa. Personalul de laborator trebuie sa aiM peTI11anentla dispozitieun


manual sau un dosar tehnic care cuprinde:
1) Tabelulnominal al personalului cu precizari privind funeria, adresa ~i numarul
de telefon.
2) Regulamentul de ordine interioara a laboratorului cu precizari privind: programul
de munca, n0TI11elede protectie a muncii ~isecuritate microbiologica, nom1ele de prevenire
~i stingere a incendiilor ~i sarcinile fiecami salariat In acest domeniu.
3) Descrierea completa a fOTI1mlarelorutilizate in laborator: etichete pentru prelevate
patologice, cereri ~i buletine de analiza, rubricile condicii de inregistrare, modul de
consemnare a rezultatelor in caiete de lucru, precizarea documentelor care se arhiveaza.
4) Planul laboratorului cu amplasarea echipamentului, reactivilor ~i mediilor de
cultura.
5) Nomenclatorul analizelor efectuate in laborator.
6) N0TI11elede prelevare, conservare ~i transport pentm produsele patologice.
7) Descrierea tehnica a fiecarui test: indicatii, principiu, material necesar, procedura,
controlul de calitate ~i interpretarea rezultatelor.
8) Lista mediilor de cultura ~i reactivilor utilizati cu formule complete ~imod de
preparare.
9) Algoritmii de identificare a microorganismelor izolate.
Manualul tehnic este completat periodic conform noilor teste implementate.
scrisorilor metodologice de la foml ierarhic superior, n0TI11elor~i standardelor de stat.
Metoda oraHi consta in intalniri periodice sau ocazionale cu personalul unui sec-
tor de activitate pentm schimb de opinii sau comunicari sCUlte, la obiect, nu afecteaza
timpul de munca ~i productivitatea.
Prin rondul in sectoarele de munca ~eful laboratomlui cunoa~te direct modul in
care fiecare salariat indepline~te sarcinile specificate in fi~a postului, cu ce probleme se
confrunta ~i poate da instructiuni operative de la caz la caz.
Metoda probelor oarbe examinate in dublu, de catre persoana verificata ~i de
catre supervizor sau un laborator de referinta, este cea mai drastica ~i obiectiva.

Analiza de calitate a activitatilor este flicuta ~i consen1l1ata saptamiinal de


imputernicit al ~efului de laborator ~i include:
1) Frecventa cu care momentul prelevarii nu este consemnat pe eticheta ~i in cererea
de analiza.
2) Frecventa cu care probele pentru cultivare ajung cu intarziere mai mare de 2 ore.
3) Frecventa, cauzele ~i responsabilitatile pentru calitatea nesatismciHoare a
prelevatelor.
4) Valoarea predictiva a microscopiei ~i culturilor.
5) Erori personale de testare.
6) Frecventa cu care rezultatele microscopiei intarzie mai mult de 2 ore.
7) Frecventa cu care rezultatele preliminare intarzie mai mult de 2 zile.

29
8) Frecventa cu care rezultatele finale intarzie mai mult de 5 zile.
9) Frecventa cu care pacientii sunt tratati cu chimioterapice la care microbul infectant
a fost rezistent in vitro.
In raport cu rezultatele acestor verificari, ~eful laboratorului programeaza
perfectionarea personalului prin studiul individual, stagii in laboratoare ierarhic
superioare, cursuri in universitatile acreditate de catre Ministerul Saniitiitii.

1.3.5.2. Evaluarea externii a calitiitii trebuie sa fie organizata de catre Ministerul


Sanatatii eu concursul Societatii Romane de Microbiologie ~iallaboratoarelor de referin(a
~isa conditioneze autorizarea de functionare a oricarui laborator de microbiologie c1inica,
atat a celor din reteaua ministerelor cu servicii de sanatate, cat ~i a celor particulare.
Obiectivele vizeaza:
1) Constructia, finisari, utilitati ~i dotari.
2) Asigurarea increderii medicilor ~i protectia pacientilor.
3) Identificarea erorilor aleatorii sau sistematizate.
4) Compararea la scara national a a laboratoarelor sub rapOliul fiabilitatii.
5) Extinderea standardizarii in microbiologia cIinica.
6) Stimularea programelor de control intern al calitatii ~i perfonnantelor.
7) Sanctiuni administrative panala retragerea autorizatiei de functionare.
Organizatoric, fiecare laborator prime~te:
Un numar de cod cunoscut numai de forul organizator $i de laboratorul respectiv.
Trimestrial un numar de trei probe pentru examene bacteriologice ~i serologice.
care se incIud intre probele analizate curent.
Cererile ~ifonnularele pentru buletinul de analiza in dublu exemplar cu precizarea
termenului de comunicare a rezultatelor.
In Romania, culturile ~i anticorpii pentru controlul extern de calitate, precum ~i
laboratoarele de referinta care examineaza dublura probelor raman a fi stabilite de forurile
organizatoare in raport de dotarea cu reactivi biologici ~i de morbiditatea prin boli
infectioase la un moment dat.
Dupa centralizarea tuturor rezultatelor, forul organizator acorda un calificativ
fiecarui buletin de analiza ~i notifica laboratoarelor controlate:
- Rezultatul corect.
- Catalogul calificativelor obtinute in care fiecare Jaborator se recunoa~te. In
conditii de anonimat, prin numarul sau de cod.
- Masurile administrative care se impun in caz de rezultate nesatisIacatoare repetate.

1.3.6. Comunicarea clara a rezultatelor

In microbiologia clinica, nu numai decizia testarilor, ci ~i modul de formulare a


concluziilor, de comunicare ~i insu~ire a lor de catre medic au impact asupra finalizarii
investigatiei.
Din multitudinea aspectelor relevate de etapele succesive ale examenului de
laborator, microbiologulle selecteaza numai pe cele semnificative clinic. Comunicarea
tuturor microorganismelor conditionat patogene dintr-o proba duce mai degrabii la confuzii
decat la 0 clarificare a rationamentului clinic. De aceea buletinul de analiza nu
30
lnregistreaza tot ce a vazut microbiologul, ci numai ce a interpretat ca semnificativ. Deci
comunicarea microbiologului este un compromis fntre raportarea factualii ~i cea
imerpretativa. Pentru ca mesajul informativ al buletinului de analiza sa fie cat mai putin
alterat de interpretarea faptelor, microbiologul adopta 0 anumita conduita:
Semnificatia c1inica a unui microorganism trebuie argumentata prin cateva repere
esentiale: prelevatul examinat ~icalitatea acestuia, numele microorganisl11ului, iar pentru
cele conditionat patogene - asociatia cu reperele citologice ale leziunii, relatii cantitative.
factori de patogenitate identificati.
Absenta unui microorganism semnificativ va fi corelata, dupa caz, cu calitatca
probei examinate.
Rezultatul neobi~nuit al unei culturi trebuie mention at, chiar daca evidente de
laborator nu pem1it 0 concluzie. Clinicianul avizat va fncerca sa 0 caute integrand datele
de laborator in ansamblul informatiilor despre bolnav ~i al celor din literatma de
specialitate. E.g., Staphylococcus epidermidis sau Propionibacterium acnes pot fi
contaminanti ai unei hemoculturi, dar pot sa aiM semnificatie clinica la pacienti cu
valvulopatie cardiaca protetizata, dupa cateterizare intravenoasa prelungita. la
imunodeficienti etc.
Daca rezultatele antibiogramei difuzimetrice se comunica simplu in categorii de
sensibilitate, cele ale testarilor cantitative trebuie comunicate ca valori ale CM! Cll
precizarea punctelor de ruptura prevazute de standardul utilizat. In acest mod decizia
clinidi va putea fi nuantata mai precis fn functie de localizarea focarului infectios.
Rezultatele examenului microbiologic trebuie fommlate Tara ambiguitati. Sunt
fonnal contraindicate fonnulari de genul "Exam en microbiologic negativ", care asuma
o dubla eroare: (a) ca au fost cautate toate microorganismele posibile ~i (b) ca all fost
utilizate cele mai performante teste posibile, ceea ce de regula nu este cazul. Mai exacte
~i mai utile sunt fonnulari de genul: "Exsudat faringian: absent Streptococcus pyogcnes
sau absent bacilul difteric" ori "Coprocultura: absente Shigella ~i Salmonella" pentru cft
indica precis: aceste bacterii au fost cautate (partial ~i 0 garantie ca au fost utilizate teste
perform ante), lasa clinicianului latitudinea legitima de a se gandi la alti patogeni posibili
~i de a face eventual solicitari de investigare fn acest sens.
Buletinul de analiza reprezinta fn fond un mesaj, 0 conventie de comunicare. De
aceea microbiologicul care fl redacteaza trebuie sa evalueze fn ce masura clinicianul
cunoa~te conventiile comunicarii ~i tem1enii utilizati in microbiologia clinica. metodele
de laborator utilizate ~i semnificatia microbiologica a date lor consemnate. Lipsa unui
comentariu sau prezenta unui comentariu ambiguu al datelor risca sa transfonne buletinul
de analiza microbiologica fntr-un document criptic.

1.3.7. Relatiile laborator-clinidi in controlul de calitate


al investigatiei microbiologice

Cu tot controlul de calitate, rezultatele de laborator pot, accidental, sa para


neverosimile, sa fie in contradictie cu alte rezultate de la acela~i pacient. sa fie in
contradiqie cu ipoteza clinica.

31
Asemenea discrepante pot fi 0 eroare, fie de laborator, fie de diagnostic prezumtiv.
in aceste situatii, clinicianul, familiarizat cu sursele variabilitatii, in detel'minarile de
laborator, trebuie sa revizuiasca in pril11ulrand conditia pacientului in momentul prelevari i
probei. Oaca persista suspiciunea erorii de laborator, trebuie solicitat un nou exam en pe
aceea~i proba (daca aceasta mai exista) sau, daca este posibil, pe 0 noua proM. AstfeL de
cele mai multe ori, situatia este clarificaHi. Oaca a fost 0 eroare de laborator, se poate
depista sursa pentru a preveni repetarea ei. Oaca nu a fost 0 eroare de laborator.
rationamentul clinic urmeaza a fi corectat. Ambele spre binele pacientului.
Comunicarile intre l11icrobiologul, executant, ~i clinicianul, solicitant ~i beneficial'
in numele pacientului, pot fi: comunicari scl'ise, intalniri organizate, intalniri spontane,
vizite periodice in serviciile clinice.
Comunidirile scrise:
Buletinul de analiza a fast eomentat mai sus.
Manualulutilizatorului include atentionari asupra practicilor gl'e~ite, nOl11en-
clatol'ul analizelor efectuate de laborator, infomlatii pentru mediei ~i asistente pl'iviroal'e
la exigentele prelevarii probelor pentru exal11enele microbiologice ~i serologice, ghidul
de interpretare a rezultatelor. Insistam asupra oportunitatii formarii unor echipe specia-
lizate pentru prelevare (fig. 1-2) .
Scrisorile l7letodologice ale laboratoarelor de referinta sau Societatii Romanc
de Microbiologie, publicate periodic, pot atentiona asupra modificarilor recente in
investigatia microbiologica clinica, modificarilor survenire in nomenclatura microorga-
nismelor, aparitiei unor noi microorganisme patogene.
InHUnirile organizate cu medicii ~i asistentele din sectiile care apeleaza cel mai
frecvent la serviciile laboratorului de microbiologie sunt utile pentru a anunta, a explica
modificari reeente ale protocoalelor de laborator ~i a analiza deficiente ale colaborarii
elinica-Iaborator.
Intftlnirile spontane "Ia dejun" sau "la coltul coridoarelor" cu schimb de opinii
asupra serviciilor de laborator (exigente ale medicilor privind rezultatele analizelor de
laborator, exigente ale microbiologilor privind prelevarile etc., necesitatea implementarii
unui nou test ~. a.).
Vizitele periodice in serviciile cHnice sunt operative ~i eficiente daca au ca obiect
un afi$ier de sesizari (blocuri eu foi deta~abile) in care asistentele ~imedieii consemneaza
orice comentarii privind serviciile laboratorului. Cu aceasta ocazie se poate stabili
contactul personal al microbiologului cu medicii care au ridicat problemele respective.

104. UTILIZAREAADECVATAA LABORATORULUI


DE MICROBIOLOGIE CLINICA

1.4.1. Eficienta laboratorului

Cre~terea marcanta a cotei analizelor de laborator in costul total al asistentei


medicale impune cunoa~terea mai realista, atat de catre clinician, cat ~i de catre
mierobiolog, a relatiei cost-beneficiu pentru bolnav ~i pentru eolectivitate. Oireqiile de

32
J.c~iune sunt: a) cunoa~terea precisa a costului analizelor; b) prescrierea unor examene
:L:1tlcrobiologice cu indicarie adecvata; c) triajul de calitate al probelor dublat de
:Twnitorizarea prelevarii ~itransportului probelor; d) alegerea testelor pentru investigatia
:nicrobiologica.

104.1.1. lndicarea adecvata a investigatiilor microbiologice. lnainte de a solicita


un examen microbiologic sunt utile cateva intrebari:
Poate numele microbului sa ajute pacientul?
Este el impOliant pentru combaterea ~iprevenirea unei izbucniri epidemice intr-o
anume colectivitate?
Exista posibilitatea unui tratament anti microbian specific?
Este necesar acest tratament?
Exemple pot ilustra legitimitatea ~i utilitatea unor asemenea intrebari pentru fonnularea
rarionala a cererii de exam en microbiologic.
La un pacient cu angina sau faringita, indicaria penrru exsudatul faringian "Exa-
men microbiologic ~i antibiograma" apare nerarionala din cel purin trei motive: a) este 0
fonnulare suis-generis pe care laboratorul 0 poate onora numai cu cheltuiala materiala $i
de timp nejustificata de posibiitarile terapeutice limitate la infeqiile bacteriene; b) Strep-
tococcus pyogenes sau alri streptococi B-hemolitici sunt astazi, cand toxiinfec(ia difterica
a devenit rara, principala cauza a anginelor ~i faringitelor care imj:lUne tratament
antimicrobian; c) penicilinoterapia infecriilor cu S. pyogenes nu necesita antibiagrama.
o formulare precisa, care solicita depistarea ~i identificarea unui anume microb
patogen, amelioreaza randamentul examenului de laborator prin limitarea invcstigatiei
la necesalUl clinic semnificativ pentru pacient ~iprin selectarea celar mai rapide, scnsibile
~i specifice metode de depistare, care difera de la un patogen la altul.
Supraaglomerarea laboratorului cu probe recoltate din aceea~i leziune, a aceluia5i
pacient, la intervale mai mici de 48 de ore este a alta ipostaza a prescrierii nerationale a
examenului microbiologic. Asemenea probe in duplicat au indicarii limitate numai la:
depistarea unor patogeni in materiile fecale, a micobacteriilar, hemoculturi, plagi ~iarsuri
intinse, cand prelevarea se face din puncte diferite. La acest interval scurt mai poate fi
indicata ~i examinarea unor prelevate prin metode invazive sau pe cale natural a numai
daca au 0 calitate semnificativ superioara primului prelevat.
Identificarea izolatelor clinic semnificative trebuie sa se apreasca la nivelu]
exigenrelor diagnostice, terapeutice ~iprognostice. Comunicarile "bacil gram-negativ in
curs de identificare" sau "bacil gram-negativ anaerob din grupu] Bacteroides .tragilis'
apar in doua etape succesive ale identificarii ~i sunt suficiente pentru decizia clinica.
Identificarea serovarurilor este rar relevanta pentru microbiologia c1inica. Exceptie t~lc
serovarurile tific ~i paratifoidice de Salmonella enterica, serovarul b de Haemophilus
injluenzae. Identificarea markerilor epidemiologici nu apare relevanta pentru decizia
c1inica. Nu trebuie confundata identificarea completa pentru necesitati academicc
(apanajullaboratoarelor de referinta sau din spitale universitare) cu identificarea pentru
necesitatile curente ale deciziei clinice. Fondurile, incadrarea, competentele 5i sarcinile
celor doua categorii de laboratoare sunt diferite.
1.4.1.2. Triajul de ealitate al prelevatelor amelioreaza randamentul economic al
laboratorului evitand examinarea inutila a un or probe nereprezentative pentru leziunea
investigata, iar monitorizarea metodelor de prelevare ~ide transport a prelevatelor previne
accesul unor asemenea probe in laborator.

1.4.1.3. Programul de lueru allaboratorului trebuie sa asigure fluxul continuu


~i productivitatea investigatiilor. Sefullaboratorului, de comun acord cu ~efii sectiilor
din spital, stabile~te ~i dispune asupra:
orelor intre care se fac prelevarile, se primesc cerelile de analiza ~ise inregistreaza
prelevatele;
orele intre care sunt eliberate buletinele de analiza;
exceptiile ~i regimul de primire a analizelor urgente, a probelor intraoperatorii.

1.4.1.4. Alegerea testelor pentru investigatia microbiologicii. Performantelc


testelor alese pentru investigatia microbiologica trebuie sa corespunda scopului propus:
diagnostic la bolnav, triaj pentru depistarea precoce a unei infectii sau a unei anumite
conditii microbiologice.
Pentru a confimla prezenta unei infectii trebuie alese teste cu specificitate ~ipredictie
pozitiva mali, in timp ce pentru triajul de excludere sunt indicate teste cu sensibilitate ~i
prediqie negativa mari.
Infectii cu prevalenta mare, dar cu predictie pozitiva mediocra a simptomatologici
clinice, aglomereaza laboratorul cu un mare numar de probe a caror examinarc prin
metodele de referinta devine excesiv de costisitoare. A~a sunt, de exemplu, infectiiJe
cailor urinare. In aceste cazuri triajul pentru eliminarea probelor negative prin teste rapide,
economice, sensibile $i suficient de specifice (e.g., citobacterioscopia cantitativa cu sau
tara testul amprentei) permite retinerea pentru urocultura cantitativa ~i antibiograma a
unui numar semnificativ restrans de probe tara riscul unor rezultate fals negative.
Asocierea testelor in asemenea algoritmi de investigatie, in conditiile respectarii
controlului de calitate, este 0 importanta sursa de economie.
In raport cu bugetul alocat, de comun acord cu ~efii sectiilor, ~eful laboratorului
stabile~te nomenclatorul analizelor ~inivelul pana la care se face identificarea microorga-
nismelor depistate pentru a asigura 0 cat mai corecta decizie clinica. Costul excesiv al
analizelor efectuate ~i ignorarea acestui cost sunt doua importante gre~eli in conducerea
laboratorului.
Examenul prelevatelor contaminate trebuie orientat ~i limitat numai la izolarea
microorganismelor clinic semnificative. Astazi, "pancultura" cu identificarea ~i
antibiograma nediscriminatorii a izolatelor este un lux nu numai costisitor, dar ~ipericulos
pentru pacient.
Examenele microbiologice "de acoperire" efectuate pe probe irelevante, necores-
punziitoare calitativ, consuma fondurile laboratorului ~i, in detrimentul pacientului. detur-
neaza aten!ia clinicianului de la realul microb infectant. Mai indicata este in acest caz
antibioticoterapia de prima inten!ie initiata prin ra!ionamentul clinico-epidemiologic.
dar supralicitarea acestei posibilita!i incarca nota de plata a tratamentului prin apelulla
noile antibiotice a carol' uzura 0 grabe~te prin selectarea ~i amplificarea fondului genic
de rezisten!a.
34
2. LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE CLINICA
(DUMITRU BUIUC)

2.1. PLANIFICAREA ACTIVIT A TII 2.5.12. Echipament din sticla, material plastic
2.1.] . Personal necesar ~i articole mici de laborator
2.6. REGULI DE COMPORTARE: RE-
2.1.2. Aprovizionarea laboratorului
2.2. SPA T1UL NECESAR AMPLASARE ~1 GIMUL ANTIEPIDEMIC, PROTECTlf\
PLAN MUNCIL PREVENIREA ~l STIN-
GEREA INCENDIILOR
2.2.1. Spa]iul necesar
2.6.1. Regimul anti epidemic
2.2.2. Amplasarea
2.6. I .1. Clasificarea microorgallismelor III/I/IICrie
2.2.3. Planul de ansamblu
de riscllI illrecrios
2.2.4. Pia nul principale!or compartimente
2.6.] .2. Cai de transmitere .~ipOr{i de illlmre III
2.3. CONSTRUCTlA $1 1NSTALA TULE OIxwlism all' illfecriilor de labowtor
2.4. MOBIUERUL
2.6. I .3. Clasificarea labowtoare!or III/iI/IC{ie de
2.5. ECHIPAMENTUL
exigellta sigllralltei allfiiJ(fi'ctioa.le
2.5.1. Microscoape ~i lupe 2.6.1.4. Barierele alltiinfi'Ctioase: primare. seClm-
2.5.2. Incubatoare, biii de apii sau de nisip dare, tertiare
2.5.3. Refrigeratoare 2.6.1.5. Illcilltele (boxele) de protec{ie microbio
2.5.4. Centrifuge logica
2.5.5. Balan]e 2.6.1.6. Sigllrall{afa{i/ de silbstantele intlamabile.
2.5.6. Omogenizatoare, agitatoare, dispozitive combllstibile. roxice .yi I'oro:il'e

de triturare a ]esuturilor ~i rupere a celu- Depozitarea


lelor Precau!ii la manipularea chimicalclor cu
nsc
2.5.7. Aparate pentru distilat apa
Precau!ii la indepartarea chimica1clor
2.5.8. Distribuitoare pentru medii de cultura
uzate
2.5.9. Containere pentru materialul conta-
Masuri la varsarea acciclentala a chimi-
minat
calelor
2.5.10. Aparatura ~i dispozitive pentru steri-
2.6.1.7. Sigllral/tafa{a de cilrellfill eleclric
lizare ~i dezinfectie
2.6. I .8. Prel'el/irea ~i slil/gerea il/celldiilor
2.5.11. lncinte (boxe) de siguran]ii microbio- 2.6.1.9. Aile masllri pril'il/d sigl/ranta aClil'i/(llii
logica I
In abo ralO r

Laboratorul de Microbiologie clinici'i, prin incadrare, constructie, compartimcn-


tare, dotari ~i functionalitate, trebuie sa asigure:
testarile necesare deciziei clinice la pacientii cu boli infectioase;
folosirea cat mai eficienta a for!ei de munca;
securitatea personalului, a colectivitatii ~i a probelor examinate.

2.1. PLANIFICAREA ACTIVIT A TII

Planificarea activitatii laboratorului de Microbiologie clinica porne~te de Ja patru


premIse:
1) NomenclatoruI de analize adaptat la necesitatiJe beneficiarilor.

35
PLANlfICARE: 2) Volumul global de activit ate repartizata pe
REACTIVI
tipuri de analize plus cre~terea estimata conform
prevederilor statistice sau programului de dezvoltare
al unitatilor beneficiare.
3) Volumul mediu al activitatii zilnice repar-
tizat pe tipuri de analize.
4) Variatiile sezoniere ale volumului activitatii,
care au ca baza de calcul analizele efectuate in primul
~i al treilea din ultimii trei ani de activitate.
PLANIFICARE Pornind de la aceste patru premise, putcm pla-
STICLARJE.
INSTRUMENT[ . nifica realist: spatiul, dotarile, reactivii ~i personalul
APARATURA
necesar pentru 0 activitate eficienta, actuala ~i de
Fig. 2-1. Premisele de planificare a perspectiva. Figura 2-1 sugereaza relatiile dintre pre-
activitatii in microbiologia clinica. mise ~i planificarea activitatii.

2.1.1. Personalul necesar

Baza de calcul 0 formeaza:


Numarul de teste per categorii ~i per zi.
Unitatile de timp per procedura (UTP), in minute.
Pornind de la aceste premise putem stabili totalul general al UTP per zi. Un
tehnician sau specialist bine calificat poate realiza 45 UTP/ora. Rezulta ca:
Numarul de ore tehnice necesare Totalul general al UTP per zi
per zi pentru totalul testelor 45 UTP per ora,
1ar
Numarul de tehnicieni sau Ore tehnice necesare zilnic
speciali~ti necesari per zi 8 ore de lucru

Valori ale UTP au fost stabilite de diferite foruri: College qf American Por/z%-
gists. Pentru laboratoarele noastre nu sunt stabilite insa UTP ~i nici nu putem extrapola
aprecierile forurilor de specialitate straine, din cauza diferentelor dintre dotari, facilitati,
tehnologii ~i calificari. De aceea ca1culul necesarului de personal pentru 0 activitate
economidi eficienta este inca aproximativ ~i subiectiv.

2.1.2. Aprovizionarea laboratorului

A) Planificarea reactivilor ~i altor materiale consumabile


1) Necesaru/ COnSlll7lu/lii anua/ are ca baza de calcul:
Numarul testelor dintr-o anumita categorie estimat ca medie din anii treculi
(revezi mai sus), e. g. 800;
Cre~terea numeric a estimata, e. g. 75;
Totalul testarilor planificate 875;
Totalul rotunjit al testarilor 900;
Reactiv necesar pentru 100 teste 25 g.

36
900 x 25 g
Cantitatea necesara pentru consum per an = 100 = 225 g.

Reactivii comuni mai multor testari se sumeaza.


:2) Stont! de rezerva. Bolile infeqioase transmisibile pot prezenta fluctuarii numerice
:r:mortante. De aceea trebuie calculat ~iun stoc de reactivi in rezerva conform fluctuatiilor
s.:zoniere ori anuale prognozate epidemiologic. E. g., fondul de rezerva pentru reactivii
:icc:esari coproculturii poate fi estimat la 90 de zile (sezonul estivo-autumnal).

Necesarul x Numar zile


225 x 90 zile
pt. consum
Stocul de rezerva = N umaru
pt. rezerva
- I ZI'1 e Ior d'111an
-------560.
360 zile b

3) Stont! plan(ficat insumeaza: Necesarul pentru consum + Stocul de rezerva.


4) Stocul planificat reprezinta cantitatea de reactiv, in term en de valabilitate,
.:xlstenta la un moment dat in laborator.
5) Stont! reportabil reprezinta cantitatea de reactivi, in tennen de valabilitate.
existenta la sfar~itul anului. EI rezulta din:
(Stocul efectiv + Cantitatea de reactivi care urmeaza a intra pana la sfar~itul anului
c:onfom1contractarilor) - Consumul probabil din momentul efectuarii calculului pana la
sfar$itul anului.

In planificarea reactivilor trebuie sa se ia sistematic in calcul stocul reportabil de


,eactivi.
Cmiotecile de evidenta a stocurilor de reactivi pennit inventarierea lor operativa.
Evidenta operativa pe cartoteci a sticlariei ~i materialelor cu unica folosinta
faciliteaza de asemenea inventarierea ~i stabilirea necesarului pentru anul urmator.

B) Aprovizionarea eu aparaturii presupune mai multe etape:


1) Documentarea asupra necesitatii (relatia cost-beneficiu).
2) Alegerea fim1ei furnizoare dupa verificarea personala a perfonnantelor unor
apm"ate similare care functioneaza in alte laboratoare sau, mai bine, verificarea unui
aparat lasat de firma in custodie.
3) :;lefullaboratorului este responsabil de inscrierea corecta ~i completa in caietul
de sarcini allicitatiei a caracteristicilor sau perfom1antelor tehnice necesare ~ieventualelor
posibilitati de upgrade, precum $i a unnatoarelor documente referitoare la partea tehnica
a relatiei cumpariitor-fumizor: certificatul ISO, certificat ISCIR (pentru aparatcle
care 11 impun: e.g., autoclave $.a.), aprobarea Ministerului Saniitarii pentru utilizare,
dovada ca ofertantul este imputernicit de firma producatoare sa-i comercializeze
produsele in Romania.
4) Organizarea licitatiei $i adjudecarea comenzii.
5) Pregatirea spatiului, instalatiilor electrice etc. inainte de comanda fem13.
6) Pentru aparatele apte de conectare la reteaua de infonnare computerizata trebuie
prevazuta ~i comanda accesoriilor de conectare.

37
7) La primirea aparatului trebuie verificate: documentele comerciale, livrarea
manualului de utilizare ~iintretinere, a certificatului de garanlie, integritatea ~i funqiona-
litatea aparatului ~i accesoriiloL
Procedura este valabila ~i pentru reactivi.

Ca reguli generale:
In fiecare laborator, unul dintre speciali~ti trebuie desemnat pentru gestiunea
inventarului ~i personalul responsabil de inventarierea sau autorizat pentru eomanda
reaetivilor, echipamentului ~i aparaturii.
Oriee comanda pentru aprovizionare se face in scris.
Contractele anuale pentru livrarea de reactivi ~i materiale consumabiIe trebuie sa
prevada expres: numele reactivilor, calitatea, numarul de cod, pretul estimat, cantitatilc
necesare defalcate pe termene de Iivrare (lunar, trimestrial, anual, in funqie de
perisabilitate ~i cantitatile folosite).
La primirea in laborator reactivii ~i alte materiale sunt imediat dezambalate ~i
confruntate cu documentul comerciaI. Se urmaresc in mod special: termenul de valabi-
Iitate, degradari ~i defecte macroscopice, perfonnantele calitative fata de martori adcevati.
Toate neconcordantele cu prevederile contractului sunt astfel semnalate 121 timp pentru
inlocuirea de ciltre fumizor a materialelor necorespunzatoare.
Reactivii verificali sunt inregistrali in cmioteei, marcati cu data primirii ~idepozi-
tati, In ordinea tenl1enilor de perisabiJitate, In condi!iile de pastrare indicate de produeator.

2.2. SPATIUL NECESAR, AMPLASARE Sf PLAN

2.2.1. Spatiul necesar

In microbiologia clinica, 0 activitate de calitate ~i in conditii de siguranta nceesita


laboratoare care asigura eca 11 m2 spa!iu de lucrulsalariat, exelusiv WC-tele, vestiare,
spalii de depozitare. Comparativ cu alte seetoare ale laboratorului clinic, sectorul de
microbiologie a beneficiat In masura mai mica de automatizari. De aceea neeesitatea
unui asemenea spatiu se mentine ~i pentru viitorul previzibiI.

2.2.2. Amplasarea

Amplasarea laboratorului de analize medicale trebuie sa faciliteze accesul serviciilor


beneficiare ~i legatura cu serviciile auxiliare. Incaperile pentru prelevarea probelor trebuie
situate In veciniitatea triajului ~i/sau a celor de tratament ambulator. Rezultate bune d{l
planificarea incaperilor de primire a probelor ~i eliberare a buletinelor de analiza intr-o
arie centrala din care radiaza diferitele laboratoare componente.
Necesitatile specifice securitatii microbiologice impun ca, In cadrul laboratorului
de analize medicale, laboratorul de Microbiologie clinica sa fie amplasat, pe cat posibil.
121 distanla ~i neaparat separat de aria centralii de prelevare a probelor, prelucrare a datelor
~i cliberare a rezultatelor, unde traficul de personal este intens.

38
2.2.3. Planul de ansamblu
Birou Recept~
Once laborator de Microbiologice clinica
::-:-::,,o:.:pune
urmatoarele compartimente: de
Oependinte (1 ) Depen din fe [3)
-~c::,:<-=u:-a.de investigatii, de pregatire a sticla-
-:",i. j", preparare $i condition are a mediilor de
: "::~Jra ~i reactivilor, de depozitare (sticlarie, Dependintel2 )
:::i:
:-:-_~c:j: de cultura, reactivi), birou, dependinte a
c
CL

:-c:-ITU necesitatile igienice ale localului $iperso- -TiT)


ro
r::L:lui. Dimensionarea acestor compmiimente :::r
2.ro
CL
n
_c~
",,oleconditionata in ultima analiza de numarul ro n
_c
::J ...,
e'c::m,enelorsolicitate. Siguranta microbiologica Preparare
;;::;:1tiepidemica impun ca laboratorul de Micro- medii de
cultura
:-:,:,logieclinica sa funqioneze cu circuit in sens
_lite. care poate fi realizat prin dispunerea
::rLc::ra, fie pe doua, fie pe trei tronsoane, de 3:
Depozit
reactivi
a
::-caperi lara comunicare Intre ele, singurul acces c
CL

':l iiecare camera fiind prin coridor. Astfel poate


:: realizata 0 scala, U$or de supravegheat, a Depozit
shclarie
Ii
n
...,
C
:;cti\"itatilor "murdare" l'ersus "curate". -0
,-T
Dispunerea pe doua tronsoane este
sugerata in fig. 2-2. Este utila atat pentru Pregatire ~
,opitalele mici, cat ~i pentru cele mai mari.
Dispunerea pe trei tronsoane este material I
+
;:1dicatapentru laboratoarele marilor spitale, mai t --::...
ales cand beneficiaza de automatizari, medii de Yes tiar
.::ultura gata pentru utilizare sau deshidratate,
:nateriale cu unica folosinta. Incaperile sunt t Decontaminare I Camera

separate prin doua coridoare longitudinale cu


material
- spalare l comuna
tehnicieni
1-.2 coridoare de roeada. Pe unul din tronsoanele
laterale sunt dispuse indiperile administrative Fig. 2-2. Sugestie pentru planul eu doua tron-
soane a unui laborator clinic de microbiologic
Iyestiar, birou, camera comuna pentru tehni- eare luereaza eu 8-16 tehnieicni pcratura .
.::ieni, biblioteca), pe celalalt tronson lateral
incaperile de lucru cu materialul contaminat (receptura, modulele de lucru pentru
tehnicieni, compartimentul de decontaminare-spalare material $i cel de pregatire a
materialului de lucru), iar pe tronsonulmijlociu incaperile cu functii de dcpozitare.

2.2.4. Planul principalelor compartimente

Locurile de munca trebuie concepute $i dotate ca unitati in care funqiile specifice


fiecarui compartiment sunt realizate independent de restullaboratorului. Numai in acest
mod evitam deplasari inutile de persoane $i materiale eu rise de contaminare $i daunatoare
39
unei activitati eficiente. Doar in cazuri exceptionale se va pemlite deplasarea unor aparate
(microscoape, centrifugi etc.) dintr-o incapere In alta, respectfmd intotdeauna sensu] de
1a "curat" spre "murdar".
In compartimentuI de investigatie microbiologica sau serologica trebuie rezervali
pentru fiecare tehnician cca 1l-l6 m2, suprafata In care dotarile pot fi dispuse ergo-
nomic, tara periurbarea reciproca a aparatelor concomitent In funqie (e. g., microscopul
nu poate tunetiona pe aeeea~i masa eu centrifuga, frigiderul nu poate fi plasat ElJ1ga
ineubatorul de 37C).
Pentru laboratoarele mici eu volum redus de analize, Ineadrate eu un singur
tehnieian, locul de munca poate fi displiS liniar (fig. 2-3) ~i presupune 0 masa sau 0
eonsola de 2-6 m/O,75 111,eu blatulla eca 0,75 111de la du~umea ~i un spariu pcntru
picioare larg de cea 0,65 m ~itot atat de Inalt, care pemlite a~ezarea confortabiJa ]3 lueru
pe un se3un rotativ cu suport solid pentru spate.
Modulul fn "L" asigura suprafata mai mare de lucru ~ipoate fi amplasat convenabil
in eolturile incaperii. Pe latura mare se poate luera In pozitie a~ezat, iar latura mica poate
fi inaltata la eca 0,95 111pentru Iucru in pozitie Oliostatica (fig. 2-3).

-2,7Sm- -3,6m-
"...J

I~I
1,75m 1

I
N Qo,
I
0-
3
'3
I
I

I
I
,
Modul Modul [-8 I Modul 1_
-.J
I
linear Inn L If ~ in"U" Ul
'3
-3,6m- -3,6m-

I~Ul I Modulin "E"


3
Fig. 2-3. Sugestie pentru module de lucru ale microbiologului in
functie de volumul analizelor efectuate per tura.

40
~\Jod!ljlll in "U" este celmai eficient pentru 0 gama diversificata de examene sau
~~~::imc][1e eu etape multiple (e. g., centrifugare, microscopie, insaman!~iIi ~. a.). Frontul
:JJ1I""lilll de lueru pentru un tehnician este de 2 m liniari masa pe fiecare latura a literei U.

je ,.!TIderezulta 0 suprafa!a necesara de eca 10m2. Pentru aetivitatea eoneomitenta a 2


:~inicieni. frontul de lucru trebuie sa creasea la 5,25 m masa pe latura dreaptii ~i stanga
:0 ii:erei, eeea ce impune 0 suprafa!a minima de 22 m2 (fig. 2-3).
Pentru laboratoarele mari, eare functioneaza cu mai muIt de 2 tehnicieni
:,:'Heomitent, cele mai eficiente sunt modulele de lucru in "E ", grupare de module in
..c" eu separarea lor partiala prin paravane longitudinale din sticla (fig. 2-3). Avantajele
modulelor de lucru in "E" sunt indiscutabile:
front de lucru mai mare in raport cu suprafa!a ocupata;
folosirea in comun, de catre 2-4 tehnicieni, a ineintelor pentru securitate
c.miepidemiea, a spa!iului de refrigerare, ineubare ete.;
utilizarea earucioarelor, prin spa!iul eomun, pentru aprovizionarea cu materialele
neeesare, elimina deplasarile frecvente ale personalului;
da impresia individualita!ii pentru fiecare tehnician, asigurand insa
supravegherea permanenta a activita!ii de catre ~efullaboratorului.
In compartimentul de spalare ~i conditionare a sticlariei, dispozi!ia instalatiiloL
aparatelor, ma~inilor ~imeselor de lueru h"ebuie sa asigure fluxul nestanjenit almaterialelor
din aria de recep!ie spre autoclave, zonele de sortare, spalare, condi!ionare ~i sterilizare
(fig. 3-5, 3-6). Dispozi!ia Iiniara in lungul pere!ilor este satistaeatoare. Aceea~i dispozi!ie
liniara este eficienta ~i in compartimentul de preparare a mediilor de cuItura ~i
reactivilor, un de trebuie sa existe 0 incinta sterila eu aer laminar pentru eonditionarea
mediilor de cultura care nu mai suporta sterilizari pana la utilizare (e. g., tumarea plaeilor
eu medii agarizate).

2.3. CONSTRUCpA ~I INSTALATIILE

Sunt recomandate urmatoarele exigen!e:


Conduete:ji refea electridi incluse in pere!i, iar cand nu este posibil trebuie sa Ii
se asigure cat mai mult traseul pe pere!ii culoarului.
Peretii interiOl"i netezi care pem1it spalarea ~i dezinfectia periodica.
Imbinarea pere!ilor eu du~umeaua ~i a pere!ilor intre ei trebuie sa fie concava. Este
formal contraindicata plinta la imbinarile pere!ilor cu du~umeaua. A~a favorizam
indepartarea prafului, spalarea ~i dezinfec!ia eficace.
Tavan cat mai absorbant pentru sunete, neted, simplu, tara profile care retin
praf.
Este formal contraindicata utilizarea tavanelor false.
DU:jumea rezistenta, tara fisuri, u~or de spalat ~i dezinfectat.
U:ji glisante, care redue curen!ii de aer in incaperile cu risc de contaminare.
U:ji eu desehidere spre culoar pentru accesul in incapelile tennostatate la 4 sau
37C (fig. 2-1).

41
Laboratorul necesitEi unnatoarele instalatii: electrica, de gaz, de apa rece, calda ~i
deionizata, de Incalzire ~i aer conditionat. Existenta unei instalatii centrale de abur
conditioneaza folosirea autoclavelor orizontale modeme. In limita posibilitatilor, 0
instalatie centrala de vacuum ~i una de aer comprimat amelioreaza mult condiTiile de
lucru.
Instalatii de aer conditionat ~ide Incalzire trebuie sa asigure temperatura ~iumiditate
constanta pe tot parcursul anului, reducand la minimum curentii de aer In ariile de
activitate.
Sisteme exhaustoare VOl'fi prevazute pentru locurile de lucru unde apar vapori
iritanti (manipularea un or reactivi), aburi (funqionarea autoclavelor, ma~inilor de spalat
etc.) sau mirosuri neplacute (culturi ale bacteriilor anaerobe, enterobacteriacee).
Iluminarea corecta a locurilor de lucru, fara reflexe sau umbre suparatoare, asigura
precizia manipularii. Pentru aceasta tehnicienii VOl'lucra In fata ferestrelor, iar cOlVurile
de iluminat, tuburi fluorescente care asigura lumina "de zi", VOl'fi fixate pe tavan. Surse
suplimentare de lumina pot fi plasate dupa necesitatile fieciirui loc de activitate.
Este foarte important ca instalatia eleetridi sa faea fata sareinii impltse de
ji/1/e{ionarea eoneomitenta a aparatelor din laborator sau din restul cladirii (mai ales
cand intra In circuit mari consumatori ca aparatura radiologica, statia centrala de aer
conditionat etc.) ~i sa asigure curentul sub tensiune stabilizata. Vor fi prevazute prize la
distante de 1,5-2 m una de alta in compartimentele de lucru, inclusiv In lungul fronturilor
de lucru multimodulare.
Chiuvete din mateliale necorosive cu instalatie de apa rece ~icalda trebuie prevazute
la extremitatea fiecarui modul de lucru al tehnicienilor. Bacurile din compariimentu] de
spalare a sticlariei impun acelea~i exigente.

2.4. MOBILIERUL

Mai convenabil este mobilierul de tip modular, care poate fi confecrionat din leml1,
otel sau masa plastica rezistenta.
Blatulmeselor trebuie sa fie neted, neinflamabil, impermeabil ~inecorosiv, pentru
a fi u~or de spalat ~i dezinfectat. Culoarea neagra evita reflexele supariltoare ~i permite
umlarirea facila a culturilor In placi Petri, a reaqiilor de aglutinare pe lama etc.
Dulapuri cu u~a glisanta, plasate pe mas a ~i sub masa, asigura depozitarea mate-
rialelor necesare fieciirui modul de lucru. Este indicata ancorarea lor la perete.
In spatiile de depozitare sunt necesare rafturi. Pentru sticlarie, medii de cultura ~i
chimicale necorosive, mai convenabile sunt cele din lemn sau aluminiu.

2.5. ECHIPAMENTUL

Repartitia echipamentului de laborator depinde de profilul fiecarui loc de activitate


(tabelu12-1).

42
Tahelul ]-1
Echipamentul compartimentelor din laboratorul de micl"Obiologie clinicii

(A) Sectorul de prelevare a probelor are prevazute incaperi separate pentru venopunctura, pre levari
de urina etc. dotate cu instala1iile, facilitarile, instrumentarul ~i recipientele prevazute conform
precizarilor din Cap. 8-19

(B) Camera pentru receptura prelevatelor patologice


Registre/Computer Incubator de 37C
Stative pentm eprubete Frigider
Tavi pentru t1acoane

(C) Locul de muncii al microbiologului

Anse Incubator
Pensa
Frigider
Tampoane Propipete vaJiate ~i varfuri corespunzatoare
Baghete de lemn Placi din material plastic cu godeuri pentru reaqii
Etalon nefeloll1etric
serologice
Bec de gaz sau incinerator electric Eprubete
Lame ~i lamele de microscop Placi Petri
Platina incalzitoare
Stative pentru eprubete
Stativ pentru colorarii Tavi pentru t1acoane
Batelie de coloranri ~ireactivi pentru microscopie Containere pentru materialul contaminat
Microscop, lupa Bm'cane separate pentru pipete ~i material ll1ic
Centrifuga ~ibalanra pentru echilibrarea tuburilor de laborator contaminat
Trompa de apa Boxa de siguranla antiepidell1ica
Baie de apa

(D) Sectorul pentru spalarea ~i pregatirea sticlariei

Autoclav( e), de preferat vertical(e) cu perete Dulap pentru uscat sticlaria spalata sau, inlipsa,
sill1plu rastele corespunzatoare
Bacuri, Iigheane ~i caldari din plastic, seturi de Etuve
perii ~i instalalie pentru spalat pipete Cutii pentru all1balarea ll1aterialelor de sterilizat
Preferabil, 0 ll1a~ina pentru spalat sticlaria

(E) Sectorul pentru prepararea/conditionarea mediilor de cultura ~i reactivilor

Autoclav(e) Pompa de vid/trompa de apa


Baie de apa ~i de nisip Filtre sterilizante pentru Iichide
Mic incubator de 60C pentru testele biologice Boxa cu curent de aer laminar
de sterilizare Recipiente pentru condilionarea mediilor de
Balanle tehnice, falluaceutice, analitica cultura ~i reactivilor
Agitator electromagnetic

43
2.5.1. Microscoape ~i lupe

Microscopul optic cu fond luminos intra in dotarea fieeami modul de investigaric


microbiologica. 0 lupa de mana este necesara pentm examinarea coloniilor, iar 0 lupa
stereoscopidi faciliteaza unnarirea coloniilor foarte mici.
Pentm microscopia cufond negru cu contrast defaza ~icufluorescenfa este neeesara
o camera obscura.
Amanunte privind microscoapele vezi in Cap. 4.

2.5.2. Incubatoare, bai de apa sau de nisip

Incubatoare de 35-37C cu volume adecvate pot fi repartizate la fiecare modul de


lucm. Cele reglate la alte temperaturi vor fi repartizate numai modulelor un de sunt
necesare ~i pot fi folosite in comun.
Camere termostatate la 35-37C sunt necesare pentm incubarea culturilor In vo-
lume mari sau/~i cu cre~tere lenta (e. g., cultivarea micobacteriilor, hemoculturi etc.).
Pererii vor fi bine izolati tennic, iar u~a glisanta prevazuta cu gamituri de etan$are.
Instalaria de incalzire electridi, tennostatata, trebuie sa asigure repaliiria unifol1na a
temperaturii controlata prin tennometre plasate la 0,5 ~i 2 m de la podea. Supraferele
interioare placate cu material plastic, ca ~i rafturile din aluminiu trebuie sa reziste la
umiditatea proprie acestor incinte, la spalarea ~i decontaminarile frecvente necesare
combaterii prafului ~i dezvoItarii mucegaiurilor.
Baile de apa, pentru inactivarea unor suspensii mierobiene, pentru decom-
plementarea semrilor sau incubarea un or reactii antigen-anticorp, trebuie termostatate $i
prevazute cu capac, preferabil din sticla, inclinat, care pem1ite scurgerea apei de condens.
Baia de nisip tem10statata la 75-85C este necesara pentm coagularea in panta $i
tindalizarea un or medii de cultura.

2.5.3. Refrigeratoare

Frigidere de 4C cu volume corespunzfttoare pot fi repartizate individual sau grupate


pe module de lucru. Canierefrigorifice sunt utile laboratoarelor mari pentru conservarea
mediilor de cultura condirionate pentm lucm, a un or reactivi etc. Conservatoarele de
-25C vor fi instal ate intr-o incapere separata.

2.5.4. Centrifuge

Centrifugele de 3000 x g, care asigura sedimentarea bacteriilor din volume de 15-


50 ml intr-un interval de timp rezonabil, sunt suficiente pentm activitatile curente din
laboratoml de microbiologie. Sunt de preferat cele cu rotor orizontal celor cu rotor an-
gular, pentru ca genereaza l11ai putini aerosoli. Din acelea$i motive de securitate
microbiologica se vor folosi pentm centrifugare numai tuburi eu capac aplicat. Cate 0
centrifuga cu balanta pentm eehilibrarea tuburilor va fi repartizata la fiecare modul unde
se il11punesedil11entarea baeteriilor ~i celulelor (examenullichidului cefalo-rahidian, al
urinei etc.).
44
LL
CD
5000 --
a--, - 8100.
L- 20
.'=
14 10.
10.00020.j
/-2:' U
~
-50.&500
410.200
t
1000
Nen
- rSo.o.
-
l200
-c CD
4000~
6000
.2
-'->CD en OJ-2000
.E! J.'?,
~o.ooo
-3000
N~ en -=
...
"-
-0
~-
-m'"
.13 3J
>
20.000
L.J
E
3)00)
HD -20001000 > 000

[oan

Fig. 2-4. Nomograma pentru caJcularea fortei centrifuge.

Centrifugari la acceleratii mai mari sunt necesare pentru sedimentarea micobac-


teriilor. In figura 2-4 prezentau nomogram a de transfonnare a rotatiilor pe minut in foqa
centrifugaHi relativa (g).

Reguli pentru folosirea centrifugelor


1) Selecteaza 2 tuburi egale intre ele ca lungime ~i grosime. In unul repartizeaza
fluidul de centrifugat, in celalalt apa. pe 0 iniiltime egala, tara a depii~i 0 limita de 2 cm
sub buza tuburilor.
2) Plaseaza tuburile in cupe perechi ale centrifugei ~i a~eaza vertical perechile tub-
cupa in stativul de pe tale1'ele balantei.
3) Folosind 0 pipeta Pasteur toama alcool de 70 in cupa mai u~oara pana la
echilibrare.
4) Plaseaza in rotor, diametral opus, perechile cup a-tub echilibrate.
5) Inchide capacul centrifugei.
6) Mare~te treptat viteza de centrifugare pana la acceleratia dorita.
7) La sfar~it, deschide centrifuga numai dupa oprirea completa a rotorului.
Precautii de respectat
1) Verifica daca amortizoarele de cauciuc sunt in cupe; altfel ri~ti sa spargi tuburile.
2) Verifica echilibrul initial al balantei.
3) Nu echilibra tubu! de centrifugat cu tub de alta fom1a sau CD tub care contine
material solid. De~i masele vor fi egale, pozitia diferita a centrelor de greutate in timpu!
centrifugarii va produce vibratii periculoase prin dezechilibrarea centrifugei.

45
4) Verifica daca ai plasat diametral opus perechile cupa-tub, mai ales la rotoarele
multiloculare.
5) Nu centrifuga material infecrios in tuburi Taracapac ~inu centrifuga in tuburi CLl
dop infundat pentru ca se va infunda ~i mai tare, cele de bumbac piitrunzand in tluidul
din tub.
6) Nu forra cu mana franarea rotorului.

2.5.5. Balante

Sunt necesare Un11atoarele tipuri de balan!e:


Balante tehnice pentru prepararea mediilor de cultura , reactivilor, solutiilor sa-
line ~i soluriilor dezinfectante in volume mari.
Balante farmaceutice pentru prepararea soluriilor colorante ~i a soluliilor de
reactivi sau prepararea un or medii de cultura in volume mici.
Balanta( e) analitica(e} pentru cantarirea precisa a antibioticelor etalon sau unoI'
reactivi in cantitari foarte mici.
Balante pentru echilibrarea tuburilor de centr!fugii: balanle mici cu doua talere
prevazute cu stativ pentru cupe.

2.5.6. Omogenizatoare, agitatoare, dispozitive de triturare


a tesuturilor ~i rupere a celuleJor

Curent, pentru triturarea ~iomogenizarea tesuturilor sunt folosite


l7lojare sau, mai eficace pentru piese mici, tuburi Grijjith (fig. 2-5).
Dupa caz, triturarea lesuturilor se poate face in stare nativii sau
congelata folosind saau ilU substanle abrazive (pulbere de cuar!, sticla
Pyrex etc.). In laboratoarele mari, pentru activitate de cercetare pot fi
folosite ol7logenizatoare de mare vitezii, cu cutite ~i dezinteg ratoarc
Vata
ultrasonice.
Agitatoare recti/inii (cu mi~care de "du-te-vino") sunt folosite
mai des pentru aerarea culturilor bacteriene in bulion. Agilatoare1e
rotative tip" Vortex" sunt utile fiecarui tehnician pentru omogenizarea
127mm tuburilor cu suspensii bacteriene, pentru solvirea rapida a unei
substanle in eprubete, iar cele electromagnetice pentru a favoriza
solvirea unor substanle in flacoane Erlenmeyer, cu volum mediu de
diluant, la 0 temperatura data.

2.5.7. Aparate pentru distilat apa


Fig. 2-5. Tub Grif-
fith pentru omoge-
nizarea probelor
Aparatele pentru distilat apa necesara mediilor de culturii trebuic
biopsice cu dimen- sa fie din sticla borosilicata cu electrozii i20lali inman~on de sticlii.
siuni mid. Pentru alte destinalii apa poate fi distilata ~i in aparate metal ice.

46
Palnie cu capac Filrru
HEPA

o0 oo'rt+Lumina

Pref i ltr u
Pres-
tub
Ventilator
Cauciuc
Varf din
Deflector

Tub Tub de
______ Aer din exrerior
------_ Aer prefiltrat
~
IT\:3rlor ~~ ump\u t
Qstictii ---- . Aer sreri l
Fig. 2-6. Dispozitiv eu Fig. 2-7. Boxii eu aer laminar pentru sigu-
piUnie pentru turnarea rantii mierobiologieii.
mediilor de eulturii.

2.5.8. Distribuitoare pentru medii de cultura

Dispozitivul Cll palnie (fig. 2-6). La 0 palnie cilindrica sau conica de 1-2 litri,
prevazuta cu capac, se adapteaza un tub de cauciuc sau material plastic autoclavabil
tenninat cu un tub de sticla efilat. 0 clema, manipulata manual, deschidc ~i inchidc
circuitul. lntregul dispozitiv, sterilizat la autoclav, este fixat intr-un stativ de rctorta.
Pcrmite repmiizarea in tuburi a unor volume aproximativ egale, prin comparatie cu un
tub martor in care este masurat volumul dorit. Volume egale de mediu se pot repartiza
semiautomat daca la dispozitivul cu palnie se adauga 0 seringa, dar asepsia nu poate fi
garantata, deci dispozitivul nu se folose~te la repmiitia mediilor care nu se mai pot stcriliza
inainte de utilizare.
Pentru reparti~area unar volume exacte de mediu folosim pipete aqionate prin
propipeta electrica. In laboratoarele mari sunt indicate aparate alltomate de repartizat
care functioneaza cu pompa peristaltica sau cu pompa tip seringa aqionate prin pedala,
manual sau electric.
Mediile de cultura care, dupa preparare, nu mai suporta sterilizarea trebuie
repartizate in boxa de protectie microbiologica cu flux de aer laminar (fig. 2-7). in lipsa
acesteia este utila 0 boxa pentru siguranta antiepidemica de clasa II (fig. 2-15) in care
suprafata de lucru este scaldata cu aer steri!.

2.5.9. Containere pentru materialul contaminat

Galeri Cll capac telescopat, din otel inoxidabil, prevazute cu coroana de arificii.
care pot fi inchise ~i deschise, prin rotirea capacului, pentru a permite evacuarea acrului
~i accesul aburului la materiale. Trebuie sa aiba dimensiuni ~i fonml corespunzatoare
autoclavelor din sectorul de spalare a sticlariei; sunt folosite pentru colectarea materialelor
contaminate de la fiecare loc de lucru.

47
Saci din material plastic rezistent sunt folositi pentru colectarea ~itransportul catre
autoclav ~i, subsecvent, la incinerator, a materialelor de unidi folosinta contaminate.
Ace~ti saci vor fi evident marcati: "Materialul de laborator contaminat. Pericol de infcqie".
Vor avea 0 anumita culoare penh'u a nu fi confundati cu sacii In care se transporta halatele
murdare ale personalului de laborator.
Borcane eu solutie dezinfectanta pentru colectarea varfurilor de propipetii
reutilizabile, lame ~i lamele de microscop sau alte articole mici de unica folosintii trebuie
previizute pentlLl fiecare loc de lucm.

2.5.10. Aparatura ~i dispozitive pentru sterilizare ~i dezinfectie


(vezi Capitolul 3)

2.5.11. Incinte (boxe) de siguranta antiepidemica


(vezi 2.6.1.5)

2.5.12. Echipament din sticla, plastic ~i articole mici de laborator

Recipientele utilizate In microbiologie trebuie sa fie din sticla neutra, pentru a nu


altera pH-ul continutului, suficient de groasa ~i tennorezistenta, pentm a evita spargerea
lor ~i contaminarea consecutiva a mediului.
Recipientele din sticlii boro-silicata (Pyrom, Turdaterm, Pyrex sau .lena) sunt celc
mai indicate pentm ca au mare rezistenta la ~ocuri tennice (i'ntre 25 ~i 255C, invers
proportional a cu grosimea) ~i elibereaza cantitati nesemnificative de alcali in solulie.
Sticla ordinara, caleo-sodica are rezistenla redusa la ~ocuri tem1ice (intre 40 ~i
90C) ~i elibereaza alcali In solulii. De aceea flacoanele din sticla calco-sodica sunt
putin rezistente ~i fiecare lot trebuie supus unui tratament pentm neutralizare (vezi 3.3.2).
Articolele din material plastic sunt de doua categorii cu unica folosinta ~i
reutilizabile. Cele cu unica folosinla, cum sunt cutii Petri, containere pentru prelevate
patologice, anse calibrate etc., se distrug prin autoclavare, de aceea sunt ambalate ~i
sterilizate de catre producator. Cele reutilizabile pot fi sterilizate prin autoclavare.
Eprubetele trebuie sa aiba gura dreapta, fiira boruri. Cele mai convenabile
dimensiuni sunt 120/12 mm pentru volume de 2-4 mL mediu, 160/16 111mpentru vo-
lume de 5-10 mL, 200/20 m111pentruvolume de 10-15 mL ~i250/25 mm pentru volume
de 20 mL.
Tuburi de centrifuga cu fund rotund sau conic, din sticla ~i din material plastic.
Tuburile Durham sunt mici tuburi din sticla de 25-30/5-6 mm Inchise la un capat
~i introduse cu gura In jos In mediul de cultura lichid pentru a detecta formarea de gaz.
Baloane cufund plat ~iflacoane Erlenmayer cu volume de la 100 pana la 1000 mL
sunt utilizate pentru pastrarea mediilor de cultura preparate.
Curent, In laboratoarele noastre, epmbete1e ~i flacoanele sunt Inchise cu dopuri de
vata nehidrofila Invelita In tifon. Proteqia lor temporara fala de contaminare poate ~i
asigurata prin acoperire cu foita de aluminiu sau cu hartie. Cea mai sigura este i'nsii
Inchid erea epru bete lor ~i flac9.'lDeJor..pr~!L~s.PSLQ.e_d.e.
..QQ]lpX2E~~niiJI1J~rubate-.Aces tea
sunt fabricate In diferite culari ~i sunt reutilizabile.
48
Curii Petri. Cutiile din sticHi sunt inca larg utilizate. Cele din sticla boro-silicata
nu se zgihie, sunt perfect plate ~i u~or de stivuit, dar sunt scumpe, fragile ~i
:::":,~::Ha
:::1pun atenrie la spalare. Cele din sticla calco-sodica presata sunt mai groase, au fundul
:=.ai muIt sau mai purin convex, cu striuri, se zgarie u~or, dar sunt mai ieftine ~i mai
T~zistente.
Cutiile Petri din material plastic, cu utilizare unica, sunt ieftine, perfect plate, u~or
2~ manipulat ~i stivuit.
Flacoane picuratoare din sticia sunt necesare pentru solutiile colorante sau reactivii
:.:tilizari in reactii calitative.
Recipiente pentru prelevate patologice. Ideale sunt containerele universale,
.:iispozabile, din material plastic, cu volum de 28 mL ~i capac in~urubat. Pentru probele
CD \olum mare sunt indicate borcane rezistente cu capac in~urubat. In lipsa acestor facilitati

se poate recurge la flacoane farmaceutice cu gura larga ~i capac in~urubat, borcane din
s:icla cu volum de 200--400 mL ~i capac in~urubat sau aplicat (mai putin sigur).
Pipete Pasteur. Furnizorii industriali ofera pipete Pasteur din sticla sau poli-
;Jropilena, scurte ~i lungi, cu calibrul de 6-7 mm. Se sterilizeaza, ca ~i pipetele gradate,
ambalate in cutii de aluminiu.
Pipetele gradate din sticla cu capacitate de I, 2, 5, 10 ~i 25 mL se folosesc inchise
cu vata nehidrofiHi la extremitatea de suctiune, pentru a preveni contaminarea fluidului
pipetat cu microbi din propipeta. Eventualele mustati de vata din afara orificiului trebuie
arse in flacara inainte de a adapta pipeta la propipeta, altfel adaptarea nu este etan~a ~i se
pierde din continutul pipetei, cu risc de erori ~i contaminari.
Foarte convenabile sunt pipetele gradate din polipropilena.
Propipetele. In laboratorul de microbiologie aspirarea cu gura a fluidului in pi pete
este interzisa. Pipetarea se face numai cu propipete. Cea mai simpla propipeta este 0
para de cauciuc adaptata la extremitatea de suqiune. Pipetari mai exacte ~i mai comode
pemlite 0 para de cauciuc prevazuta cu supape sau diferite tipuri de propipete automate
eu volum reglabil, la care se adapteaza pipete gradate sau varfuri dispozabile din plastic.
Lame !ji la17lelede microscop. Pentru necesitatile microscopiei, in microbiologie
sunt suficiente lamele cu margini simple, mai ieftine dedit cele cu margini polisate.
Reamintim ca obiectivele putemice sunt corectate numai pentru lamele cu grosimea de
0,17 mm (- Nr. Vz ), care sunt livrate in cutiute cu 100 bucati.
Pentru colOJ'atpreparatele microscopice folosim:
stative din sarnu] ane,yate la tiivi l7letalice el71ailate;
cutii pentru biii de colorant, Borrel pentru colorat 0 singura lama, Laveran pentILl
colm'at simultan 3 lame, Coplin pentru mai muIte lame.
Stative !ji pmzere. Pentru tuburi ~i flacoanele cu medii de cultura sunt indicate stative
autoclavabile din propilena sau metal acoperit cu propilena, care reduc riscul spargerii
eprubetelor, un dezavantaj al stativelor din metal. Stativele din lemn sunt neigienice,
dificil de decontaminat.
Co~urile din sarma sunt riscante pentru incubarea ~i transportul eprubetelor cu
culturi: riscul spargerii ~i al scurgerii lichidului. Pentru eprubete sunt mai convenabile
cutii din propilena, iar pentru flacoane tavi din aluminiu dimensionate pentru 10-100
flacoane, dupa marimea lor. Co~urile din sanna raman rezervate numai recipiente cu
material neinfeqios.

49
Find de 1llSClinlill!areeste confectionat din sarma inoxidabila, de platina sau crom-
nichel, cu grosime in functie de consistenta materialului microbian manipulat. Este fixat
intr-un pOli-fir din metal, care trebuie tinut perfect curat prin frecarea periodica, u~oara,
cu ~mirghel fin a extremitatii inferioare pentru indepartarea materialului carbonizat. Port-
firul din sticla este contraindicat. Find drept (perfect drept) se utilizeaza pentru insa-
mantari prin intepare, ansa (firul buclat la 0 extremitate) pentru insamfmtarea in medii
lichide ~i pentru epuizarea inoculului in striuri pe suprafata medii lor solide, iar fint!
spatulat pentru manipularea coloniilor microbiene cu consistenta ferma (fig. 2-8).
Etaloml de inocul este 0 bagheta din sticla cu diametrul de 3-4 mm, cudata in L
prin incalzire in flacara, la cca 36 mm de extremitate. Folose~te pentru cuantificarea
bacteriilor prin dispersia unifonna, pe placa cu mediu de cultura agarizat, a unui volum dat
de inoculum.
Becuri de gaz
Becul Teclu of era 0 flacara cu temperaturi intre 400-1 OOOC in funqie de aerarea
reglata prin in~urubarea sau de~urubarea placi metalice de la extremitatea inferioara,
tronconica a tubului arzator .
Bead Bunsen ofera 0 flacara cu temperaturi de 700-1000C, functie de aerare,
care se face, la presiunea atmosferica, prin doua orificii diametral opuse la partea
inferioara, cilindrica, a arzatorului
reglate printr-un man~on metalic
rotativ .
Beat! Mecker ofera 0 tlacara
-1::-0 mai mare ~imai fierbinte: de la 700
: la 1200C cand aerarea se face la
~<s.0
.J~~ presiunea atmosferica, prin coroana
~o
~<s. de orificii de la baza cil indrica a
~r.$'
t? i-,Q,
arzatorului sau 1700C cand arderea
..f0rci se intretine cu aer comprimat.
Alte articole de dimensiuni
mici necesare locului de lucru al
~ microbiologului. Pensa de disectie,
Port- Porr-
~{\So 1.'5\1.' (o\\brofa bisturiul, foarfecele pot fi rinute la
fir fir \le \.In mondren
dispozitie i111preunacu ansele intr-
un pahar conic. Tampoane de vata,
similare celor pentru prelevarea
exsudatelor de pe suprafere, sunt
necesare la etalarea inoculului
pentru antibiogra111a difuzimetrica.
Tije port-tampon din le111n(baghete)
sterilizate in cutii de aluminiu sunt
utile pentru manipularea probelor de
Sparula Fir Ansa
sputa. Bucati de panza pentru dezin-
drept fectia curenta a suprafetelor sau
Fig. 2-8. Fire de insamantare ~i modul de calibrare a dupa scurgeri accidentale de mate-
ansei bacteriologice. rial infectios.

50
2.6. REGULI DE COMPORTARE IN LABORATORUL
DE ~nCROBIOLOGIE: REGIMUL ANTlEPIDEMIC, PROTECTIA
MUNCH, PREVENIREA SI STlNGEREA INCENDHLOR

2.6.1. Regimul antiepidemic


Activitatea in laboratoarele de microbiologie implidi riscul contractarii unor infectii.
care pot fi grave. Prevenirea infectiilor de laborator ~i a raspandirii lor eventuale in
colectivitate impune cunoa~terea:
riscului potential reprezentat de microorganismele manipulate;
cailor prin care ele patrund in organism;
metodelor corecte de limitare a accesului acestor microorganisme la caile de
::ransmitere ~i p0l1ile de intrare.

2.6.1.1. Clasifiearea microorganismelor in funetie de riseul infeetios. Organizatia


.\londiala a Sanatatii clasifica agentii infectio~i in patru grupe de rise individual ~i pentru
colectivitate (tabelu12-2).
Tabe/lIl2-2

Clasificarea agen!i1or infec!io~i in "aport ell riseul infee!iei de laborator


(dupa W. H. O. 1983)
Bacterii:
Virusuri:
Grup Individual:
NumaiIndividual:
Nematode
Fungi Rise
redus
moderat
dermatofiti
pentru
(stadii
la manipulari non-propagative
microscopie.
microscopia
gazda Bacilu]
infective).
sau Virusul
Bacilul
Bacillus
Bacilul
oportuni~ti
~i
Brucella
izolare
parazite
Microbi Agenlii difteric
trematode. CML
tetanic
botulinic
anthracis
insamanlarea
~i
Enterovirusuri
pentru
Micobacterii
Bacilulleprei
Spirochete
Virusurile
Yersinia
Fungi
nepatogeni
I
imunocompromisa: identificare
cestode,
prelevatelor
(serologice, protozoare
imul10deficienlei
Rickettsii
om
encefalopatiei
~. condilionate
hepatitei
dimorfi
pestisa.Exemple
pentru B,uzuaHi:pato!ogice:
colorarea
umanc
(tiStaphylococcus
fos, febre patate)
patogene
C sanatos:
adultul posibil oportuni~ti
epidermidis. Badills pentru
Sllblilis.
iBacili
Bacilii
Legionella
virusul dizenterici
vaccinurituberculozei
sponfig01l11evii atenuate
variolei)
amprente]or
Streptococi
Virusul gripal transmisile
de organe):
piogeni etc. I I

51
Tabelul 2-2 (eontinuare)

Numai eand
cand
De individual:
Grup NumaiIndividual: exista
exista
Rise
la inoeulare mare rise
la manipularea
panarise
Omsk, de
de
Virusurileaerosoli:
aerosoli
Coxiella
Virusul
laeulturilor:
identifieare:
materialelor
Riekettsii
Lassa,
Virusul eoneentrare
sau
CML
Francisella
eu seMachupo
bumeti
(tifos.
Burkholderia
Ebola,
febrelor de
manipuleaza
fUlarensis
spori
febre
hepatitei material
infeetan!i
patate) tulpini
(sol.
pselldo1llal/ei
Exemple
hemoragiee:
B. C Junin. euliura Congo-Crimeea.
Marburg,
mare Baeilii
Gonoeoc tubereulozei
rezistente
formelor la antibiotiee:
filal11entoase):
infeqios, eneefalitei
Virusul manipularea Yersinia
fungi
rusedede pestis
dil110rfi
eulturi in eantita!i mari
primiivara-vara

2.6.12. Gii de transmitere ~i porti de intrare in organism ale infectiilor de


laborator. Agen!ii infec!io~i patrund in organism prin mucoasa digestiva (ingestia), prin
plamani (inhalare), prin piele (injectare) ~i prin conjunctiva oculara (tabeluI2-3).

Tabe11l12-3
Doze illfectioase pelltru 25-50% din voluntari
(dupa W. L BARKLEY ~i A. G. WEDUM, 1977)
Boala sau mierobul 57
105
300
180
10~
I10
O~ Doze*
Calea lnhalare
Intradennie
de piitrundere
lngestie
I

* Doza in numar de organisl11e.

RisC1l1 ingestiei de agenti infectio~i apare in cursul pipetarii cu gura, al introdueerii


in gura a degetelor ~i a obiectelor de pe mesele de laborator (creioane, tigari, alimente)
contaminate prin seurgeri sau stropiri neobservate ori insuficient dezinfeetate.
RisC1l1 inhalarii apare la manipulari generatoare de aerosoli ale materialelor
infeqioase (tabelul 2-4). Mari generatoare de aerosoli sunt culturile liofilizate, la
desehiderea sau spargerea fiolelor (1215 particule viabile/m3 aer, respeetiv 43551/m3),
sau spargerea unor flacoane eu cultura (13959 particule viabile/m3).

52
Tobellil 2-4

lIt:i:Jm:gu1 numiirului de particule viabile din e~antioane de aer prelevate in cursul unor proceduri de
laborator sau accidente generatoare de aerosoli
omo-
culturi
in
bumbac
ml
cultura
placa
capacul inoculului
Procedura
cu
insuficient
unei
de
0-5,5de 0-35
77-1246
50 ml
genizator
Decantarea
Introducerea
dopului
pe 30 Procedura
Rangul
culturii
ansei
Spargerea fierbinti 6-24
0-115
80-ISDD
0-20
0,8-5,0
centrifugate
in strans
m1 cultura
100 a unui
in centrifuga Agitarea
tub
:0:::-_"c'd de 50 ml

Stropii de fluid irifecfios ajun~i In achi pot detel111inainfeqii grave.


Transmiterea transcutana a infec!iilor de laborator se poate realiza prin in!epilturi
.::...ace de seringa, pipete Pasteur sau cioburi de sticlil contaminate, prin contaminarea
::lagilor tiliate, zgariate, a abraziunilor, chiar minuscule, nesesizate.
Infecfiile de labaratar sunt cantractate pe cai diferite ~i cu daze mai mari dedit in
--:cd natural. De aceea evalufia lar este atipica ~ifrecvent grava.

2.6.1.3. Clasificarea laboratoarelor In functie de exigent a sigurantei antiinfec-


fioase. Un laborator este autorizat sa manipuleze microorganisme cu un anumit grad de
risc, numai in masura in care personalul este pregi'itit, are dotarile necesare ~i poate
aplica metodele de siguran!a pentru a preveni raspandirea agen!ilor infeqio~i in mediul
unde sunt manipula!i sau men!inu!i. Organiza!ia Mondiala a Sanata!ii a stabilit patru
niveluri de exigen!a: nivelurile 1 ~i 2 eorespund laboratoarelor de baza, nivelul 3 labo-
ratoarelor eu regim restrietiv ~inivelul4 eelor eu regim de maxima restric!ie (tabelul 2-5).
Tobe/1I12-5
Clasificarea laboratoarelor dupa nivelurile de exigen!a
ale sigurantei antiinfec!ioase
(C. D. C. - NIH, 1984; WHO, 1983)
+halat
sau
IV 11
pentru
pcntru
BoxaI
1Ill11aS{l
IINivtl
al+
Nivelul
controlLucru
es3trict
dmaterialelor
Nive12
Iprotectie;
pe LDe
de care
foarte
Nive13Laboratoare
Nivel4 IDin
secundar
BTM* Laboratoare
Laboratoare
Clinice
lucreaza
periculoase
invatamantul BTM
cu
deNivel
saniitate
organisme
ucru de
unica
ie$irii
siguran!a
Iiza
Clasificare pe de
masa
Exemple ana-
micro-+
2dcschisa
publica
protectie
din
Regim
specializate +
folosintaBra.
clasa
de halat,
aerului,
senmalizarea ]]]control
masca,
apelor
boxa
Boxa
$iriscului
acces
activitate de
siguran!a
atclasa
manu$i
reziduale
de siguranla
siguranta
biologic
Exigenle deschisa
activitali
$i imp
din use toate activitatile
generatoare de
aerosoli Echipament de

* BTM = buna tehnica microbiologica.

53
Nivelurile 1 $i 2: laboratoarele de baza in care se
manipuleaza microorganisme cu risc de gradul I ~i 11.
Exigentele privind constructia, instalatiile, mobilierul $i
echipamentul sunt cele prezentate mai sus (revezi 2.3-2.5).
Siguranta antiepidemica este asigurata daca in aceste
conditii de dotare ~i facilitati se utilizeaza 0 bwu[ tehnidl
microbiologica, iar intrarea in toate spatiile cu risc bio-
BIOHAZARD logic este corect marcata (fig. 2-9).
Fig. 2-9. Indicatorul internatio- Nivelul 3: laboratoarele cu regim restrictiv, in care
nal pentru risc biologic.
se manipuleaza microorganisme cu risc de gradul II I.
Exigente:
controlul strict al comunicarii incaperilor, nu se admit tavane false ~i alte comu-
nicari intre incaperi decat prin u~a care poate fi zavonlta;
ventilatie in sens unic cu presiune negativa in camerele de lucru ~ifiltrarea aerului
extras din incaperi;
manipularea microorganismelor numai in boxe de siguranta din clasa I sau II
contra aerosolilor;
semnalarea riscului biologic la intrarea incaperilor ~i acces restrictiv in lncaperi.
Nivelul 4: laboratoarele cu regim de maxima restrictie, in care se manipuleaza
microorganisme cu risc de gradul IV, functioneaza In regim de exigenta speciala care
depa~e~te scopurile acestei carti.

2.6.1.4. Barierele antiinfectioase. In laboratoarele de microbiologie diferentiem


trei bariere antiinfectioase:
barierele primare, care previn raspandirea unui microb in laborator;
bariere secundare, care protejeaza personalul in cazul depa~ii accidentale de
catre microorganisme a barierelor primare;
bariere te11iare, care previn raspandirea in comunitate a l11icroorganismelor care
au depa~it barierele primare ~i secundare.
Barierele primare reunesc tehnici ~i echipamente prin care se previn f0l111areade
aerosoli $i accesul microorganismelor la personal.
1) Toate prelevatele patologice $i umorile organismului sunt potential infectante.
Eticheteaza cu insemnul riscului biologic probele care provin de la pacienti cu SlDA $i
cu hepatitii sau pot contine alte microorganisl11e din grupele III $i IV de risc,
2) Nu pipeta cu gura. Folose$te numai propipete sau dispozitive de pipetare.
3) La locul de lucru, nu introduce in gurii nici un obiect: propipete tubulare, etichete,
creion, pix, tigiiri, pipeta, degete, alil11ente, bauturi.
4) Restrange la strictul necesar folosirea obiectelor ascutite: ace de seringa (daca
pot fi inlocuite cu c311Ule),pipete Pasteur din sticlii (daca pot fi inlocuite cu pipete capilare
din material plastic).
5) Inlocuie~te sticlaria ciobita sau cu fisuri.

54
Alcool2,Scm
peste nlsip

Nisip

Fig. 2-10. Flacon cu alcool ~i nisip Fig. 2-11. Bec Bunsen previizut cu
pentru desciircarea ansei inainte de man~on din tablii inoxidabilii, care
sterilizarea prin ardere la ro~u. previne, la sterilizarea ansei, imprii~-
tierea de particule contaminate.

6) Respeeta intoemai tehniea de eentrifugare a materialului infectios. Centrifugheaza


suspensiile mieroorganismelor din grupurile III ~i IV de rise numai in centrifuga eu eupe
inehise.
7) Folose~te numai anse de inoeulare eomplet inehise, eu bucHi de maximum 3 111111.
pentru a evita descarcarea spontana, ~i firul nu 111ailung de 5 em, pentru a reduce vibratiile
care pot desearea materialulmanipulat.
8) La manipularea eu ansa a materialelor vaseoase (e. g., sputa) sau purin aderente
la spatula (e. g., eulturi de mieobaeterii) desearca firul, inainte de inealzirea la ro~u, intr-un
tlaeon eu nisip spalat ~i alcool de 96 (fig. 2-10). Eviri astfel impra~tierea pe masa de
partieule infeerioase la introdueerea firului in flaeara. Alternativ, pori folosi un bee
Bunsen eu flaeara ineonjurata de un eilindru din tabla inoxidabila (fig. 2-11).
9) Pentru deeantarea supernatantului, dupa eentrifugarea fluidelor eu rise infectios.
folose~te reeipiente care previn raspandirea stropilor eontaminanri (fig. 2-12).

Garnirura
etcn~

2,5 cm In
recipient

5% fenol
Flacm de sticla
Recipient metalic

Fig. 2-12. Vase pentru decantarea supernatantului dupii centrifugarea tluidelor cu risc infecrios.

55
10) Verifica daca omogenizatoarele folosite nu elimina aerosoli in cursul funqio-
narii. Efectueaza toate omogenizarile, inclusiv cele in mojar sau in tub Griffith, pe un
patrat 40/40 cm din hartie de filtru imbibata cu solutie dezinfectanta (vezi 3.2.2).
11) Asigura penn anent la locul de lucru un recipient cu solutie dezinfectanta activa
(vezi 3.3.1).
12) Dezinfecteaza mas a $i suprafetele de lucru la terminarea activitatii $i dupa
mice varsare de produs infectios sau de cate ori suspectezi 0 contaminare accidentaliL
13) La spargerea accidentala a unui recipient cu cultura sau produs patologic.
acopera locul cu 0 panza $i toama deasupra 0 solutie dezinfectanta. Lasa pe loc 30 minute.
Protejeaza mainile cu manu$i $i, folosind un carton rigid, trage resturile pe un fara$
pentru autoclavare.
14) La fiecare loc de lucru:
folose$te galeti cu capac (sau pungi fixate in galeti) pentru colectarea separata a
materialelor reuti]izabi]e $i de unica folosinta contaminate; in]ocuie$te $i autoclaveaza
zi]nic;
asigura borcane cu so]utie dezinfectanta separate pentru pipete $i mici obiecte
reuti]izabile; gole$te-]e zilnic, pentru decontaminare in continuare, $i pune solutie
dezinfectanta proaspata.
15) Nici un material contaminat dupa fo]osire nu parase$te laboratorul inainte de a
fi sterilizat.
16) Manipuleaza microorganisme]e din grupul III de risc numai daca laboratorul
este autorizat $i numai in boxe de siguranta.
17) Folose$te pentru prelevarea $itransportul probe lor numai recipiente rezistente,
de preferat incasabi]e, bine inchise.
18) Pentru expedierea prin pO$ta amba]eaza ~ieticheteaza l11aterialu]infectios con-
fOlm instruqiunilor Organizatiei Mondia]e a Sanatatii, reglel11entarilor po~tale nationale
$i intemationa]e.
Barierele secundare protejeaza persona]ul de microorganisme scapate prin
barierele primare.
1) Poarta tot til11pul activitatii ha]at, $ort $i capelina de proteqie curate, corect
incheiate $i legate. Pastreaza separat echipamentul de proteqie de hainele ~i lenjeria
pentru exterior.
La manipularea probelor provenite de la bolnavi cu hepatita sau SlDA ori care
contin alte microorganisme din grupu] III de risc, poaria $ort din materia] plastic peste
echipamentul de proteqie $i imbraca manu$i chirurgicale din cauciuc.
2) Dezbraca ~i ]asa la locu] de lucru echipamentul de protectie ori de cate ori te
deplasezi in alte zone de activitate (vestiar, birou, cantina etc.).
3) SpaJa mainile dupa manipularea materia]e]or infeqioase $i inainte de a parasi
locu] de lucru. De darit, pentru aceasta, este 0 chiuveta separata de cea de la masa de
]UCIU.

4) Protejeaza sub pansament hidrofug orice solutie de continuitate de pe tegumentul


expus (abraziuni, zgarieturi, taieturi).

56
5 I Supune-te eontrolului medical periodic.
6) Raporteaza ~efului de laborator ~i cabinetului medical orice boala intercurenta.
?:.=.:c fi 0 infeqie profesionala.
'7) Comunica acelora~i autoritati:
sarcina, imediat dupa ce survine: poate eontraindiea manipularea anumitor
::::.::roorgamsme;
eventuale tratamente eu steroizi sau medicamente imunosupresive: pot fi 0
.::cmraindicatie pentru eontinuarea activitatii in mediul eu rise infeqios.
8) Supune-te vaceinarilor programate de eondueerea unitatii.
9) In laboratoarele unde se manipuleaza bacilii tuberculozei, personalul trebuie sa
lIe vaccinat BCG sau controlat tuberculino-pozitiv ~i supus anual controlului radiologic
prcventiv.
Barierele tertiare reunesc eehipamente ~i facilitati de proteetie suplimentara a
personalului ~i preventie a raspandirii agentilor infectio~i in afara laboratorului; boxele
de siguranta antiepidemica, eontrolul eurentilor de aer creati prin instalatii1e de ventilatie
~i incalzire, filtrele exhaustoarelor de aer, instalatiile de neutralizare a apelor reziduale.

2.6.1.5. Boxele de siguranta antiepidemica. Boxele de siguranta microbiologica


au ralul de a capta ~i retine aerosolii infeetanti, care apar in cursul unor manipulari,
protejand astfel personalul de inhalarea aeestora. Se impart in c1ase: I, II, Ill. Cele din
clasele I ~i II folosese pentru manipularea mieraorganismelor din grupul III de risc in
laboratoarele clinice ~i in laboratoarele cu regim restrietiv,
iar cele din elasa III pentru manipularea microorganismelor
Spre
din grupul IV de risc. Operatorul luereaza eu mainile ~i ventilatorul
antebratul in interiorul incintei ~i observa mi~dirile printr-o exhausror
fereastra. +
In boxa de clasa I aerul curat, pus in mi~eare de un I
ventilator, patrunde frontal ~i antreneaza aerosolii printr-un o Indicator penrru
curenrul de aer
filtm care ii retine total sau in cea mai mare parte. Eventualele
paJiieule neretinute de filtm sunt Iaeute inofensive prin dilutie
in atmosfera (fig. 2-13). Boxa este eficienta la un flux al
aerului cu minimum de 0,75 m/secunda. Filtrele trebuie
I
schimbate cand fluxul de aer seade sub aeeasta viteza. Un I
\

indicator de flux ~i un avertizor monitorizeaza funqionarea I


\
boxei. \
"
In boxa de clasa II aeml eurat patmnde filtrat ~i este \ '-
recirculat prin filtre in praportie de 70%, incat supra fata de
lucm este scaldata cu aer praetie steril. Aproximativ 30% --- Aer curar
din aer este eliminat in atmosfera eomplet debarasat de -- - - - Aer contominar
aerosoli ~i este inlocuit cu aer din camera antrenat spre Fig. 2-13. Boxa de c1asa 1
filtre la intrarea boxei tara a ajunge ea atare in aria de lueru pentru siguranta antiepidc-
(fig. 2-14). mica.

57
Pentru 0 funqionare eficienta, in box a se
introduc nUl11ai l11aterialele strict necesare.
_ro- 30% aor ",tea,
./ ManipuHirile se fac in l11ijloculariei de lucru. Sunt
interzise surse de caldura (flacara, microinci-
~ neratoare) pentru ca perturba fluxul de aer: se
lucreaza cu anse dispozabile din material plastic.
/~ Dispersor
Mainile se scot din boxa numai dupa 2-3 minute
QJ rnmrn de la tenninarea lucrului, interval necesar aspirarii
~ I'
cl,( I I II I I
aerosolilor ~i, imediat, sunt spalate pan a la cot
avand la vedere 0 contaminare posibila in cursul
.;2 II' tti~ I
: lucrului.
i
A
I II Al11plasarea boxei de securitate microbio-
I i
logica sau antiepidemica in incaperi trebuie sa
I I I I 1
II l' i I I
\ \I:?
\ \ \\ evite curentii de aer creati prin circulatia persona-
:,dri
, '- -;!,:uu '" V
--E--~--- ~::/,,/
~ __ .J&
lului, de u~a; fereastra sau surse de incalzire.
Amanunte privind verificarea fluxului de aer,
schimbarea filtrelor ~idezinfeqia acestor boxe pot
----- Aer curat fi gasite in cartile tehnice insotitoare.
________ Aer contaminat
Este formal interzis a folosi boxa sterila ell
Fig. 2-14. Boxa de c1asa II pentro sigu-
aer laminar orizontalla manipulari de materia!
ranta antiepidemica. i1~fecrios, pentru ca .fiuxul de aer care scalda
suprafara de lucru este protector spre operator
(v. fig. 2-8).
III
Boxa de cIasa este complet inchis3. Operatorul i~i introduce mainile in aria de
lucru prin m3nu~i fixate etan~ la aparat. Aerul este admis ~i evacuat prin filtre (fig. 2-15).

2.6.1.6. Siguranta fata de substantele inflamabile, combustibile, toxice ~i


corosive. Toate recipientele care contin asemenea substante, ca ~i locurile de depozitare
a lor VOl' fi marc ate prin etichete cu insemne conventionale categoriei (toxic, inflamabil).
Substantele inflamabile sau combustibile
sunt volatile ~idegaja vapori pe suprafata tluidului. Spre 1- -- Aer curat
- - -- Aer contamlnar
Punctul de aprindere este cea mai midi tem- venhlatorul exhaustor I I
peratura la care tensiunea vaporilor degajati de
asemenea substante este suficienta pentru
Filrru HEPA
aprindere.
-Manometru
Substantele inflamabile au punctul de
Pre Filrru
aprindere cuprins intre 22,8C ~i37,2C. In ordinea
descrescatoare a riscului de aprindere putem
retine: eterii ~i acetaldehida; etanolul, acetona ~i
gazolina; alcoolul propilic ~i xilenul.
Substantele combustibile au punctul de
aprindere cuprins rntre 37,8C ~i60C. In ordinea
descrescatoare a riscului de aprindere rerinem:
etilenglicolul $i acidul acetic glacial; anilina, Fig. 2-15. Boxa de c1asa III pentru sigu-
glicerolul ~iuleiul mineral. ranfa antiepidemicii.

58
Depozitarea substantelor inflamabile ~i combustibile se face la adapost de lumina
solara directa, in incaperi bine ventilate, amplasate departe de ie~ire, de surse de caldura,
flacara sau scantei,
in textul ca11ii toti reactivii ~i substantele cu risc la manipulare (toxic, coroziv,
inflamabil etc.) VOl' purta, intre paranteze, mentiunea "precautii".

Precautii la manipularea substantelor chimice cu risc


I) Nu apuea niciodata recipientele de capac.
2) Verifica insemnele de pe eticheta.
3) Evita varsarea ~i stropirea.
4) Este interzisa manipularea substantelor inflamabile langa flacara, dispozitive
care produc scfmtei, beeuri electrice neprotejate cu glob de siguranta, persoane care
fumeaza in inci'ipere.
5) Dupa caz, poarta manu~i ~i ochelari de protectie. Lentilele de contact din masa
plastica pot fi afectate de vapori sau stropi ai unor solventi, de aceea este preeaut sa fie
inlocuite cu ochelari pe durata activitatii in laborator.
6) Nu tuma niciodata apa intr-un acid mineral putemie eoncentrat (e. g., acid sul-
furic). Caldura degajata brusc va impra~tia in jur stropi carosivi.

Precautii la indepartarea chimicalelor uzate


I) Eehipeaza-te cu oehelari protectori, ~ort ~i manu~i protectoare din cauciue.
2) Folose~te 0 ehiuveta din material necorosiv in care eurge, fara a stropi, un jet de
apa rece.
3) Prelinge cel mult 500 ml fluid (reactivi corosivi, solventi hidrosolubili) cat mai
aproape de gura de scurgere, fara a stropi.
4) Lasa apa rece sa curga mai multe minute dupa fiecare fraqiune tumata.
5) Procedeaza ca mai sus ~i pentru cantitati maxime de 100 ml solventi insolubili
in apa.
Pentru neutralizarea ~i indepaltarea unor cantitati mai mari de chimicale consulta
forurile responsabile de protectia mediului.

Masuri la varsarea accidentala a chimicalelor fluide


I) Limiteaza cat mai repede extinderea seurgerii.
2) Utilizeaza un material absorbant pentru a reduce presiunea vaporilor degajati de
sub stante toxice sau inflamabile.
3) Neutralizeaza acizii eu bicarbonat de sodiu.
4) Neutralizeaza alcalii eu solutie 1% de acid boric.
5) Spala apoi suprafata afectata cu apa.
6) Varsarea unar cantitati mari de alcali sau aeizi impune, dupa neutralizare, spalare
ingrijita ~i repetata cu apa din abundenta.

2.6.1. 7. Siguranta fata de curentul electric


I) Tot personalul este obligat sa cunoasca localizarea tabloului electric general ~i
modul de manipulare a intrerupatoarelor aferente. Inlocuirea sigurantelor arse va fi tacuta
numai de catre electricianul autorizat.

59
2) Se interziee folosirea prizelor, ~teeherelor sau transformatoarelor eu eareasa
spmia sau a eonduetorilor improvizati ori eu izolatia alterata.
3) Se interziee folosirea triplu-~teeherelor sau prizelor multiple pentru a nu
suprainearea reteaua electrica.
4) Cordoane prelungitoare pot fi utilizate numai eu aprobarea servieiului tehnie al
spitalului.
5) Cere exeeutarea legliturii eu pamiintul pentru fieeare priza ~i folose~te pentru
coneetare numai ~teehere eu nul de proteqie. Semnaleaza serviciului tehnie, pentru
verifieare de catre electrician autorizat, orice aparat care provoaca la atingere ~oe sau
fumicaturi.

2.6.1.8. Prevenirea ~i stingerea incendiilor


I) Toti salariatii sunt responsabili pentru prevenirea incendiilor $i trebuie sa
cunoasca prin instructaj periodic ~i afi~are:
indatoririle precise care Ie revin in caz de incendiu;
modul de alarmare a personalului, fonnatiei de pompieri a spitalului ~i unitiitii
militare de pompieri;
amplasarea ~i modul de utilizare a tuturor tipurilor de extinetoare;
caile de evacuare a personalului ~i inventarului.
2) Nu pastra in spatiile de lucru reactivi inflamabili in exces fata de strietul necesar
~i resturi de asemenea reactivi.
3) Supravegheaza cu atentie: sursele de ciildura, flaciira deschisa, sursele de sdintei
(motoare, intrerupatoare electrice, frecare sau impact). Cea mai frecventa caliZel a
incendiilor din spitale este fllmatul nesupravegheat, unnat de scurt-circuite elecn"ice.
4) Clasificarea extinctoarelor din dotare, in functie de tipurile de incendii in care
este pennisa utilizarea lor, trebuie cunoscuta de toti salariatii laboratorului. Este pennisa
utilizarea:
extinctoarelor cu apa sub presiune in incendii care implica materiale eombustibile
obi~nuite (lemn, hiirtie, mase plastice, lenjerie);
extillctoarelor cu CO2 :jispuma in incendii care implica fluide inflamabile, griisimi
~i uleiuri minerale;
extinctoarelor de tip chi71lic uscat (pulberi etc.) in incendiile care impl iea
instalatiile electrice, cand exista riscul electrocutarii din eauza conduetibilitatii eleetriee
prin fluide. Niciodata nu folosi in asemenea incendii extinctoare cu apa sau spuma:
tehnici speciale sunt necesare pentru stingerea incendiilor care implica metale
eombustibile (magneziu, potasiu), cand se impune interventia eehipelor speeiaJizate.
5) Impaeheteaza imediat in folie anti-foe orice persoana eu hainele aprinse. In eaz
de aprindere a hainelor este total contraindicata incerearea de salvare prin fuga: curentul
de aer va inteti flaearile. Intinde-te pe jos ~i prin rostogolire pe du~umea inabu~a tlaeiira
pana la sosirea primului ajutor.

2.6.1.9. Alte masuri privind siguranta activitatii 'in laborator


I) Nu fugi $i nici nu merge repede prin laborator, mai ales la intersectiile holurilor.
2) Evita distraetia zgomotoasa ~i gesturile largi, necontrolate.

60
3) Nu desehide u~ile bruse, ei eu preeautie.
4) Cireula pe partea dreapta a euloarelor ~i searilor.
5) Nu bloc a, eu mese, ambalaje sau alte materiale, euloarele. Carueioarele pentru
materia Ie pot fi stationate numai temporar ~ipe 0 singura pmie a euloarului.
6) Observa prezenta pe du~umele a liehidelor varsate, hi'trtiilor, mueurilor de tigara,
eablurilor eleetrice ~i ia imediat masuri pentru indepartarea lor in siguranta.
Seful laboratorului este raspunzator de implementarea ~i respectarea tuturor
masurilor de proteetie antiepidemica, a altor masuri de proteetie a muncii in laborator
~i a masurilor de prevenire ~i stingere a ineendiilor. Faptul ea poate delega unor
anume subordonati sareini privind instruetajele, verificarea cuno~tintelor personalului
~i a masurilor la fiecare loe de lueru, nu 11 exonereaza de niei una din aeeste
responsabilitati.
3. STERILIZAREA, DEZINFECTIA SI SPALAREA
IN CIRCUITUL MATERIALELOR DIN
LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE
(DUMITRU BUIUC)

3.1. STERILIZAREA Necesitatea testelor de eficien(a


3.1.1. Sterilizad prin ciildurii uscata Coeficientul fenolic
Incalzirea la ro~u Testul de capacitate in utilizare Kelsey-
Flam barea
Sykes
Incinerarea
Testarea dezinfectantclor in condilii de
Sterilizarea prin aer cald utilizare
3.1.2. Sterilizari prin ciildurii umeda
Protectia personalului
3.1.2. 1. Steriliziiri la peste] DDoe
3.2.2. Dezinfectantele uwale III laboratoarele
Autoclavul cu perete simplu
Autoclavul vertical cu manta de abur de microbiologie
Autoclavul orizontal cu evacuare gravi- Hipoclori(ii
ta(ionala a aerului Formaldehida
3.1.2.2. Tindalizarea sau sterilizarea fractionatii Glutaraldehida
3.1.3. Filtrarea Detergenrii cationici
3.1.4. Radiatiile ultraviolete Alcoolii
3.1.5. Controlul eficientei sterilizarii Iodoforii
3.1.6. Prezervarea sterilitatii materialelor 3.3. DECONTAMINAREA SI CIRCUITUL
3.2. DEZINFEqIA MATERIALELOR iN LABORATO-
3.2.1. Precautii privind siguranta dezinfec- RUL DE MICROBIOLOGIE
tiei chimice
3.3.1. Colectarea materialelor contaminate
Necesitatea diferentierii dintre "curat" ~i
"murdar" 3.3.2. Tratarea rnaterialelor pentru rcutili-
zare sau dezafectare
Necesitatea penetrarii agentului dezin-
fectant 3.4. ASEPSIA iN MICROBlOLOGIE

Sterilizarea este distrugerea sau indepartarea tuturor microorganismelor, inclusiv


a sporilor.
Dezinfectia este distrugerea formelor vegetative ale microorganismelor, dar nu In
mod necesar ~i a sporilor.

3.1. STERILIZAREA

In laboratoarele de microbiologie ob!inem sterilizarea prin tehnici bazate pe


uTI11iitoriiagen!i:
a) Ciildurii uscatii: Inciilzirea la ro~u;
flambarea;
ll1Cll1erarea;
aer cald.
b) Ciildurii umedii: peste lOODC(autoc1avare);
la sau sub lOODC(tindalizare).
c) Filtrare.
d) Radia!ii ultraviolete.
Sterilizarea chimicii prin oxid de etilen, utilii pentru chirurgie ~i stomatologie, nu
este justificatii in microbiologie.
62
3.1.1. Sterilizari prin dldura uscata

Incalzirea la ro~u este indicata pentru find drept, ansa $i spatula de insamantare.
Flambarea, adica infierbantarea obiectului de sterilizat prin trecerea repetata in flacara
timp de cateva secunde, este indicata pentru, gura eprubetelor $i flacoanelor. Tehnica
este contraindicata pentru sterilizarea obiectelor voluminoase care se incalzesc $i se
r:kesc pre a ineet pentru a fi utilizate imediat (pipete gradate etc.) sau pe care caldura
tlacarii Ie degradeaza (obieete din material plastic, 0tel etc.). ,
lncinerarea presupune arderea eu redueere la eenu$a. In laboratoarele de
microbiologie este indicata pentru materialele dispozabile din plastic, reziduuri organice
solide, gunoiul, cadavrele $i carcasele animalelor de experien!a. Metoda pune probleme
de control al poluarii mediului $i siguran!ei microbiologiee. Cei interesati pot gasi
amanunte privind exigen!ele de construe!ie, de funqionarea $i eontrolul de eficienta a
incineratoarelor din spitale (la care apeleaza uzuallaboratoarele de microbiologie c1inica)
detaliate manuale de specialitate.
Sterilizarea prin aer cald. Judicatz'i: obiecte de laborator din stiela (eprubete.
tlacoane, pipete) sau por!elan (mojare, pistile), seringi Luer din sticla, instrumental'
chirurgical, substan!e grase, pulberi tem10stabile. Contraindicatii: solutii apoase. obiecte
din eauciue sau cu gamituri din cauciuc, seringi din sticla cu metal, tesiituri $i vata din
bumbac sau fibra sintetidi, materiale contaminate din laborator.
Sterilizarea prin aer cald se realizeaza in etuva la 160-l80C timp de 0 ora. Timpul
de sterilizare ere$te peste 0 ora in eazul ambalajelor voluminoase sau obiectelor $i
substan!elor care se incalzesc greu (tabelul 3-1).
rohellil 3- I
Parametrii sterilizi'irii prin aer cald ~i prin vapori de apa sub presiune
I i8
a25
de
60
35-45
25-3018
120-150
50
70
75
20-25 18microbilor
18omorare
25 de egalizare Timpul
17-27
25
45
2-7
7-12
95-125
0 35
50
Timpul'
II ~i volumul
Materialul
volum alopera!iei2
Timpul' in
totalcare este supus
mult
Idem
Ulei de
Soiutii inredus
recipientului)
In
vol.apoase
10
fiole
(maximum permL
dea 10
pima
ambalaje cutie.
I (maximum
la
85% in20eprubete
mlvolumul
voluminoase;
din din volumul
75-80%pulberi in cutii
recipientului)

I Timpul masurat in minute.


2Masurat din momentulln care temperatura din incinta de sterilizare a atins valoarea selectata.
NOTA: Este contraindicat a steriliza concomitent volume mari cu volume mici pentru ca. la aeeea')i
durata de expunere. volumele mici se supraincalzesc, iar cele mari pot ramane nesterilizate.

63
Etuva este 0 incinta cilindrica sau paralelipipedica eu pereti dubli, din tabla.
termoizolanti. Rezistente electriee ~i un termostat permit mentinerea constanta a
temperaturii selectate, unifonnizata in incinta de sterilizare printr-un sistem de ventilatie.
Obiectele de sterilizat se a~eaza in etuva pe rafturi din sita metalica.
Procedura:
1) A~eaza obiectele pregatite pentm sterilizare (vezi mai jos) pe rafturi, tara a
umple incinta la refuz ~irespectand mici spatii inh'e ambalaje pentm circulatia nestanjenita
a aemlui cald.
2) Inchide u~a aparatului, desehide orificiile de ventilatie ~i conecteaza aparatul Ia
reteaua elech'ica. Etuvele mari au ventilator eu palete, care porne~te 0 data cu rezistentele
electrice.
3) Marcheaza timpul de sterilizare (confom1 tabelului 3-1) din momentul In care
tern10metml indica 160-180C,
4) Scoate obiectele sterilizate numai dupa racirea aparatului.
Exista etuve automate cu afi~area continua a parametrilor sterilizarii.

3.1.2. Sterilizari prin caldura umeda

3.1.2.1. Sterilizari la peste 1OOe. Utilizam autoclave in care vapOlii de apa saturati
realizeaza 115C la 0,5 atmosfere, 121C la 0 atmosfera ~i 134C la 2 atmosfere. Prezenta
aemlui compromite sterilizarea: vaporii de apa, mai u~ori, incalzesc partea superioara a
incintei, iar aeml, mai greu, ramane in partea inferioara cu temperaturi insuficiente penn'u
sterilizare. Parametrii sterilizarii la autoclav sunt prezentati in tabelul 3-1.

Autoclavul este un cazan cu pereti rezistenti in care, dupa inchiderea etan$a cu un


capac masiv, pres at cu buloane sau cu un sistem cabestan, vaporii de apa se comprima Ia
presiunea necesara sterilizarii.
A) Autoclavele eu perete simplu pot fi veliicale sau orizontale. Sunt cele mai
indicate pentm sterilizarea solutiilor ~i materialului eontaminat din laborator. Aici se
mai sterilizeaza sticlaria pentm culturi de celule $i aparatele de filtrare.
La aeest tip de autoclave vaporii provin din apa aflata In cazanul de presiune $i
patrund in camera de sterilizare de jos in sus prin suportul de tabla perforata pe care se
a$eaza obiectele de sterilizat. Un manometru controleaza presiunea din interiorul
cazanului. Un robinet de vapori, aflat in parte a superioara a autoelavului, pune In legatura
cazanul cu exteriorul. Un al doilea robinet, aflat la partea inferioara, permite evacuarea
apei din cazan. 0 supapa de siguranta evacueaza vaporii cand presiunea lor depa$e$te
limita de securitate. Cazanul este cuprins intr-un man$on de tabla groasa, care la partea
inferioara formeaza un loca$ pentm adaptarea sursei de caldura (fig. 3-1).
Procedura:
1) Toama apa distilata in cazan, prin incinta de sterilizare, pc'ma la 2-3 em sub
nivelul suportului.
2) A$eaza pe suport obiectele de sterilizat in ambalajul lor. Ambalajele sunt:
flaeoane, eprubete, cO$uri pentru eprubete $i flacoane mici, cutii, casolete, h.liie pentru
impachetarea unoI' obiecte, galeti sau saci din plastic tennorezistent pentru materialul de
64

~~
laborator contaminat. lntrodu flacoanele cu Valva de siguran,fci
capacul semiin~urubat, casoletele cu orifi-
.~ - (/ """11I::._,

ciile deschise, galetile rura capac. J/ Aer- - --."


3) inchide etan~ capacul stnlngand
buloanele diametral opus, intai cu mana, ./
apoi complet cu 0 parghie. /;~~<>~
1;- - - - ~" ~
'--'
t I Manometru
4) Conecteaza sursa de caldura.
5) Deschide robinetul pentru eva- evacuare
r\\ \ \ \
CAMERA . it
II
euarea aerului. Odata cu vaporii de apa, prin Valva de 1\ \ \\ I

robinetul deschis, se evacueaza ~i aerul din


incinta de sterilizare, asigurand astfel 0 con- :i
vectie putemica: vaporii in contact cu obiec-
:~~~~r
~~\ + t 11\ t\ tIIt )1 I
Abur
tele reci Ie cedeaza caldura ~i se conden-
seaza, presiunea lor tinde sa scada ~i atrage \ \ I
alta cantitate de vapori care transporta ~i Placa
~rforata
cedeaza caldura ~. a. m. d. Aprecierea co-
recta a evacuarii aerului se face cufundand
intr-un vas cu apa rece un tub de eauciuc
adaptat la robinetul de vapori. Aerul este
complet evacuat din incinta de sterilizare Fig. 3-1. Autoclavul vertical cu perete simplu.
cand inceteaza a mai barbota prin apa.
6) inchide robinetul de evacuare a aerului.
7) Cfmd presiunea ajunge la valoarea aleasa, regleaza sursa de caldura pentru a
mentine aceasta presiune pe toata durata timpului de sterilizare (tabelul 3-1).
8) Intrerupe sursa de caldura ~i lasa aparatul sa se raceasca pfma cand manometrul
indica 0 (presiune atmosferica). Numai in acest moment deschide lent robinetul de vapori,
apoi cazanul. Nu deschide autoclavul cat timp presiunea este peste eea atmosferica,
pentru ca liehidele fierbinti vor fierbe exploziv ~i se pot sparge flacoanele.
9) Lasa materialele, pentru uscare, in autoclavul deschis. Cand materialele ajung
la cea 80C pot fi scoase. Aceasta dureaza, functie de volumul ambalajelor ~ivascozitatea
solutiilor. Flacoanele mari cu mediu de cultura agarizat pot necesita ~i cateva ore.
Dezavantaje: In ambalaje pot persista pungi cu aer . Cantitatea mare de eondens
in cursul sterilizarii . Uscarea dificila dupa sterilizare, care impune 0 serie de precautii
(e. g., evitarea contactului obiectelor ambalate in hartie cu supra fete nesterile pfma la
perfecta uscare a ambalajului).
B) Autoclavele eu manta de abur sunt concepute pentru sterilizarea materialelor
chirurgicale din bumbac, obiecte ~i instrumente din eauciuc, instrumentar metalic, etc ..
pentru ca asigura uscarea rapida ~iperfecta a materialelor sterilizate. Pot fi verticale sau
orizontale.
in lipsa unui autoclav cu perete simplu, pot fi utilizate ~ipentru sterilizarea solutiilor
sau altor materiale din laborator .
AutoclavlIl vertical Cli manta de abur. Vaporii de apa provin din rezervorul
de apa plasat in partea inferioara a cazanului de presiune ~i patrund in incinta de

65
Valva de siguranta sterilizare, de sus in jos, dupa ce au
trecut prin mantaua de abur ~i au
Incalzit-o (fig. 3-2). In acest autoclav
Valva de gasim unnatoarele accesorii In plus
evacuare
fata de autocIavul cu perete simplu: 0
a aerului
->1" I' \ i
nlor ~
!?i vapo- (\

Mano-
metru
S?
i~
;jAb~J"
r\,' ((CAME~"
I I
palnie de alimentare ~i 0 niveUi pentru
controlul apei din sursa de vapori.
robinete care pun in comunicare sursa
de vapori cu aceste piese, un robinet
I ~ i' I
A\\~I::i de evacuare a aburului ~i un robinet
, \; It 'I'I,'j
I '1
I I

I :: ' ~
r , III
I

::
I
1 prin care se elimina apa de condens
acumulata In partea decliva a incintei
I : I I I
II ,: Aer ; I de sterilizare.
Nivela
Proeedura:
1) Deschide robinetele piUniei
de alimentare cu apa ~i ale nivelei.
2) Toama apa distilata in rezer-
VOl' pana la marca indkata pe nivela.
3) A~eaza in incinta de steri-
lizare materialele in ambalajele lor.
4) Inchide etan~ capacul cazanului.
5) Conecteaza sursa la caldura.
6) Deschide robinetul pentru evacuarea aerului ~i inchide toate celelalte robinete
ale aparatului.
Pelltru sterilizarea solutWor procedeaza in continuare ca la autocIavul cu perete
simplu, etapele 5-9. In acest caz nu operezi deloc nici cu robinetul de evacuare a aburului,
nici cu cel de evacuare a condensului (raman inchise).
Pentru sterilizarea materialelor ehirurgieale, seringilor, sticlariei eu destinatie
speeialii, dupa epuizarea timpului de sterilizare:
- intrerupe sursa de caldura,
- deschide robinetul de evacuare a aburului ~i, cfmd presiunea a coborat la 0,5
atmosfere,
- deschide robinetul pentru evacuarea condensului, iar cand presiunea a coborat
la zero,
- deschide capacul autoclavului,
- scoate casoletele ~i Inchide orificiile numai dupa ce s-au racit in autoclav. In caz
contrar, prin racire In exterior, pana la 0 treil1le din volul1lullor va absorbi aer atl1losferic
contaminat.
Autoclavul orizolltal eu evaeuare gravitationala a aerului poate fi cilindric sau
rectangular. U~a se Inchide cu sistem cabestan (fig. 3-3).
Vaporii proveniti din sursa exterioara cu mare presiune trec spre manta ~i incinta
de sterilizare printr-un regulator de presiune.

66
Filtru

Spre fX)ffifEde vid


sau ejector de <bur

Termo -
metru

y'l,," non-relur
Fig. 3-3. Autoclavul orizontal eu evaeuare gravitationala a aburului.

Aburul este obligat sa patrunda prin partea superioara a incintei de sterilizare,


fortand astfel aerul ~i condensul sa se scurga gravitational prin conducta de la partea
inferioara a incintei, care este prevazuta cu site pentru retinerea impuritatilor.
Valve termostatice (capcane pentru abur pur) asigura retinerea in incinta de
sterilizare ~i manta numai a aburului pur. Ele se deschid cand temperatura scade cu mai
mult de 2e sub cea a aburului pur ~i evacueaza automat aerul ~i condensul. Se reinchid
cand temperatura revine la 0 diferenta mai mica decat 2e fata de cea a aburului pur.
Un termometru indica temperatura aburului din canalul de scurgere deasupra
capcanei de abur, cat mai aproape de partea inferioara a incintei de sterilizare.
Un sistem de vacuum favorizeaza uscarea final a a materialelor sterilizate, iar un
sistem de racire previne fierberea violenta a lichidelor ~i gr[ibe~te scaderea presiunii la
sfar~itul sterilizarii.
Procedura:
1) Prin admisie de abur, incalze~te mantaua pana la temperatura de sterilizare.
Reduci astfel formarea condensului in incinta de sterilizare ~i grabe~ti uscarea tinala.
2) Plaseaza in incinta autoclavului materiale1e de sterilizat ~i inchide u~a etan~..
3) Deschide accesul vaporilor de apa in incinta de sterilizare cu valva canalului de
evacuare a aerului ~i condensului deschisa.
4) Unnare~te termometrul canalului de evacuare a incintei de sterilizare. Cand
atinge temperatura selectata pentru sterilizare (uzual 5-10 minute) marcheaza timpul de
sterilizare conform indicatiilor din tabe1ul 3-1. Indicatiile manometrului sunt mai putin
fidele pentru ca nu atesta prezenta aburului pur in incinta.
NOTA. Curata zilnic sitele canalului de evacuare pentru a-i asigura penneabilitatea perfecta.

67
5) La epuizarea timpului de sterilizare: opre~te accesul vaporilor in incinta de
sterilizare, dar continua circularea lor prin manta.
La sterilizarea sohl{iilor: lasa presiunea sa scada pana la zero In incinta de sterilizare.
Pierderea de caldura prin u~a Taramanta a autoclavu1ui realizeaza scaderea presiunii in
10-30 minute, in raport cu volumele de lichid sterilizate. La volume mari de medii agarizate
scaderea presiunii poate dura mai mult de 0 ora, ceea ce poate degrada mediile termo-
sensibi1e. Autoc1avele modeme sunt prevazute cu sisteme de racire a flacoanclor tara
fierbere exploziva. In lipsa acestora, la sfar~itu1 operatiunii racirea poate fa grabita prin
deschiderea foarte lenta a valvei de evacuare a incintei.
La sterilizarea materialelor chirurgicale ~i seringilor:
- Scaderea presiunii in incinta de sterilizare este provocata prin deschiderea
imediata a valvei de evacuare. Uscarea poate fi grabita prin aqionarea sistemului de
vacuum.
- Deschiderea autoc1avului se face numai dupa ruperea vidului din incinta de
sterilizare prin deschiderea valvei de acces a aerului filtrat. Casoletele trebuie sa se
raceasca in autoc1av aproape de temperatura camerei.
Protecfia operatorului.
1) Nu deschide capacul autoc1avului inainte de coborarea presiunii la zero ~i
deschiderea 1enta a robinetului de evacuare a incintei. Volume1e mari de solutii pot avea
Inca pese lOODC~i 1a contactul cu aeru11a presiunea atmosferica pot exploda.
2) Pentru deschiderea capacului, echipeaza-te cu manu~i protectoare tem10izolante
~i protejeaza fata cu un vizor care acopera de asemenea pielea gatu1ui ~i pieptul.
Autoclave1e modeme, incalzite prin rezistente electrice, sunt programate
semi automat sau automat. Pot fi prevazute cu sonda ten110electrica ~isistem de inregistrare
continua a parametrilor sterilizarii.

3.1.2.2. TindaIizarea san sterilizarea fractionata evita Incalzirea la temperaturi


peste 100De.
Principiu: In medii care permit gem1inarea spori1or, inca1ziri repetate omoara atat
f0l111elevegetative existente initia, cat ~i pe cele gel111inatedin spori in intervalele dintre
incalziri.
Indicatii: Sterilizarea unor medii de culturii, alimente.
Necesar. Autoclav: pentru tindalizare la lOODC,in vapori fluenti (autoc1avare cu
robinetul pentru vapori deschis); baia de apa sau de nisip: pentru tindalizari sub 100De.
Procedura: Substantele de sterilizat, in volume mai mici de 1 litru, se mentin 30-
60 minute, 3-8 zi1e consecutiv, la temperatura impusa de compozitia lor. In intervalele
dintre incalziri recipientele cu substante1e supuse steriliziirii se mentin la temperatura
camerei pentru gen11inarea sporilor.

3.1.3. Filtrarea

Filtrarea este trecerea unui fluid printr-un corp poras, filtru. Filtrele Cll porozitiiti
convenabi1e pot debarasa de microorganisme fluidu1 filtrat, acestea fiind retinute mecanic
~i electrostatic in porii filUll1ui. Metoda este indicata pentru decontaminarea bacteriana

68
;;i fungidi a aerului, a unor medii de cultura pentru microorganisme, reactivi care nu
suporta incalziri. Filtre]e c]asice, confectionate din porte]an sau pamant de infuzorii ori
sticla poroasa (filtre Schott) sunt astazi in]ocuite prin membrane filtrante din acetat de
celuloza cu porozitati intre ] ;;i 0,025 mm. 0 membrana cu porozitatea de 0,22 mm
retine toate bacterii]e.
Pentru utilizare, membrane]e filtrante sunt fixate pe un supOli perforat din ote!
inoxidabi] ;;i montate intre partea superioara ;;i eea inferioara a unei pa]nii adaptate la
sistemu] de filtrare prin presiune negativa sau pozitiva. Membrana impreuna cu palnia
montate ]a recipientu] de co]ectare a fluidu]ui filtrat sunt sterilizate in prea]abi] ]a autoclav.
Filtre]e mici pot fi adaptate ]a seringi (filtrare prin presiune pozitiva) sau la un tub de
centrifuga (filtrare gravitationaHi). Pentru a evita co]matarea porilor, suspensiile cu mare
densitate a particu]e]or sunt prefiltrate printr-un materia] fibros sau granular.
Filtrele HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters) sunt fo]osite pentru
sterilizarea aerului in boxe]e de siguranta antiepidemica, a ee]or cu aer laminar etc.

3 .1A. Radiatiile ultraviolete (UV)

wmpile gennicide sunt tuburi din stic1a specia]a in care descareari]e e]ectriee 1ntr-o
atmosfera cu vapori de mercur la joasa presiune genereaza radiatii uv. Aproximativ
95% din radiatia lampi]or cu vapori de mercur ]a joasa presiune are ]ungimea de undii
gennicida de 253,7 nm. La aceasta se adaugii un mic pro cent de radiatie cu lungimea de
unda de 184,9 nm produeiitoare de ozon cu efect de asemenea germieid. Cantitatea de
ozon produsa de lampile germicide utilizate in spitale ;;i laboratoare nu depa;;e~te
eoncentratia periculoasa de 0 parte la 10 milioane ;;i seade progresiv cu varsta lampii.
La alegerea intensitatii lampilor ;;i a timpului necesar de expunere trebuie tinut
cont ca intensitatea radiatiei UV variaza invers proportional cu piitratul distantei de la
sursa.
Viata de funqionare a lampilor gem1ieide uzua]e este de 100 de ore, dar scade mai
repede dupa aprinderi freevente. Cand intensitatea radiatiei UV produse scade sub 60(/,,0
din cea nominala (dupa cea 3/4 din timpul prevazut), lampi]e trebuie sehimbate. Lampi
speciale cu catod rece au 0 viata mai lunga.
Pentru a ]e mentine efectu] gem1icid maxima], lampile trebuie periodic euratate
prin ;;tergere cu 0 carpa moale umezita in alcoo] sau amoniac ;;i apa.
In laboratorul de microbiologie, radiatiile UV fac parte din sistemu] barierelor
secundare antiepidemice. Cum inhalarea este 0 modalitate frecventa de transmitere a
infectiilor de laborator, instal area de ]ampi gennicide este indicata pentru:
Reducerea incarcaturii microbiene a spatiilor de ]ucm. Lampi gem1icide sunt
montate la partea superioara a peretilor ~i, separate de incapere prin ecran opac.
functioneaza pe durata activitatii. Sistemu] de conditionare a aeru]ui asigura trecerea
pem1anenta a microbilor din aer prin raza de actiune a lampilor.
Constituirea unei bariere protectoare intre aria cu anima]e inoculate, boxe]e de
necropsie etc., ;;i personalul de laborator sau animale sanatoase.
Laboratoarele care nu dispun de boxe cu aer laminar sau boxe pentru siguranta
antiepidemica pot folosi, pentru repartizarea medii]or de cu]tura sau alte manipu]ari
aseptice, boxe sau hote cu aerul ;;i suprafete]e sterilizate prin radiatii Uv.

69
3.1.5. Controlul eficientei sterilizarii

Se face prin indicatori fizici (manometru, tennometru), chimiei (tabelul 3-2) ~i


biologici. Indicatorii jizici .)i chimici nu dau indicatii asupra timpului cat s-a l11entinut
temperatura de sterilizare. Indicatorii biologici, tuburi eu fire de bumbae impregnate eu
spori de Bacillus stearotermophilus ~i uscate (pentru etuve) sau fiole cu suspensie de B.
stearotermophilus (pentru autoclave) au 0 mare fidelitate. Dupa sterilizare se testeaza
viabilitatea sporilor prin insamfmtarea lor in medii de eultura adecvate.
lndicatori chimici ~i biologici sunt in prezent comercializati diferentiati pentru
etuve ~i autoclave.
Tabelul3-2

Indicatori chimici pentru sterilizarea prin caldura


PentruPunctu]
autociav
Tiouree
de
180-182C
Punctul fuziune
121-122C
134aC
120aC
180aC
IISoC
Su Substanta
Ifametoxipiridazinii Pentru etuva
ribromfenol

Tuburi cu indicatori chimici sau biologici se plaseaza la diferite nivele ale ineintei
de sterilizare, in eentrul ambalajului. Uzual, sterilizarea fiecarui lot de l11aterialese testeaza
prin indicatori fizici ~i chimici, iar saptamanal aparatele sunt verificate prin indicatori
biologici.

3.1.6. Prezervarea sterilitatii materialelor

Se face diferentiat in functie de natura materialului ~i metoda de sterilizare.


Eprubetele ~iflacoanele se sterilizeaza prevazute cu dopuri de vata ~itifon, protejate
cu eapi~on de hartie sau foita de aluminiu. Fomie eficienta este protejarea prin capac
in~urubat.
Pipetele gradate se sterilizeaza prevazute cu filtru de vata, invelite individual in
benzi de hartie pergament sau grupate in cutii din tabla de aluminiu prevazute cu capac
~i amortizor din vata de stic1a pentru protectia varfurilor.
Placile Petri se sterilizeaza invelite, individual sau grupate, in hartie pergament.
Mojarele ~i pistilele se invelesc separat in hartie.
Umezirea ambalajelor de hartie, a dopurilor ~i filtrelor din vata compromite
sterilitatea. Sporii fungici, omniprezenti in pulberile de contaminare a dopurilor ~i
al11balajelor,gennineaza in conditii de umezeala, iar hifele lor se dezvolta in profunzime,
patrund ~i elibereaza spori care eontamineaza continutul.

3.2. DEZINFECTIA

Dezinfectia in laboratorul de microbiologie utilizeaza in principal agentii chimici,


sub stante cu efect antimicrobian nespecific. Asemenea substante Ie numim dezil(fectanle,
daca din cauza efectelor iritante ori toxice Ie putem aplica numai pe suprafete inerte, ~i

70
antiseptice, daca toxicitatea mai redusa permite aplicarea lor pe tegument, unele mucoase
sau phlgi. Dneori, aceea~i substanta (e.g., cloramina B) in solutii diluate este antiseptic,
iar in solutii mai concentrate dezinfectant.
Agentii chimici de dezinfectie difera prin eficienta antimicrobiana, activitatea in
prezenta substantelor organ ice ~itoxicitate. Cele mai sensibile la substantele dezinfectante
sunt organismele in fonna vegetativa (bacterii, fungi, protozoare) ~i virusurile cu inveli~
lipidic; relativ rezistente sunt micobacteriile ~i virusurile nude, iar endosporii bacterieni
~i multi dintre sporii fungici sunt foarte rezistenti (tabelul 3-3).
Tabel1l13-3

Proprietiitile unor substante dezinfectante uzuale in laboratorul de microbiologie


+
+++
NP+++
+
+0--
+
+++
"0++++
++
++
+++1
+++
+++1
+++"
0.;::
2 A
G-
~
-
+0...0..
0..
-
;:;
<: ,,"
+
+++
++
+++
.D
+ <:
OJ
+
e0...
<u
0...
';) '"
Cl A+.~+0~~U
"-'
.:::
,-
I:...+~ +++
~+0 "-' Toxicitate
.~
IS
en Active
r:n"-'
contra de
Inactivate
~
rf) ;a
.",
...e.o
"-'
'" + c" .g
~ ~~
<OJ

amoniu cuatemar

1 Peste 40"e +++=bun NP = neprecizat


Peste 200e ++= mediu G=Gram
+ = slab e = cationic
-= de loc A = anionic

3.2.1. Precautii privind siguranta dezinfectiei chimice

Necesitatea diferentierii dintre "curat" ~i "murdar"


Prezenta substantelor organice reduce eficienta antimicrobiana a dezinfectantelor.
De aceea, in regimul lor de utilizare diferentiem conditia "cural" de "murdar". Prin
"curat" intelegem lipsa substantelor organice, care poate fi realizata prin spalarea
suprafetelor cu apa ~i sapun sau detergenti. Prin "murdar" intelegem prezenta substantelor
organice (e.g., lenjerie murdara, supra fete contaminate cu sange, excrete, produse
patologice, culturi microbiene). Frecvent nu putem realiza spalarea inaintea dezinfeqiei.
Ca atare pentru dezinfectie vom utiliza solutii antimicrobiene mai concentrate in
circumstanta - "murdar" decat in circumstanta "curat".
Din acelea~i ratiuni, nu introduce mainile in solutia antiseptica, ci toarna solutia
antiseptica peste maini.
Necesitatea penetriirii agentului dezinfectant in anfractuozitatile ~i porii
echipamentului contaminat impune 0 buna etalare ~i dispersie a echipamentului expus la
agentii in fonna gazoasa (e.g., formaldehida), cufundarea completa cu indepartarea bulelor
de aer in solutiile dezinfectante.

71
Necesitatea testeJor de eficienta a dezinfectanteJor
Testari efectuate de produceitor ~i de laboratoarele de referin{a atesta capacitatea
antimicrobiana a dezinfeetantelor ~i stabilitatea soIutiilor.
Coeficientul fenolic arata cu cat este mai activ un compus fenoIie in comparatie eu
fenolul pur. Testul Rideal- Walker detennina coeficientuI fenolie eu substante pure, iar
testul Chick-Martin iI detennina in prezenta de substanta organiea. Coefieientul fenolie
se exprima printr-o cifra unnata de initialele R. W. sau C. M., care precizeaza eonditiiJe
de testare. Substantele cu coefieienti fenolici mai mari au efeet antimicrobian mai mare.
CoeficientuI fenolic C. M. este mai mic decat ceI R. W. din eauza testarii in prezenta de
substanta organica.
Testul de capacitate fll utilizarea Kelsey-Sykes este mai adecvat diversitatii actuale
a substantelor dezinfectante. TestuI reproduce circumstantele de utilizare "curat" ~i
"murdar" prin adaugarea Ia dilutiile testate de substanta organica. Testul Kelsey-Sykes
precizeaza coneentratiile de dezinfectant indicate pentru situatiile "eurat" sau "murdar".
Amanuntele privind testarea depa$ese scopurile acestui capitol. Cei interesati pot consulta
lucrari de referinta cum ar fi KELSEY ~i MAURER (I974) sau excelenta sinteza a lui
POLl ~i colab. (1979).
Testarea dezi'~fectantelor III cOlldifiile de utilizare revine fiecarui laborator ~i se
impune ca test periodic.
Principiu: Prezenta unui numar redus de microorganisme viabile in solutia unui
dezinfectant este posibila, depa~irea unei anumite limite indica insa defieienta in
prepararea, manipularea sau conservarea soIutiei.
Necesar:
- pipete gradate de 1 mL sterile,
- flacoane de 25 mL sterile eu capac in~urubat,
- diluant neutralizant (tabelul 3-4),
- propipeta de 20 mL
- plaei eu agar nutritiv.
Ti:lbelllI3-4

Diluantii neutralizanti pentru testarea dezinfectantelor in conditii de utilizare

DiluantuI GrupuI de Aldehide


Iodofori
substante dezinfectante
3% W/vAlcooli Fenoli + detergenti
Feno!i
Compu~i
Hipocloriti
Hipoclorit de+ amoniu cuatemar
detergenri

Procedura:
1) Preleva aseptic 1 mL solutie dezinfectanta din fiecare bore an sau galeata folosind
pipete separate. Prelevarile se fac din containerele cu solutii stoe diluate pentru utilizare,
borcanele ~i containerele cu echipament contaminat (pipete, lame de microseop,
instrumente etc.), galetile eu carpa sau peria pentru du~umeIe etc.

72
2) Transvazeaza fiecare proM de 1 mL solutie dezinfectanHi in dite un recipient cu
9 ml diluat neutralizant, marcat pentru identificarea probei, ~i omogenizeaza.
3) ]n interval de cel mult 0 ora dupa omogenizarea probe lor de dezinfectant, preleva
eu pipete Pasteur separate un mie volum din fiecare amestec dezinfectant-diluant
neutralizant ~i insamanteaza, in spotun separate, cate 0,2 mL pe suprafata bine uscata a
doua placi cu agar nutritiv.
4) Incubeaza cele doua pliici astfel:
Una timp de trei zile la 32 sau 37C. Bacteriile patogene cultiva optimla 37C,
dar celor afectate prin dezinfectant Ie poate fi mai convenabila temperatura de 32C.
A doua timp de 7 zile la temperatura camerei pentru cultivarea bacteriilor saprofite
~i a fungilor.
5) Numara coloniile dezvoltate pe spoturile de insamantare.
Inte Ip retare:

Numaru Illllcroorgamsme
. Ior / m I = NxD, _ ,
solutie dezinfectanta Volumul msamantat
unde: N = numar de colonii;
D = factorul de dilutie (inversul dilutiei);
Volumul insamantat = 0,2 mL.
Deei, dacii am numarat 6 colonii, in solutia dezinfeetanta verificata au fost
6x 10= 300 mieroorganisme viabile / mL. Peste 250 mieroorganisme viabile / mL indica
0,2
o solutie dezinfectanta ineficienta.
Protectia personalului. Multe dezinfectante sunt iritante pentru oehi, caile
respiratorii, piele. La manipularea substantelor stoe pentru prepararea solutiilor, operatorul
va purta, dupa caz, manu~i ~i ochelari de protectie.

3.2.2. Dezinfectante uzuale in laboratoarele de microbiologie

Hipocloritii sunt comercializati ca solutii pentru uz industrial sau in laboratoare


(100 000 ppm clor activ) sau pentru uz casnic (10 000 sau 50 000 ppm clor activ). Pentru
uz casnic sunt de asemenea Iivrati hipoeloriti in forma solida, tabletata. Toate aeeste
preparate pot fi utilizate in laborator daca se tine cont de concentratia in elor activo Au
eject germicid asupra unei game largi de microorganisme, bacterii in f0l111avegetativa
(inelusiv micobacterii), fungi, spori, virusuri. Activitatea antimicrobiana scade mult in
prezenta proteinelor, altor sub stante organice ~imaselor plastice. Detergentii ii inactiveaza.
Indica{ii: Dezinfectia suprafetelor, borcane pentru pipete ~i echipament mic
contaminat.
Concentratia indicata a solutiei
Circumstanta dezinfectante (ppm elor activ)
Suprafete relativ curate 1 000
Borcane pentru pipete contaminate 2500
Suprafete contaminate cu sange 10 000

Solutiile raman active 24 ore.

73
COlltrailldicafii: Corodeaza metalele. Nu se aplica pe suprafe!ele metalice ale
centrifugelor ~i aparaturii supusa la solicitiiri mecanice.
Precau!ii: Efecte iritante, functie de concentratie, asupra pielii, ochilor, cailor
respiratorii.
Derivati fenolici. Efectul gennicid se limiteaza la bacterii In fonna vegetativa
(inclusiv micobacterii) ~i fungi, nu este afectat de proteine, dar eficienta scade pe
suprafetele de cauciuc, lemn sau material plastic. Sunt ineficienti asupra sporilor ~i
virusurilor nude.
Indicafii: Dezinfectia suprafetelor, borcane pentru pipete ~i echipament mic
contaminat. Solutiile 1% sunt indicate pentru circumstante "curate", cele 2-5% pentru
circumstan!e "murdare". Solutiile se schimba la 24 ore.
Precaufii: Efect iritant posibil asupra ochilor ~i pielii.
Formaldehida este un gaz foarte iritant, stabil numai la temperaturi peste 80C; la
temperatura camerei polimerizeazii repede ~i formeazii pe suprafete un depozit atb. Se
comercializeaza sub doua fonne:
parafonnaldehida, polimer solid, alb, cu miros u~or intepiitor din cauza degajarii
de formaldehida;
formolul, solutie apoasii 37-48% de formaldehida stabilizata cu 8-15% metanol
contra polimerizarii la temperaturi mai joase.
Efectul germicid putemic se extinde asupra tuturor microorganismelor, Tara a fi
inactivat de proteine sau detergenti.
Forme de uti/hare ~i illdicafii:
I) Forma gazoasa este indicata pentru dezinfectia suprafetelor, echipamentului ~i
efectelor care nu pot fi udate. Principala indica!ie in laboratorul de microbiologie este
dezinfectia periodicii a boxelor de securitate microbiologica.
Are efect antimicrobian mai putemic la temperaturi peste 20C ~i umiditate mai
mare de 60% (optimii 80-90%). Se obtine prin incalzirea fonnolului (un volum formol +
2 volume apii In fierbiitor electric) sau parafonnaldehidei (pe re~ou electric). Concentratii
maxime de 2 g fomlaldehida per m3 se obtin, la 20C, dar suficienta pentru dezinfectie
este concentratia de 0,05 g/m3 Pentru dezinfectia unei boxe de securitate microbiologica
(cca 0,3-0,4 m3) sunt suficienti 25 ml fonnoI sau 3-4 g paraformaldehida, iar pentru
ind'iperi 15 ml fonnol/m3 aer.
Penetrabilitatea fomlei gazoase este redusa, ca atare suprafe!eIe supuse dezinfectiei
trebuie bine etalate. Fonnaldehida fiind foarte iritantii, boxeIe pentru dezinfeqie vor fi
inchise etan~. ParafomlaIdehida depusa pe suprafe!ele dezinfectante emite timp indelungat
vapori iritanti, ceea ce impune fie aerisirea prelungitii, fie neutraIizarea paraf01111aldehidei
prin vapori de amoniac.
2) Solzqii cu 4% formaIdehidii (fonnol diIuat I110) sau mai concentrate (pana ]a
10%) sunt indicate pentru dezinfectia suprafeteIor sau culturilor microbiene. Solutii1e
0,04- 1% sunt foIosite pentru inactivarea suspensiilor bacteriene aglutinabile.
Glutaraldehida are efect alltimicrobian foarte bun (inclusiv asupra virusurilor
hepatitei B, C), neinfluentat de proteine. Se utilizeaza in concentratii de 2% activata in
solutie alcalina (tamponatii cu bicarbonat de sodiu lapH 7,5-8,5). Este indicata pentru
dezinfectia suprafeteIor metal ice pe care nu Ie corodeaza. De~i este mai put in iritanta
decat fomlaIdehida, contactul cu pielea ~i conjunctivita trebuie prevenit.

74
Detergentii cationici sunt compu~i de amoniu cuatemar activi asupra bacteriilor
(mai ales gram-pozitive), mai putin asupra fungi lor ~i inactivi asupra micobacteriilor ~i
sporilor. Sunt inactivati de proteine, alte sub stante organice, mase plastice, detergenti
anionici ~i sapunuri. Solutii apoase 1-2% sunt larg utilizate pentru spalarea (agenti
tensioactivi de udare ~i spumanti) ~i dezinfectia suprafetelor. Nu corodeaza metalele, nu
sunt toxici, nici iritanti.
Alcoolii utilizati pentru dezinfectie sunt etanolul ~i propanolul in solutii apoase
70-80%. Au efect antimicrobian relativ lent ~isunt ineficienti asupra fungilor ~i sporilor.
Nu sunt inactivati de proteine sau detergenti, iar activitatea antimicrobiana cre~te mult
prin asociere cu hipoeloriti (la concentratie finala de 2.000 ppm elor activ) sau cu formol
(10% formol in alcool 70%). EvWi contactul direct al tegumentului cu asemenea solutii.
Protejeaza-te cu manu~i de cauciuc.
Sunt utilizati ca atare, mai bine in amestec cu hipoeloriti sau formol, pentru
dezinfectia suprafetelor ~ipentru echilibrarea cupelor de centrifuga. A1coolii sunt iritanti
pentru conjunctiva, dar nu afecteaza pie lea nom1ala.
Iodoforii (iodo = iod; phor = purtator; purtator de iod) sunt detergenti neionici din
clasa propilenglicolilor, care complexeaza iodul ~i, in solutii apoase, 11elibereaza lent Cll
efecte germicide asupra bacteriilor (inelusiv micobacteriile), fungilor, sporilor ~i
virusurilor cu inveli~ lipidic sau nude. Sunt fnsa inactivati de proteine ~i alte substante
organice, mase plastice ~i detergenti anionici. In solutii apoase eu 75-150 ppm iod pot fi
utilizati in borcanele pentru pipete ~i eehipament contaminat, pentru dezinfeqia supra-
fetelor, iar solutiile in 50% alcool cu 1 600 ppm iod au efecte sporocide ~i sunt utilizate
penu'U antiseptizarea mainilor. Petele Eisate de iodofori pe piele ~i suprafetele sunt u~or
fndepartate cu 0 solutie de tiosulfat de sodiu.
La manipularea iodoforilor trebuie evitat contactul cu conjunctiva.

3.3. DECONTAMINAREA SI CIRCUITUL MATERIALELOR


IN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

Este interzis ca materialele contaminate sa paraseasca laboratorul sau sa patrunda


in ariile cu activitate "curata" din laborator.
Prima bariera de aparare antiinfectioasa care se aplica este dezinfectia echipamen-
tului contaminat de la masa de lucru, cat mai curand completata prin autoclavare sau
incinerare finaHi. Culturile bacteriene nu trec prin dezinfectie, bariera cu eficienta greu
de control at in aceasta conditie, ci trec direct la autoclavare.

3.3.1. Colectarea materialelor contaminate

Galeti Cll capac pentru colectarea recipientelor cu culturi sau resturi de prelevate
patologice. Trebuie sa fie lipsite de fisuri sau gauri pentru a se evita scurgeri contaminante
periculoase. Sigure sunt galetile din otel inoxidabil sau din plastic rezistent la autoclavare
(polipropilena). Nu trebuie sa fie mai adanci de 25 cm, pentru a pem1ite 0 buna penetrare
a vaporilor de apa, iar diametrul corespunziitor unei manipulari facile in autoclav.
Niciodata nu se vor umple pana la refuz.

75
Pungile din plastic autoclavabil este de dorit sa dubleze interiorul galetilor. Trebuie
sa fie rezistente ~i manipulate atent pentru a evita spargerea sau ruperea. Legate la gura
eu sanna, VOl' fi transportate in camera de sortare impreuna cu galeata suport. Galetile ~i
pungile colectoare trebuie marcate distinct pentru materialul reutilizabil ~i pentru cel
dispozabil.
Boreanele en solntie dezinfeetanta stau pe masa de lucru pentru colectarea
echipamentului mic contaminat ~i, separat, a pipetelor contaminate. Prea frecvent sunt
alese ~i manipulate incorect.
Alegerea borcanelor. Cele din sticla sunt casabile ~i, ca atare, periculoase. De
preferat sunt recipientele rezistente din polipropilena. Pentru echipamentul mic convin
borcane de llitru cu capac in~urubat (permite in final inclinari repetate, pentru imersarea
completa a articolelor supuse dezinfectiei). Borcanele inalte trebuie sa permita imersarea
completa a pipetelor tara riscul scurgerilor contaminante.
Umplerea Cll solllfie dezinfectantii. Borcanele pentru echipamentul mic VOl' fi
marcate cu vopsea la nivelul de 750 mL. eu 0 mensura se introduce in borc::mdezinfectant
in cantitate suficienta sa asigure concentratia recomandata pentru "circumstanta murdar"
dupa completarea volumului la 750 mL cu diluant.
La fel se procedeaza ~i cu borcanele pentru pipete, tinand cont de volumul lor.
Adaugarea unui detergent compatibil cu dezinfectantul utilizat (tabelul 3-3) u~ureaza
spalarea final a a pipetelor.
Utilizarea corectii a solufiilor dezinfectante
1) Nu supraincarca, pentru a evita scurgeri contaminante la mobilizarea borcanului.
2) Nu introduce obiecte care plutesc decat dad pot fi umplute ~i imersate complet
sau daca borcanul are capac ~i poate fi inclinat repetat.
3) Nu introduce materiale cu continut proteic mare, ci colecteaza-Ie separat pentru
autoclavare directa.
4) Nu dilua dezinfectantul prin scurgeri de lichide. Pentru supematantul din tuburile
de centrifuga folose~te un container separat cu solutie mai concentrata de dezinfectare ~i
prevazut cu palnie pentru retinerea aerosolilor contaminanti (fig. 2-12).
5) Nu lasa mai mult de 24 de ore materia1ele in solutia dezinfectanta ~i nu refolosi
solutia pentru ca se pot selecta ~i inmulti bacterii de contaminare rezistente.
6) Solutii1e dezinfectante nefolosite 24 de ore se arunca.

3.3.2. Tratarea materialelor pentru reutilizare sau dezafectare

Barierele antiinfectioase prin care trece materialul contaminat din laborator in


vederea reutilizarii sau dezafectarii sunt marcate in figura 3-4. lncinerarea materialelor
neautoclavate ori nedezinfectate este admisa numai sub supravegherea laboratorului.
Intr-un incinerator tara supraveghere speciala pot ramane necarbonizate parti de animale
(blana, pene, intestine) sau alte materiale. Dezinfectia cu ~untarea autoclavarii este admisa
numai pentru pipetele gradate.
Circuitul materialelor contaminate de la mesele de lucru pana la dezafectare sau
reutilizare (fig. 3-5) este organizat ~i supravegheat de ~efullaboratorului pentru a preveni
incruci~ari cu materialele decontaminate sau sterile ~iie~irea din laborator a unor materiale
contaminate.

76
___ ca~O\JITA UZUALA
NUMAI INCINERATOR CONTROLAT
DE LABDRATOR
-----'IPETE GRADATE

Fig. 3-4. Fluxul de tratare a materialelor contaminate din


laboratorul de microbiologie .

.......... NUHAI INCINERATOR


CONTROLAT DE LABrnATOR

Fig. 3-5. Circuitul materialelor in laboratorul de microbiologie de


la modulul de lucrn pana la dezafectare sau reutilizare.

La inn"area in sectorul de pregiitire a materialului (fig. 2-2) se rezerva 0 masa


pentru recep!ia containerelor cu materialele contaminate.
Autoclave separate sunt prevazute penn-u sterilizarea materialelor contaminate de
aruncat ~i a materialelor reutilizabile. Galerile se introduc in autoclav, tara capac, iar
pungile dezlegate, deschise 1a gura ~i men!inute in containerul lor. Dispunerea
containerelor in incinta de sterilizare trebuie sa asigure acces libel' vaporilor de apa.
Sticlaria contaminata. Dupa autoclavare mediul de cultura este scurs sau raclat
din recipiente. Unneaza spalarea mecanica sau manuala cu apa calda ~i detergent. Pentru
spalarea manuala sunt necesare: un set de pelii adaptate fiecarui tip de recipient (eprubete,
baloane etc.), 0 chiuveta adanca (bac) cu doua compartimente - unul pentru spalare,
altul pentru clatire, ~i ligheane din plastic pentru clatirea finala cu apa distilata sau
deionizata.
Gamiturile din cauciuc pentru etall~area capacelor fn~urubate VOl'fi scoase, spalate
separat intr-o strecuratoare, ~i reasamblate dupa uscarea ambelor piese.
Sticlaria calco-sodidi noua poate fi neutralizata prin imersare peste noapte In
solu!ie 1% de acid clorhidric. Pentru verificare, un e~antion din fiecare lot va fi umplut
cu apa neutra plus cateva picaturi dintr-un indicator de pH adecvat. Dupa autoclavare

77
pH-ul trebuie sa ramana nesehimbat sau sa ereasea eel mult eu 0,5 unitati. In eontinuare
spalarea ~i sterilizarea pentru utilizare se fae ea ~i in eazul stielariei in uz.
Materialele decontaminate numai in solutie dezinfectanta. Dupa ce au fost
mentinute imersate peste noapte in solutia dezinfectanta sunt manipulate in eontinuare
eu mana protejata in manu~a de caueiuc.
Pipetele gradate sunt seoase din solu!ia dezinfeetanta, dopul de vata este aspirat
printr-un tub de eaueiue eu eapcanii eoneetat la trompa de apii sau este seos eu un carlig
fin ~i sunt introduse in dispozitivul de spalare prin apa sub presiune sau prin sifonari
repetate.
Echipamentul mic este retinut intr-o streeuriitoare din polipropilena dupa scurgerea
boreanului in ehiuveta eonectata la fosa septica. La aceea~i chiuveta se scurg ~iboreanele
din care au fost scoase pipetele. Strecuriitoarea eu continutul ei este apoi plasata intr-un
container pentru autoclavare.
Pregatirea lamelor i lamelelor de microscop: 4.2.4.1.
Borcanele colectoare, golite de solu!ia dezinfectanta, sunt autoclavate pentru
distrugerea eontaminantilor reziduali.
Incinerarea
Cat timp laboratoarele noastre nu dispun de incinerator special supravegheat de
personal calificat corespunzator, este precaut a incinera numai materiale autoclavate,
care nu sunt acceptate de serviciul de salubritate. Pentru a preveni poluari periculoase
este de dorit ca masele plastice sa fie sub 20% din materialul incinerat.

3.4. ASEPSIA IN MICROBIOLOGIE

Asepsie inseamna manipulare la adapost de microorganisme.


Pentru 0 manipulare aseptica uzuala de material microbian se lucreaza la adapost
de curen!ii de aer ~i se respectii urmatoarele exigente:
1) Ordoneaza pe masa echipamentul strict necesar.
2) A~eaza-te comod pe scaun cu antebratele complet pe blatul mesei ~i fa toate
mi~ciirile sub controlul vederii.
3) Tine ansa in mana dreapta, ca pe un creion, de extremitatea opusa firului.
4) Tine in mana stanga recipientul din care prelevi sau in care unneaza sa introduci
materialul manipulat, cat mai aproape de extremitatea inferioara, incat conlinutul ~i
traiectul ansei sa ramana sub controlul vederii.
5) Scoate dopul recipientului cuprinzandu-I intre auricularul, inelarul ~ipalma mainii
drepte. Daca nu lucrezi in boxa de securitate microbiologica din clasa II sau Ill, men!ine
inclinat recipientul tara dop pentru a preveni depunerea de pulberi in interior. Similar,
evita sa !ii expusa orizontal suprafata placilor cu mediu agarizat.
6) Sterilizeaza prin flambare gura recipientelor inchise cu vata.
7) Introdus ansa in recipient pentru prelevarea sau depunerea materialului micro-
bian. Evita cu atentie atingerea cu ansa a gurii ~iperetilor in zona superioara a recipientului.
8) lmediat dupa retragerea ansei, flambeaza gura recipientului ~i introdus dopul
sau in~urubeaza capacul.
9) Resterilizeaza ansa.

78
La mallipuliiri cu pipete gradate:
Dadi sunt invelite individual in hartie, rupe ambalajul prin riisucire la mijlocul
pipetei. Scoate jumiitatea ambalajului dinspre extremitatea inchisii cu vatii, introdu pipeta
in propipeta apoi scoate jumiitatea ambalajului dinspre varf.
Cand utilizezi pipete cu volum mai mare de 5 ml este f0TI11alcontraindicatii
schimbarea pozitiei pipetei inciircate de la verticalla oblic (inertia mare a coloanei de
fluid poate provoca stropiri). In aceste cazuri este indicat ca scoaterea dopurilor sii fie
fiicuta de ciitre un ajutor.
Manipularea asepticii in boxele de sigurantii antiepidemica are cateva pm1icularitiiti
care decurg din restrictia privind utilizarea fliiciirii: utilizarea anselor disponibile din
plastic, utilizarea tuburilor cu capac in~urubat.
Repartizarea aseptica a mediilor de cultunl se face, ideal, In boxe sterile cu flux
orizontal de aer laminar (fig. 2-8). In lipsa boxei cu aer laminar, pentru repartizarea
aseptica a mediilor de culturii se pot folosi boxele de sigurantii antiepidemicii din cJasa 11
unde aerul piitrunde vertical In aria de lucru dupa filtrare (fig. 2-16).
4. MICROSCOPIE
(DUMITRU BUIUC)

4.1. MICROSCOPUL OPTIC 4.2.3. Incidente frecvente in microscopie ~i


4.1.1. Definitie ~i principiul de function are remedierea lor
4.1.2. Descrierea microscopului optic 4.2.4. Preparate microscopice
4.1.2.1. Partea mecanicii 4.2.4.1. Pregiitirea lamelor .ii lamelor de
4.1.2.2. Sistemll! optic microscop
4.1.2.3. Sistemll! de illllninare 4.2.4.2. Preparate microscopicI' llmede
4.2.4.3. Preparate microscopicI' colorate
4.1.3. Amplasarea microscoapelor
4.3. METODE SPECIALE DE
4.2. MICROSCOPIA OPTIC:&' PE CAMP
MICROSCOPIE OPTICA
LUMINOS
4.3.1. Microscopia pe fond negru
4.2.1. Iluminarea ~i focusarea imaginii
4.3.2. Microscopia cu contrast de fazii
4.2.2. Intretinerea microscopului 4.3.3. Microscopia cu fluorescentii

In microbiologia clinica, microscopul este indispensabil. Microscopia uzuala 0


facem cu fond ]uminos. Numai In circum stante speciale recurgem 1a microscopia cu
fond negru, cu contrast de faza sau cu fluorescenta.

4.1. MICROSCOPUL OPTIC

4.1.1. Definitia ~i principiul de functionare

Microscopu] este format, In esenta, din doua sisteme de Ientile cup]ate: a) obiec-
tivu], sistem de Ientile cu distanta focala de ordinulmm, situat catre obiectu] examinat ~i
b) ocularul, sistem de Ientile cu distanta focal a de ordinul cm, situat catre ochiul exa-
minatoru]ui. Obiectivu] fonneaza imagine a primara, real a, marita. Ocularu] funqioneaza
ca 0 ]upa: reia imaginea primara, fom1ata imediat Inauntrul distantei sale foca]e, ~i 0
transfonna In imagine virtua]a, InuIt maritii, rastumata ~i obtinuta ]a distanta minima a
vederii clare a observatorului: 20-25 cm (fig. 4-1).
aU
I...
'-~

I 8. - .'"
I -I'
I I _ - _
I iI --~~-~~--
_-_----- I I

t.-=_
: ..~~~_p_-=---::::-:-
I - - Ii !I

A" l-o-L~-~-:I-/f-iv-l ~~7/Jjf g{~1:/


Fig. 4-1. Principiul de functionare al microscopului optic.
AB = obiectul. F, = focamI obiectivuIui. A'B' = imaginea reaJa, miirita ~irastumatii a obiectivului
plasatii la 0 distantii mai micii deciit distanta focal a a oculallllui, mai aproape de focal'. F,=
focarul ocularului. A"B" = imaginea virtuala mult marita ~i rastumata, in raport cu obiectul.

80
13
12

11

14
10
9

8
15
7
16
6
17
5 18
19
20
4 21
22
23

24

25

Fig. 4-2. Schema microscopului de laborator ML-4M produs Industria Optica Romilna.
I) Rozeta pentm manipularea filtrului mat (vedere par[iala). 2) Sursa de lumina. 3) Butoanele
pentru centrarea filamentu]ui sursei de lumina. 4) Corpu] ansamb]u]ui mi~carilor. 5) Butonul
mi~carii grosiere. 6) ]ndice ~irepere pentru cursa mi~carii fine. 7) Bra\Ul microscopului. 8) Supor[ii
reg]abili pentru fixarea ]amei. 9) Obiective. ] 0) Capu] revolver. I]) Capul binocular. 12)
Dispozitivul inelar pentru coreClia ametropiei ocu]are (ine]ul de ajustare a dioptriilor). 13) Ocu-
Jar. ]4) Butonul pentru fixarea capu]ui binocular. IS) Masa port-obiect. 16) Condensor. ] 7)
Butonul de fix are a condensoru]ui. ] 8) Parghia diafragmei de apertura. ] 9) Butoanele telescopate
pentm mobilizarea mesei. 20) Butonu] mi~carii fine. 2]) Butonul de focalizare a condensorului.
22) Loca~u] tl]trelor. 23) Rozeta diafragmei de camp. 24) Butoane]e pentru reglarea oglinzii.
25) Talpa microscopului.

4.1.2. Descrierea microscopului optic

Orice microscop are In compunere 0 parte mecanicii, un sistem optic ~i un sistem


de ilul11inare. Detalii privind fonna ~i amplasarea diferitelor cOl11ponente ale acestor
sisteme pot varia in raport cu produsul fiecarei fim1e. Axam descrierea pe l11icroscopul
de laborator ML-4M care era produs de industria optica din Romania (fig. 4-2) ~i mai
functioneaza Inca 111mai l11ultelaboratoare.

81
4.1.2.1. Partea mecanicii. Talpa (25) este suportul care asigura stabilitatea
aparatului. Pe talpa este fixat cOlpul ansamblului mi.)carilor (4) care poarta:
Bra{ul microscopului (7) pe. care este fixat suportul sistemului optic, tllblll
microscopullli. Deplasarea bratului pe vertical a, prin dispozitivele defocalizare grosiera
.)ifina actionate prin butoane (respectiv 5 ~i 20), asigura mi~carea tubului in axuJ optic.
Butonul mi~carii fine are tamburul divizat in 50 de unitati, fiecare corespmmind la 0
mi~care de 0,002 mm a tubului. Mi~carea diviziunilor se umlare~te in raport cu indicele
triunghiular de referinta, gravat pe un inel concentric cu butonul mi~carii fine ~i fix at pe
corpul ansamblului mi~carilor. Limitele domeniului de luau al mi.)cariijine (cca 1,7 mm)
sunt gravate prin doua repere pe corpul ansamblului mi~carilor .)i un indice pe culisa
mi~carii fine (6). lndicele trebuie adus in mijlocul cursei marcata prin cele doua repere.
A~a pastram pemlanent capacitatea de deplasare a tubului in cele doua sensuri.
Suportul condensorilor actionat pentru focalizare printr-un buton (21).
Masa port-obiect (15) prevazuta cu 0 deschidere centrala pentru iluminarea
obiectului, supor{i reglabili pentru jixarea lamei port-obiect (8) ~i doua butoane
concentrice (19) care controleaza mi~carea transversala ~ilongitudinal a a mesei cu precizie
de 0, I mm urmarita prin sistem vemier pentru fiecare directie.
4.1.2.2. Sistemul optic. Obiectivele (9) se adapteaza la partea inferioara a tubului
printr-un cap revolver (10) cu ajutorul diruia pot fi aduse, pe rand, in axul optic al
microscopului. Pozitionarea corecta a obiectivului in axul optic este semnalata printr-un
dedic. Ocularele (13) sunt adaptate, prin telescopare, la paliea superioara a tubului.
Capul binocular (11) este prevazut cu prisme pentru schimbarea directiei faseiculului
luminos ~idivizarea lui catre cele doua oculare, care se pot adapta la distanta interpupilara
a examinatorului. Tubul ocularului stang este prevazut eu un dispozitiv inelar pentru
corec{ia ametropiei ochilor (12).
Puterea de marire a microscopului se calculeaza multiplicand puterea de marire a
obiectivului cu cea a ocuJarului ~ia capului binocular (valori gravate pe montura fiecareia
dintre aceste piese). Puterea de marire se exprima printr-un numar care arata de cate ori
diamehlll imaginii este mai mare decat diametrul obiectului real.
Distan{a de luau a obiectivului se exprima prin distanta dintre lentila obiectivului,
cand acesta este focalizat pe un preparat sub!ire, ~i suprafata lameJei de acoperire a
preparatului. Cu cat este mai mare puterea unui obiectiv, cu atat este mai mica distanta
de lucru. De aceea in cursul focalizarii imaginii, pentru a evita spargerea preparatului ~i
degrad area lentilei obiectivului prin apasare excesivii pe lama, obiectivele cu marire
putemicii trebuie manipulate cu atentie.
Profunzimeafocala. Grosimea preparatului care poate fi viizutii la un moment dat
in focar, ca ~i aria investigata a preparatului scad 0 data cu distanta focala a obiectivului.
De aceea pentru examenul de ansamblu al unui preparat sunt indicate obiective cu putere
de miirire mica (profunzime focala mare), iar pentru examenul detaliilor, obiective
putemice (profunzime focala mica).
Marirea uti/a este marirea care ofera 0 imagine cu detalii a obiectului real. Cand
depa~e~te 0 anumita limita, miirirea nu mai ofera aceste detalii ~i devine marire goala,
inutilizabilii. Miirirea utila a microscopului depinde de puterea de rezolutie a obiectivului.
Ecuatia care define~te puterea de rezolu!ie a obiectivlllui este:
A
d = 2AN'

82
unde: Axuloptic

d = cea mai mica distantii dintre doua puncte


luminoase ale preparatului pentru care obiectivul mai
ObiectlV
formeaza in ochiul examinatorului imagini distincte
(puterea de rezolutie);
A = lungimea de unda a luminii utilizate (domeniul
vizibi1400-750 nm);
AN = apeltura numerica a obiectivului.
Apertllra l111meridi a obiectivului exprima cantitatea
de lumina utilizata pentru fonnarea imaginii. Ea rezulta din
ecuatia:
An = n . sin a, Prepararul
microscopic
unde:
n = indicele de refraqie al mediului dintre obiect ~i
lentila obiectivului;
a = semiunghiul de deschidere allentilei, unghi cu Sursa de lumina
varful in focar (fig. 4-3).
Fig. 4-3. Reprezen tare
Obieetivele llseate, la care mediul dintre obiect ~i schematica a unghiului de
lentila obiectivului este aerul, au apertura numerica teoretica aperturii.
maxima 1,0: indicele de refractie al aerului = 1, iar sin 90
= 1 (valoarea maxima a unghiului a cand lentila obiectivului este aplicata pe obiect).
Apertura numerica maxima practica a obiectivelor uscate este insa 0,95.
Obieetivele ell imersie, la care mediul dintre obiect ~ilentila obiectivului are indicele
de refraqie mai mare decat al aerului ~i apropiat de cel al sticlei, ca uleiul de cedru eu
11 = 1,515, egal eu al stic1ei crown (fig. 4-4). Apertura numeric a maxima este realizata la

obiectivele apocromate: 1,4. Obiectivele cu imersie acromate, utilizate cure nt, au apertura
numerica de 1,25 sau 1,30.
Calitatea imaginii depinde ~i de capacitatea definitorie a obiectivului, capacitatea
acestuia de a forma imagini eu contur net, precis. Capaeitatea definitorie a obiectivllllli
se asigura prin corectarea aberatiilor sferica (fig. 4-5) ~i cromatica (fig. 4-5) a lentilelor.
Obieetivele acromate au aberatia cromatica corectata prin suprapunerea focarului
a doua radiatii (fig. 4-7). Sunt obiectivele utilizate curent in microscopie.
Obiectivele apocromate au aberatia cromatica corectatii prin suprapunerea focarului
a trei radiatii ~i toto data au apertura numeric a maxima.
Pentru a putea alege obiectivul care asigura cele mai bune performante intr-un
scop dat, pe montura fiecarui obiectiv sunt gravate: puterea de marire, apeltura numerica,
coreqia aberatiilor (mentiunea apocromat, cele acromate, uzuale, fiind tara mentiune
speciala), lungimea mecanicii a tubului (160 mm) ~igrosimea lamelei de acoperire pentru
care este corectat obiectivul (uzual 0,17 mm). Microscopia curenta in microbiologie
c1inica necesita umlatoarele obiective acromate 6X/0,l; 1OX/0,30; 20X/0.4; 40X/0,65
~i 90X/1,25 ori 1,30 lU la care asociem, dupa necesitatile de marire, oculare 5X, 7X
sau lOX.

83
ll31;J 6
@
2

r~&~
I I SUfSa rJe /um/fla

Fig. 4-4. Principiul de function are al obiectivului cn imersie: uleiul de cedru dintre preparat ~ilentila
frontalii a obiectivului previne pierderea prin refractie a razelor cu valoare 'in formarea imaginii
(razele 1-5), imaginea apare cu detalii pe camp microscopic bine luminat. Prin refractie in aer, in lipsa
uleiului de cedru, 0 parte din razele cn valoare in formarea imaginii sunt pierdute (razele 7-9)
imaginea apare siiracii 'in detalii pe camp microscopic insuficient luminat.

-i! IFs.
~~U-J~
I
A
FjlI I ~
dI

b
I
8
Fig. 4-5. Aberatia sferid. Zonele inelare ale lentilei au focare proprii, mai apropiate pentru zonelc
periferice decM pentru cele centrale.
Pe ecranul AB, in Fj imaginea punctului luminos L apare cu 0 aureola relativ mare ~i slaba. Dcplas3nd
ecranul spre FJ ajung"em intr-o pozirie ab in care imaginea punctului L este cea mai neta (diametru minim ~i
iluminare relativ unifoll11a). 0 asemenea corectie a aberariei sferice se nume~te "prin lipsa", spre deoscbirc
de corectia prin asociere de Ientile, care este "prin exces" (cre~te distanra focala a zonelor marginale ale
lentilei dincolo de cea a zonelor centrale).

84
r I'Qrlll~ Ii (/I7VI. !
5l/CUS/va(aI/la/Il'l
l'Ciao mlocarll/

I lbas/ru-
-~:.----
yip!!}-
L -- -- I
.,-- rO;,v

JmafJ/rIea pUf7duIUI /um/-


f70S i'f7cof7/ural de ha/oUi/

Fig. 4-6. Aberatia cromaticii.

L
F

Fig. 4-7. Corectia aberatiei in sistemul apocromat suprapune focaml a doua radiatii diferite:
in exemplul ales, focarul radiatiei verzi (FV) ~i al celei ro~ii (FR).

4.1.2.3. Sistemul de iluminare. Sursa de lumina este inclusa in talpa microseopului


(2) $i e~te Ie m1ata dintr-un bee (de preferat eu filament patrat) $i dispozitivele de dirijare
a fascieululL i luminos catre preparat: butoanele pentru centrarea filamentului Himpii (3),
diafragma de camp, oglinda interioara $i condensor.
Oglinda interioara, manipulata prin doua butoane (24), dirijeaza fluxul luminos
catre eondensor printr-un orificiu inconjurat de loca:julfiltrelor (22). Unfiltru mat, plasat
intre sursa de lumina $i diafragma de camp, asigura unifol111itatea fluxului luminos $i
este rabatabil cu ajutorul unei rozete (1). Diafragma de camp poate fi ac!ionata printr-o
rozeta (23).
Condensorul de camp luminos (16) este un sistem de Ientile care focalizeaza lu-
mina asupra preparatului $i eontribuie esen!ial la luminozitatea imaginii. Iluminarea
adecvata a preparatului presupune adaptarea aperturii numeriee a condensorului la apeltura
numerica a obiectivului. Pentru aceasta condensorul dispune de 0 diafragma iris,
diafi'agma de apertura, manipulata cu 0 parghie (18). Daea apertura nUl11crica a

85
condensorului 0 depa~e~te pe cea a obiectivului, in microscop patrunde lumina parazita,
care produce stralucire aberanta a imaginii. Daca apel1ura numerica a condensatorului
este mai mica dedit cea a obiectivului, se pierd detalii ale imaginii (v. fig. 4-4, B).
Condensorul este fixat sub masa port-obiect printr-un suport care culiseaza pe verticala
aqionat de un buton (21).
Microscopul ML-4M este inzestrat ~i cu 0 oglinda exterioara, care se poate monta
in loca~ul filtrelor dnd, accidental, sursa de lumina intema nu funqioneaza. in acest caz
folose~te ca sursa de lumina un bec mat de 40-60 W sau, mai bine, 0 lampa de mare
intensitate cu diafragm iris.

4.1.3. Amplasarea microscoapelor

Microscopul trebuie plasat pe 0 masa stabila intr-o latura a incaperii care perll1ite
a~ezarea examinatorului cu spatele la fereastra. Lumina directa care patrunde in ochi
jeneaza observarea detaliilor microscopice.
Pentru ll1icroscopia cu fond negru sau cu luminescen!a este indicata 0 camera
obscura.

4.2. MICROSCOPIA OPTIC~ PE CAMP LUMINOS

Bacteriile, micetele, protozoarele Ie unnarim in produse patologice sau in culturi


fie in stare nativa, vie (preparate umede), fie dupa fixare ~i colorare (preparate colorate).

4.2.1. Iluminarea ~i focusarea imaginii

1) Bran~eaza microscopul la re!eaua de alimentare electrica prin intermedi uI


transforl7latorului de tensiune.
2) inchide pana la jumatatea cursei diafragma de camp ~irabate geall1ul mat pentru
a verifica daca filamentul becului este centrat. Imaginea filamentului trebuie sa apara in
centrulloca~ului filtrelor (filamentele patrate) sau intr-unul din diametre (filamenteJe
lineare, mai pu!in satisIacatoare). PentIll a observa mai bine filamentul, plaseaza pe
loca~ul filtrelor un geal11mat sau 0 foi!a de hartie pelur.
Daca se impune, corecteaza centrarea ac!ionand butoanele care deplaseaza axial
dispozitivul de ilul11inare. La seriile mai vechi ale microscopului ML-4M centrarea
filamentului se face, mai pu!in comod, rotind 0 buqa randalinata solidara cu dulia becului
~i fixata printr-o rozeta concentrica.
3) A~eaza pe mas a port-obiect preparatul microscopic ~i fixeaza-I intre suporrii
reglabili.
4) Rote~te capul revolverului pentru a aduce in axul optic obiectivul selectat. Este
recol11andat ca initial preparatul sa fie scrutat cu un obiectiv uscat slab.
5) Privind lateral, manipuleaza butonul mi~carii grosiere pana dnd lentila
obiectivului ajunge cat mai aproape de preparat.

86
6) Prive~te prin oculare ~i ajusteaza-le pentru propria distanta interpupilara pfma
cand obtin viziunea binoculara perfecta a campului microscopic.
7) Focalizeaza preparatul aqionand tubul microscopului numai de jos in sus prin
butonul mi~carii grosiere, apoi, daca lucrezi eu un obieetiv putemic, prin butonul mi~ci'irii
fine.
Selecteaza 0 suprafata din preparat cu elemente bine etalate. Pentru aceasta
aqioneaza butoanele concentrice care controleaza mi~carile transversale ~i longitudinala
ale mesei POli-obiect.
8) Actioneaza butonul de focalizare a condensatorului pana obrii imaginea
diafragmei de camp cu cel mai clar contur. La examinari cu obiectivele lOX sau 6X redu
apertura numerica a condensatorului prin de~urubarea monturii cu lentila superioara.
9) Centreaza imaginea diafragmei de camp aqionand butoanele oglinzii. Initial
ambele butoane trebuie sa fie la jumatatea cursei pentru a asigura suficienta mobilitate
intr-un sens sau altul.
10) Deschide diafragma de camp pana la limita campului microscopic. 0 deschidere
mai mare introduce lumina parazita in microscop, care detemlina stralucire suparatoare
a imaginii.
11) Regleaza deschiderea diafragmei de apertura. Pentru aceasta scoate ocularuL
prive~te prin tubul microscopului ~i actioneaza parghia diafragmei de apertura pana ce
imaginea ei ocupa 1/2 - 1/3 din diametrul pupilei de ie~ire a obiectivului. Deschiderea
spre maximum a diafragmei de apertura cre~te puterea de separare, dar scade contrastul
imaginii; invers, miqorarea ei scade puterea de separare, dar cre~te contrastul imaginii.
Odata stabilite aceste reglaje, este contraindicata reglarea fluxului luminos prin
modificarea diafragmei de camp sau pozitiei condensatorului. Acum fluxulluminos mai
poate fi crescut prin rabatarea filtrului mat, sau scazut prin introducerea filtrului fumuriu
NG 5/2 in loca~ul filtrelor. Filtrul verde VG 6/2 ofera un contrast mai bun imaginii ~i
cre~te puterea separatoare, dar altereaza interpretarea culorilor. Cu filtrul albastru BG
33/2 se obrine nuanra alba a luminii, care nu altereaza culorile preparatului.
12) Focalizarea finala a imaginii prin ajustarea dioptriilor:
Obtureaza ocularul stang cu capacul din trusa microscopului, prive~te Cll ochiul
drept in ocularul drept ~i focalizeaza imaginea prin butonul mi~carii fine.
Obtureaza ocularul drept, prive~te apoi cu ochiul stang prin ocularul stang ~i
focalizeaza imaginea numai prin rotirea inelului de ajustare a dioptriilor lara a atinge
butoanele mi~carii grosiere sau fine a tubului.

4.2.2. Intretinerea microscopului

1) Tine penn anent microscopulla adapost de praf: sub husa sau in cutie.
2) Mentine in cutia lor obieetivele ~i ocularele nefolosite.
3) Dupa fiecare exam inare curata uleiul de cedru de pe lentila obiectivului lU ell 0
hartie moale, care nu lasa scame. In lipsa acesteia, folose~te pulpa degetului ~i ~terge
imediat uleiul de pe deget cu 0 carpa.

87
4) Nu atinge cu mana suprafetele optice.
5) Nu apropia exagerat ochii de oculare. Clipirea va Hisa um1e de grasime de pe
gene pe lentila ocularului.
Periodic:
6) Sterge elementele optice ale microscopului, exceptand fetele frontale ale
obiectivelor ~i condensatorului, cu 0 carpa curata din finet imnuiata in amestec etanol
96 cu eter in pa11i egale.
7) Curata fata frontala a obiectivelor, in special a celui cu imersie, ~icondensorului
cu 0 carpa de finet umezita in benzina sau xilo!. Este fonnal contraindicata utilizarea
alcoolului pentru aceasta operatie: cleiul folosit de produciitor pentru montarea lentilelor
este solubil in alcoo!.
8) Pentru indepartarea eventualelor pulberi din veciniitatea monturii lentilelor
folose~te 0 mica pensula curata sau, mai bine, insufla cu 0 para un jet de aer (nu sufla
niciodata cu gura pentru ca poti proiecta pe Ientile stropi de saliva).
Apeleaza la un tehnician autarizat pentru revizia anuala a microscopului sau pentru
interventii in caz de incidente pe care nu e~ti abilitat sa Ie rezolvi singur: gripare,
deteriorarea unar piese etc. Pentru aceasta mentioneaza cronologic in fi~a microscopului
toate defectiunile survenite ~i data reviziilor sau interventiilor de remediere.

4.2.3. Incidente frecvente in microscopie ~i remedierea lor

Cele mai multe sunt legate de examinarea prin obiectivul cu imersie. Unl1are~te
atent tabelul 4-1.

4.2.4. Preparate microscopice

Folose~te pentru efectuarea preparatelor microscopice numai lame ~i lamele de


microscop curate ~i bine degresate, pe care 0 picatura de apa se intinde in strat subtire ~i
unifonl1. Lamele de microscop sunt lame din sticla cu dimensiuni de 76/25 mm: cele cu
grosimea de 1-1,1 mm permit cea mai bun a focusare a imaginii. Lamel ele au dimensiuni
variate in funqie de indicatii. Pentru camerele de numarat elemente figurate folose~te
lamele de 26 x 18 x 0,5 mm, care sunt inflexibile ~i asigura volumul nominal al camerei.
Pentru examenele uzuale intre lama ~i lamela ori pentru protectia preparatelor colorate
sunt indicate insa lameIe piitrate cu latura de 18, 22 sau 24 mm ~igrosimea de 0,1-0,17 mm.
Lamele cu grosimea de 0,17 mm sunt numite de unele firme cu nr. 11/2. Obiecti ve1e
putemice sunt corectate pentru lamelele de 0,17 mm.

4.2.4.1. Pregatirea lamelor ~i lamelelor de microscop. Imerseazii lamele noi,


una cate una, intr-un vas cu amestec sulfo-cromic ~i mentine-Ie la temperatura camerei,
mai multe zile. Altemativ, pot fi fierte intr-o solutie din 6 piiqi acid azotic (precou!ii),
6 pii11ibicromat de potasiu ~i 100 piiTtide apa.
Spalii-Ie apoi abundent cu apa de robinet, clate~te-le cu apa distilata ~ipiistreaza-Ie, In
borcan inchis, imersate in alcooI50%. Pentru utilizare scoate lamele din solutia alcoolica
~i usucii-1e prin ~tergere cu 0 carpii curata.

88
Tabelu/4-1

Incidente frecvente in microscopie: cauze ~iremedii

Incidentul
tata cu strat mai Obiectiv
Pulberi
Deschidne
Lentila incorect
sau illlpuritiili
Uleiul defrontal
cedru
imporitati
exeesiva
Cauze a posibileRemedii
sub Schimba
Curata
Poziliollat
a prinsscop. Curala
0 brat
COlltroleaza
a pepcdiafragmei
frotiu:
Corecteaza
ocular:
Ridica
Veritica
Cura(a
obiectivului ocularul
bula0 imagine
bra(ul obieetivul
~iseuleiul
cucudeobiectivul
lama
Pozi(ioneaza xilol
segrija
tubulmicroscopului
acoperita mi~cadelentila
corect
declicul
aerdereclu buna
pozilia
rotesc
camp cudata
cu0cedrll
frotiul lama
0lamei
microscopului unul
revolverului
indica
datii
deschiderea
ulei din
defectarea
decucu cedru
{'~idiati-agmci
~irotiul
ocularul trusa
reiascoate
us- obiectivului
altui
lafocusarea.
pozitiollarea micro-
deprimului
peincidentul
cordonullentila
camp DacadeobiectivlIlui ~i reiauleiuloperalia
se repeta. cllrala de pe frotiu ~ide
cu 0 noua
0 data
ctObiediv
ntre talpa cu~iposibil tivului
obiectiv
bratul Lama
Uleigrosdepusa
pieatura
Frotiu Clluleifrotiul
dedecedru
acoperit
balsam in dejoscorec(ia
c;;uulei
preadecatvascos: cedrulamauscat
aderadupaladeexamin[lr~
asigurata Fabricant~iante-
obiectiv obiec-
cste inlocuiqte lamela
campul micro-

00
..0

~ "=_"_ ..~ "'~


o
1.0

Tabelu/ 4-1 (continuare)

sauremediazacontactele
onIncidentul
~tekerelor* Pan a de Cauze
Diafragmacurent
imperechere dedecamp lanumerica
Remedii
posibile
Inoelilare
relea
~i, distan!a
Veri
Vdupa
erifiea
inainte
sauAdapteaza
Verifica fica ~i~i
eaz,suficienta
deextrema
priza
lampa
defilamentullampii
Verificii apertura
Controleaza
inegale
Verifiea corecteaza
~i~icele
lnlocuiqte
coreeteaza
folosind
acorect
remediaza
privi
incorect
doua
declicul
monteaza
remediaza fiecare
Illicroscopului
siguran!a
un bec
prinnecentrate
binocular
diafragme
reglate centrare
revolveruluicudetransforlllatoru-
condensor altcontrol
~ifixeaza transformator
unapertllra
iacorecteaza obieetre-
Pozilionarea
Cllglarea
edaptare
sau becul
ndensor Illi- Illi
insufiei-
cu aper-
dioptriilor obiectivului

* Nu executa aceste opera!iuni cu transformatorlilin priza: pericol de eleetroclilarc.


In caz de urgenta, freaca de cateva ori 0 bucata de sapun cu degetul inmuiat in apa
~i ~terge cu el suprafata lamei. Indeparteaza filmul de sapun ~tergand insistent lama cu 0
carpa uscata ~i curata. In final flambeaza bine lama trecand-o de cca 10 ori prin flacara
unui bec de gaz. Evita sa depui lama fierbinte pe supra fata rece, se poate sparge.
In limita posibilitatilor, nu reutiliza lamele de microscop pentru ca nu ai certitudinea
indepartarii prin spalare a organismelor din frotiul anterior.
Pentru pregatirea lamelelor procedeaza ca ~i pentru lame.

4.2.4.2. Preparate microscopice umede


Principiu: Citoplasma este incolora ~i are indice de refraqie putin diferit de al
mediului de montare a preparatului. De aceea in preparate umede microbii devin vizibili
numai in conditii speciale de iluminare: reducerea diafragmei de aperhlra la microscopul
cu fond luminos, examen pe fond negru (vezi 4.3.1) ori microscopie in contrast de
faza (vezi 4.3.2). Ultimele doua metode ofera mai multe detalii morfologice sau structurale
ale obiectului examinat.
Illdica{ii: Examinam preparate umede pentru depistarea rapida ~i identificarea
spirochetelor, fungi lor sau protozoarelor. Metoda pen11ite observarea rapida a mobilita1ii
microorganismelor. Sunt de asemenea utile pentru depistarea ~i identificarea rapida a
unor elemente celulare ~i necelulare in expectoratie, urina ~.a.
Procedura:
1) Depune 0 mica portiune din produsul microbian in centrullamei de mieroscop
marcata cu indicativul produsului examinat. Ca fluid de montare folose~te insu~i prelevahll
patologic, bulionul de cultura sau alte solutii, in raport eu indicatia examenului (e. g.,
solutie 10-20% KOH pentru examinarea fungilor din prelevate patologice, solutie salina
izotona etc.).
2) Acopera picatura cu 0 lamela ~i apas-o u~or cu pensa de vata pentru a elimina
bulele de aer ~i a obtine un strat fin de lichid. 0 apasare exagerata poate altera structura
microorganismelor sau celulelor. La manipularea lamelei nu lasa amp rente pe suprafa1a:
un11ele de sebum perturbii calitatea imaginii microscopice.
3) Absoarbe excesul de lichid de pe marginile lamelei cu hartie de filtru apoi
etan~eaza prin parafinare preparatul. Pentru aceasta depune in lungul marginilor lamelei
parafina topita cu ajutorul firului drept sau capilarul indo it al unei pipete Pasteur u~or
incalzit. Parafinarea preparatului evita f0n11area curentilor de fluid ~ievaporarea in cursul
examinarii.
4) A~eaza preparatul pe masa port-obiect a microscopului.
5) Examineaza numai cu obiective uscate: scrutarea preparatului cu obiectivul 6X
sau lOX, observarea detaliilor cu obiectivul20X sau 40X. Nu utiliza obiective cu imersie
deoarece, prin vascozitate, uleiul de cedru antreneaza lamela, formeaza curenli de fluid
$i creeaza impresia falsa a mobilitatii microorganismelor examinate.
6) Dupa examinare, depune preparatul in recipient cu solutie dezinfeetanta.
Interpretare: Mi~carea browniana detem1ina oscilatia pe loc a particulelor. Curentii
de fluid antreneaza 0 multime de pmticule care traverseaza campul microscopic in aceea$i

91
directie. Un microorganism este mobil cand i~i modifica pozi!ia fa!a de un reper din
vecinatate. Bacteriile monotriche sau lofotriche au mi~cari rapide de rostogolire, cele
peritriche au mi~cari oscilatorii.

4.2.4.3. Preparate micros cop ice colorate


Principiu: Fixarea coloran!ilor (e.g., coloran!i bazici de anilina ~.a.) pe strueturile
protoplastului mare~te refringen!a microorganismelor ~i pennite observarea detaliilor
morfologice. Structmi speciale asociate peptidoglicanului bacterian dete1111inaanumite
afinita!i tinctoriale care apar dupa colora!ii diferen!iale (e. g., Gram, Ziehl-Neelsen ~. a.).
In colorariile negative particulele insolubile ale colorantului (carbonul din tu~ul de
India, nigrozina) f01111eazafondul negru al dimpului microscopic pe care se observa
u~or, ca un halou incolor, capsula unor microorganisme ca pneumococii, Cryptococcus
neoformans etc. (vezi Cap. 41).
Indica!ii: identificarea microscopic a a mieroorganismelor.
Procedura:
1) Efectllareafrotiului. Frotiul este materialul microbian etalat In strat subtire pe
suprafara unei lame de microscop marcata cu indicativul produsului examinat. II efectuam
in trei timpi: etalare, uscare ~i fixare.
a) Etalarea
Din cultura bacteriana In me diu lichid preleva cu ansa 0 picatura ~i etaleaz-o 1n
centrullamei, In strat cat mai subrire, prin mi~cari circulare excentrice pe suprafata de
1-2 cm3 tara a atinge marginile lamei.
Din cultura pe mediul solid preleva 0 cantitate, numai prin atingerea unei colonii
cu ansa, ~i depune-o In centrullamei langa 0 picatura de apa distilata sterila. Experienta
Iti va arata cantitatea optima de cultura pentru a obtine un frotiu subtire cu elementele
bine dispersate in monostrat. Arde surplusul de cultura de pe ansa ~i, dupa riicire,
omogenizeaza progresiv cultura depusa In picatura de apa ~i etaleaza. Incepatorii au
tendin!a de a efectua frotiuri groase, inutilizabile.
Etaleaza prelevatele patologice fluide procedand ca pentru eultura 1n mediul
liehid. La etalarea exsudatelor fibrinoase (sputa ~. a.) evitii mi~carile de du-te-vino ale
ansei pe aeeea~i suprafata pentru eO.dilacereazii exsudatul fibrino-purulent (realul produs
patologic), 11fragmenteaza ~i 11amesteea In materialul de contaminare (e. g., saliva).
Depune in centrullamei un mic flocon uco- sau fibrino-purulent. Prin mi~cari radiare ~i
exeentriee ale ansei intinde in strat cat mai sub!ire exsudatul care, freevent, se etaleaza
ca 0 pelicula. Inevitabil, alaturi de portiuni sub!iri vor exista ~i portiuni groase Tara a
constitui un impediment.
Pe suprafa!a de sectiune a unor prelevate biopsiee sau necropsice aplica lama In
a~a fel ca in portiunea central a so.ramana ampl'enta leziunii. Altemativ, frotiul se poate
efeetua zdrobind, Intre doua lame sau Intre lama ~i lamela, f01111atiunigranulare din
puroi sau din sputa.
b) Uscarea rapida afrotiului in ael' eald deasupra unui bee de gaz sau pe platina
Incalzita la 70C, are avantaje farO.de usearea spontana la temperatura eamerei. In

92
zonele frotiului unde uscarea intarzie (centru, portiuni mai groase), hiperconcentrarea
sarurilor, pe masura ce uscarea progreseaza, ratatineaza fagocitele, ceea ce creeaza
dificultati la examinare.
c) Fixarea frotiului pentru bacterioscopie se face umal prin ciildura. Trece lama,
cu frotiul in sus, cateva secunde prin flacara unui bec de gaz. Dosul mainii trebuie sa
suporte atingerea lamei astfel inciilzite. 0 incalzire mai putemica poate carboniza frotiul.
Examenul citobacterioscopic sau eel pentru protozoare impune fixarea chimica.
2) Colorareafrotiului
Pune lama cu frotiulln sus pe stativul de colorare.
Acopera frotiul, pe rand, cu reactivii indicati confonn prevederilor fiecarei metode
de colorare (vezi Cap. 41).
Dupa epuizarea timpului indicat spala lama cu apa.
In final, absoarbe excesul de apa intre doua sugative ~i pune lama vertical in
stativ sau orizontal pe platina incalzitoare pentru uscare.
Examineaza la microscop.
3) Protejarea frotiurilor deosebite se face prin montarea In balsam de Canada.
Pentru aceasta:
Spala cu xilol unnele uleiului de cedru de la 0 eventuala examinare anterioara.
Imerseaza lama vertical in baia de xilol.
Scurge partial excesul de xilol.
Mentine lama orizontal in mana ~i depune pe latura lunga, in dreptul frotiului, 0
picatura de balsam de Canada.
Fa contactul intre jumatatea unei laturi lamelei ~i pic:'ltura de balsam. Evi1i
fonnarea bulelor de aer dadi aduci progresiv lamela din pozitie oblica, sprijinita pe
margine a lamei, in pozitie orizontala peste frotiu. Impinge lamela pana acopera frotiul ~i
preseaz-o pentru a elimina eventualele bule de aer ~ia unifonniza, cat mai sub1ire, stratul
de balsam. Cu degetul, infii~urat in strat subtire de tifon, ~terge excesul de xilol ~ibalsam
de pe laturile lamelei.
Lasa lama in pozitie orizontaHi pana a doua zi, dupa care poate fi pusa pe stativ
pentru uscarea completa a balsamului.

4.3. METODE SPECIALE DE MICROSCOPIE

4.3.1. Mieroseopia eu fond negru


Principiu: Metoda se bazeaza pe fenomenul descris de John Tyndall, intr-o camera
obscura particulele de praf, care in conditii de iluminare obi~nuita raman invizibile.
cand se afla in calea unei raze de lumina nedireqionam spre ochiul observatorului (condirie
a obscuritatii), devin vizibile prin lumina difractata ~i reflectata difuz pe suprafa1a lor ~i
indica astfel observatorului traiectoria acestei raze.
Condensatorul pentru camp lntlllzecat opre~te accesul spre obiectiv al razelor de
lumina directe (creeaza fondul intunecat) ~i ilumineaza oblic obiectul. Parte din razele

93
---- Obiechv difractate ~ireflectate de ditre obiectul iluminat
oblic patrund In obiectiv ~i formeaza imaginea
luminoasa a obiectului pe fondul negru al
~, campului. Un astfel de condensor este conden-
satorul cu ogJinzi sferice concentrice (fig. 4-8).
La microscopia pe fond negru obiectul floteaza
_Condensor Intr-o pelicula de lichid pentru a evita retlexia
total a a razelor Inainte ca acestea sa-l lumineze.
lndicafii: Examen electiv pentru depistarea
rapida a spirochetelor, organisme fomie tIne, putin
refringente ~imobile.
Necesar:
1) Condensor cu oglinzi sferice concen-
Sursa de trice, care Inlocuie~te condensorul pentru camp
lumina
luminos la un microscop optic.
Fig. 4-8. Condensorul eu oglinzi sferice 2) Sursa de lumina cu mare intensitate ~i
eoneentrice pentru microscopia pe fond diafragma iris. La microscopul ML-4M exami-
lntuneeat. narea se face cu geamul mat rabatat din fata
diafragmei de camp.
3) Lame de micros cop cu grosimea de 1,0 mm. Numai pe asemenea lame preparatul
este plasat In focarul condensatorului, care are distanta focala de 1,2.
4) Ulei de cedru.
5) Camera obscura.
Procedura:
1) Centreaza diafragma de camp folosind condensorul de cfllnp luminos ~iobiectivul
lOX.
2) Inlocuie~te condensorul de camp luminos cu cel pentru iluminare pe fond negru.
3) Depune 0 picatura de ulei de cedru pe lentila superioara a condensorului ridicata
la nivelul mesei port-obiect.
4) Pune preparatul umed Intre lama ~i lamela peste picatura de ulei de cedru de pe
lentila condensorului.
5) Examineaza preparatul cu obiectivull OX, apoi cu un obiectiv uscat mai putemic,
dupa necesitate. Cu cat obiectivul are 0 apertura mai mare, fondul campului microscopic
este mai putin Intunecat.
6) Dupa examinare, depune preparatullntr-un recipient cu solutie dezinfectanta.
Interpretare: Pe fondul negro al campului microscopic observa imaginea luminoasa,
stralucitoare a spirochetelor mobile.

4.3.2. Microscopia Cll contrast de faza

Principiu: Interferenta dubleaza intensitatea luminoasa a doua raze in concordanta


de faza ~ianuleaza lumina a doua raze In opozitie de faza (defazare cu 1 din lungimea de
unda). Ochiul sesizeaza u~or aceste diferente extreme in intensitatea fluxului luminos. La

94
trecerea printr-un obiect transparent (e.g., 0 celula) razele
refractate ~i difractate sufera numeroase defazari interme-
diare intre situatiile extreme mentionate mai sus. Aceste
defazari intennediare oscileaza in jurul a I din lungimea de OCULAPUL

unda ~i nu sunt sesizate la microscopia cu fond luminos, PLANL,L FOCAL


AL CCULAPllUI
fiind mascate de razele directe.
Microscopul cu contrast de faza permite observarea
integrala a detaliilor din imaginea obiectului, fom1atain planul
focal superior al obiectivului prin interferenta razelor directe
cu cele refractate in preparat. Pentru aceasta 0 diafragma PLACA DE FAZA iN
PLANUL FOCAL
inelara, plasata sub condensor, reduce fasciculul razelor "'_ SUPEflOPAl 08IEC TIVtYcUI

directe, iar 0 pladi de faza, plasata in planul focal superior d 1


al obiectivului, absoarbe partial razele directe ~iaccentueaza
defazarea razelor refractate ~idifractate in obiectul examinat j j 00"""
(fig. 4-9).
lndieatii: Observarea rapida in preparate native,
CONDENSOR

folosind toata apertura obiectivului ~iputerea de rezolutie a


microscopului, a protozoarelor, a fungilor, a fagocitelor sau - DIAFPAGMA INELARA

a efectului citopatic al virusurilor in culturi de celule cu detalii


Fig. 4-9. Drumul razelor de
structurale, care in alte conditii pot fi observate numai prin lumina in microscopul cu con-
coloratii speciale, dificile. trast de faza: detalii pri\'ind
Necesar: diafragma inelara ~i placa de
faza (adaptare dupa Americon
1) Condensor special care incorporeaza in partea
Optical COlllPWI\'),
inferioara un disc rotativ prevazut eu 0 serie de diafragme
inelare. Acestea sunt rondele de sticla opacifiata, dar cu un inel ingust de sticla clara
penuLl accesul fluxului luminos. DiameuLll inelului este individualizat in raport cu apel1ura
fiecarui obiectiv: de la 4,5 mm pentru obiectivull OX pana la 18 mm pentru obiectivul
90X.
2) Obieetive de faza, Obiective obi~l1Uitecare in planul focal superior au montata
o placa de faza forl11atadintr-o rondela de sticla. Razele directe u'ec printr-un ~ant circu-
lar, u~or metalizat, care Ie absoarbe partial. Razele refractate trec prin restul placii, mai
gros, unde sunt defazate. Profunzil11ea ~antului este astfel calculata incat defazarea razelor
refractate in raport cu razele directe sa fie de I lungime de unda. In aceste conditii
diferenta de intensitate intre raza directa ~icea difractata se reduce ~i imaginea obiectului
apare cu to ate detaliile structurale.
Obiectivele de faza sunt identificate prin literele Ph gravate pe montura.
3) Ocular de centrare.
4) Lampa de mare intensitate IUl11inoasa.
5) Filtru verde.
Proeedura:
I) Monteaza condensorul ~i obiectivul pentru contrast de faza.
2) Centreaza lumina folosind rondela 0 a condensorului.
3) Focuseaza obiectivul pe proM.

95
4) Roteaza sub condensor diafragma inelara corespunzMoare obiectivului ales.
5) Inlocuie~te ocularul cu ocularul de centrare, care pennite observarea planului
focal superior al obiectivului cu placa de faza.
6) Privind prin ocularul de centrare ~i folosind ~uruburile de centrare plasate sub
condensor, suprapune exact diafragma inelara cu inelul de faza.
7) Reinsera ocularul obi~nuit ~i examineaza.
lnterpretare: Pe fondul cenu~iu al campului microscopic se observa imaginea
obiectului cu detalii structurale net distincte. Examenulln camera obscura ~i utilizarea
filtrului verde favorizeaza observarea detaliilor.

4.3.3. Microseopia eu fluoreseenta

Principiu: Luminescenta este fenomenul prin care 0 substanta absoarbe radiatii


ultraviolete din domeniul apropiat spectrului vizibil (radiatia de excitatie) ~i emite 0
radiatie cu lungime de unda mai mare, respectiv 0 radiatie luminoasa. Ourata iluminarii
dupa Incetarea actiunii radiatiei de excitatie imparte substantele luminescente in
fluorescente (iluminarea ulterioara dureaza mai putin de 10-7 secunde) ~i fosforescente
(iluminarea ulterioara dureaza mai mult de 10-7 secunde). Mai multe substante naturale
sunt fluorescente: minereuri de uraniu, uleiuri, picaturi de grasimi etc.
Fluorocromii sunt coloranti fluorescenti. A~a sunt: auramina 0, acridin-oranjul R,
tripaflavina etc. Functie de fluorocrom, lamina emisa variaza de la albastra la ro~ie sau
alba. Un interes aparte prezinta fluorocromii care sunt stabili In solutii apoase neutre ~i
se pot lega covalent de anticorpi mcand conjugatul fluorescent: izotiocianatul de
fluoresceina (fluorescenta verde) ~i lisamin-rhodamina (fluorescenta portocalie).
lndicatii: Coloratia fluorescenta este utila pentru depistarea rapida a bacililor acido-
rezistenti pe frotiurile din sputa ~isectiuni tisulare. Utilizari mai largi are coloratia imuno-
fluorescenta pentru depistarea ~i identificarea rapida a microorganismelor In prelevate
patologice, a unor anticorpi in ser, a imunoglobulinelor ~. a.
Microorganismele colorate fluorescent sau imuno-fluorescent (vezi Cap. 25) pot fi
observate in conditii speciale de microscopie.
Necesar:
1) Sursa de radiatii. Cea mai indicata este 0 lampa din sticla de cuart cu vapori de
mercur, tip HBO, care emite radiatii ultraviolete, luminoase ~i calorice.
2) Set special de filtre:
filtru caloric, care absoarbe radiatiile calorice emise de lampa;
jlltre de excitatie, care permit accesul spre preparat numai radiatii10r cu lungime
de unda mica (ultraviolete, violete sau albastru inchis), radiariile de excitatie;
filtre de baraj (de protectie), care opresc radiatiile de excitatie nocive pentru
ochi, dar sunt penneabile pentru lumina emisa de fluorocromi (de la verde la ro~u).
3) Condensor pentru fond negru care, prin dispersia laterala a razelor incidente,
mare~te contrastul imaginii mai mult decat condensorul de camp luminos.
4) Lame subtiri de 1,0 111m.

96
5) Obiective acromate (obiectivele apo- ~OchiUI examinahJrulUi
,, ...
,
cromate pot avea sticla fluorescen1ii), dintre care Filtru de proFecrie
obiectivul cu imersie trebuie sa aiM diafragma Ocular

iris pentru reducerea aperturii numerice.


6) Lichid de imersie nefluorescent cu
vascozitate redusa, care nu se usuca, pentru
contactul intre lama ~i condensor ~i pentru
obiectivele 60X, 90X sau 100X, e. g., glicerina
neutra tamponata, dimetilftalat sau ulei nefluores-
cent. 1

Procedura:
~ (~ Sursij
lumIna
dE
1) Monteaza la microscop dispozitivul r
Lentila de ciimp
monocular, singurul care valorifica integral Filtru caloric
fluxulluminos fluorescent evitand diviziunea in Filtru de excJ~t'e

prisma dispozitivului binocular. Fig. 4-10. Schema optica a microscopului


2) Monteaza condensorul pentru fond cu fluorescen!a
negru.
3) Monteaza filtrele caloric, de excitatie ~ide baraj confonn schemei din figura 4-1 O.
Filtrele de excitatie ~i de baraj se aleg tinand cont de lungimile de unda ale radiatiilor
absorbite, respectiv emise maximal de fiecare fluorocrom utilizat.
4) Plaseaza preparatul microscopic pe mas a port-obiect a microscopului ca pentru
un examen pe fond negru.
5) A1ege obiectivul corespunzator maririi dorite.
6) Prinde ~i focuseaza imagine a iradiind preparatul timp strict necesar acestor
operatii ~i observatiei. lradierea excesiva, prin efect fotodinamic, scade intensitatea
emisiunii de lumina din preparat.
7) Indeparteaza primul preparat lasand obiectivul pe loc. Aceasta va scurta timpul
necesar focusarii unnatoarelor preparate.
Microscoapele cu fluorescenta modeme ilumineaza preparatul de sus in jos. per-
mit utilizarea lamelor port-obiect cu diferite grosimi, evita laborioasa pun ere la punct a
imaginii cu condensatorul de fond negru ~iutilizeaza cu randament mai mare radiatia de
excitatie.
lnterpretare: Se tine cont de morfologia organismelor observate, fluorocrol11ul
utilizat, intensitatea fluorescentei ~iaspectul fondului.

97
5. IZOLAREA BACTERIILOR SI STUDIUL CULTURILOR
(DUMITR U B UIDC)

5.1. IZOLAREA BACTERIILOR 5.1.3. Illcubarea culturilor


5.1. I. Alegerea mediilor de cultura pentru izo- 5.2. STUDlUL CULTURILOR
lare 5.2.1. Citirea culturilor
Medii lichide 5.2.1. I. Caracterele de cui/lira ale i::olatelor
Medii solide: 5.2. l.2. Caracterele microscopice ale i::olate/or
agarul-sfmge 5.3. IDENTlFICAREA BACTERI lLOR
mediile diferenpale lZOLATE
mediile selective 5.3.1. Scurta introducere in taxonomie
Rolul mediilorde imbogapre 5.3.2. Necesitatea culturilor pure
5. I .2. Prelucrarea prelevatelor patologice ~j 5.3.3. Caractere fenotipice studiate pentru
tehnici de insaman!are pelltru izolarea ~i identificarea bacteriilor
identificarea bacteriilor 5.4.INREGISTRAREA REZULTATELOR

Cultivarea bacteriilor in microbiologia clinica are drept scop: izolarea lor din
prelevatele patologice, identificarea ~i testari pentru initierea ~imonitorizarea terapiei
antimicrobiene.
Prelevatele patologice odata reception ate ~i triate calitativ, microbiologul trebuie
sa hotarasca:
1) Mediile de cultura ~i metodele indicate pentru izolare.
2) Atmosfera, temperatura ~i intervalul necesare pentru izolarea tuturor
microorganismelor cu semnificatie clinica din prelevatul examinat.
3) Izolatele cu semnificatie clinica, algoritmul ~i stadiul pana la care conduce
identificarea acestora.
4) Daca antibiograma este indicata ~i care din rezultatele ei se impun comunicate.
Semnificatia clinic a a unor izolate poate fi stabilita inca in primocultura, ci'md se
face ~i identificarea lor microscopica (e. g., izolatele din prelevate necontaminate, bacili
gram-negativi izolati dincolo de un anumit prag in urocultura cantitativa). In aceste cazuri,
~i in urgente, antibiograma poate fi efectuata inaintea identificiirii pana la nivel de gen
sau specie. In urgente 0 antibiograma difuzimetrica orientativa poate fi Iacuta in
primocultura unor prelevate necontaminate daca cito-bactelioscopia atesta densitatea
suficienta a bacteriei semnificative clinic (e. g., cazul meningitelor purulente.
pielonefritelor acute etc.). Dar semnificatia clinicii a unor izolate poate fi stabilita numai
dupa identificarea speciei, a serovarului etc. (e. g., izolarea bacililor dizenterici sau a
bacililor tifici in coproculturi).
In acest capitol yom aprofunda numai izolarea bacteriilor in primocultura, obtinerea
culturilor pure necesare identificiirii ~i antibiogramei, locul caracterelor de cultura $i
microscopice pentru initierea identificarii. Amanunte privind conditiile de calitate,
prelucriiri speciale, criterii de semnificatie a izolatelor din prelevate particulare, mediile
de cultura, testele de identificare, testele microbiologice pentru initierea ~i monitorizarea
terapiei antimicrobiene sunt detaliate in capitole speciale.

98
5.1. IZOLAREA BACTERIILOR

5.1.1. Alegerea mediilor de cultura pentru izolare

Medii de cultura comercializate exista cu sutele. La acestea se adauga variate


medii manufacturate in multe laboratoare. Dar pentru fiecare categorie de prelevate
patologice se utilizeaza uzual un me diu sau un set de medii care pem1it izolarea bacteriilor
cel mai frecvent implicate in infectiile zonei respective a organismului. Acest set de medii
uzuale poate fi suplimentat cu alte medii in raport cu datele c1inico-epidemiologice, morfo-
patologice sau cu cele cito-bacterioscopice. Microbiologul trebuie sa fie foarte bine fami-
liarizat cu aspectul culturilor bacteriene pe un anumit mediu. De aceea este mai indicat sa
lucreze cu un set restrans de medii, care satisfac 0 gama cat mai larga din exigentele
izolarii bacteriilor in cultura (exigentele nutritive, evitarea antagonismului pl1ncontaminantii
probei etc.), decat sa recurga la noi medii, cu care este mai putin familiarizat, fara 0 buna
justificare.
Mediile de cultura lichide, bulioanele, au utilizarea restransa la izolarea din
prelevate necontaminate (e. g., sange, exsudate din seroase, aspirate din colectii purulente
profunde, biopsii tisulare prin ac). Izolarea prin insamantarea in medii lichide are cateva
avantaje;
este cea 111aisensibiHi metoda de izolare in vitro: cultura poate fi initiata de un
numar redus de bacterii, volumul prelevatului insamantat poate fi crescut;
neutralizeaza prin dilutie factori antimicrobieni din prelevatul examinat.
Mediile solide pot fi neselective, diferentiale ~i selective.
1) Agarul 1mbogii{it cu 5% sange de berbec este mediul neselectiv cel mai folosit
pentru insamantarea prelevatelor necontaminate ~i a unora din cele contaminate (e. g.,
exsudate din caile respiratorii ~i din cavitatile lor conecte, exsudat conjunctival, puroi
etc.). Preparat cu sange de cal favorizeaza izolarea Haemophilus i1~fluenzae,iar cu sange
de 0111evidentiaza capacitatea hemolitica a coloniilor de Gardnerella vagina lis, specie
nehemolitica pe agar cu sange de la alte specii animale.
2) Mediile d!ferentiale contin substratul pentru 0 anumita enzima sau citotoxina
bacteriana ~i un indicator care atesta atacarea acestui substrat. Astfel agarul-sange
diferentiaza bacteriile hemolitice de cele nehemolitice, mediile lactozate, cu variati
indicatori de pH, diferentiaza enterobacteriaceele care fem1enteaza lactoza (Iactozo-
pozitive) de cele care nu fennenteaza (lactozo-negative) ~. a. m. d. In acest mod sunt
favorizate izolarea ~iidentificarea preliminara in primocultura a unoI' bacterii din prelevate
contaminate.
3) Mediile selective contin sub stante care inhiba dezvoltarea bacterii!or de
contaminare a prelevatelor. Exista 0 diversitate de medii selective in raport cu diversitatea
patogenilor anume urmariti.
Pentru izolarea enterobacteriaceelor din prelevate contaminate exista medii eu trei
niveluri de selectivitate:
Slab selective (e. g., mediul Mac Conkey - agenti inhibitori saruri biliare ~i
cristal violet; me diuI EMB - agenti inhibitori eozina Y ~i albastru de metilen, care inhiba
baeteriile gram-pozitive.

99
Moderat selective (e. g., mediul Salmonella-Shigella - agenti inhibitori saruri
biliare ~i verde briliant), care inhiba, pe langa bacteriile gram-pozitive, ~i 0 parte din
bacilii gram-negativi comensali.
inalt selective (e. g., mediul Wilson-Blair - agent inhibitor verde briIiant), care
inhiba 0 gama mai larga de bacterii pentru a facilita izolarea salmonelelor.
Agarul-sange poate fi tacut selectiv pentru izolarea unor patogeni pretentiosi
nutritivi prin adaos de antibiotice: colil11icina ~i acidul nalidixic inhiba dezvoltarea
bacteriilor gram-negative ~i favorizeaza izolarea celor gram-pozitive; bacitracina inhiba
dezvoltarea bacteriilor gram-pozitive ~i favorizeaza izolarea hemofililor, kanal11icina Si
vancomicina favorizeaza izolarea bacililor gram-negativi anaerobi ~. a. m. d.
Mediile de imbogatire sunt medii lichide care, prin anumite substante inhibitoare,
prelungesc faza de lag a bacteriilor de contaminare, tara a intarzia insa intrarea anumitor
patogeni in faza exponentiala. Astfel preincubarea fecalelor 18 ore la 37C in bulion cu
selenit de sodiu ~.a., inainte de epuizarea pe un mediu selectiv adecvat, favorizeaza izolarea
sa1mone leIor.
Utilizarea mediilor diferentiale ~i selective nu trebuie ul111aritacu orice pret, ci
numai in masura in care aduce avantaje reale, tara a incarca inutil costul analizei. Exemple:
Includerea unui mediu diferential lactozat in bateria de medii pentru izolarea
patogenilor din sputa nu 0 vedem indispensabila pentru ca: a) nu aduce nici un avantaj
nutritiv suplimentar comparativ cu agarul-sange; b) nu caracterizeaza nici un factor de
patogenitate; c) semnificatia clinica a izolatelor conditionat patogene este stabilitii pe
criterii cantitative, raportul cu celulele inflamatorii ~.a.,intre care capacitatea de fem1entare
a lactozei nu i~i afla locul; antibiograma izolatului cu semnificatie clinica se impune Si
se poate face inaintea identificarii.
Izolarea salmonelelor in bacteriologia clinica nujustifica utilizarea mediilor inalt
selective. Microbiologul bine familiarizat cu aspectul culturii enteropatogenilor pe un
singur mediu cu selectivitate mijlocie izoleaza bacilul tific cu acela~i randament ca ~i
restul salmonelelor sau bacililor dizenterici tara a mai trebui sa apeleze ~i la mediul inalt
selectiv Wilson Blair.
Tulpini ale unui patogen pot sa nu cultive pe mediul selectiv ales. De aceea
sensibilitatea izolarii unor patogeni cre~te daca mediul selectiv este dublat ~i de un
mediu neselectiv: tulpini de bacili dizenterici care nu cultiva pe medii cu selectivitate
mijlocie, dar pot fi izolate pe mediul cu selectivitate joasa (e. g., mediul Mac Conkey
~. a.) sau diferential lactozat (e. g., agar cu albastru de bromtimol lactoza etc.); tulpini
de baciI difteric care sunt inhibate pe mediile cu telurit, dar pot fi izolate pe agar-
sange etc.
Suspiciunea prezentei in prelevat a bacteriilor cu perete defectiv (e. g., infeqii
persistente la pacienti sub terapie cu antibiotice ~-lactamice confonn antibiogramei)
obliga la insamantarea ~i intr-un l11ediuprotector hiperton cu zaharoza.

100
5.1.2. Prelucrarea prelevatelor patologice ~itehnici de insamantare
pentru izolarea ~iidentificarea bacteriilor

Insamantarea prelevatelor patologice, in functie de natura lor, 0 facem direct sau


dupa 0 prealabila prelucrare: concentrare, decontaminare, omogenizare, inactivarea uno I'
sub stante antimicrobiene.
Prelevatele omogene, fluide (sange, exsudate seroase prelevate pe anticoagulant
puroi) sau emulsionabile (fecal e), Ie putem insamanta direct.
Concentram prin centrifugare probele fluide sau omogenizate (sputa).
Decontaminarea prin spalare in solutie salina izotona este utila pentru sputa muco-
purulenta, pentru port,iunile muco-sanguinolente din scaun. Tratarea cu hidroxid de sodiu
decontamineaza probele pentru izolarea micobacteriilor; concomitent fluidifica ~i
omogenizeaza sputa.
Omogenizarea sputei pentru izolarea bacteriilor neacido-rezistente 0 facem cu
N-acetil-cisteina, iar a tesuturilor prin mojarare in tub Griffith.
Toate aceste prelucrari ale probelor prealabile insamantarii VOl' fi reluate cu
amanunte tehnice in capitolele speciale.
1) Epuizarea inoculului cu ansa pe placi cu mediu agarizat :ji ob{inerea c1l!turilor
pure necesare identijlcarii.
Initial evaporam condensul de pe suprafata mediului prin mentinerea placilor cca
30 minute la 37C cu capacul intredeschis: "uscarea placilor".
Pe placile cu medii agarizate neselective, uzuala este izolarea prin epuizare
semicantitativa a inoculului in 4 cadrane conform schemei din figura 5-1, Cll arderea
ansei cfmd schimbam directia striurilor de epuizare. Metoda pel111iteaproximarea relativa
a cre~terii cum este precizat in tabelul 5-1.

B c

Fig. 5-1. Epuizarea inoeulului eu ansa In patru eadrane pe plaeii eu mediu


agarizat permite aprecieri semnifieative ale izolatelor din primoeulturi.

101
Tabelul5-1
Aprecierea semnifieativa a ere~terii in primoeultura pe placi
eu mediu agarizat dupa epuizarea inoeulului in 4 eadrane
---
23<5
<5
>5
>5 >10
<10
,

din cadranele
I
i Numarul coloniilor pe striurile de insamfmtare

Pentru izoUiri pe medii selective, cantitatea de inoculum trebuie sa fie mai mare,
iar epuizarea mai putin drastica. Initial, conform schemei din figura 5-2, etalam in aria A
una sau mai multe anse cu inocul ori inocul prelevat pe tampon. Epuizam apoi inoculul,
rara sterilizari intermediare ale ansei, prin 3 serii de striuri: B, C ~iD (fig. 5-2). Cantitatea
de fluid prelevata in ansa difera cu pozitia de scufundare ~i retragere a ansei: cantitate
minima ~i constanta la scufundarea ~iretragerea verticala, cantitate maxima la scufundare
cat mai oblica ~i retragerea ansei prin "smulgere" din fluid.
Pura poate fi considerata ace a cultura formata din descendentii unei singure colonii
rezultate dupa 0 epuizare a materialului microbian, care duce la cre~terea sub f01111ade
colonii bine izolate pe un mediu de cultura neselectiv. Ideal ar fi ca asemenea cre~tere sa
p0111eascade la indivizi izolati. Practic ea p0111e~tede la unitati f01111atoarede colonii
(po ate indivizi, poate 0 mica grupare de organisme asemanatoare).
In microbiologia clinica, 0 singura epuizare optima pe un me diu neselectiv poate fi
suficienta, dar 0 reepuizare este de doril. Cand cultura primara rezulta dupa epuizare pe
un mediu selectiv, reepuizarea pe un me diu diferential este obligatorie. Coloniile
microorganismului urmarit pe mediul selectiv pot contine un numar de contaminanti
inhibati, care la repicarea directa in mediul de identificare i~i reiau activitatea. Bacteriile
inhibate raman in profunzimea coloniilor, in apropierea suprafetei insamantate. De aceea,
la purificarea izolatelor de pe mediile selective, pentru repicarea prin reepuizarea acestor
colonii prelevam inoculul numai prin atingerea suprafetei
A
coloniei; niciodata nu trebuie sa sectionam colonia cu ansa.
Izolarea bacteriilor din prelevate contaminate cu Pro-
teus este posibila pe medii care inhiba caracterul invaziv al
c o acestor specii: agar cu saruri biliare, agar cu eritrocite de
cal ~i carbune activ (sangele integral reduce capacitatea
adsorbtiva a dirbunelui), agar-sange cu alcool feniletilic,
un agar deficient in electroliti.
In prezenta clostridiilor invazive, izolarea bacteriilor
anaerobe in cultura pura este mai dificila ~i poate impune
Fig. 5-2. Epuizarea eu ansa a repicari multiple.
unui prelevat patologie pe
plaea eu mediu seleetiv Sansa de a repica 0 mutanta in cursul purificarii unei
(sugestie). culturi pe medii nutritive uzuale este de una la cateva

102
milioane. Pentru a 0 minimiza, odatiiconvin~i de puritatea culturii,
nu mai repiciim colonii individuale, ci un inocul prelevat din mai
multe colonii.
2) Insaman{area nmedii liehide 0 facem direct cu seringa
de prelevare (hemoculturi), cu pipeta (sedimentul lichidului
cefalo-rahidian), cu ansa incarcata cu prelevat patologic
monomicrobian ori cultura pura (fig. 5-3).
(A) lnclina tubul ~i descarcii ansa pe peretele tubului a~a
cum indica figura. (B) Cand readuci tubulla verticala, inoculul
ajunge submers ~i difuzeaza in mediu.
3) Izolarea baeteriilor sporulate de eele nesporulate pe
baza termorezisten{ei sporilor. Mentine in baia de apa la 80C, A B

timp de 10 minute, produsul microbian suspensionat in solutie Fig. 5-3. Insiiman!area


cu ansa a unui tub cu
salina izotona, apoi epuizeaza suspensia pe 0 placii cu mediu
bulion nutritiv.
agarizat.
(A) lnclina tubul ~i des-
4) Insaman{area cu ansa a mediilor solid(fieate npanta card ansa pe pcretcle tubu-
este indicata pentru: lui a~a cum indica figura.
Mentinerea pe durata limitata, de la cateva zile pana la (B) Cand readuci tubul la
vel1icala, inoculul ajunge
1-2 saptamani, a culturilor pure (e. g., tulpini de identificat,
submers ~i difuzeaza in
tulpini de referinta). Preleva cu ansa inocul din mai multe colonii medill.
ale culturii purificate pe placii cu mediu agarizat. Depune
inoculul in partea inferioara a pantei, imediat deasupra apei de condens, ~i retrage ansa
spre partea superioara a pantei descriind mi~cari in S pe suprafata mediului .
Izolarea in cdtura pura a tulpinilor de Proteus din prelevate contaminate. Descarca
o ansa din prelevatul patologic strict in apa de condens a tubului. Incubeaza tubul in pozitie
verticala. Singuri'i cultura de Proteus va invada, prin "catarare", suprafata pantei de mediu.
5) Insaman{area ell firul drept a coloanei de
agar nutritiv moale este indicata pentru testarea
mobilitatii bacteriilor sau pentru conservarea pe
durate mai lungi, de una pana la 6 luni, a tulpinilor
bacteriene. lncarcii firul cu inocul din cultura pura ~i
inteapa central coloana de agar nutritiv pana aproape
de fundul tubului. La testarea mobilitatii, retrage acul
cat mai exact pe acela~i traiect pentm a evita dilacerari
suplimentare ale mediului in care cre~terea po ate da
impresia falsa de mobilitate a bacteriei.
6) Insamantarea eu find drept a mediilor
A B
solid(fieate n eoloana $i panta este indicata pentru
Fig. 5-4. Insaman!area eu firul drept testarea unor activitati biochimice. lncarca firul eu
a mediului solidificat In coloana ~i
inocul din cultura pura ~i procedeaza mai intai la
panta.
(A) lnsaman!area eoloanei prin intepare. insamantarea prin intepare a coloanei, apoi retrage
(B) lnsamanrarea pantei prin striuri acul insamanteaza panta prin mi~cari in ,So pana in
in "S". partea sa superioara (fig. 5-4).

103
5.1.3. Incubarea culturilor

Majoritatea bacteriilor cu interes medical cresc bine la 37C. Unele bacterii (e. g.,
Yersinia enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Listeria monocytogenes) cultiva optim
sau/~i exprima caractere importante pentru identificare la temperatura camerei, 20-30C
(mobilitate etc.). Altele cresc optim la 42C (e. g., Campylobacterjejwzi/coli). Cre~terea
fungilor cu interes medical este optima la 30C.
Laboratoarele mici se pot rezuma insa la un incubator reglat pentru 35-37C. La
aceasta temperatura yersiniile se VOl'dezvolta mai lent ~i vor necesita prelungirea cu 24
ore a perioadei de incubare, Campylobacterjejuni se poate dezvolta ~i la 37C pe mediul
Campy-BAP. Cercetarea mobilita!ii yersiniilor sau cultivarea fungilor poate fi ul111arita
~i la temperatura camerei.
In laboratoarele mari, incubatoarele reglate la 0 gama mai larga de temperaturi
sunt necesare nu numai pentru a ameli ora randamentul izolarilor, ci ~ipentru identificarea
corecta a multor izolate (yersinii, listerii, micobacterii).
Incinta incubatoarelor trebuie supravegheata pentru a asigura (v. tabelul ]-4):
Constanta temperaturii.
Umiditatea de eel pu!in 70% poate fi ob!inuta prin men!inerea in incinta a unui
cristalizor deschis din care apa se evapora liber. Este esen!iala pentru cultivarea un or
bacterii, mai ales daca perioada de incubare se prelunge~te. Incubatoarele model11e au
rezervoare cu apa care regleaza umiditatea dupa necesita!i.
Indepartarea regulata a pulberilor prin ~tergerea suprafe!elor cu carpa umezita.
Bacteriile aerobe ~i facultativ anaerobe Ie cultivam in atmosfera n0l111ala.
Bacteriile carboxifile Ie cultivam uzual intr-un borcan acoperit in care Uisam sa
arda 0 lumanare, care se stinge cand concentra!ia CO2 atinge 5-10%. Concentra!ia de 5%
CO2 0 ob!inem i prin reac!ia dintre carbonatul de ca1ciu ~i acidul clorhidric dintr-un mic
vas plasat in borcan acoperit sau exsicator:
Buca!ele de mal111Ura(0,25 x V) g,
Acid clorhidric 25% (2,50 x V) ml,
unde V = volumul in litri al borcanului de incubare. Concentra!ii mai mari de CO2
ob!inem crescand cantitatea reactivilor.
Bacteriile microaerofile pot fi cultivate in tennostate cu atmosfera reglata sau in
pungi etane din plastic insuflate cu amestec gazos: oxigen 5-7%, dioxid de carbon 8-10%
i azot 85%.
Pentru cultivarea bacteriilor strict anaerobe recurgem, in functie de dotarea
laboratorului, la procedee fizice, chimice sau biologice.
1) Procedeele .fizice cu mare randament i eficien!a pennit cultivarea bacteriilor
anaerobe pe placi cu mediu agarizat:
Camera anaeroba (glove box) In care toate opera!iunile, de la Insamantarea i
observarea culturilor pana la repicari, se fac in absen!a oxigenului.
Sistemul Mac Intosh i Fildes. Dintr-un borcan etan aerul, Indepartat cu 0 pompa
de vid, este Inlocuit cu hidrogen sau un amestec gazos (azot 85%, dioxid de carbon 5</"0,
hidrogen 10%), iar clorura de paladiu inclusa in azbest catalizeaza la cald (rezistentii
electrica) fixarea hidrogenului pe urmele de oxigen.

104
Sistemul Gaspak este un borcan etan~ in care reactia dintre apii ~i 0 tab1etii cu
borohidrat de sodiu, clorura de cobalt, acid citric ~i bicarbonat de sodiu degajii hidrogen
~i dioxid de carbon. Granule din aluminat de paladiu, fixate la capac, catalizeazii 1areee
fixarea completii a oxigenului pe hidrogen cu fonnare de apii.
In incintele anaerobe potentialul de oxido-reducere poate fi monitorizat vizual.
Mai utilizat este indicatorul Fildes ~i Mac Intosh cu albastru de metilen:
a) Glucozii solutie apoasii 6% (prezervata cu un mic cristal de timol);
b) NaOH solutie 1/10 N: 6 ml in 94 ml apii distilata;
c) Albastru de metilen solutie apoasii 0,5%; 3 ml in 100 ml apii distilatii.
Cite 1 ml din solutiile a, b ~i c se amestecii intr-o eprubetii, iar continutul se fierbe
pana 1adecolorare, dupa care se plaseaza in incinta anaeroba inainte de a 0 inchide etan~.
Pe parcursu1 ~i la sIa.r~itul incubarii:
- culoarea albastra = rH nesatisfiiciitor;
- incolor = rH satisfiiciitor pentru cultivarea anaerobi1or.
2) Procedee chimice
Bulioane cu ingrediente reduciitoare (acid tioglicolic sau tioglicolat de sodiu), u~or
agarizate, pentru cre~terea vascozitiitii, ~i cu un indicator pentru monitorizarea rH-ului
(albastru de metilen sau resazurina) sunt repartizate in tuburi in co1oanii ina1ta. Cand
indicatorul de rH apare oxidat pe iniiltime mai mare de 1, de la suprafala coloanei, mediuJ
trebuie "regenerat prin fierbere 15 minute in baie de apii pentru indepiirtarea aeru1ui
solvit. Dupii regenerare, tuburile, racite brusc la curent de apii, sunt insiimanlate.
Intr-o cutie Petri creiim, prin parafinare, 0 incintii etan~ii din care oxigenu1 este
indepiirtat prin reactia cu piroga1olul in mediu a1calin (fig. 5-5). Un pachelel eu:
Piroga1ol 0,4 g,
Carbonat de potasiu 0,4 g,
Talc 4,0 g
este suficient pentru a crea anaerobioza intr-o eutie Petri cu diametrul de 11 cm.
3) Procedee biologice
Procedeul Tarozzi utilizeazii tuburi eu bulion nutritiv in care agent reduciitor
sunt fragmente de organe proaspete de animal prelevate aseptic (ficat, rinichi). Tuburile
sunt insamantate dupa verificarea sterilitatii timp de 24-48 ore la 37C.
In diametrul unei placi Petri mediul agarizat, adecvat exigenlelor nutritive ale
anaerobilor, este decupat ~i indepiirtat pe 0 liitime de 2-3 mm. Pe 0 jumatate a p1iicii
insiimantiim dens 0 bacterie aeroba foarte avidii de oxigen (e. g., Bacillus subtilis), iar pe
Pachetelcu
reducalor ,.
l
amesJec
~ 1.7'-. ~./C" --''-

II II I "~ . v/
Paraflna //// I

Fig. 5-5. ModaIitate simpIii de a erea incinta anaeroba intr-o


placa Petri eu ajutorul pirogalolului.

105
cealalta jumiitate epuizam bacteria anaeroba, imediat etan~am cutia prin parafinare. Bac-
teria aeroba consuma oxigenul ~i creeaza conditii pentru cre~terea bacteriei anaerobe.
Cultivarea pe placii Petri transformatii, chimic sau biologic, in incinta anaerobii are
posibilitati modeste ~ipennite cultivarea numai a anaerobilor dependenti de un rH relativ
scazut.
Prezervarea de contactul cu aerul a culturilor in tuburi este realizata prin acoperirea
bulionului cu un strat de ulei de parafina steril sau prin cultivare in tuburi Weinberg
(tuburi de 240/10 mm) cu coloanii de geloza moale regeneratii.
In microbiologia clinicii bacteriile anaerobe trebuie izolate prin epuizarea pe pHiei
cu mediu de culturii preredus.lnsamantarea bulioanelor anaerobe ramane indicatii pentru
hemoculturi. Practica insamantarii in paralel a unui tub cu bulion anaerob ~i a unei pliici
aerobe eu repicarea ~i identificarea izolatelor din bulion numai in absenra cre~terii aerobe
expune la erori ~i cheltuieli inutile: cre~terea in bulion poate fi initiatii doar de cateva
unitari fonnatoare de colonii care sunt lara semnificarie clinica reala.

5.2. STUDIUL CULTURILOR

5.2.1. Citirea culturilor

5.2.1.1. Caracterele de cultura includ: exigenrele de cultivare (nutrien!i,


atmosfera), intervalul necesar pentru apari!ia culturii, aspectul ~i consistenra coloniilor,
modificari ale mediului, mirosul degajat de cultura; aceste caractere orienteazii iden-
tificarea izolatelor.
Exigenlele de cultivare. Diferen!iem bacteriile in nepreten!ioase ori cu anumite
exigen!e nutritive; strict aerobe ori anaerobe, facultativ anaerobe, microaerofile,
carboxifile. Temperatura optima de cultivare face de asemenea diferentieri utile identi-
ficarii preliminare a izolatelor din prelevate patologice .
lntervalul necesar pentru aparilia culturii diferen!iaza microorganismele eu
cre~tere rapida, a caror cultura apare dupa 24-48 de ore (frecvent peste noapte), de eele
cu cre~tere lenta, care necesita zile sau saptamani pentru apari!ia culturii.
Citirea culturilorpentru aprecierea cre~terii cere 0 anume experien!a ~imulta atenrie.
Examinarea trebuie lacuta sub 0 buna iluminare oblicii, atat cu ochiulliber, cat ~i sub
lupa sau stereomicroscop, pentru a putea depista cele mai mici colonii ~i a inregistra
corect aspectullor. Citirea prin transparenta pennite sa verificiim mai corect opaeitatea
~imodificarile mediului dinjurul coloniilor. La manipularea coloniilor cu ansa observiim
consistenta ~i aderen!a lor la mediul de cultura .
Mmfologia coloniilor. Figura 5-6 sugereaza principalele repere morfologice ale
coloniilor microbiene.
Dimensiunea 0 estimam in mm. Uneori ne limitam la tenneni generici: microcolonii
I
(vizibile numai cu stereomieroscopul), colonii mici (eu diametruJ sub mm), mijlocii
(de cca 1 mm), mari (peste 2 mm).

106
Q
0.
Circulara
Bombat
Filamentoasa
.'
FORMA
Plat
Punctiforme
Convex
~.-

Neregulata 0
()O
@f
RELIEFUL Lenticulara
Dendritic a

Acuminat

Ombilicat

Papilat

MARGINILE

invazive
intregi D Ondulat-
~Filamentoase
~Erodate

D
L:s
Ondulate

Lobate

Fig. 5-6. Principalele aspecte morfologice ale coloniilor microbiene ~itermenii


folositi pentru descrierea lor.

Forma: punctifonne, circulare, neregulate (in "harta geografica"), filamentoase,


dendritice, lentieulare.
Reliefitl: plane, aplatizate, convexe, bombate, acuminate, pulvinate, ombilicate.
Marginile: intregi, ondulate, lobate, zimtate, filamentoase, cu valuri succesive de
invadare a mediului.
Suprafata coloniilor poate fi neteda, umeda, lucioasa - forma de cultura S
conditionata de hidrofilia ~iinearcatura electronegativa a structurilor microbiene de inveli~
-, sau mata, uscata, rugoasa - forma de culturii R a microorganismelor cu hidrofilie ~i
incarcatura electronegativa reduse. Alte aspecte: suprafata papilata, eu striuri radiare,
zbarcitii, catifelata, pufoasa, lanoasa, prafoasii .
Densitatea opticii: transparente, semitransparente, opace.

107
.lrizafii ale suprafeTeiunar colonii pot fi surprinse in anumite unghiuri de iluminare.
Culoarea eoloniilorpoate fi alba, galbena, aurie, neagra etc. in funqie de varietatea
pigmenTilor produ~i sau a virajului de culoare a unar indicatori inclu~i in mediul de
cultura.
Modifidiri ale mediului din jurul eoloniilor pot fi produse de citotoxine, enzime
sau pigmenTi difuzibili:
- Hemoliza pe agar-scmge poate fi de tip:
- Alfa: zona de inverzire a mediului cu numeroase hematii intacte din cauza
hemolizei parriale.
- Beta: zona complet clara, incolora, din cauza hemolizei complete.
- Alfa-prim: halou de hemoliza incompleta cu inverzire, imediat inconjurat cu 0
zona de hemoliza clara, completa.
- Gamma, de fapt un atribut impropriu, pentru ca indica absenTa hemolizei.
Denumirea se refera la coloniile streptococilor nehemolitici.
- Cald-rece: zona clara de hemoliza completa (aparuta dupa incubare la 37C)
inconjurata cu 0 zona de hemoliza mai puTin clara, dar lara modificare de culoare a
mediului (aparuta dupa incubarea in continuare la temperatura camerei sau la frigider).
- Reae{ii pe medii diferenfiale zaharate: virajul de culoare a mediului ~i
culoarea coloniilor in functie de indicatorii de pH ~i fermentarea sau nefermentarea
substratului.
- Reacfii pe lnediul eu giilbenu!j de ou:
- Lecitinaza: precipitat opac in jurul coloniilor.
- Lipaza: film circular cu irizaTie perlata in imediata vecinatate a coloniilor.
- ProteoIiza: clarificarea mediului din jurul coloniilor.
- Pigmentogeneza. Pigmentii hidrosolubili difuzeaza ~icolareaza progresiv mediul:
fluoresceina, piocianina, melanina. Revezi mai sus culoarea coloniilor.
Mirosul degajat de eultura anumitar izolate poate fi semnificativ:
- PseudolllOnas aeruginosa: aroma asemanatoare florilor de iasomie.
- Proteus: ~ocolata arsa.
- Clostridii: putrid, fecaloid, de corn ars.
- Prevotella melaninogeniea: acru.
- Nocardiile ~i streptomicetele: de subsol mucegait.
Consistenfa coloniilor poate fi untoasa, mucoasa-filanta, a albu~ului de ou bine
batut spuma, friabila, cretoasa, pasloasa, pieloasa.
Aderen(a la mediu: neaderente (antrenate de ansa aluneca pe suprafata mediului),
puTin aderente, aderente, incastrate in mediu.

5.2.1.2. Caracterele microscopice. Identificarea microscopica a unei bacterii


izolate 0 facem dupa:
Dimensiunea, forn1a ~i a~ezarea celulelor bacteriene; prezenta sau absenta unor
structuri cum sunt: endosporii, granule metacromatice.

108

..
Afinitatea tinctoriaUi (reactii de culoare) deteffilinata prin colorariile diferenriale
Gram, care imparte bacteriile in gram-pozitive (violete), gram-negative (ro~i) ~i gram-
variabile, colora!ia Ziel-Neelsen (sau coloratii inrudite), care impart bacteriile in aeido-
rezistente (ro~ii) ~ineacido-rezistente (albastre).
Circumstan!ele izolarii, caracterele de cultura ~imicroscopice pennit 0 identificare
precoce a unor bacterii, utila pentru decizia terapeutica inainte de identificarea speeiei ~i
de antibiograma. E. g., izolarea, din hemoculturi sau exsudate seroase ori puroi aspirat
prin punc!ie, a unor coci gram-pozitivi a~ezati in ciorchini, care fomleaza colonii mari,
bombate, opace, galben-aurii, ~-hel110litice, eu consisten!a untoasa sugereaza un Staphy-
lococcus; izolarea dintr-un exsudat a unor coei gral11-pozitivi a~ezari in lanturi, care
formeaza colonii miei, transparente, cu 0 zona larga de b-hemoliza sugereaza un Strepto-
coccus.
Regulat recurgem la colora!ia Gram. Colora!ii pentru baeteriile acido-rezistente
sunt utile in circumstante clinice care sugereaza prezenta unor asemenea baeterii (infectii
granulomatoase eronice etc.).
Pentru a simplifica descrierea ~i inregistrarea caracterelor morfotinctoriale ale
bacteriilor sugeram umlatoarele categorii microscopice mai freevent izolate sau observate
in prelevate patologice:
1) Actinomicete: bacterii filamentoase, ramifieate, gram-pozitive, cu aspeete de
pseudo-hife intre!esute in pseduo-micelii laxe. La efectuarea frotiului prinmi~cari brutale
ale ansei, pseudo-hifele se pot fragmenta in fonne bacilare difterimorfe.
2) Bacillus: bacili aerobi gram-pozitivi, unii miei (0,5/1,2 /lm), al!ii mari (2,5/1 /lm),
cu capete rotunjite sau retezate drept, izola!i sau fonmlnd lanfliri lungi; poarta cate un
endospor, mai frecvent oval (dar la unele specii pot fi ~i sferici) central sau subtermina],
care mai frecvent nu defoffileaza sporangiul (dar la unele specii i1pot defoffila). Sporangiul
apare unifoml colorat sau vacuolar. Speciile de Bacillus morfologic asemanatoare eu
Bacillus anthracis (bacili gram-pozitivi mari, cu capetele retezate, inliintuiti ~i cu spor
central, oval, care nu defonneaza sporangiul) Ie numim uzual bacili antracoizi.
3) Bacteroidacee: bacili anaerobi, gral11-negativi, nesporulati, drepti, ineurbati sau
helieoizi, polimorfi.
4) Clostridii: bacili anaerobi, gram-pozitivi sau gram-variabili, cu lungimi variate
pana la forme filamentoase, cu capetele rotunjite, ascutite sauboante, izolati, in pereehi
sau formand scurte lanfliri; pomia cate un endospor oval sau sferic, care, uzual, defol111eaZa
bacilu!.
5) Corinebacteriile (bacili difterimorfi): bacili maciucati, frecvent gram-variabili
cu granulatii metacromatice polare, a~ezati in palisate ~ilitere unghiulare (aspect de litere
ehineze~ti).
6) Enterobacteriacee: bacili gram-negativi, ocazional colorati bipolar, mai frecvent
mari (0,3-1/1-6,0 /lm), cu capetele rotunj ite, izola!i, ocazional a~ezati in perechi.
7) Hemojili: mici bacili polimorfi (fonne cocobacilare pana la filamentoase) gram-
negativi, aerobi: cultiva dependent de prezen!a factorilor X ~i V.
8) Neisserii: diplococi gram-negativi, renifol111isau in boabe de cafea. '
9) Pneumoeoei: diplococi gram-pozitivi, ovali sau in flacarii de lumanare, capsulari
in prelevatele patologice.
10) Pseudomonade: bacili gram-negativi fini, drePti sau u~or incurbati.
II) Stajiloeoci: coci sferici, gram-pozitivi, a~ezati in ciorchini, eventual in perechi
sau izolati.
12) Streptoeoci: coci gram-pozitivi, sferici sau ovali, a~ezati in perechi ~i lanruri.
13) Bacii aeido-rezisten{i.
Predicria acestor categorii microscopice penttll bacteriile dintr-un anumit gen este
maximala la bacilii acido-rezistenti, c10stridii ~i Bacillus, stafilococi, streptococi ~i
neisserii, dar scade la 0,8 pentru pseudomonade, la 0,63 pentru enterobacteriacee ~i la
0,44 pentl1l bacteroidacee sau Haemophilus.

5.3.IDENTIFICAREA BACTERIILOR IZOLATE

5.3.1. Scurta introducere in taxonomie

Diversitatea tot mai crescuta a microorganismelor utile sau dauniitoare impune


indentificarea lor cat mai precisiiin scopul separiirii celor dorite de cele nedorite ori al
dignosticului etiologic ~i terapiei etiotrope a bolilor infectioase.
La lucrurile ~i fiinrele inconjuratoare ne referim cu un nume, nu Ie descriem cu
ansamblul caracterelor pe care Ie au.Pentru aceasta omul a observat, a comparat lucrurile,
fiintele s-au fenomene1e, le-a reunit pe cele asemanatoare in grupe (unitati) pe care le-a
aranjat intr-o anumita ordine (c1asificat) ~ile-a marc at (numit). In raport cu aceste sisteme
de unitati marcate putem identifica, prin comparatie, un obiect, un fenomen sau 0 fiintii
nou observata. Aceasta este esenta ~tiintei pe care 0 numim taxonomie ~i care
inmiinucheazii trei domenii distincte, dar intrepatrunse, ale cunoa~terii: clasificarea,
numirea ~i identificarea. Metaforic, taxonomia a fost comparata cu un coctail pe care
consumatorul 11savureaza, dar numai cei initiati ii recunosc ingredientele.
(1) Clasificarea obieetelor este Tacuta dupa insu~iri aparente. Este 0 clasificare in
chei. 0 cheie reune~te obiectele care au in comun caractere u~or de recunoscut. In Jumea
vie 0 asemenea clasificare expune la erori din cauza evolutiei divergente sau convergente
a unor caractere (e.g., liliecii zboara, dar nu sunt pasiiri etc.).De aceea unitatea de
clasificare a vietuitoarelor trebuie sa corespunda unei grupari naturale particulare. Un
taxon biologic reunete indivizi asemanatori datorita deseeden{ei dintr-un stra1710,'iCOl71Ull,
deei posesori ai unei b!forma{ii genetiee e0111une. Aadm; clasifiearea organismelor vii
este jilogenetiea.

Specia, taxonul de baza ai lumii vii, este 0 comunitate reproductiva f0l111atadin


populatii care habiteaza un anumit areal ~iai carei indivizi se incruci~eaza liber in natura,
cu arice individ de sex opus, dand descendenti viabili ~i fertili. Speciile aparute prin
evolutie divergenta dintr-un stramo~ comun sunt renumite intr-un gen; genurile cu origine
comuna in familii; familiile in ordine; ordinele in clase, clasele in diviziuni; diviziunile
in regnuri.
110
Spre deosebire de clasificarea organismelor eucariote, clasificarea celor procariote
intampina dificultati, dintre care retinem:
- Numarul redus de caractere morfologice;
- Insuficienta amprentelor fosile, care reflect a filogenia;
- Nu poate fi studiat un individ, ci 0 populatie, pe care 0 numim tulpina;
- Aparitia frecventa in populatiile bacteriene a un or variante genetice, care, sub
presiuni selective ale mediului, genereaza clone diferite prin unele caractere, Tara ca
apartenenta la aceea~i specie sa fie alterata;
- Inmultirea exclusiv vegetativa face dificil de recunoscut discontinuiHitile in
evolutia divergenta a unei specii procariote. Ca atare, specia bacteriana este definita ca
un grup de tulpini cu multe caractere comune prin care difera semnificativ de alte tulpini.
In stadiul actual specia bacteriana este fom1ata dintr-un grup de tulpini alese de taxono-
mist.
Clasificarea bacteriilor cere cuno~tinte obtinute prin tehnici speciale de observare
a morfologiei ~i structurii, fiziologiei ~i activitatii biochimice, biologiei moleculare ~i
geneticii, structurii antigenice etc.
Caracterele folosite pentru clasificare trebuie sa fie genetic stabile. Valoarea unui
criteriu taxonomic variaza cu grupul biologic care trebuie comparat. Un caracter prezent
sau absent la toti membrii unui grup nu poate fi folosit pentru a diferentia membrii sai,
dar poate defini grupul (e. g., toti stafilococii au catalaza, toti streptococii nu au catalaza).
Caracterele instabile genetic nu sunt criterii taxonomice (e.g., caracterele codificate
plasmidic: plasmidele pot fi transmise interspecific sau pot fi pierdute).
Perspectiva spre clasificarea natural a a organismelor procariote este deschisa prin
tehnicile moderne de studiu: (I) Studiul continutului relativ de guanina + citozina (G+C)
al ADN purificat. Cu cat continutul G+C a doua bacterii este mai apropiat, cu atat acestea
sunt mai inrudite. (2) Omologia secventelor nucleotidice ale ADN cantificata prin
fonnarea moleculelor hibride pomind de la doua catene ADN cu origini diferite. (3)
Studiul secventelor oligonucleotidice ale ARN ribosomal. (4) Studiul structurii primare
a enzimelor izofunctionale sau a citocromului c. (5) Studiul imunologic al proteinelor
bacteriene omoloage (catalaze, aldolaze etc.).
(2) Numirea ~tiintifica a microorganismelor este rucuta dupa caracterele lor
observate ~i in acord cu nonne internationale. Conform acestor norme specia este
denumita, dupa sistemul binominal al lui Linne, prin doua cuvinte latinizate, care
caracterizeaza cat mai sintetic microorganismul in cauza.
Primul cuvant, scris cu litera initiala majuscula, indica genul ~i este un substantiv
sau adjectiv la singular. El precizeaza particularitati morfologice (Staphylococcus = s.
gr. staphyle, ciorchine de strugure; s. gr. coccus, boaM; coci a~ezati in ciorchini), habitatul
natural al organismului (En terococcus = s. gr. enteron, intestin; s. gr. coccus, boaba; coci
care traiesc in intestin); sau numele unui savant 'cu rnerite deosebite in descoperirea
microorganismului (Escherichia = Theodor Escherich, bacteriolog german). Latinizarea
numelor de gen este rucuta prin sufixele: -um, -us, -as, -a respectiv Clostridium,
Steptococcus, Pseudomonas, Treponema etc.

III
Al doilea cuvant este un epitet specific descriptiv pentru specie ~i scris cu litera
mica. El poate fi un adjectiv acordat cu numele genului (Staphylococcus aureus, 0 specie
de Staph:vlococcus care produce pigment auriu), un substantiv la genitiv (Mycobacte-
rium chelonae, 0 specie de Mycobacterium gazduita de broa~te !estoase), un nume propriu
la genitiv (Rickettsia prmvazekii, 0 specie de Rickettsia numita in memoria bacteriologului
gem1an Stanislas von Prowazek rapus de tifosul exantematic pe care 11studia).
Cand intr-un text numele genului se repeta, poate fi prescrutat prin ini!iala, daca
aceasta nu creeaza confuzii (Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. capitis ~.a.).
Identificarea unei bacterii numai pana la nivel de gen este men!ionata prin numele
genului urmat de abrevierea spp., 0 specie a genului.
Sufixe diferen!iate latinizeaza numele familiilor (-aceae, Enterobacteriaceae),
ordinelor (-ales, Spirochaetales) sau clasele (-es, Mollicutes).
Observa!i ca numele ~tiin!ifice ale taxonilor biologici sunt scrise cu caractere italice,
iar numele taxonilor de rang superior, incepand cu genul, sunt scrise cu litera initiala
majuscula. in activitatea curenta, nu in documente oficiale (e.g., buletine de analiza
microbiologica) ori texte academice, put em folosi denumiri comune, acceptate prin
consens: meningococ = Neisseria In en ingitidis, bacilullui Koch = Mycobacterium tu-
berculosis, specie descoperita de Robert Koch.
(3) Identificarea este, in esen!a, utilizarea practidi a schemei de clasificare.
Cheile dihotomice de identificare nu sunt "sisteme de c1asificare", ci instrumente
de analiza antitetica: pun intrebari la care raspunsul este DA sau NU. Aceasta u~ureaza
mult compararea caracterelor unei tulpini necunoscute ell cele ale unei specii tip conservata
intr-o coleqie. Cheile dihotomice sunt utile la identificarea preliminara a unei bacterii,
dnd examinihn caractere foarte stabile genetic la grupe mari de bacterii, cum ar fi caractere
microscopice, producerea de catalaza, de oxidaza etc. (e.g., un coc gram-pozitiv catalazo-
pozitiv poate fi Staphylococcus, Micrococcus, dar niciodata Streptococcus). ldentificarea
speciilor prin ehei dihotomice expune insa la erori: un singur earaeter inconstant prezent
sau 0 eroare analitica denatureaza toate etapele ulterioare ale algoritmului de identifieare.
Taxonomia numeridi este metoda de identificare celmai larg folosita in prezent.
Schemele de elasifieare numeriea se bazeaza pe un mare numar de caraetere taxonomice
(in jur de 100). Computerul grupeaza tulpinile pe baza freeven!ei cu care exprima
earacterele fenotipiee. Nivelul uzual prestabilit de similaritate globala este de eel putin
80%. Cu aeeste date este eonstruita 0 matriee de treeven!a ea tem1en de comparatie
pentru identifiearea tulpinilor neeunoscute. Deci, in locul speciei tip, reale, taxonomia
numeric a ofera ca tennen de compara!ie 0 abstrac!ie numerica, matricea de frecventa.
Sinonime sugestive pentru taxonomia numerica sunt: taxonomia computerizata,
taxometrica sau fenetica.
Grupari infraspecifice (subtiparea) ~i aplicatiile lor. Frecvent, in cadrul speciilor
microbiene sunt delimitate grupari infraspecifice (variante) definite antigenic (serovar),
prin activitatea biochimica (biovar), prin sensibilitatea la anumi!i bacteriofagi (lizovar)
~.a.m.d. Ocazional folosim ~i denumirea fonnata prin sufixul -tip: serotip, biotip, lizotip
etc. Gruparile infraspecifice pot fi utili marcheri epidemiologici prin care um1arim filia!ia
cazurilor intr-o epidemie.

112
Valoarea unui sistem de subtipare este masurata prin capacitatea discriminatorie ~i
fiabilitate.
Discriminarea. Un marcher are putere de discriminare cu atat mai mare cu cat
permite repartizarea microorganismului studiat intr-un mare numar de tipuri dintre care
nici unul nu este foarte raspandit. Capacitatea discriminatorie redusa a unui marcher
epidemiologic expuse la rezultate fals pozitive.
Piabilitatea depinde de stabilitatea genetica a caracterului marcher. Lipsa de
fiabilitate are efect opus capacita!ii discriminatorii reduse: rezultate fals negative. Probcibil
nici unul din sistemele clasice de subtipare nu este total fiabil.
Biologia moleculara ne ofera acum sisteme de subtipare cu excelenta capacitate
discriminatorie ~imare fiabilitate: e.g., analiza profilului plasmidic, digestia endonucleazica
de restric!ie a ADN cromosomal sau plasmidic, electroforeza in camp pulsatil ~i electro-
foreza enzimatica multiloculara, ribotipia ~ianaliza prin amplificare genica a fragmentelor
rezultate dupa digestia ADN cu endonucleaze de restric!ie, amplificarea ADN polimorf,
secventierea ADN etc
Clasificarea organismelor procariote a fost insa grevata de dificultati din care
re!inem:
- numarul redus de caractere morfologice ~i insuficien!a amprentelor fosile, care
reflecta filogenia;
- nu poate fi studiat un individ, ci 0 populatie bacteriana;
- aparitia frecventa in populatiile bacteriene a unor variante genetice, care, sub
presiunea selectiva a factorilor de mediu, pot genera clone diferite numai prin unele
caractere de popula!ia parentala ~i care nu altereaza apartenenta la specie;
- inmultirea exclusiv vegetativa face dificil de recunoscut discontinuitatile in
evolutia divergenta a unei populatii procariote.
Populapa este 0 multime de indivizi ai unei specii care habiteaza un anumit biotop.
Populatii ale aceleia~i specii pot sa difere intre ele prin caractere selectate sub presiunea
factorilor de mediu proprii diverselor biotopuri (nutrien!i, factori antimicrobieni etc.).
Biotopul este 0 portiune de spatiu, cu conditii de viata particulare, populata ~i
transfonnata de un ansamblu de organisme vii care constituie 0 biocenoza.
Clona este 0 popula!ie care rezulta dintr-o singura celula prin inmultire vegetativa.
Tulpina microbiana este 0 populatie a unei specii constituita din descendentii
unei singure izolari in cultura pura, pe care microbiologul 0 manipuleaza in scopul
studierii.
In contextul conturat, specia bacteliana ar putea fi privita doar ca 0 grupare de tulpini
cu multe caractere fenotipice comune prin care difera semnificativ de alte tulpini. Acesta
este insa motivul pentru care clasificarea bacteriilor a fost supusa unor repetate remanieri.
Exceptand utilizarea sondelor de acizi nucleici sau reactiile de amplificare genic a
(vezi Cap. 26), tehnicile taxonomice l110demedepa~esc necesitatile microbiologiei clinice,
unde microbiologul recurge in continuare la studiul caracterelor fenotipice, dar, ca ten11en
de referinta, folose~te noile clasificari tot mai apropiate de clasificarea natural a a
microorganismelor.

113
La 0 tulpina care nu a fost inca identificata, ne referim cu denumirea de "izola1";
dupa identificarea genului, pana la identificarea speciei, ne referim cu numele genului
Ulmat de abrevierea sp. (de la specie, 0 specie a genului; e. g., Staphylococcus sp.).
Pentru identificarea bacteriilor, analiza caracterelor fenotipice studiate poate fi
Ia.cuta prin doua metode: secventiala ~i simultana.
Metoda secventiala utilizeaza chei dichotomice, instrumente de analiza antitetica:
pun intrebiiri la care raspunsul este DA sau NU. Caracterele cheie pozitive devin markeri
sau caractere de diagnostic de la care pomesc alte asemenea intrebari pana la incadrarea
bacteriei in specie.
Metoda simultana studiaza toate cracterele unui organism necunoscut, iar unitatea
taxonomica este stabilita prin comparatie cu tabele de identificare.
Desigur, arice test pentru depistarea caracterelor fenotipice are 0 anumitii
reproductibilitate legata de calitatea reactivilor, experienta personalului ~.a. Un rezultat
fals pozitiv sau fals negativ duce mai frecvent la identificari eronate prin metoda secventiala
(mai ales cand eroarea se produce in secventele initiale) decat prin metoda simultana. Dar
metoda secventiala are avantajul incontestabil al comparatiilor rapide, operative. De aceea.
la sugestia lui S. T. Cowan, recomandam 0 conduita eclectica bazata pe controlul riguros
de calitate a testarilor, mai ales in etapa secventiala (vezi Cap. 28-38; 40, 41).

5.3.2. Necesitatea culturilor pure


La repicarea unei culturi impure, care asociaza doua organisme, apare una din
um1atoarele patru posibilitati: (I) cele doua organisme devin comensale; (2) cele doua
organisme se asociaza intr-o simbioza; (3) un organism il antagonizeaza pe celalalt; (4)
un organism cre~te mai repede ~i illipse~te pe celalalt de nutrienti esentiali. In primele
doua cazuri testarea culturii impure poate duce la 0 sumare de rezultate care nu
caracterizeaza nici unul dintre organismele asociate, ci pe un al treilea inexistent in
cultura, evident 0 eroare. In ultimele doua cazuri va fi caracterizat organisl11ul care a
acaparat cultura ~i care poate sa nu fie in mod necesar organisl11ulum1arit, ci organismul
de il11purificare.

5.3.3. Caractere fenotipice studiate pentru identificarea bacteriilor

Caracterele de culturii ~i cele l110rfo-tinctoriale pennit selectarea algoritmului de


identificare a izolatelor semnificative clinic. Urmeaza studiul metabolismului ~i
activitatilor biochimice, sensibilitatea la agenti fizici ~i sensibilitatea sau toleranta la
agenti chimici.
Metabolismul$i activitii{ile biochimice Ie studiem pe medii speciale de identificare
in care, prin anum* indicatori, unnarim l110dificarea substratului unui anumite enzime
bacteriene. Astfel unnarim:
Functia respiratorie prin: testul catalazei, testul oxidazei, reducerea nitratiJor.
Actiunea asupra carbohidratilor:
a) Modul de atac asupra zaharurilor: oxidativ sau fermentativ (testul Hugh ~i
Leifson).

114
b) Calea fenl1entativa: calea acida mixta (testulla ro~umetil) sau calea butilenglicolica
(testul Voges-Proskauer).
c) Spectrul fenl1entativ al carbohidratilor.
Utilizarea unei anumite surse de carbon: citrat, acetat, malonat.
Actiunea asupra compu~ilor azotati: decarboxilarea sau dezaminarea
aminoacizilor, producerea de indol, de hidrogen sulfurat, hidroliza ureei, a hipuratului.
Hidroliza unor sub stante biologice complexe prin producere de proteinaze, 1ipaze,
fosfolipaze, dezoxiribonucleaze, hidroliza amidonului etc.
Sensibilitatea sau toleranta la agentifizici sau chimici:
Sensibilitatea la diferite temperaturi.
T01eranta la conditii extreme de pH, salinitate, bila .
Sensibilitatea la optochin, la bacitracina etc.
Indicatiile, principiul, mediile de cultura, procedura, interpretarea ~i controlul de
calitate al acestor teste sunt detaliate in Cap. 39 ~i 40.
Frecvent, In cadrul speciilor microbiene se delimiteaza taxoni infraspecifici
(variante) definiti antigenic (serovar), prin sensibilitatea la anumiti bacteriofagi (Iizovar),
activitatea biochimica (biovar). Taxonii infraspecifici pot fi utiliza$i ca markeri
epidemiologici. In microbiologia clinica ne limitam la identificarea antibio-varurilor
(antibiograma, rezistograma)$i, uneori, la identificarea serovarurilor unor specii sau a
un or caractere particulare de patogenitate (toxigeneza, capacitati entero-invazive).

5.4.INREGISTRAREA REZULTATELOR

De$i acest capitol nu da amanunte privind prelucrarea $i conduita examinarii


diferitelor prelevate patologice, prin diteva exemple modul de unl1arire $i inregistrare a
rezultatelor unei culturi.
Dupa citirea primoculturii unui prelevat patologic identificat prin numarul de
inregistrare $i data insamantarii, fiecare tip de colonie este numit prin litere mici ale
alfabetului (a), (b), (c) $. a. $i inregistrat in caietul de lucru in ordinea prevalentei (con-
form simbolurilor conventionale din tabelul 5-1) cu date rezumative privind caracterele
de cultura $i microscopice. Izolatele clinic semnificative sau virtual semnificative sunt
apoi repicate pentru purificarea culturii$i studiu sub numele codificat prin reperele
enuntate mai sus.
Exemple:

Nr. 551. TAMPON FARINGIAN - amigdalita


Ziua I: AS/O] (AS = agar-sange; 02 = aerob);
a) +++0,5 mm transparente, acuminate, b-he111olitice, gram-pozitivi,
streptococi;
b) +++0, 1m111a-he11101itice;
c) + 1 111m,R, zharcite, aderente.
a) latex aglutinare, grup Lancefield:
A: +; C: -; G: -.
Deci 551 (a) este tulpina 551 de Streptococcus pyogenes; 551 (b) $i 551 (c) nu au
fost studiate fiind clinic nesemnificative.
NI: 612. MATERII FECALE - febra enterica (?)

115
Ziua 1: ADCL (ADCL = agar dezoxicholat lactoza);
(a) +++3 mm, L - cu centru negru;
(b) ++2 mm, L - eu centru brun;
(c) + 3 mm, L +.
Repicare din bulion selenit pe ADCL.
(a) 1, (a) 2; (b) 1, (b) 2 repicari pe AABTL, TSI, MILF
(AABTL = agar albastru de brom-timollaetoza;
TSI = mediu politop: triple sugar iron:
MILF = me diu politop: mobilitate, indol, lizindeearboxilaza, feniJalanin-
dezaminaza).
--
, 2 +A+(b)+(b)
+2 12 -
+
Ziua AG AG
(a) (a) 1 +-
AG +; +.
a:la grup
Hd: D:
Glucoza
ri anti-Salmonella: 612 (b) 2: anti-Salmonella polivalent:

Deci 612 (b) 2 este tulpina 612 de S. enterica serovar Typhi.


N,: 303. PUROI

Ziua 1: AS/02;
a) ++++ 2 mm, rotunde, bombate, galbene, ~-hemolitice; gram-pozitivi,
stafilococi;
b) + 1 mm, rotunde, bombate, albe, nehemolitice; gram-pozitiv,
stafilococi.
a) Coagulaza: pozitiva.

Deci 303 a) este tulpina 303 de Staphylococcus aureus.

Ziua 2: AS/ AnC02 (AnC02 = anaerobioza cu 5% CO);


c) ++++ 1 mm, rotunde, bombate, galbene, ~-hemolitice; gram-pozitivi,
stafilococi (ca a);
d) + 1 nm1, rotunde, albe, nehemoJitice; gram-pozitivi, stafilococi (ca b);
e) + punctiforme, transparente, gram-pozitivi, bacili difteroizi.

116
6. CUANTIFICAREA MICROORGANISMELOR
(DUMITRU BUlUC)

6.1. METODE BlOLOGICE Numararea coloniilor din picatura


6.1.1. Tehnici cantitative 6.1.2. Tehnici semicantitative
Numararea In placi tumate 6.2. METODA NEFELOMETRICA
Numararea dupa epuizare pe suprafata mediului

Patru sunt circumstan!ele care impun cuantificarea baeteriilor in microbiologia


clinica:
1) Stabilirea se11lnifica!iei clinice a unor izolate din prelevate patologice, CLlmsunt
urina $. a. Cei interesa!i asupra indica!iilor examenelor microbiologice cantitative pentru
diagnosticul, trata11lentul $i prognosticul infeqiilor umane pot consulta exeelenta
monografie a lui S. C. EDBERG (1981).
2) Controlul de calitate al mediilor de cultura.
3) Testarea sensibiliUi!ii bacteriilor la antibiotice.
4) Testarea eficientei solu!iilor dezinfectante.
In to ate aceste circumstante, suntem interesati, de numarul bacteriilor viabi/e $i nu
de numarlillor total.
Toate metodele de cuantificare a bacteriilor viabile au limite de reproductibilitate
care decurg din:
Dispersia individual a nesatisrucatoare a bacteriilor din suspensii. Mai ales in
faza logaritmica de cre$tere, bacteriile se aglomereaza. Astfel, ceea ce numaram noi in
realitate sunt unita{iformatoare de colonii (UFC), care pot varia de la 0 singura celula
bacteriana pana la aglomerari de zeci, sute sau chiar mii de organisme. Erorile sunt
cuprinse intre 90% pentru suspensiile cu concentra!ii intre 104 $i 105 bacteriUml, chiar
cand insaman!am 11laimulte placi in paralel.
Repartitia neomogena a bacteriilor, mai ales in prelevatele muco-purulente,
fibrinoase.
Pentru numararea bacteriilor viabile utilizam metode biologice, iar pentru
determinan'a numarului total de bacterii (organisme vii + organisme momie) - metoda
nefelometric. a. Totu$i, metoda nefelometrica, mai rapida $imai simpla deeM cele biologice,
poate estima satisrucator $i nU11laruibacteriilor viabile daca facem detel111inarilein plina
faza logaritmica a culturii.

6.1. METODE BIOLOGICE

6.1.1. Tehnici cantitative

Principiu: Exista 0 corela!ie intre numarul coloniilor dezvoltate, dintr-un volum


dat al unei suspensii pe 0 placa eu un anumit mediu de cultura, $i concentratia UFC din
suspensia bacteriana.

117
Necesar:
1) Tuburi 16/160 mm ~i stativ pentru tuburi.
2) Pipete gradate sterile: una de 10 mL ~i mai multe pipete de 1 mL, in raport cu
numarul dorit de dilutii.
3) Diluant steril: apa peptonata 0, I %.
4) Tuburi cu 10 mL mediu agarizat.
5) Placi Petri cu diametrul de 9 em.
Exigen{e:
1) Evita utilizarea apei distil ate sau a solutiei saline izotone ca diluant; pot fi letale
pentru unele bacterii. Cel mai bun diluant pentru uz general este apa peptonata 0, 1%, iar
pentru omogenizarea ~i diluarea probelor biopsice bulionul tioglicolat.
2) Echilibreaza diluantulla temperatura camerei pentru a evita moartea unar bacterii
prin ~oc tennic in diluant la temperatura frigiderului.
3) Utilizeaza pipete foarte curate pentru a evita adsorbtia bacteriilor pe il11puritatile
de pe pipeta; pipetele silieonate sunt l11aibune.
4) Verifica dad varful pipetei este intreg ~i nu utiliza pipete ciobite sau cu varful
reracut.
5) Pipeteaza cu pipeta in pozitie vertical a ~i observa meniscul fluidului eu raza
vederii orizontala.
6) Evita riscurile ~i erorile cauzate de fonnarea bulelor de aer, preeum ~i pipctarea
rapida, brutala, cand se fonneaza mai multi aerosoli ~i pana la 0, I mL fluid pot ral11ane
pe pipeta.
Proceduri:
Indiferent de tehniea aleasa, procedura incepe cu pregatirea dilutiilor. Pentru
aeeasta, cu pipeta de 10 mL, repartizeaza cate 9 mL diluant in tuburi sterile. Tuburile
cu capac in~urubat pot fi apoi autoclavate ~i eonservate la frigider. Daca folose~ti
dopuri din bUl11bacsau eu capac din aluminiu aplieat, repartizeaza aseptic diluantul
steril ~i folose~te tuburile imediat; ~i autoclavarea, ~i conservarea la frigider modifiea
in aeeste cazuri volumul de diluant .

Diluarea probelor flu ide


1) Numeroteaza ~i a~eaza tuburile eu diluant in stativ.
2) Omogenizeaza proba prin agitare ~ipreleva 1 mL, eu varful pipetei eufundat la
maximum 1,5 em sub nivelul fluidului.
3) Transvazeaza eantitatea prelevata in primul tub cu diluant mentinand varful
pipetei la maximum 1,5 em deasupra nivelului de diluant. Dupa scurgerea fluidului, laS3
pipeta pe loc eca 3 secunde apoi retrage-o cu grija pentru a nu atinge peretii tubului.
Depune pipeta in borcanul eu dezinfeetant.
4) Cufunda 0 noua pipeta eu varfulla maximum 1,5 em sub nivelul de liehid din
primul tub ~i omogenizeaza continutul prin aspirare ~irespingere de 10 ori, rara a f011113
de bule de aer. Transvazeaza 1 mL din continutul omogenizat in al doilea tub proeedand
ca la punctul (3). Depune pipeta in borcanul cu dezinfeetant sau pastreaz-o in primul tub
(vezi maijos).

118
5) Procedeaza in continuare ca la punctul (4) pentru a trasnvaza, cu 0 noua pipeta,
1 mL din tubul 2 In tubul 3 ~. a. m. d. confonn tabelului 6-1.
Tabclll16-1

DiJuarea decimaHi a bacteriilor dintr-o suspensie


Nr. tubului 0,01
5a.oool
20.0000
0.001
10'2
10" 310,4 I1 0,1
410'3 10,1

Daca nu schimbi pipeta dupa fiecare dilutie, erorile se cumuleaza.


Pentru cuantificiiri nprobe biopsice, frecvent de dimensiuni reduse,
1) Ciintiire~te proba Impreuna cu recipientul in care a fost transportatii.
2) Transvazeaza proba in tubul Griffith sau mojar pentru omogenizare.
3) Cantare~te din nou recipientul de transport. Diferenta intre prima ~i a doua
cantarire indica greutatea probei.
4) Omogenizeazii proba cu un volum de diluant de 9 ori mai mare decat masa sa.
Presupunand ca acum bacteria este raspanditii unifom1 Intre faza dispersii ~i cea de
dispersie, obtii astfel dilutia initiala de 10'1.
5) Procedeaza In continuare confom1 indicatiilor din tabelul 6-2 pentm a ob!ine
unnatoarele dilutii decimale.
Ta be/II I 0-2
DiJuarea decimala a bacteriilor dintr-o proba biopsicii
Nr. tubului O.OOl
210,3
410':'
310,4 1 0.01
0.00001
0,0001 10'2

Daca greutatea probei este foarte mica ~ivolumul dilutiei 10.1 nu pennite 0 pipetare
exacta, se poate proceda la omogenizare cu ob!inerea unei dilu!ii ini!iale mai mari.
A) Numiiriitoarea npliici turnate este tehnica de referinta.
1) Tope~te mediul agarizat necesar ~i race~te tuburile la 45C in baie de apa.
2) Marcheaza In acest timp minimum doua pHici Petri per dilutie,
3) Pipeteaza in centrul fiecarei placi cate ImL dilu!ie folosind numai pipeta dilutiei
respective mentinuta in tub. Mai corectii este folosirea pentru fiecare dilutie unei pipete
noi, dar consumul de material devine excesiv. Mentine ridicat capacul placii numai
intervalul strict necesar pipetarii.
4) Toama imediat mediul de culturii dintr-un tub ~i agita u~or placa, prin mi~cari
circulare intr-un diametru de cca 15 cm, de care ori in sens orar ~i anti-orar, apoi de 6 ori
inainte ~i Inapoi pe distanta de cca 15 cm,
5) Lasa mediul sa se gelifice, apoi incubeaza pHicile, cu capaculln jos, 24-48 de
ore la temperatura favorabilii cre~terii.
6) Minimizeaza eroarea, selectand pentru numiiriitoare placile insamc1n!ate Cll
dilutii1e din care s-au dezvoltat Intre 30 ~i 300 de colonii. Plaseaza placa Tara capac, Cll

119
stic1a in sus, pe caroiajul de numarare, bine iluminat prin transparenta ~i, sub lupa,
marcheaza cu creionul de scris pe stic1a fiecare colonie reperata, Folosirea in acest scop
a unui contor de mfma este mai comoda.
Daca nici una din dilutii nu a dat mai putin de 300 colonii, alege placile insamantate
cu dilutia cea mai mare, imparte placa in patrimi sau optimi ~inumara coloniile dintr-un
sector. Pentru calcul multiplica numarul obtinut cu totalul sectoarelor per placa.
7) Calculeaza numarul mediu de colonii dezvoltate per placa la 0 anumita dilutie.
Numarul unitatilor fonnatoare de colonii/mL este egal cu produsul dintre numarul mediu
al coloniilor per placa ~i inversul dilutiei insamantate.
B) Numararea dupa epuizare pe suprafafa mediului este mai putin exacta, dar
satisface exigentele clinice pentru uroculturi, care confrunta laboratorul cu un mare numar
de probe ~i impun diferentierea izolatelor dintr-o proM dupa aspectul coloniilor. Or, la
numararea in placa tumata, coloniile aceleia~i bacterii pot avea trei aspecte, dupa cum
s-au dezvoltat pe suprafata mediului, in profunzime sau intre mediul de cultura ~i sticla.
1) Depune cu micropipeta 0,1 mL dilutie a suspensiei microbiene in centrul unei
placi Petri cu suprafata mediului bine uscata.
2) Disperseaza unifonn inoculul cu etalorul de sticla steril prin mi~cari de du-te -
vino in timp ce rote~ti placa. Se poate folosi ca etalor ~i capilarul inchis al unei pipete
Pasteur cudat in crosa. In final descrie cu etalorul 0 mi~care continua pe circumferinta
plficii pentru a nu lasa acumulari de lichid la acest nive!.
3) Mentine placile cu capacul intredeschis cca 0 ora la 37C pentru adsorbtia
inoculului, apoi incubeaza-le cu capacul injos ~i numara coloniile.
4) Calculeaza unitatile fonnatoare de colonii dupa fonnula:
D
X=Nx vo 1umu l~lllsamantat
~ -~--,
unde:
X = numarul unitiitilor fom1atoare de colonii/mL;
N = numiirul coloniilor per placii;
D = inversul dilutieL
Pentru economie de materiale, la efectuarea curentii a uroculturilor cantitative,
cand unnarim numai un anumit prag ~i un ordin de marime al concentratiei bacteriene
din proba, ne putem rezuma la insamantarea numai a dilutiei 10-2
C) Numararea coloniilor din picatura. Metoda MILES ~iMISRA este larg indicata
pentru testarea calitatii mediilor de cultura ~i capacitatii bactericide a substantelor
antimicrobiene.
1) Usucii bine suprafata pliicilor timp de 30 minute la 37C ~i marcheazii distinct
sectoare pentru fiecare piciiturii.
2) Depune cate 20 mL din fiecare dilutie pe cel putin cinci sectoare (fig. 6-1).
Pentru aceasta tine pipeta vertical, cu viirfulla cca 2 cm de suprafata mediului (evita
raspandirea de stropi la impactul tluidului cu mediu).
3) Mentine pliicile cu capacul in sus pana la uscarea picaturilor, apoi intoarce pliicile
cu capacul in jos pentru incubare.

120
Fig. 6-1. Depunerea piditurilor in seetoare 10 _1
pe pladi en agar nutritiv pentru euantifiearea
baeteriilor prin metoda Miles ~iMisra.

10 - .

4) Cu ajutoml unei lupe de mana examineaza cre~terea din circumferinta picaturilor.


Alege pentm numarare dilu!iile care au dat intre 10 ~i 40 colonii.
5) Numarul UFC/mL dilu!ie rezulta din suma coloniilor dezvoltate impart,ita la
numarul sectoarelor insamantate ~i inmultita cu 50. Daca numaml coloniilor dezvoltate
in 5 sectoare este mai mic de 10, admitem ca numaml UFC/mL este mai mic de 100, iar
daca numarul coloniilor dezvoltate nu se poate aprecia (peste 40), admitem ca numarul
UFC/mL este peste 2 000.

6.1.2. Tehnici semicantitative

Principiu: dintr-un volum foarte mic de suspensie bacteriana, prelevat cu 0 ansa


calibrata convenabil ~i epuizat pe 0 placa cu me diu agarizat, se dezvolta un numar de
colonii po sibil de numarat.
Indicafii: aproximarea, economica ~i satistacatoare clinic, a numarului de bacterii
in probele de urina tara a recurge la dilutii.
Necesar:
I
1) Anse calibrate din platina sau anse dispozabile din plastic, care preleva 0,0 sau
0,001 mL. Ansele din aliaj de crom-nichel se decalibreaza repede prin ardere repetata ~i.
tara frecvente recalibrari, expun la erori.
2) Cite 0 placa cu mediu agarizat pentru fiecare ansa insamantata.
Procedura:
1) Omogenizeaza cu grija, prin agitare, suspensia microbiana.
2) Imerseaza ansa imediat sub nivelul fluidului ~i imprima-i ciiteva mi~cari pe
verticalii in sus ~i in jos.
3) Retrage ansa din fluid in pozitia verticala ~i cu viteza moderata a mi~carii.
4) Descarca ansa in striu pe unul din diametrele placii cu mediu agarizat ~i epuizeaza
imediat inoculul pe toata suprafa!a placii in striuri stranse perpendiculare pe striul de
descarcare. Rote~te placa cu 90 ~i reia epuizarea intr-o a doua serie de striuri
perpendiculara pe prima (fig. 6-2).

121
1 2 3

Fig. 6-2. Epuizarea inoculului cu ansa caJibrata pe placii


cu mediu agarizat:
(A) Stria de desciircare a ansei. (B) Striurile primare de epuizare
sunt perpendiculare pe stria de deseiireare. (C) Striurile seeun
dare sunt perpendiculare pe striurile primare.

Insamantarea a doua plaei, una eu ansa de 0,00 I mL ~ieealaIta ell ansa de 0,0 I mL,
poate servi drept control de ealitate.
5) Ineubeaza plaeile ~i, a doua zi, numara eoloniile dezvoItate.
6) Numarul UFC/l11L suspensie testata rezulta din inl11ultirea eu I 000 (la
insamantarea eu ansa de 0,001 mL) sau 100 (ansa de O,OlmL) a numarului de eolonii
obtinute.
Exigen{ele vizeaza: manipularea ansei la prelevarea inoeulului din proM ~ieontrolul
ealibrului ansei, l11aiales al eelor reutilizabile.
Varia{iile volumului prelevat sunt mai mari eu ansele de 0,00 ImL. La prelevari ell
ansa in pozitie vertieala erorile sunt de 50% ~i tind sa fie in minus la prelevarea din
volume l11ieide suspensie. Erorile sunt in plus eand ansa este manipulata oblie: pana la
150% din volul11ul nominal pentru un unghi de 45.
in cazul anselOl- calibrate reutilizabile:
I) Folose~te ansa numai pentru euantifieari.
2) Dupa fieeare utilizare eHite~teansa eu apa distilata ~iverifiea sa nu retina mate-
rial earbonizat.
3) Zilnie, verifiea sub lupa daea nu s-a deformat.
4) Verifiea lunar ealibrul ansei prin metoda eolorimetrarii dilutiei de colorant:
Prepara 0 solutie 0,75% de albastru Evans, filtreaz-o prin hartie Whatman nr. 40.
Pastreaza aeeasta solutie stoe la temperatura eamerei in flacon ennetic inchis.
Prepara cat mai exact di1utii 1 : 500, I : I 000, 1 : 2 000 ~i 1 : 4 000 ale soluriei
stoe in apa distilata. Detem1ina speetrofotometrie la 600 nm densitatea optiea a fieearei
dilutii ~i traseaza 0 eurba liniara de referinta eu densitatile optiee obtinute.
Transvazeaza 10 anse din solutia stoe in 10 mL apa distilata. Clate~te in apa
distilata ~i arde ansa inainte de fieeare prelevare a solutiei stoe.
Coloril11etreazadilutia obtinuta. Densitatea optic a detenninata speetrofotometrie,
a aeestei solutii trebuie sa eorespunda, pentru ansa de 0,001l11L, dilutiei de 1 : I 000 a

122
solutiei stoc 20%. In caz contrar, ansa trebuie inlocuita,
recalibrata, sau trebuie tacuta corectia eorespunzatoare la
cuantificarea UFC.
Frecvent in mierobiologia cliniea suntem insa
confruntati cu necesitatea stabilirii economice a unui anume
prag cantitativ la un mare numar de probe (e. g., 105 UFC/mL
in urocultura probelor dinjetul mijlociu). In acest caz dispersia
inoculului se poate face cu ansa calibrata de 0,001 mL numai
!~
pe 1/4 din suprafata placii cu diametrul de 9 cm, dar In cazul Fig. 6-3. Epuizarea ino-
eulului eu ansii ealibratii
suspensiilor bacteriene dense metoda poate sa ramana utila de 0,001 numai pe 1/4 din
exclusiv pentru stabilirea acestui prag, tara relatii cantitative suprafata unei pliici Petri
este 0 metodii eeonomieii de
mai exacte (fig. 6-3).
stabilire a unui anume prag
cantitativ, fiirii a asigura
insii cuantifiearea unor
6.2. METODA NEFELOMETRICA.
suspensii baeteriene dense.

Uzuala In microbiologia clinica este nefelometria cu ajutorul etaloanelor din scara


Mc Farland.
Prepararea etaloanelor
1) Prepara 0 solutie 1,175% de clorura de bariu chimic pura (BaC11'2H10) in apa
distilata.
2) Prepara 0 solutie de 1% de acid sulfuric chimic pur.
3) Alege 11 eprubete noi din sticla boro-silicata, foarte bine spalate, cl1itite ~i egal
calibrate.
4) In eprubetele mareate ~ia~ezate in stativ, repartizeaza volumele de solutii preeizate
in tabelul 6-3.
Tobe/lt! 6-3
Etaloanele nefelometrice Me Farland

3
121I
Nr. etalonu1ui
218
59.9
24
30
15
7
6
8
4 230
90,4
9.8
9.0
9.5
9.6
9.1
27
0,8
9.2
0.1
0.9
9,7
9,4
0.7
0,5
1.0
0,6
9,3
0,2
0,3 0.05
0.5
9.95
1,5
aproximativa

Procedura
1) Efeetueaza suspensia bacteriana intr-un tub similar eu ale etaloanelor.
2) Plaseaza tubul in fata unui text tiparit cu caractere negre bine imprimate. Adu,
pe rand, etaloanele pana dnd clarita tea cu care se observa earacterele prin cele doua
tuburi este identica. Acest etalon aproximeaza concentra!ia bacteriana a suspensiei.
Lumina, alba, suficient de intensa ~iunifonna, trebuie sa vina din spatele observatorului ~i
sa traverseze sub aceea~i incidenta tuburile.

123
;000
000
Fig. 6-4. Folosirea comparatorului Walpole
pentru determinarea concentratiei bacteriene
dintr-o cultura in bulion; dispunerea tuburilor:
(4) cultura in bulion nutritiv;(3) apa distilata:
(1), (5) etaloane; (2), (6) bulion nutritiv din low I
folosit pentru cultivarea bacteriei.

l::>
",.-~.. , ,
'."', I
Xl
.D
-<6
( 10 '\~ (~': \
\
-
..... ....
' \ "
'\ __ .','
I I,
"'. ~.. '
. "
~
u::

(;'(-- ----7:\-- n_
,,/>!J 8 I.J
3) Pentru a ajunge la 0 anumita densitate, alege etalonul eorespunzi'itor ~idilueaza
sau concentreaza suspensia pfma la egalizarea opacita!ilor.
Daea suspensia bacteriana este 0 eultura in bulion, pentru comparare corecta,
plaseaza cultura, etaloanele, un tub eu apa distilata ~i tuburi eu bulion martor intr-un
comparator Walpole eonfonn sehemei din figura 6-4. Observa tuburile prin transparenta,
privind prin perechile de orificii 7-10, 8-11 ~i 9-12, In fata unei surse de lumina alba,
unifonna eu 0 sarma neagra interpusa de-a lungul filtrului.
7. TEHNICI BAZATE PE STUDIUL ACIZILORNUCLEICI
UTILIZATE INDIAGNOSTICUL SI SUPRAVEGHEREA
MICROBIOLOGICA A BOLILORINFECTIOASE
MARlA DAMIAN
7.1. INTRODUCERE 7.3.1. Profilul plasmidic
7.2. METODE GENETICE UTILlZATE 7.3.1.1. Profilul de restriqie enzimatica a ADN
IN DlAGNOSTlCUL MICROBIO- plasmidic
LOGIC 7.3.2. Analiza fragmentelor de restrictie (res-
7.2.1. Izolarea ~i purificarea acizilor nucleici triction fragments lenght polymor-
7.2.2. Transformarea geneticii phism-RFLP)
7.2.3. Amplificarea genicii 7.3.2.1. Ribotipia
7.2.3.1. Clonarea
7.3.2.2. Profilul demacrorestric~e in camp pulsator
7.2.3.2. Amplificarea enzimatica in lant (poly- 7.3.3. Metode bazate pe analiza peR
merase chain reaction- PCR)
7.3.3.1. RAPD (Random amplified polymol1)hic
7.2.3.2.1. Electroforeza in gel de agaroza DNA)
7.2.3.2.2. Tipuri de metode PCR. 7.3.3.2. PCR- RFLP
7.2.4. Hibridizarea molecularii
7.3.3.3. Rep- PCR
7.2.4.1. Hibridizarea in solutie
7.3.3.4. PCR-hibridizare
7.2.4.2. Hibridizarea pe membrana
7.3.3.5. PCR-secventiere
7.2.5. Secventierea
7.3.3.6. MLST (Multilocus Sequence Typing)
7.2.5.1. Secventiereaautomata
7.2.5.2. Pyrosecventierea 7.3.3.7. AFLP (Amplified Fragment Lenght Poly-
7.2.6. Microchips (microarray) m01])hism)
7.3. METODE GENETICE UTILlZATE IN 7.4. CONTROLUL DE CAll TATE IN LA-
SUPRAVEGHEREA MICROBIOLO- BORATORUL DE MICROBIOLO-
GICA GIE MOLECULARA

7.1. INTRODUCERE

Studiul diversitatii microorganismelor, precum ~i al relatiilor filogenetice ~i


epidemiologice existente intre acestea, are la baza sistematica bacteriana ~i consta din
clasificare, nomenclatura, identificare ~i tipizare. Clasificarea sau taxonomia
microorganismelor consta in incadrarea acestora in grupe (taxoni), nomenclatura exprima
numele ~tiintific, international, corect, identificarea reprezintii plasarea tulpinii de studiat
inu"-un grup taxonomic, iar tipizarea consta in detectarea unor caracteristici particulare
ale tulpinilor apartinand aceluiasi grup taxonomic.
Istoric, bacteriile au fost identificate pe baza morfologiei lor, a proprictati]or
colorimetrice, capacitatilor pigmentogene, caracteristicilor sporogenetice, cerinte]or
nutritionale, capacitatii de a produce acid din zaharuri, etc.
Suuctura antigenica, compozitia in acizi gra~i, profilul de proteine (citop]asmatice,
de membrana sau totale), sensibilitatea/rezistenta la bacteriofagi, sensibilitateairezistenta
la substante antimicrobiene, sensibilitatea/rezistenta la bacteriocine, bacteriocinogeneza,
sunt proprietati care stau la baza dezvo]tarii metodelor fenotipice de tipizare bacteriana.
Progresele inregistrate in ultimii ani in domeniul bio]ogiei mo]ecu]are au permis
dezvoltarea unor metode rapide de diagnostic ~itipizare bazate pe studiul acizi]or nucleici,
depozitarii inforn1atiei genetice la to ate organismele vii. Analiza acizilor nucleici are ca

125
scop descifrarea infoffi1atiei genetice utilizabilii in studii taxonomice ~i/sau epidel11iologice
precum ~i in instituirea unor strategii de prevenire ~i control al infectiilor l11icrobiene.
Utilizand aceste metode au fost definite taxospeciile, care grupeaza tulpini
microbiene cu proprietati fenotipice similare, ~igenospeciile, tulpini care prezinta 0 inalta
omologie in secventa acizilor nucleici.
Avantajele oferite de studiul acizilor nucleici (u~urinta cu care sunt extra~i ~i
purificati, strategii COl11unede abordare a studiului, indiferent de sursa de izolare a
acestora, rapiditatea ~ispecificitatea diagnosticului, in cazul infectiilor produse de gel1l1eni
greu cultivabili sau ne cultivabili, etc.) impun metodele genetice de analiza, ca l11etode
uzuale in laboratoarele de diagnostic ~i epidemiologie (Tabelul 7-1).
Producerea unor evenimente genetice in regiuni inalt conservate conduce la
variabilitatea tulpinilor in cadrul speciei, evidentierea lor constituind l11arkeri genetici
utili in subtiparea tulpinilor.
Elel11entele genetice mobile, cu rol in 1110dificareastructurii genol11ice (plasmide,
bacteriofagi, transpozoni), genele responsabile de sinteza factorilor de virulenta,
secventele de insertie, regiunile repetitive (direct sau invers repetate), genele responsabile
de rezistenta la antibiotice, l11utatiilepunctifonne, mutatiile in regiunile inalt conservate
ale genol11ului bacterian, deletii1e, inversiile, etc, sunt structurile genetice tinta utilizate
in diagnosticull11olecular all11icroorganismelor patogene.
Tabe11l17-1

Caracteristicile metodelor fenotipice ~i genotipice

Metode fenotipice Metode genotipice


Necesita tulpini izolate 'in cultura pura; Se pot aplica direct pe produsul suspectat a
Necesita ulilizarea mediilor de cullura fi contaminat;
(uneori selective, speciale) penlru cre~tere Timp redus de la momentul prelevarii probei
bacleriana; pana la stabilirea diagnoslicului microbiologic;
, Proprielatile fenolipice sunl supuse Se aplica tuluror microorganismelor. indife-
variabilitatii ca urmare a conditiilor de cultivare, rent de gradul de cultivabilitale al aceslora;
sladiului de dezvoltare bacteriana. numarului de Sunt reproductibile deoarece se adreseaza
pasaje'in natura sau 'in laborator, etc; acizilor nucleici. depozitarii informatiei genetice
Serologia implica consum mare de timp ~i a organismelor, structuri cu 0 [nalla stabililate;
materiale pentru producerea serurilor; Evidentiaza relaria dintre informaria geneticii
- Este nesemnificativa atunci dnd se ~i expresia acesteia:
adreseaza speciilor heterogene care cup rind Discrimineaza [ntre rulpini apartinftnd
lulpini cu grad diferil de palogenilate; aceleia~j specii (funqie de markerul rinra);
- Nu exisla seruri comercializate dedit pentru Sunt 'inalt specitlce ~i sensibile;
un numar limitat de microorganisme; Slillt merode de analiza pentru reorganiziiri
Lizolipia implica consum mare de timp ~i taxonomice;
materiale pentru producerea ~i 'intretinerea Sunt metode de studiu epidemiologic cu
preparatiilor fagice; valoare universala.
- Numai caleva specii implicate 'in patologia
infeqioasa pot fi tipizate prin bacteriofagi;
Bacteriocinotipia se aplica numai
speciilor/lulpinilor producatoare/sensibile la
bacleriocine
- ESle un caracter instabil fiind determinal de
structuri genetice localizate pe elemente mobile

126
Existenta unor biinci de date privind genomul complet al principalelor entitati im-
plicate in patologia infectioasa (Salmonella, E. coli, COlynebacterium, i.1ycobacte-
rium, Haemophilus, Pseudomonas, Toxoplasma, HPV, HIV, HCV, HVB, influenza/
SARS) a permis dezvoltarea unor metode standardizate de analiza m oleculara, uti lizand
kituri comerciale ~i aparatura dedicata, astfel incat rezultatele obtinute sa poata fi
comparate ~i validate.

7.2. METODE GENETICE UTILIZATE


IN DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC

7.2.1. Izolarea ~i purificarea acizilor nucleici

Metodele genetice de analiza microbiologica presupun accesulliber la acizii nucleici


prezenti in celula bacteriana, prin unnare izolarea ~i purificarea acizilor nucleici este
prima etapa in diagnosticul molecular.
Elementele reac{iei
Suspensia bacteriana, obtinuta fie direct din produsul de examinat, fie dupa
cultivare pe medii lichide sau solide;
Substante chil11ice cu rol de detergenti, necesari lizei chil11ice a celulelor (NaOH,
SDS, CTAB, etc.);
Enzime cu rol in degradarea proteinelor bacteriene (lizozim, proteazi'i E,
proteinaza K, lizostafin, etc.);
Substante chil11ice cu rol in indepartarea proteinelor ~i polizaharidelor din solutia
de acizi nucleici (fenol, cloroform, alcool izoamilic, perclorat de sodiu, etc.);
Alcool etilic absolut, pastrat la -20oe, ~i alcool etilic 70%, pastrat la temperatura
camerei, pentru precipitarea din solutie a acizilor nucleici;
Solutie de Tris-EDTA sau apa ultra pura (libera de DNA-ze, RN-aze) pentru
dizolvarea acizilor nucleici.
Kituri comerciale
Tori reactivii necesari trebuie sa fie cu un grad inalt de puritate sau "pentru biologie
l11oleculara".

Etapele reactiei
1. Liza celulara se poate realiza mecanic, (prin ultrasonare sau spargere cu bile de
sticla), tennic, chimic sau enzimatic.
2. In funcrie de analiza genetica care unneaza a fi efectuata, in continuare sc
rcalizeaza sau nu izolarea ~i purificarca acizilor nuclcici. Accasta etapa poatc fi realizata
dupa un protocol clasic, specific pentru tipul de celule bacteriene studiatc (bacterii gram-
pozitive, gram-negative, acido-rezistente, etc) ~i tipul de acizi nucleici necesari studiului
(ADN plasmidic de dimensiuni mari sau mici, ADN cromozomal, ARN de diferite tipuri),
sau cu kituri comerciale specifice pentru fiecare tip de aplicatie.
3. Pi'istrarea acizilor nucleici se realizeaza in solurie (Tris-EDTA sau apa ultra pura),
la -20oe.

117
7.2.2. Transformarea geneticii

Se define~te prin modificarea proprieUirilor unei celule bacteriene ca um1are a


achiziriei, in mod spontan sau dirijat, a unui fragment de ADN exogen.
Componentele reac{iei
Tulpina bacteriana competenta/autocompetenta, cunoscuta, care urmeaza a fi
transformata genetic;
ADN total izolat din cultura bacteriana necunoscuta, utilizat pentru transfonnare;
Mediul de reacrie.
Etapele reac{iei
Metoda este folosita in laborator pentru identificarea tulpinilor de Acinetobacter spp.
1. Cultivarea tulpinii auxotrofe, autocompetente TrpE27 de Acinetobacter pe un
mediu sintetic.
2. Prepararea ADN din tulpinile de cercetat, prin liza tennica.
3. Aplicarea ADN de cercetat, in striuri, In sectoare, peste cultura bacteriana
auxotrom.
Intr-un sector se striaza ADN din tulpina de referinta (mart or) de Acinetobacter.
4. Se inregistreaza cre~terea bacteriana (Fig. 1).

7.2.3. Amplificarea genica

Amplificarea este definita prin cre~terea numarului de c6pii ale unor fragmente de
acizi nucleici de interes. Aceasta se poate realiza prin experimente de clonare ~i prin
amplificare enzimatica in lanr (PCR-polymerase chain reaction).
7.2.3.1. Clonarea consta in introducerea unui fragment de ADN de interes intr-o
celula bacteriana apartinand unui grup taxonomic cu un timp de generarie foarte scurt
(de obicei E. coli), cu scopul de a ob!ine un numar mare de c6pii ale acestuia.
Componentele reactiei
ADN care um1eaza a fi clonat;
Vector de clonare;
Celule bacteriene receptor.
Vectorii de clonare sunt molecule de
ADN care poarta un fragment de ADN strain,
patrund In celula bacteriana receptor ~i se
multiplica odata cu aceasta producand un
numar mare de c6pii. Ace;;tia se caracterizeaZ[l
prin capacitatea de a se autopropaga in celula
bacteriana gazda, prezenta unui situs de
clonare care sa pennita inserarea fragmentuluJ
Fig. 7-1. Transformarea genetica la tulpini
de Acinetobacter sp. de ADN strain ~i a unui marker de seleqie.
B, C, D, E: tuJpini de Acinetobacter spp. Vectorii de clonare utilizari in bacteriologie
A, F: tulpini apartimlnd altar genuri. pot fi plasmide (ADN extracTOmozoma] care

128
se replica autonom), fagi (molecule de ADN linear din bacteriofagi lambda), cosmide
(molecule de ADN extracromozomal cu proprietati de plasmide $i fagi), cromozomi
bacterieni artificiali (obtinuti din plasmide F).
Etapele reac!iei
1. Prepararea fragmentu1ui de ADN care mmeaza a fi clonat.
2. Prepararea vectorului de clonare.
3. Inserarea fragmentului de ADN de interes in ADN vector.
4. Introducerea constructului (vector + ADN de interes) in celule bacteriene
receptor.
5. Se1ectatrea celu1elor care contin fragmentul de ADN de interes.
7.2.3.2. Polymerase chain reaction (peR) consta in amplificarea exponentiala a
unei regiuni de interes medical din genomul bacterian. Reactia se desfa$oara dupa modelul
replicarii naturale a ADN.
Componentele reactiei
ADN matrita, constituit din molecule de ADN care contin fragmentul de interes
medical care lli1neaza a fi amplificat. De cele mai multe ori, cand se Um1are$teidentificarea
prin PCR a unei regiuni genomice de interes in patologia infectioasa, liza celulara tem1ica,
prin inca1zirea suspensiei bacteriene la 100C timp de 10 minute, este suficienta pentru a
pune 1a dispozitia reactiei ADN de cercetat. Cand produsul de amplificare genidi este
utilizat in experimente ulterioare, se impune purificarea ADN, dupa un protocol clasic cu
fenol/clorofonnJa1cool izoamilic $i precipitare cu alcool etilic absolut sau utilizand kituri
comerciale, special concepute pentru purificare ADN in vederea PCR.
ADN matrita trebuie sa fie 1iber de uree, SDS, acetat de sodiu, componente ale mediilor de
cultura, inhibitori prezenti in probele bio1ogice.Cantitatea folosita in reactie este de aproximativ
100 ng, cantitati prea mici nefiind suficiente pentru a se obtine un produs de amplificare
vizibi1 pe un gel de agaroza, cantitati prea mari putand sa inhibe reactia.
Primerii (amorsele) sunt fragmente de ADN monocatenar (oligonucleotide)
complementare celor doua capete ale fragmentului care um1eaza a fi amplificat, sintetizate
in 1aborator. Ace$tia sunt elemente crueiale in desfa$urarea reactiei de amplifieare, de
modul in care sunt construiti depinzand amplifiearea fragmentului dorit, eliminarea
amplificarilor nespecifice, cre$terea randamentului reactiei, obtinerea unui produs de calitate
uti1 in experimente ulterioare.
Continutul in G+C al eelor doi primeri trebuie sa fie cuprins intre 40% $i 60%,
foarte apropiat de eel al matritei, cu 0 distributie corespunzatoare a celor patru baze
azotate pe toata lungimea lor, cu cat mai putine repetitii.
Lungimea primeri10r este de 18-25 nucleotide, iar diferenta dintre cei doi primeri
pereche nu trebuie sa fie mai mare de 3 nucleotide.
Secventa primerilor trebuie sa fie eomplementara unei regiuni inalt conservata din
structura regiunii genomice de interes astfel incat eventuale evenimente genetice care ar
putea avea loc la nivelul acesteia (inversii, de1etii, insert,ii, etc) sa nu influenteze rezultatul
reactiei. Nu trebuie sa contina secvente repetate invers sau secvente complementare pe
lungimea lor mai mari de 3 nucleotide pentru a preveni formarea de structuri in ae de par
(hairpin structures). Seeventa lor trebuie astfel selectata incat in capatul 3' sa se tennine
cu C sau G.

129
Primerii pereche nu trebuie sa fie complementari in capatul 3' pentru a preveni
formarea dimerilor, iar pe toata lungimea lor complementaritatea sa nu depa~easca 3
baze azotate. Cand se unnare~te detectarea prin PCR a regiunii genomice responsabila
de sinteza unei proteine a carei secventa in amino acizi este cunoscuta, se utilizeaza
primeri degenerati, astfel incat sa poata fi amplificate toate combinatiile de codificare
posibile corespunzatoare cADN.
Pentru a minimaliza problemele legate de secventa primerilor, designul ~iselectatrea
acestora este asistata de calculator, fiind disponibile programe capabile sa propuna
secventele cele mai apropiate parametrilor definiti de utilizator (ex. DNA STAR).
Temperatura de denaturare (Tm' 50% denaturare a hibrizilor) a celor doi primeri
pereche se calculeaza astfel incat sa nu difere cu mai mult de 5C, iar a produsului
amplificat fata de primeri sa nu difere cu mai muIt de 100e. Cand lungimea primerilor
este de 15-20 baze azotate, Tmse caIculeaza dupa Ufmi'itoarea formula:
Tm(in 0c) = 2(A+T) + 4(G+C)
Cand lungimea primerilor este de 14-70 nucleotide, Tm se ca1culeaza dupa
urmatoarea formula:

Tm(in 0c) = 8l,5C + 16,6 (Ioglo[K+] + 0,41 (%[G+C]) - (675/n)


(un de n este numarul de baze azotate din oligonucleotide).
Concentratia de preparare a primerilor pereche trebuie sa fie apropiata, iar cantitatea
fiecaruia in reactie este de 50-100 pmol (cantitati mai mici putand fi folosite dupa
optimizarea reactiei) .
Taq ADN polimeraza. Sinteza unui lant nou de ADN pe baza complementaritatii
cu ADN matrita din reactie este catalizata de polimeraze termostabile izolate din
archaebacterii hipertennofile, tennofile ~i/sau mezofiIe. Cea mai cunoscuta ~i utilizata
polimeraza este Taq polimeraza izolata din Thermophilus aquaticlts. Exista 0 mare
varietate de polimeraze, ele difera insa prin fidelitate, eficienta, capacitate de a sintetiza
un lant mai lung sau mai scurt de ADN, etc. In funqie de scopul reaqiei de amplificare.
se pot alege diferite tipuri de polimeraze. Cand produsul de amplificare este utilizat in
experimente de cIonare se utilizeaza polimeraze cu functie de corectare a nucIeotidelor
gre~it introduse (proofreading). Cand se amplifica un fragment lung de ADN se folosesc
polimeraze cu fidelitate ridicata (high fidelity) sau un amestec de enzime. Multi
produci'itori ofera coctailuri de enzime (Tbr si Taq, Taq ~i Pfu, etc.), sau enzime obtinute
prin tehnologia ADN recombinant.
Concentratia recomandata de Taq ADN polimeraza, utilizata intr-un volum de
reactie de 50-100 Ill, variaza intre 0,5 si 2,5 unitati, atunci cand ceilalti parametri ai
reactiei sunt optimizati. Cantitatea insa se optimizeaza utilizand concentratii diferite in
reactie ~i evaluand rezultatele pe gel de electroforeza .
Cationi bivalenti, cu rol in catalizarea reactiei enzimatice. Toate ADN polimerazele
tem10stabile functioneaza in prezenta ionilor bivalenti, in mod obi~nuit ioni de Mg>,
uneori de Mn2+. In reactiile obi~nuite se utilizeaza 1,5mM Mg2+, dar se cunosc reaqi i
care functioneaza la 0 concentratie de 4,5 sau chiar 6 mM.

130
Deoxinucleozid trifosfati (dNTP) necesari pentru alungirea lan!ului de ADN nou
sintetizat. Reac!iile PCRstandard con!in cantita!i echimolare de dATP, dTTP, dCTP ~i
dGTP pentru a evita incorporarile eronate in lanftil de ADN. Intr-o reaqie standard,
realizata in volum de 50 ).11,cu 1,5 mM Mgct, se recomanda a se folosi 200 - 250 ).1M
din fiecare dNTP. 0 cantitate excesiva de dNTP poate conduce la incorporari gre~ite de
nucleotide.
Cationi monovalenti (K+) sunt importan!i pentru randamentul reac!iei. Un PCR
standard confine 50 mM KCI, suficient pentru a amplifica un fragment de ADN lung de
500 baze azotate. 0 cantitate mai mare, de 70 - 100 mM, conduce la 0 cre~tere a
cantita!ii de produs amplificat atunci cand fragmentul este scurt.
Tamponul de reac!ie este necesar pentru men!inerea unui pH in mediul de reaqie
de 8,3 - 8,8, la teperatura ambianta. Reac!iile standard se realizeaza in tampon Tris-HCI,
10 - 50 mM. DMSO poate fi util in unele reaqii in concentra!ie de 3-10%. Cantita!i mai
mari inhibi'i pana la 50% activitatea Taq ADN polimerazei. Gelatina, albumin a serica
bovina sau tween 20 pot fi adaugate in reaqie ca stabilizatori ai enzimei, de~i in multe
protocoale reaqia funqioneaza corect tara acestea.
Etapele reactiei
I. Denaturarea moleculei de ADN de cercetat consta in ruperea legaturilor de H
dintre cele doua lanftiri ale dublului helix. 0 denaturare incompleta poate conduce la
e~uarea reaqiei de amplificare. Denaturarea standard se realizeaza la 95C timp de 30
secunde sau la 97C timp de IS secunde. Cand ADN matri!a este bogat in G+C sunt
necesare temperaturi mai ridicte/timp de denaturare mai mare. Intr-un protocol standard
este inc1usa 0 denaturare ini!iala de 3-5 minute la 95C.
2. Alinierea primerilor la molecula de ADN matri!a se realizeaza pe baza de
complementaritate ~i este dependenta de temperatura de aliniere (Ta), calculata cu 3~5C
sub Tm'Daca temperatura de aliniere este prea ridicata, formarea hibrizilor primer/ADN
matri!a este foarte slaba ~i prin urmare cantitatea de produs amplificat este foarte mica.
Daca temperatura de aliniere este prea scazuta, se produc amplificari nespecifice
(amplificarea altor fragmente decat cele de interes). Optimizarea temperaturii de aliniere
este 0 opera!iune importanta a fiecarui protocol de lucru ~i se realizeaza prin efectuarea
unor reactii
, a carol' temperatura variaza intre 2 si 10C sub T In calculata a celor doi
primeri pereche.
3. Extensia primerilor consta in sinteza unui nou Ian! de ADN pe baza
complementarita!ii cu ADN matri!a. Aceasta se realizeaza la temperatura de 72-78 C,
optima de activitate a Taq ADN polimerazei. In primele doua cicluri de amplificare
fiecare primer se va extinde pana la capatul moleculei matri!a, urmand ca in celelalte
cic1uri extensia sa se realizeze numai pe lungimea fragmentului delimitat de cei doi
primeri. Rata de polimerizare a Taq ADN polimerazei este de 2000 nucleotide/minut,
prin urmare timpul de extensie este stabilit in funqie de lungimea fragmentului care
um1eaza a fi amplificat. In cele mai multe protocoale PCR, ultimul cic1u de amplificare
se deruleaza pe un timp de trei ori mai mare dacat cele anterioare pentru a permite
amplificarea completa a produsului.
4. Numarul de cicluri de amplificare depinde de numarul de copii de ADN prezente
in mediul de reaqie, eficien!a de extensie a primerilor, lungimea fragmentului care
um1eaza a fi ampli ficat. In protocoalele standard sunt necesare cel pu!in 25 cicluri, 30 de

131
eic1uri sunt eel mai frecvent realizate, iar peste 30 de eic1uri se amplifiea numai dupa
optimizarea reactiei. Cand numarul de eicluri depa~e~te limit a eoreeta, In reactie apar
produ~i de amplifieare nespeeifica. Figura 7-2 prezinta desfa~urarea schematica a unei
reaetii de amplifieare enzimatica In lant.
5. Vizualizarea produ~ilor de amplifieare se realizeaza prin eleetroforeza In gel de
agaroza.

3' 5'
-""""'"""---- --,,""'-
5' 3'

3' 5'

a
5' 3'

3' -.---=--.----.- 5'


5' 5' b

.
5' 3'
3' 5'

----
_"""
--------~

~ .....
__ ' ..,<-=<~--.c""~._~"'~~

3'
5'
5'
5'

C
-. 5'


3'

4Iii 5'
3'

5' 3'
5' .'.')'

3' 5'
_~.'"~_A~"~_
...~.__;;

-
---.-


5" 3'

Fig. 7-2. Schema de desfii~urare a peR. a: denaturare; b:aliniere; c: extensie.

132
7.2.3.3. Electroforeza in gel de agaroza
Electroforeza in gel de poliacrilamida $i hibridizarea moleculara sunt metode
utilizate in identificarea produ$ilor de amplificare PCR, dar metoda cea mai utilizata de
separare, identificare $i purificare a acizilor nucleici este electroforeza in gel de agaroza.
Principiul metodei consta in migrarea moleculelor de acizi nucleici, incarcate electric
negativ, intr-un camp electric.
Componentele reactiei
Gelul de agaroza. Moleculele de ADN dublu catenar, lineare, migreaza prin
matricea gelului cu 0 rata invers proportionala cu loglOdin greutatea lor moleculara. Prin
unnare, concentra!ia agarozei este func!ie de lungimea $i confonna!ia fragmentelor de
ADN care urmeaza a fi separate.
ADN care um1eaza a fi migrat poate fi circular inchis, circular deschis sau linear.
La aceea$i greutate moleculara, viteza de migrare este func!ie de fonna in care acesta se
afla.
Tamponul de migrare are rolul de a men!ine pH-ul mediului de reaqie in timpul
electroforezei. Tris/acetatul (TAE: tris, acid acetic, EDTA) este cel mai utilizat atunci
cand migrarea este de scurta durata. Trislboratul (TBE: tris, acid boric, EDTA) este mult
mai stabil, se folose$te la electroforezele de lunga durata, dar nu este corespunzator
pentru purificare.
Voltajul aplicat este in func!ie de lungimea fragmentelor care unneaza a fi sepa-
rate. Voltajul scazut determina a rata de migrare scazuta a ADN, dar 0 foarte buna
separare.
Sistemul de electroforeza submers, a1catuit din sursa de curent (necesara stabilirii
voltajului/amperajului sistemului) si cuva de electroforeza (de diferite dimensiuni).
Etapele reac{iei
1. Prepararea gelului. Gelul se prepara din agaroza pentru biologie moleculara
de diferite tipuri, in func!ie de dimensiunile fragmentelor de ADN care urmeaza a fi
separate $i de prelucrarile ulterioare la care este supus. Tamponul pentru prepararea
gelului este identic cu tamponul de migrare. Cantitatea de gel preparata este funqie de
numarul de probe care urmeaza a fi migrate, grosimea optima a gelului fiind de 0,5 mm -
1cm. Concentra!ia agarozei in gel variaza de la 0,7%, pentru fragmentele mari pfl11ala
2,5%-3% pentru fragmentele foarte mici.
2. lncarcarea probelor pe gel se face submers, in cuva de electroforeza in care s-a
pus deja tamponul de migrare. Pentru ca probele sa nu iasa din godeuri se adauga
tampon de depunere (solu!ie de albastru cu rol de a tine proba in godeu ca urmare a
con!inutului in glicerol $i de monitorizare a migrarii ca unnare a con!inutului in albastru
de brom fenol).
Daca proba care urmeaza a fi migrata contine un singur fragment de ADN,
cantitatea de incarcare variaza intre 5ng si 200ng, daca contine mai multe fragmente
se incarca 0,1-0,5 llg, iar dad proba consta din ADN genomic supus digestiei enzimatice
se incarca pana la 10llg.
3. Migrarea se realizeaza ca unnare a voltajului aplicat sistemului. Timpul de
migrare $i voltajul sunt in relatie directa cu lungimea fragmentelor de ADN supuse
migrarii.

133
4. Vizualizarea se realizeaza dupa colorare cu
bromura de etidiu (BET) ~i iluminare in ultraviolet
(UV). Bromura de etidiu are capacitatea de a se
intercala intre bazele azotate ale moleculei de acid
nucleic ~i de a da lumina fluorescenta la iluminare
Fig 7-3. Detectare prin peR a genelor ~u UV (2~0-36~11l~). Bromura ~e..et!~iu se poate
mtroduce m gelm tlll1pul preparam ~1 m tamponul
care codificii sinteza de toxin a difterica
la tulpini de COIJ!l11bacteriul11 de migrare, dar trebuie avut in vedere ca influenteaza
diphtheriae. (original) rata migrarii.
5. Documentarea gelului se face fie prin fotografiere cu 0 camera Polaroid fie prin
preluarea imaginii pe un computer pentru a fi analizata ~i imprimata (fig. 3).

7.2.3.4. Tipuri de metode peR


Revers transcrierea (RT-PCR) este reaqia prin care se amplifica moleculele de
ARN. Reactia incepe cu conversia enzimatica a moleculei monocatenare de ARN in
molecuU'ide ADN complementar (cADN). Plimerul oligodeoxinucleotidic este hibridizat
cu molecula de ARN, este apoi elongat cu ajutorul unei polimeraze ARN-dependente
(revers transcriptaza). Se realizeaza astfel 0 copie a ARN, cADN, care este in continuare
amplificat cu ajutorul Tag ADN polimerazei dupa principiul unui PCR standard.
Long PCR este utilizata pentru amplificarea unor fragmente de ADN lungi de 2 -
25 kilobaze (kb). Metoda se aplica pe ADN de buna calitate, inalt purificat (ADN obtinut
prin liza in situ in bloculete de agaroza da rezultate foarte bune in long PCR). Primerii sunt
mai lungi decat intr-un PCR standard (25 - 30 nucleotide), T m nu trebuie sa difere cu mai
mult de 1cc, iar gradullor de puritate poate influenta amplificarea. Reactia utilizeaza un
amestec echilibrat de ADN polimeraze termostabile astfel incM incorporarile gre~ite sa
fie reduse la un nivelminim.
PCR invers (inverted sau inside-out PCR) este reactia prin care se amplifica un
fragment de ADN necunoscut, dar care este delimitat la unul din capete de 0 secventa
cunoscuta. ADN total este supus restriqiei endonucleazice, iar fragmentele de restriqie
sunt circularizate. ADN circular este utilizat ca matrita intr-o reactie de amplificare stan-
dard in care primerii sunt complementari cu secvente din fragmentul de ADN cunoscut,
iar elongarea se realizeaza divergent.
PCR cantitativ, metoda cunoscuta ca real time PCR, permite cuantificarea ADN
din proba de analizat in timpul fazei exponentiale a PCR. Se aplica pentru a masura
incarcatura cu acizi nucleici a unei probe, pentru a identifica mutatii punctifom1e (single
nucleotide polymorphisms, SNP), etc. Metoda necesita aparate speciale cu doua funqiuni:
una de a amplifica acizii nucleici ~ialta de a masura cantitatea de acizi nucleici acumulati'i
in timpul amplificarii. Masurarea consta in detectarea intensitatii fluorescentei pe masura
cre~terii cantitatii de ADN sintetizat.
PCR multiplex consta in amplificarea mai multor regiuni genomice in acelasi timp,
utilizand mai multe perechi de primeri, cu scopul de a economisi ADN matrita, reactivi ~i
timp de lucru. Se pot folosi pana la opt perechi de primeri simultan intr -0 reactie multiplex,

134
cu conditia ca fiecare sa fie verificata in reaqie PCR standard. Reactia necesita
optimizarea cantitatii de ADN matrita, Taq ADN polimeraza, concentratia fiecarui primer,
concentratia ionilor de metale, in vederea obtinerii ampliconilor corecti ~i in cantitate
suficienta pentru interpretarea reactiei. Aparatele de PCR cu gradient de temperatura
sunt deosebit de utile pentru optimizarea acestui tip de reactie.
Nested peR este metoda prin care se unnare~te cre~terea specificitatii reaqiei ca
U1TI1area amplificarii regiunii tinta in doua reactii succesive. In prima reaqie este utilizata
o pereche deprimeri care delimiteaza 0 regiune genomica mai larga pe care este localizata
secventa de interes. In a doua reactie, care are ca matrita ampliconul obtinut in prima
amplificare, se folose~te 0 pereche de primeri care contine unul dintre primerii utilizati
in prima reactie ~i un al doilea complementar secvetei de interes, sau doi primeri
complementari celor doua capete ale secventei de interes.

7.2.4. Hibridizarea moleculara


Metoda se bazeaza pe capacitatea acizilor nucleici de a disocia (denaturare) atunci
cand sunt supu~i unor conditii de stres (factor te1TI1ic,stringenta ionica) ~i de a reasocia
(renaturare) cand conditiile denaturante au fast eliminate. Denaturarea consta in ruperea
legaturilor de H intre bazele azotate ale celor doua lanturi a ADN ~iprin unnare prezentarea
ADN sub fonna monocatenara (single strain ADN - ssADN). Cand reasocierea se
realizeaza cu lantul pereche se obtine un duplex omolog, in timp ce daca reasocierea se
realizeaza prin complementaritate cu un lant de ARN sau ADN heterolog se obtine un
duplex hibrid (hibridizare). Studiul hibrizilor of era informatii privind gradul de
similitudine intre moleculele de ADN extrase din celule diferite ~i reprezinta baza
~tiintifica a taxonomiei moleculare.
Rata cu care aceste doua procese se realizeaza depinde de complexitatea genomica,
de dimensiunea fragmentelor de acizi nucleici din reactie ~i concentratia acestora,
concentratia ~i tipul sarurilor ~i a moleculelor organice din tamponul de reaqie,
temperatura la care are loc reactia.
Cele doua lanturi de acizi nucleici care unneaza a hibridiza se pot afla in solutie
(hibridizare in solutie) sau unul dintre ele poate fi fixat pe 0 membrana (hibridizare pe
suport solid).

7.2.4.1. Hibridizarea in solutie


Parametrii reactiei
Complexitatea genomic a exprima lungimea cromozomului bacterian, prezenta/
absenta regiunilor repetitive ~inumarul de copii ale acestora, prezenta/absenta elementelor
genetice mobile inserate sau nu in cromozomul bacterian ~inumarul de copii ale acestora.
Lungimea fragmentelor de acizi nucleici influenteaza direct proportional rata reaqiei
de denaturare/renaturare. Moleculele de acizi nucleici care um1eaza a fi hibridizate sunt
fragmentate (prin ultrasonare), iar ADN monocatenar (capetele ramase neimperecheate
sau buclele datorate diferentei de secventa) sunt digerate cu nucleaza S 1.

135
Pentru a putea recunoa~te hibrizii, unul dintre lanturile de ADN (de obicei eel
eunoscut) este marcat. Pentru hibridizarea in solutie, marearea se face eu iod radioaetiv
(1251), iar eitirea consta in inregistrarea radiatiilor beta emise intr-un lichid de scintilatie.
Pentru hibridizarea pe sup011solid marcarea poate fi radioactiva e2p, 35S) sau neradioactiva
(biotina, acetylaminofluorena, digoxigenina, etc). Citirea in acest caz se realizeaza prin
radiografiere, chemiluminiscenta sau colorimetrie. Hibridizarea in situ (fluorescence in
situ hybridization-FISH), utilizeaza fragmente de ADN marc ate fluorescent, cu secventa
cunoscuta, in scopul de a localiza pe cromozom 0 regiune de interes medical.
Cantitatea de ADN utilizat in reaqie este esentiala pentru realizarea duplexului.
Aceasta se masoara fie spech'ofotometric, in lumina UV la 260 nm, fie pe gel de
agaroza fata de marker de greutate moleculara (benzi de lungime ~i concentratie
cunoscute).
Temperatura de reasociere este funqie de temperatura de jumiitate denaturare a
ADN ~ieste egala cu Tm - 25C. Temperaturi mai mari conduc la instabilitatea duplexului,
iar temperaturi mai scazute pot determina reasocieri nespecifice. Stabilirea corecta a
temperaturii de hibridizare este critica pentru specificitatea reactiei, atat in hibridizarea
in solutie dh ~i pe membrana.
Concentratia ionica a mediului de reaqie constituie un parametru esential al reaqiei
de hibridizare. Ionii de Na (clorura de sodiu, fosfat de sodiu, EDTA, citrat de sodiu) sunt
utilizati ca agenti chelatori pentru a inhiba nucIeazele din mediul de reactie .
Substantele organice sunt utilizate cu scopul de a scadea temperatura de stabilitate
a duplexului (in special la moleculele bogate in G+C) ~i astfel reaqia sa se desIa~oare, in
conditii de specificitate maxima, la temperaturi mai joase. Se utilizeaza in acest scop
fom1amida, ureea, dimethylsulfoxid, dextran sulfat, polyethylenglycol sau clorura de
tetraethylamoniu, in funqie de conditiile concrete ale experimentului.
Hibridizarea in solutie este in principal utilizata pentru taxonomie bacteriana, in
timp ce hibridizarea pe suport solid este utilizata pentru diagnostic ~i epidemiologie.
7.2.4.2. Hibridizarea pe membrana se realizeaza conform specificatiilor
producatorului de membrana ~i/sau kit de hibridizare.
Etapele reactiei
1. Fixarea ADN pe membrana este prima etapa a reactiei de hibridizare ~i se
realizeaza dupa protocoale diferite, in functie de tipul de analiza care UTIneazaa fi realizat.
Fixarea de realizeaza sub actiunea luminii UV (timp de 5 minute) sau a caldurii (SOC).
a) Hibridizare pe colonii. Coloniile bacteriene care urmeaza a fi studiate sunt spotate
pe membrana (nitroceluloza sau nylon), sunt lizate pe membrana ~i tratate cu RN-aza
pentru eliminarea moleculelor de ARN.
b. Hibridizarea pe cultura totala (replica plate), Cultura totala dezvoltata din proba
de anaIizat este trecuta pe membrana, unde se apIica acela~i procedeu ca in cazul
hibridizarii pe colonii.
c. Dot blot este 0 metoda de transfer a ADN total pe membrana, sub presiune
controlata, utilizandu-se aparate dedicate, cu godeuri. In godeurile aparatului se pune
ADN total, dupa ce celula a fost lizata sau suspensia celulara, liza efectuandu-se in
godeuri.

136
d. Southern blot este metoda de transfer a ADN extras ~ipurificat, in general, dupa
ce a fost digerat, iar fragmentele de digestie separate prin electroforeza in gel de agaroza
(transfer din gel).
In toate cazurile, inainte de fixare, ADN este supus denatun'irii, astfel incat pe
membrana se afla ssADN, permisiv hibridizarii, daca in mediul de reaqie exista alt
ssADN cu secventa complementara.
2. Prehibridizarea este etapa in care membrana este tratata special, intr-un tampon
de hibridizare, cu scopul acoperirii situsurilor nespecifice in vederea reducerii zgomotului
de fond. Etapa se realizeaza la temperatura Tm-25C, la 0 stringenta ionica
corespunzatoare conditiilor de hibridizare, optimizate in functie de ADN care urmeaza a
fi hibridizat.
3. Hibridizarea consta in introducerea membranei intr-un mediu de reactie care
contine ADN cunoscut, marcat (sonda nuc1eotididi), in vederea identificarii unor zone
de omologie cu acesta pe molecula de ADN fixat pe membrana. Se realizeaza in acelea~i
conditii de temperatura ~i stringenta ionica in care s-a realizat hibridizarea.
4. Revelarea hibrizilor se realizeaza printr-o metoda corespunziitoare tipului de
marcaj utilizat.
5. Citirea ~i interpretarea rezultatelor este asistata de calculator, in prezent existand
un numar important de programe capabile sa realizeze scheme normalizate ale profilului
de hibridizare, sa calculeze gradul de similitudine ~i sa realizeze arbori genetici.

7.2.5. Secventierea
Standardul de aur in diagnosticul ~i epidemiologia moleculara este reprezentat de
secventiere. Metoda consta in detenninarea ordinii nucleotidelor in lantul de acid nucleic.
La 24 ani dupa descoperirea structurii ADN, in anuI1977, au fost dezvoltate doua
metode de secventiere, una bazata pe 0 reaqie de amplificare enzimatica (chain tennina-
tion method) ~i alta pe degradarea chimica a dublului helix.
Metoda eel mai larg utilizata se bazeaza pe sinteza unui nou lant de ADN in prezenta
unei ADN polimeraze ~i a celor patru nucleotide. Un oligonucleotid, cu 0 secventa
complementara unei regiuni de pe ADN matrita, este utilizat ca primer. Cele patru nucle-
otide se introduc in reaqie in amestec echilibrat. In sistemul clasic, se realizeaza patru
reactii pentru cele patru nucleotide, in fiecare dintre acestea introducandu-se, in procent
de 1%, un nuc1eotid modificat (dideoxinucleotid - gruparea OH a carbonului din pozitia
3' este inlocuita cu un atom de H) astfel incat nu se poate lega de nuc1eotidul unnator.
Reactia de sinteza se opre~te in momentul in care, intamplator, in locul unui nucleotid se
incorporeaza omologul sau modificat (metoda denumita Sanger dupa numele
cercetatorului care a descris-o prima data). Primerul sau nucleotidele pot fi marcate
(radioactiv sau chimic).
Elementele reactiei
ADN matrita, denaturat chimic sau termic;
Primerul, complementar unei secvente de pe molecula ADN matrita;
ADN polimeraza, cu rol in sinteza noului lant de ADN;
Cele patru deoxinucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP);
Dideoxinucleotide (unul pentru fiecare reactie, ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP);

137
Aparatul pentru evidentierea secventei (sistem de electroforeza in gel de
poliacrilamida) .
Softuri pentru alinierea ~i interpretarea secventelor
Etapele reactiei
1. Prepararea ADN care Un11eaZaa fi secventiat. ADN matrita se extrage ~i se
purifica din celulele bacteriene de interes. Fragmentul care unneaza a fi secventiat se
obtine fie prin restrictie enzimatica, fie prin PCR. Cand fragmentul de secventiat este
rezultatul unei restrictii acesta se introduce intr-un vector (plasmid sau bacteriofag) in
vederea secventierii. Indiferent de modalitatea de obtinere, ADN de secventiat se purifica
inainte de secventiere.
2. Amplificarea enzimatica se realizeaza intr-o ma~ina de PCR obi~nuita, dupa
optimizarea reaqiei.
3. Separarea fragmentelor amplificate se realizeaza in gel de poliacrilamida, mignlnd
in paralel cele patru reactii (in sistemul clasic de secventiere).
4. Citirea secventei se face manual, in functie de modalitatea de marcare utilizata,
revel area mcandu-se autoradiografic, chemiluminiscent sau enzimatic (in functie de tipul
de marcaj utilizat).
5. Interpretarea se realizeaza utilizand programe de calculator dedicate, multe dintre
acestea fiind accesibile pe internet. Alinierea se face fata de secventele cunoscute ~i
publicate in handle de date (GenBank). In cazul identificarii unei secvente noi, aceasta
se trimite spre introducere in banca de gene.
7.2.5.1. Secventierea automata a aparut ca 0 necesitate a standardizarii metodei,
utilizabila in diagnosticul ~i epidemiologia moleculara a bolilor infectioase. Exista in
prezent retele internationale de supraveghere microbiologica, specializate, care utilizeaza
aceasta metoda pentru tipizarea patogenilor (spa gene pentru Staphylococcl/S aureus,
emm gene pentru Streptococus pyogenes, etc.).
Metoda are la baza secventierea cu dideoxinucleotide, dar utilizeaza nucleotide
marcate fluorescent (fiecare nucleotid este marcat cu un alt fluorocrom). Un laser este
utilizat pentru a stimula lumina fluorescenta, iar fluorescenta este captata de un instru-
ment capabil sa detennine lungimea de unda. Aparatele automate sunt capabile sa
diferentieze nucleotidele dupa tipul de lumina emisa astfel incat cele patru reactii se
realizeaza intr-un singur tub. Rezultatele sunt oferite sub forma unei electroforegrame,
fiecare nucleotid prezentandu-se sub forma unui peak de alta culoare (Fig. 7-4). Aparatul
identifica ~i salveaza secventa in computer.

~~~Hd
Fig. 7-4. Secventa ampliconului blasH\' la Salmonella Enterica. (original).

138
Utilizarea secventierii automate e1imina lucrul cu radioactivitate (periculos pentru
manipulator, producere de de~euri radioactive, multe laboratoare nu au permisiunea de a
lucra cu radioactivitate), reduce timpul de lucru, utilizeaza kituri comerciale, citirea este
automata ~iprin unnare rezultatele sunt mult mai fiabile ~i comparabile interlaboratoare.

7.2.5.2. Pyrosecventierea
Nevoia continua de rapiditate in diagnostic ~i epidemiologie precum ~i necesitatea
de a descoperi noi markeri genetici sau gene cu functii alterate a condus la descoperirea
~iintroducerea in practica de laborator a unei noi metode de secventiere, pyrosecventierea
(secventierea bazata pe sinteza ~i pirofosfat). Are la baza sinteza de ADN nou ca urmare
a alungirii unui primer utilizat ca amorsa, in prezenta ADN polimerazei ~i a celor patru
nucleotide. Incorporarea unui deoxiribonucleotid trifosfat in lantul nou de ADN este
insotita de e1iberare de pirofosfat (PPi). ATP sulfurilaza, existenta in mediul de reactie,
converte~te PPi la ATP care catalizeaza conversia luciferinului la oxiluciferin in prezenta
luciferazei. Oxiluciferinul genereaza lumina vizibila care este captata de 0 camera digitala
sub fonna un or peak-uri (pyrograma). Inaltimea picurilor este proportional a cu numarul
de nucleotide incorporate. Mediul de reactie contine apyraza, 0 enzima care degradeaza
dNTP neincorporate ~i ATP ceea ce face ca emisia de lumina sa inceteze. In acest tip de
secventiere, dNTP sunt introduse in reactie pe rand, dupa ce prima a fost incorporata, iar
excesul degradat.
Este 0 metoda de secventiere in timp real, superioara metodei Sanger in ceea ce
prive~te timpul de executie, pretul de cost, cuantificarea, u~urinta de a fi efectuata ~i de
a citi secventa. Este utilizata pentru identificarea secventei unui fragment de interes
biomedical, tiparea microorganismelor, studii de transgeneza, detectarea mutatiilor
punctifonne, insertiilor, deletiilor, detectarea markerilor genetici de virulenta, de rezistenta
la antibiotice, etc.
Metoda este in intregime automatizata, aparate dedicate ~i kituri de reactivi fiind
astazi comercializate pentru a permite utilizarea acesteia in laboratoarele clinice.

7.2.6. Microchips (microarrays)

Expresia genica consta in transcrierea infonnatiei continuta de ADN in molecule


de ARN mesager (mARN) ~i traducerea acesteia in proteine cu 1'01 structural sau
functional. Expresia genica este un mecanism complex influentat atat de stimuli extemi
cat ~ide modificari la nivelul acizilor nucleici. Deteriorarea/modificarea expresiei genice
este cauza multoI' maladii, detectabile prin identificarea tipurilor ~i cantitatii de mARN
produs de celule.
Tehnologia micro array consta din membrane de mici dimensiuni, lame de sticlii
sau chip-uri de silicon pe care sunt fixate sonde nucleotidice, reprezentand un numar
mare de gene, aranjate intr-un pattem definit. Prezenta in celula a mARN corespunzator
unei gene are ca rezultat hibridizarea moleculara si aparitia in consecintii a unui spot in
pozitia genei respective pe microchip. Profilul de hibridizare este citit in functie de culoare
~i intensitatea acesteia. Rezultatul este salvat ca imagine digitalii a microchipului in
computer ~i este analizat utilizand programe dedicate.

139
Elementele reactiei
Microchipuri pe care sunt fixate fragmente de acizi nucleici tinta, responsabili de
sinteza unei proteine de interes in patologia infectioasa (producere de proteine implicate
in virulenta bacteriana, enzime implicate in rezistenta la antibiotice, toxine, etc). Acestea
pot fi ADN, cADN sau oligonucleotide, obtinute prin restriqie enzimatica, PCR sau sinteza
chimica .
Solutia de hibridizare care contine un amestec de cADN marc at fluorescent.
Acesta constituie proba de analizat. mARN produs de celule este extras, purificat,
amplificat prin revers-transcriere, iar cADN astfel obtinut este marcat cu fluorocromi.
Tehnologia microarray se utilizeaza pentru detectarea nivelului de expresie genica,
interrelatia dintre diferite gene implicate in detenninarea unei maladii, detectarea unor
mutatii, numarul de copii al unor gene repetitive, polimorfismul in secventa unei gene (ex.
SNP), etc.
Din ce in ce mai multe laboratoare apeleaza la acest tip de tehnologie pentlU diag-
nostic molecular, personalizarea medicatiei ~i/sau integrarea diagnosticului cu terapia. De
aceea sunt necesare eforturi pentru standardizarea metodei ~i crearea unei banci de date
accesibila laboratoarelor care utilizeaza aceasta tehnologie. NCB! (National Center for
Biotechnology Information) a lansat "Gene Expression Omnibus", 0 banca de date
accesibila online, iar grupul de lucru "Microarray Markup Language" a construit banca
de date "Microarray Gene Expression" cu scopul de a pune la dispozitia laboratoarelor a
unei platfoDne pentlU trimitere ~ianaliza a cantitatii enODnede infoDnatii privind expresia
genica, colectate in intraga lume.

7.3. METODE GENETICE UTILIZATE IN SUPRAVEGHERE


MICROBIOLOGICA

Laboratorul de epidemiologie moleculara pune la dispozitia sistemului de supraveghere


microbiologica a bolilor infectioase 0 mare diversitate de metode bazate pe studiul acizilor
nuc1eici cu scopul de a identifica sursa infectiei, modalitatile de raspandire a acesteia,
distributia spatio-temporala a tulpinilor implicate intr-un eveniment epidemic. Metodele
moleculare se caracterizeaza printr-o mare sensibilitate ~i reproductibilitate conferite de
moleculele tinta ale acestora, acizii nucleici, nealterati de manipularile in laborator. Sunt
metode care se aplica tuturor microorganismelor cu 0 mare put ere de discriminare,
eliminandu-se conceptul de "netipabil".
7.3.1. Profilul plasmidic a fost prima metoda moleculara utilizata in studiul
clonalitatii tulpinilor implicate in fenomene cu caracter epidemic. Metoda consta in
extragerea ~i purificarea acizilor nucleici extracromozomali ~i separarea lor prin
electroforeza in gel de agaroza. Numarul de fragmente precum ~i dimensiunea acestora,
izolate dintr-o tulpina bacteriana, constituie profilul plasmidic al acesteia. Teoretic, tulpini
izolate din acelasi focar prezinta un profil plasmidic identic.
Nu totdeauna doua fragmente de ADN cu aceea~i dimensiune sunt identice,
secventa lor putand fi diferita ~iprin unnare ~i informatia/expresia genica este diferita.
7.3.1.1. Profilul de restrictie enzimatidi a ADN plasmidic. Metoda consta in
digestia ADN plasmidic total cu una sau mai multe enzime de restrictie ~i separarea

140
fragmentelor rezultate prin electroforeza in gel de agaroza. Principiulmetodei se bazeaza
pe faptul ca doua fragmente de ADN cu procent de omologie ridicat vor ciaprin restrictie,
cu aceea~i enzima, un profil de fragmente identic.
Elementele reac{iei
Cultura bacteriana de studiat;
Kit pentru purificare ADN plasmidic;
Enzime de restrictie;
Gel de agaroza;
Sistem de documentare a gelului.
Etapele reac{iei
1. Extractia ADN plasmidic se poate realizeaza "clasic" dupa una dintre metodele
utilizate, pentru plasmide mici sau pentru plasmide mari, in functie de interesul medical
al analizei. In prezent exista kituri comerciale care pennit extractia si purificarea ADN
plasmidic (eliminarea in totalitate a ADN cromozomal) intr-un timp mult mai scurt ~i cu
o eficienta sporita.
2. Digestia cu endonucleaze. Se aleg enzime de restrictie in a~a fel incat patternul
generat sa contina un numar suficient de fragmente pentru a fi discriminatoriu ~inu prea
multe pentru a putea fi comparabil. Conditiile de digestie sunt cele indicate de producatorul
enZllnel.
3. Separarea fragmentelor prin electroforeza in gel de agaroza. Conditiile de
electroforeza se optimizeaza pentru fiecare specie analizata.
4. Documentarea gelului se realizeaza, dupa colorare cu bromura de etidiu, fie prin
fotografiere cu sistem Polaroid, fie prin captarea imaginii cu 0 camera digitala ~i salvarea
ei in computer in vederea analizei.
Acest tip de analiza se nume~te RFLP (Restriction fragment Length folymor-
phism) ~i se studiaza utilizand programe cumparate cu licenta sau libere pe internet.

7.3.2. Metode bazate pe analiza fragmentelor de restrictie

7.3.2.1. Ribotipia este 0 metoda RFLP bazata pe resnictie enzimatica ~ihibridizare


moleculara ~i se define~te ca profilul de restrictie al genelor responsabile de sinteza
ARN ribozomal (rARN).
Genele care codifica sinteza rARN sunt organizate in unitati de transcriere
policistronice, operoni rm. Pomind de la promotor, genele sunt aranjate in urmiitoarea
ordine: 5' -16S - 23S - 5S-3'. Un operon rm tipic de E. coli se spatiaza pe 0 lungime de
6000- 7000 perechi de nucleotide. Operonii rm sunt prezenti pe cromozomul bacterian
in multiple copii, variind de la 1 la 11, in functie de specie. in regiunea intergenica
cuprinsa intre genele care codifica sinteza moleculelor 16S ~i 23S se afla 0 regiune
variabila care contine gene codante pentru una sau mai multe specii de ARN de transfer
(tARN), pre cum ~i secvente repetate direct.
Analizele structurale comparative ale moleculelor de rARN au condus la concluzia
ca, de~i exista diferente in secventa lor nucleotidica, se pastreaza un inalt grad de conservare

141
a structurii secundare ~iterti are pe intreg spectrul evolutiv. Secventa nucleotidica, atat a
unitatii 16 S cat ~i a unitatii 23 S prezinta regiuni cu un inalt grad de conservare, pre cum
~iregiuni hipervariabile.
ARN ribozomal este ancestral, universal distribuit, aparent neexpus transferului,
cu cea mai mare parte a structurii prim are constanta ceea ce-i confera functionalitate
constanta. Aceste proprietati fac ca moleculele de rARN sa fie considerate "cronometre
moleculare" in studiile taxonomice, filogenetice ~i epidemiologice.
Numarul operonilor I'm, precum ~i pozitia diferitelor gene in structura acestora
influenteaza puterea de discriminare a ribotipiei ca metoda de analiza epidemiologica.
Elementele reac{iei
Cultura bacteriana care unneaza a fi analizata;
Kit de extractie ADN genomic (total);
Enzime de restrictie;
Sistem de electroforeza;
Sistem de documentarea gelului;
Sistem de transfer ADN de pe gel pe membrana (Southern blot);
Sonde nucleotidice;
Kit de marc are ~i revel are a hibrizilor moleculari;
Softuri de analiza a RFLP.

Etapele reac{iei
1. Extragerea ADN total se realizeaza utilizand metoda care pune la dispozi!ie
ADN de calitate (puritate ridicata, molecule lungi, nefragmentate). Dupa extrac!ie ~i
purificare ADN se supune tratarii cu RN-aza ~i dializei pe filtru.
2. Restrictia enzimatidi se realizeaza cu enzime Cl,l situsuri de restrictie dese pe
cromozom pentru a genera un numar mare de fragmente, cu lungimea de la cateva sute
de perechi de baze pana la cateva mii de perechi de baze.
3. Separarea fragmentelor de restrictie se realizeaza prin electroforeza intr-un
gel mare (lung de 20 cm), un voltaj scazut (50Y) ~i un timp indelungat (peste noapte.
14-16 ore) pentru a realiza 0 spatiere corecta a tuturor fragmentelor (de dimensiuni
mari ~i mici).
4. Fotografierea gelului pentru verificarea calitatii restrictiei enzimatice.
5. Transferul fragmentelor de restricpe pe membrana de nylon se realizeaza In conditii
denaturante (concentratie sh-ingenta de ioni de Na+), astfel incat ADN sa se afle pe
membrana in structura monocatenara, pennisiva hibridizarii.
6. Fixarea ADN monocatenar pe membrana se realizeaza fie prin expunere la lumina
UV timp de 5 minute, fie prin "coacerea" membranei la 80C timp de 1 ora.
7. Sonda molecularii este reprezentata de cinci oligonucleotide, doua complementare
cu regiuni conservate ale moleculei l6S, ~itrei cu omologie pe molecula 23 S (5 OligoMix).
Acestea sunt marc ate tenninal cu digoxigenina.
8. Prehibridizarea se realizeaza la 53C, timp de 0 ora, iar hibridizarea la aceea~i
temperatura timp de 16 ore (peste noapte). Sonda va hibridiza cu fragmentele de restriqie
pe care gase~te omologie de secventa.
9. Spalarile posthibridizare, la 45C ~i temperatura camerei au rolul de a elimina
sonda in exces.

142
10. Cuplarea cu anticorpi antidigoxigenina marcati cu fosfataza alcalina se realizeaza
pe fragmentele de restrictie care au hibridizat cu sonda nucleotidica.
11. Revelarea enzimatica. In mediul de reaqie se realizeaza un sandwich, ADN /
sonda + digoxogenina / anticorp anti digoxigenina + fosfataza alcalina, care va fi evidentiat
printr-o reactie de culoare, cu un complex NBT/BCIP (nitrobluetetrazolium ~i bromo-
chloroindofenil). Sunt vizibile pe membrana numai fragmentele care au hibridizat cu sonda,
deci cele pe care sunt Iocalizate secvente omologe operonilor rm.
Documentarea profilului de hibridizare se realizeaza fie prin scanarea membranei ~i
utilizarea imaginii pentru a fi prelucrata cu pachetul de programe TaxotronR (lnstitut Pas-
teur, Paris), un ansamblu de programe alcMuit din RestrictoScanR, RestrictoTyper",
Adanson" ~i Dendrograf'\ fie prin preluarea imaginii cu 0 camera digitala, salvarea ei in
computer ~i analiza cu un alt program dedicat (BioNumerics).
7.3.2.2. Profilul de macrorestrictie in camp pulsator (PFGE, ulsed Eield Gel
Electrophoresis ).
Metoda considerata pana in momentul de fata standardul de aur pentru epidemiologia
moleculara, presupune includerea'microorganismului de studiat in agaroza, liza acestuia
in situ ~i digestia ADN total cu enzime de restrictie cu situsuri rare de recunoa~tere pe
cromozom. Fragmentele generate in urma digestiei sunt separate intr-un pattern de benzi
discrete, in functie de greutatea lor moleculara, prin electroforeza in gel de agaroza, sub
actiunea unui curent electric care i~i schimba sensul dupa un program prestabilit.
Exista mai multe sisteme de camp pulsator care difera prin unghiul sub care este
aplicat campul electric, numarul de electrozi ~i modul de aranjare al acestora, orientarea
gelului, modelul cuvei, etc. Indiferent de tip, toate sistemele PFGE au eliminat distorsiunile
majore in migrarea fragmentelor de ADN ~i sunt capabile sa separe fragmente care
ajung pana la 6000 kb in Iungime.
Rezolutia sistemelor depinde insa de timpul de puIs, puterea campului electric,
temperatura, compozitia tamponului, tipul ~iconcentratia agarozei, unghiul dintre campuri.
Timpul de puIs influenteaza mobilitatea ADN in matricea gelului ~i depinde de
lungimea fragmentelor supuse migrarii.
Voltajul aplicat sistemului este functie de timpul de puIs ~imarimea fragmentelor
de ADN. Pentru separarea fragmentelor mari se recomanda un voltaj scazut, un timp de
puIs mare ~i un timp de migrare indelungat (cateva zile).
Unghiul intre campurile electrice aplicate sistemului este in mod obi~nuit de 90 ~i/
sau 110-120.
Temperatura de migrare este cuprinsa intre 4C si 15C. 0 temperatura controlata
a migrarii permite obtinerea de rezultate reproductibile.
Patternurile de restrictie sunt markeri moleculari utili in stabilirea gradului de inrudire
~ia clonalitatii tulpinilor studiate. Tulpinile sunt considerate clonale, atunci cand pattemurile
lor de restrictie prezinta acela~i numar de fragmente, fragmentele corespondente avand
aceea~i greutate moleculara. Tulpinile sunt considerate strans inrudite, atunci cand profilurile
de digestie difera prin doua sau trei fragmente.

143
Elementele reacfiei
Cu1tura bacteriana supusa ana1izei;
Reactivi pentru liza ce1ulara chimica ~i enzimatica;
Enzime de restrictie cu numar redus de situsuri pe cromozomu1 speciei careia ii
apartin tu1pini1e studiate;
Sistem de e1ectroforeza in camp pulsator;
Sistem de documentare a gelu1ui.
Etapele reacfiei
1. Prepararea ADN de analizat consta in realizeaza unar b1ocu1ele prin ing10barea
cu1turii bacteriene intr-un gel de agaroza cu punct de topire scazut (low melting agarose).
Liza ce1u1ara(chimica ~ienzimatica) se rea1izeaza in situ. E1iminarea tuturor e1emente1or
care ar putea inhiba reactia se rea1izeaza prin spa1ari repetate ale b1ocu1ete1or.
2. Restrictia enzimatica se rea1izeaza de asemenea in situ, enzime1e uti1izate tlind
a1ese in functie de compozitia in G+C a cromozomu1ui speciei care se analizeaza. Inainte
de restrictie b1ocu1ete1ecu ADN sunt echi1ibrate in tamponu1 enzimei care va fi uti1izaHi.
Restrictia se realizeaza in conditiile descrise de producator, un timp indelungat.
3. E1ectroforeza se realizeaza dupa un program prestabilit, linandu-se seama de
lungimea fragmentelor de ADN care unneaza a fi separate ~i de sistemul de PFGE.
4. Documentarea ge1ului se face dupa colorare cu bromura de etidiu ~i deco1orare.
Imaginea este fotografiata sau captata cu 0 camera digitala.
5. Analiza se face ca in toate metode1e RFLP.

7.3.3. Metode bazate pe peR


7.3.3.1. RAPD (Random Amplified E.olymorphic DNA) este metoda care utilizeaza
o amplificare de tip PCR, 1astringenta scazuta, cu un singur primer cu secvenla arbitrara,
pentru a genera un profil de fragmente de amplificare necunoscute, de lungimi diferite.
Primerii, universal utilizati, au in general 0 lungime de 10 baze ~i eel putin 40% conlinut
in G+c. Conditiile de PCR pennit a1inierea primeri10r ori de cate ori gasesc omologie pe
ambele 1anluri ale moleculei de ADN. Teoretic, doua molecule de ADN cu cu un grad de
similitudine ridicatii vor prezenta un numar ega1 de regiuni de omologie cu un primer ~i
prin amplificare vor da patemuri RAPD identice.
RAPD este 0 metoda de subtipizare simpla, reproductibi13., u~or de standardizat ca
unnare a existentei ~i comercializarii unui kit dedicat.
Elementele reactiei
Cultura bacteriana pentru analizat;
Kitu1 pentru RAPD;
Sistem de e1ectroforeza;
Sistem de documentare a ge1ului.
Etapele reactiei
1. Prepararea ADN care intra in reactie se face fie prin extractie ~i purificare, fie
prin liza tennica a cu1turii bacteriene.

144
2. Reactia de amplificare se realizeaza conform instructiunilor producatorului kitului.
3. Electroforeza in gel de agaroza se realizeaza in conditiile unei electroforeze
orizontale c1asice.
4. Documentarea ~i analiza gelului se realizeaza ca in conditiile unui RFLP.
7.3.3.2. PCR-RFLP este 0 metoda care combina 0 reactie de PCR urmata de 0
restrictie enzimatica a produsului amplificat. PCR-ribotipia amplifica fragmentul intergenic
16S-23 S dupa care ampliconul este supus restrictiei cu endonuc1eaze. Regiunea este 0
secventa variabiHi, aici aflandu-se un numar diferit de structuri genetice care codifica
tARN, precum ~iregiuni repetate. Cand doua molecule de ADN analizate sunt izolate din
doua tulpini cu evolutie clonal a, regiunea este identica ~i supusa restrictiei cu aceea~i
enzima va da un profil de restrictie identic. Existenta unor mutatii punctiforme in struCtura
amplificata poate conduce la pierderea unui situs de restrictie, respectiv la aparitia unui
profil de restrictie diferit.
7.3.3.3. Rep-PCR este utilizata pentru amplificarea unor regiuni repetitive de pe
cromozomul bacterian. Numarul acestor regiuni poate fi variabil sau secventa lor poate
suferi diverse modifidiri ca unnare a unor evenimente genetice derulate la nivelul acestora
(deletii, mutatii, inversii, etc). Metoda consta in amplificarea de tip PCR a regiunilor res-
pective urmata sau nu de RFLP (in functie de lungimea secventelor respective). Teoretic,
doua tulpini bacteriene inrudite epidemiologic au un profil de amplificare identic ~i un
RFLP al produ~ilor amplificati identic. ERIC-PCR (Ia tulpini de Enterobacteriaceae) ~i
BOX-PCR (la tulpini de Streptococcus) suntmetode utile in tiparea moleculara a tulpinilor
izolate din contexte epidemiologice speciale.
7.3.3.4. PCR-hibridizare include metode care detecteaza/identifica produsul
amplificat prin hibridizare cu sonde specifice. In acest caz, fie se fixeaza pe membrana
produsul de amplificare, iar sonda, marcata, este introdusa in tamponul de hibridizare, fie
se fixeaza pe membrana sonda, iar produsul de amplificare, marcat este aplicat peste
aceasta in tamponul de hibridizare.
Spoligotyping este 0 metoda de peR asociata cu hibridizarea, conceputa ~iutilizata
pentru prima data pentru analiza moleculara a tulpinilor de Mycobacterium tuberculo-
sis. Fundamentul ~tiintific al metodei consta in structura cromozomului acestei specii care
prezinta un numar important de regiuni repetate separate intreele de regiuni genomice de
dimensiuni diferite. Profilul de amplificare (numarul de regiuni interspatiale) pem1ite
diferentierea/analiza clonala a tulpinilor. Evidentierea profilului se face dupa hibridizare
pe membrana, pe care se afla fixate oligonucleotide specifice diferitelor regiuni interspatiale,
a ampliconului obtinut prin peR.
7.3.3.5. PCR-secventiere este metoda care utilizeaza tehnica PCR pentru
detectarea unei regiuni genomice de interes medical, regiune care este ulterior secventiata
in vederea tiparii moleculare a tulpinilor studiate. Modificari, la nivel de un singur nucleotid,
in secventa regiunii respective modifica secventa aminoacizilor in produsul de expresie ~i
reprezinta marker utilizat in epidemiologia moleculara. Metodadevine din ce in ce mai
larg utilizata in retelele intemationale de supraveghere a bolitor infectioase (spa PCR-
secventiere petru detectarea genelor responsabile de producerea proteinei A la Staphy-
lococcus aureus, emm PCR-secventiere pentru diferentierea tulpinilor de Streptococ-
cus pyogenes, bla PCR-secventiere pentru identificarea tipului de B-Iactamaze la
microorganisme rezistente la antibiotice ~-lactamice, etc).

145
7.3.3.6. MLST (Multilocus Sequence Typing) este metoda de analiza bazata pe
identificarea mutatiilor in gene esentiale pentru bacterii (housekeeping genes). Se bazeaza
pe secventierea automata, rezultatele fiind indubitabile, comparabile intre laboratoare din
intreaga lume. Metoda este universal valabila deoarece acumularea de modificari in
secventa genelor esentiale este un proces relativ lent ~i stabilin timp. S-au facut progrese
impOliante in acest domeniu, datele fiind acumulate in banci cu acces international.
Primerii sunt construiti pe baza secventei complete a principalelor grupari taxonomice
de interes medical existente in bancile de date utilizand programe dedicate. Se realizeaza
o reactie de PCR, ampliconii sunt identificati prin electroforeza in gel de agaroza, purificati
cu un kit comercial ~i cuantificati prin comparare cu un marker de greutate moleculara
(ex. Smart ladder), dupa care sunt supu~i secventierii. Interpretarea rezultatelor se face
automat prin accesarea paginii de web a MLST.
7.3.3.7. AFLP (Amplified fragment Length Eolymorphism) este 0 tehnica de ADN
fingerprinting bazata pe reactia PCR. In analiza AFLP, ADN genomic bacterian este
digerat cu enzime de restrictie, fragmentele sunt ligate cu adaptori, ADN astfel obtinut
reprezentand matrita in reactii PCR. Primerii utilizati pentru PCR contin secvente omologe
adaptorilor care au in capatul 3' nucleotide selective. Numai fragmentele de restrictie in
care nucleotidele care flancheaza situsul de restrictie hibridizeaza cu nucleotidele selec-
tive vor fi amplificate.
Reactia se realizeaza conform instructiunilor producatorului, comercializandu-se
kituri dedicate acestei tehnici.

7.4. CONTROLUL DE CALITATE iN LABORATORUL


DE MICROBIOLOGIE MOLECULARA

Alocarea spatiului pentru peR.


Pentru a preveni contaminarile incruci~ate ~i amplificarile nespecifice, spatiul
laboratorului in care se lucreaza PCR este impartit in patru arii (zone) distincte:
Aria A in care se realizeaza prelucrarea probei in vederea amplificarii (extractia ~i
purificarea acizilor nucleici).
Aria Beste alocata pentru prepararea solutiilor/reactivilor stoc pentru PCR ~ipentru
efectuarea premixului pentru amplificare enzimatica.
Aria C, destinata adaugarii ADN matrita.
Aria D, post PCR, este folosita pentru analiza produ~ilor de amplificare. Aici se
realizeaza electroforeza in gel, restrictia enzimatica a ampliconilor, purificarea post PCR
in vederea secventierii, alte manop ere cu acizi nucleici.
Reactivi $i consumabile
ADN matrita este extras dupa protocol standard sau confonn instructiunilor
produciitorului, atunci cand se utilizeaza kit de extractie.
Reactivii pentru PCR sunt procurati de la companii care poseda licenta de
comercializare ~iutilizare in astfel de reactii.
Apa utilizata trebuie sa fie de calitate "penhll biologie moleculara" libera de RN-aze
~i DN-aze.
Reactivii pentru biologie moleculara (enzime, primeri, ADN etc) sunt conservati
la -20C.

146
Materialele din plastic, de unidi utilizare, trebuie sa fie sterile.
Echipamente de baza
Se utilizeaza micropipete automate, cu volum reglabil, calibrate. Laboratorul trebuie
echipat cu seturi de pipete dedicate fiecarei arii de lucru.
Aparatul pentru PCR (termocyc1erul), licentiat pentru a fi utilizat in PCR, este
verificat pentru corectitudinea temperaturii afi~ate. Cand aparatul nu este echipat cu
capac incalzit amestecul de reactie este acoperit cu un strat de ulei de parafina stelil
(50 ).11) pentru a impiedica evaporarea probei. Pentru a u~ura optimizarea reaqiei se
comercializeaza aparate cu gradient de temperatura. In functie de capacitatea blocului
ma~inii de PCR ~i de nevoile laboratorului, se pot executa mai multe experimente in
acela~i timp. Pentru fiecare lot de experimente, care se des:fa~oara simultan pe aparatul
de PCR, se introduc in reactie un martor de ADN sigur pozitiv pentru segmentul matrita,
un martor de ADN sigur negativ pentru fragmentul respectiv ~i un martor in care ADN
este inlocuit cu apa.
Hota cu flux laminar prevazuta cu lampa de UV, verificata in ceea ce prive~te
fluxul de aer ~i capacitatea de sterilizare.
Toate celelalte aparate trebuie verificate pentru functionare corecta ~i amplasate in
locatii bine definite.
Toate reaqiile efectuate in laboratorul de microbilogie moleculara includ martori
pozitivi de reactie ~imartori negativi. Pe langa ace~tia, sunt reactii care includ martori de
control al functionarii corecte a principalelor componente ale reactiei.
Prevenirea contaminari/or incrucifjate
Cateva reguli de biosecuritate sunt absolut necesare in laboratorul in care se
efectueaza PCR:
1. Efectuarea procedurilor in spatii speciale conform "alocarii spatiului";
2. Se lucreaza cu manu~i de unica utilizare pentru a evita contactul nuc1eazelor
existente pe piele cu produsele care se manipuleaza;
3. Sunt necesare seturi diferite de micropipete in diferitele arii de lucru ~i pipete
speciale pentru lucrulin hota cu flux laminar;
4. Reactia PCR se efectueaza in hota cu flux laminar prevazuta cu lampa UV;
5. Se utilizeaza varfuri sterile, cu filtru hidrofob, corespunzatoare tipului de pipeta
utilizat;
6. Se prepara ~i se utilizeaza un set special de reactivi numai penhll PCR;
7. Masinile de PCR sunt localizate intr-un spatiu situat in afara celui in care se afla
hota cu flux laminar pentru realizarea PCR;
8. Se reduce la minim traficul prin camera in care se realizeaza PCR;
9. Tampoanele, reactivii, enzimele, repartizate in cantitati mici, se pastreazii in
congelatorullocalizat in spatiul de PCR, cat mai aproape de hota cu flux laminar;
10. Spatiile de PCR sunt prevazute cu echipament mic (vortex, agitator magnetic,
miocrocenh'ifuga);
11. Tuburile de reactie, scoase de pe ma~ina de PCR, se deschid in aria D.
12. lncinta hotei cu flux laminar in care se afla apa pentru PCR, tuburile, stativele,
varfurile, pipetele, uleiul mineral (cand se utilizeaza), tampon de reactie se expunluminii
UV 5-20 minute inainte de reactie.

147
Metodele moleculare de analiza au un rol deosebit de important in cunoa$terea
structurii genetice a microorganismelor circulante intr-o zona geografica $i intr-o perioada
de timp, infonnatiile fiind utile in studiul circulatiei agentilor infectio$i, stabilirea originii
unor epidemii, calea parcursa $i modul de diseminare a acestora, precum $i detectarea
importului intr-o zona indemna. Tehnicile de biologie moleculara se recomanda prin speci-
ficitate, selectivitate $i rapiditate ca metode de analiza epidemiologiea eel putin la nivelul
Centrelor Nationale de Referinta. Datorita dezvoltarii sondelorreci, inconvenientullucrului
cu radioactivitate a fost eliminat, reaqiile de hibridizare $i secventiere puti'mdu-se efectua
la nivelul oricarui laborator dotat cu baza tehnica corespunziitoare.
Analiza asistata de calculator a imaginii $i tratarea statistica a datelor a crescut
exactitatea $i u$urinta compararii moleculelor de ADN de diferite origini.
Extractia $i secventierea automata a aeizilor nucleiei au redus considerabil consumul
de reactivi $i timp de executie, iar aparatele pentru PCR au revolutionat diagnosticul
infectiilor microbiene, reactiile putandu-se efectua direct pe produsul patologic.
Dupa tem1inarea marelui proiect privind structura genomului uman, eunoa$terea
structurii genetice a microorganismelor care colonizeaza organismul uman reprezinta
zona de cercetare de eea mai mare importanta pentru microbiologia clinic a fiind
considerata al doilea mare proiect "Genomul uman: Microbial Community Genomies".

Bibliografie

1. Ausubel EM, Brent R, et aI. Current Protocols in Molecular Biology. 1996, John Wiley
& Sons, Inc, USA.
2. Belkun A. DNA Fingerprinting of Medically Important Microorganisms by Use of
PCR. Clin. MilVbiol. Rev, 1994,7, (2): 174-184.
3. Belkum A, Scherer S, Alphen L, Verbrugh H. Short-sequences DNA repeats In
prokaryotic genomes. Microbial Mol. Bioi Rev, 1998,62 (2):275-293.
4. Dale, W.1. Molecular Genetics of Bacteria, yd Ed. 1998, John Wiley & Sons. Inc.
USA.
5. Damian, M. Ribotipia, metoda moleculara utila in studiile epidemiologice. Bacterial.
Virusol. Parazitol. Epidemiol, 2000,45, (1-2):3-Il.
6. Freifelder, D. Microbial Genetics. 1987, Jones and Bartlett Publishers, Inc.
7. Furows S.J, Ridgway, G.L. Good laboratory practice in diagnostic laboratories using
nucleic acid amplification methods. Clin. Microbial. b!fect., 2001, 5, 227-229.
8. Gavrila L. Genomica. Un tratat despre genom, de la virusuri la om. 2003, Editura
Enciclopedica, Bucuresti.
9. Innis M.A., Gelfand D.H, Sninsky JJ, White Th. J. PCR protocols, a guide to methods
and applications. 1990, Academic Press, Inc.
10. Juni E. Genetic transformation assays for identification of strains of Moraxella
IIrethralis. J Clin Microbial. 1977,5(2): 227-235.
1 I. Kraviec S, Riley M. Organization of Bacterial Chromosome. Microbial. Rev, 1990.
54,3:502-539.
12. Lewin B. Genes VII. 1999, Oxford University Press.
13. Lin 1.J, Kuo J, Ma J. A PCR-based DNA fingerprinting technique: AFLP for
molecular typing of bacteria. Nucl Acid. Res, 1996, 24 (I 8): 3649-3650.
14. Maiden M.C.J, Bygraves 1.A. et a1. Multilocus sequence typing: A portable approach
to the identification of clones within population of pathogenic microorganisms. Proceeding o{ the
National Academy of Science of the United States of America, 1998,95 (6): 3140-3145.

148
15. Olive M.D, Bean P. Principles and Applications of Methods for DNA-Based Typing
of Microbial Organisms. J. Clin. Microbial. 1999,37 (6): 1661-1669.
16. Penner G.A, Bush A, et al. Reproductibi1ityof random amplified polymorphic DNA
(RAPD) analysis among laboratories. PCR Methods and Applications. 1993, (2): 341-345.
17. Raue H.A., Klootwijk J, Musters W. Evolutionary conservation of structure and
function of high molecular weight ribosomal RNA. Prog. Biophys. Malec. Bioi, 1988, 51. (50),
77-129.
18. Regnault B, Grimont F, Grimont P.A.D. Universal ribotyping method using a
chemically-labelled oligonucleotide probe mixture. Res. Microbiol, 1997, (148): 649-659.
19. Widjojoatmodjo M.N, Fluit A.D.C, Verhoef J. Rapid identification of bacteria by
PCR-single strand conformation polymorphism. J. Clill. Microbial, 1994,32 (12): 3002-3007.
20. Sambrook J, Russell D.W. Molecular cloning, a laboratory manual. 2001, 3-rd ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
21. Sherratt DJ. Mobile Genetic Elements. 1995, Oxford University Press.
22. Smolinski M.S, Hamburg M.A, Lederberg J. Microbial Threat to Health: Emergence,
Detection and Response. 2003, National Academic Press, SUA.
23. Stackebrandt E, Goodfellow M. Nucleic acid techniques in bacterial systematics.
1991, John Wiley & Sons Inc, USA.
24. Snyder L, Champness, W. Molecular Genetics of Bacteria. 1997, ASM Press.
Washington, D.C.
25. Sullivan C.B, Diggle M.A et al. Multulocus Sequence Typing: Data Analysis in
Clinical Microbiology and Public Health. Molecular Biotechnology, 2005,29, (3): 245-254.
26. Tenover F.C, Arbeit R.D, Goering R.V, Mickelsem P.A, Murray B.E, Persing D.H.
Swaminathan B. Interpreting Chromosomal DNA restriction pattern produced by pulsed-field
electrophoresis: Criteria for bacterial strain typing. J. Clill. Microbial. 1995,33 (9): 2233-2239.
27. Versalovic J, Koeuth Th, Lupski R. Distribution of repetitive DNA sequences in
eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nuc/. Acid. Res. 1991. 19 (24):
6823-6831.
8. DIAGNOSTICUL INFECTIILOR VIRALE,
CHLAMIDIALE SI RICKETTSIENE
IN LABORATORUL CLINIC
(DUMITRU BUIUC)

8.1. PARTICULARITATI $1 MOTIVATII Lichidul cefalo-rahidian


8.2. PRELEVAREA PROBELOR PENTRU Exsudate din seroase
DIAGNOSTICUL VIROZELOR Fluidul vezicular ~i raclate cutanate
8.2.1. Alegerea probelor Frotiuri din leziuni veziculare
8.2.2. Momentul preleviirii Probe biopsice sau necropsice
8.2.3. Transportul ~i conservarea Sfmgele
8.2.4. Proceduri de prelevare a probelor 8.2.5. Prelucrarea probelor
Spalatura nazala Spalaturi nazale sau faringiene
Aspiratul nazofaringian Tampoane
Tamponul nazofaringian Fecale
Spalatura faringiana Aspirat nazofaringian
Tamponul faringian Sputa
Sputa Raclatul conjunctival sau vezicular
Exsudatul sau raclatul conjunctival Saliva
Raclatul comean Urina
Tamponul bucal Fluidul vezicular
Saliva Lichidul cefalo-rahidian ~i exsudate din
Fecalele seroase
Tamponul rectal Probele biopsice sau necropsice
Urina Sangele

8.1. PARTICULARITk:p $1 MOTIVATII

Virusurile, chlamidiile ~i ricketsiile cultiva numai pe gazde vii (culturi de celule,


embrioni de gain a, animale de laborator), ceea ce limiteaza drastic posibilitatea de izolare
~i identificare a acestor organisme in cele mai multe laboratoare clinice.
Mult timp impactul diagnosticului de laborator al virozelor asupra deciziei clinice
a fost redus prin inaccesibilitatea laboratoarelor clinice la tehnicile de izolare ~i
indentificare a virusurilor, rezultatele tardive ale investigatiei virologice ~i serologice
fata de evolutia acuta a celormai multe viroze ~i,nu in ultimul rand, de saracia arsenalului
chimioterapic antiviral. In aceste conditii, diagnosticul virozelor abia depa~ea, prin cateva
imperative, sfera academica:
Viroze in care profilaxia, prognosticul ~i, rar, terapia depindeau de un diagnostic
precis. E. g., diagnosticul rabiei la animalul mu~cator (pentru vaccinarea antirabica a
celor mu~cati), diagnosticul rubeolei la gravide (pentru intreruperea sarcinii), diagnosticul
infectiilor grave cu virus Herpes simplex (primele posibilitiiti terapeutice).
Viroze foarte grave saul~i cu potential epidemigen important (poliomielita,
gripa ~. a.) pentru masuri de combatere in focar ~i profilaxie.
Triajul donorilor de sange pentru profilaxia hepatitei B.

150
Motivatia diagnosticului etiologic al infectiilor determinate de chlamidii ~irickettsii
este insa puternici'i: necesitatea dublata de posibilitatea terapiei antimicrobiene.
Diagnosticul serologic al acestor boli este mai operant pentru decizia clinica dedit in
vlroze.
Din anii 1980, diversificarea chimioterapicelor antivirale, aparitia ~i diversificarea
unor metode tot mai performante pentru depistarea antigenic a rapida a antigenelor ~i
acizilor nucleici virali ca ~i progresele metodologice ~i tehnice privind izolarea ~i
identificarea virusurilor au modificat semnificativ relatia cost-beneficiu in favoarea
beneficiului ~i au adus motivatii noi pentru diagnosticul virozelor. lata, in rezumat, cum
se reflecta in sfera motivatiilor diagnostice aceste mutatii tehnologice ~i de cunoa~tere:
1) Accesibilitatea crescuta la diagnosticul virologic pentru tot mai nmlte laboratoare
prin comercializarea unor:
truse cu reactivi pentru depistarea antigenic a a variate virusuri;
culturi celulare.
2) Impactul tot mai important al diagnosticului virologic asupra deciziei clinice prin:
recunoa~terea infectiilor care beneficiaza de tratament antiviral (e. g., infeqiile
grave cu virusurile herpes simplex, varicela-zoster, respirator sincitial ~. a.);
evitarea de tratamente antivirale toxice ~i costisitoare (e. g., administrarea
ribavirinului la sugari cu infectie acuta a tractusului respirator inferior determinata de
alti agenti infectio~i decM virusul respirator sincitial);
evitarea abuzului de terapie antibacteriana la pacienti cu meningoencefaliti'i
enteroviral a, la sugari cu boala respiratorie acuta virala;
3) Reducerea cheltuielilor pentru diagnosticul virologic prin:
Utilizarea unor chei clinice de orientare a investigatiei virologice (e. g., virus
Herpes simplex, adenovirus la un pacient cu keratita), ceea ce apropie precizia cererii de
examen virologic de solicitarea confrrmarii prezentei streptococului ~-hemolitic in exsudatul
faringian sau a bacililor tifici in materiile fecale.
Detectarea virusului prin metode directe imunologice sau non-imunologice.
Diagnosticul prezumtiv al grupului viral pe baza efectului citopatic poate orienta
atitudinea clinicianului in fata unui pacient cu meningita enterovirala ~i face inutila
identificarea costisitoare a serovarului.
4) Izolarea unor virusuri devine mai rapida ~i mai sensibila prin noile tehnici de
centrifugare a inoculului pe filmul celular, iar identificarea izolatelor se poate face rapid
prin coloratie imunofluorescenta a celulelor infectate. Astfel, peste 90% din tulpinile de
virus Herpes simplex pot fi izolate ~i identificate in 24 de ore, iar intervalele de izolare ~i
identificare a virusului citomegalic au fost semnificativ scurtate.
5) Examenele virologice au ameliorat diagnosticul izbucnirilor nosocomiale de
gastroenterite infantile sau infeqii respiratorii acute.
6) Diagnosticul serologic cedeaza tot mai mult locul celui virologic, dar i~ipastreaza
unniitoarele indicatii:
investigarea epidemiologica a virozelor;

151
investigarea starii imune a unar persoane (e. g., aprecierea riscului unei femei
tinere de a contracta rubeola in raport cu titrul anticorpilor antirubeolici);
instrument accesoriu pentru interpretarea, prin autoserodiagnostic, a semnificatiei
clinice a virusurilor izolate din prelevate de pe suprafata unor mucoase (e. g., entero-
virusuri, adenovirusuri, herpesvirusuri);
diagnosticul virozelor al caror agent etiologic cultiva dificil sau deloc.
Fie ca se realizeaza pe probe de ser unice sau prelevate in dinamica, rezultatele
diagnosticului serologic al virozelor trebuie interpretate prudent din cauza reaqiilor
incruci~ate, uneori extinse.
Tabefllf 8-1

Posibilitiitile ~i Iimitele metodelor de laborator in diagnosticul infectiilor virale ~i chlamidiale


(adaptat dupa KONEMAN ~icolab., 1992)
Sensibilitatelmpune
Rezultate fals pozitive ~i unor
fals
MetodaNecesita
virusuri
pentru
Ore
in
Posibile
prelevate
serun
specificitate
de ~1
greu
speciticitate
IgM.reaqii~iZile
Timp
Cere -0 zi pentru
OreDiagnostic
cultivabile
dotiiri sau
- siiptamiini
virusuri
negative.
de Limite
dinamica
deloc.
<>ainii.:
lncruci~ate
necesarPosibilita!i
maxime.
Siiptiimiini Izolatele
celule
pilor
accesibil,
dificil
sau
pde
disponibile
~ipre!
de culturi incubare
cultivat redus
testarea
titrarea
ersonal anticor-
a calificat
embrionilor reduse
ii. Utilii de probe Diagnostic rapid: util pentru
are
ica!ia cIinica a loturi

Investigatia virologica este insa costisitoare ~i trebuie atent apreciata in tenneni


de cost-beneficiu. De aceea, chiar ~i tarile cu tehnologie medicala dezvoltata au recurs
la ierarhizarea laboratoarelor sub raportul competentelor pentru diagnosticul virologic.
Astfel College of American Pathologists recunoa~te patru niveluri ale labaratoarelor:
Nivelul I, laboratoarele care nu pot investiga nici 0 viroza. La necesitate, trimit
prelevatele cu cererea de analiza laboratoarelar de rang superior cu care au conventii in
acest scop.
Nivelul II, laboratoarele care pot efectua investigatii limitate la detectari de
incluziuni ~i de antigene virale ori chlamidiale. Desigur ~i investigatii serologice.
Laboratoarele de nivell ~i II apartin micilor spitale.
Nivelul III include laboratoarele capabile sa izoleze numai virusuri care cresc in
culturi de celule uzuale ~i Ie pot identifica in masura in care exista comercializate ~i
dispun de truse cu reactivi imunologici. Pentru alte izolari ~i identificari apeleazii la
laboratoarele de referinta. Apartin in general marilor spitale.
Nivelul IV include laboratoarele de referinta ale institutelor nationale de saniitate
publica, de cercetare sau ale spitalelor universitare. Prin baza material a, facilitiitile de
care dispun ~i incadrarea cu personal inalt calificat trebuie sii asigure izolarea ~i
identificarea virusurilor comune.

152
Izolarea ~i identificarea virusurilor in laboratoarele de nivel III ~i IV satisfac
necesitatilor deciziilor clinice ~iale unor investigatii epidemiologice.
Din nefericire in Romania numai unele spitale judetene au laboratoare care satisfac
partial exigentele nivelului II pentru diagnosticul virologic ~i numai 0 mica parte din
laboratoarele universitare ~i ale institutelor regionale de sanatate publica satisfac exigente
ale nivelului Ill. In aceste conditii singurele laboratoare de referinta pentru izolarea ~i
identificarea virusurilor, chlamidiilor ~irickettsiilor sunt cele ale Institutului de Virusologie
"Stefan Nicolau" ~i ale Institutului "loan Cantacuzino" din Bucure~ti.
Posibilitiitile diagnosticului serologic, pe baza truselor de anti gene comercializate de
cele doua institute precizate mai sus sau obtinute din import, se extind la 0 rete a mai larga
de laboratoare.
In consecinta, consideram ca in aceasta carte este suficient sa precizam numai:
Particularitatile prelevarii, prelucrarii ~iconservarii probelor in vederea expedierii
spre laboratoarele de referinta pentru izolarea virusurilor rickettsiilor ~i chlamidiilor.
Microscopia uzuala pentru depistarea incluziunilor virale ~i chlamidiale.
Reaqiile antigen-anticorp pentru depistarea antigenica ~i diagnosticul serologic.
Metode rapide non-imunologice pentru diagnosticul acestor infectii.

8.2. PRELEVAREA PROBELOR PENTRU DIAGNOSTICUL


VIROZELOR

8.2.1. Alegerea probelor


Alegerea prelevatelor pentru diagnosticul de laborator al virozelor se supune
principii lor enuntate in subcapitolull.3.3 .1. Diagnosticul virologic impune insa frecvent
prelevari multiple din variate situsuri, pentru ca:
Mai multe virusuri, cu diferite porti de intrare, pot avea acela~i organ tinta. E. g.,
numeroase virusuri pot determina meningoencefalite ~ine obliga nu numai la examinarea
probelor de Iichid cefalo-rahidian, ci ~i de spalaturi sau tampoane faringiene (entero-
virusuri, virusul Herpes simplex), urina (virusul urlian), fecale sau tampon rectal (entero-
virusuri); sange de faza acuta pentru izolarea de arbovirusuri (in circumstante epidemio-
logice sugestive) ~ipentru eventualitatea diagnosticului serologic.
Prezenta virusului, in cantitati decelabile, intr-un prelevat poate varia. E. g.,
prezenta virusului citomegalic in urina.
In tabelul8-2 am prezentat principalele sindroame cu etiologie virala ~iprelevatele
indicate pentru diagnostic.
In functie de sindromul investigat, putem examina: aspirate (exsudate, secretii,
excrete), spalaturi nazale ~i faringiene, fecale, tampoane de pe mucoase ~i din leziuni
cutanate, tesuturi, sfmge.

153
VI Tabelul8-2
~
Un ghid de prelevare a probelor pentru diagnosticul principalelor sindroame cHnice cu etiologic virala
Posibillll)
VRS
Rhinovirus
Punc\ie
Aspirat
Gripal
ciell.
gian.
Paragripal
Tampon A,rarnazofarin-
pentru
traheal trdnstora-
B1,2 aspiralie
faringian
Detraheal
VRS
Rhinovirus
nazala
Adenovirus
Mai Bronhii
Pulmon
Enterovirus
A.Trahee
Alternative
Rhinovirus
Coronavirus
Post mortem
Posibila1l
Punqie Btranstoracica
nazofaringian
pentm
Epstein-Barr
elee\ie
nazo(aringian.
Paragripall,2
Paragripal
Aspirat
Tampon
Gripal A,aspirape
SplUllturll
Paragripal Virusuri biopsicPosibili'
I,1.22 sau implicatel)
B31-3 Aspirat e }) patologice
Prelevate Serologic
Guturai TamponPulmon..
VRS
Enterovirus
Posibilii
faringianl\
SpllllHurii
nazofaringian Posibila21
Coronavirus
sau biopsie
pal
pes Asimplex
novirus Adenovirus
Tabelu/ 8-2 (continuare)

Coxsackie
Rotavirus
Coxsackie
Adenovirus
CML
Posibil1i'
Posibilli;' --
" Siinge BAB
-
--
central
nazofaringian
Ilepatitei
Serologie
Norwalk
Fecalc
cefalorahidian
Lichid
Fecale
Coxsackie
Adenovirus
Ehterovirus
Urlian
AIternati
CMV
Post Mai
Coronavirus
Tampon
Aspiratmortem
Biopsie
Epstein-Barr
nazofaringian
De eleqie
Paragripal
gian
gian
PosibiHi
Mai
Urinaftecvent
Fecale
rar
Varicda-zoster
Tampun
Sange
Tampon
nazofaringian
ve Virusuri
rectal
hepatic1\rectalimplicate"
nazofarin-
nazofarin-
+-+- tecale
Tampon Uzual .
Posibilli;'
Prelevate ticat
Tampon rectal
nu' patologice
Posibila7J
Adenovirus
atite Echo
titei A Rotavirus Aspirat

....
Vl
Vl
Vl Tabelu/8-2 (continuare)
0\
FicatPosibila3
Adenovirus
Pulmon
Fecale Posibila'l. 7)
Coxsackie
cefalorahidian
Splina
Serologie
nazofaringian
Aspirat
vezicular
Echo
Post
Rara Maimortem
Creier
Coxsackie
Ficat
Fecale Posibila11
Posibila'
Adenovirus
Miocard
Varicela-zoster
Fccale
Rare
Coxsackie
Urina Posibila"
Alternative
Splinii
Con\inut
Tampon
Gripal
Urimi
Exsudat A.AVirusuri
) 11Rcolon
Ararcerebralii
(pcntru din
pericardic implicate)' Creier
Splina Posibila
Aspirat
Dcnazofaringian
nazot~lringian
Biopsie
Mai elcctie
frecvent
Pulmon
Enterovirus
veziculelor
Raclat rectalhazavirus
Con\inutde laintestinal
Rubeolic
Lichid
Creier
Denga
Aspirat Prelevate patologicc
Echo hemoragica
CMV
Cistita
Togavirus
Epstein-Barr Tampon
Tampon,
Tabelul8-2 (continuare)

- Vaccinal
Coxsackie
PosibilaJ)
Rujeolic
Epstein-Barr
VIH
Alternative
Varicela-zoster
Vaccinal
Raclat
Fecale
DePost mortem
Mai
Tampon
eleclie
Aspirat
A
cornean
rarcornean
nazofaringian Fecale
--Virusuri implicatel)
rectal
conjunctival
Epstein-Barr Prelevate patologicePosibilii'i)
SangePosibiliiJ\
Raclat conjunctival Serologic
Varicela-zoster
Rujeolicsimplex
Herpes Adenovirus
Herpes simplex

IIAbrevieri: VRS = virus respirator sineiliaI; CMV = virus citomegaIic; CML = virusul choriomeningitei limfocitare; SIDA = sindromul imunodefieienlei
dobandite; VIH = virusul imunodeficienlei umane.
21 (a) Rhinovirus: excep(ie din cauza numeroaselor serovaruri, (b) Enterovirus: Iimitat la autoserodiagnostic din cauza numeroaselor serovaruri;

predic(ia pozitiva a izolatelor din faringe: 0,70-0,89. (c) Paramixovirusuri: reac(ii incruci~ate. (d) CMV: precaut sa fie confirnlat prin izolate de virus ~iapreciat
in contextul clinic ~ial altor investiga(ii mierobiologiee.
31 V. Epstein-Barr: metoda de elee(ie. Testul antieorpilor heterofili pozitiv la eea 90% din adul(ii eu mononueleoza infec(ioasa, dar propor(ia scade sub

80% la eopii intre 2-4 ani sau sub 30% la cei sub 2 ani ~i impune, in caz de rezultat negativ, teste eu antigene speeifiee.
4) Enterovirus: doar pentru autoserodiagnostic, data fiind predic(ia pozitiva de 0,70-0,89 a izolatelor din faringe ~isub 0,4 a eelor din feeale.

5) Rotavirus ~iv. Norwalk: interes limitat la izbueniri epidel11iee; enterovirus ~iadenovirus; autoserodiagnostic pentru ca predic(ia pozitiva a izolatelor

din intestin este sub 0,4.


i" Vezi nota de subsol 2c.
7J V. herpes simplex: utilitate nesel11nificativa; enterovirus: vezi nota 4.
XI Enterovirus: excep(ie din callza nlll11eroaselor serovarllri; izolatele din (esuturi ~i 1I111oristerile au predic(ia pozitiva de 0,90- I,0.
Vl
--J "I Unica metoda uzualii penlru laboratoarele clinice.
In general, din mai multe motive, prelevari1e pe tampoane dau rezuItate inferioare
comparativ cu aspiratele, spalaturile sau probele fecale:
Virusul cu celulele care I-au replicat se absorb ireversibil pe fibra tamponului.
Intre 80 ~i 90% din infectivitatea suspensiilor de virus varicela-zoster este pierduta in
interval de numai 5 minute la 4C dupa imbibarea tampoanelor. Fenomenul vizeaza insa
~i aIte virusuri.
Tamponul poate fi toxic pentru virus. Este cunoscuta toxicitatea alginatului de
calciu pentru virusu1 Herpes simplex sau virusuri respiratorii.
Ra~ini1e distilate in cursu1 steri1izarii din1emnu1 de conifere a1tijei pOli-tampon
sunt toxice pentru virusuri sau chlamidii.
Tamponul preleva frecvent insuficient produs patologic.
De aceea, descarca, imediat dupa prelevare, tamponul prin agitare insistenta in
mediu1 de transport, iar 1aretragerea din flacon ruleaza-l bine pe peretele interior, deasupra
nivelului de lichid, pentru descarcare dit mai completa. Tampoanele pe tija de lemn pot
fi lasate sa se dilacereze in mediu dupa ruperea tijei deasupra tamponului.

8.2.2. Momentul prelevarii


Probele pentru examene virologice trebuie prelevate cat mai precoce in faza acuta
a bolii. Eliminarea virusurilor respiratorii dureaza intre 3 ~i 7 zile; virusurile Helpes
simplex ~ivaricela-zoster sunt prezente in leziuni maximum 3-5 zile de la debutullor, iar
din lichidul cefalo-rahidian virusurile pot fi izolate numai in primele 2-3 zile dupa debutul
manifestarilor clinice.

8.2.3. Transportul ~i conservarea

Virusurile sunt organisme fragile, mai ales cele cu anvelopa. Semiviata lor se
masoara, de cele mai muIte ori, in ore la temperatura camerei, in zile la 4C ~i in luni la
-70C. De aici decurg cateva imperative:
1) Necesitatea mediilor de transport ~i a medii lor crioprotectoare.
2) Refrigerarea probelor la 4C, uzual pana la 24 ore; maximum 96 ore pentru
transport in laboratorul de referinta.
3) Congelarea la -70C cand intervalul de timp pana la inoculare depa~e~te limitele
mentionate mai sus.
Medii de transport pentru virusuri. Principial, aceste medii sunt solUlii saline,
tamponate, suplimentate cu 0 proteina (serum-albumin a bovina sau, mai obi~l1Uit,gelatina)
pentru stabilizarea virusurilor fragile ~i antibiotice pentru a minimiza contaminarea
bacteriana ~i fungica. Un indicator permite monitorizarea vizuala a pH-ului pentru a
preveni acidifierea mediului, nociva virusurilor.
Intr-un studiu comparativ, trei medii de transport au dat cele mai bune rezultate:
solutia salina Hanks cu gelatina, mediul Stuart ~i mediul Leibovitz-Emory. Mai sunt
indicate bulionul cu triptoza-fosfat (vezi Cap. 40).
Pentru transportul chlamidiilor ~i virusurilor, WARFORD ~i colab. (1984)
recomanda mediul cu zaharoza, fosfat, glutamat (vezi mediul SPG in Cap. 39).
Fecalele (exceptand tamponul rectal), lichidul cefalo-rahidian, saliva, urina, probe Ie
biopsice sau necropsice nu necesita medii de transport. Procedeaza conform indicatiilor
de la prelevarile respective (vezi mai jos 8.2.4).

158

-
In vederea utilizarii, conditionam ~isterilizam volume de 3-4 mL mediu de transpOli
'in flacoane de 5 ml cu capac 'in~urubat. Pana la utilizare, pot fi pastrate, pentru 24 ore, la
4C sau, mai multe saptamani, congelate la -70C ori -20e. In volume mai mari de
me diu praba este diluata, iar 'in volume mai mici se poate usca.
Conservarea la 4C 0 realizam 'in frigider sau, pe durata transportului, 'in container
izotem1 cu granule de gheata hidrica.
Congelarea la -70C trebuie racuta brusc, 'in strat subtire, prin ratire rapida a
flaconului 'in baie de alcool cu gheata carbonica (-78,soC). Daca pastrarea se va face 'in
acela~i amestec refrigerator, probele trebuie initial 'inchise ennetic 'in fiole din sticla
boro-silicata, deoarece CO, difuzeaza prin dopurile de cauciuc sau gamiturile de cauciuc
~i acidifica mediul cu efecte foarte nocive pentru virus.
Decongelarea trebuie racuta brusc sub curent de apa la robinet pentru a asigura 0
cre~tere a temperaturii probei de minim 2YC per minut.
Este fonnal contraindicata pastrarea probelor la -20DC 'in congelatoare de uz casnic:
congelarea la punctul eutectic ~i oscilatiile tennice 'in jurul acestui punct sunt foarte
nocive virusurilor.
o revista cuprinzatoare privind transportul probelar pentru examenul virusologic
a publicat F. S. JOHNSON (1990).

8.2.4. Proceduri de prelevare a probelor

SpaHitura nazala. Necesar: para sterila din cauciuc cu volumul de cca 30 mL .;;i
extremitatea efilata conic; mediu de transport.
Procedura: Plaseaza pacientul ~ezand, cu capacul 'in extensie de cca 70 pe ceara.
Aspira in para de cauciuc 3-7 mL mediu de transport. Insera extremitatea dispozitivului
pana la 'infundarea unei nari, strange ~i relaxeaza brusc para pentru a proiecta fluidul pe
mucoasa nazala ~i a-I absarbi imediat. Transvazeaza prelevatul 'in flaconul de transport.
Altemativ poti folosi un flacona~ picu-
ratar cu tubul tenninat printr -0 tetinii mai volu- Tetlnade
cauciuc
minoasa din cauciuc ~i etan~at la capacul cu
profunzime de cca 1,5 cm. Plaseaza pacientul
'inpozitie ~ezanda ~iumple tubul pi curator cu
mediul de transport din flacon. Introdu tubul
'in nara pacientului ~i proiecteaza viguros Spalatuia - -
naz3la
fluidul 'in nas prin apasarea tetinei. Mentine d'
b 1fl 1 . 1 Me IU de
su nara capacu aconu Ulpentru co ectarea transporf 1":--1- I -_
fluidului de spalare care se scurge (fig. 8-1).
Astfel este recuperata cca jumatate din
mediul de transport utilizat. Transvazeaza
atent prelevatul din capac 'in flacon. A B
Inlipsa acestor facilitati, dar cu rezultat .
dispozitiv pentru prelevat ~i
. t' satlslacator,
mal PU,1ll . +:-: - proce deaza dupa- cum FIg. 8-1. Un
spiiliitura nazalii.
unneaza: pacientul 'inpozitie ~ezand cu capul (A) Flaconul pregiitit pentru recoltare. (B)
'in u~oara extensie pe ceara; instileaza rapid Picuratorul, tetina ~i capacul in care s-a scurs
'in fiecare nara 4-5 mL mediu de transport ~i Iichidul de spaliitura.

159
imediat flecteaza-i capul pentru a colecta lichidul de spalare intr-un vas steril (e. g., 0
cutie Petri, un pahar dispozabil) mentinut sub nari. Transvazeaza aseptic proba in flaconul
de transport.
Aspiratul nazofaringian. Adapteaza etan~ 0 sonda Nelaton la 0 seringa de 20 mL.
Aspira per-nazal continutul nazofaringian. Descarca sonda in flaconul cu mediul de
transport.
Tamponul nazofaringian: Folose~te tampon umectat cu mediul de transport.
SpaHitura faringiana. Pacientul, cooperant, face gargara cu 10-20 mL mediu de
transport ~ielimina tluidul intr-un pahar steril dispozabil. Transvazeaza aseptic 3-4 mL din
proM in flaconul de transport.
Tamponul faringian: Folose~te tampon umectat cu mediul de transport.
Sputa. De la un pacient cooperant preleva 0 proM dupa tuse spontana profunda
Tusea f0rtata, la comanda, nu da probe de calitate.
Exsudatul san raclatol conjunctival: vezi 17.2.2.
Raclatul cornean: vezi 17.3.2.
Tamponul bucal. Sterge fem1 cu un tampon din vata uscat mucoasa jugala, de
ambele parti, in dreptulmolarilor superiori ~i mucoasa plan~eului bucal anterior limbii.
Descarca imediat tamponul in mediul de transport.
Saliva. Pre1eva 1-2 mL saliva in recipient steril cu gura larga, tara mediu de
transport.
Fecalele. Recolteaza 1-2 probe de scaun 1a interval de 24-48 ore (vezi Cap. 19).
Cu 0 spatula prelevii 4-6 grame de fecale ~i Ie introdu in flacon, tara me diu de transport,
dar ennetic inchis pentm a preveni uscarea. Chiar daca fecalele au 0 bogata microbiota
intrinseca, lucreaza aseptic pentm a preveni contaminarea cu vimsuri de la alti membri
ai anturajului.
Tamponul rectal este indicat pentm prelevari de la sugari sau cand prelevam mai
multe probe de la acela~i pacient. Metoda este insa mai putin sensibiIa de cat prelevarea
din scaunul emis spontan. Sterilizeaza tampoane obi~nuite protejate intr-un tub de sticla
lung de 6 cm, care, inserat in anus, va evita incidentele la introducerea sau retragerea
tamponului prin sfincter. A~eaza pacientul aplecat cu fata ventraIa pe dunga patului.
Lubrifiaza cu ulei de parafina steril 2-3 mm din extremitatea distala exterioara a
man~onului pentm a depa~i mai u~or sfincteml anal. Evita excesul de ulei care po ate
contamina tamponul. Dupa depa~irea sfinctemlui, impinge bland tal11ponul uscat prin
man~on in rect pe 0 profunzime de cca 5 cm. Rote~te bland. Retrage tal11ponul ~i
controleaza daca este colorat cu materii fecale. In caz contrar reia operatia prin l11an~onul
mentinut inca pe loc. In final retrage ~iman~onul. Descarca imediat tamponul prin rotire
viguroasa in mediul de transport. (vezi mai sus).
Urina. Preleva cur at 10-20 mL de urina prinsa in zbor din jetulmijlociu (vezi
Cap. 14).
Lichidul cefalo-rahidian pre1evat de catre specialist (vezi Cap. 10), in cantitatea de
cca 5 mL, tara mediu de transport, este expediat, in recipient inchis etan~, pentm examinare

160
imediata. Multe din virusurile prezente in lichidul cefalo-rahidian sunt labile. De aceea, daca
proba nu poate fi examinata in interval de ore, trebuie congelata la -70C.
Exsudate din seroase sunt prelevate aseptic de ciitre specialist, prin punc!ie ~i
aspira!ie, in volum de cca 5 mL, ~i expediate la laborator, tara mediu de transport, in
recipient inchis etan~.
Fluidul vezicular ~i raclate cutanate. Alege cateva vezicule recent aparute ~i
decontamineaza-le suprafata prin ~tergere blanda cu solutie salina izotona sterila sau cu
eter (precau!ie). Nu folosi alcool sau alcool iodat pentru decontaminare. Veziculele de
pe suprafata mucoaselor pot fi abordate ca atare.
Punctioneaza ~i aspira continutul mai multor vezicule cu un ac de 25-26 G adaptat
la seringa pentru tuberculina. Dilueaza imediat aspiratul in 1-2 mL mediu de transport
pentru a preveni coagularea. Altemativ, veziculele pot fi deschise cu varful unui bisturiu
sau cu un ac steril, iar fluidul absorbit cu un tampon, care h'ebuie descarcat imediat in
mediul de transport.
Prelevarea poate fi completata prin raclarea u~oara a bazei leziunii cu lama unui
bisturiu, rara a produce sangerare, iar materialul celular obtinut suspensionat in acela~i
recipient cu fluidul vezicular.
Frotiuri din leziuni veziculare. Prelevatul trebuie sa contina suficiente celule pentru
a pennite depistarea inc1uziunilor virale prin microscopie uzuala sau a antigenelor virale
prin coloratie imunofluorescenta. Fluidul vezicular nu contine suficiente celule pentru
acest scop.
Alege leziuni in stadiul incipient, vezicular (nu pustule). Decontamineaza suprafata
~ideschide vezicula prin incizie periferica, cu bisturiul steril. Ridica epidenna ~i absoarbe
fluidul cu un tampon sau cu hartie de filtru. Rac1eaza u~or baza leziunii cu lama bisturiului
(vezi mai sus). Etaleaza materialul celular prelevat pe doua lame de microscop in strat
fin cu diametrul de 5-10 mm. Pentru coloratia imunofluorescenta asigura 3 lame tinand
cont de martorii necesari.
Probe biopsice sau necropsice. Abordeaza leziunile cat mai precoce. Utilizeaza
seturi separate de instrumente sterile pentru incizia tegumentului ~i abordarea fiecarei
leziuni. Preleva probe cu latura de cca 1,3 cm ~i plaseaza-le in borcane separate. In
virozele sistemului nervos central preleva probe din cortextul lobului temporal, din
mezencefal, maduva cervicala ~ilombara. Nu utiliza mediu de transport sau lichid fixator.
Probele biopsice ~i necropsice trebuie pastrate la 4C in recipient inchis etan~ ~i
prelucrate cat mai curand dupa prelevare. Numai la nevoie vor fi conge late, pentru perioada
limitata, la -70C.
Atentie deosebita trebuie acordata probelor cu volum mic, cum sunt biopsiile prin
ac, pentru a Ie feri de uscare: se expediaza, prin curier special, in flaconul inchis etan~
impreuna cu cateva picaturi din mediul de transport steril.
De la cadavru, pentru izolare de enterovirusuri, preleva segmente de 5-7 cm din
colonul descendent cu continutul fecal retinut inh'e duble legaturi.
Sangele poate fi prelevat pentru examen serologic sau virologic.
Viremia este prezenta in multe viroze, dar folosirea si'mgelui pentru diagnosticul
virologic apare indicata numai intr-un numar limitat de infectii:
faza acuta a infectiei cu virusul citomegalic la gazda n0TI11oreactiva;

161

--------
pneumonii cu virus citomegalic la pacienti cu transplant de maduva osoasa sau in
cadrul SlDA;
arboviroze manifestate ca boli febrile nediferentiate, meningoencefalite sau febre
hemoragice;
infectia cu virusul choriomeningitei limfocitare.
Cat mai curand dupa debutul bolii, preleva 2-4 mL de sauge heparinat de la pacientii
suspecti de infectie cu virus citomegalic. Izolarea arbovirusurilor se poate face atat din
sangele prelevat pe anticoagulant, cat ~i din cheagul sanguin.

8.2.5. Prelucrarea probelor

SpaHituri nazale, faringiene sau bucale. Examineazii proba dupa agitare. Daca
se observa particule (debriuri celulare etc.) saumucus, procedeaza ca in cazul tampoanelor
(vezi mai jos). Daca apare omogena, poate fi inoculata ca atare.
Tampoane. Prelucreaza identic tampoanele nazofaringiene, faringiene, conjuncti-
vale, bucale, rectale sau din vezicule. Dupa descarcarea ingrijita a tamponului, transfera
suspensia intr-un tub de centrifuga cu capac in~urubat, care contine cateva perle sterile
din sticla cu diametrul de 4-5 mm. Agita bine cca 30 secunde, manual sau pe agitator
Vortex, pentru dispersia particulelor in suspensie. Centrifugheaza 30 minute la 3 000 xg
~i 4C. Aspira supematantul cu atentie pentru a nu mi~ca perlele, care pot tulbura
sedimentul. Folose~te supematantul pentru izolarea de virus.
Fecale. Intr-un tub de centrifuga cu volumul de 25-30 mL, care contine 20-30 perle
din sticla, pune cu spatula cca 1 g de fecale ~iadauga solutie Hanks cu antibiotice pentru a
asigura urmatoarele concentratii finale: penicilina 1000 U/mL, streptomicina 1000 /-lg/mL
(sau gentamicina 200 /-lg/mL) ~inistatina 100 U/mL (sau amfotericina B 20 /-lg/mL)-vezi
Cap. 39. In~urubeaza capacul ~i agitii bine tubul, apoi centrifugheazii cum este descris
pentru prelevatele pe tampoane. Inainte de inocularea in culturile celulare, supematantul
trebuie mentinut 30-60 minute la 40C.
Aspiratul nazofaringian. Procedeaza ca pentru tampoane.
Sputa. Decanteazii proba intr-un tub de centrifuga cu volumul de 25-30 mL, care
contine 20-30 perle din sticlii. Adaugii un volum egal din mediul de transport cu antibiotice
(vezi Cap. 39). In~urubeazii capacul, agitii bine tubul, apoi centrifugheazii cum este precizat
pentru tampoane.
Raclatul conjunctival sau din vezicule. Procedeaza ca pentru spalaturile de pe
mucoase.
Saliva. Adauga 0,1 mL din dilutia 1/10 a fiecarei solutii stoc de antibiotic (vezi
Cap. 39) per ml proM. Agita, centrifugheaza (ca pentru spalaturi de pe mucoase) ~i
mentine supematantul30-60 minute la 4C inainte de inocularea in culturi de celule.
Urina ca atare poate fi toxica pentru culturile celulare; trebuie neutralizata la pH
7,0 cu solutie 0,1 N fie de NaOH, fie de HC1, dupa caz. Adauga antibiotice in proporria
mentionata pentru saliva ~i mentine amestecul 30-60 minute la 4C inainte de inoculare.
Fluidul vezicular nu necesita un tratament special cand este prelevat aseptic prin
punctie ~i aspiratie. Tampoanele din vezicule se prelucreaza ca ~i restul tampoanelor.

162
Lichidul cefalo-nlhidian ~i exsudatele din seroase pot fi utilizate ca atare.
Dad exista suspiciunea de contaminare, trebuie tratate cu antibiotice.
Probele biopsice sau necropsice. Procedeazadupa cum UTI11eaza:
1) Cantare~te proba in cutie Petri sterila.
2) Masoara 0 cantitate din mediul de transport cu antibiotice, suficienta pentru a
realiza suspensia 20% (g/v) a tesutului. E. g., 8 mL mediu pentru 2 g tesut.
3) Marunte~te proba in fragmente mai mici de 2 mm folosind pensa, bisturiu ~i
foarfece sterile.
4) Transfera proba astfe1 maruntita intr-un mojar steril care contine 0 cantitate de
nisip spa1at (vezi Cap. 42), este racit 1a 4C ~i mentinut pe baie cu granule din gheata
hidrica.
5) Mojareaza adaugand progresiv mediu1 de transport. Initial obtii 0 pasta de tesut,
care se omogenizeaza treptat cu restul diluantului.
6) Transfera, cu 0 pipeta, suspensia intr-un tub de centrifuga cu capac In~urubat.
Centrifugheaza 30 minute la 1000 xg ~i 4C. Decanteaza atent supematantu1 pentru
inoculare.
Piesele tisulare mici sau tesuturile moi (creier, ficat) pot fi omogenizate in tubu1
Griffith.
Daca se intentioneaza cocultivarea cu diferite culturi de celule, pentru a spori
sensibilitatea izolarii, tesutul maruntit, mra omogenizare, este suspensionat in mediul de
cultura ~i trebuie sa ajunga in cel mai scurt timp la laboratorul de referinta.
Sangele. Probele pentru examenul serologic sunt tratate conform precizarilor din
Cap. 25.
Pentru izolarea arbovirusurilor inocu1am probe de ser sanguin.
Virusu1 citomegalic poate fi izolat din leucocite. Pentru aceasta, aspira in seringa
cu 2-4 mL sange heparinat suficienta solutie 6% dextran pentru a asigura 1 mL pentru
fiecare 2 mL de sange. Incubeaza seringa, cu pistonul in jos, 30-60 minute la 37"C. In
final, folosind un ac de 21 G, exprima intr-un tub de centrifuga stratul superior, bogat In
leucocite. Sedimenteaza e1ementele figurate sanguine prin centrifugare 20 minute 1acca
300 xg. SpaH'ice1ulele de doua ori cu tampon fosfat salin ~i fo1ose~te suspensia ce1u1ara
spalata pentru izo1area virusu1ui.
Nota. Trimite laboratorului de referinta, dupa caz, suficient produs patologic ca
atare sau prelucrat pentru ca, In principiu:
0 parte din proba este examinata, iar
aha parte, amestecata cu un volum egal din solutia 70% de sorbitol, este conge lata
la -70C pentru cazurile cand se impune reizolarea de virus.

163
PARTEAI

BIBLIOGRAFIE SELECTIV A

BAISDEN, C.R. (1985): The Office practice laboratory, Aspen Systems Corporation, Rockville.
BALS, M. G. (1982): Laboratorul clinic in infeqii, Editura Medicala, Bucure~ti.
BILElE, v., N., POSZGI (editori) (1984): Bacteriologie Medicala, vol. I, Editura Medicala, Bucure~ti.
BUlUC D. (2003): Microbiologie Medicalii, edi!ia 6-a, Editura "Gr. T. Popa", Ia~i.
C.D.C. - N.I.H. (1984): Biosafety in microbiological and biochemical laboratories, U.S. Department of Health
and Human Services, Center for Diseases Control, National Institutes of Health, Washington D.C.
COLLINS, C. H., P. M. LYNE, J. M. GRANGE (1995): Collinns and Lyne's Microbiological Methods,
7-th edn, Butterworth-Heineman, London, U.K.
EDBERG, S. C. (1981): Methods of quantitative microbiological analyses that SUPPOI1the diagnosis, treat-
ment, and prognosis oh human infections. C.R.C. Critical Rev. Microbiol.
FIELDS, B. N. (1996): Virology, 3-rd edn, Raven Press.
FRENEY, 1., F. RENAUD, W. HANSEN, C. BOLLET (2000): Precis de Bacteriologie Clinique, Ed. ESKA,
Paris.
HENRY, J. B., G. A., THREATTE (editors) (2001): Clinical Diagnosis and Managment by Laboratory
Methods, 20-th edn, W. B. Saunders Co., Philadelphia.
LELAND, D. S., (1996): Clinical Virology, W. B. Saunders, Philadelphia.
LENNETTE, E. H., E. T., LENNETTE (1995): Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Ch lamydial
Infections, 7-th edn, American Public Health Association, Washington D. C.
MILES, A. A., S. S. MISRA (1938): The estimation of bactericidal power of the blood. 1. H)'g. Camh ..
38:72.
MIMS, C. A., J. H. L. PLAYFAIR, 1. M., ROITT et al. (1993): Medical Microbiology, Mosby Europe
Limited, London.
MURRAY, P. R., E. J. BARON, 1. H., JORGENSEN et al. (2003): Manual of Clinical Microbiology, 8-th
edn, A.S.M. Press, Washington D.C.
NOE, D. A. (1985): The Logic of Laboratory Medicine. Urban and Schwal1zenberg, Baltimore.
RUSSEL, A. D. (1996): Activity ofbiocides against mycobacteria. 1. Apll. Bacterial. Symp. Suppl. 8 J :87S.
RUSSEL A. D., W. B. HUGO, G. A. 1. AYLIFFE (1992): Principles and Practice of Disinfection, Preserva-
tion and Sterilization, 3-rd edn, Blackwell Science, Oxford, U.K.
RUTALA, W. A. (1995): Chemical Gem1icides in Health Care, Polyscience, Morin Heights, PQ, Canada.
STOKES E. J., G. L. RIDGWAY, M.W.D. WREN (1993): Clinical Microbiology, 7-th edn. Edward Arnold.
London, U.K.
TOPlEY & WILSON'S Microbiology and Microbial Infections (2005): 10-th edn, Hodder Arnold, LOll-
don, U.K.
WARFORD, A. L., K. A. REKRUT, R. A. LEVY et al. (1984): Sucrose phosphate glutamate for combines
transport of chlamydial and viral specimens. Am. 1. Clin. Patha!. 8 1:762.
WINN, W. Jr., S. ALLEN, W. JANDA et al. (2005): Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic
Microbiology, 6-th edn, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia.

164
Partea a II-a

INVESTIGAREA ETIOLOGICA
A PRINCIPALELOR SINDROAME INFECTIOASE

9. HEMOCULTURA IN DIAGNOSTICUL INFECTIEI


(DUMITRU BUIUC)

9.1. INTRODUCERE 9.4.3. Interpretarea rezultatelor. Diferentierea


9.2. CONSIDERATII ETIOPATOGENETICE contaminantilor
$1 CLINICE Argumentele mierobiologului
9.3. EFECTUAREA HEMOCULTURILOR Argumentele clinicianului
9.3.1. Indicatii 9.4.4. Comunicarea rezultatelor
9.3.2. MateriaIe necesare 9.5. EXAMENUL MICROBIOLOGIC IN
9.3.3. Mediile pentru hemocultura
CONDITII BACTERIEMICE PARTI-
9.3.4. Conditionarea mediilor CULARE
9.3.5. Prelevarea sangelui 9.5.1. Bacteriemiile de cateter
9.3.5.1. M071lentul preleviirii
Metoda eantitativa
9.3.5.2. NU71liirul!ji volumul preleviirilor
Metode semicantitative
9.3.5.3. Zone de punctie
Izolarea semieantitativa
9.3.5.4. Prelevarea!ji transportul hemoculturilor
Microscopia semicantitativa
9.3.5.5. Criterii de calitate a hemoculturilor
9.5.2. Hemoculturi cantitative
9.4. INCUBAREA $1 URMARIREA
HEMOCULTURILOR 9.5.3. Hemocultura in leptospiroza

9.4.1. Incubarea 9.5.5. Hemocultura in bruceloza

9.4.2. Urmarirea 9.5.6. Hemocultura in fungemii

ExamenuI macroscopic 9.5.7. Hemocultura in infectii sistemice cu

Microscopia micobacterii conditionat patogene


Subcultivarea hemocultmilor: 9.5.8. Hemocultura prin metoda lizei cu centri-
eu cre~tere evidenta fugare
lara cre~tere evidenta 9.5.9. Hemocultura prin metoda lizei Cll filtrare

165
9.1. INTRODUCERE

Hemocultura, insamantarea ~i incubarea unei probe de sange, intr-un mediu de


cultura adecvat, urmare~te izolarea ~i identificarea bacteriilor sau fungilor antrenati de
curentul circulator in anumite conditii patologice. Prin aceasta hemocultura devine 0
importanta metoda de diagnostic, care poate orienta sau reorienta terapia antimicrobiana
a unor boli infectioase grave.

9.2. CONSIDERATII ETIO-PATOGENETICE ~I CLINICE

Sangele omului nOffi1aleste steril, iar sistemul circulator are importante capacitati
de eliminare a microorganismelor. De aceea numarul unitatilor formatoare de colonii in
cursu 1 bacteriemiilor, fungemiilor ~i septicemiilor ramane, cu ullele excePtii, in general
redus.
Bacteriemia este prezenta in sange a bacteriilor provenite dintr-un focar septic
sau de pe 0 mucoasa lezata. Frecvent starea bacteriemica este lipsita de expresie clinica
sau se insote~te llumai de frison ~i febra la care se pot adauga simptome ~i semne proprii
cOllditiei care a detenninat descarcarea bacteriemica .
Bacteriemii ocazionale:
- Pot fi tranzitorii ~i spontan rezolutive cand sunt ocazionate de extraqii dentare ~i
alte interventii stomatologice, un cateterism uretral, 0 bronhoscopie, interventii chirur-
gicale pe mucoase nom1al colonizate sau pe focare septiee tisulare, urinare, ginecologice.
Majoritatea sunt detenninate de microorganisme din mierobiota indigena.
- Pot evolua gray cand apar dupa perfuzia unor solutii contaminate, cand sunt
detenninate prin colonizarea unor inseqii vasculare (e.g., catetere ~.a.) sau cand apar la
consumatorii de droguri pe cale intravenoasa.
Au unnari grave cand sunt detenninate, prin transloeare intestinala, de bacili gram-
negativi eu un anumit potential patogen la nou-nascuti ~i sugari inainte de constituirea
mioerobiocenozelor climax intestinale cu bariera lor anaeroba (e.g., bacteriemii cu
Escherichia coli Kl, cu Salmonella) sau la pacienti leucemici ori imunosupresati (e.g.,
bacteriemii cu Pseudomonas aeruginosa) .
Bacteriemii intermitente insotesc evolutia celor mai variate focare de infeqie:
nefrite interstitiale, colecistite ~i angiocolecistite, enterocolite, alveolite pulmonare,
meningite, peritonite, osteomielite, artrite, flegmoane ~i abcese, infectii ale plagilor,
arsurilor sau escarelor. GRANDSEN ~i co lab. (1996) au stabilit, prin analiza statistidi,
~apte factori de risc pentru bacteriemii cu Pseudomonas aeruginosa: neutropenia, terapia
citotoxica sau cu corticosteroizi, sexul masculin, infeqia nosocomial a, mai ales in servieii
de terapie intensiva, terapie antibacteriana in antecedente, focarul de infeqie. Foeare de
infeqie ~i interventii cu mare rise generator de asemenea baeteriemii sunt: infectiile
cailor urinare, cateterisme ~i interventii urologiee, iar eu rise redus sunt: foearele de
infeetie osoase, altieulare. meningiene, ale eailor respiratorii superioare ~i ale tractusului
genital feminin.
Intermitenta sistematizata au baeteriemiile din unele boli infeqioase eicliee ea
febrele reeurente, febra de Wolhynia.

166
Bacteriemii continue apar in evolutia unor boli infectioase ciclice ca febrele
enterice, leptospiroze ~.a.; in infectii endovasculare cum sunt endocarditele subacute,
anevrisme infectate, tromboflebite.
Aparitia unor metastaze septice amplifica procesul bacteriemic amorsat de focarul
infectios initial:
Septicemia este termenul clinic prin care individualizam 0 bacteriemie importanta
cu evolutie clinic a neregulata, imprevizibila ~i grava, acompaniata de frisoane, febra
neregulata, toxemie, hipotensiune, prostratie, eruptii cutanate polimorfe ~i variate
metastaze septice tisulare sau viscerale. Gravitatea sindromului septicemic lasa pe al
do ilea plan simptomatologia focarului infectios primar, care trebuie insa intotdeauna
cautat.
Aceasta diferentiere bacteriemie versus septicemie ramfme didactica, este artificiaIa.
Bacteriemiile ~i fungemiile adultilor evolueaza, in general, cu un numar redus de
microorganisme circulante, apreciat de diferiti autori intre 1 ~i 30 UFC/mL sfmge. La
nou-nascuti, sugari ~icopilul mic concentratia depa~e~te frecvent 100 UFC/mL.ln general,
intre gravitatea conditiei clinice, a prognosticului ~i concentratia bacteriilor din sfmge
exista 0 relatie direct proportionala.
Microoranismele izolate cu semnificatie clinica din hemoculturi, in ordinea
aproximativa a frecventei actuale, sunt:

Staphylococcus aureus Peptococcus niger


Escherichia coli Clostridium perfi'ingens
Klebsiella spp. Propionibacterium spp.
Pseudomonas aeruginosa Veillonella spp.
Enterobacter ;;pp. Salmonella spp.
Serratia spp. Stafilococi coagulazo-negativi
Proteus spp. CO/ynebacterium spp.
Streptococi a ~i f3-hemolitici Listeria monocytogenes
Pneumococi Leptospira
Enterococi Brucella spp.
Haemophilus injluenzae Fungi:
Neisseria meningitidis Candida spp.
Anaerobi: c,yptococcus l1:eoformans
Bacteroides fragilis (grup) Histoplasma capsulatum
Fusobacterium spp. Aspergillus spp.

Pana la 10% din bacteriemii pot fi polibacteriene. Exista diferente intre spectrul
etiologic al bacteriemiilor legate de varsta pacienti10r (predominanta bacililor gral11-
negativi facultativ anaerobi intestinali la nou-nascuti ~isugari), reactivitatea il11una(variate
organisl11e oportuniste, inclusiv stafilococi coagulazo-negativi, la gazda imuno-
compromisa), poarta de intrare sau focarul infectios (frecventa bacteriilor anaerobe dupa
intervenrii chirurgicale pe colon; a streptococilor viridans ~ienterococilor in endocarditele
bacteriene subacute; a stafilococilor coagulazo-negativi la pacientii cu proteze valvulare
cardiace sau cu insertii intravenoase).

167
Retinem, Cll importanta pentrll practica hemocll/turii:
gravitatea conditiei septicemice, de unde urgenta unor hemoculturi;
prezenta frecvent intermitenta a bacteriilor in sange, de unde necesitatea
hemoculturilor repetate;
concentratia .J:ngeneral redusa a bacteriilor in sange, de unde necesitatea
insamantarii unor volume mai mari de sange ~i prelungirii timpului de incubare;
prezenta a numero~i factori antimicrobieni in sange, de un de necesitatea
neutralizarii prin diluare sau/~i chimice a acestora;
varietatea microorganimelor implicate, de unde necesitatea un or medii de cultura
~i conditii de incubare care satisfac 0 gama larga de exigente;
controlul contaminarii probe lor prin punctie ~i aspiratie transtegumentara sau
manop era J:nsamantarii, de unde necesitatea antiseptizarii speciale, un anumit mod de
insamantare ~i anumite criterii pentru diferentierea bacteriilor de contaminare de cele cu
semnificatie clinica.

9.3. EFECTUAREA HEMOCULTURILOR

9.3.1. Indicatii

Hemoculturile sunt indicate la urmatoarele categorii de pacienti:


1) cu sindrom septicemic;
2) nou-nascuti, sugari, gazde imunocompromise la orice varsta, inclusiv drogatii
pe cale intravenoasa, cu semne clinice sugestive, chiar minime:
3) cu endocardita infectioasa;
4) cu sindrom sugestiv pentru infectie sistemica cu patogeni specifici (febra enterica,
bruceloza, leptospiroza etc.);
5) cu sindroame febrile fara cauza precizata;
6) cu infectii bacteriemice polietiologice (alveolite pulmonare, meningite, peritonite,
pielonefrite acute, infectii puerperale, angio-colecistite, infectii ale plagilor ~i arsurilor);
7) cu stari febrile dupa interventii chirurgicale pe intestin, focare infectioase cronice,
cateterism venos prelungit, dializa peritoneala.

9.3.2. Materiale necesare

Multe hemoculturi fiind urgente, truse cu materialele precizate mai jos trebuie sa
fie permanent la dispozitia serviciilor in care sunt internati pacienti Cll conditii
bacteriemice:
1) Seringa sterila de 20 mL de unica folosinta (corespunzator mai mica pentru copii).
Seringa poate fi fnlocuita avantajos cu un set de transfer (tub cu ace la ambele
capete) pentru ca permite fnsamdntarea direct fn mediul de cultura, ceea ce minimizeaza
riscul contaminarii. Este operant cand mediile de cultura sunt conditionate in flacoane
cu prevacuum.

168
Ace cu calibrul19 G sau 21 G.
2) Bucata de mU$ama 40/40 cm.
3) Sapun lichid, alcool iodat 2% $i eter (precautie). Alcoolul iodat 2% este bactelicid
in doua minute. II preferam solutiei de betadina gennicida abia in 30 de minute.
4) Pense sterile.
5) Tampoane sterile din tifon 5/5 cm.
6) Garou.
7) Flacoane sau tuburi cu medii adecvate de cultura (vezi mai jos) preindilzite la
37C.
8) Masca sterila $i spirtiera, daca sunt folosite flacoane sau tuburi carora trebuie sa
li se scoata dopul pentru insamantare.

9.3.3. Mediile pentru hemocultura

Pentru hemoculturi sunt indicate medii cu mare valoare nutritiva: bulion infuzie
cord-creier, bulion tripticaza-soia, bulion Columbia sau bulion Brucella. Cultivarea ~i a
bacteriilor anaerobe necesita bulion Columbia cu 0,01-0,05% cisteina sau bulion cu
tioglicolat.
Izolarea bacteriilor cu perete defectiv impune folosirea unui bulion hiperton (os-
motic protector) cu 6% sorbitol sau 10% zaharoza.
Adaugarea la mediul pentru hemocultura de "liquoid" (sodium polyanethyl sul-
phonate) in concentratie final a de 0,025-0,050% are un dublu avantaj:
efect anticoagulant, prin care evita formarea cheagului ro$U de sange in care pot
fi mascate colonii bacteriene;
completeazii efectul dilutiei pentru neutralizarea fagocitelor, a complementului
$i a unor antibiotice ca aminoglicozidele $ipolimixinele. "Liquoidul" este anticoagulantul
cu cele mai restranse efecte inhibitoare antibacteriene: limitate numai la meningococi,
gonococi, Streptobacillus moniliformis ~i Gardnerella vaginalis. Utilizarea altor
anticoagulante (citrat, oxalat, EDTA) este fonllal contraindicata pentru efectul lor in-
hibitor.
Rii$ini anionice (antimicrobial removal device) pot adsorbi pana la 100 /lg de anti-
biotic, cu excePtia moxalactamei ~i imipenemului, dar sunt avantajoase numai pentru
izolarea stafilococilor de la pacienti sub tratament antimicrobian.

9.3.4. Condition area mediilor: flacoanele pentru hemocultura

Sunt indicate flacoanele speciale cu membrana de cauciuc sau plastic fixata cu


capac in~urubat, care penllit insamantarea tara indepartarea capacului. Volumul de mediu
per flacon este de 50-100 mL pentru prelevarea sangelui de la adulti $i de 20-50 mL
pentru prelevarea de la copii.
Cea mai eficace $i eficienta economie este folosirea mediilor comercializate eu
eertifieat de garantie (sterilitate $i calitiiti nutritive).

169
9.3.5. Prelevarea sangelui

9.3.5.1. Momentul prelevarilor:


Prelevarile trebuie mcute fnaintea tratamentului antimicrobian. Oricat de grava
ar fi 0 septicemie, acest tratamentpoate fi temporizat 1,5-3 ore pentru prelevarea corecta
a hemoculturilor.
In bolile care evolueaza sistematic cu faza bacteriemica (alveolite pulmonare,
febre enterice, leptospiroza, bruceloza), procentul hemocuiturilor pozitive cre~te eu cat
acestea sunt practicate mai aproape de debutul boW.
In boIiIe cu bacteriemii continue (e.g., endocardite infectioase), prelevarea nu
este legata de un moment anume In cursul zilei.
In boIiIe cu bacteriemii intermitente, sistematizate (e.g., febra de Wolhynia etc.)
sau nesistematizate (e.g., supuratii, pielonefrite ~.a.), fiecare descarcare bacteriemica se
Insote~te de frisoane ~i este unnata de un cro~et febriI. Hemoculturile trebuie recoltate
conform evolufiei predictive a curbeifebrile sau/~i In momentul cand bolnavul senmaleaza
aparitia ji-isoanelor.

9.3.5.2. Numarul ~i volumul prelevarilor:


Majoritatea bacteriemiilor sunt intennitente. In aceste conditii 0 singura prelevare
asigura izolarea bacteriei din sange cu 0 sensibilitate de numai 0,8. Trei pre levari
intennitente In 24 ore cresc sensibilitatea izolarii aproape de 1,0. Rar sunt necesare mai
multe pre levari. In urgente ritmul prelevarilor poate fi la intervale de 30-60 minute.
In bolile cu descarcare bacteriemica continua (e.g., endocardite infectioase) sunt
suficiente doua pre levari In 24 ore.
Pentru adult sunt necesari 20-30 mL sange per prelevare. La nou-nascuti, sugari ~i copii
mici, concentratia realizata de bacteri In sange fiind semnificativ mai mare, sunt suficienti
1-3 mL sange per prelevare.

9.3.5.3. Zone de punctie.


Electiv: venele de la plica cotului sau, la nou-nascuti ~i sugari, venele jugulare.
Alternativ: venele antebratului inferior sau dorsale ale mainii. In endocarditele eu focar
septic pe valvulele mitrale sau aortice, punqia arteriala poate ameliora sensibilitatea
hemoculturii. Punctia la nivelul pliului inghinal impune decontaminare foarte atenta din
cauza microbiotei indigene de cca 1 000 de ori mai numeroasa decat la nivelul bratelor ~i
antebratelor. Este indicat ca acele 2-3 prelevari necesare sa fie mcute din vene diferite
(vezi maijos).

9.3.5.4. Prelevarea ~i transportul hemoculturilor


1) Lucreaza la adapost de curenti de aer ~ipoarta masca daca Insamantarea impune
scoaterea dopului flacoanelor cu mediu.
2) Plaseaza pacientulln decubitus dorsal cu bucata de mu~ama sub cot, In zona de
punctie, pentru a preveni patarea lenjeriei de pat cu solutiile decontaminante.
3) Decontamineaza-ti mainile prin spalare Ingrijita cu apa ~i sapun, Ullllata de
uscare cu prosop curat.

170
Aplidi garoulla cca 10 cm proximal de zona punctiei ~i strange-l pentru a aprecia,
prin palpare, dimensiunea ~i elasticitatea venei de punctionat. Simpla inspectie vizuaJa
fi'ecvent nu depisteaza vene profunde excelente pentru punctie. La nevoie, veneJe sunt
evidentiate mai bine dacii pacientul strange ~i relaxeaza de cateva ori pumnul. Nu masa
~inu flagela antebratul.
5) Da drumulla garou.
6) Antiseptizeaza-ti degetele cu alcool iodat 2%.
7) Decontamineaza larg, concentric, zona de punctie, intai prin spalare cu apa ~i
sapun lichid, apoi prin badijonare cu alcool iodat 2%. Dupa cca 1 minut badijoneaza
zona, tot concentric, cu un tampon inmuiat in eter (precautii) pentru a indeparta iodul ~i
a lasa tegumentul cat mai uscat. Punctia ~i aspiratia singelui prin tegument umezit, chiar
cu antiseptic, expune proba contaminarii cu bacterii rezidente in porozitatile epidennei
(stafilococi coagulazo-negativi, Propionibacterium spp., bacili difterimorfi).
8) Antiseptizeaza membrana de cauciuc a flacoanelor cu mediu de cultura, even-
tual contaminata dupa scoaterea capacului protector.
9) Ajutorul reaplica garoul.
10) Fixeaza tegumentul deasupra punctului de punctie prin tensionare pe brat cu
degetele mainii libere ~i, cu seringa pozitionata in axul venei, in unghi de cca 30 cu
tegumentul ~iacul cu bizoul in sus, punctioneaza pielea ~ivena subjacenta printr-o mi~care
moderat de brusca. 0 cedare u~oara este uzual resimtita la piitrunderea acului in vena.
Inainteaza pentru a pIasa in vena bizoul cu 0 parte din ac.
11) Exercita 0 u~oara presiune negativa prin retragerea pistonului. Sangele trebuie
sa patrunda liber in seringa sau in tubul setului de transfer. Cand scurgerea este neregulata,
rote~te u~or seringa pentru a repozitiona bizoul in vena. Sangele nu mai curge cand
varful acului perforeaza vena ~i patrunde in tesut. Retrage putin acul pentru a obtine
sange din nou.
J2) Cand sangele incepe sa curga in seringa sau prin setul de transfer, da drumulla
garou pentru a preveni fonnarea unui hematom.
13) Volumul necesar de sange odata recoltat, retrage acul din vena ~i preseaza
imediat punctul de punctie cu tampon steril. Pacientul sau ajutorul continua compresia
pana la hemostaza completa.
14) Prin perforarea membranei de cauciuc a flacoanelor repartizeaza imediat sangele
recoltat in 2 flacoane cu mediu de cultura (respectiv pentru incubare aerobii ~i anaeroba).
Dacii folose~ti pentru prelevare un set de transfer, ceea ce este de dorit pentru ea
pem1ite insamantarea direct in flaconul eu mediul de cultura, cind sangele a inaintat
sufieient in tubul de legatura, perforeaza membrana flaconului men!inut sub nivelul
punctului de punqie.
In eventualitatea cii prima tentativa de prelevare e~ueaza, folose~te pentru veni-
punctura alt ae sau alt set de transfer.
15) Agita bland flaconul pentru omogenizarea singelui in masa mediului.
16) Asigura, in cel mai scurt timp, transportul flacoanelor fiecarei hemoculturi la
laborator.
Cand hemocultura nu poate fi rucuta la patul bolnavului, folose~te pentru prelevarea
probei un tub eu 1 mL solu!ie 0,25-0,5% "liquoid" ca anticoagulant ~i expediaza imediat
proba la laborator pentru insaman!are.
171
9.3.5.5. Criterii de calitate a hemoculturilor
(1) Prelevarea inaintea terapiei antimicrobiene sau, dad nu este posibil, inaintea
dozei subsecvente de antibiotic. Precizarea antibioticului utilizat.
(2) Punctionarea altei vene la fiecare hemocultura.
(3) Evitarea prelevarilor prin cateter intravascular.
(4) Expedierea imediata la laborator sau, daca nu este posibil, incubarea flacoanelor
la 37C pana in momentul expedierii.
(5) Izolarea aceleia~i bacterii in mai multe flacoane.
in cererea de analiza vor fi specificate: diagnosticul clinic, ora recoWirii; in
caz de tratament antimicrobian, antibioticul ~i ora ultimei administrari inainte de
prelevare; dad prelevarea a fost facuta in cursul frisonului sau puseului febril.

9.4. INCUBAREA SI URMARIREA HEMOCULTURILOR

9.4.1. lncubarea

La primirea in laborator, 1-2 din flacoanele hemoculturii trebuie aerist( e) prin


perforarea membranei (dezinfectate) cu un ac protejat cu filtru de vata, pentru incubarea
aerobii. Acul poate fi retras cfmd presiunea din flacon se egalizeaza cu presiunea
atmosferica. Incubarea in atmosfera cu 5-10% CO2 este de dorit ~i devine obligatorie
pentru izolarea brucelor. Flacoanele comercializate pentru hemoculturi contin COr Unul
din flacoane ramane neaerisit pentru incubarea anaeroba.
Incubeaza flacoanele cu hemoculturi la 37C $i examineaza-le macroscopic sau
radiometric, microscopic ~i prin subcultivari timp de 7 zile. Se impune incubare mai
prelungita a hemoculturilor de la pacienti cu endocardita subacuta, a celor prelevate sub
antibioticoterapie (pana la 14 zile) sau cand unnarim microorganisme cu exigente
particulare (vezi mai jos).

9.4.2. Vrmarirea hemoculturilor

Examineaza macroscopic, de doua ori pe zi in primele 3 zile, apoi zilnic, supema-


tantul prin transparenta, iar stratul de hematii in lumina reflectata. In absenta cre~terii,
stratul de hematii apare ro~u, nemodificat, acoperit cu bulionul galben $i limpede. Semne
ale cre$terii sunt: aparitia de colonii sau a unui depozit floconos pe stratul de hematii;
tulburare unifonna sau limitata la suprafata mediului, uneori cu pelicula; hemoliza;
coagularea mediului; bule de gaz.
Unele bacterii pot cre~te in stratul de hematii fara sa modifice supematantul (e. g.,
meningococi, Haemophilus injluenzae, pneumococi, unele pseudomonade, Bacteroi-
des, Fusobacterium), iar pneumococii sufera uneori autoliza precoce. Dupa incubare
prelungita pot sa apara false semne de cre~tere: tulburare steriIa a mediului cauzata de
modificarea sangelui, prezenta "liquoidului", a agarului.

172
Sunt comercializate sisteme semiautomate sau automate computerizate pentru
detectia rapida a bacteriilor in hemoculturi. Principiile pe care se bazeaza aceste sisteme
sunt in esenta:
detectia directa a producerii CO2, fie prin prelevare seriata de e~antioane de gaz
din flaconul de cultura ca in sistemul BACTEC (Becton Dickinson Instruments Systems,
Sparks, USA), fie prin fortarea fluidului de cultura (sub presiunea CO2 degajat) sa treaca
intr-un compartiment semnal de unde poate fi examinat microscopic ~i subcultivat ca in
Oxoid Signal System (Unipath, Basingstoke, Hampshire, England), fie prin difuziunea
CO2 printr-o membrana semipenneabila in cOl11partil11entulsel11nal unde acidifica ~i
schimba culoarea detectorului de la verde la galben ca in sistemul BacT/Alert (Organon
Teknika Corp, Durham, NC, USA);
detectia producerii de CO2, a variatiilor de pH sau Eh prin extinctia fluorescentei
unui indicator ca in sistemul Vital (bio-Merieux, Marcy-l 'Etoile, France);
cre~terea pe suprafetele de agar ale un or medii difazice, ca in Septi-Chek (Roche
Diagnostic Systems, Ruthelford, Ni, USA) ~.a.;
detectia electronica a turbiditatii bulionului.
Microscopia. Deschide ~i l11anipuleaza flacoanele strict aseptic. Efectueaza ~i
examineaza frotiuri colorate Gram.
Subcultivarea. Sunt posibile doua situatii:
Hemoculturi cu cre~tere evidenta. In raport cu flaconul in care a aparut cre~terea,
epuizeaza 0 ansa pe agar-sange ~ocolat pentru incubare aeroba sau cu agar-sange pentru
anaerobi. Epuizarea ingrijita pe 0 jumatate de placa este necesara pentru ca 10-15%
din hemoculturi sunt polimicrobiene. Functie ~i de rezultatul bacterioscopiei, putel11
recurge la:
Teste de identificare in cultura primara.
- Pentru diplococi sau streptococi: sensibilitatea la optochin, la bacitracina, testul
cu bila-esculina, toleranta la sare.
- Pentru stafilococi: testul coagulazei.
Cand cocii gram-pozitivi apar fara a~ezare cracteristica, testul catalazei poate
orienta diagnosticul: pozitiv la stafilococi, negativ la streptococi.
- Pentru bacilii gram-negativi: oxidaza, insal11antarea pe l11ediile politope TSI ~i
MIU/MILF, utilizarea citratului.
Antibiograma directa, nestandardizata, aduce rezultate utile in interval de 6-8 ore
~i are reproductibilitate buna in raport cu antibiograma pe subcultura standardizata.
Insal11anteaza placile cu un tamponinl11uiat in hel110cultura pozitivata (vezi Cap. 23).
Confirmarea rezultatelor prelil11inareprin testarea subculturilor pure este obligatorie.
Avand in vedere posibilitatea bacteriemiilorpolimicrobiene, aceste testari trebuie tacute
pentru mai multe colonii.
Hemoculturi flira cre~tere evidentii. Zilnic epuizeaza cate 0 ansa pe 0 placa cu
agar-sange ~ocolat pentru incubare aeroba ~i agar-sfmge pentru anaerobi.
Contralul final: la sfar~itul perioadei de observatie, din hemocultura ol11ogenizata
prin agitare, insamanteaza cateva picaturi in tub cu bulion tioglicolat ~i um1are~te 3 zile
o eventuala cre~tere la 37C.

173
9.4.3. Interpretarea rezultatelor. Diferentierea contaminantilor

Chiar In conditii ideale de decontaminare a tegumentului punctionat ~i de asepsie,


3-5% din hemocu1turi sunt contaminate cu bacterii din microbiota tegumentului. Acest
procent cre~te cfmd masurile de decontaminare a tegumentului sunt dificile: e. g., sugari,
pacienti cu deTI11atoze.Incidenta In cre~tere a bacteriemiilor cu bacterii conditionat
patogene din microbiota tegumentului la pacienti imunocompromi~i obliga la 0 evaluare
atenta a semnificatiei clinice a izolatelor din specii conditionat patogene ca: stafilococi
coagulazo-negativi, Propionibacterium spp., alte pseudomonade dedit P aeruginosa etc.

Argumente de competenta microbiologului:


Izolarea aceleia~i bacterii (specie, antibiovar etc.) In mai multe flacoane ale unui
set de hemocultura, dar mai ales In hemocu1turi repetate din vene diferite, indica
semnificatie clinica.
lzolarea de bacterii diferite din flacoanele hemoculturilor de la acela~i pacient
indica 0 contaminare.
Hemocultura cantitativa argumenteaza mai convingator semnificatia clinica a
izolatelor conditionat sau accidental patogene ~i este indicata cand decontaminarea
tegumentului pentru punctie este dificila. Necesita prelevarea sangelui pe "liquoid"
Insamantarea, strict aseptica, in placi cu agar-sange ~ocolat pentru incubare aeroba ~i
agar-sange pentru anaerobi. Placile insamantate trebuie urmarite 7 zile. Pragul
semnificatiei clinice este de cel putin 10 colonii de stafilococi coagulazo-negativi sau
cel putin 3 colonii de baeili gram-negativi ori streptoeoci per plaea insamantata cu 0,5 mL
sange.
Prezenta unoI' structuri bacteriene implicate In patogenia bacteriemiilor de cateter:
e. g., glicocalixul stafilococilor coagulazo-negativi.
Argumentarea bacteriemiei polimicrobiene se bazeaza pe izolarea a eel putin
doua microorganisme din aceea~i hemocultura, de eel putin doua ori In 24 ore.
Argumente de competenta clinicianului
Varsta ~i statusul imuno-reactiv al pacientului.
Particularitati ale focaru1ui septic primal'.
Prezenta sindromului umoral inflamator.
La pacienti imunocompromi~i, 1a cei cu proteze valvulare cardiaee sau eu insel1ii
vasculare sunt cunoscute bacteriemiile cu stafilococi coagulazo-negativi sau Propioni-
bacterium spp. Bacteriemiile polimicrobiene sunt mai frecvente la capii, mai ales cfmd
exista anomalii ale barierelor antimicrobiene, la pacientii cu peritonite seeundare, infeqii
ale cailor urinare, operatii pe cord desehis, infectii ale pli'igilor ~i arsurilor.
Sintetizand competentele pentru atestarea semnificatiei izolatelor cu virulenta
redusa din hemoeulturi, HlRAKATA ~i colab. (1996) au propus un scar al semnificatiei
clinice, de la 1la 9 punete, care insumeaza un punctaj de baza (tabelul 9-1) ~i un punetaj
aditianal.

174
Tabe/u/ 9-1

Punctajul de baza pentru calcularea scorului de semnificatie clinica a izolatelor din hemoculturi
(HIRAKATA ~i colab., 1996)

Numarul flaeoanelor eu hemoculturi (pozitive/total) Punctajul21


3 de baza

Punctajul aditional include: 1) acela~i microorganism crescut ~i din alt situs de


punctie venoasii; 2) simptomatologie clinica sugestiva pentru sepsis; 3) prezenta factorilor
de risc iatrogen cum sunt: eateter intravenos, terapie imunosupresiva; 4) semne de
inflamatie, eel pu!in doua din: febra peste 38C, leueocitoza, ere~terea vitezei de
sedimentare a hematiilor ~i eoneentra!iei seriee a proteinei C reactive; 5) stare a generala
alterata, eel pu!in una din unnatoarele: sciiderea tensiunii arteriale, scaderea fluxului
urinar, seiiderea plachetelor sanguine, cre~terea fibrinogenului sau produ~ilor de degradare
a fibrinei.
Izolatele virulente (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Strepto-
coccus pyogenes, Haemophilus spp., Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa,
Bacteroides spp. sau al!i anaerobi ~i Candida albicans) dau scoruri maxime. Scorurile
izolatelor eu virulen!a redusa (stafiloeoei coagulazo-negativi, enterococi, bacili gram-
negativi nefennentativi al!ii deeatPseudomonas aeruginosa) se extind de la lla 9 puncte,
adiea de la semnifica!ia de contaminant spre semnifiea!ia clinica realii.
Absen!a cre~terii poate fi urmarea absen!ei baeteriilor in proba examinata,
sensibilita!ii insufieiente a metodei ori prelevarii probelor sub antibioticoterapie.
Activitatea antibacteriana a hemoculturilor poate fi obiectivata prin ronde Ie din
hartie de filtru impregnate eu 0,02 mL din bulionul hemoeulturii ~idepuse, cate 0 pereche,
pe suprafa!a unei pHici eu agar Mueller-Hinton cu spori de Bacillus subtilis ATCC 6633
(vezi Cap. 24). Folosirea de cilindri din o!el inoxidabil cu diametrul de 6-8 mm pennite
depunerea unui volum mai mare de bulion (0,1 mL). Dupa 8 ore de incubare la 37C, 0
zona de inhibi!ie a ere~terii in jurul depozitului de bulion testat indica activitate
antibaeteriana in hemoeultura, propoqionala cu diametrul aeestei zone.

9.4.4. Comunicarea rezultatelor

Rezultatele hemoeulturii trebuie comunicate etapizat, factual ~i, nUl11aicand este


cazul, dublate cu 0 nota interpretativa.
Telefonie, comunical11 categoria microscopica a izolatelor imediat dupa obtinerea
lor: e.g., "Coci gram-pozitivi sau bacili gral11-negativi in curs de identificare". Buletinul
de analiza va eonsemna etapa cu etapa: categoria microscopica, identitatea probabila ~i
antibiograma (pe baza testarii primoculturii) ~i rezultatele finale bazate pe testari
standardizate ale subculturilor pure. Absenta cre~terii dupa perioada de observatie trebuie
consel11nata ea atare "Nici 0 cre~tere dupa .... zile de incubare" ~i nu "Hemocultura
negativii".

175
Toate izoIateIe trebuie comunicate. Clinicianul este cel care stabile;;te in final
semnificatia lor. Dar microbiologul poate interveni cu interpretari argumentate, de
competenta sa, privind probabilitatea contaminarii (legaturafeedback laborator clinica).

9.5. EXAMENUL MICROBIOLOGIC IN CONDITII


BACTERIEMICE PARTICULARE

9.5.1. BacteriemiiIe de cateter

Infectia de cateter (inflamatie locala, bacteriemie) este un risc al catetelizarilor


intravenoase prelungite (perfuzii, dializa extrarenal a etc.). lnseqiile transcutana ~i
intravenoasa (i.v.) ale cateterelor sunt frecvent colonizate cu microorganisme din
microbiota epidennei fad invadarea curentului sanguin. Riscul inflamatiei ~ibacteriemiei
apare dnd numarul organismelor de colonizare depa~e~te 103 UFC/inseI1ie i.v. Pentru
controlul acestui risc ~i diagnosticul rapid al bacteriemiei consecutive au fost propuse
metode cantitative ~i semicantitative de examinare a cateterelor.
Prelevarea ~i examinarea probelor.
Consideram unnatoarele situatii: caracterul venos central retras din vena, cateterul
venos central mentinut in vena ~i cateterul venos periferic.
(1) Cateterul venos central este retras din venii.
- Antiseptizeaza locul de insel1ie a cateterului prin badijonare, folosind consecutiv
un tampon steril cu betadina, apoi unul cu alcoo!. Evita umezirea excesiva a tegumentului
cu antiseptic. A~teapta uscarea spontana a tegumentului ~iscoate cateterul, fara a-I atinge
de tampon. Astfel este evitata contaminarea cateterului cu unne de antiseptic, care pot
detem1ina un rezultat fals negativ.
- Imediat dupa retragerea din vena, sectioneaza ~i trimite laboratorului pm'tea
proximal a cu 0 lungime de 4-6 cm cu tot cu varf.
- Introdu fiecare segment de cateter in cate un recipient steril. Probele trebuie sa
ajunga in laborator in cel mai scmt timp, inaintea deshidratarii sangelui (indicator de
cali tate a probei).
Daca exigenta examinarii imediate nu poate fi respectata, segmentele de cateter
trebuie introduse aseptic in cate un tub cu bulion nutritiv, care urmeaza a fi incubat la
37C pana in momentul expedierii catre laborator.
Cand este suspicionata bacteriemia de cateter, in afara segmentelor de cateter, VOl'
fi prelevate ~i doua hemoculturi una prin cateter, cealalta prin punctionarea unei vene
periferice.
Indicatorii de calitate sunt cei ai hemoculturii. AIt criteriu important de cali tate
este evitarea uscarii cateteruIui, prin examinarea imediata sau insamantarea extemporanee
in bulion nutritiv.
Cererea de analiza trebuie sa cuprinda urmatoarele mentiuni:
- prezenta sau nu a reactiei locale la locul de insertie (e.g., congestie, exsudat
purulent);

176
- conditii generale ale pacientului: febra, leucograma, VSH, concentratia
proteineiC reactive - suspiciunea de bacteriemie sau sepsis, ori solicitare ca exa-
men de rutina;
- tratamentul antimicrobian, eventual.
Metoda cantitativa. lnfige un ac steril in extremitatea proximala a insertiei i.v. a
cateterului ~i agit-o de cca 3 ori intr-un volum cunoscut de bulion tripticaza-soia. Mai
eficace este omogenizarea timp de un minutpe agitator Vortex. Efectueaza dilutii decimale
in acela~i mediu de cultura ~i epuizeaza dte 0,1 mL din fiecare dilutie, ca ~i bulionul
nediluat, pe ciite 0 placa cu agar siinge. Incubeaza 24-48 ore la 37C. Numara coloniile
dezvoltate ~i, tiniind cont de dilutie ~i volumulinsamiintat, ca1culeaza numarul UFC/
insertie.
lntopretare: prezenta a peste 103 UFC/insertie atentioneaza asupra iminentei
inflamatiei ~i bacteriemiei, care devin efective la peste 104 UFC/insertie.
Metodele semicantitative sunt u~or accesibile oricarui laborator .
Microscopia semicantitativa. Depune insertia i.v. a cateterului (cca 1 cmlungime)
intr-o picatura de solutie salina izotona pe suprafata unei lame de microscop. Acopera
cu a doua lama ~iruleaza insistent insertia intre cele doua lame. Separa lamele, usuca-le
~i Ie fixeaza prin caldura, apoi coloreaza-le Gram ~i respectiv cu albastru de metilen.
Examineaza la microscop cu marire mica (X 100), apoi cu imersia (X 1 000).
lnterpretare: In raport cu numarul polimorfonuclearelor ~i microorganismelor
observate, ca1culeaza scorul de pozitivare dupa sistemul propus de Cooper ~i Hopkins-
tabelul 9-2.
Tabe11l19.2

Punctajul pentru calcularea scorului microscopic* de pozitivitate pentru insertia Lv.a cateterelor
(dupa Cooper ~i Hopkins)

Scar 1/ 5Microarganisme
1/20 PMN
->1-101lama--3-10/lama
cilmpuri
1/5 cfimpuri
campuri
1120 cilmpuri > 1/cfimp

* Examinare cu marile de 1 000 X.

lzolarea semicantitativa. Cu 0 pensa sterila, ruleaza, in zig-zag, insertia i.v. a


cateterului pe intreaga suprafata a unei placi cu agar-siinge. Incubeaza 24-48 ore la 37C
~i numara coloniile dezvoltate.
lntelpretare: Prezenta a 15 colonii se coreleaza cu bacteriemia. Insertia i.v. a
cateterului are in lumen ~ipe suprafata 1-1,5 mg apa. Rezulti'i ca 15 colonii corespund la
cca 15 000 UFClinsertie. Corelatia este mai putemica daca se ridica pragul semnificativ
la 100 colonii per placa.
Consideriind semnificativ pragul de 50 UFC/insertie i.v. de 2 cmlungime, COMAN
~i colab. (1994) au gasit pentru pragul + 1 al microscopiei semnificative 0 sensibilitate
de 0,83 (fig. 9-1 ~i 9-2).

177
Fig. 9-1. Amprenta insertiei
intravenoase a eateterului de
la un sugar eu flebWi septicli
~istare septieemicii: aspeete
micros copice.
(A) la marire de 200 X; (B)la
marire de 1000 X (prin ama-
bilitatea prof. dr. Gabriela
Coman)

Fig. 9-2. Cultura semiconfluenta dupa in-


samantarea semicantitativa a inseqiei Lv. a
cateterului de la un copil cu septicemie (prin
amabilitatea prof. dr. Gabriela Coman).

178
Rezultatele foarte bune dau testarile pentru prezenta glicocalixului pe suprafata
insel1iei i.v. a cateterului sau capacitatea izolatelor (bacterii gram pozitive, gram-nega-
tive sau levuri) de a produce glicocalix - vezi Cap. 40.
(2) Cateterul este mentinut in venii. Efectuam in tuburi sterile, doua hemoculturi
cantitative (vezi hemocultura cantitativa) comparative: una prin cateter, cealalta din vena
periferica (distal de cateter). Respecta toate precautiile de antisepsie ~i asepsie imp use
de prelevarea hemoculturii. Dupa omogenizarea sangelui, prelevam din fiecare tub 100flL
sange diluat ~i epuizam aceste volume pe cate 0 placa cu geloza sange. lncubam 24-48
ore la 37C.
Interpretarea rezultatelor. Izolarea unui numar de cel putin 5 ori mai mare de colonii
din proba prelevata prin cateter decat cea prelevata din vena periferica semnifica septi-
cemia de cateter.
(3) Catetere venoase periferice. Procedeaza ca in cazul cateterelor venoase centrale
retrase din vena.
Practici gre~ite.
Uscarea cateterului prin temporizarea examenului citobacteriologic. Pentru a
preveni erorile generate in asemenea situatii, este indicata efectuarea extemporaneu a
frotiului ~i insamantarii.
Prelevarea din cateterele centrale (arteriale sau venoase) numai a varfului. Trebuie
prelevata ~i examinata ~i insert,ia intravasculara adiacenta celei cutanate, pentru ca de la
insert,ia epidermica incepe colonizarea cateterului.

9.5.2. Hemoculturi cantitative

In general, persistenta hemoculturilor pozitive indica e~ecul tratamentului anti-


microbian ~i necesitatea reOlientarii acestuia. Intr -0 serie de conditii (e. g., bacteriemii la
pacienti cu SIDA, febra tifoida) bacteriemia dispare mai lent. In asemenea situatii
hemoculturi cantitative (revezi 9.4.3.) seriate argumenteaza eficienta tratamentului dnd
concentratia bacteriilor din sange scade constant.

9.5.3. Hemocultura in leptospiroza

Principiu: $ansa izolarii leptospirelor cre~te daca


repetam zilnic hemoculturile in primele 6 zile de boala,
neutralizam, prin dilutii succesive ale probei, inhibitorii natural prezenti in sange,
mai ales dupa a 4-a zi de boala.
utilizam pentru fiecare hemocultura doua medii diferite sau, cel putin, acela~i
mediu din doua loturi diferite.
Necesar: Un tub cu 10 mL ~i 3 tuburi cu cate 3 ml mediu de cultura convenabil
leptospirelor.
Procedura: Insamanteaza 0,5 mL sange in tubul cu 10 mL mediu de cultura ~i
omogenizeaza continutul. Transvazeaza 0,3 mL din acest tub in primul tub cu 3 mL
mediu ~i procedeaza, in continuare, la fel pentru a dilua succesiv proba pana in ultimul
tub al seriei.

179
'----==........
..."""'
. ".,,c~

Dacii hemocultura nu poate fi practicata la capul bolnavului, recolteaza sangele pe


anticoagulant (heparina sau oxalat de sodiu, niciodata pe citrat de sodiu, care este inhibi-
tor) ~i efectueaza insamantarile in interval de maximum 1-2 ore.
lncubeaza tuburile la 28-30C ~i urmare~te cre~terea pana la 5 saptamani prin
microscopie pe fond negru repetata la intervale de 5 zile. Cel mai precoce leptospirele
pot fi observate in a 3-a zi de incubare a hemoculturii.

9.5.4. Hemoeultura in brueeloza

Este indicata insamantarea sangelui in flacoane cu mediu difazic: bulion ~i panUi


de agar preparate pe baza de digestie tripsica de cazeina, digestie pepsicii de tesuturi
animale ~i autolizat de levura (vezi Cap. 39). Flacoanele insamantate sunt incubate 4-6
saptamani la 37C in atmosfera cu 5-10% CO2, Cre~terea 0 urmarim prin subcultivari
oarbe: bisaptamanal inundam, prin inclinarea flacoanelor, panta de agar, dupa care Ie
reincubam in pozitie verticala. Repicarile pentru identificare Ie facem din primocultura
aparuta pe panta de agar.

9.5.5. Hemoeultura in fungemii

Este de asemenea indicata folosirea flacoanelor cu mediu difazic in functie de


exigentele fungilor suspectati. lncubarea 0 facem 30 de zile la 30C cu subcultivari
oarbe pe panta de agar dupa 48 ore de la insamantare, apoi saptamanal.
Mai sensibila, pentru izolarea fungilor, este metoda hemoculturii cu liza-centrifugare
sau liza-filtrare (vezi maijos).

9.5.6. Hemoeultura in infeetiile sistemiee


eu mieobaeterii eonditionat patogene

Este solicitata mai ales la pacientii cu SIDA. Uzual folosim metoda lizei cu
centrifugare.

9.5.7. Hemoeulturi prin metoda lizei eu eentrifugare

Indicatii: In special pentru depistarea fungemiilor, mai ales cu fungi dimorfi, a


infectiilor cu micobacterii la pacientii cu SlDA.
Principiu: Sangele, prelevat in tuburi cu "liquoid", polietilenglicol ~i saponina,
este lizat, iar microorganismele sunt concentrate prin centrifugare.
Necesar: tuburi cu reactivi necesari - sunt livrate ~i comercial.
Procedura: Preleva 10 mL sange in tuburi pentru hemoliza. cat mai repede dupa
prelevare, centrifugheaza, insamanteaza sedimentul ~i incubeaza culturile in conditii
adecvate pentru microorganismele unnarite:
Pentru micobacterii insamanteaza tuburi cu mediul Lowenstein-Jensen. Incubeaza
culturile 3 luni la 37C cu urmarire saptamanala a cre~terii pe frotiuri colorate fluores-
cent cu auramina sau, uzual, Ziehl-Neelsen.

180
Pentru fungi insamanteaza cate 0 placa cu agar-sange ;;ocolat, agar tripticaza-
soia cu sange, agar Sabouraud $i agar infuzie cord-creier cu sange. Incubeaza primele
doua pUici 3 zile la 37C, apoi 18 zilela 30C, iar ultimele doua 4 saptamani la 30C Cll
examinare zilnica in prima saptamana, apoi bisaptamanal.
Rata contaminarilor accidentale in aceasta metoda laborioasa poate fi controlata
printr-o buna tehnica aseptica in incinta pentru siguranta microbiologica de c1asa II.

9.5.8. Hemoeultura prin metoda lizei eu filtrare

Sangele lizat, imediat dupa prelevare, este filtrat prin membrana de acetat de
nitroceluloza. In final membrana filtranta este spalata $i taiata in mai multe parti, care
sunt depuse, cu fata in sus, pe placi cu medii agarizate pentru incubare in variate conditii.
De;;i mai laborioasa $i cu riscuri de contaminare mai mari decat hemocultura prin liza-
centrifugare, metoda prin liza-filtrare are 0 serie de avantaje: cre$te rata izolarilor la
pacienti sub terapie antimicrobiana pentru ca, 0 data cu concentrarea microorganismelor,
elimina $i chimioterapicul din proM; cre~terea izolatelor sub forma de colonii.
10. EXAMENUL LICHIDULUI CEFALO-RAHIDIAN
iN DIAGNOSTICUL INFECTIILOR
, SISTEMULUI
NERVOSCENTRAL
(DUMITRU BUIUC)

10.1. 1NTRODUCERE 10.4.3. Citologia calitativa


10.2. CONSIDERA TII ANATOMOCLIN1CE $1 10.4.4. Bacterioscopia
ET10PATOGEN1CE 10.4.5. AUe metode rapide pentru depistarea
10.3. PRELEVAREA $1 TRANSPORTUL microorganismelor in lichidul cefalo-
PROBELOR rahidian
10.4. EXAMENUL PROBELOR 10.4.6. Cultivarea
10.4.1. Examenul macroscopic 10.4.7. Antibiograma
10.4.2. Citologia cantitativa 10.4.8. Comunicarea rezultatelor

10.1. INTRODUCERE

Examenullichidului cefalo-rahidian in infectiile sistemului nervos central este 0


urgenta din cel putin doua motive:
mortalitatea mare ~i sechelele grave care apar in lipsa tratamentului adecvat ~i
precoce;
terapia antimicrobiana indicata ~i posibila in cele mai multe dintre infeqiile
grave de la acest nivel.
Lichidul cefalo-rahidian (LCR) nonnal este un fluid steril, incolor ~i clar; contine
cel mult 3 celule nucleate/mm3 (de regula limfocite), 50-70 mg glucoza/dL, 15-40 mg
proteine/dL ~i 680-730 mg cloruri/dL. La bolnavii cu meningite, infectii ale ;;unturilor
pentru controlul hidrocefaliei, encefalite, poliomielite, put em unnari in LCR:
1) Microbul infectant (dupa caz, bacterie, fung, protozoar, virus).
2) Antigene ale microbului infectant.
3) Consecinte ale metabolismului microbian ~i metaboliti microbieni: hipoglico-
rahie, hiperlactacidorahie, aparitia alcoolului etilic, a acizilor gra~i volatili etc.
4) ModifiCari care reflecta inflamatia: pleiocitoza cu 0 anume fom1Ula leucocitara,
hiperproteinorahie.
5) Aparitia unor anticorpi.
6) Modificari care reflecta perturbiiri hidroelectrolitice in circulatia sistemica pe
fondul hiperproteinorahiei: hipoclorurorahia.

10.2. CONSIDERATII ANATOMO-CLINICE SI ETlO-PATOGENETlCE

Emisferele cerebrale, cerebelul, puntea ~ibulbul rahidian sunt cuprinse intr-o cutie
osoasa complet inextensibila din momentul inchiderii fontanelelor la sugar. Tot a~a,
maduva spinarii este inconjurata de canalul vertebral, iar riidacinile nervoase spinale
traverseaza gaurile intervertebrale, toate fonnatiuni osoase inextensibile.

182
Intregul sistem nervos central (SNC) este invelit de meninge, care are trei foite:
una externa fibroasa, dura mater, ~i doua interne, mai fragile, arahnoida ~i pia mater.
Arahnoida dubleaza dura mater, iar pia mater acopera intim to ate fonnatiunile anatomice
ale SNC. Intre arahnoida ~i pia mater este delimitat spatiul subarahnoidian, un sistem
areolar de lacune intercomunicante realizate prin trabecule conjunctive formate ca
expansiuni ale arahnoidei.
Lichidul cefalo-rahidian apare, in proportie de 60-70%, ca secretie a plexurilor
coroide din ventriculii cerebrali ~i,in proportie de 30-40%, prin difuzie libeza din tesutul
nervos. Fonnat in ventriculii cerebrali, LCR trece in spatiul subarahnoidian prin trei
foramene ale ventriculului IV. Resorbtia LCR prin vilii ~i granulatiile arahnoidiene este
in echilibru cu secretia.
Rolul fiziologic al LCR este de protectie biomecanicii (amortizare ~i mentinere a
formelor anatomice proprii SNC, tesut cu consistenta semifluida) ~i biodinamica
(eliminarea surplusului de lichid interstitial, mentinerea homeostaziei mediului in care
functioneaza neuronii). Barierele hel11atol11eningee~i hel11atoencefalidi reduc accesul
agentilor infectio~i, al metaboliti1or toxici, dar ~i al chimioterapicelor catre LCR ~itesutul
nervos.
Defecte congenitale, cicatrizarea unoI' leziuni inflamatorii ~.a. stranguleaza circulatia
dintre ventriculii cerebrali ~i spatiul subarahnoidian ~i detennina hidrocefalie, conditie
corectata chirurgical prin ~unturi care evita strictura.
Infectiile SNC pot evolua ca:
1) Meningite purulente cauzate cel mai frecvent de bacterii; ocazional de protozoare.
Afecteaza frecvent tesutul nervos subjacent ~i ventricuIii cerebrali.
2) Meningite cu lichid clar ~i evolutie acuta: sunt determinate mai frecvent de
virusuri (meningite aseptice), uneori de leptospire. Ocazional au variate alte cauze
(chimice, fizice, alergice, neoplazii, focare supurative parameningiale). Ccmd evolueaza
cronic, este posibila etiologia tuberculoasa, sifiIitica sau fungicii. Dificile probleme de
diagnostic pun meningitele bacteriene "decapitate", prin tratament antimicrobian
incomplet, care pot evolua cu lichid claro
3) Ence.falitele, inflamatii ale creierului, mai frecvent sunt virale, dar pot sa apara
~i prin mecanism infecto-alergic. Uzualli se asociaza ~i meningita.
4) Poliol11ielitele sunt inflamarii ale tesutului nervos, care evolueaza cu distrugerea
selectiva a neuronilor motori (spinali, bulbari etc.). Cel mai frecvent sunt virale.
5) Supurariile (abcese cerebrale, subdurale sau epidurale) au un tablou clinic com-
plex in care semnelor neurologice focale (cele mai frecvente) Ii se asociaza semne de
iritatie meningiala ~.a. De altfella ace~ti pacienti punctia pentru prelevarea LCR este
fonnal contraindicata din cauza hipertensiunii intracraniene. Cand se obtin totu~i probe,
profilul modificarilor citologice ~i biochimice din LCR este nespecific. Examenul mi-
crobiologic al puroiului din aceste abcese este prezentat in Cap. 11, iar examenul probelor
biopsice pentru diagnosticul infectiilor fungice intracerebrale se conduce dupa indicatiile
din Cap. 38.
Infectarea SNC se poate produce:
Hematogen, in cursul unor bacteriemii (mai ales cand se depa~esc 104 UFC/mL
sange) sau viremii cu variate porti de intrare. La randul rau, meningele infectat devine
focar bacteriemic.

183
Din nazofaringe prin tecile limfatice olfactive (meningococ, pneumococ,
Haemophilus injluenzae).
Prin contiguitate, din focare infectioase juxtameningiene (otomastoidita, sinuzite,
propagarea rino-cerebrala a infec!iilor cu zigomicete, Aspergillus spp.).
Din exterior (conduct auditiv extern, tegumente, nazofaringe) dupa fracturi
craniene (meningite traumatice cu cel mai variat spectru etiologic), punctii rahidiene san
interven!ii chirurgicale pe nevrax (meningite iatrogene, eventual cu tulpini bacteriene de
spital) ~i la pacien!i cu anomalii congenitale (meningocel ~.a.).
De aceea examenul microbiologic al sangelui ~ial prelevatelor de la variatele poni
de intrare ale infec!iei sunt examene complementare in diagnosticul etiologic al infectiilor
meningoencefalice.
Consecutiv coloniziirii cu bacterii din miocrobiota cutanatii, mai ales Staphy-
lococcus epidermidis, a ~unturilor pentru controlul hidrocefaliei.
Rar pe cale intraneural a (e.g., virusul rabic prin nervii senzitivi periferici,
ocazional virusul Herpes simplex prin radacinile nervului trigemen ori ale nervilor
sacra!i).
Bacteriile izolate din LCR, in ordinea frecven!ei, sunt prezentate in tabelul 10-1.

Tabellil 10-1

Meningite bacteriene ~i fungice. Ordinea descrescatoare aproximativa a etiologiilor apreciata


in funetie de eonditia pacientilor

A) Nou-naseut ~i sugarul piina la doua luni: Listeria


LeptmpiralIlonocytogenes
Pneumococi
Candida
Leptospira
Haemophilus
L. albican/!
Cryptococcus
Mycobacterium
Bacilul i1~fluenzae
monocytogenei)ne(~fonnans-l)
piocianie tip b
tuberculosis2)
Streptoeoei
Stafilocoei viridansS)
eoagulazo-negativiS)
Pneumoeoei
Enterobacteriaceae
Neisseria
C) Adult meningitidis

1) Rara dupa viirsta de 5 ani


21 Frecventa in cre~tere
3) La pacienti eu focare infectioase otice sau sinuzale
4) La pacienti imunodeprimati
5) Meningite iatrogene.

184
Meningitele fungice (ClyptococcuS neoformans, Candida albicans) sunt rare ~i
apar la gazda imunocompromisa.
Meningitele bacteriene ~ifungice tratate antimicrobian precoce ~icorect se vindeca.
Dau 0 mortalitate mare dad nu sunt tratate ~i lasa sechele grave daca tratamentul este
tardiv sau incorect.
Meningitele virale sunt relativ frecvente. De~i cele mai multe nu beneficiaza inca
de tratament antiviral, in majoritatea lor evolueaza benign.
Grave, frecvent letale, sunt meningitele amibiene determinate de Naegleriafol,vleri
sau Acantamoeba-Hartmanella. Acestea sunt organisme tennofile, care habiteaza bazinele
de apa contaminate fecal. Boala afecteaza copii ~i tineri dupa imbaierea estivala in
asemenea ape. Forma infectanta sunt trofozoitii, care patrund activ spre meninge prin
tecile limfatice ale nervilor olfactivi.
Meningitele aseptice sunt mai frecvente la copii ~i determinate in cca 70% din
cazuri de enteroviruuri (Coxsackie A7, A9, B2-B5, Echo serovarurile 4,6,9, 11,16,30;
rar poliovirus sau enterovirus 71) ca izbucniri epidemice estivo-autumnale. Imbolnavirile
in sezonul de iama ~iprimavara sunt determinate mai frecvent de virusul urlian, rujeolic,
varicela-zoster. Rar sunt cauzate de virusul gripal, paramixovirusuri, adenovirusuri,
citomegalovirus.
Meningoencefalita herpetica apare ocazional ca infectie a adultului sau nou-
nascutilor. Virusul choriomeningitei limfocitare infecteaza sporadic adultii dupa contact
cu colonii de ~oareci. In Romania meningoencefalitele arbovirale sunt rare.

10.3. PRELEVAREA SI TRANSPORTUL PROBELOR

Prelevarea probelor de LCR este de competenta exclusiva a speciali~tilor


infectioni~ti, neurologi sau neurochirurgi, care au apreciat indicatia ~i oportunitatea
punctiei. Se face prin rahicenteza, uzual lombara, sau punctie ventriculara in conditii
strict aseptice pentru a asigura:
protectia pacientului contra infectiei iatrogene;
securitatea microbiologica a probei fata de contaminarea cu bacterii din microbiota
cutanata.
Cantitatea de 5-10 mL LCR satisface necesitatile pentru examenele citologice,
biochimice ~i microbiologice. Fragmentarea probei, inca de la prelevare, in doua tuburi
de cetrifuga minimizeaza riscul contaminarii pe parcursul prelucrarilor necesare diferitelor
examene. Utilizeaza tuburi conice cu capac in~urubat, sigur sterile ~i tara bacterii l110arte
de la utilizari anterioare. Transporta proba, imediat ~i tara refrigerare, la laborator.
Temporizarea examinarii distruge celulele ~i,asociata refrigerarii, omoara meningococii.
Cel mai puternic influentate de intervalul prelevare-examinare sunt leucocitele
polimorfonuc1eare: in interval de 1-2 ore dupa prelevare numarullor scade cu 50 12%
~i respectiv 68 10% din valorile initiale. Numarul limfocitelor ~i macrofagelor este
nesemnificativ alterat in interval de 3 ore dupa recoltare.

185
10.4. EXAMINAREA PROBELOR DE LCR

Cand cantitatea probei de LCR primita in laborator apare insuficienta, prioritatea


investigatiilor trebuie stabilita de comun acord cu medicu1 care a solicitat examinarea.

1004.1. Examenul macroscopic

Observa: transparenta, culoarea, fluiditatea.


Transparen{a. Examineaza proba, comparativ cu apa de robinet, in tuburi identice
aplicate, sub buna Huminare, pe un text tiparit cu litere negre. Um1are~te claritatea
literelor observate prin cele dO\la tuburi.
Probele cu pana 1a 100-150 celule/mm3 raman transparente, ca apa de robinet. 0
u~oara opalescenta poate fi sesizata dnd proba contine cca 200 polimorfonucleare sau
400 limfocite ori 700-800 hematii/mm3 Aspectul tulbure semnifica 0 pleiocitoza de
ordinul a 103/mm3, iar cel purulenta de ordinul a 104/mm3
Culoarea. 0 apreciem in acelea~i conditii de iluminare, dar pe un fond alb. Lichidul
cefalo-rahidian nonnal este incolor. Proba obtinuta poate sa apara:
Ro~u opalescenta in hemoragii meningiene prin boala de fond sau prin incident
de punctie (hemoragie iatrogena). Meningitele cu LCR hemoragic sunt rare: meningo-
encefalita carbunoasa ~i, ocazional, meningita leptospirotica. Originea sangerarii este
stabilita pril1 proba celor 3 tuburi. Daca la prelevare se observa scurgere de lichid san-
guinolent, proba trebuie prelevata in 3 tuburi succesive. Clarificarea LCR in tubul 2 sau
3 indica natura iatrogena a hemoragiei.
Ro~u transparent, aspect "lacat", in hemoragii meningiene mai vechi.
Xantocrom (cu diferite nuante de galben) datorita methemoglobinei sau bilirubinei.
Pentru acuratetea examinarii, este indicata repetarea citirii ~i dupa centrifugarea
probei cu aprecierea cu10rii supernatantului ~i sedimentului (e. g., supernatant incolor cu
mic buton ro~u de hematii).
Fluiditatea. Lichidul cefalo-rahidian nonna1 ~i in majoritatea meningitelor este
fluid ca apa. Probele purulente sunt vascoase. Unele pot coagula sau prezinta numai val
de fibrina. Valul fibrinos apare, dupa intervale variabile, in apropierea peretilor eprubetei
~i prin retractare poate lua fonna unei pall1ii cu circumferinta spre suprafata probei. Intr-o
proM cu lichid clar are predictie pozitiva de cca 0,9 pentru meningita tuberculoasa. Rar
apare in meningite neoplazice sau virale. Este indicat ca, inainte de centrifugare, valul sa
fie prelevat cu ansa ~i etalat cu grija pe 0 lama de microscop pentru baciloscopie.

10.4.2. Examenul citologic cantitativ

Citologia cantitativa este esentiala pentru probele de LCR clare, opalescente, sau
tulburi. Se poate renunta la ea in cazul probelor purulente.
Agita bine proba dintr-ul1 tub pentm omogenizare. Preleva aseptic cu pipeta Pas-
teur 0 cantitate mica de lichid, suficienta pentru a umple camera de numarat Fuchs-
Rosenthal (fig. 10-1).

186
Lamela

Numaratoarea: 7celule

Fig. 10-1. Numararea celulelor din LCR in camera Fuchs-Rosenthal.

Sus stanga - umplerea camerei cu proba de LCR. Umeze~te u~or profilele laterale ale lamei
pentru a asigura aderenta lamelei. Lamela a aderat perfect daca la acest nivel observi inelele de
difraerie Newton.
Dreapta - reteaua de numarat are 16 mm\ ceea ce la adfmcimea de 0,2 mm a profilului central al
lamei da volul11ul de 3,2 111m3al camerei (practic 3 mm3). Examineaza cu obiectiv 20X ~j ocular
5X. Daca pe un patrat mare sunt cca 50 celule repartizate unifonn, numara celulele de pe cele 4
patrate mari ale diagonalei: numarul celulelor/mm3 va rezulta din sum a celulelor de pe cele 4
patrate mari inmu1tita cu 4 ~i impartiti'i la 3. Daca densitatea celulelor este mai mica, 1a
numaratoarea pe toate cele 16 patrate mari ale camerei ~i imparte suma la 3 pentru a at1a numarul
celulelor/mm3
Stangajos: detaliul unui patrat mic. Numara, pe rand, celulele de pe latura stfmga, latura superioara,
apoi restul supraferei. in zona laturilor numara numai cclulele care intra cu mai mult de j umatatc
in aria patratului.

Numarulleucocitelor In LCR cre$te variabil In functie de natura $i stadiul evolutiv


al meningitei: - 104 celule nucleate/mm3 In rneningitele acute bacteriene, 50-1 OOO/mm'
In meningitele virale, 50-500/mrn3 In meningita tuberculoasa. In meningite acute
bacteriene la debut sau In cele "decapitate" prin terapie antimicrobiana oarba, nurnarul
celulelor din LCR poate fi redus. In probele cu val sau cheag fibrinos nurnarul celulelor
trebuie considerat minimal din cauza absorbtiei celulelor pe cheagul de fibrina.
Prezenta sangelui In proha, ca unnare a traurnatismului punctional, falsifica nurnarul
preexistent de leucocite $i proteinorahia. Eroarea poate fi semnificativa la diferen!ierea
meningitelor cu lichid clar de absenta reactiei inflarnatorii.
Corecria pentru leucocite. La pacientii cu leucograma nonnala scade din numarul
de leucocite/mm3 LCR cate unleucoeit pentru fieeare 1000 hematiiimm3 LCR. La pacien!ii
eu anemie sau leucoeitoza utilizeaza formula dedusa prin regula de 3 simpla:
Llmm3 sange x H/mm3 LCR
Llmm3 LCR = ----------
H/mm3 sange
unde L = leueoeite $i H = hematii.
187
--~~--~-~~-~ =c

10.4.3. Citologia calitativa

Centrifugheaza tubul destinat examenului citologic 15 minute la 1 500 xg. Reexa-


mineaza macroscopic supematantul ~i sedimentul. Decanteaza supematantul cu 0 pipeta
Pasteur prevazuta cu propipeta ~i utilizeaza-l pentru examenele biochimice. Efectueaza
din sediment un preparat umed intre lama ~i lamela ~i frotiuri colorate cu albastru de
metilen sau, preferabil, Giemsa.
Din probele purulente frotiul este indicat a fi facut direct, fara centrifugare.
Numara diferentiat polimorfonuclearele neutrofile, limfocitele ~i macrofagele
pentru a stabili fonnula procentuaHi a reactiei inflamatorii.
Circumstante1e clinico-epidemiologice, aspectul macroscopic, profilul citologic ~i
biochimic al LCR (tabelul 10-2) orienteaza diagnosticul etiologic ~i investigatii1e
ulterioare (tabelull0-3).

10.4.4. Bacterioscopia

Bacterioscopia este cea mai accesibila metoda rapida pentru diagnosticul etio-
logic almeningitelor.
De~i prezenta leucocitelor favorizeaza sedimentarea bacteriilor, multe bacterii nu
sedimenteaza in intervalul de timp ~i acceleratia indicate pentru examenul citologic. De
aceea, probele, in care reactia inflamatorie cu polimorfonucleare este minima, trebuie
concentrate prin centrifugare 10 minute la 10 000 xg sau cel putin 30 minute la 1 500 xg.
In meningitele acute bacteriile realizeaza in LCR celmai frecvent concentratii mai
mari de 105 UFC/ml, situatie in care centrifugarea unei probe pfma la 2 mL da rezultate
satisfacatoare. In meningitele cronice cu bacili acido-rezistenti sau in cele fungice
sensibilitatea depistarii cre~te cu volumul de LCR supus centrifugarii ~i prin examinare
de probe repetate.
Efectueaza frotiurile numai pe lame noi pentru a avea siguranta ca nu au bacterii
restante de la examinari anterioare.
Din probe Ie purulente, pentru un reZUltat mai rapid, putem efectua un frotiu ~i
inainte de centrifugare.
Coloralia Gram. Examinarea atenta, timp de cca 10 minute, cu marire de 1000 X
depisteaza bacteriile din LCR cu sensibilitate variabiala ~i specificitate satisfacatoare.
Recolorarea prelungita la 2 minute cu fucsina favorizeaza depistarea unoI' bacterii ca
HaenlOphilus influenzae ~i Fusobacterium spp., care fixeaza slab contracolorantul, mai
ales safranina.
Bacterioscopia pe frotiuri colorate cu albastru de metilen este frecvent mai
sensibila dedit cea pe frotiuri colorate Gram.
Coloratiile pentru bacili acido-rezistenti. Sensibilitatea depistarii bacililor acido-
rezistenti cre~te pe frotiuri efectuate in straturi suprapuse. Depune cu pipeta Pasteur 0
piciitura din sedimentul probei de LCR tara etalare. Usuca lama ~idepune 0 noua picatura
in acela~i loc. Repeta operatia de 3--4 ori. Frotiul trebuie scrutat cu atentie cca. 15 minute.
Daca laboratorul dispune de microscop pentru fluorescenta, este indicata examinarea
frotiurilor colorate cu auramina sau auramin-rodamina. Sensibilitatea depistarii bacililor
acido-rezistenti variaza in limite foarte largi, specificitatea este insa buna.

188
TabelullO-2

Profilul citologic ~i biochimic al LCR in meningite (adaptat dupa MARTON ~i GEAN, 1986)
- -
PrezentTuberculoasa
<Mononucleare
PMN
?Nonnala
Crescute
Variabil
Crescute:
Foartc
Scazutii
0,76-0,85
0,77-0,81
20-40
0,85
U~or
>35
40-300
-100
65-70
15-100
20-40
(initial
100-200
Leptospirotica
25-100 tinere
Monunucleare
Insuficienta
1000-2000
500
5-1000
Foarte
Crescut: ?Foarte
0.96
lnsuficienta
100-500
Normala
Scazuta
Virala
Amibiana
mg/dL
mg/dL crescute:
mica
Foartc
Mica
PMult
Mica
Crescut:
0,96
1,0Fungica
0,58
crescute:
mg/dL
mg/dL3
mg/dL
segmentate
PMN)
Sute-miil)
mg/dL
Foarte - ?35Normal:
MN crescute:
mica
scazuta mg/dL Mononucleare Tipul de meningita
20-40
:<:;
mg/dL
Bacteriana

I) Uneori < 100, aheori > 60 000; la nou-nascut ~i sugar D.W. Teele (citat de GRENIER ~i MARCHAND, 1983) accepta diagnosticul de meningita
bacteriana acuta (chiar cu cultura stcrila) daca sunt prezente pestc 8 leucocite sau peste I PMN/mm3 LCR.
2) Raportul glicorahie/glicemie < 0,31 are sensibilitate ameliorata pana la 0,70 In meningitele bacteriene acute ~i evita rezultate fals negative la
pacienti cu diabet zaharat (POWERS, 1981).
3) Poate fi redusa la cca [;.\din pacienlii infectati cu virus herpes simplex sau urlian.
In caz de proba hemoragicii se impune corec(ia proteinorahiei: penlru fiecare 100 hemalii/ll1m3 LCR se scad 0,1 mg proteine/dL LCR
41

(FISHMAN, 1987).
\000
>-'
\0 TabelullO-3
o
E~alonarea investigatiilor in mierobiologia elinica in raport eu impactul asupra deciziei eHnice
nou- gram-negativi
(la Test
LA A-Sab
Limulus
Accesorii
Sellsibilitate:
ClE, CoA,___
Microscopic:
Microscopie
Microscopie:
CryptocoCCU,I'
pentru
Cocultivare
Microscopic
Agar
Page ~LA, pecu_______
I)pc:O:\,O
antigen
1,5%
Obligatorii
infrotiu
coloratic
agarfond
contrast colorat
_.negru
.transparent
solutie
Medii de
Examene
eu(tu~E. rapide
. __pentru
___ncgativa
dcsalina
faza
izolare2l
p.
AS, McC, BTS,
LJMediul Korthof AS, BTSde S.(McC),
AS.strie
AS+ (ASC), BTS
BTS,
aureus BTS,
AS
RFC+ pcntru
strie deanticorpi
Specificitate:
Sensibilitate: S.aureus
S. aureusanti-Coccidioides
0,1-0,9
1,0
<1,0
va

I) CIE = eontraimunoelcctroforcza; CoA = eoaglutinare eu S. aureus; LA = latcxaglutinare, RFC = reaqic dc fixarc a cOll1plcmcntului,
2) 0 = ll1edill utilizat hleultativ. AS = agar-sallgc. ASC = agar siinge ~oeolat. McC = agar Mac Conkey, BTS = bulion tioglicolat eu 10% sange de
lepllrc.
Depistarea ~i identificarea microscopidi a altor agenti infectio~i in LCR. Uzual
este preparatul umed intre lama ~i lamela.
Cryptococcus neoformans. Este indicat preparatul colorat negativ cu tu~ de India
sau suspensie 2,5% nigrozina in glicerol 50%. UTInare~te levurile rotunde sau ovale,
inmugurite ~iinconjurate cu un halou mare incolor, capsula. Nu toate tulpinile au capsula
evidenta. Sensibilitatea metodei este de numai 0,5, modesta fata de depistarea antigenica.
Examenul sedimentului din probe repetate cre~te sensibilitatea depistarii. Erori posibile:
confundarea hematiilor, leucocitelor, a particulelor de amidon cu levuri incapsulate.
Leptospire. Examineaza preparatul umed la microscopul cu fond negru ~i
um1are~te prezenta leptospirelor cu morfologia ~imi~earile lor earacteristice. In LCR, ca
~i in sange, leptospirele pot fi depistate in prima saptiimana de boala. In probele
hemoragice, expansiuni fibril are ale hematiilor ~iplachetelor pot fi confundate cu lepto-
spire. In asemenea situatii lasa proba la temperatura camerei pentru sedimentarea spontana
a hematiilor ~i examineaza supematantul.
Amibe. La primirea probei de LCR in laborator, agita u~or tubul pentru a desprinde
trofozoitii de pe stiela. Centrifugheaza imediat proba 5-8 minute la cca 200 xg. Folosind 0
pipeta gradata cu propipeta, decanteaza supematantullasand restant maximum 0,5 mL.
Retine supematantul decantat intr-un tub steril la 4C pentru alte examinari necesare.
Resuspensioneaza sedimentul in supematantul restant.
Depune 0 pici'itura din sedimentul resuspensionat pe 0 lama de mieroscop, acopera
cu 0 lamela nr. 1 ~i examineaza cu obiectivul 1OX ~i 40X ~i lumina diafragmata
corespunzator. De preferat este examinarea la microseop cu platina incalzita la 35-37
~i cu iluminare in contrast de faza.
Pastreaza restul sedimentului pentru cultivare (vezi mai jos).
Naegleriafowleri apare ca trofozoiti ~i chi~ti. Trofozoitiii au un stadiu amibian ~i
unul biflagelar. FOTInaamibiana este alunl;?itaca un limax, are cca 10/35 f.1m~i mi~cari
vii prin pseudopode boante, hemisferice. In stadiul biflagelar organismul este sensibil
mai mic, pirifoTIn. Chi~tii, mai freevent sferici, au diametrul de 7-15 f.1m~i un perete
gros cu mai multi pori plini cu material mucoid.
Acanthamoeba are trofozoiti de 15-45 f.1mdiametru, cu pseudopade subtiri, acumi-
nate (acanthopade). Chi~tii sferici, de 10-25 /lm diametru, au perete dublu, gros:
endochistul rotund, poligonal sau stelat ~i exochistul valurit, zbarcit.
Ambele organisme au nueleul unic, cu un nucleol mare.
Amibele pot fi uTInarite ~i pe preparate fixate ~i colorate. Lasa pici-itura de sedi-
ment pe lama de microscop timp de 5-10 minute, in camera umeda, pentru a permite
amibelor sa adere la stiela. Coloreaza tricrom sau cu sulfat feriamoniacal-hematoxilina
(vezi Cap. 42).
D([eren{ierea dintre amibe fji macro[age. La examenul cu obiectivul mic al
preparatelor umede amibele pot fi confundate cu macrofagele. La marire mai puternica,
mobilitatea este cea care Ie diferentiaza. Dqi cu mi~cari lenqe, Naegleria este evident
mai mobila decat macrofagele. Acanthopodele faciliteaza difrentierea macrofagelor de
Acanthamoeba.
Pe preparatele bine colorate, nueleul rotund cu nueleol unic, mare ~i central, al
acestor amibe se diferentiaza net de nueleul neregulat cu mai multi nucleoli al
macrofagelor. Eritrocite fagocitate se observa intracitoplasmic la Naegleria, dar lipsesc
la Acanthamoeba.

191
La putinii pacienti cu abcese cerebrale amibiene, Entamoeba histolytica se
diferentiaza u~or de Naegleria prin mi~carile mai vii, pseudopode digitifom1e, iar pe
preparatele colorate nucleul apare cu un nueleol mic central sau excentric.

10.4.5. Alte metode rapide pentru depistarea microorganismelor in LCR

Performantele microscopiei ca metoda rapida pentru diagnosticul etiologic al


meningitelor pot fi ameliorate prin metode mai sensibile, imunologice sau non-
imunologice. Trusele cu reactivi comercializati in prezent pem1it utilizarea contraimuno-
electroforezei, a latexaglutinarii ~icoaglutinarii pentru depistarea antigenica ~i a testului
Limulus pentru depistarea endotoxinei. Cele mai indicate sunt latexaglutinarea ~i testul
Limulus (tabelul 10-4).
rabe/u/10-4

Sensibilitatea ~i specificitatea, in raport ell eultura, a eelor mai utile metode alternative pentru
depistarea rapidli a microorganismelor in LCR (dupa AUWERA, 1987)

0.99
0.94
0,99
Testul/Microorganismul Specificitate
LOOLOO Sensibilitate
0,87
0,60
0,96
0,64
0,90
::;0,71
1,00
H. Endotoxina
injlllenzae
N. meningitidis tip b
N. meningitidis

Latexaglutinarea. Detecteaza in interval de 2-10 minute anti gene bacteriene sau


fungice in cantitati de ordinulng/ml. Testul trebuie insotit de l11artoripentlll specificitatea
aglutinarii. Prezenta factorului reumatoid in LCR poate da reactii fals pozitive. De aceea
testam probele pozitive in latexaglutinare ~i pentru prezenta factorului reumatoid, fie
efectuam reactia pe probe tratate cu ditiothreitol ori incalzite 10 minute in baie de apa la
fierbere.
Testul Limulus unnare~te gelificarea prin endotoxina a lizatului amibocitelor de
Limulus polyphemus. Sensibilitatea testului variaza intre ng ~i )..1g/ml.La 1 mL reactiv
adauga 0,1 mL din proba de LCR, incubeaza la 37C ~i unniire~te tubul din 30 in 30 de
minute pentru aparitia gelificarii (++++) sau a unei turbiditati (+).
Contraimunoelectroforeza este celmai putin sensibil dintre testele imunologice:
detecteaza antigenul numai in cantitati de ordinul )..1g/mL.Poate da rezultate fals nega-
tive in infectiile cu serovarurile VII ~i XIV de pneumococ, al carol' polizaharid capsular
migreaza catre anod numai dupa tratarea cu acid fenilboronic (ANHALT ~icolab., 1975).
Serul anti-Neisseria meningitidis grup B reactioneaza incruci~at cu antigenul Kl al E.
coli. De aceea rezultatele contraimunoelectroforezei trebuie interpretate prudent pentru
a orienta corect terapia antimicrobiana.

192
10.4.6. CuHivarea

In functie de suspiciunea care decurge din cireumstantele clinico-epidemiologice


~i examenele preliminare, insamanteaza cate 0 picatura din sedimentul probei de LCR,
utilizat ~i pentru bacterioscopie, pe mediile indicate in tabelul 10-3.
Cultivarea bacteriilor. Etaleaza picatura pe un cadran al placii ~i cu ansa sterila
continua epuizarea, ill striuri, pe celelalte trei cadrane. Insamantarea pHicii cu agar-sange
~i strie de S. aureus sau agar-sange ~ocolat nu este necesara cand microscopia directa a
depistat bacterii gram-pozitive.
Dacii nu lucrezi cu medii de cultura conditionate in boxa cu aer laminar, este precaut
sa insamantezi per placa 1-2 piciituri din sedimentul probei tara etalare. Eviti astfel
eventuale rezultate fals pozitive prin etalarea cu ansa a unei microcolonii de contaminare
a placii.
lncubeaza la 37C, in atmosfera cu 5% COo, mediile insamantate. Lasa capacul
tubului cu bulion tioglicolat pe jumiitate in~urubat pentru a permite schimbul de gaze.
Umlare~te zilnic aparitia culturii: timp de 3 zile pe placi ~i 5 zile in tubul cu bulion
tioglicolat.
Cultivarea micobacteriilor. Insamanteaza doua pante cu mediul Lowenstein-Jensen.
Incubeaza tuburile la 37C in pozitie inclinata, pentru absorbtia inoculului, in primele
24 ore, apoi in pozitie verticala. Dupa 14 zile de incubare, UD11are~tesaptamanal, pan a la
8 saptamani, aparitia culturii, intai cu lupa apoi cu ochiulliber.
Cultivarea leptospirelor. Ineubeaza tubul cu mediul Korthof insaman!at timp de
30 zile la 37C ~i urmare~te, prin microscopie pe fond negru, la fiecare 5 zile, aparitia
culturii.
Cultivareafungilor. Insamanteaza doua pante cu agar Sabouraud. Incubeaza tubmile
la 25-30C, in pozitie inclinata in primele 24 de ore, pentru absorbtia inoculului, apoi in
pozitie verticala. Urmare~te aparitia culturii zilnic, in prima saptamana, apoi bisaptamanal
pana la 4 saptamani. Sensibilitatea izolarii fungilor din LCR variaza intre 0,68 $i 1,0;
cre$te eu numarul probelor examinate.
Cocultivarea al71ibelor.Folose~te placi cu gel transparent de agar 1-1,5% preparat,
tara substrat nutritiv, in solutie salina Page pentru amibe (vezi Cap. 40). Depune eu
pipeta Pasteur 2-3 picaturi din sedimentul probei de LCR in centrul fiecareia din doua
plaei preinsamantate dens cu eultura de Escherichia coli. Incubeaza 0 placa la 37C $i
una la temperatura camerei.
Observa zilnic, timp de 7 zile, placile la mieroseop cu obiectivul lOX. Amibele
apar ca mici pete mai refringente care, uD11ariteatent, sunt mobile. Marcheaza aria in
care ai observat amibe $i decupeaza in ea un mic bloc de agar. Transfera bloeul decupat,
cu fata in jos, pe alta placa cu agar transparent preinsamantat cu E. coli. Incubeaza $i
observa aparitia amibelor. Repicarea confirma izolarea amibei ~i permite intretinerea
culturii. Dupa 2-3 zile de incubare apar primii chi$ti.
ldentificii izolatele conform indicatiilor din Capitolele 28-38.
Pentru diagnosticul etiologic al meningitelor ~imeningoencefalitelor virale, in rapOli
cu conjunctura clinico-epidemiologicii, mai prelevam pentru examinare, in afara de LCR
~i,alte probe conform indicatiilor tabelului 8-2. Sensibilitatea globala a izolarii virusurilor
din LCR este de numai 0,41. Doar sensibilitatea izolarii enterovirusurilor este apreciabil
mai mare: 0,72.

193
10A.7. Antibiograma

Daca microscopia directa atesta prezenta unei densitati bacteriene suficienHi in


proba de LCR (zeci de bacterii in medie/dimp microscopic examinat cu marire de
1 OOOX);se poate tenta antibiograma pe cultura primarii ale carei rezultate urmeaza a fi
confirmate prin antibiograma pe subcultura standardizata (vezi Cap. 23). Testarea
cantitativa este de preferat celei difuzimetrice.
Avand in vedere importanta antibioticelor l3-lactamice in terapia meningitelor
bacteriene acute, testeaza izolatele din primocultura pentru producerea de l3-lactamaza
(vezi Cap. 23).

lOA.8. Comunicarea rezultatelor

Din cauza urgentei, tratamentul antimicrobian al meningitelor este initiat pe baza


rationamentului clinico-epidemiologic. Comunicarea etapizata a rezultatelor po ate
(re)orienta mai tintit acest tratament. De aceea, odata obtinute ~iverificate de supervizor
sau ~eful laboratorului, rezultatele microscopiei, examenului biochimic, categoria
microscopica a izolatelor ~i testul pentru l3-lactamaza pot fi comunicate telefonic imediat,
unnand a fi completat buletinul de analiza al etapei.
11. EXAMENUL MICROBIOLOGIC AL PUROIULUI
(DUMITRU BUIUC)

11.1. INTRODUCERE 11.4.1. Examenul macroscopic


11.2. CONSIDERA TII CUNICE $1 11.4.2. Microscopia
ETIOPATOGENICE Pregiitirea probelor
11.2.1. Supuratii cutanate Examenul preparatului umcd
11.2.2. Infectii ale arsurilor, pli'igilor ~i ulce- Examenul fi'otiului colorat
ratiilor cutanate cronice Gram
11.2.3. Supuratii ganglionare, ale seroaselor ~i ExamenuJ frotiuriJor colorate pentru bac-
parenchimelor terii acidorezistente
11.2.4. Supuratii osteoarticulare 11.4.2. Cultivarea ~i izolarea In cultura pura
11.2.5. Micetoame
Izolarea cantitativa din plagi ~i arsuri
11.3. PRELEVAREA $1 TRANSPORTUL
Probe biopsice
PROBELOR DE PUROI
Prelevatul pe tampon
11.3.1. Precizari de ordin general
IzoJari calitative din puroi'~i probe biopsice
11.3.2. Prelevi'iri din arsuri, plagi ~iulcere cuta-
nate infectate Bacterii aerobe ~j facultativ anaerobe
Bacterii anaerobe
Arsuri ~i plagi
Brucele
Plagi mu~cate
Ulcere-cutanate cronice Actinomicete
11.3.3. Prelevari din colectii purulente Bacilii acido-rezistenli
11.3.4. Prelevi'iri din fistule Fungii
11.4. EXAMENUL DE LABORATOR AL Situalia leziunilor granulomatose
PUROlULUI Antibiograma

11.1.INTRODUCERE

Numerose infectii detennina distrugerea purulenta a unui !esut. Numim supurarie


fom1area sau scurgerea de puroi. Puroiul este un exsudat fibrinos, uneori sanguinolent,
care contine leucocite (predominant polimorfonucleare neutrofile, in inflama!iile acute,
sau mononucleare, in inflama!iile cronice specifice), resturi celulare ~i microorganis-
mule ele) detem1inant( e). Supura!iile pot afecta orice tesut ~i organ cu acumulare de puroi
in interstitiile cutanate (pustule, furuncule, hidrosadenita, abcese, gome), in tesuturile
musculo-scheletale (abcese, flegmoane, osteomielita etc.), in ganglionii lil11fatici, in
viscere (abcese), in cavitati prefonnate (sinusuri paranazale, urechea medie, seroasc:
meninge, pleura, pericard, peritoneu, sinoviale1e articulare), pe suprafere tisulare denudate
(plagi, arsuri). Colectiile purulente se pot deschide spontan prin una sau mai multe fistule.
Varietatea situsurilor anatol11ice afectate ~i a l11ecanismelor protogenetice implica
~i 0 mare varietate de agenti etiologici: mai frecvent bacterii ~ifungi, ocazional protozoare.
Erori de prele.var~~iexaJ1}inare a probelor l11aidue inca la rezultate de genu puroi I
"steril". Tratqmenhtl chirurgical ~-CterapiaantimicrobiaI1-a-de prima intentie, bazat3 pe
ralIonan1entul clinico-epidel11iologic, atenueaza asel11enea erori. Consecinte grave au
insa ra!ional11ente circulare de tipul: supurarii cutanate sau limfocutanate determina mai
frecvent stafilococii, deci ~i aceasta supuratie cutanata este stafilococia. Uneori :;;i

195
laboratorulintare$te eroarea pe baza unui argument inconsistent: izolarea catorva co]onii
de stafilococi din puroiul unei fistule tara ca microscopia directa sa confimle prezenta
lor intre celulele inflamatorii. In repetate randuri am semnalat etichetari eronate de
stafilococie pentru variate micoze cu manifestari cutanate sau limfocutanate.

11.2. CONSIDERA TII CLINICE SI ETIO-PATOGENETICE

11.2.1. Supuratii cutanate

Impetigo stafilococic, streptococic sau, uzual, mixt este tot mai frecvent intftlnit,
mai ales la copii, ca 0 boala a mizeriei.
Frecvente sunt infectii]e unitatilor pilo-sebacee (furuncule, carbuncu]e, hidro-
sadenite) cauzate de Staphylococcus aureus.
Manifestari supurative cutanate pot fi cauzate $i de variati fungi dupa diseminari
hematogene (Histoplas17la capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis)
sau unnare a unor intepaturi cauzate de spini ori a$chii de lemn (Sporothrh schenckii.
Cladosporiwn spp. $.a).

11.2.2. Infectii ale arsurilor, pHigilor ~i ulcerelor cutanate cronice

Tesutul denudat de inveli$ul cutanat este contaminat cu bacterii din microbiota


tegumentului $i microorganisme vehiculate princorpi straini.
Contaminarea cu microorganisme gram-pozitive ale epidennei duce la 0 colonizare
Iimitata de factorii antimicrobieni ai gazdei $i chiar stimulanta pentru procesul de granulare
ca prima etapa a vindecarii.
Traumatismele, arsurile, escare]e $iulcerele trofice sporesc receptivitatea tesuturilor
la infectie prin sumarea a cel putin patru factori:
Perturbarea irigarii sanguine, care impiedica aportul de factori antimicrobieni $i
scade vitalitatea tesutului:
Prezenta tesutului necrotic $i a hematomului din spatiul dezorganizat anatomic,
excelente medii de cultura pentru microorganisme.
.. Corpii straini, care deprima semnificativ fagocitoza $i contamineaza plaga cu
mlcroorgamsme exogene.
S. D. ELEK (citat de EDBERG, 1981) a detemlinat, ]a voluntari, pustule numai
dupa injectare intradermica a 7,5.106 UFC de Staplz)'locoCCliSaureus/O,I mL, iar D. S.
LINDSEY $i colab. (citati de EDBERG, 1981) au stabilit ca doza minima care determina
gangrena gazoasa la capre este de 106 clostridii injectate intramuscular in vo]um de I mL.
Nivelul cantitativ critic a] bacteriilor care inclina balanta de la favOlizarea granularii
la infectie este probabillegat de acumularea in tesutul denudat a agresinelor $i invazinelor
bacteriene. Aceasta ar explica de ce Streptococcus pyogenes, care are capacitati invazive.
fibrinolitice $i leucotoxice mai active decat bacteriile conditionat patogene, initiaza invazia
tisulara pomind de la doze semnificativ mai reduse.
La nivelul oricarui tesut denudat consideram doua zone distincte: (1) Spatiul mort
(tesut necrotic, hematom, exsudat stagnant) contaminat cu variate microorganisme. care

196
se imnultesc independent la acest nivel. (2) Tabeluill-I
Tesutul viabil subjacent de la care pome~te Bacterii izolate in cultura pura ~i cantitati > 10'
procesul de cicatrizare ~icare raspunde prin UFC/g de tesut biopsic din plagi traumatice
inflamatie la contaminarea, colonizarea sau
6I
% din totalul
4032:178
12
16
invazia microbiana. Aceasta
Escherichia
Klebsiela- coli diferentiere izolatelor
Specia
Proteus spp.El1rerobacter
Bacteroides
Staphylococcus
Providel1cia
Streptococi
Pseudomol1as spp.
CorYl1ebacterium
spp.
f3 epidermidis
spp.
- hemolirici
aerugil10sa
Staphylococcus aurells
are consecinte in patogenia infectiei supra-
fetelor denudate, in practica chirurgicala ~i
a investigatiei microbiologice.
Dintre contaminantii plagii, pro-
gresiv, se selecteaza tulpina cu cel mai mare
potential patogen (tabelul 11-1) sau aso-
ciatii bacteriene sinergice (ca Escherichia
coli - Bacteroides fragilis ~.a.), care inva-
deaza tesuturile. Astfel flora gram-pozitiva
de contaminare initiala este in scurt timp
dominata ~i inlocuita de S. aureus sau de bacili gram-negativi. Invazia microbiana a
tesutului viabi1 subjacent plagii se face, pomind de la spatiul mort, in lungul septurilor
fibroase ~i prin 1imfaticele adiacente nervilor ~i vaselor sanguine. Proliferarea
perivasculara a microorganismului invadant detem1ina leziuni caracteristice de vasculita
~ichiar invazia vaselor mici. Vasele mari sunt protejate de invazia intraluminala cu bacterii
prin bariera formata de tesutul elastic ~imembranele bazale. Acestor leziuni de vasculita
Ii se asociaza tromboze septice responsabile de: hemoragii interstitiale, necroza in
teritoriul tisu1ar irigat de vasele trombozate, diseminarea sanguina a infectiei. Daca
acumnularea unei bacterii in concentratii peste 105 UFC/g de tesut semnifidi infeqia,
depa~irea cu numai 2 loglo a acestui prag se insote~te cu diseminare septicemica.
Eradicarea microorganismelor din spatiul mort creat de traumatism este practic
imposibila rura interventie chirurgicala. Daca aceasta intarzie, evolutia spre infectie nu
poate fi evitata. E~antionajul din ora in ora al plagilor dupa traumatism dilacerant a
ariitat ca sunt suficiente 5,17 ore pentru ca bacteriile conditionat patogene sa realizeze
nivelul critic 105 UFC/g de tesut.
Cand colonizarea tesutului denudat se apropie de nivelul critic, inse~i materialele
de sutura scad de cca 1000 ori doza infectata. In experimente pe ~oareci a fost demonstrat
ca in prezenta suturii doza de S. aureus necesara pentru apariiia puroiului scade de la 10"
la 103 UFC.
Patul tisular pregatit pentru greru la pacienti cu arsuri, in ciuda aspectului "curat"
a continut in 34% din cazuri peste 105 UFC bacterii gram-negative/g. La 30 pacienti cu
peste 105 UFC/ g de tesut din acest pat au fost necesare III greruri repetate. Din contra,
77 grefe au prins per primam la 81 pacienti cu sub 105 UFC/g de tesut din pat, de cele
patru e~ecuri fiind responsabil Streptococcus pyogenes.
Plagile traumatice sunt mai frecvent infectate de bacteriile prezentate in
tabelul11-1. Bacilii gram-negativi intestinali sunt frecvent implicati in infeqiile plagilor
din regiunea coapselor, feselor, abdomenului inferior. In infectia plagilor de razboi sunt
larg implicate bacteriile anaerobe, inclusiv clostridiile. Infeqii cronice cu Nocardia ale
plagilor contaminate cu sol sunt frecvent eronat diagnosticate. Micobacterioze

197
posttraumatice sunt cauzate de Mycobacteriumfortuitum-chelonae (provenit din sol, de
la animale inferioare, corpi straini, ace, seringi ~i medicamente injectabile contaminate),
M. marinum (provenit din apa de mare, de la pe~ti).
Pliigile chirurgicale din zone nonnal contaminate se pot infecta cu bacterii din
microbiota regiunii anatomice in care a avut loc interventia chirurgicala (e. g., colon).
Frecvent infectia plagilor operatorii se produce cu tulpini de spital. S. aureus, P.
aeruginosa, Klebsiella spp.
Pliigile mu~cate de animale sunt frecvent infectate cu Pasteurella multocida:
mu~caturile de ~obolan sunt particular infectate cu Spirillum minus sau cu Streptobacil-
lus moniliformis, iar mu~caturile de om sunt urmate de infectii mixte cu aerobi \>ianaerobi
ai cavitatii bucale.
In arsuri intalnim frecvent stafilococi, P. aeruginosa, Klebsiella spp., Enterobacter
spp., enterococi; mai rar Moraxella spp., Proteus spp., Escherichia coli, Providencia
spp., Hajilia. In ultimii ani sunt semnalate tot mai frecvent infeqii ale arsurilor determi-
nate de fungi: Candida spp., zigomicete, Aspergillus spp.
Ulcerele cutanate cronice pot fi infectate de streptococi piogeni (grup A, G ~.a.),
streptococi anaerobi, S. aureus, Nocardia spp., Mycobacterium spp., treponeme.
Investigarea etiologica a unui ulcer cutanat cronic presupune ~i examenele serologice
pentru sifilis.

11.2.3. Supuratii ganglionare, ale seroaselor ~i parenchimelor

Sunt frecvent urmarea propagarii pe cale limfatica sau hematogena a infectiei din
focare de la nivelul mucoaselor (uterina, faringiana, bronhopulmonara) sau tegumentelor
(furuncule, celulite). Alteori aceste infeqii apar prin solutii de continuitate intre
inveli~urile organismului ~i cavitatile seroase (perfora!ii intestinale etc.).
Adenite supurate pot fi determinate de streptococi piogeni, stafilococi, bacterii
intestinale, varia!i fungi. La copii pot fi in cauza Mycobacterium tuberculosis sau alte
micobacterii. Buboane tributare p0rtii de intrare a infec!iei apar in tularemie, pesta,
limfogranulomatoza veneriana.
Abcesele viscerale au variate etiologii. Mai frecvent sunt implicate bacterii
facultativ anaerobe sau anaerobe. Ocazional pot fi detenninate de Entamoeba histo~vtica
(in special cu localizare hepatica).
Din puroiul pleural, bacteriile cel mai frecvent izolate sunt:
Streptococcus pneumoniae Enterobacteriaceae
Streptococcus pyogenes Fusobacterium spp.
Staphylococcus aureus Bacteroides spp.
Pseudomonas aeruginosa Peptostreptococcus spp.
In puroiul peritoneal pre domina enterobacteriaceele asociate cu variate bacterii
gram-pozitive ~i gram-negative anaerobe.
Diagnosticul de laborator al supura!iilor pelvine este tratat in Capitolul16.
In etiologia pleureziilor ~i peritonitelor poate fi implicat M,vcobacterium tuber-
culosis.

198
11.2.4. Supuratiile articulare

Artritele septice sunt monobacteriene ~i gasim implicati stafilococi, streptococi


piogeni, neisserii patogene, Haemophilus injluenzae, bacili gram-negativi sau Myco-
bacterium tuberculosis .
Osteomielite sunt determinate frecvent de stafilococi ~i de bacili gram-negativi.
In prezenta leziunilor granulomatoase trebuie suspectata implicarea micobacteriilor sau
fungilor (Sporothrix, Coccidioides, Blastomyces, Oyptococus).

11.2.5. Micetoamele

Micetoamele sunt infectii cronice locale, progresiv distructive ale pielii, tesutului
subcutanat, musculo-aponevrotic ~i osos detenninate de fungi (eumicetoame) sau de
actinomicete (actinomicetoame) care patrund in tesuturi prin plagi determinate de spini,
a~chii de lemn etc. Clinic se manifesta ca tumefieri care contin granuloame supurative
cu multiple fistule prin care se scurge puroi cu granule micotice variate ca aspect.
Actinomicetoamele sunt determinate mai frecvent de Actinomyces spp. ~i evolueaza in
regiunea cervico-faciala (cca 60% din localizari), abdominal a (cca 30%) sau toracica.
Eumicetoamele sunt localizate cu preciidere la picioare ~i maini, fiind determinate de
ascomicete, ca Emericella, Petrielidium, sau deuteromicete, ca Acremonium spp,
Curvularia spp., Fusarium spp., Madurella spp., Exophiala jeansel711ei.

11.3. PRELEVAREA ~I TRANSPORTUL PROBELOR DE PUROI

Fata de variemtea supuratiilor, este imposibila detalierea prelevarii puroiului in


fiecare conditie. De aceea, dupa unele precizari de ordin general, yom detalia numai
cateva situatii.

11.3.1. Precizari de ordin general

Prelevarea probelor din supuratii frecvent este unica ~iirepetabila. De aceea legatura
medic-Iaborator trebuie sa fie irepro~abila sub rapOltul: planificarii examenului, avertizarii
laboratorului, tehnicii de prelevare, ambalarii, etichetarii ~i expedierii imediate a probei
in intervalul de maximum 1-2 ore.
Tampoanele sunt contraindicate pentru prelevarea puroiului ori de dite ori putem
obtine probe prin punctie-aspiratie, chiuretaj sau biopsie. I~()lClreabacteriilor anaerobe
de pe tampoanele uzuale este imposibil~, Cu precautii speciale (e. g., utilizarea pentru
transport a unui mediu stabilizator norr-i1Utritiv;~Stuart,Amies ~.a., a containerelor anae-
robe), tampoane pot fi utilizate numai pentru prelevarea puroiului din coleqii foarte
mlCl.
Cand este necesara, irigarea leziunilor se face cu solutii saline non-inhibitorii,
cum este solutia Ringer lactozata.
Leziunile cronice sunt sarace in bacterii, de aceea se imEll]2J2r:~1~~Y(1teprobecu
volum 111aimare decM din leziunile - - .-

199
Tamgond:>
vata sleril Unele bacterii anaerobe sunt omorate ~upa cateva
secunde in contact cu oxigenul atmosferic~~It~Je,_c;i1n
~~ . ~$J~;fJ Bacteroides, Clostridium peJji'ingens, PeptostreptocoCClIS,
supravietuiesc 30-90 minute in prezenta a 2-8% oxigen.
In lips~_COl1tainerelor speciale pentmanaergbLJ?}lroiul
Punctie SI
aspir'arie recoltat plin pupctie cu selinga este h'anspOliat lalal?gl:~to~'~
prin procedeul"seringa anaeroba" (fig. 11-1), care asigur~
f
supra~ietuirea; anaerobilor cel putin 30 dC:]l1inllJ:~_.
__
In laboratOl;,---6data-examenele preliminare ~i insa-
mfmtarile tacute, restul probei, corect etichetat ~i inchis
enlletic, este refrigerat pentm eventualitatea necesitatii
unoI' examene de laborator suplil11entare.

Elimina
i Obtureaza 11.3.2.Prelevari din arsuri, pHigi
bulele
de aer
acul(u cbp
de c:aUClU(
~iulcere cutanate infectate

Arsuri ~ipli'igi
Prelevari biopsice sunt indicate cand conduita
terapeutica impune cunoa~terea concentratiei bacteriene
Fig. 11-1. Prelevarea ~i trans-
in tesuturile viabile afectate prin arsuri sau traumatism ~i
portul in "seringii anaerobii" a
extinderea leziunilor.
probelor de puroi aspirate din
colectii ~i cavitiiti o arie tara escara este spalata cu solutie salina izotona
sterila pentru indepartarea exsudatului stagnant sau a
eventualilor agenti topici antimicro'bieni. Prelevarea se face cu perforatoml dermic de
4 mm. Anestezia nu este necesara in caml plagilor. Proba se expediaza la laborator in
tub inchis el111eticpentru examinare imediata.
Prelevarile intraoperatorii se fac, dupa debridarea ~i excizia tesutului devitalizat,
din resut viabil de la baza plagii .
Prelevarea cantitativa cu tamponul. Alege 0 arie a plagii lips ita de resut necrotic
~i pregate~te-o cum este precizat l11aisus. Umecteaza un tampon din vata hidrofila cu
solurie Ringer lactozata. Invarte varful tamponului, timp de 5 secunde, pe 0 arie de ] cm2
a plagii, suficient de fel111pentru a detel111ina0 u~oara sangerare din resutul subiacent.
Acesta da garanria prelevarii din resut viabil. Imerseaza tamponul intr-un mL bulion
tioglicolat ~i expediaza-lla laborator pentru examinarea imediata.
De$i intervalul de 95% confidenta al prelevarii cantitative pe tampon este in limita
al,7 loglo (u~or mai redus decat al tehnicii biopsice, care este in limita a 1,31 log\ll)'
simplitatea ~i disconfortul redus pentru pacient 0 indica pentru monitorizarea pacienrilor
ar$i, la care poate asigura prelevari bisaptamanale.
E$antionajul corect de la nivelul denudarilor mari impune prelevari din mai multe
puncte ale suprafetei lezate.
PHigi mu~cate. Dupa toaleta ingrijita a plagii sunt indicate, in functie de condiriile
locale: puncria ~i aspiraria din colectiile purulente, punctie oblica, prin tegument nor-
mal, ~i aspirarie din resutul inflal11at. La pacienti suspectati de febra a mu~caturii de
$obolan este utila puncria-aspirarie ganglionara.

200
Ulcerele cutanate cronice. Examinarea prelevarilor pe tampon este in~eHHoare.
Sunt indicate biopsia sau produsul de chiuretaj dupa spalarea exsudatului stagnant de pe
suprafata leziunii. Rezultate bune da aspiratia lichidului interstitial de sub suprafara
denudata facuta prin punctia oblica a tegumentului sanatos de la periferia ulceruJui cu ac
hipodermic adaptat la seringa etan~a.

11.3.3. Prelevari din colectii purulente

Din leziuni accesibile punctiei (abcese superficiale, colectii din cavitatile seroase)
puroiul trebuie aspiral(;~_un __
<!~~Jlfi.cientde~~os (pel1t1JdJu~vit~<pl,lnqiaQlr1J~
in caz,-!.l<
puroiuluiVascos) adaptat la seringa etan~3'. - -- - .
Pentru eventualitatea depistarii unui abces in interventii pe organele toracice,
abdominale sau pelvine, chirurgul trebuie sa aiba la indemi'ma recipiente sterile pentru
colectarea ~i expedierea puroiului. De cate ori se excizeaza peretele abcesului (mem-
brana piogena), cateva fragmente trebuie expediate pentru examenuJ microbiologic.

11.3.4. Prelevari din fistule

Fistulele pot drena puroiul din coleqiiJe musculo-scheletale, subcutanate sau


ganglionare. Rar tamponul prelevat de la orifi!l,!LUttJleidepisteaza adevaratull11icrob
care a detenmnat supuratla'.'S-unfI?gl(:;[it~si:iaiare_'l~ianti3eptizare~ingnjita a. teg1ll11eniUlU1"'
urmata de chiuretarea cat maFprofuilcIr a traiectului fistulos cu expedierea imediata la
Janoralor a nroausulurobti~---~ <-~_.-.-._~-----<--_ ..~-._ .._.---

J 1.4. EXAMENUL DE LAB ORATOR AL PUROIULUl

11.4.1. Examenul macroscopic

Este posibil numai pentru probele de puroi prelevate in seringa sau recipiente.
Ul111arim:mirosul, culoarea, consistenta, omogenitatea sau prezenta granuleJor.
Culoarea puroiului variaza de la galben la ro~u bruno Aspectul ro~u se datoreaza
prezentei sangelui sau hemoglobinei. Puroiul din abcesele hepatice amibiene este brun
inchis sau galben-brun. Cel din pIagile ~iarsurile infectate cu bacil piocianic este albastru-
verzui. Puroiul verzui sugereaza 0 infectie pneumococica.
Consisten/a. Purciul cre1110s,bine legate~~t.i~yentru infe~lii s,tafiJ.()~.()E!t::.
cel fluid pentru infectii sirepfococice, iafCeICaZeos pentru irifeC1:Tatuberculoasa. Puroiul
poate ajunge la laborator coagulat in infectiile stafiIococice sau in cazuJ probelor
hemoragice.
Puroiulmicetoamelor este fluid ~i contine granule caracteristice, colonii tisulare
ale micetului sau actinomicetului infectant. Pentru observarea granulelor examineaza
proba de puroi, cu ochiulliber ~i cu lupa, in baie de solutie salina izotona, intr-o cutie
Petri a~ezata pe fond negru. Tabelul 11-2 descrie caracterele granulelor din puroiul
micetoamelor in functie de agentul etiologic. Tifonul tampoanelor de acoperire a fistulelor
unui micetom trebuie examinat cu atentie penull ca poate retine granule din puroiul
drenat.

201
No Tabeluill-l
N
Principalele caractere ale granulelor din puroiul micetoamelor (adaptare dupii PADHYE ~i AJELLO, 1980)

MaterialDimensiunea
de
Alba
Absent
Ro~uAbsent
AlbaiGalben
Galbena/
Galbena/
Neagra Albii
Galbena/Bruna
lnchis
Prezent Albii
Ferma
Consistenta
Galbenal omogen Sfericii/Lobata
Ferma-dura
Moale
deschis
Ovala/Lobata
Variabila-multilobata
Lobatii/Miiciucata
Rotunda/Ovala
Moale-ferma
Ovala/Lobata/Ren
Sferica/Lobata
Alba/Ro~iatica
Ro~u-brun/Neagra
periferic Neregulat sfericii, iforma
t,O-2,O
0,5-5,0
0,2-0,5
1,0-5,0
0,5-1,0
1,0-2,0
0,3-0,5
0,025-0,150
0,2-5,0
0,3-0,6
Forma fin dendriticii"cimentare"
Lobata/Ovala/Serpiginoasa
Agentul etiologic I) Culoarea
Petrellidium boydii
Actinomyces spp.
Streptomyces somaliensis

II Agcnti ctiologici selllilalati in ROlllania


In nocardioze granulele sunt rare sau lipsesc, mai frecvent apar in eumicetoame.
Mirosul. Puroiul fluid, cenu~iu-murdar, cu miros fetid, sugereaza 0 supuratie cauzata
de bacterii anaerobe sau de 0 infectie mixta cu bacterii facultativ anaerobe.

11.4.2. Microscopia

11.4.2.1. Pregatirea probelor. Vom considera pe rand: probele biopsice, probele


uzuale de puroi, probele prelevate pe tampon ~i puroiul din micetoame.
Probele biopsice pentru examenul cantitativ.
- Cintare~te recipientul de transport cu proba.
- Transfera proba intr-un tub Griffith pentru omogenizare ~i cfmtare~te reeipientul
de transport ta.ra proM. Diferenta dintre cele doua valori da greutatea probei.
- Omogenizeaza proba adaugand bulion tioglieolat in propoqie de I mUg de tesut.
Aceasta este suspensia mama.
- Etaleaza pe 0 lama de microscop, intr-o arie eu diametrul de 15 mm, 0,01 mL din
suspensia mama de tesut.
- Usuca frotiul 15 minute pe platina incalzita la 75C. Degreseaza, inainte de
colorare, frotiurile din probe care contin tesut subcutanat. Pentru aceasta acopera frotiul
cu xilol de 2 ori cate 30 de secunde.
Probele biopsice pentru examene calitative uzuale. Examineaza sub lupa sau
stereomicroscop, cu marire de 30X, probe biopsice mari pentru a repera eventuale
microabcese. Diseca cu foarfece ~i pensa sterile fragmentele suspecte. Majoreaza
fragmente maruntite pentru examenul bacteriologic.
Probele de puroi uzuale. Imediat dupa primirea probei, efectueaza cu ansa un
frotiu subtire ~i uniform. Coloreaza gra1E-~i examineaza.La.sererea clinicianului oriin
functie de aspeetul purorulm, efectUeaza ~i unufrotiu pent&9]orareZiehl-Neelsen sau
un preparatumeotri.tte
- lama ~i lamelamonta.t in '
solutiesalina izotona.
Probelepre{evate-petampon. Adsorbpacelulelor iI1n~n1!ltoriiian1icroorganis-
melor pe fibra de vata denatureaza rez~mltet~tlac;a:erecillar~;f~oti~l~i e~t~ t~l~;;~lIz~ta.
Pe 0 laina--de-microscop steriliiata -pi-inflarnhare ~irfcIt~, efectueaza extempor~i1eu'
frotiul prin rularea u~oara, :rara apasare, a tamponului pentru a obtine un frotiu sub!ire ~i
unifonn in centrullamei. Daca leziunea supurativa este de mici dimensiuni, utilizeaza
un tampon umectat in prealabil cu solutie salina izotona. Fixeaza frotiul prin ealdura ~j
expediaza-l, impreuna eu tamponul, la laborator pentru examinare.
Pentru bacterioscopia cantitativa a exsudatului din plagi sau arsuri prelevat pe
tampon, limiteaza etalarea frotiului la 0 arie eu diametrul de 15 mm.
Puroiul din micetoame. Preleva cu ansa sau eu 0 pipeta Pasteur granule observate
in baia cu solutie salina izotona (vezi mai sus). Efectueaza cu unul din granule un preparat
umed montat in solutie 10% KOH. Zdrobe~te alt granul intre doua lame de micros cop
dispuse in cruce. Separa lamele, usuca ~i fixeaza prin caldura frotiurile astfel obtinute.
Coloreaza unul Gram ~ipastreaza-l pe ceJalalt in rezerva pentru coloratia Ziehl-Neelsen
sau Kinyoun modificata (vezi Cap. 42).

203
11.4.2.2. Examenul preparatului umed
Dupa caz unnarim:
Amibe mobile in puroiul din abcese hepatiee.
Scoleqi sau cro~ete de Echinococcus
Celule levurifol111e ~i pseudohife de Candida, fonna levurica de Histoplasma
duboisii, Blastomyces dermatitidis ori sferule de Coccidioides immitis.
Microcolonii ale actinomicetelor sau fungilor in granulele micetoamelor. Cu
diafragma de apertura redusa corespunzator, baleiaza preparatul sub marire de 100X
pentru a repera structurile filamentoase care diferentiaza granulul actinomicotic de
microeolonii tisulare ale stafilococilor. Examineaza detaliile cu marire de 600X.
In granulele actinomicetoamelor se pot observa 5-6 mase filamentoase intretesute
cu diametrul de cca 100 11m,inconjurate eu filamente radiare, ramificate, cu diametrul
de cca 111m, sau mai subtiri, refringente, miiciucate, dispuse in diferite planuri suprapuse.
Aspectul maciucat poate lipsi.
Granulele eumicetoamelor sunt f0l111atedin hife groase de 2-5 11m, septate ~i
ramifieate, care prezinta din loc in loc, mai ales la peri feria granulelor, celule bizar
balonizate cu diametrul pana la 15 11m.
Referitor la imp0l1anta microscopiei puroiului cu grunji din leziuni inflamatorii
multiplu fistulizate, subliniem ca am intalnit epitelioame spinocelulare cervico-faciale
infectate care mimau actinomicoza, dar microscopia in serie a granulelor galbui cu
diametrul de 1-3 mm a aratat numai aglomerari de celule epiteliale scuamoase, iar culturile
au izolat flora mixta exclusiv actinomicete.

11.4.2.3. ExamenuI frotiului colorat Gram


Bacterioscopia cantitativa din exsudatul plagilor ~i arsmilor. Baleiaza cu marire
de 1000X toata suprafata frotiului special pregiitit in acest scop. 0 singura bacterie
observata pe frotiu semnifici'i prezenta a cel putin 105 UFG/g de tesut. Bacterioscopia
cantitativa poate fi practicata ~i intraoperator cu 0 eficacitate de 0,96.
Pentru examenele uzuale unnarim ~i inregistram:
- Piocitele. Uneori Ie observam numai ca "celule inflamatorii rotunde", dar pe
frotiuri bine colorate granulocitele sunt distincte de lil11focite ~i l11acrofage.
, - Categoria microscopica a bacteriUm' observate (revezi 5.2.1.2.). Baeterii foarte
numeroase ~i polimorfe, care includ streptococi, baeili gram-negativi ~i gram-pozitivi,
inclusiv bacili fusiformi, sugereaza 0 infeqie l11ixtacu bacterii anaerobe.
- Aprecierea semicantitativa a microbilor observa{i: fOal1e rari (unul pe 50-100
cfllnpuri microscopice), rari (unul pe 10-20 campuri microscopice), nUl11ero~i(I-lOpeI'
camp), foarte numero~i (zeci sau sute per camp).
Puroiul micetoamelor. Granulele actinol11icetoal11elorsunt fonnate dintr-o masa
de filamente subtiri cu diametrul intre 0,5-1 11m,gram-pozitive. Uneori pseudomiceliul
este lax sub fonna de paianjen sau se fragmenteaza, l11aiales la 0 preparare brutala cu
ansa a frotiului, in f0l111ecocoide ~ibacilare difteroide. Frecvent pseudohifele nocardiilor
apar moniliforme ~icolorate neunifonn gral11-pozitiv.Oricum, diferentierea microscopica
a nocardiilor de alte actinomicete 0 face numai acido-rezistenta lor partiala (vezi mai jos).
In granulele eumicetoamelor este bine evidentiata reteaua hifelor groase de 2-5 11111,
septate, ramificate, gram-pozitive ~i cu frecvente balonizari.

204
11.4.2.4. Examenul frotiurilor colorate pentru bacterii acido-rezistente
ColoratWe Ziehl-Neelsen sau Kinyoun pentru bacilii acidorezistenti sunt indi-
cate la cererea c1inicianului sau dnd bacterioscopia ramfme negativa pe frotiurile colorate
Gram din exsudatele purulente pleurale, articulare, supuratiile osoase sau ganglionare ~i
trebuie suspectata prezenta bacililor tuberculozei.
Baciloscopia puroiului din abcese fesiere dupa injectari intramusculare profunde
poate depista micobacterii din grupul M fortuitum-chelonae ocazional implicate in
asemenea supuratii iatrogene. La pacientii proveniti din zone tropicale nu trebuie neglijate
coloratiile pentru microorganisme acido-rezistente la microscopia racletelor din ulcere
cronice ale gambelor ~i bratelor, care pot fi determinate de MycobacteriUln ulcerans.
Egal sunt indicate aceste coloratii ~i la examinarea rac1etelor din leziunile cutanate
nodulare ulcerate ale inotatorilor ~i pescarilor, care pot fi determinate de Mycobacte-
rium lnarinum .
Coloratiile Ziehl-Neelsen !ji Kinyoun mod!ficate, cu decolorare scurta, sunt in-
dicate pentru diferentierea nocardiilor de alte actinomicete. Pseudohifele sau numai
fragmente de pseudohife ale nocardiilor (N. asteroides, N. brasiliensis, N. caviae) variaza
de la acido-rezistenta partiala la acido-rezistenta completa, in timp ce restul actino-
micetelor sunt neacido-rezistente.
Daca bacterioscopia prin metodele uzuale ramfme negativa, efectueaza imediat,
coloreaza May Grunwald Giemsa ~i examineaza un nou frotiu. In puroi din coleqii
cutanate am putut depista astfel rapid f0TI11a levurica de Histoplasma capsulatulJI ~i
sferule de Coccidioides immitis.

11.4.3. Cultivarea probelor

Mediile de cultura insamanlate, condiliile ~i durata de incubare sunt in functie de


conjunctura clinico-epidemiologicii, rezultatele microscopiei, localizarea ~i caracterele
leziunilor supurative examinate.

11.4.3.1. Izolarea cantitativa din plagi ~i arsuri:


Probe biopsice:
- Dilueaza decimal, de la 10-1 la 10-3, in bulion tioglicolat, suspensia mama de
lesut omogenizat.
- Etaleaza cate 0,1 mL din fiecare dilulie, inc1usiv suspensia mama, pe 0 placa cu
agar-sange pentru incubare aeroba ~i una cu agar-sange suplimentat pentru anaerobi.
- Incubeaza placile la 37C cu citiri la 24 ~i 48 de ore a placii aerobe ~i la 48-72
ore a celei anaerobe.
- Numara coloniile din placile pe care au crescut intre 30 ~i 300 de colonii ~i
calculeaza con centralia bacteriilor din lesut dupa fOTI11Ula.

Numarul UFG/g tesut = N x D x F x 10.


unde: N = numarul coloniilor pe placa; D = inversul dilutiei insamantate; F =

factorul de dilulie, adica w;v ; W = greutatea tesutului omogenizat in g; V = volumul


de diluant utilizat pentru dilulia mama; 10 pentru cii am insamanlat 0,1 mL dilutie.

205
Prelevatul pe tampon. Imediat dupa primirea probei, rote~te insistent tamponul
in mediu1 de transport, pentru descarcarea continutului, apoi stoarce-l prin presare
insistenta pe peretele tubului. Di1ueaza decimal suspensia mama astfel obtinuta ~i
procedeaza ca mai sus tinand cont ca tamponul nu este adecvat pentru izolarea bacteriilor
anaerobe.

Numarul UFC/tampon =N x D x 10
1zolatele in cantitate ~ 105 UFC/g de tesut sau ~ 106 UFC/tampon au semnifica!ie
clinica; trebuie identificate ~i se impune antibiograma. Peste 108 UFC/tampon se izoleaza
de la pacientii cu diseminare septicemica a infectiei.
Streptococii ~-hemolitici au semnificatie c1inica indiferent de cantitatea in care
sunt izolati (de verificat, in p1agile feselor, perineului, coapselor sau abdomenului infe-
rior daca aceste izolate nu sunt Enterococcus fa eca lis var. zimogenes, care nu intra sub
incidenta acestui criteriu de semnificatie).
Daca examenul histopatologic confirma prezenta infiltratului inflamator, a leziunilor
de vaseulita ~i tromboza in probele examinate, capata semnifieatie clinic a ~i izolatele in
cantitati de 103-104 UFC/g, mai ales in prezenta unei asoeiatii de baeterii aerobe ~ianaerobe.

11.4.3.2. IzoHiri calitative din puroi ~i probe biopsice


Bacterii aerobe $i facultativ anaerobe cu cre$tere rapidii. Bateria minimala a
mediilor de izolare include:
- 0 placa eu agar-sange,
- 0 placa cu agar Mac Conkey sau alt mediu eu selectivitate joasa pentru bacilii
gram-negativi,
- 0 placa cu agar-sange selectiv, prin colimicina ~i acid nalidixic, pentru cocii
gram-pozitivi,
- un tub cu bulion tioglicolat imbogatit (vezi mai jos), numai pentru probele
necontaminate aspirate din colectii inchise ..
Probele de puroi mticular trebuie insamantate suplimentar pe cate 0 placa cu agar-
sange ~ocolat (eventualitatea hemofililor, in specialla copii pfma la varsta de 5 ani), agar
Mueller-Hinton cu supliment HYL ori agar Thayer-Martin modifieat (eventualitatea
gonoeoeilor sau meningoeoeilor).
Incubeaza culturile la 37C in atmosfera cu 5-10% CO2, timp de 24---48ore, perioada
prelungita pana la 5 zile pentm urmarirea neisseriilor sau a eulturii in bulion.
Bacteriile anaerobe. Epuizeaza probele de puroi sau eele biopsice pe oplaca cu
agar-sfmge pentm anaerobi, aditionat cu gentamicina ~i vancomicina In cazul probelor
contaminate. Numai probele de puroi neeontaminate pot fi insamantate ~ijn-buliGn
tioglicolat imbogatit cu/vitamina Kj' hemina ~i ser de iepure.
Incubeaza culturile la 37C, in atmosfera anaeroba cu 5-10% CO2 pana 1a 7 zile.
Brucelele. Epuizeaza probele pe agar-sange cu infuzie de cord, agar Brucella
(Difco) etc., incubeaza culturile la 37C in atmosfera cu 5-10% CO2 ~ium1are~te apari!ia
cre~terii pana la 28 de zile.
Actinomicetele. Epuizeaza probele pe cate 0 placa eu agar-sange pe baza de
infuzie cord-creier: una cu incubare anaeroba la 37C pana la 21 de zile pentru izolarea

206
actinomicetelor anaerobe, celelalte cu incubarea aerobii la 25, 30 ~i 37C pfma la 14
zile pentru izolarea speciilor aerobe. Urmare~te la fiecare doua zile placile pentru aparitia
culturilor .
Bacilii acido-rezistenfi. Decontamineaza chimic probele contaminate (vezi Cap.
13). Insamanteaza mai multe tuburi cu mediu Lowenstein-Jensen. Incubeaza tuburile
aerob la 37C, primele 24 ore in pozitie inclinata pentru adsorbtia inoculului pe panta de
mediu, apoi in pozitie verticala pana la 60 zile. Unnare~te aparitia culturilor de doua ori
in prima saptamana, apoi saptamanal.
Mycobacterium fortuitum-chelonae poate fi omorat prin decontaminarea chimica
a probei, insa prelevatele contaminate nu creeaza probleme pentru ca aceasta bacterie
cultiva, intre 3 ~i 7 zile, pe agar-sange sau agar Mac Conkey.
Fungii. Insamanteazii:
- Pante de agar Sabouraud glucozat neselectiv ~i selectiv prin adaos de cyclo-
heximidii.
- Pante de agar-sange pe baza de infuzie cord-creier nese1ectiv ~i selectiv prin
aditie cu cloramfenicol ~i gentamicinii sau cloramfenicol, gentamicina ~icycloheximida.
Incubeazii aerob, la 30C, tuburile cu mediul Sabouraud pentru izolarea fungilor
fi]amento~i ~ilevurilor oportuniste ~i la 37C tuburile cu mediu imbogatit pentru izolarea
formelor tisulare (levurice) ale fungilor dimorfi. Urmare~te culturile pana la 30 de zile.
Situafia leziunilor granulomatoase cu bacterioscopie neconcludenta. Insaman-
tarile trebuie sa vizeze: brucelele, micobacteriile ~i fungii.
Identifica microscopic ~irepica izolatele clinic semnificative pentru a obtine cultura
pura necesara antibiogramei ~i introducerii In algoritmul de identificare.
De~i in terapia multor supuratii primeaza tratamentul chirurgical, rezultatul
antibiogramei trebuie comunicat in interval minim posibil.
12. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECTIILOR TRACTUSULUI RESPIRATOR SUPERIOR
SI CAVITATILOR CONECTE
(DUMITRU BUIUC)

12.1. INTRODUCERE Rolu] laboratorului in controlul e~ecurilor


12.1.1. Conditia anatomohistologica penicilinoterapiei
12.1.2. Conditia microbiologica 12.2.4. Confirmarea bacteriologici'i a anginei
12.1.3. Entitati nosologice ~i conditii patoge- difterice
netice ]2.2.5. Candidoze
12.1. FARINGITE 12.2.6.Angina ~i stomatita Vincent
12.1.1. Spectrul etiologic 12.2.7.Faringite gonococice
12.1.1.1. Viroze ]2.2.8.Faringite determinate de Arcanobac-
12.2.1.2. lnfecfii bacteriene teriulll haemolyticlllll
Streptococcus pyogenes 12.3. EXSUDATELE NAZAL $] NAZOFA-
A]!i streptococi piogeni RINGIAN
Mycoplasma pneumoniae 12.3.I.Prelevarea probelor
COI}'11ebacterium diplztheriae
12.3.2.Depistarea purtatorilor sanato~i de:
ArcanobacteriulII haelllolyliculII
Staphylococclis alireliS
Gonococi
Streptococcus pyogenes
Asocia!ii fuso-spiri]are
bacili difterici
12.2.1.3. Infecfii fungice
meningococi
Margaritarelul
Haemophilus il~flllel1:weserovar b. invaziv
12.1.2.Prelevarea ~i transportul probelor de
12.4. SINUZITE
exsudat faringian
12.1.3.Diagnosticul de laborator al faringitelor 12.4.I.Spectrul etiologic
streptococice 12.4.2.Prelevarea probelor
Transportul ~i conservarea probelor 12.4.3.Examinarea probelor
Microscopia directa 12.5. OTITE
Metode rapide pentru depistarea antigenica 12.5.1.0tite medii
Cu]tivarea 12.5.2. Otite externe
ldentificarea 12.6. LARINGITE $1 EPIGLOTITE
Antibiograma ]2.6. 1.Laringite
Comunicarea rezultate]or 12.6.2. Epiglotita acuta

12.1. INTRODUCERE

Infectiile tractusului respirator superior detem1ina boli pentru care se solicita eel
mai frecvent consult medical.

12.1.1. Conditia anatomo-histologica a tractusului respirator superior


Anatomic, tractusul respirator superior incepe de la nari ~i se continua pfma la
orificiul glotic prin cavitati1e nazale, nazofaringe (cu cavitatile conecte: sinusurile
paranazale, urechea medie ~i antrul mastoidian), oro-faringe ~i laringele superior. Prin
oro-faringe comunidi larg cu cavitatea bucala.

208
Epiteliul respirator, columnar, pseudostratificat, ciliat, dublat cu un strat de mucus
produs de numeroasele celule caliciforme diseminate ~ide glande sero-mucoase, acopera
cavita!ile ~i cometele nazale, sinusurile paranazale, portiunea extraosoasa a trompei lui
Eustachio.
Un epiteliu scuamos stratificat nekeratinizat, prevazut cu glande de tip mucos pur,
continuare din mucoasa bucala ~icontinuat pe mucoasa esofagiana, acopera orofaringele
~i cripetele amigdaliene.
Acumulari de !esut limfatic sunt bogate la nivelul oro- ~i nazo- faringelui unde
constituie amigdalele. Granulocite polimorfonuc1eare, limfocite ~i monocite trec, prin
diapedeza, in fluidul crevaselor gingivale ~i de aici in saliva.

12.1.2. Conditia microbiologidi

Etajul supraglotic al tractusului respirator gazduie~te 0 flora bacteriana abundenta,


care reune~te peste 300 de specii repaliizate in diferite ni~e ecologice: crevasele gingi vale,
placa dentara, mucoasa lingual a, jugala, oro- faringe, criptele amigdaliene, nazo- faringe
~icavita!ile nazale. Crevasele gingivale gazduiesc pana la 109unita!i fonnatoare de colonii
(UFC)/mg de con!inut, saliva contine 108-9UFC/mL, iar placa dentara cca 1011 /g. Bacteriile
anaerobe Ie domina pe cele aerobe in proportie de 5-10: 1. Organisme comune sau foarte
frecvente ~i in cantitatile cele mai mari sunt:
bacterii anaerobe: specii de Veillonella, Bacteroidaceae din genul Prevotella
(P. melaninogenica ~.a.), peptostreptococi, lactobacili etc.;
bacterii aerobe sau facultative: streptococi viridans, neisserii nepreten!ioase.
Frecvent izolate, dar limitate la concentratii de 103-5UFC/mL sunt Staphylococ-
cus epidermidis, Haemophilus spp., bacili difterimorfi, streptococi ~-hemolitici, pneu-
mococi, Candida albicans, Actinomyces spp., Bifidobacterium spp., FusofacteriwJ/ spp.
Bacili gram-negativi ~i pseudomonade apar rar la persoanele nonnale, dar rata
portajului ~i cantitatea lor cresc semnificativ la varstnici ~i 1apacientii spitalizati pentru
boli grave.
Terapia antimicrobiana induce disbioze importante ale microbiocenozelor
orofaringiene cu aparitia predominanta a Staphylococcus aureus, bacililor coliformi,
pseudomonadelor ~i levurilor.
Sinusurile paranazale ~i urechea medie raman necolonizate gra!ie eliminarii
eficiente, prin transportul muco-ciliar, a contaminantilor ocazionali.

12.1.3. Entitati nosologice ~i conditii patogenetice

Infectiile tractusului respirator superior se manifesta ca:


faringite, pentru care folosim tennenul de angina atunci cand inflamatia inelului
limfatic faringian, in special a amigdalelor palatine, este marcanta;
nazofaringite;
rinite;

209
sinuzite;
otite medii;
laringite ~i epiglotite.
Lipsa barierelor anatomice distincte intre segmentele ci'iilor respiratorii superioare
pem1ite propagarea infectiei prin continuitate, de unde interpi'itrunderea simptomatologiei
clinice (e.g., nazo-faringite-angine) ~i frecvente complicatii prin afectarea sinusurilor ~i
urechii medii, a laringelui ~i, mai jos, a cihlor respiratorii inferioare.
Propagarea limfatica a infectiei este posibila:
mai rar in infectiile virale (e.g., mononucleoza infectioasa, adenoviroze);
foarte frecventa in infeqiile bacteriene (e.g., limfadenitele cervicale streptococice).
Situatia particulara a propagarii spre meninge, prin tecile limfatice ale filetelor
nervului olfactiv, a unor bacterii care infecteaza nazo- faringele a fost precizata in Cap. 10.
Virusurile sunt patogenii primari care determina cel mai frecvent infectii ale cailor
respiratorii superioare (v. tabelul 8-2). De~i nu beneficiaza de tratament antiviral, aceste
viroze se vindeca spontan dar, prin lezarea epiteliului respirator ~i obstruarea congestiva
a orificiilor sinuzale sau a trompei lui Eustachio, favorizeaza suprainfeqia cu baeterii
din microbiota indigena.
Doar cateva bacterii (e.g., Streptococcus pyogenes, Mycoplasma pneumoniae,
Chlamydia pneumoniae, Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus h!flllenzae serovar
b) se manifesta ca patogeni primari la aceste nivele ~i determina boli, uneori eu riseuri
grave, care insa beneficiaza de tratament antimicrobian.
Prediqia semnelor clinice pentru etiologia bacteriana a acestor infeqii este
mediocra. De aici interesul pentru diagnosticul de laborator.
Conditii locale (leziuni prin sub stante iritante, caustice, deshidratare exeesiva a
mucoasei) ~i, mai ales, sistemice (hemopatii maligne ~.a.) favorizeaza aparitia anginelor
u1cero-necrotice determinate de asociatii ale unor specii din mierobiocenozele
orofaringiene (e.g., asociatia fuso-spirilara).

12.2. FARINGITE

12.2.1. Spectrul etiologic

12.2.1.1. Viroze. Aproximativ 70% din infeqiile care afecteaza faringele sunt
viroze. Virusurile implicate sunt: rhinovirusurile (in specialla adulti), adenovirusurile,
virusul Herpes simplex 1, virusurile Coxsackie A (mai ales la copii), virusurile grip ale
(la toate varstele), paragripale. Fenomenele inflamatorii fiind mai extinse, pacientii au
rinoree, stranut, disfagie, tuse cu febra, in general moderata. In infeqia cu unele serovaruri
adenovirale se asociaza conjunctivita. Mononucleoza infectioasa, detem1inata de virusul
Epstein- BaIT,se particularizeaza printr -0 angina severa, frecvent u1cerata, adenita cervieaEi
~i semne de afectare sistemica.

12.2.1.2. lnfectiile bacteriene. Cu rol demonstrat in etiologia faringitelor sunt:


1) Streptococcus pyogenes este responsabil de majoritatea faringitelor bacteriene
carora Ie imprima gravitate prin complicatii infeqioase (sinuzite, otite medii, mastoidite,

210
adenite cervicale supurate, flegmon amigdalian, celulita difuza a plan~eului bucal - an-
gina Ludwig) sau post-infectioase (reumatism cardioarticular acut, glomerulonefrita acuta,
coree). Flegmonul amigdalian ~i angina Ludwig sunt infectii bacteriemice.
La copilul mic infeqia evolueaza ca 0 nazofaringita subacuta cu exsudat discret ~i
febra moderata. La copilul mare ~i adult manifestarile sunt acute, zgomotoase: febra
mare, cefalee, disfagie, greata, varsaturi. Pacientii au faringele putel11ic congestiv, angina
cu variate aspecte ale exsudatului (pultaceu, ulceratie cu falsa membrana etc.), uneori
pete~ii pe palatul moale, frecvent adenita cervicala. De~i sugestiva, aceasta simptoma-
tologie are prediqie mediocra ~i nu poate singura sa evite abuzul sau retinerea eronata
de la antibioticoterapie.
Multitudinea serovarurilor M de S. pyogenes ne expune aproape anual riscului
acestor faringite, totu~i infectiile sunt mai frecvente la copii pana la 12-14 ani.
Fmingitele cu tulpini eritrotoxigene de S. pyogenes se Insotesc cu scarlatina cand
pacientii nu sunt imuni la aceasta toxina .
. 2) Alti streptococi piogeni (grup B, C sau G) sunt ocazional cauza a unor faringite
a caror evolutie poate figrava.
3) Chlamydia pneullloniae este 0 cauza frecventa a faringitelor.
4) Mycoplasma pnelllllOniae detennina pana la 10% din faringitele ~colarilor.
5) Corynebacterium diphtheriae detennina angine pseudomembranoase grave
Insotite cu toxemie. Mult timp stapanita aproape complet Plin vaccinare, in prezent difteria
apare ca boala reemergenta, motiv pentru care trebuie sa reintre in aten!ia clinicienilor
infectioni~ti, epidemiologilor ~i microbiologilor.
6) Arcanobacterillm haemolyticllm (numit anterior Corynebacterium haemol.vticwlI)
cauzeaza ocazional faringite.
7) Gonococii, dupa raporturi sexuale aberante, pot cauza faringite benigne.
Asociatii fuso-spirochetozice detel111inastomatita ~i angina Vincent, caracterizate
prin leziuni ulcero-necrotice care pot fi acoperite de false membrane. Boala, relativ rara,
apare la pacienti cu igiena bucala deficitara ~i deficite locale sau sistemice ale aparari i
antiinfeqioase. Este 0 infec!ie mixta cu bacterii anaerobe dominata de badli gram-negativi
fusiformi (Fusobacterium spp., Prevotella spp.) ~itreponeme bucale. Asocierea S. p.vogcncs
nu poate fi exclusa a priori.
Rolul altor bacterii in etiologia faringitelor ramane inconsistent demonstrat.

12.2.1.3. Infectii fungice. In conditii de disbioza, levuri din microbiota orofarin-


giana, in special Candida albicans, se inmultesc excesiv ~i pot dete11l1inastomatita ~i
faringita (margaritel), mai frecvent la prematuri, nou-nascu!i, pacienti debilitati. Zonele
afectate ale mucoasei (jugale, linguale, faringiene) apar putel11ic congestive ~i acoperite
cu depozite alb-cenu~ii, care pot conflua int1'-ofalsa membrana. Lipse~te aden ita cervicala.

12.2.2. Prelevarea ~i transportul probelor de exsudat faringian

Indicafli: diagnosticul faringitelor ~i anginelor streptococice; confirm area


diagnosticului de difterie; diagnosticul altor angine bacteriene, fungice sau virale; depis-
tarea portajului de S. pyogenes ~i de C. diphtheriae (vezi 12.3.2.2. ~i 12.3.2.4).

211
Necesar: tampoane de uz general, apasiitor de limba, sursa de lumina, masca.
Procedura: Exsudatul faringian se preleva inainte sau dupa 3-4 ore de la toaleta
gurii ori ingestia de alimente.
A~eaza pacientul pe scaun, cu fata spre sursa de lumina, gatulin u~oara extensie ~i
ceafa sprijinita de perete. In conditii de iluminare adecvata, deprima baza Iimbii ell
apasatorul steril ~i, in timp ce pacientul pronunta vocal a A, ~terge cu tamponul fem1, dar
nu brutal, amigdalele ~i peretele posterior al faringelui, vizand in special orice zona
inflamata, ulcerata, depozite purulente. Cand exista, falsa membrana trebuie u~or desprinsa
la periferie ~i tamponata mucoasa subiacenta. Atat la introducerea, cat ~i la scoaterea
tamponului din faringe evita atingerea cu baza limbii sau cu palatul moale. Reintrodu
tamponulin tubul protector etichetat.
Pentru c.ptelevan~a faringiana declan~eaza reflex de tuse, protejeaza-te cu masca
de tifon.
Transport ~i ccnservare. lntervalul de timp in care trebuie efectuata examinarea ~i
modalitatile de conservare a probei sunt functie de microorganismele unnarite. Referitor
la prelevarile pentru diagnosticul virozelor revezi Cap. 8.

12.2.3. Diagnosticul de laborator al faringitelor streptococice

Examenul uzual al tamponului faringian vizeaza depistarea ~i identificarea


streptococilor f3-hemolitici. Cultivarea pentru alte bacterii se face numai la cerere expresa,
pentru ca impune alte medii de cultura.

12.2.3.1. Transportul ~i conservarea probelor. Tamponul faringian trebuie exa-


minat in interval de maximum 3 ore dupa prelevare. Daca acest interval nu poate fi
respectat, se impune imersia ~itransportul tamponului in bulion de conservare-imbogatire.
Mediul recomandat de conservare-imbogatire este bulionul Todd-Hewitt cu azid de sodiu
(1: 16 000) ~i cristal violet (1 :500.000). La primirea in laborator, inainte de epuizarea
pentru izolare, incubeaza tamponul timp de 3-5 ore la 37C.
12.2.3.2. Microscopia direcdi a exsudatului faringian pe frotiu colorat Gram nu
este uzual recomandata pentru diagnosticul anginelor streptococice, din cauza abundentei
streptococilor viridans din micro biota indigena de la acest nivel. Sunt argumentate in'sa
~i opinii contrarii.

12.2.3.3. Metode rapide pentru depistare antigenica. Sunt comercializate truse


pentru detectarea S. pyogenes prin latexaglutinare, coaglutinare sau ELISA direct in
tamponul cu exsudat faringian. Mai larg utilizata este latexaglutinarea. Sensibilitatea
depistarii antigenice a S. pyogenes in tamponul faringian variaza intre 0,80-0,95, dar
specificitatea este de 0,98. Astfel detectarea antigenic. a streptococilor grup A poate
inlocui cultura doar cand rezultatul este pozitiv. In cazul unui rezultat negativ nu ne
putem dispensa de cultura, cu atM mai mult cu cat faringite, uneori grave, deten11ina ~i
streptotocii grup C ~i G.
12.2.3.4. Cultivarea. Insamanteaza probe Ie pe placi cu agar infuzie de cord sau
agar tripticaza-soia cu 5% sange de berbec. Alte medii au un continut mai mare de glucoza,
care inhiba producerea streptolizinelor. Sangele de berbec este mai indicat decat sangele

212
de cal sau de iepure pentru di hematiile de
epuizarea
berbec contin NAD-aza. Enzima distruge In striurl
cu ansa
factorul V ~iinhiba cre~terea speciilor hemo-
litice de Hae11lophilus, din microbiota
faringelui, ale diror colonii pot fi confun-
date cu cele ale streptococilor ~-hemolitici.
Pe agar cu sange de berbec caracterul
~-hemolitic al Enterococcus faecalis var
ZY11logenes uzuallipse~te, dar se manifesta
pe agarul cu sange de caI. Fig. 12-1. Epuizarea eu ansa a exsudatului
Ruleaza toate fetele tamponului pe un faringian pc 0 jumatate de placa
cadran al unei placi cu diametrul de 9 cm.
Epuizeaza apoi inoculul cu ansa in celelalte trei cadrane. Prin intepare sau scurta seqionare
a mediului cu ansa la sfiir~itul epuizarii in fiecare cadran se creeaza conditii microaerofile
care protejeaza de oxidare streptolizina 0 ~ipennit depistarea tulpinilor de S. pyogenes
neproducatoare de streptolizina S. De aici interesul folosirii placilor cu un strat mai gros
de mediu. Precizam ca in aerobioza, in lipsa streptolizinei S, streptolizina 0 imprima
coloniilor aspect {X-hemolitic.
Pentru economie, un tehnician experimentatpoate epuiza corect tamponul ~i pe 0
jumatate de pladi (fig. 12-1).
Fo1osirea unui mediu selectiv (mai ales asociat mediului de imbogatire) penl1ite
insamfmtarea mai multoI' probe pe 0 singura placa. Sunt recomandate:
Agarul-sange cu cristal violet (1llg/mL), care inhiba stafilococii.
Agarul-sange cu sulfametoxazol (23,75 Ilg/mL) ~i trimetoprim (1,25 Ilg/mL)
inhiba stafilococii, streptococii viridans ~ibacilii gram-negativi, dar inhiba ~iunele tulpini
de streptococi ~-hemolitici grup C sau G, care sunt sensibile la cotrimoxazol. De aceea
aplicarea unei rondele cu cotrimoxazol (din trusa pentru antibiograma difuzimetrica) pe
primul cadran de epuizare favorizeaza reperarea coloniilor ~-hemolitice in zona de
difuzare a chimioterapice1or ~i evita riscul rezultate10r fals negative, aria selectiva fiind
limitata .
Agarul-sange cu 3,5% c10rura de sodiu favorizeaza, cu rezultate superioare altar
medii selective, izolarea streptococilor ~-hemolitici cauzatori de faringite (grup A, B, C,
G) prin inhi, ,area florei de asociatie, mai ales a streptococilor orali, inclusiv streptococii
~-hemo1itici din grupul S. 11lilleri.
Incubarea culturilor 0 facem uzual aerob peste noapte la 3TC cu prelungire
pana la 48 ore daca la prima citire a placilor lipsesc colonii1e ~-hemolitice caracteristice.
Procentul depistarii S. pyogenes cre~te de la 63% in culturile aerobe la 98% in cele
anaerobe prin manifestarea ~-hemolizei i la coloniile tulpinilor care produc numai
streptolizina oxigenlabilii. Dar aceasta exigenta depa~e~te posibilitatile multor laboratoare
~i 0 inlocuim cu insamantarea mediului prin intepare la sfiir~itul fiecarui cadran de
epUlzare.
Citirea culturilor. Examineaza atent placile in lumina reflectata ~iprin transparentii
unl1arind coloniile mici (0,5-1,0 mm diametru), transparente sau opace, inconjurate cu
ozona larga de ~-hemoliza. La examen sub lupa suprafata coloniilor poate fi neregulat

213
mamelonata (colonii matt), lucioasa ~i cu reliefacuminat (colonii glossy) sau mocoida.
Majoritatea coloniilor sunt opace ~i ansa Ie mobilizeaza intregi. In absenta coloniilor
j3-hemolitice, la prima sau la a doua citire a culturilor, urmarim cu atentie hemoliza din
jurul punctelor de intepare a mediului. Daca la acest nivel constatam hemoliza 13,se
impune repicarea culturii din profunzimea intepaturii cu incubare anaeroba a subculturii.
Poate fi 0 tulpina de S. pyogenes produci'itoare exclusiv de streptolizina O.

12.2.3.5. Identificare. Verifica, prin frotiu colorat Gram, daca aceste colonii sunt
de streptococi pentru a Ie introduce in algoritmul de identificare: diferentierea prezumtiva
in streptococi grup A sau non-grup Aplin testul de sensibilitate la bacitraeina, identificarea
antigenica a grupului, identificarea biochimica a unor streptococi non-grup A.

12.2.3.6. Antibiograma. Streptococcus pyogenes ~i-a mentinut nealterata marea


sensibilitate la penicilina. A dobandit insa , in proporj:ii variate, rezistenta la alte antibiotiee
eventual indicate in terapia streptococeiilor (e.g., eritromicina). Antibiograma poate fi
tacuta pentru supravegherea epidemiologica a rezistentei la aceste antibiotice, dar
rezultatele, raman de uz intel11 pentru laborator (vezi Cap. 21, 22) ~i sunt comunicate
numai la eerere expresa (e.g., pacientii sensibilizati la peniciline).
12.2.3.7. Comunicarea rezultatelorrecomandam sa fie tacuta in urmi'itorii termeni:
"Prezent streptococ j3-hemolitic prezumtiv grup A sau non-grup A", daca
identificarea s-a bazat numai pe testul de sensibilitate la bacitracina; indicarea grupului
antigenic, daca identificarea a fost definitiva. Precizarea semicantitativa a cre~terii con-
form tabelului 5-1. La cre~tere mai mica de 1+ mentioneaza numarul coloniilor 13-hemo-
litice izolate. Daci'i prelevarea, conservarea ~i insamantarea probelor au fost coreete ~i
tara imbogatirea probei, in general, mai putin de 20 colonii 13-hemolitice per placa
semnifica simplu portaj (e.g., anginii virala sau eu altii etiologie la un purtiitor siiniitos de
streptococ j3-hemolitic). In eaz de dubiu, leueograma ~i fOl111Ulaleucocitarii alaturi de
viteza de sedimentare a hematiilor aduc argumente suplimentare pentru etiologia virala
sau streptococieii.
"Absenti streptococi j3-hemolitici". Contraindiciim fonnulari altemative ca: "Flora
normala", pentru ea nu avem argumente peliinente in acest sens, sau "Culturii mixtii tara
semnificatie etiologica", pentru ca, tara indicatie expresii privind alti patogeni, nu i-am
investigat ca atare.
Izolarea predominantii ~i in cantitate mare de Staphylococcus aureus, Klebsiella
pneUlnoniae sau alte Enterobacteriaceae ori Pseudomonas aeruginosa reflectii disbioza
oro-faringianii a unor pacienti spitalizati, eventual sub antibioticoterapie, ori varstnici ~i
nu are in mod necesar semnificatie clinici'i. Sunt comunicate numai la cerere expresa
pentru pacienti sub terapie imunosupresiva, chimioterapie anticanceroasa sau cu hemopatii
maligne. In caz de complicatii infectioase grave ar putea ajuta c1inicianul pentru initierea
terapiei antimicrobiene de prima intentie.

12.2.3.8. Rolullaboratorului in controlul e~ecurilor penicilinoterapiei. Uneori


sub penicilinoterapie simptomatologia faringitelor diagnosticate streptococice persistii.
Suprainfectia streptococicii a faringitelor virale este cunoscutii. In aceste cazuri e~ecul

214
este numai aparent: continua simptomatologia bolii virale neinfluentata de penicilina.
Examenul unui nou tampon faringian asociat cu leueograma ~i formula leueoeitara
elueideaza situatia.
Este insa posibil ea sub penieilinoterapie S. pyogenes sa persiste in exudatul
faringian. E~eeul poate avea eel putin 4 cauze:
(a) Infectie la paeient purtator faringian de baeterii producatoare de (}-laetamaza,
cum sunt tulpini de stafiloeoei, de Moraxella catarrhalis, de Haemophilus spp. sau de
Bacteroides spp. De~i explieatia a fost contestata, se impune tirajul izolatelor asoeiate
din oro-faringe pentru produeerea de (}-laetamaza (vezi Cap. 23).
(b) Infectie eu tulpini de S. pyogenes tolerante la penieilina. Asemenea testare
depa~e~te posibilitatile activitatii de rutina.
(c) Reinfeetia eu S. pyogenes in mediul familial sau in eoleetivitati inehise eu
eonditii de promiseuitate. Se impune investigatia epidemiologiea.
(d) Tratament exclusiv eu penieilina Via eopii.

12.2.4. Confirmarea bacteriologica a anginei difterice

Difteria a devenit 0 boala reemergenta. De aeeea fieeare laborator trebuie sa fie


familiarizat ~i pregatit pentru aeest diagnostic. Examenul bacteriologic eonfim1a sau
infirma diagnostieul de difterie intr-un interval de timp in care, de eele mai multe ori,
aetul terapeutic este deja eonsumat pe baza prezumtiei cliniee.
Prelevam 3 tampoane de la lil11itafalsei membrane ~iun tampon nazofaringian pe
eale nazala.
Microscopia directa. Efectueaza, extemporaneu, eu pril11ultampon faringian un
frotiu ~i, fixat prin ealdura, expediaza-l imediat la laborator impreuna eu eelelalte
tampaane. Unnare~te pe frotiul ealm"at Gram sau, mai bine, eu albastru de l11etilenalcalin
Laff1er ori prin metoda Albert prezenta baeililor eorinefonni eu granule l11etaeromatiee
polm"e. Absenta lor nu exclude diagnostieul de difterie.
Cultivarea. Epuizeaza al 2-lea tampon faringian pe a plaea eu mediu Tinsdale,
seleetiv prin te1urit de potasiu, ~ipe 0 placa eu agar-sange. Inteparea repetata a mediului
Tinsdale, eu ansa sau firul de insamantare, in lungul striurilor de epuizare favorizeaza
aparitia haloului earaeteristic eoloniilor de baeil difterie.
Insamanteaza al 3-lea tampon faringian pe 0 panta eu ser de bou eoagulat Laff1er,
apoi imerseaza tamponul, pentru imbogatire, intr-un tub eu mediul O.S.T.
Il11erseaza pentru imbogatire in l11ediulO.S.T. ~i tampanul nazofaringian.
Ineubeaza taate eulturile, aerob, peste noapte la 37C.
Citirea culturilor. Examineaza pe rand:
Cre~terea pe mediul Laff1er. De~i neseleetiv, acest mediu favorizeaza ere~terea
baeililor difteriei in eea 14 ore eu morfo logia lor earaeteristiea. Flora de asoeiatie eultiva
mai tardiv. Um1are~te, pe frotiul eolorat Gram sau printr-o eoloratie speciala pentru
granulele metaeromatiee, prezenta in eultura a baeililor corineformi eu granule
metaeromatiee caraeteristiee.
Cre~terea pe agar-sange da 0 dubla informatie: (a) Controleaza ealitatea prele-
vatului. Pe mediul selectiv poate sa nu apara eultura. Daea lipse~te eultura ~ipe plaea eu

215
agar-sange, prelevatul a fost necorespunzator. (b) Unele angine streptococice pot simula
difteria sau S. pyogenes se asociaza bacilului difteric in unele cazuri grave de difterie .
Placa cu mediul Tinsdale pentru observarea coloniilor caracteristicc bacililor
difterici: negre cu halou bruno Sunt posibile doua eventualitati:
a) Coloniile caracteristice lipsesc: continua incubarea placii cu 0 noua citire dupa
alte 24 de ore ~i epuizeaza pe cate 0 placa cu me diu Tinsdale tamponul faringian ~ipe cel
nazo-faringian imbogatite in mediul O.S.T.
b) Coloniile caracteristice sunt prezente:
- Efectueaza un froiu colmat Gram pentru a elimina eventualitatea unor specii de
stafilococ care pot fonna pe mediile cu telurit de potasiu colonii asemanatoare celor ale
bacililor difterici.
- Repica pe mediul Loffler 0 colonie caracteristica, verificata microscopic pentru
a obtine cultura pura necesara identificarii.
Bacilii difterici apar cu morfologia caracteristica numai in cultura pe me diu I Loffler
ori in falsa membrana, conditiile in care au la dispozitie fosfati in cantitate suficienta
pentn.! f01111areaincluziunilor de volutina.
Cand cultura pe mediul de izolare este prea densa, pentru purificare corecta
efectueaza 0 repicare suplimentarii pe 0 placii cu mediul Tinsdale sau cu agar-sange.
Identificarea. Verifica pe frotiu colorat Gram morfologia ~ipuritatea culturii, iar pe
frotiu colorat Albert prezenta incluziunilor de volutina pentru a introduce tulpina izolatii in
algoritmul de identificare: testele catalazei, nitratazei, ureazei, cistinazei, de fermentare a
glucozei, maltozei, zaharozei, dextrinei, glicogenuluiJamidonului (vezi Cap. 30).
Determinarea toxigenezei este cea care confinna sau infi1111ain final diagnosticul
de difterie. Efectueaza testul Eleck sau e)f.pediaza tulpina laboratorului de referinta pcnttLi
testare in vivo.

12.2.5. Candidoze

Diagnosticul margariteluluijugal, lingual sau faringian este mai ales microscopic.


Preleva cu tamponul din depozitul pseudo-membranos al leziunilor ~i efectueaza un
preparat umed montat in solutie 10% de KOH sau un frotiu colorat Gram. Prezenta in
cantitate enonna de levuri, mai ales sub forma de pseudohife, care denota cre~tere
submersa in epiteliul malpighian are valoare diagnostica. De~i nu este necesar, frecvent
se recurge la cultivarea probei pe mediul Sabouraud glucozat cu incubare peste noapte
la 30 sau 37C. Valoare diagnostica are numai izolarea predominanta ~i in cantitate
mare de Candida albicans, rar C. tropicalis, in concordanj:a cu rezultatele microscopici
directe. lzolarea unei specii de Candida tara confirmarea frotiului direct este
nesemnificativa.

12.2.6. Angina ~i stomatita Vincent

Diagnosticul acestor fODne rare de angina sau stomatita este esential microscopic:
prezenta pe frotiu colorat Gram a foarte numero~i bacili fusifoDni gram negativi ~i spi-
rochete in contextul unei reactii inflamatorii. Rezultatul poate fi comunicat imediat.

216
Cultivarea prelevatului pe agar-sange 0 facem nu pentru a confirma rezultatul
microscopiei directe (aceste specii anaerobe sunt foarte dificil de cultivat ~i necesita
timp indelungat), ci pentru a exclude posibilitatea infectiei cu Streptococcus pyogelles.

12.2.7. Faringite gonococice

Apar numai dupa raporturi sexuale aberante ~i evolueaza benign. lnvestigatia de


laborator 0 facem numai la cerere expresa. Microscopia directa este tara valoare din
cauza numeroaselor neisserii nepretentioase din microbiota oro-faringiana.
Epuizeaza extemporaneu tamponul faringian pe 0 placa cu agar Mueller-Hinton
imbogatit prin supliment HYL ~i selectiv prin colimicina ~i lincomicina (cca 3-7 IJ./mL)
ori cu mediul Thayer-Martin modificat selectiv prin adaos de vancomicina (3 IJ.g/mL),
colimicina (7,5 IJ.g/mL) ~i nistatina (12,5 U/mL). lncubeaza imediat cultura la 37C in
atmosfera cu 5% CO2, Daca se impune, tamponul poate fi expediat la laborator imersat
in mediul de transport Stuart pentru cultivarea in cel mai scurt timp. Amanunte privind
izolarea ~i identificarea gonococilor vezi in Cap. 15. Aici subliniem numai necesitatea
controlului microscopic al coloniilor oxidazo-pozitive inainte de purificarea culturii
necesara identificarii. Exigenta este impusa de prezenta in exsudatul faringian, in afara
de neisserii, ~i a unor bacili gram-negativi oxidazo-pozitivi.

12.2.8. Faringite determinate de Arcallobacteriu11l haemolyticum

Arcaobacterium haemolyticum poate cauza, mai frecvent la adulti tineri, faringite


acute cu angina, asemanatoare celor streptococice. Imbolm'ivirile, u~oare pana la severe,
se insotesc cu eruptie scarlatinifomla sau/~i cu adenita cervicalii la cca 50% din pacienti.
Epuizeaza tamponul faringian pe 0 placa cu agar-sange de berbee suplimentat eu
NaCl pana la concentratia finala de 3,5% (tinand cont de concentratia initiala a NaCI
din agarul baza). Insamanteaza cate 0 sh'ie de Staphylococcus epidermidis perpendicu-
lar pe striurile de epuizare a probei. Incubeaza cultura la 37C (cre~terea este stimulata
in atmosfera cu 5%CO,) pana la 48 ore cu 0 prima citire dupa 24 ore. Unnare~te coloniile
mici (~O, 75 mm diametru), rotunde, u~or reliefate, discret ~-hemolitice ~i cu hemoliza
sinergiea, mai larga, in veeinatatea striei de S. epidermidis. Pe agar cu sange de cal
~-hemoliza eoloniilor de A. haemolyticwn este mai bine exprimata. Specia nu cre~te pe
alte medii selective pentru S. pyoneges.
Identificarea preliminara, pe baza careia introducem izolatele in algoritmul de
identificare (vezi Cap. 30), include:
Microscopia coloniilor pe frotiu colorat Gram. A. haemolyticum in primele 18 ore
apare ca bacili gram-pozitivi, ocazional a~ezati in V, lipsiti de granule metacromatice.
Ulterior bacilii devin granulari ~i se segmenteaza in fomle cocoide neregulate .
Testul catalazei este negativ.
Inregistreazii ~i comunicii semicantitativ rezultatele izoliirii acestei specii (vezi
tabelul 5-1); fiind comensala oro- faringiana criteriului semnificatiei ei clinice este
cre~terea predominanta ~i in cantitate mare pe placa de izolare.

217
12.3. EXSUDATELE NAZAL SI NAZO-FARINGIAN

Examenul microbiologic al exsudatului nazal este indicat pentru: diagnosticul unar


viroze respiratorii (vezi Cap. 8); depistarea portajului de Staphylococcus aurells sau
Streptococcus pyogenes. Examenul microbiologic al exsudatului naso-faringian 11
efectuam pentru: diagnosticul tusei convulsive (vezi Capitolul 13); diagnosticul
infectiilor cu Mycoplasma pneunwniae ~i cu Chlamydia; diagnosticul virozelor
respiratorii (vezi CapitoluI8); depistarea portajului de S. pyogenes; depistarea portajului
de bacili difterici, meningococi, Bordetella pertussis; bacterii mai frecvent prezente la
acest nivel dedh in nas sau oro-faringe.

12.3.1. Prelevarea probelor

Exudatulnazo-faringian se preleva cu tamponul, eel mai u~or per-nazal. Se utilizeaza


tampon confeqionat pe aplicator de sanna crom-nichel de 20 em lungime ~i I mm diametrul.
Una din eXh"emitati este indoita, inmuiata in colodiu ~i infa~urata strans cu vata hidrofila
cu fibra lunga pentru a forma tamponul propriu-zis. Extremitatea libera este indoita in
bucla pentru a facilita manipularea. Se sterilizeaza la autoclav in tub 16/160 mm.
A~eaza pacientul pe scaun, cu fata spre sursa de lumina ~i ceafa sprijinita de perete
pentru imobilizarea capului. lntrodu bland tamponul printr-o nara, in lungul plan~eului
nazal, pana atinge peretele posterior al nazo-faringelui. Lasa tamponul pe loc cateva
secunde, apoi rote~te-l u~or pentru a-I incarca cu exsudat ~iretrage-l. Cantitatea de prelevat
cre~te daca retragi tamponul putin ~i il reinseri in aceea~i pozitie: prima tamponare
stimuleaza secretia de mucus nazo-faringian.
Cand um1arim, la copilul mic, patogeni din caile respiratorii inferioare, este precaut
a stimula mai intai un acces de tuse prin prelevarea unui tampon faringian. Exsudatul
proiectat din caile respiratorii inferioare va fi retinut in nazo-faringe util pentru prelevare
prin tampon nazo-faringian sau aspiratie nazo-faringiana. ,
Aspiratul nazo-faringian pe cale per-nazala este indicat la sugari. II realizam cu 0
sonda N6laton introdusa printr-o nara ~i adaptata la 0 seringa etan~a de 20 mL.
Tamponulnazal. Sterge, pe rand, vestibulul foselor nazale cu tamponul de uz gene-
ral umectat cu solutie salina izotona. Prelevarile nazale pentru izolare de vims sunt descrise
in Cap. 8.

12.3.2. Depistarea purtatorilor siiniito~i

Depistarea portajului de germeni patogeni in caile respiratorii superioare este.


indicata in scopuri epidemiologice (e.g., stabilirea sursei de infectie, carantinarea
purtatorilor fata de colectivitatile cu rise).

12.3.2.1. Depistarea portajului nazal de Staphylococcus aureus este solicitata


de epidemiolog numai in focare demonstrate de stafilococii nosocomiale. In alte
imprejurari este inutil pentru ca rata portajului nazal de S. GlU-eLtS este de cca 30% in
colectivitatea generala ~i poate ajunge la 70% la personalul de spital.
Prelevam un tampon nazal de la personalul ~i pacientii vizati de ancheta epi-
demiologica. Epuizeaza tamponul pe 0 placa cu agar-sange sau, mai bine, pe 0 placa cu
mediu selectiv: mediul Chapman (agar nutritiv hiperclorurat, suplimentat cu manitol ~i

218
ro~;ufenol) sau mediul Baird-Parker (agarnutritiv cu clorurii de litiu, telurit de potasiu, glicinii,
piruvat de sodiu ~i giilbenu~ de ou). Incubeazii culturile peste noapte la 37C. Umlare~te
aparitia coloniilor caracteristice: mari, cu diametrul de 1-2 mm, rotunde, S, bombate .
Pe agar-sange sunt eel mai frecvent hemolitice.
Pe mediul Chapman ga1bene, cu ha10u galben .
Pe mediul Baird-Parker, negre cu halou clar.
Verifica puritatea izolatoarelor de pe mediile selective. Daca pe aceste medii nu au
apiirut colonii caracteristice, prelunge~te incubatia panii la 48 ore. Identificarea izolatelor
pe agar-sange trebuie completatii prin microscopie pe frotiu colorat Gram ;;i testul
coagulazei.
Cand probele nu pot fi examinate imediat, expediaza tampoanele la laborator
imersate in mediul Chapman lichid in care sunt ~i preincubate la 37C pentru imbogatire
inainte de epuizarea pe mediul de izolare.
In focarul epidemic, prelevarea tampoanelor nazale trebuie repetatii de 1-2 ori la
intervale de 0 siiptiimanii pentru a diferentia portajul de durata de eel tranzitoriu.
Dupii identificare, expediazii culturile pure de S. aureus laboratorului de referinta
pentru tiparea fagicii.

12.3.2.2. Depistarea purtatorilor de Streptococcus pyogenes este indicata pentru


investigatii in focare epidemice ~ipentru carantinarea purtiitorilor sanato~i fata de salile
de operatie, colectivitiiti pediatrice etc. Purtiitorii nazali au potential epidemic mai mare
dedit cei faringieni.
Prelevii un tampon naza1 ~i unul faringian sau nazo-faringian. Procedeaza la
imbogatirea probelor, cultivarea lor ~i identificarea izolatelor cum a fost precizat la
12.2.3.4.-12.2.3.5.

12.3.2.3. Depistarea purtatorilor de baeili difterici. Dupa generalizarea vacci-


niirii antidifterice, purtiitorii de bacili difterici deveniserii rari, iar investigarea lor viza
mai mult carantinarea fatii de colectivitiitile pediatrice. a datii cu reemergenta bolii,
vigilenta laboratoarelor pentru depistarea portajului de bacili difterici trebuie sa creasca
din eel putin doua motive: (a) inmultirea posibilii a focarelor de difterie; (b) existenla
unor grupe semnificative de populatie receptiva la boala prin absenta unor programe
de revaccinare in conditiile intreruperii multi ani a circulatiei tulpinilor toxigene de
C. diphtheriae.
Prelevii un tampon nazo-faringian ~i unul faringian. Expediazii-le la laborator
imersate in mediul de imbogiitire a.S.T. ~iprocedeaza in continuare conform precizarilor
de la 12.2.4.

12.3.2.4. Depistarea purtatorilor de meningoeoei. Rata portajului nazo- faringian


al meningococilor variaza intre 5 ~i 30% in colectivitatea general a ~ipoate cre~te pana la
70-80% in conjuncturii epidemica. Raportul cost-beneficiu nujustifica aceasta examinare
pentru chimioprofilaxia infectiilor meningococice din focare familiale sau colectivitiiti
inchise.
Epuizeazii tamponul nazo-faringian, prelevat per-nazal, pe 0 placa cu agar-sange.
agar-sange ;;ocolat sau mediul HYL selective prin adaos de lincomicina ;;i colimicinii

219
(revezi 12.2.7). Incubeaza culturile la 37C in atmosfera cu 5-10% CO" cu citirea placilor
dupa 24 ~i 48 ore. Unnare~te pentru indentificare coloniile oxidazopozitive.
Cand probele nu sunt examinate imediat, tampoanele trebuie imersate in mediul
Amies sau Stuart pentru transportul catre laborator.

12.3.2.5. Depistarea portajului de Haemophilus influenzae serotipul b, invaziv.


Epuizeaza tamponul nazo-faringian pe 0 placa cu agar-sfmge ~ocolat cu infuzie de cord
bovin sau pe 0 pladi cu agar Levinthal selective prin bacitracina (300 ).lg/mL). Incubeaza
cultura peste noapte la 37C in atmosfera cu 5-10% CO2, Urmare~te coloniile sugestive
(cenu~ii, semiopace, netede, u~or convexe, cu margini regulate, dar cu tendinta la confluare
dind sunt capsulate; pe agar Levinthal, In iluminare oblica, sunt iridescente) pentru
purificarea culturii. Simpla identificare lara serotipare nu are valoare din cauza ratei
fomie mari a portajului diferitelor serotipuri noninvazive sau a tulpinilor necapsulate.

12.4. SINUZITE

12.4.1. Spectrul etiologic

Toate conditiile care depIima transportul muco-ciliar al epiteliului respirator ~i/sau


obstrueaza orificiile sinuzale (viroze respiratorii, reactii alergice, deviatii ale septului
nazal ~ipolipi nazali) favorizeaza colonizarea ~isuprainfectia bacteriana a acestor cavitati.
Infectii dentare mixte, dominate de bacterii anaerobe, pot afecta, prin contiguitate,
sinusurile maxilare.
Infectia bacteriana accentueaza edemul mucoasei, impiedica ~i mai mult drenajul
cavitatilor ~i evolueaza catre supuratie, care se poate propaga spre cavitatile vecine cu
consecinte din cele mai grave: etmoidita-celulita periorbitara; sinuzite-meningite, abcese
epidurale, subdurale, cerebrale, osteomielita craniana.
Etiologia sinuzitelor acute este dominata de Streptococcus pnewfloniae, S pyogenes
~i Haemophilus influenzae (mai frecvent serovaruIi non-b). Peptostreptococii, alte bacterii
anaerobe nesporulate, neisserii sau Moraxella catarrhalis sunt organisme rar implicate,
iar Staphylococcus aureus ~i bacili gram-negativi aerobi sau facultativ anaerobi ~ cel
mai rar. Mycoplasma pneumoniae poate fi ocazional implicata.
In sinuzitele cronice infectia este uzual mixta cu participarea bacteriilor anaerobe
nesporulate.

12.4.2. Prelevarea probelor

Examenul puroiului sinuzal este, in general, rar solicitat din cauza metodelor agresive
de prelevare a probelor.
Exsudatul aspirat prin punctia aseptica a sinusurilor afectate of era cele mai bune
~anse de stabilire corecta a diagnosticului etiologic. Specialistul otorinolaringolog este
eel care apreciaza oportunitatea examenului microbiologic ~i efectueaza prelevarea dupa
o ingrijita antiseptizare a mucoasei nazale la nivelul punqiei.

220
Fluidul de spaUitura a sinusurilor,efectuata de specialist in scop de drenaj al cavitatii
infectate, poate fi colectat intr-o tavita renal a plasata sub narile pacientului. Produsul
trebuie atent examinat macroscopic pentru prelevarea;;i examinarea numai a p0l1iunilor
purulente.
Exsudatul nazo-faringian prelevat din vecinatatea orificiilor sinuzale este rara
valoare din cauza contaminarii masive cu microbiota indigena. Rezultatele, in~elatoare,
nu justifica efortul examinarii, iar pacietul beneficiaza mai mult prin tratament empiric
de prima inten!ie bazat pe condi!ia clinico-epidemiologica a suferintei.

12.4.3. Examinarea probelor

1) Efectueaza din proba ~i examineaza un frotiu colorat Gram.


2) Epuizeaza dite 0 ansa din restul probei pe 0 placa cu agar-sange ~ocolat pentru
incubare aeroba in ah110sfera cu 5% COo ~i pe 0 placa cu agar-sange anaerob.
3) Incubeaza placile la 37C ~i urri1are~te aparitia culturii pana la 48 ore.
Controleaza prin frotiu colorat Gram coloniile aparute pentru controlul puritatii
culturii ~i introducerea izolatelor in algoritmul de identificare, inc1usiv efectuarea
antibiogramei.
Staphylococcus aureus izolat din probe de spalatura sinuzala nu are in mod necesar
sernnifica!ie clinica: poate proveni din narile unui purtator. Semnifica!ia clinica 0 atesta
numai confruntarea dintre cultura ~i microscopia directa: prezen!a a minimum 10
stafilococi in medie/campuri cu eel putin 3 polimorfonucoeare fiecare ~i examinate cu
marire de 1000X.

12.5.0TITE

Etiologia ~i patogenia otitelor medii ~i a otitelor externe sunt complet diferite.

12.5.1. Otitele medii

Aceste boli, mai frecvente la copii in varsta de la 3 luni la 3 ani, sunt favorizate de
infeqii primare cu virusuri respiratorii sau Mycoplasma pneumoniae care, prin congestia
~i edemul trompei lui Eustachio, blocheaza drenajul norn1al al cavita!ii ~i eliminarea
contaminantilor ocazionali proveni!i din microbiota nazo-faringelui. Dintre ace~ti
contaminanti se recruteaza bacteriile care colonizeaza ~i infecteaza urechea medie de
unde infectia se poate extinde la antrul mastoidian ~i, prin contiguitate, la meninge.
Principalii agenti etiologici ai otitelor medii sunt: Streptococcus pneumoniae.
S. pyogenes ~i Haemophilus injluenzae (indiferent de serovar ~ichiar tulpini necapsulate).
Mai rar sunt in cauza Enterobacterioaceae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus allrells
sau/~i bacterii anaerobe.
Pacientii acuza durere pulsatila in urechea afectata, hipoacuzie, ameteli, greata,
varsaturi. Obiectiv se constata: febra, timpan congestiv, ingro~at, bombat, cu reperele
~terse ~i mobilitatea redusa sau absenta. Timpanul se poate fistuliza cu aparitia unei
scurgeri purulent-sanguinolente in conductul auditiv extern.

221
Examenul bacteriologic este solicitat de specialistul otolaringolog numai cfmd
apreciaza necesara 0 terapie antimicrobiana mai tintita dedit cea bazata pe rationamentul
clinico-epidemio 10gi c.
Prelevatul de electie pentru examenul bacteriologic este exsudatul aspirat prin
timpanocenteza. Altemativ se poate recurge la insamantarea extemporanee cu lanteta de
punctie. In caz de perforare spontana a timpanului, exam inam exsudatul prelevat pe un
fin tampon steril ghidat prin speculum auricular ditre fistula. Tamponul trebuie expediat
laboratorului imersat in mediu de transport. Examenul exsudatului nazo- faringian este
lipsit de valoare din cauza motivelor precizate la 12.4.2.
Examenul de laborator include:
I) Microscopia directa pe frotiu colorat Gram din aspiratul prin timpano-centeza.
2) Cultivarea probelor epuizate de 0 placa cu agar-sange ~ocolat, pentru incubarea
aeroba in atmosfera cu 5% CO?, ~i pe una cu agar-sange anaerob.
3) Umlarirea pana la 48 ore a culturilor incubate la 37C
4) Microscopia culturii pentru verificarea puritatii, introducerea izolatelor in
algoritmul de identificare ~i antibiograma.

12.5.2. Otitele externe

Patogenetic au particularitati proprii infectiilor tegumentului. Le tratam insa in


acest capitol tocmai pentru a sublinia distinctia care trebuie facuta intre tamponul cu
exsudatul leziunii tegumentare a conductului auditiv extern ~i tamponul cu exsudat
prelevat din fistula timpanului.
Mai frecvent sunt cauzate de pseudomonade, mai ales Pseudomonas aeruginosa
~i alte bacterii aerobe in conditii favorizante cum sunt: patrunderea apei in conductul
auditiv extern cu macerarea tegumentului la acest nivel (otita inotatorilor) sau diabetul
(otite exteme maligne). Oeazional poate fi in cauza Staphylococcus aureus. Baeteriile
anaerobe nu sunt implicate in aceste infectii superficiale.
Pacientii au scurgere otica sero-sanguinolenta sau purulenta din conductul auditiv
extem ~i nu din urechea medie.
Exsudatul din conductul auditiv extern, prelevat pe tampon, trebuie expediat in
mediu de transport.
Microscopia este lara valoare din cauza contaminantilor abundenti.
Epuizeaza tamponul pe 0 placa cu agar-sange ~i pe una cu mediu selectiv lactozat
pentru bacili gram-negativi (e.g., agar Mac Conkey) cu incubare aeroba la 37C timp de
48 ore. Citirea ~i interpretarea culturilor, dupa 24 ~i 48 ore de incubare, trebuie tacute
atent ~i prudent pentru ca bacteria infectanta poate fi dominata de contaminanti din
eonduetul auditiv extern, cum sunt stafiloeoci coagulazo-negativi ~i baeili difterimorfi.

12.6. LARINGITE SI EPIGLOTITE

12.6.1. Laringite

Laringitele acute compliea freevent raceala eomuna, sindrom cauzat de variate


virusuri respiratOlii (vezi tabelul 8-2). Moraxella catarrhalis este izolata ell frecventa
semnificativ ere scuta din nazofaringele adultilor eu laringita acuta; de uude concluzia ca

222
poate fi implicata in etiologia sindromului. Pacientii sunt ragu~iti ~i au tuse latratoare.
Infectia se poate extinde ~i in etajul subglotic. La copii sub varsta de 3 ani complicatia
este mai severa ~i frecvent evolueaza cu sindromul de crup dominat prin semne de
obstructie respiratorie acuta. Bacilul difteric este astazi 0 cauza exceptional a a crupului.
Mycobacterium tuberculosis poate infecta laringele pe cale bronhogena sau
hematogena ~i determina laringite cronice, care, cand evolueaza cu ulceratii ~i mase
exofitice, pot impune diferentierea de carcinomullaringian.
Uzual, examenul bacteriologic al exsudatului faringian Ul111are~tenumai excluderea
difteriei ca 0 cauza a crupului la copii. La pacienti cu laringite cronice, specialistul
otorinolaringolog poate solicita depistarea bacililor tuberculozei in probe laringiene (vezi
Cap. 13).

12.6.2. Epiglotita acuta

Epiglotita acuta este 0 forma severa a crupului detenninata la copii intre 2 ~i 4 ani
varsta aproape exc1usiv de Haemophilus injluenzae serovar b. La adult sindromul este
rar, fiind determinat de streptococi, stafilocici, pneumococi sau Haemophilus paraphro-
philus. Pacientii au febra, toxemie sistemica, dureri faringiene, disfagie, dispnee pana la
asfixie.
Este interzisa prelevarea probelor pe tampon de la nivelul epiglotei inflamate pentru
ca poate determina spasm glotic cu asfixie, iar izolarea H. injluenzae de la acest nivelnu
este un criteriu suficient de semnificatie c1inica.
Se pot practica hemoculturi, care sunt pozitive cu H. i1!fluenzae la cca 50% din
copiii investigati. Gravitatea sindromului impune insa terapie antimicrobiana de prima
intentie bazata pe criteriile c1inico-epidemiologice.
13. DIAGNOSTICUL DE LAB ORATOR AL INFECTIILOR
TRACTUSULUI RESPIRATOR INFERIOR
(DUMITRU BUIUC)

13.1.INTRODUCERE 13.3.4. Fluidifierea probelor


13.1.1. Conditia anatomo-histologicii a 13.3.5. Cultivarea probeIor
tractusului respirator inferior (TRI) lzolarea semicantitativii
13.1.2. Conditia microbiologicii a TRI Izolarea cantitativii
13.1.3. Entitiiti nosologice ~i patogenetice ale 13.3.6. Identificarea izolatelor
infectiilor tractusului respirator inferior (lTRI) 13.3.7. Metode neconventionale de izolare
13.1.4. Spectrul etilogic al ITRI 13.3.8. Comunicarea rezultatelor
13.1.5. Prelevate patologice ~i criterii de 13.4. EXAMENUL MICROBIOLOGIC IN
semnificatie clinicii a izolatelor SUSPICIUNEA TUBERCULOZEI
13.2. PRELEVAREA, TRANSPORTUL $1 PULMONARE
CONSERVAREAPROBELOR
13.4.1. Microscopia
13.2.1. Preleviiri curente
13.4.2. Decontaminarea, omogenizarea ~i con-
Sputa
centrarea probelor
Aspiratul hipofaringian 13.4.3. Izolarea
Tamponul sau aspiratul nazo-faringian 13.5. CONDUITA IN SUSPICIUNEA ITRI CU
Aspiratul gastric a jeull BACTERII ANAEROBE
Hemoculturi
13.6. EXAMENUL DE LAB ORATOR IN
Aspiratul pleural SINDROMUL DE TUSE CONVULSIVA
Aspiratul prin orificiul de traheostomie
13. 7. EXAMENUL DE LABORATOR IN
13.2.2. Preleviiri invazive
DIAGNOSTICUL LEGIONELOZEI
Aspiratul transtraheal
13.7.1. Microscopia directii
Prelevate bronhoscopice
13.7.2. Izolarea
Aspiratul pulmonar transtoracic
13.7.3. Serodiagnosticul
Biopsia pulmonarii
13.3. EXAMENUL DE RUTINA. AL EXSU- 13.8. EXAMENUL MICROBIOLOGIC IN
DATELOR TRI SUSPICIUNEA ACTINOMICOZEI
PULMONARE
13.3.1. Examenul macroscopic
13.3.2. Spiilarea sputei 13.8.1. Microscopia
13.8.2. Izolarea
13.3.3. Microscopia
Examenul frotiului colorat Gram: 13.9. EXAMENUL PROBELOR IN SUSPI-
Tirajul citologic de calitate al sputei CIUNEA MICOZELOR PULMONARE
Bacteriscopia caJ1titativii 13.10. INVESTIGATIA ETIOLOGICA IN
Bacterioscopia prelevatelor neconta- PNEUMONIILE INTERSTITIALE
minate 13.10.1. Mycoplasma pneumoniae
Examenul frotiului colorat Giemsa: 13.10.2. Chlamidii
Celule inflamatorii 13.10.3. Virusuri
Celule de exfoliere a epiteliului respira- 13.11. DEPISTAREA VIERMILOR PARAZITI
tor CU CICLU PULMONAR

13.1. INTRODUCERE

Infeqiile tractusului respirator inferior (ITRI) sunt cauzate de foarte variate


microorganisme ~i, prin gravitate a lor, multe impun tratament antimicrobian. Desigur.
circumstantele c1inice (simptamatologie, varsta, bali de fond), paraclinice (examen ra-

224
diologic, leucograma, viteza de sedimentare a hematiilor etc.) ~iepidemiologice (infeqii
domiciliare sau de spital, sporadice sau epidemice) pot orienta diagnosticul catre un
grup mai larg sau mai restrans de agenti etiologici. Dar terapia antimicrobiana orientata
numai prin criteriile c1inico-epidemiologice nu poate acoperi intregul spectru etiologic
al acestor infectii, iar bacteriile mai frecvent implicate in etiologia ITRI au dobandit, in
proporrii variate, rezistenta la antibioticele de electie. De aici interesul pentru diagnosticul
etiologic al ITRl, operatie frecvent dificila ;;i complexa.

13.1.1. Conditia anatomo-histologidi a tractusului respirator inferior


(TRI)

Tractusul respirator inferior se extinde din etajul subglotic al laringelui pana la


alveolele pulmonare via trahee, bronhiile lobare, segmentale, lobulare, bronhiole.
Un epiteliu fin, la limita sau sub limita rezolutiei microscopului optic, separat de
endoteliul capilar numai printr-o membrana bazalii fina, acopera peretii alveolari.
Mucoasa traheo-bron~ica este acoperita cu un epiteliu colunmar pseudostratifieat
ciliat. Toate celulele sunt in contact cu membrana bazala, dar unele, mai putin dezvoltate,
celulele bazale, nu au contact cu fata luminala a mucoasei; altele, mai dezvoltate, celulele
stratului mijlociu, se apropie de fata luminala :tara a 0 atinge insa. In fine, fala luminala
a mucoasei este bordata de celulele cilindrice complet de dezvoltate, unele ciliate, allele
secretoare de mucus, celulele caliciforme. Presiunea reciprodi dintre celule detem1ina
fonna neregulata a lor ~i dispunerea nuc1eilor in trei straturi: bazal, median ~i luminal.
Glande sero-mucoase diseminate contribuie, alaturi de celulele calicifonne, la constituirea
mucusului de acoperire. Corionul contine fonnatiuni limfoide necapsulate.
Vasele limfatice intrapulmonare, grupate cu bronhiile, m1erele ~ivenele pulmonare,
sunt lipsite de valvule ~i dreneaza limfa catre ganglionii hilario Intre reteaua limfatiea
pulmonara ~i plexurile limfatice pleurale se stabile~te un numar redus de anastomoze in
tesutul conectiv interlobular. Numai aceste anastomoze au valvule eu desehiderea spre
pleura pennitand drenarea retrograda a limfei pulmonare in caz de intrerupere a scurgelii
acesteia spre ganglionii tributari hilari (ca in cazul unor procese inflamatorii: adenite,
limfangite etc.).
La pacienti cu procese inflamatorii cronice sau cu neoplaziiepiteliul respirator
traheobron~ic sufera 0 metaplazie scuamoasa mai mult sau mai putin extinsa.

13.1.2. Conditia microbioJogica a TRI

De~i supus frecvent contaminarii microbiene, prin pulberi ~i aerosoli inhalati, etajul
infraglotic al tractusului respirator ramane necolonizat gratie unor efieiente bariere
antimicrobiene:
Filtrarea aerodinamicii ~i sedimentarea (fig. 13-1) .
Transportul muco-ciliar (fig. 13-2) accelerat prm viteza ventilatiei pulmonare ~i
reflexul de tuse. Eficienta transportului muco-ciliar este remarcabila: in decurs de 0 ora
sunt eliminate peste 90% din bacteriile trasor depuse pe mucoasa bron~ica. Doar la cca

225
Parhcule
impactah? Macrofaq
antrenal
Direcha tTansportului
fll trate de , mucociliar

perii narilor) 1S..umOS1!"


P,articule ~

""";""'''''' ':i/'''''':'.'(W;:;~\
Particule de10-15.um 9f
. , . ,th,-W;'i\{in
;,'\'t,,((~M\,\.',
I ".- \.
Impacteaza pe

cornetele
~i nazofaringe --V
nazale4V\, Celula caliciform a
(secretoare de mucus)
\~~~.:
~~.~,," ,', ;'":'

Particule de -10).J.rn CELULE EPITELIALE:


:;s~~~l]j
trahee
impacteaza In () matura ciliara

Particule de - 5 prn 0
inlermediara
sedimenteaza in ()
bronhii ~i bronhiole

Particule < S.urn III tanara


ajung In alveole ()

Fig. 13-1. Filtrarea aerodinamidi ~i sedi- Fig. 13-2. Transportul mueo-eiJiar din eiiile respira-
mentarea sunt barierele primare antimiero- torii funetioneazii euplat eu barierele antimierobiene
biene ale diilor respiratorii ehimidi ~i imunologicii

20% din persoanele nonnale au fost depistate pe mucoasa traheo-bronhica bacterii


nepatogene in numar redus .
Transportul alveolo-bron:jic. Particulele de dimensiuni sub 5 flm depa~esc
mecanismul de filtrare aerodinamidi ~i sedimentare, dar, ajunse in alveolele pulmonare,
sunt fagocitate de macrofage, care antrenate in stratul de mucus bron~iolar intra in
continuare sub inciden!a transportului muco-ciliar (fig. 13-3) .
Drenajul limfatic :ji sanguin al microorganismelor care au eludat fagocitarea de
catre macrofagele alveolare.

Fig. 13-3. Transportul alveolo-bron~ic functioneazii euplat eu bariel'ele


antimierobiene eelularii ~i ehimieii ~i este eoneetat eu trans-
portul muco-eiJiar

226
0 complexa bariera chimica supeljieiala: mucus, lizozim, lactoferina, surfac-
tant, cxj-antitripsina, interferoni .
Bariera imunologica fonnata din IgA secretoare, IgE-mastocite, limfocite ~i
plasmocite din corionul mucoasei traheo-bron~ice; IgG ~i IgM circulante care amorseaza
sistemul complement ~i faciliteaza fagocitoza.

13.1.3. EntWiti nosologice ~i patogenetice ale ITRI

lnfectiile etajului infraglotic al tractusului respirator reunesc variate entitati clinice


~i etio-patogenetice - traheobron~ite, bron~iolite, alveolite, pneumonii interstitiale,
supuratii - cu evolutie acuta sau cronica. Unele sunt infectii primare, altele sunt secundare
unor deficiente locale sau generale ale apararii antiinfeqioase. In conditii care deprima
eliminarea microbiana din tractusul respirator (infectii primare ~ialergii, bron~ita cronica.
bron~iectazii, mucoviscidoza, corpi straini, tumori, traheostomie, inhalare de gaze iritante)
microorganisme din micro biota oro- faringiana sau din mediul extern persista pe mucoasa
traheo-bron~ica ~ipot initia colonizari abortive sau de durata, variate ca spectru ~iamploare
in raport cu impOlianta conditiei care le-a general. Acele microorganisme dotate eu
suficiente capacitati patogene, pentru a rupe noul echilibru instabil cu gazda, initiaza
infectii secundare ale TRl.
Primare sau secundare, ITRI sunt eel mai frecvent aerogene, mai rar sunt localizari
in cadrul unor infeqii bacteriemice (septicemii, bruceloza etc.). Alveolitele acute
evolueaza initial bacteriemic ~ipot genera complicatii prin propagare limfatidi anterograda
(mediastinite) sau retrograda (pleurezii).

13.1.4. Spectrul etiologic alITRI

o etiologiesuspicionata prin circumstantele clinico-epidemiologiee (tabelulI3-1)


poate orienta eficient investigatia microbiologica.

Tabelul13-1

Spectrul etiologic allTRI

Tipul Domiciliare
Primare
pneumococi,
influenzae
Circumstante
netipabil, BGN aerobi2)
c1inico-
epidemiologice
Haemophilus
Staphylococcus
Pneumococi,
Virusuri Toxoplasma
aureus pneumoniae
streptococi
I), Mycoplasma grup B, 0, G,
Microorganisme implicate
achomatis, Mvcobacterium
ei bacili coli-
Congenitale
formi, Treponema tuberculosis
pallidum, Listeria nlOno(~Vfogenes,

227
Tabe11l113-1 (continuare)

Tipul Circumstante clinico- ., .. i

.,. "
1I1lect1el epl'd emlO
. 'I oglce
. Mlcroorgamsme
- llnpllcate
Pneumonii Pana la 3 luni C. trachomatis, v. citomegalic, Pnellmocystis carinii.
Ureaplasma lIrealyticllm, streptococi grup B, Escher-
ichia coli, S. allreus
.3 luni - 5 ani Virusuri I), pneumococi, H. influen~ae serovar b
.5-35 ani M. pneumoniae, virusuri I), pneumococi, Chlamydia
pnellmoniae
Peste 35 ani Pneumococi, S. aurellS, bacterii anaerobe,il, Legionella
pnellll1ophila, H. influenwe i

Suprainfeqia gripei Pneumococi, S. aureus, Streptococcus pyogenes, I

H. influenzae, Neisseria meninr;itidis


Nosocomiale BGN aerobi-I, S. allrells. pneumococi. bacterii
anaerobeJ1, L. pneulI1ophila, L. micdadei
De aspiratie
Domiciliare Bacterii anaerobeJ)
Nosocomiale Mai frecvent infectii mixte cu bacterii anaerobeJI, BGN
aerobi11, S. allrells'
Traheostomie BGN aerobi- , S. aurells
Gazda compromisa
Hipogammaglobulinemie Pneumococi, H. influen~ae serovar b
Deficit al imunitatii ce- Fungi (P. carinii. levuri, zigomicete, Aspergillus spp),
lulare virusuri (CMV. varice1a-zosteI', herpes simplex.
rujeolic), baci1ii tuberculozei ~i micobacterii conditionat
patogene, Nocardia spp., legionele, Toxoplasma
r;ondii, Stronr;iloides stercoralis
Neutropenie BGN aerobi"l, Asper.r;illus spp., pneumococi
Epidemice V. gripa1, M. pneumoniae, L. pneumophila,
C. pneumoniae, C. psittaci
Cronice Fungi patogeni4i, micobacterii, bacterii anaerobe'1
Fibroza chistica Bacilul piocianic, S. aureus, H. inflllen~ae
Necrozante Bacterii anaerobeJi, bacilul piocianic, Klebsiella spp.,
S. allreus, micobacterii
Abcese Bacterii anaerobe3), mai I'ar: S. au reus, Klebsiella spp ..
micobacterii, fungi patogeni41
Empieme Para- sau metapneumonice
Copii/tineri S. aureus, pneumococi, H. influenz.ae, S. pyogenes,
bacterii anaerobeJ)
Adulti Bacterii anaerobe'i, pneumococi, S. aureus.
BGN aerobi1)
Plagi toracice penetrante S. aureus, BGN aerobi-I
Abcese subdiafragmatice Infectie mixta: bacterii anaerobeJ) (inclusiv Bacteroides
fi'agilis) + BGN aerobi1)
IIVirusuri:
Copii pfll1a la 5 ani: v. respirator sincitia1, adenovirus, v. paragripale, v. gripa1 A, B, v. variccla-
zoster, v. mjeolic, v. mbeolic, v. Epstein-Ban, enterovims .
Adulti': v. gripal A, B, v. paragripale, v. varicela-zoster, v. Epstein-Ban, adenovirus.
2) BGN aerobi: bacili gram-negativi aerobi (Klebsiella spp., Escherichia coli, Proteus spp .. bacilu!
piocianic).
3) Bacterii anaerobe principale In ITRI: peptostreptococi, Prevotella melaninogenica. Fusobacte-
rillmnllcleattlm; mai rar (in infectii domiciliare) Actinomyces spp.
4) Fungi patogeni: Blastomyces dennatitidis, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Cryp-
tococcus neofonnans

228
13.1.5. Prelevate patologiee ~i eriterii de semnifieatie clinidi a izolatelor

Pentru diagnosticul microbiologic al ITRI se pot examina:


Prelevate contaminate cu microbiota tractusului respirator superior: sputa, tam-
pon nazo-faringian, aspirate nazo-faringian, hipofaringian, prin tub endotraheal, prin
bronhoscopie simpUi. Aspiratul prin canula de traheostomie este contaminat mai frecvent
cu microorganisme din mediul extern .
Prelevate care :}unteaza contaminarea oro:faringiana: aspirat transtraheal,
aspirat pulmonar transtoracic, aspirat bronhoscopic prin cateter protejat cu caJ1Ule
telescopate, biopsie transbron~ica, biopsie pulmonara cu torace deschis; aspirat pleural,
hemoculturi.
Prelevatele cu contaminare oro-faringiana pun dificile probleme de interpretare a
semnificatiei izolatelor: daca organismele conditionat patogene depistate au semnificatie
clinica sau de contaminanti, daca un patogen pretentios nu este mascat prin cre~terea
contaminantilor, daca patogenul bronho-pulmonar a fost sau nu antrenat in expectoratie.
Patogenii primari, care includ majoritatea virusurilor, Mycoplasma pneul71011iac,
Chlamydia spp .. Coxiella burnetii. Legiollella pneumophila, bacilii tuberculozei, fungii
patogeni ~.a., au semnificatie clinic a indiferent de prelevatul 1n care sunt depistati.
Dilema semnificatiei organismelor conditionat patogene depistate in prelevate cu
contaminare oro-faringiana a fost rezolvata in buna parte prin confruntarea cantitativa
intre citobacterioscopie ~i sputocultura. Detenninari repetate in prelevate care ~unteaza
contaminarea oro-faringiana atesta ca bacteria infectata realizeaza in focarul bronho-
pulmonar concentratii de cel putin 105-6 UFC/mL exsudat sau gram de tesut. Deoarece
bacteriile din saliva depa~esc cu 2-3 log acest prag de semnificatie, cuantificarea devine
operanta numai sub controlul realului produs patologic prin triajul citologic de calitate
~i decontaminarea probelor. Spalarea sputei intens muco-purulente reduce contaminarea
oro-faringiana cu cca 3 log, tara a influenta concentratia bacteriei infectante prins a in
trama fibrinoasa a probei, dar reducerea contaminantilor ajunge la cel mult 2 log in
probele cu mai putin real produs patologic. Deci clinic semnificative apar numai bacteriile
conditionat patogene izolate in cantitati de cel putin 105-6 UFC/mL (sputocultura canti-
tativa) sau sunt izolate predominant ~i in cantitate mare (sputocultura semicantitativa) ~i
se regasesc semnificativ asociate celulelor inflamatorii pe frotiul Gram din sputa.
In diagnosticul pneumoniilor, simpla sputocultura necorelata cu microscopia directa
are capacitate predictiva derizorie de numai 0,06, comparativ cu cea de 0,91 a cultivarii
aspirate lor transtraheale. Din contra, corelarea cantitativa dintre sputocultura ~i citobac-
terioscopia probelor examinate amelioreaza semnificativ performantele examinarii.

13.2. PRELEVAREA, TRANSPORTUL SI CONSERVAREA PROBELOR

13.2.1. Prelevari eurente, aeeesibile oricarui serviciu implieat


in diagnosticul ~i terapia ITRI
1) Sputa
lndicatii: Prelevatul uzual pentru majoritatea ITRI.
Prelevare: Probe de calitate corespunzatoare obtinem la intern area in spital, de la
pacienti cooperanti, prin tuse spontana, profunda ~i supravegheata. Pacientul trebuie sa

229
inteleaga diferenta dintre "a expectora" ~i a "a scuipa". Periajul simplu al dintilor, clatirea
energica a gurii ~i gargara cu apa sunt de dorit inaintea prelevarii. Daci.i proba apare
constituita in principal din saliva, trebuie imediat insistat pentro prelevarea unei noi
probe corespunzatoare calitativ. In infectiile acute 0 proba mucopmulenta cu volum de
1-2 mL este suficienta.
La tu~itorii cronici, pentro diagnosticu1 tuberculozei sau al infeqiilor fungice
bronho-pulmonare, cantitatea de sputa examinata trebuie sa fie mai mare: e.g., toata
sputa de 1a expectoratia matinal a sau cea expectorata in interval de 1-2 ore. Nu examina
insa niciodata probe sumate din 24 ore pentro ca multiplicarea microorganismelor de
contaminare falsifica rezultatele: rezultate fals pozitive prin inmultirea fungilor saprofiti
contaminati; rezultate fals negative prin omorarea micobacteriilor in procedura mai
drastica de decontaminare impusa de asemenea probe.
La pacientii cu tuse slab productiva se pot obtine mai u~or probe de expectoratie
matinala. Stimularea expectoratiei prin inhalare de aerosoli calzi cu solutie salina 10%
~iglicerinata 15% ofera, de multe ori, probe cito1ogice nesatisIa.catoare pentro diagnosticul
infectiilor bronho-pu1monare acute, dar utile pentro diagnosticul tuberculozei.
Transport, conservare. Probele, prelevate intr-un recipient steril (preferabil din
plastic) de cca 100 mL, cu gura larga ~icapac ennetic, sunt etichetate ~i expediate imediat
laboratorolui pentru a fiexaminate in interval de cel mult 0 ora de la prelevare. Modalitati
optime de conservare a probelor nu sunt. Refrigerarea la 4C previne multiplicarea
contaminanti10r, conserva unii patogeni, dar scade pana la anu1are izolarea altora cum
sunt Haemophilus influenzae sau Neisseria meningitidis. Uti1izarea unui mediu de
transport perturbii raporturi1e bacteriilor cu reperele citologice ale exsudatului, esentiale
pentro aprecierea calitatii probei ~i interpretarea rezu1tate1or sputoculturii.
Criterii de caUtate:
Raportul dintre realul produs patologic, obiectivat prin numarol celulelor
inflamatorii, prezenta fibrinei, ~i contaminarea oro-faringiana, obiectivata prin numarol
celulelor epiteliale scuamoase, permite stabilirea unor praguri de calitate acceptata a
probelor. Pragul cito10gic de calitate a probelor de sputa se refera in particular la diag-
nosticul infectiilor determinate de organisme conditionat patogene rezidente din micro-
biota oro-faringiana: numai in probe cu realul produs patologic predominant poate fi
obiectivata semnificatia clinica a acestor microorganisme. Desigur, pentro depistarea
patogenilor care nu fac parte din microbiota oro-faringiana pot fi examinate probe de
sputa ~i sub pragul cito1ogic stabi1it, dar riscul rezultate10rt fa1s negative cre~te odata cu
sciiderea realului produs pato10gic din proM, aspect asupra caroia clinicianul trebuie
atentionat.
Receptia probei in interval de maximum 0 ora dupa prelevare, pentro a incepe
examinarea inainte de inmultirea necontrolata a microorganismelor contaminate.
Prelevarea probei inaintea terapiei antimicrobiene.
Din nefericire, prea frecvent primim spre examinare probe de "sputa" de la pacienti
neinstroctati, nesupravegheati ~i care au ramas peste noapte la capul bolnavului. Ori
to ate acestea inseamna timp ~i materiale cheltuite pentro un rezultat nerelevant clinic
sau chiar periculos pentro pacient.

230

-
Sputa este putin adecvata pentru depis-
tarea corecta a:
- Pneumocystis carinii, Aspergillus spp.,
zigomicete, Candida albicans din cauza
mobilizarii insuficienteprin expectoratie a
acestorpatogeni din focarul bronho-pulmonar.
- Legionella din cauza antagonizarii prin ==
Vacuum

microbiota oro-faringiana, de unde rata mai - ,,-


redusa a depistarii prin sputocultura decat prin
microscopie directa cu coloratii specifice:
- inutilizabila pentru diagnosticul infec-
tiilor cu bacterii anaerobe din cauza contami-
narii masive, constante a probelor cu aceste
bacterii, care face inoperant criteriul izoIarii
cantitative;
- Candida albicans din cauza conta- Fig. 13-4. Dispozitiv pentru aspiratie hipofa-
minarii masive a probelor la pacienti cu dis- ringianii
bioza oro-faringiana.
2) Aspiratul hipofaringian. Aspiratia hipofaringiana este indicata la sugari. 0
sonda N6laton sterila, conectata la un sistem de aspiratie, se introduce in hipofaringe cat
mai aproape de orificiul glotic (fig. 13-4). Accesul de tuse declan~at de contactul
hipofaringelui cu sonda mobilizeaza exsudatul bronho-pulmonar, care este aspirat in
colectorul plasat intre sonda ~i sistemul de vid.
Conditia microbiologica, controlul de calitate, avantajele ~idezavantajele aspiratului
hipofaringian sunt similare cu ale sputei.
3) Tamponul sau aspiratul nazo-faringian sunt indicare numai pentru diagnosticul
ITRI cu patogeni primari, organisme care nu apartin microbiotei oro-faringiene. Aspiratia
poate fi tacuta cu dispozitivul din figura 13-4 sau cu sonda N6laton adaptata la 0 seringa
etan~a.
4) Aspiratul gastric a jeun este indicat perntru depistarea bacililor tuberculozei,
mai ales la sugari ~i copilul mic. Poate fi utilla adulti care nu expectoreaza, dar proportia
rezultatelor fals negative cre~te din cauza aciditatii gastrice mai mari. Probele trebuie
neutralizate imediat dupa prelevare cu solutie 10% de bicarbonat de sodiu in prezenta
unui indicator de pH.
5) Hemoculturile efectuate sistematic in primele zile de evolutie a unei alveolite
acute sunt pozitive la cca 30% din pacientii pneumonici.
6) Aspiratul pleural este indicat in toate cazmile de empiem.
7) Aspirtul prin orificiul de traheostomie. Traheostomia ~i canularea induc ~i
intretin un proces inflamator peste care se suprapune colonizarea precoce traheo-
bron~ica cu microorganisme aspirate din mediul extern ca urmare a ~untarii tiltrului
aerodinamic al cailor respiratorii superioare ~i perturbarii transpOliului muco-ciliar.
Interpretarea examenului microbiologic al unui asemenea prelevat este dificila ~iexpune
la erori mari.

231
13.2.2. Prelevari prin tehnici agresive

Aceste prelevari: sunt de eompetenta unor cadre cu inalta calificare; impun


riscuri pentru pacient; sunt irepetabile; ofera de eele mai multe ori probe cu volum
foarte redus.
De aceea trebuie planificate in conditii care sa incline balanta risc-beneficiu in
favoarea beneficiului pentru pacient: pacientul sa poata suporta procedura; tratamentul
antimicrobian anterior este 0 contraindicatie relativa a procedurii (cre~te proponia
rezultatelor fals negative); laboratorul, competent pentru urmarirea patogenilor
suspectati prin ipoteza clinica, trebuie expres avizat asupra solicitarii examenului.
1) Aspiratul transtraheal (ATT)
Aspiratia transtraheala este 0 metoda invaziva care ~unteaza contaminarea
orofaringiana ~i of era rapid 0 proM de exsudat din ambele arii pulmonare.
lndicatii: a) Cand sputa sau alte prelevate conventionale nu dau rezultate
concludente fie din cauza eontaminarii oro-faringiene (cazul bacteriilor anaerobe,
C. albicans), fie din cauza antagonizarii organismului infectant prin contaminantii
orofaringieni (cazullegionele1or ~.a.). b) Cand gravitatea bolii justifica riscul unei prelevari
invazive. c) Pentru a exclude infectia bacteriana in pneumopatii cu multiple optiuni
diagnostice (neoplasm, embolii pulmonare etc.). Astfel beneficiul ATT poate depa~i riscul
pentru paeient in investigarea pneumopatiilor neerozante eu multiple microabeese intr-un
segment sau lob pulmonar. In pneumonii domiciliare ATT apare rar justificata. La paci enti
cu expectoratie putrida, pneumonii de aspiratie, riscul procedurii trebuie apreciat fata de
eficienta estimatii a medicatiei antimicrobiene empirice contra presupu~ilor patogeni
anaerobi.
Contraindicatii: diateze hemoragice, hipoxemie severa, hemoptizii ~itusea rebela,
necontrolata. Procedura este in general contraindicata la copii din cauza calibrului redus
al eailor respiratorii ~i dificultatilor de cooperare.
Examenele de laborator prealabile trebuie sa ateste indispensabil: numarul pla-
ehetelor sanguine mai mare de 100 000/mm3, timpul de protrombina de cel putin 60% in
raport eu martorul, alti parametri de sangerare normali, p 02 mai mare de 60 mmHg sub
oxigen are suplimentara.
Prelevarea este de competenta specialistului pneumolog.
Complica,tii: a) Ale punc!iei: sangerare, lezarea peretelui posterior al traheei, emfi-
zem subcutanat, mediastinal sau pneumotorax, abcese cutanate sau paratraheale. b) Ale
plasarii cateterului: tuse severa paroxisticii ~i hipoxie sau hemoptizie. e) Vasovagale:
aritmii, ischemie miocardica, stop cardiac, hipotensiune.
Transportul probei trebuie asigurat imediat la laboratorul in prealabil avertizat.
Acuratetea. Concordanta izolatelor, exclusive sau predominante, din ATT eu cele
din hemoculturile pacien!ilor pneumonici a validat valoarea aeestui prelevat. Baeteriile
infectante sunt prezentate aproape intotdeauna in concentratii de cel putin 106 UFC/mL.
Rezultatele fals negative au 0 rata apreciata la 1%. Apar eand prelevatul nu contine
mucus ~i celule inflamatorii, cand pacientul a fost sub tratament antimicrobian sau daea
bronhiile implicate sunt obstruate.
La pacientii eu legioneloza, din eauza secre!iilor bron~ice reduse, este frecvent
necesara instilarea de solu!ie salina pentru a obtine aspirat. Aceasta poate dilua produsul

232
patologic. Ca urmare, la pacientii cu boala legionarilor, de$i rata izolarii bacteriei din
ATT este mai mare dedit din sputa, rata depistarii microscopice directe prin coloratie
Dieterle sau imunofluorescenta este mai mare in sputa dedit in ATT.
Rezultatele fals pozitive au 0 rata apreciata la 20%. Apar cand pacientul aspira
secretii oro-faringiene in cursul procedurii, daca accesul de tuse proiecteaza varful
cateterului in oro-faringe (riscul este redus la cateterele din polivinil, mai rigide dedit
cele din polietilena) sau la pacientii cu colonizari de fond ale tractusului respirator infe-
rior (bron$ite cronice, bron$iectazii, neoplasme pulmonare).
Bacterii de colonizare a tractusului respirator inferior sunt depistate la majoritatea
pacientilor cu bron$ite cronice $i la bron$iectazici in cantitati care pot depa$i 106 UFC/mL.
In general sunt bacterii aerobe $i facultativ anaerobe, dar la bron~iectazici apar adesea
bacterii anaerobe. Bacteriile de colonizare pot include pneumococi $i hemofili a ci'iror
prezentii trebuie interpretata prudent.
o procedura sensibila $i inofensiva pentru depistarea contaminarii ATT cu secre!ii
oro-faringiene este nebulizarea oro-faringelui pacientilor cu 3 mL solutie 1% albastru de
metilen inaintea aspiratiei. Cu ochiul liber se depisteazii UID1ede colorant panii la 2 j.lg/mL,
corespunz3.ior unei dilutii de 1:5000 a solutiei trasor in secretii purulente sau, in termeni
de contaminare oro-faringiana, contaminari de - 5.104 UFC ale ATT. Metoda este utilii
pentru diferentierea celulelor epiteliale scuamoase metaplazice traheobron~ice de celulele
epiteliale scuamoase normale ale contaminarii oro-far:ngiene.
2) Prelevate bronhoscopice
Preleviirile bronhoscopice, disconfortante pentru pacient, implicii interventia unui
cadru special calificat. Includ: a) aspiratia prin canalul bronhoscopului cu sau rara irigare
bron~icii, periaj bron~ic cu perie neprotejatii: b) periaj endobron~ic cu perie protejata in
sistem de canule telescopate cu dop distal din polietilenglicol, care evita contaminarea
oro- faringianii; c) biopsia transbron~icii.
lndicatii: Pentru investigarea ITRI pre1evarea bronhoscopicii apare indicatii numai
cand infectia este una din ipotezele serioase de diagnostic al pneumopatiei insuficient
argumentata prin tehnicile clasice (absenta expectoratiei sau rezultate irelevante ale
sputoculturii), iar 0 prelevare bron~icii se impune ~i din alte ratiuni diagnostice:
a) prelevari prin periaj sau, la nevoie, prin biopsie transbron$ica de la nivelul unor
leziuni depistate;
b) suspiciunea persistentii de tuberculozii, legionelozii, infeqie fungica sau cu
citomegalovirus neconfinnatii de explorarile conventionale;
c) depistarea unor patogeni oportuni~ti la pacienti pneumonici imunocompromi~i:
Pneumocystis carinii, Nocardia spp. Semnificatia clinica a unor levuri (Candida spp.)
sau bacterii care colonizeaza uzual oro-faringele poate fi stabilita numai in prelevate
obtinute prin dispozitive protejate de contaminarea oro-faringianii sau cand microscopia
confinna pe sectiuni histologice corelatia microorganismului GU focarul inflamator
(biopsie transbron$ica).
Prelevarile prin dispozitive neprotejate de contaminarea oro-faringiana au prea
putine avantaje fata de sputa, doar e~antionaj mai tintit pentru examen citologic $i
ameliorarea depistarii un or patogeni ca P. carin ii, Nocardia sau fungi patogeni.

233
Contraindicatii. De~i bronhoscopia este privita cao tehnica de investigare mai
putin invaziva, are urmatoarele contraindicatii relative: boala cardiovasculara severa,
insuficienta respiratorie severa, hipertensiune pulmonara, uremie, diateza hemoragidi
(sangerari spontane, trombocitopenie refractara la transfuzia de trombocite). Bronhoscopia
poate fi tentata numai la pacienti cu minimum 20 000 trombocite/nuu3, iar daca este vizata
biopsia transbron~ica numarul minim de trombocite trebuie sa fie 50 000-100 000/mm3.
Tehnica. Insistamnumai asupra acelor aspecte implicate in ameliorarea eficientei
examenului microbiologic: efectuarea bronhoscopiei intr-o pozitie a pacientului care
sa reduca scurgerea secretiilor bucale in caile respiratorii inferioare (pozitia ~ezand sau
decubit lateral cu capul decliv); limitarea volumului de anestezic ~i administrarea lui
prinnebulizare pentru a evita diluarea probei.
Odata bronhoscopul directionat spre leziune, cateterul, care protejeaza peri a ata~ata
la 0 sarma retractabila, este inserat ~i impins prin canalul intern pana forteaza dopul de
polietilenglicol. Acesta este netoxic ~i se solva rapid pe suprafata mucoasei. Sub control
vizual peria este scoasa 1-2 cm ~i introdusa direct in exsudatulleziunii, apoi retrasa in
cateter ~i tot dispozitivul este retras prin canalul intern al bronhoscopului. Exteriorul
cateterului este spalat cu alcool ~i uscat, iar peria, de pe care s-a retras cateterul, este
separata aseptic, plasata intr-un flacon cu 1 mL solutie Ringer lactozata ~i imediat
transportata la laborator pentru insamantare cantitativa in interval de maximum doua
ore. Prelevatul este suficient atat pentru examen microbiologic, cat ~i citologic.
Complicatii: febra, bacteriemie, noi infiltrate pulmonare sunt raportate cu frecventa
variata, in general redusa. Scaderea cu 10-20 mmHg a pO, arterial este posibila ~i pune
probleme la pacientii hipoxici. Dupa biopsia transbron~ica- pot sa apara pneumotorax ;;i
hemoptizie la cca 8%, respectiv 7% din pacienti.
Acuratetea. La examinarea prelevatelor bronhoscopice mai frecventa este problema
rezultatelor fals pozitive decat a celor fals negative. Utilizarea dispozitivelor de prevenire
a contaminarii oro-faringiene reduce proportia rezultatelor fals pozitive. Efectul
antimicrobian al anestezicului a fost exagerat: este practic nul daca probele sunt
insamantate la interval de doua ore de la prelevare. Eventualele rezultate fals negative
datorate diluarii patogenului pot fi minimizate prin reducerea volumului soluTiei de
anestezic ~i administrarea ei prin nebulizare. La gazda imunocompromisa biopsia
transbron~ica depisteaza corect patogenul pulmonar in medie la 50% din pacienTi cu
valori extreme intre 26 ~i 76%,0 acuratete diagnostica superioara periajului endobron~ic
~i spalaturii bronho-alveolare. Asocierea biopsiei transbron~ice cu periajul amelioreaza
eficienta investigatiei.
3) Aspiratul pulmonar transtoracic
Asp irati a transtoracica prin ac ofera, pentru examenul citologic ~i microbiologic,
probe necontaminate direct din parenchimul pulmonai.
Indicatii: a) pneumopatii cu leziuni nodulare suspect maligne in care infectia este
una din ipotezele diagnostice: b) infectii pneumonice ale copilului, care nu expectoreaza
~i la care aspiratia transtraheala este riscanta; c) infectii pneumonice neobi~nuite ale
adultului sau la pacienti imunocompromi~i.
Contraindicatii. Majore: boala pulmonara buloasa, diateze hemoragice ireductibile,
leziuni vasculare, respiratie asistata mecanic. Relative: leziuni vecine cordului ~i marilor
vase, hipertensiune pulmonara, tuse necontrolabila, hipoxemie, chist hidatic pulmonar.

234
Tehnica este rezervata pneumologilor experimentati, in consecinta nu insistam
asupra amanuntelor privind executia. Proba trebuie examinata imediat de catre laboratorul
preavizat; se poate rezuma la cateva picaturi, ca atare decizia microscopie (citologie,
colorarii microbiologice) versus culturi pentru microorganismele incluse in ipotezele
diagnostice poate fi arbitrara.
Complicatii: Pneumotorax la 20~30% din punqionati, hemoptizie la 3-10% din
pacienti (senmalate ~i cazuri mortal e), rar embolie gazoasa.
Acuratetea. Aspiratul transtoracic a precizat etiologia pneumpatiilor la 40-60%
din copiii investigati in acest mod, dar proportia rezultatelor fals negative nu se cunoa~te
pentru ca in aceste studii restul copiilor au ramas cu diagnosticul neprecizat, tara
investigatE pentru virusuri sau micoplasme. La adulti imuno-compromi~i, cu infiltrate
pulmonare focale sau difuze, patogenii pulmonari au fost depistari in aspiratul pulmonar
in proportii de la 53 la 82%: fungi oportuni~ti, nocardii, micobacterii, Legionella, P carinii.
4) Biopsia pulmonara
Biopsia pulmonara transtoracica prin ac este tot mai mult abandonata in favoarea
biopsiei transbron~ice sau a biopsiei pulmonare deschise prin toracotomie.
Biopsia pulmonara deschisa ofera, sub control vizual ~itactil, celmai reprezentativ
prelevat in cantitati suficiente pentru un exam en complet histopatologic ~i microbio-
logic. La necesitate pot fi prelevate multiple biopsii din situsuri anatomice diferite. Mai
frecvent, in pneumopatii difuze, se practica prin toracotomie anterioara limitata in al 4-lea
spatiu intercostal. La pacienti cu stare clinica relativ buna, toracotomia posterolateral a
pennite biopsiere pulmonara, pleurala, peribron~ica, hilara ~i de ganglioni mediastinali.
Indicatia principala prive~te diagnosticul infecriei pulmonare la pacienti imunocom-
promi~i. Dezavantajele includ necesitatea pregatirii preoperatorii, anesteziei generale,
ingrij irilor postoperatorii, costul. Incidenta complicatiilor este redusa: pneumotorax
intarziat, hemoragii. Rata deceselor este sub 1%.
In infec!iile pulmonare ale pacienrilor imunocompromi~i proportia depistarii agen-
tului etiologic (bacterii ~i fungi oportuni~ti, actinomicete, micobacterii, Legionella,
P carinii, virusuri) variaza intre 55 ~i91%, superioara depistarii in biopsiile transbron~ice.

13.3. EXAMENUL DE RUTINA.. AL EXSUDATELOR


TRACTUSULUI RESPIRATOR INFERIOR

Acest examen vizeaza in primul rand sputa din ITRI bacteriene acute detem1inate
de patogeni comuni, pneumococi, H. injluenzae, S. aureus, Moraxella catarrlzalis, bacili
gram-negativi aerobi ~.a., cu ~anse rezonabile de a depista ~i alte bacterii sau fungi cand
ace~tia sunt in cauza. Suspiciunea unei anumite etiologii trebuie expres comunicata
laboratorului deoarece poate impune alte medii de cultura ~i proceduri.

13.3.1. Examenul macroscopic


Sputa poate fi vascoasa, purulenta de culoare galbena, verzuie, ruginie sau cu urme
de sange.
Probele albe mucoide sau spumoase, gri mucoide sau spumoase, apoase (uneori cu
particule alimentare) sunt calitativ necorespunzatoare pentru diagnosticul infeqiilor non-
tuberculoase.

235
13.3.2. Spalarea sputei (revezi ~i 13.1.5.)

Probele de sputa mucopurulenta este indicat sa fie decontaminate prin spalare in


3 Mi succesive de solutie salina izotona. Spalarea dezagrega probele fluide, care nici nu
trebuie examinate in continuare fiind de calitate necorespunzatoare.
Toama perste proM, in recipientul de prelevare, 0 cantitate din fluidul de spalare
~i agita pentru separarea exsudatului bronhopulmonar de secretiile oro-faringiene.
Plaseaza pe fond negru doua cutii Petri cu diametrul de 8 cm ~i repartizeaza in
fiecare cca 20 mL fluid de spalare.
Rastoama proba prespalata in capacul primei cutii.
Preleva cu ansa sau, mai u~or, cu doua mici baghete din lemn portiuni purulente
din proM ~i Ie agita 15-20 secunde in fiecare din um1iitoarele doua bai de spalare.
Portiunile purulente din ultima baie de spalare servesc pentru microscopie ~i cultivare.
Mai economic, decontaminarea se poate face prin spalarea sputei mucopurulente
intr-o strecuratoare de ceai sub jet de apa. Lucreaza cu apa deionizata pentru a evita
prezenta de subtante antimicrobiene (e.g., elor).

13.3.3. Microscopia

Absoarbe pe un dreptunghi din hartie de filtru excesul de fluid de pe ciite un frag-


ment mucopurulent ~i etaleaza-l pe 3 lame de microscop in strat dit mai subtire ~i uni-
fom1 evWind dilacerarea exsudatului prin mi~cari de dute-vino ale ansei (v. fig. 13-5, C).
Dupa uscare, fixeaza doua frotiuri prin caldura ~i coloreaza-le:
primul Gram, pentru triajul citologic de calitate a probei ~i bacterioscopie;
al doilea Ziehl-Neelsen, pentru uDnarirea bacililor acidorezistenti. Infectii
bronhopulmonare acute pot surveni la tuberculo~i contagio~i inca nedepistati, situatie
tot mai frecventa.
Fixeaza al treilea frotiu timp de 3 minute cu alcool metilic in vederea colora!iei
Giemsa modificata pentru sputa (vezi Cap. 42). Pe acest frotiu pot fi uDnarite detalii
citologice ~i pot fi observati fungi eventual prezenti.
Desigur, etalarea expectoratiilor neomogenizate nu poate fi ideala, de aceea
preparatul microscopic trebuiue scrutat in mai multe zone, intai cu un obiectiv mic pentru
aprecieri globale privind distributia elementelor (celule, fibrin a, mucus), apoi cu un
obiectiv putemic pentru observarea detaliilor din zonele suspectate.

13.3.3.1. Examinarea frotiului colorat Gram


1) Triajul citologic de caUtate al sputei, aspiratului hipofaringian sau prelevatelor
bronhoscopice neprotejate de contaminare oro-faringiana. Scruteaza frotiul din proba
cu marire de 100 X. In zone bine etalate, cu celulele dispuse in monostrat (fig. 13-5)
determina pe 5-10 ciimpuri numarul mediu al celulelor inflamatorii (Cl) ~i al celulelor
epiteliale scuamoase (CES). Pe aceasta baza sunt propuse trei criterii de triaj calitativ
al sputelor pentru examenul bacteriologic: criteriul grupelor de calitate, al raportului
CI/CES ~i al scorului de calitate Q.

236
Fig. 13-5. Sputa: frotiuri colorate Gram ~i examinate cu marire de lOOX
A) ProM intens purulenta cu contaminare oro-faringiana minima: observati fibrina ~i mucina, mult peste 25
CI ~i numai 2 CES/dimp microscopic. B) Proba cu contaminare oro-faringiana masiva: fibrina absenta,
prezente mult peste 15 CES ~i peste 25 Cl/camp microscopic. C) Frotiu efectuat defectuos: exsudatul puru-
lent a fost dilacerat cu ansa, prin mi~cari de dute-vino, in fii~ii subtiri amestecate cu secretii de contaminare
oro-faringiana; pe un asemenea frotiu nu putem efectua corect bacterioscopia cantitativa (vezi textul). D)
Frotiu din sputa mucopurulenta cu insule compacte de CI diseminate pe fondul secretiilor oro-faringiene de
contaminare. In asemenea insule de CI putem efectua corect bacterioscopia cantitativa.

Grupele de caUtate citologica ale sputei (tabelul13-2) pot fi determinate rapid.


Criteriul este mai putin restrictiv dedit eelelalte, dar cu rezultate satismcatoare. Accepta
pentm examinare probele din gmpele 3-5, condi!ie in care sunt respinse ca nesatis-
mcatoare cca. 25% din probe. Reparti!ia
Tabel/1l 13-2
probelor intre aceste gmpe acceptate tine,
in afara respectarii normelor de prelevare, Grupele de calitate ale sputei in raport cu
~ide structura patologiei pulmonare inves- compozitia celulara pe frotiul colorat Gram
i
tigate. De la pacienti nonnoreactivi cu ><
Celuleintlamatorii
> 25
10-25
<10
25<>epiteliale
>Compozitia
<10
10-2525Celule celulara
25
I

infectii bronho-pulmonare
43 5
2
6 1 acute pana
Grupa la
scuamoase
70% din probe apartin grupei a 5-a de
cali tate, maximala. Dar majoritatea pro-
bel or de la pacienti cu metaplazie scua-
moasa a epiteliului respirator apartin
gmpei a 3-a.
Raportul celule injlamatorii/celule
epiteliale scuamoase mai mic de 5 indica

237
probe nesatismciitoare (nepurulente, cu contaminare orofaringiana masiva). Probele
purulente, in care predomina exsudatul bronho-pulmonar, realul produs patologic, au
raportulCI/CM mai mare de 5 ~i sunt cu atat mai purulente Cll cat raportul este mai mare.
Raportul CIICES permite aprecierea calitativa a probelor examinate eu diferite mariri,
incIusiv pe preparat umed .
Scorul de calitate Q propus de BARTLETT (1974) ~i de BARTLETT ~i colab.
(1979) este calculat conform indica!iilor din tabelul 13-3. E.g., 0 proM de sputa pentru
care examenul microscopic in aceste condi!ii atesta prezen!a fibrinei ~i in medie/camp
peste 25 CI ~i 7 CES are scorul "Q" = +3, rezuItat din (+2) + 0 + 1, in timp ce 0 proba Tara
fibrina eu peste 25 CI ~i peste 25 CES/camp realizeaza seorul "Q" = 0, rezultat din (+2)
+ (-2) + O.
Tabelul13-3

Calificativele pentru stabilirea scorului "Q" de calitate microscopic a a probelor destinate


examenului bacteriologic din prelevate contaminate cu micro biota indigenii a traiectelor
de eliminare
maJpighiene (CES)pentru
Sputa per AJte
Numar ceJuJe +1
campa+2 -1
a +2
proda-2
CaJificative
usea
0+1 pentru (Cl)
Calificative ceJuJe inflamatorii
celule
I

(miirire de

"Q ,,= suma algebrica a calificativeJor pentru CI ~i CES + J (calificativuJ acordat pentru prczenta
fibrinei in preJevatuJ examinat).

Sunt acceptate pentru baeterioscopie ~i sputocultura numai probele eu seorul "Q"


de eel pu!in + 1. Apliea!iile metodei se extind ~ila alte prelevate contaminate eu mierobiota
traieetelor de eliminare naturala.
Ramane la latitudinea fieearui laborator, in raport eu experienta dobandita, sa recurga
la una din eele trei metode de triaj eitologie ealifieativ. Dar eludarea triajului eitologie
de ealitate limiteaza pana la anulare valoarea sputoeulturii.
2) Bacterioscopia cantitativa. Seleeteaza ~i examineaza eumarire de I 000 X cat
mai multe campuri bine etalate ~i eorect diferen!iate tinctorial, cu cel putin 3 celule
inflamatorii ~i la distanta de cel putin 3 diametre, in oriee directie, de celule epiteliale
scuamoase. Pe asemenea eampuri determina numarulmediu de baeterii dintr-o categorie
microscopica/camp (baeterii pneumocoeoide, hemofiloide, neisserioide, bacili gram-
negativi etc.).
Asoeierea cu polimorfonucIearele a eel putin 10 baeterii din aeeea~i categorie
microseopiea are predictie pozitiva de peste 0,9 pentru izolarea in sputoeultura a unui
patogen din aceea~i categorie microscopica in cantitate de cel putin 106 UFC/mL
(fig. 13-6, 7, 8, 9). Ca atare am numit-o asociere semnificativa clinic.

238
Fig. 13-6. Sputa intens purulenta (calitatea citologica, in ordinea metodelor de apreciere citate In
text: categoria 5, raportul Cl/CES mai mare de 20, iar "Q" = +3). Bacterioscopie cantitativa pe frotiu
colorat Gram, marire de 1 000 X.
Obse/'va{i: peste 10 bacterii pneumococoide asociate cu 7 granulocite polimorfonucleare ~i fibrilla.
Sputocultura a izolat cantitativ peste 10" UFC Streptococcus pnellllloniae/mL iar semicantitativ predomi-
nant ~i In eantitate mare (4+) pneumoeoei.

Fig. 13-7. Sputa muco-purulenta (citologic, calitatea: categoria 5, raportul Cl/CES peste 20, iar
"Q" = + 3). Bacterioscopie cantitativa pe frotiu colorat Gram, marire de 1 000 X.
Obse/'va{i: sute de bacterii hemofiloide "In bane de pe~ti" asociate eu fibrina ~i 3 polimorfonucleare.
Sputocultura a izolat eantitativ peste 107 UFC Haemophilus influenzae/mL, iar semieantitativ predominant ~i
In cantitate mare (4+) aceea~i bacterie

Fig. 13-8. Sputa muco-purulenta (citologic, calitatea:


categoria 4, raportul CI/CES 20, iar "Q" = + 2). Frotiu
colorat Gram, bacterioscopie cantitativa pe 0 insula
compacta de CI, marire de 1000X
Ohse/'va{i: zeci de diplococi gram-negativi "In boabe de
cafea", majoritatea intracelulari, 4 polimorfonucleare ~i
fibrina. Sputocultura a izolat cantitativ peste 106 UFC
Moraxella cata/'/'halis ~i streptococi viridans/mL, iar
semicantitativ predominant (4+) M. catarrhalis ~istrepto-
coci viridans (3+).

239
Fig. 13-9. Sputa purulenta (citologic, calitatea:
categoria 5, CI/CES peste 20, iar "Q" = +3). Bacterio-
scopie cantitativa pe frotiu coloratGram, marire de
1000X.
Ohserva{ii: zeei de baeili gram-negativi mai freevent in
pereehi ~i eapsulati asoeia[i eu 6 polimorfonueleare ~i
fibrina. Sputoeultura a izolat eantitativ peste 10" UFC
Klehsiella pnezlIilOniae patogena pentru ~oareee!Il1L iar
semieantitativ predominant (4+) aeeea~i baeteric.

Comunicarea asocierii semnificative a unei bacterii cu celulele inflamatorii din


sputa orienteaza rapid tratamentul antimicrobian al pacientilor pneumonici.
~i in sputa, dar mai ales in fluidul de spalatura bron~ica, un reper calitativ impor-
tant, u~or de identificat, sunt celulele ciliate ale epiteliului respirator. Intr-un context
inflamator, bacteriile asociate lor capata semnificatie clinica (fig. 13-10), chiar in prezenla
unor celule epiteliale scuamoase, care pot fi de contaminare orofaringiana, dar ~i se
metaplaziere a epiteliului traheo-bron~ic (vezi mai jos).
Deoarece ATT poate vehicula ~i bacterii
de colonizare tranzitorie a tractusului respira-
tor inferior, bacterioscopia acestui prelevat
trebuie interpretata tot cantitativ.
3) Bacterioscopia prelevatelor necon-
taminate. Pe frotiurile din exsudat pleural, aspi-
rat pulmonar transtoracic sau probe biopsice,
prezenta bacteriilor este semnificativa ca atare
tara a fi necesare relatii cantitative.

13.3.3.2. Examinarea frotiului colorat


Giemsa: detalii citologice cu interes pentru
microbiolog.

Fig. 13-10. Spalatura bron~ica. Frotiu colorat Gram, marire de 1 OOOX,dar raporturilc de mariI'e
modificate pentru reproducere.
A)Celule ciliate de descuamare ~i celule inflamatorii. B) Ohserva{ii: zeci de bacterii pneumoeoeoidc ~i
hemofiloide asociate cu 3 celule mature de exfoliere din epiteliul respirator.

240
-------.
Celulele expectorate pot fi impar-

-
tite in celule inflamatorii ~i celule de
exfoliere (fig. 13-11). 10J.l~ .. c.~
..m .C .'
1) Celule inflamatorii. Obi~nuit
detenninam procentul acestor celule in d
expectoratii.
Polimorfonuclearele neutrafile e~ _..
(PMN) pot fi integre sau in diferite stadii
de dezintegrare. Celulele integre au . ....,~ .. . .. ..
-
- '" '.'
f~;~..;.c. .. ;g..,,-. ......
..-

nucleul segmentat in mai multi lobi ~i


citoplasma cu granulatii fine azurofile.
Se pot observa conglomerate de granu-
latii, granulatii toxice ~iparticule fagoci-
tate. Au dimensiunea cuprinsa intre 10-
15 ).lm, dar dimensiunile variaza de la un Fig. 13-11. Schematic, citologia exsudatelor
expectorate sau prelevate bronhoscopic:
preparat la altul ~i chiar pe acela~i prepa-
a) celulii ciliata; b) celulii cu ciliocitophtorie, ca In gripii:
rat, functie de procesele degenerative ~i c) celulii calicifonnii; d) celulii intennediara ~i e) celule
de uscare- fixare. Sunt prezente in numar bazale ale epiteliului respirator; f) granulocit poli-
mare in inflamatii de natura infectioasa morfonuclear; g) granulocit eozinofil: h) celula epi-
teliala scuamoasii; i) macrofag alveolar, Celllla care
(bacteriana, virala), dupa agresiuni fizice
poate sa aparii ~i binllcleatii.
sau chimice ale mucoasei bron~ice.
Expectoratia bron~iectazicilor cuprinde pana la 90% PMN, in special dezagregate. Sunt
frecvente in expectoratia astmaticilor, chiar in absenta infectiei.
Macrofagele ~i histiocitele sunt, dupa PMN, cele mai frecvente celule in exsudatele
cailor respiratorii inferioare. Au diametrul de 10-40 ).lm, eitoplasma multa, uneori
microvacuolara, alteori umpluta cu elemente fagocitate: granulatii brun-verzui (eel mai
frecvent "granule de praf', dar pot fi ~i celule eardiace eu pigment feric), lipide, hematii,
celule nucleate etc. Nucleul unie, oval, este situat excentric. Uneori au doi sau mai multi
nuclei.
Monocitele, precursori ai macrofagelor ~i histiocitelor, au talie mai mica, nucleul
invaginat, mai fin reticulat ~i citoplasma relativ clara.
Eozinofilele pot avea unele particularitati. Intr-o expectoratie proaspata, bine etalata,
apar ca celule cu volumul PMN, cu nucleul bi- sau trilobat ~i cu granulatii ro~ii, mari,
stralucitoare, clar diferentiate. Dar adesea eozinofilele, prinse in trama de mucus, au
morfologia mai putin bine precizata ~i nucleul miqorat, iar granulatiile pot fi mai putin
distincte, cu 0 nuanta spre albastru. Uneori trebuie sa ne limitam numai la celule sparte,
dar ale caror granulatii ro~ii stralucitoare permit 0 identificare. Cand ne rezumam numai
la examinarea frotiului colorat Gram, aceste granulatii eliberate prin liza eozinofilelor
pot fi confundate cu bacterii hemofiloide.
Prezenta eozinofilelor in exsudatele cailor respiratorii inferioare trebuie interpretata
prudent. In numar mic ele pot sa apara in orice proces inflamator acut sau, mai ales,
subacut. La copilul mic, cand inflamatii cronice ale tractusului respirator inferior
241

------=":;;.:.Jji' II-c!!!
.!!,'
.. R'1""-c~~-
"'''''"'',,,'"'_ ,,_II!", !!!ll!!!!!ll!!!!!ll!! ii""'='"---

determina un proces alergic post-infectios (bron~ita astmatiforma), prezenta eozinofilelor


pe fond de polinucleoza are valoare diagnostica deosebita. La pacienti cu bron$ita cronica
pot constitui pana la 5% din celulele expectorate. In schimb, la pacientii cu astm bron$ic
20-90% din celulele expectorate sunt eozinofile.
Limfocitele apar cu morfologia caracteristica (nuc1eu mare cu desen cromatinian
estompat ~i citoplasma redusa, slab bazofila) in numar destul de redus in expectoratii. Le
intalnim in expectoratia astmaticilor ~i a copiilor cu bron$ita astmatifoffi1a in contextul
inflamator dominat de PMN, eozinofile $i macrofage. Mai rar Ie intfllnim in comp licatiile
bacteriene ale virozel or pulmonare, dnd in contextul inflamiltor putem gasi $iplaslllocite,
celule ovale cu nucleul excentric, adesea cu cromatina dispusa "in spite de roaHI", uneori
picnotic, ~i citoplasma bazofiIa. Propoqia limfocitelor cre~te in expectoratia puseelor de
2cutizare ale bron~itei cronice. Limfocitele sunt frecvente in expectoratia bolnavilor de
tuberculoza pulmonara.
2) Celule de exfoliere a epiteliului respirator. In exsudatele tractusului respirator
inferior aI-ar celule din toate cele trei faze ale epiteliului respirator alaturi de care pot fi
identificate celule epiteliale degenerate ~icelule metaplazice. Indiferent de varsta, nucleii
celulelor epiteliului respirator au aspect asemanator: ovali sau rotunzi, mici; ocazional
aceste celule pot fi binucleate, cu structura cromatiniana U$or de identificat.
Celulele cilindrice ciliate au corpul alungit, cu polul bazalingustat ~i cel apical cu
platou de cili scurti, observati la 0 marire putemica. Nucleul oval este situat parabazaJ,
Exfoliaza frecvent in bron$ita cronic a (pana la 20% dill totalul celulelor exfoliate) ca
celule izolate, intacte sau degenerate. In astmul bron$ic apar sub fonna de mase celulare,
creola bodies. In infectiile cu Mycoplasma pneumoniae $i ill viroze respiratorii, in spe-
cial gripa, se exfoliaza celule degenerate, tara cili: ciliocitophtoria.
Celulele bazale sunt mici cu citoplasma redusa in raport cu volumulnucleului ~i,
la un examen superficial, pot fi confundate cu limfocitele. Diferentierea 0 face llucleul,
care la celulele bazale are structura cromatiniana mai putin densa. Celulele mediane sunt
mari, cu citoplasma mai bogata ~i aspect frecvent poligonal. Exfoliaza in numar mare ill
toate procesele de iritare bron$ica: infectii, substante iritante etc. In sputa bron$iticilor
cronici celulele bazale constituie pana la 67-77% din totalul celulelor bron~ice exfoliate.
Celulele metaplazice sunt elemente heterotope a diror interpretare depa$e~te cadrul
microscopiei uzuale a sputei. Se pot gasi izolate sau in placarde. Cea mai frecventa
heterotopie este metaplazia epiteliului bron~ic in epiteliu scuamos. Apare frecvent in
pneumopatii cronice inflamatorii (bron~ita cronic a, bron~iectazie, abcese pulmonare,
tuberculoze, infarcte pulmonare vechi, sarcoidoza), dar poate fi $i neoplazica.
Interpretarea citologiei exfoliative in asemenea circumstante cere experienta
citologid. Unele caractere foarte generale pot fi doar orientative. Astfel, daca metaplazia
reproduce partial planul de structura al epiteliului scuamos, ne inscriem cu probabilitate
in parametri inflamatori. Prezenta insa de celule fibra de tip scuamos, de fapt de strat
scuamos cu keratinizare, prezenta de celule in placarde cu anizocitoza, anizocarioza, un
aranjament dismorf al elementelor in cadrul placardului reprezinta un semnal de alarma
ca produsul sa fie examinat de catre histopatolog.
Cei interesati de microscopia elementelor non-celulare ale expectoratiei pot consulta
avantajos lucrarea lui MEDICI ~i CHODOSH (1981).

242
13.3.4. Fluidifierea

Fluidifierea permite omogenizarea probelor ~i este indispensabila pentru sputo-


cultura cantitativa. Intr-un tub cu perle de sticla, amesteca un volum de sputa, din ultima
baie de spaJare, cuun volum din solu!ia proaspata 0,5% de N-acetil-L-cisteina sterilizata
prin autoclavare 20 minute la 121C. Agita u~or. Fluidifierea se produce in cateva minute.
Evita agitarea excesiva care, prin aerare, oxideaza acetil-cisteina ~idetennina repolimeri-
zarea mucmel.

13.3.5. Cultivarea probelor

1) Mediile de cultura recomandate sunt: agar-sange ~i agar-sange ~ocolat. ambele


pe baza de infuzie de cord bovin, ~iun mediu diferentiallactozat (agar Mac Conkey sau
cu eozina ~i albastru de metilen).
Agarul-sange este minimum indispensabil. Permite izolarea majoritatii bacteriilor
implicate in etiologia ITRI acute, iar 0 strie de stafilococ auriu insamantata peste ariile
de epuizare a probei pennite, prin fenomenul de satelitism, izolarea ~i identificarea in
cultura primara a speciilor de Haemophilus.
Agarul-sange ~ocolat depisteaza hemofilii cu sensibilitate mai mare ~i este indis-
pensabil izolarilor cantitative.
Utilizarea medii lor diferen!iale lactozate este facultativa: favorizeaza unl1arirea
bacililor gram-negativi reperati microscopic.
2) Izolarea semicantitativa. Epuizeaza in patru cadrane pe placile cu mediu agarizat
dite 0 ansa din proba de sputa omogenizatii sau numai spalata. Daca pentlll izolare utilizezi
numai agar-sange, insaman!eaza, perpendicular peste striuril~ sectoarelor 4-2 de epuizare,
cate 0 strie de S. aureus. lzolareahemofililor este favorizata daca pe al doilea sector de
epuizare al placii cu agar-sange ~ocolat plasezi 0 rondela cu 10 Ilg bacitracina. Reperarea
pneumococilor in sputocultura ~i sensibilitatea depistarii lor sunt ameliorate dad in al
doilea sector de epuizare a probei pe placa agar-sange depui 0 rondela de 4 Ilg optochin.
Insaman!eaza in mod similar aspiratele hipofaringian, cele bronhoscopice sau
transtraheale.
3) lnsamantarea cantitativa a expectora!iilor este facultativa ~icostisitoare. Dilueaza
proba omogenizata 10-2 ~i 10-3 in solu!ie Ringer lactozata. Epuizeaza cate 0,1 mL din
fiecare dilu!ie pe cate 0 placa cu mediu de izolare.
Izolarea cantitativa din prelevatele prin periaj bron~ic este obligatorie. Agita viguros
pe Vortex tubul cu peria imersata intr-un mL solu!ie Ringer lactozata. Epuizeaza cantiUiti
de 0,01 ~i 0,001 mL din suspensie pe cate 0 placa cu mediile de izolare recomandate.
Folose~te pentlll aceasta anse calibrate (vezi Cap. 6).
4) Incubeaza culturile peste noapte, aerob, la 37C; cele pe agar-sange ~i pe agar-
sange ~ocolat in borcan cu lumanare.
A doua zi, examineaza culturile ~i inregistreaza izolatele pe tipuri de colonii,
semicantitativ sau cantitativ, in raport cu modul de insaman!are.

243
La epuizarea cantitativa, tine cont ca 0 colonie de pe placa insamfmtata cu 0,1 mL
din dilutia 10-2 semnifica 103 UFC/mL, respectiv 104 UFC/mL in cazul dilutiei 10-3. La
probele de periaj bron~ic, tinand seama ca peria preleva cca 0,001 mL, fiecare colonie
rezultata dupa epuizarea ansei de 0,01 mL semnifica cel putin 105 UFC/mL exsudat.
Din expectoratiile care indeplinesc exigentele citologice de calitate ~isunt prelucrate
confonn indicatiilor precizate, izolam numai 1-2 bacterii cu cre~tere 4+ sau 3+, dupa
epuizarea semicantitativa, sau peste 105-6 UFC/mL, dupa epuizarea cantitativa. Este
rezonabi1 ca in cazul probe lor cu mai mult de 3 izolate in cantitate mare sa sistam identi-
ficarea la nivel microscopic ~i sa nu tentam antibiograma pentru ca nu putem argumenta,
de obicei, pentru nici unul in mod convingator, semnificatia clinica. In aceste cazuri
antibioticoterapia condusa pe baza rationamentului clinico-epidemiologic este mai utila.
Daca nu regase~ti categoriile microscopice bacteriene depistate pe frotiul direct in
asociatie semnificativa cu leucocitele sau celulele bron~ice (revezi fig. 13-6, 7, 8, 9,10)
printre izolatele predominante ~i in cantitate mare, reincubeaza placile pana la 48 de ore.
Procedeaza la fel ~i in cazul probelor prelevate de la pacienti sub antibioticoterapie.

13.3.6. Identificarea izolatelor ~i comunicarea rezultatelor

Nivelul pana la care conducem identificarea izolatelor care il1trunesc un minim al


criteriilor de semnificatie clinic a depinde de: contextul clinic al pacientului ~i COI1-
fruntarea dintre sputocultura ~i citobacterioscopia cantitativa. Identificarea comensalilor
rezidenti ai oro-faringelui, cum sunt streptococii viridans, corynebacteriile, neisseriilc
nepretentioase, stafilococii coagulazo-negativi, Candida spp., se opre~te la nivel de grup.
Izolatele care se regasesc semnificativ asociate leucocitelor pe frotiul direct din sputa
trebuie identificatre pana la nivel de specie.
1) Streptococii
Streptococii cx-hemolitici trebuie diferentiati in pneumococi, cu semnificatie clinica
posibila, ~i streptococi viridans, tara semnificatie clinica. Sensibilitatea la optochin
identifica prezumtiv pneumococii, iar solubilitatea in bila 0 confim1a. De dorit pentru
confinnarea identitatii pneumococilor ar fi reactia de umflare a capsulei sau 0 aglutinare
pasiva.
Streptococii ~-hemolitici trebuie identificati pfma la nivelul grupului antigenic prin
precipitare inelara sau 0 aglutinare pasiva. Sensibilitatea la bacitracina ramane numai
un test prezumtiv de diferentiere in streptococi grup A ~i non-grup A.
Streptococii nehemolitici se inregistreaza ca atare: nu sunt identificati in continuare
~i nici comunicati.
Numai in pneumoniile congenitale ~i neonatale, streptococilor cx-hemolitici ~i
nehemolitici Ii se vor testa capacitatea de hidroliza a hipuratului ~i cre~terea pe agar cu
esculina bila pentru a diferentia corect streptococii grup B ~i D care, in acest context, pot
avea semnificatie clinica.
2) Hemofilii trebuie identificati pana la nivel de specie pe baza caracterelor de
cultura ~i necesitatilor nutritive in factorii X ~i V.

244
3) Neisseriile. Caracterele microscopice, de cultura ~i reactia oxidazei pozitiva Ie
identifica la nivel de gen. In masura in care citobacterioscopia atesta semnificatia clinica
a acestor izolate, testeaza cre~terea pe mediul Thayer-Martin modificat pentru a diferentia
meningococii de Moraxella catarrhalis. Oricum, coloniile alb-cenu~ii, friabile ~i intens
oxidazo-pozitive sunt puternic sugestive pentru M. catarrhalis.
4) Enterobacteriaceele pot cauza ITRI la gazde compromise. In conditii de
spitalizare sunt implicate ~i alte specii in afara de K. pneumoniae sau tulpini hemolitice
de E. coli. Eforturi de identificare in cadrul familiei pana la nivelul de gen ~i specie sunt
justificate numai in circumstante clinico-epidemiologice sugestive ~i cfmd citobacte-
rioscopia cantitativa atesta asocierea senmificativa a bacililor gram-negativi cu leucocitele
(v. fig. 13-9). Tran~area senmificatiei enteronacteriaceelor izolate in sputocultura po ate
necesita prelevari care ~unteaza contaminarea oro-faringiana.
5) Bacilii gram-negativi nefermentativi izolati in sputocultura presupun, in general,
comentarii similare celor pentru enterobacteriacee. Identificarea bacilulului piocianic,
cel mai important reprezentant al grupului, se face pe baza caracterelor de cultura
(pigmentogeneza, capacitatea de a cultiva la 41 C ~.a.), dar frecvent tulpinile izolate de
la pacienti cu fibroza chistica sunt nepigmentogene ~i trebuie sa recurgem la teste
biochimice de identificare. Restul izolatelor sunt inregistrate la nivel de gen sau grup
(e.g., Flavobacterium spp. saD Pseudomonas spp. diferita de P. aeruginosa etc.),
identificarea speciei unnand numai in caz de semnificatie c1inica demonstrata.
6) Dintre stafilococi se impune.identificat S. aureus, restul ii inregistram numai ea
stafilococi coagulazo-negativi tara a-i comunica. La pacienti sub terapie antimierobiana,
mai ales in conditii de spitalizare, semnificatia c1inica a S. aureus trebuie argumentata
prudent.
7) Bacilii gram-pozitivi. Corinebacteriile Ie inregistram ca baeili difterimorfi nUll1ai
pe baza caracterelor de cultura ~i ll1icroscopice. Insa la pacienti tineri, care au contacte
eu animalele ~i sunt in conditii de imunodeficienta sau imunosupresie, prezenta bacililor
corinefonni in sputa poate sugera 0 infectie cu Rhodococcus equi ~iimpune aprofundarea
identificarii. Posibilitatea unei nocardii trebuie apreciata in raport cu circull1stanta clinica
(revezi tabelul 13-1).
Izolan a in sputocultura a bacililor antracoizi, calificati obi~nuit drept contall1inanti,
trebuie interpretata prudent la gazda cOll1promisa, la care, ocazional, Bacillus cereus ~i
B. subtilis au fost sell1nalati ca 0 cauza de infectii pulmonare.

13.3.7. Metode neconventionale de izolare

Tulpinile Sale pneull1ococilor ~i serovarurile 0:1-3 de Klebsiella pneumoniae,


implicate in infectii respiratorii, sunt virulente pentru ~oareci, la care detell11ina infeqie
septicemica ll10rtala in 24-72 ore. Exceptie fac tulpinile unor serovaruri de pneull1ococi,
e.g., serovarul14. Laboratoarele care dispun de facilitatile necesare pot ineerca injectarea
expectoratiilor la ~oareci dnd citobacterioscopia sugereaza aceste etiologii.

245
13.3.8. Comunicarea rezultatelor

Comunica izolatele in cantitate de cel putin 105-6 DFC/mL sau izolatele predomi-
nante~i in cantitate mare (cel putin 3+ 1a inregistrarea semicantitativa acre~terii), care
se regasesc semnificativ asociate celulelor il1f1amatorii pe frotiul direct. In infec!iile
grave, antibiograma acestor izolate poate fi efectuata chiar inaintea identifidirii lor pana
la nive1ele stabilite mai sus.
Proportia in care bacterii cu semnificatie c1inica pot fi stabi1ite in sputa acceptata
prin triaju1 cito10gic de 1a pacienti cu ITRI contractate in colectivitatea generala este
relativ modesta: - 60%.
Asocierea sputoculturii cantitative cu inocularea la ~oarece amelioreaza mult, pe
seama pneumococilor, izolarea bacteriilor cu semnificatie c1inica.

13.4. EXAMENUL MICROBIOLOGIC


iN SUSPICIUNEA TUBERCULOZEI PULMONARE

13.4.1. Microscopia

Eta1eaza frotiurile numai pe lame noi. Numai la nevoie recicleaza lame cu frotiurile
negative pentru bacili acido-rezistenti, dar numai dupa ce au fost mentinute minimum 48
ore in amestec sulfocromic, spa1ate, degresate ~i sterilizate prin aer cald.
Din sedimentu1 probei omogenizate (vezi 13.4.2) eta1eaza un frotiu subtire ~i uni-
form pe 0 suprafata de cca 3-4/1,5 cm. Frotiu1 efectuat din portiuni bine alese ale probei
(portiuni purulente, cazeoase) poate da rezultate mai bune dedit concentratu1 probei.
1) Examinarea frotiului colorat Ziehl-Neelsen. Examineaza cu marire moderata
(obiectiv 90X ID, ocular 5X) pentru a scruta in timp rezonabi1 0 suprafata cat mai mare.
Depune 0 picatura de u1ei de cedru 1amijlocul unei extremitati a frotiului fara a-I atinge
cu bagheta. Examineaza camp cu camp (cca 2-5 secunde/camp) evitand mi~carea con-
tinua a lamei. Ba1eiaju1 frotiului de 1a0 extremitate la alta pennite examinarea a eea 100
de ciimpuri. Daca pe prime1e 100 de campuri au fost depistati 1-3 bacili sau nu au fost
observati de 10c, continua examenu1 pe alte 100 campuri de pe margine a superioara ~i
respectiv inferioara a frotiului (fig. 13-12). Examenul corect a1 unui frotiu poate dura
pana 1a 20 minute. Artefacte acido-rezistente sunt u~or confundate eu bacili aeido-
rezistenti. De aceea observarea numai a catorva bacili acido-rezistenti pe tot frotiul se
consemneaza ca suspiciune ~i se solicita
examinarea unei noi probe.
i
2) Examinarea frotiulu calm-at fluores-

: (~~ :11 IJ
Fig. 13-12. Baleiajul microscopic al unui
cent cu auramina se face initial cu obiectivul
20X ~i ocu1aru11 OX, iar confinnarea bacililor
depistati, prin examinarea acelora~i campuri cu
frotiu colorat Ziehl-Neelsen pentru bacilo- obiectivul40X. Examenul a 30 de campuri (cca
scopia sputei, schematic 1- 3 minute) echivaleaza Cll scrutarea prin

246
obiectivul cu imersie a celor 300 de dimpuri de pe frotiul colorat Ziehl-Neelsen. Metoda
elimina rapid frotiurile negative, cele pozitive urmand a fi confirm ate prin examinare cu
imersia a aceluia~i frotiu recolorat Ziehl-Neelsen.
Comunica rezultatele semicantitativ (tabelul13-4).
Tabelll/ 13-4

Microscopia pentru micobacterii: comunicarea sem'icantitativii a rezltttatelor

Numar de bacili/cfunp microscopic Intens


Absenti
Moderatpozitiv
Consemneaza
Intens pozitiv
bacili
Slabpozitiv
pozitiv(+++)
(+++)
(+)numarul~i solicita
acido-rezistenti
(++)
Inregistrare-cmnunicare examinarea
2/camp
0/100 deexaminat
unei noi cil.mpuri cu
probe IV obiectiv 40X
I

13.4.2. Decontaminarea, omogenizarea ~i concentrarea probelor

Sputa, aspiratul bron~ic sau gastric contin numeroase microorganisme cu cre~tere


rapida care invadeaza ~i degradeaza mediul de izolare inaintea aparitiei culturii bacililor
tuberculozei sau altor micobacterii cu cre~tere lenta. In aceste prelevate mucoase repariitia
bacililor este neunifonna, frecvent contin particule de material solid provenit din pulmoni,
care trebuie examinate.
Decontaminarea chimica realizeaza concomitent fluidifierea ~i omogenizarea
probelor necesare concentrarii micobacteriilor. Multitudinea metodelor de decontaminare
chimicii demonstreaza ca nici una nu este ideala.
Decontaminarea prin solutie de NaOH este cea mai simplii ~i aceesibila, dar po ate
afecta viabilitatea micobacteriilor. Pentru a minimiza acest inconvenient nu depa~i
concentratia finala de 2% NaOH in proM ~i nu prelungi timpul de contact peste 30
minute (inclusiv durata centrifugarii).
Procedura. Intr-un tub de centrifuga cu capac (protectia contra aerosolilor) pipeteaza
in volume egale proba ~isolutia 4% de NaOH. Mentine tubul 15-20 minute la 25-30C
cu agitare initial ingrijita, apoi la fiecare 5 minute. In final adauga 1 mL alcool etilic de
96 pentru fiecare 5 mL continut ~i centrifugheaza 10 minute la eel putin 13 000 xg.
Decanteaza supematantul intr-un container de siguranta microbiologica (v. fig. 2- 14) ~i
~terge buza tubului eu un tampon din vata inmuiat in alcool de 70. Adauga 0 picatura
din solutia indicator albastru de bromtimol ~ineutralizeaza imediat sedimentul adaugand
eu piciitura, pana la euloarea verde ca iarba, persistenta, solutie 2 M de HC!. In final
adauga 0 picatura din solutia cu 8 000 V.l. penicilinaJmL.

13.4.3. Izolarea

Insamanteaza sedimentul probei pe 3-5 pante cu mediu Lowenstein-Jensen, cca


0,25 mL per tub. Sensibilitatea izolarii cre~te cu numarul tuburilor insamantate. Dupa
incubare 24 ore la 37C in pozitie foarte inclinata, care asigura scaldarea integrala cu

247
fluid a pantei, pentru adsorbtia inoculului, incubeaza in pozitie vertical a tuburile inchise
ermetic. Examineaza culturile dupa 2 saptamani de incubare, initial cu lupa, apoi cu
ochiulliber, saptamanal, pana la 8 saptamani. Daca frotiul direct a depistat bacili acido-
rezistenti care nu apar in cultura, incubeaza tuburile suplimentar pana la 90 zile.
Identifica izolatele prin caracterele microscopice (acido-rezistenta, dispozitie in
corzi), de cultura (temperatura optima ~i viteza de cre~tere, aspectul coloniilor, pigmen-
togeneza), biochimice (producere de catalaza ~i termorezisteta acesteia, producerea de
niacina sau, mai bine, sensibilitatea la hidrazida acidului tiofen-2-carboxilic). Evident,
intre laboratoare apar inevitabil diferentieri privind nivelul pana la care pot conduce
identificarea micobacteriilor. Laboratoarele spitalelor judetene trebuie sa asigure identi-
ficarea M. tuberculosis ~i antibiograma. Identificarea altor specii este de competenta
laboratoarelor de referintii unde urmeaza a fi expediate tulpinile.
Depistarea micobacteriilor condition at patogene in prelevate contaminate capata
semnificatie clinica numai cand, in absenta bacililor tuberculozei, sunt izolate in cantitate
mare sau izolarea lor repetata coincide cu evolutia bolii.

13.5. CONDUITA iN SUSPICIUNEA ITRI CU BACTERI ANAEROBE

Sunt indicate pentm examinare numai ATT, prelevate bronhoscopic cu dispozitiv


protejat, probe biopsice. Epuizeazii probele, in afara mediilor mentionate la 13.3.5. (I) ~i
pe agar anaerob CDC cu 5% sange sau agar anaerob cu 5% sange lacat de cal ~i antibiotice
(gentamicina ~i vancomicina).

13.6. EXAMENUL DE LABORATOR iN SINDROMUL


DE TUSE CONVULSIV A

Investigatia etiologica a sindromului de tuse convulsiva presupune un examen bac-


teriologic ~iunul virologic sau serologic. Planificarea acestor examene trebuie transmisa
telefonic laboratorului.
Preleva doua tampoane nazofaringiene, drept ~i stang, pe cale pernazala ~i probe
de ser sanguin in dinamica.
Imerseaza fiecare tampon in tub cu cca I mL solutie 1% casaminoacizi (CAS).
Daca probele sunt conservate la 4C, examenul bacteriologic poate fi temporizat cel
mult 2 ore. Pentru prelevarea in vederea examenului virologic procedeaza conform
precizarilor din Capitolul 8. La primirea in laborator:
Epuizeaza imecliat tampoanele pe cate 0 pladi cu agar Bordet-Gengou proaspat
preparat (de dorit selectiv prin adaos de 0,5 U, penicilinii/mL) .
Descarca apoi, prin rotire viguroasa, tampoanele in solutia CAS ~i incubeaza
suspensia 0 ora la 37C. Din fiecare proba astfel incubata efectueaza cate 2 frotiuri per
lama (testul ~i martorul), usuca-le ~i fixeaza-Ie prin caldura pentru coloratie imuno-
fluorescenta . Pastrate la 4C frotiurile uscate ~i fixate pot fi examinate ~i dupa 5-6 luni.
Incubeaza placile cu mediul Bordet-Gengou la 3T in atmosfera umeda ~iurmare~te,
pana la 4 zile, aparitia culturii. Identifica izolatele prin caracterele de cultura, microscopice
~i biochimice. ldentificarea definitiva prin aglutinari pe lama ramane de competenta
laboratorului de referinta.

248
Practic, toate laboratoarele clinice arondate marilor colectivitati pediatrice trebuie
sa poata stabili etiologia sindromului de tuse convulsiva prin examen serologic cu baterie
de antigene: aglutinare eu antigen B. pertussis, RFC cu antigene virale (adenovirus,
virusurile paragripale ~i respirator sincitial). Un numar restrans de laboratoare poate fi
antrenat, sub controlullaboratorului de referinta, in eantionajul tulpinilor de B. pertussis
necesar supravegherii sensibilitatii la antibiotice i prepararii vaecinului.

13.7. EXAMENUL DE LAB ORATOR


IN SUSPICIUNEA LEGIONELOZEI

Baza materiala pentru diagnosticul etiologic al legionelozelor in laboratoarele


noastre clinice abia um1eaza a fi realizata.

13.7.1. Microscopia directa

Examinam: frotiuri din sputa, exsudate bronho-pulmonare prelevate invaziv;


amprente din probe pulmonare biopsiee sau necropsice i frotiuri din omogenatul acestora;
frotiuri din exsudatul pleural.
Coloratia Gram este, practic, inutila; coloratia Giemenez sau coloratia Dieterle
prin impregnatie argentica dau rezultate nesatismcatoare.
Indicata este coloratia imunofluoreseenta directa, care are sensibilitatea cuprinsa
intre 0,25 ~i0,75, dar speeificitatea ajunge la 0,99-1 ,00 cand se utilizeaza mmiOli adecvati.
Martorii trebuie sa controleze posibilitatea fluorescentei altor bacterii prin reactii
incruci~ate (e.g., pseudomonade, Xanthomonas maltophilia, Bordetella pertusis, tulpini
de Bacteroides fragilis), prin antieorpi naturali din conjugatele utilizate (e.g., antipneu-
mocoeici, antistreptococici), prin fixare nespecifica a conjugatelor (Staphhylococcus
aureus) ori contaminarea reactivilor i lamelor de microscop cu legionele din mediul
ambiant. Astfel sunt necesare:
preparate microscopice pozitive i negative dintr-un prelevat similar celui
examinat;
frotiuri din suspensii de Legionella;
frotiuri din suspensii ale altor bacterii;
0 bun a cunoa~tere a morfologiei legionelelor.
Coloratia imunofluorescenta directa necesita conjugate polivalente, care identifiea
multiple serogrupe sau specii de Legionella, i monovalente pentru identificarea speeifiea
a speciilor, serogrupelor i serovarurilor.

13.7.2. Izolarea

Cultivam prelevate de la nivelul cailor respiratorii, exsudat pleural, cand exista, i


putem tenta hemoculturi.
Epuizeaza prelevate necontaminate pe eate 0 placa cu agar-sange i cu agar BCYE
(Buffered Charcoal Yeast Extract), care prin continutul in elorhidrat de L-cisteina i

249
pirofosfat feric satisface exigentele nutritive specifice legionelelor, iar prin carbunele
activat previne oxidarea fotochimica a extractului de levura. Decontamineaza sputa fie
prin spalare timp de 5 minute in baie cu tampon 0,2 M HCI- KCI pH 2,0, fie prin inealzire
1,-2 minute in baie de apa la 60C.
Pentru hemocu1turi folose$te mediul CYE difazic aditionat cu L-cisteina $i pirofosfat
feric.
Incubeaza culturile aerob la 37C $i urmare$te-le timp de 7 zile. Singura earboxifila
este Legionella gormanii. Ii asiguram izolarea in borcan eu lumanare. In general,
concentratii de CO2 peste 5% sunt inhibitoare pentru legione1e.
Numai pe mediul BCYE, abia dupa 2-3 zile de incubatie apar primele colonii de
Legionella, initial in ariile dens insamantate, mici punetiforme. DiametiUI lor ere$te
progresiv la 1-2 mm dupa 3 zile de ineubare. Sunt rotunde, eu margini U$or neregulate,
convexe, stralucitoare, verzui.
Repica 2-3 colonii pe un mediu clar, e.g., agar Feeley-Goffi1an pentru a acumula
cultura pura necesara identificarii.
Daca specificitatea izolarii legionelelor este de 1,0, sensibilitatea nu depa$e$te
0,80.

13.7.3. Diagnosticul serologic

Preleva, in dinamica, probe de ser acut (pana in a 7-a zi de boala) $i de convales-


cent (dupa 3-4, eventual $i 6 saptamani de la debutul bolii). Unnarim anticorpii prin
imunofluorescenta indirecta. Semnificative pentru diagnostic sunt titruri peste 1: 128
(L. pneumophila) sau I :256 (alte specii) ori 0 cre$tere de minimum 4X a titrului in
serurile tardive fata de cel precoce.

13.8. EXAMENUL MICROBIOLOGIC


IN SUSPICIUNEA ACTINOMICOZEI PULMONARE

Expectoratia pacientilor cu actinomicoza sau nocardioza pulmonara contine


frecvent, dar nu in mod necesar, granule de "sulf'. Examineaza atent, pe fond negru, eu
lupa, Mile de spalare a probelor pentru depistarea acestor granule.

13.8.1. Microscopia

Daca expeetoratia contine granule, examineaza-Ie microscopic confoffi1 indicatii10r


de la 11.4.2. pentru depistarea mieroeo10niilor tisulare ale aetinomieetului.
In absenta granulelor, unnare$te prezenta elementelor pseudohifale intretesute in
mieelii laxe sau fragmentate in forme baeilare, ramifieate, difterimorfe. Prin eoloratie
Ziehl-Neelsen sau Kinyoun modifieate, diferentiaza nocardiile, cu aeidorezistenta lor
variabila, de Actinomyces spp. organisme neacidorezistente.

250
13.8.2. Izolarea

Spala, zdrobe~te ~iinsamanteaza granulele de "sulf' eventual depistate in prelevatul


patologic. In absenta acestora:
Pentru izolarea nocardiilor este recomandata concentrarea prin centrifugare a
expectoratiilor fluidifiate cu N-acetil-L-cisteina. Epuizeaza probele, in duplicat sau
triplicat, pe pante cu agar Sabouraud glucozat 2% (tara antibiotic e) ~i pe placi cu agar-
sange pe baza de infuzie cord-creier. Incubeaza culturile aerob la 37C. Urmare~te
cre~terea la fiecare 48 ore timp de doua saptamani sau mai mull. Incubarea initiaHi a
culturilor la 45C favorizeaza cultivarea N. asteroides in detrimentul bacteriilor de
contaminare. Frecvent N. asteroides supravietuie~te decontaminarii chimice a expecto-
ratiilor pentru izolarea micobacteriilor, chiar la tratarea cu hidroxid de sodiu, ~i cultiva
bine pe mediul Lowenstein-Jensen .
lzolarea actinomicetelor anaerobe poate fi flicuta ~i din sputa cu conditia
insamantarii ~i interpretarii semicantitative a sputoculturii. Izolarea unei singure colonii
sau a unui numarredus de colonii ale acestor actinomicete bogat reprezentate in microbiota
bucala nu are semnificatie clinica. Epuizeaza probele dupa cum urmeaza:
- pe 0 pladi cu agar-sange pe baza de infuzie cord-creier, pentru incubare aerobii:
- pe cate doua placi cu agar-sange anaerob ~i agar-sange lacat cu gentamicina ~i
vancomicina pentru incubare anaeroba. Incubeaza toate culturile la 37C. Examineaza
un set din placile anaerobe dupa doua zile, iar al do ilea dupii 5-7 zile, comparativ cu
cre~terea aeroba.
Inregistreaza caracterele de cultura ~imicroscopie ale izolatelor pentru purificarea
culturii ~i introducerea in algoritmul de identificare.
Nocardiile formeaza colonii bombate, zbarcite, cretoase, albe sau roz pana la
portocaliu, prafoase, pieloase in care, microscopic, observam filamente subtiri, monili-
fonne, ramificate, gram-variabile, slab acidorezistente ~i cu tendinta la fragmentare in
forme cocobacilare.
Microcoloniile actinomicetelor anaerobe sunt vizibile dupa 2-3 zile, la stereomi-
croscop, cu forma de "paianjen". Dupa 7-14 zile cresc pana la 0,5-2 mm diamehl.l ~i iau
aspect muriform sau de molar.

13.9. EXAMENUL PROBELOR iN SUSPICIUNEA MICOZELOR


PULMONARE

Examineaza macroscopic ~i pre1ucreaza pre1evate1e patologice in vederea


microscopiei ~i cultivarii. In probe1e de sputa urmarim in mod special partile muco-
purulente, mulaje bron~ice, false membrane, dopuri purulente (fonnate din micelii
fungice). La planificarea examenelor microbiologice intraoperatorii cere prelevarea
oricaror tumori fungoase intracavitare suspecte de aspergilom.
Umlare~te ~i inregistreaza, pe preparatele microscopice directe, umede ~i colorate,
prezenta ~i caracterele elementelor fungice in vederea identificarii preliminare a levurilor
sau a fungilor filamento~i, a argumentarii seillilificatiei clinice ~i a cultivarii.

251
Sensibilitatea depistarii fungilor in diferite prelevate din ihfectiile bronhopulmonare
am precizat-o mai sus (revezi 13.1.4). Acum insistam $i asupra specificitatii.
Prezenta fungilor, patogeni sau oportuni$ti, in prelevate corect recoltate prin metode
invazive, care $unteaza contaminarea oro-faringiana, are semnificatie clinica. La
examinarea prelevatelor contaminate, microscopia directa are 0 contributie majora pentn:
interpretarea semnificatiei fungilor depistati.
Levurile care, prin fonna, dimensil,me, prezenta, numarul $i modul de ata$are a
blastoconnidiilor, dispozitia intra- sau extracelulara, evoca fonna tisulara a unor anume
fungi dimorfi sau prin prezenta capsulei evoca Cryptococcus neofomzans, trebuie
acceptate cu semnificatie clinica, fiind microorganisme care detennina infectii exogene.
Prezenta in sputa proaspata a hifelor adevarate $i pseudohifelor cu artroconidii
$i blastoconidii evoca 0 specie de Trichosporon cu semnificatie clinica.
In schimb prezenta levurilor inmugurite, rotunde sau ovale, cu diametrul de 2-4 11m,
chiar insotite de pseudohife cu extremitati rotunjite $i blastoconidii tem1inale nu semnifica
in mod necesar 0 candidoza bronho-pulmonara. Aceea$i morfologie 0 au $i speciile de
Candida depistate microscopic frecvent in secretiile oro-faringiene ale pacientilor cu
disbioze (e.g., din cauza igienei bucale precare sau antibioticoterapiei). Invers, absenta
din sputa a levurilor $i pseudohifelor de Candida nu exclude candidoza tractusului res-
pirator inferior.
Hife groase de 8-15 11m,neseptate, hialine indica un zigomicet: mucor, Rh isopus.
Absidia etc. Prezenta exclusiva a hifelor $i izolarea repetata din sputa a aceleia$i specii
Ii argumenteaza semnificatia clinici'i. Zigomicetele contaminante dezvolta in expectoratii
conidii.
Prezenta in pseudomembrane, mulaje sau dopuri bron$ice ori intracavitare a unor
hife mai subtiri, de 5-7 11m (chiar de 2,5 11min aspergiloamele pulmonare), hialine,
regulat septate $i extensiv ramificate pseudodihotomic indica mai frecvent 0 specie de
Aspergillus. La extremitatea putin ramificata (batrana), hifele sunt frecvent goale, iar la
cea ramificata au citoplasma refringenta. In zona activa de cre$tere aspectul inca neseptat
preteaza la confuzii cu zigomicetele. Alte argumente de semnificatie sunt: prezenta
conidioforilor cu extremitatea putemic clavata pe suprafata careia se aliniaza fialide cu
cate un lant de conidii sferice; prezenta in centrul dopurilor purulente sau concretiunilor
de hife putemic balonizate, probabil conidii genninate.
Frecvent, daca nu dispunem de probe biopsice, semnificatia fungilor oportuni$ti,
care pot contamina expectoratiile, ramane a fi tran$ata numai prin serodiagnostic.

Microscopia in suspiciunea pnemocistozei

Pneumocystis carin ii, aglomerat sub forma de ciorchini in exsudatul alveolar, este
dificil mobilizat in expectoratie. De aceea examenul sputei sau spalaturii bron$ice este
frecvent fals negativ. Rezultatele ameliorate dau probele obtinute prin periaj bron~ic sau
aspiratie transtraheala. eel mai acurat diagnostic 11asigura insa examenul amprentelor
de biopsie pulmonara cu torace deschis.
Uzual examinam frotiuri colorate Giemsa, dar sunt indicate frotiuri de rezerva
pentlll coloratiile de electie cu albastru de toluidina sau Gomori. Fungul poate fi depistat
cu aspecte variate: a) fonne extrachistice rotunde, unele mici de I-311m; b) chi$ti cu

252
diametrul de cca 7 flm, care contin 2-8 fonne intrachistice mici, uneori semilunare.
Chi~tii sunt identificati mai u~or pe frotiurile colorate Gomori cu nitrat de argint-
metenamina, prip prezenta unei perechi de ingro~ari parietale in fonna de virgula.
Izolarea. Insamanteaza probele pe:
agar-sange pe baza de infuzie cord-creier cu incubare aeroba la 37C pentru
izolarea formei levurice a fungilor dimorfi; la suspiciunea blastomicozei utilizeaza,
suplimentar, ~i 0 placa cu acela~i mediu de cultura lara sange .
agar Sabouraud glucozat 2% pentru izolarea fonnei miceliene a fungilor dimorfi,
a fungilor filamento~i sau a levurilor.
Pentru izolarile din prelevate contaminate insamanteaza in para leI acelea~i medii
cu amestec selectiv de antibiotice: penicilina 20 U.I./mL, cloramfenicol 50 flg/mL ~i
cicloheximida 500 flg/mL.
Vezi amanuntele tehnice privind conditionarea mediilor, insamantarea, incubarea
~i unnarirea culturilor, masurile de siguranta antiepidemica in Cap. 2.6.
Identificarea corecta a multor fungi depa~e~te capacitatile laboratorului clinic.
Expediaza asemenea tulpini laboratorului pentru identificare ~i antibiograma.

13.10. INVESTIGKfIA ETIOLOGICA


IN PNEUMONIILE INTERSTqIALE

o prop0rtie insemnata dintre pneumoniile interstitiale beneficiaza de antibioti-


coterapie fiind infectii bacteriene determinate de Mycoplasma pneu17loniae, Chlamydia
pneumoniae, C. psittaci, C. trachomatis, Coxiella burnetii. Cum insa, chiar in conditii
ideale, rezultatele examenului microbiologic sunt tardive, antibioticoterapia, in caz de
necesitate, este initiata ~i condusa pe criterii clinico-epidemiologice.
Necesitatea testarii serurilor in dinamica, ser acut ~i ser de convalescent (dupa
2-3 saptamanii de la debutul bolii), intarzie mult rezultatele. Doar titrarea anticorpilor
IgM permite diagnostic pe proM unica de ser, in prima saptamana de boala, cu eventual
impact asupra conducerii terapiei antimicrobiene.

13.10.1. Mycoplasma pneumoniae

Izolarea ~i identificarea micoplasmelor sunt rezervate unui numar limitat de


laboratoare dotate cu tehnologia necesara, in generallaborioasa. In caz de necesitate,
prelevatele sunt expediate catre aceste laboratoare. Mycoplasma pnewnoniae este foarte
sensibiHi la desicare, de aceea tamponul nazo-faringian trebuie desciircat imediat dupa
recoltare, in mediul de transport: bulion nutritiv cu 0,5% serumalbumina bovina ~i
penicilina 200 U.I./mL. Sputa ~i tesuturile pot fi expediate ca atare. Conservate la 4C,
probele trebuie examinate in interval de 24 ore.

13.10.2. Chlamidii

Microscopia pentru depistarea incluziilor chlamidiale in expectoratii este inoperanta.


Prelevatele destinate izolarii chlamidiilor (tampon nazo-faringian, sputa, aspirat
hipofaringian, la care in psitacoza se adauga sange, biopsie splenidi ~i hepatica) sunt

253
expediate laboratorului de referinta conservate in mediul 2SP aditionat cu 5% ser de
vitel sau in mediul SPG eu antibiotiee (vezi Cap. 40). Daea examinarea se po ate
face pfma in 24 de ore, probele sunt refrigerate la 4C, in caz contrar trebuie
congelate la -70C.

13.10.3. Virusuri

Uzualla nivelullaboratoarelor c1iniee se realizeaza prelucrarea initial a a prelevatelor


(spalatura faringiana, aspirat sau tampon nazo-faringian, sputa, tesut pulmonar prelevat
neeropsic) pentru expedierea c~tre laboratorul de referinta (revezi Cap. 8).

l3.ll. DEPISTAREA VIERMILOR PARAZITI

Examenului preparatului umed intre lama ~i lamela din sputa pennite depistarea
oualor de Paragonimus westennani, protoscolec~ilor de Echinococcus in cazul; de ruptura
a chi~tilor hidatici pulmonari, larvelor de Strongiloides stercoralis sau Ascaris
lumbricoides. Aspectele depa~ese scopurile acestei carti. Cei interesati pot consulta
bibliografia reeol11andata.
14. DIAGNOSTICUL DE LAB ORATOR AL INFECTIILOR
TRACTUSULUIURINAR
(DUMlIRU BUruC)

14.1. INTRODUCERE Examenul frotiului colorat Gram


14.1.1. Conditia anatomohistologicii a B. 0 procedura economica
tractusului urinar 14.3.2. Urocultura cantitativa prin insiiman-
14.1.2. Conditia microbiologicii tare cu pipeta
14.] .3. Consideratii clinicoepidemio]ogice ]4.3.3. Urocultura cu ansa calibrata
]4.1.4. Consideratii etiopatogenetice 14.3.4. Citirea uroculturilor cantitative
]4.1.5. Piurie ~i bacteriurie 14.3.5. Identificarea izolatelor ~i comunical'ea
]4.2. PRELEVAREA, TRANSPORTUL S] etapizata a rezultatelor
CONSERVAREAPROBELOR 14.3.5. Urocultura cantitativa prin testul
]4.2.1. Prelevari uzuale amprentei
Proba curata prinsa in zbor din jetul 14.4. DIFERENTIEREA BACTER]URIEI
mijlociu VEZICALE DE BACTERIURIA
Prelevari la copilul necooperant RENALA
Proba prinsa in zbor din jetul mijlociu Prelevari prin cateterizare ureteral a
rara decontaminare speciala a organelor Prelevari prin ca'teter Foley ell spiilarea
genitale veZlCIIurmare
14.2.2. Prelevari speciale Detectarea in sedimentul urinar a baeteriilor
Aspiratia suprapubiana coafate cu anticorpi
Prelevari prin cateter 14.5. EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL
]4.2.3. Expedierea probelor de urina la URINEI PENTRU IZOLAREA UNOR
laborator PATOGENI SPECIFICI
14.3. EXAMENUL elTO-BACTERIOLOGIC 14.5.1. Urocultura pentru diagnosticul
UZUAL AL URINEI tuberculozei renale
A. Metoda de referinta 14.5.2. Urocultura pentru izolarea bacililor
14.3.1. Microscopia tifici
Pregatirea probelor 14.5.3. Examenul urinei pentru depistarea
Examenul preparatului umed in camera leptospirelor
hemocitometrica

14.1. INIRODUCERE

lnfectia tractusului urinar (ITU) este una din cele mai frecvente conditi patologice.
Predictia pozitiva pentm lIU a simptomatologiei c1inice oscileaza in jur de 0,5, chiar
mai redusa in cazul sindromului uretralla femei. Un numar apreciabil de lIU evolueaza
asimptomatic, iar la copilul sub varsta de 2 ani simptomatologia ITU este nespecifica.
De aceea, eel mai mare numar de probe care aglomereaza laboratoml clinic sunt cele de
urina, a caror examinare microbiologica cere un anumit discernihnant pentm a nu epuiza
resursele laboratorului in investigatii mra finalitate sau chiar cu rezultatE eronate.
diiunatoare pentru pacient.

255
14.1.1. Conditia anatomo-histologidi a tractusului urinar

Sistemul urinar este fonnat din cei doi rinichi, diile urinare intra- ~i extrarenale.
Partea glandulara a rinichiului coafeaza sinusul, 0 mare cavitate adjacenta hilului renal.
Sinusul contine bazinetul renal, tesut conectiv lax ~i tesut adipos prin care trec spre ~i
dinspre portiunea glandulara nervii, arterele, respectiv venele ~i vasele limfatice.
Bazinetul renal se continua la nivelul hilului cu ureterul prin care urina ajunge in
vezica urinarii, de unde este eliminata periodic prin uretrii.In bazinet se deschid calicele
mari, care reunesc calicele mid.
Partea glandularii este concentrata in cortexul renal, care acopera zona medularii
fonnata din 8-18 piramide renale conice. Baza piramidelor renale este dispusa spre cor-
tex, iar varful sau papUa proemina in lumenul fiecarui calice mic. Varful papilei este
perforat de 10-25 orificii prin care se deschid tubii uriniferi.
Nefronul, unitatea secretorie a rinichiului, este fonnat din segmente repartizate
intre cortex (capsula lui Bowman, care inconjura glomerulul vascular renal, tubii contor!i
proximal ~i distal) ~imedulara (ansa lui Henle, care face jonctiunea dintre tubii contort,i).
La limita dintre corticala ~i medulara, fiecare tub contort distal se continua cu un scurt
tub colector. Tubii colectori strabat radiar zona extema a medularei ~i fuzioneaza rcpetat
cu alti tubi similari in zona intern a pentru a fornla ducturile papilare.
Din arterele arciforme de la jonctiunea corticalei cu medulara radiaza spre periferie
arterele interlobulare ale caror mici ramificatii formeaza glomerulii renali. Circulatia
venoasa, de retur, paralelizeaza arterele. Aspectul striat al medularei renale este dat