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Sntesis de ADN y los genes de reparacin

RRM1 y ERCC1 en el cncer de pulmn


Zhong Zheng, MD, Ph.D., Tingan Chen, MD, Ph.D., Xueli Li, MD, Eric Haura, MD,
Anupama Sharma, MD, y Gerold Bepler, MD, Ph.D.
N Engl J Med 2007; 356:800-808 22 de febrero 2007 DOI:
10.1056/NEJMoa065411

El cncer de pulmn representa ms de una cuarta parte de todas las


muertes relacionadas con cncer en los Estados Unidos, a pesar de las
mejoras en el diagnstico y la gestin. Slo recientemente hay
marcadores moleculares se integran en las decisiones sobre el
tratamiento del cncer de pulmn. Otras pistas prometedoras todava no
son clnicamente tiles debido a la falta de validacin o requisitos
tcnicos complejos.
RRM1, el gen que codifica la subunidad reguladora de la ribonucletido
reductasa, es importante en el cncer de pulmn de clulas no
pequeas. Se encuentra en 11p15.5 segmento de cromosoma, una
regin con una frecuente prdida de heterocigosidad en el cncer de
pulmn de clulas no pequeas.Los bajos niveles de expresin del gen
estn asociadas con una mala supervivencia entre los pacientes con LLA
de clulas no pequeas de cncer de pulmn.En las clulas de cncer de
pulmn modificados genticamente, un aumento en la expresin de la
protena RRM1 aumenta la expresin de la fosfatasa y homlogo de
tensina (PTEN), un inhibidor de la proliferacin celular; disminuye la
fosforilacin de la quinasa de adhesin focal; y disminuye la migracin
celular y la invasin. Fibroblastos neoplsicos de ratn con el aumento
de expresin de un RRM1 transgn han reducido potencial metastsico,
y en ratones transgnicos, altos niveles de RRM1 estn asociadas con la
resistencia inducida por carcingeno para los tumores de pulmn. RRM1
es tambin el predominante determinante celular de la eficacia de la
gemcitabina nuclesido anlogo (2 ', 2'-difluorodesoxicitidina).
gemcitabina, anlogos de platino, y taxenes son los principales agentes
de quimioterapia para el cncer de pulmn de clulas no pequeas.
Se describe un mtodo simple, automatizada, inmunohistoqumica para
la determinacin de la expresin RRM1 en los tumores, la localizacin
subcelular de RRM1, la asociacin entre la protena RRM1 y su ARN
mensajero (ARNm), y la asociacin de RRM1 con PTEN y con la
reparacin por escisin grupo de complementacin cruzada 1 (ERCC1)
de protena en el cncer de pulmn de clulas no pequeas. Tambin
describimos el uso de este mtodo para validar RRM1 como un marcador
de la evolucin clnica en una gran cohorte de pacientes con cncer de
pulmn de clulas no pequeas.

MTODOS
Pacientes
Los pacientes eran un subgrupo de todos los pacientes que fueron
sometidos a toracotoma para reseccin de un cncer primario de
pulmn en el Lee Moffitt Cancer Center y el Instituto de Investigacin H.
entre 1991 y 2001. Los pacientes fueron elegibles para su inclusin en el
estudio si tenan un adenocarcinoma, escamoso- carcinoma de clulas, o
carcinoma de clulas grandes; se haban sometido a una reseccin
completa del tumor (reseccin R0); y tenan la enfermedad en estadio I
de la estadificacin patolgica. Los pacientes con un cncer nonlung
anterior se incluyeron si la enfermedad se consider curado. Los criterios
de exclusin eran un cncer de pulmn anterior, la quimioterapia
preoperatoria o radioterapia, y cualquier radioterapia anterior en el
pecho. Estudios de estadificacin tenan que incluir un examen fsico y
una tomografa computarizada del trax y el abdomen superior. Ninguno
de los pacientes se someti a 18 F-fluorodesoxiglucosa la tomografa por
emisin de positrones para la estadificacin, y ninguno recibido
cualquier forma de terapia adyuvante. Cantidades suficientes de tejido
de tumor primario tenan que estar disponibles para la construccin de
microarrays de tejidos. Se identificaron 187 pacientes que cumplan
estos criterios.
Los datos de seguimiento para la supervivencia global, la supervivencia
libre de enfermedad, y los sitios de la recidiva del tumor se obtuvieron a
intervalos regulares. Hemos recomendado que los pacientes tienen las
visitas de seguimiento cada 3 meses durante 2 aos y luego las visitas
cada 6 meses durante 3 aos, y luego las visitas anuales. Los resultados
de seguimiento desde consultas externas se obtuvieron por correo y por
telfono los contactos regulares. Para los datos sobre la supervivencia
general, el tiempo desde el diagnstico hasta la muerte se registr. El
estado vital de los pacientes se verific con el uso de los registros de
estadsticas vitales. Para la supervivencia libre de enfermedad, el
momento de la reseccin quirrgica de la recurrencia o la muerte se
registr. Los datos correspondientes a los pacientes sin recurrencia del
tumor fueron censurados en el momento de la ltima visita de
seguimiento.
El estudio fue aprobado por la junta de revisin institucional de la
Universidad del Sur de Florida.
La deteccin in situ y cuantificacin de la expresin de protenas
Se construy un microarray tisular. Se utiliz inmunofluorescencia
combinado con el anlisis cuantitativo automatizado (AQUA) para
evaluar la expresin in situ de las molculas diana. 22 Los antgenos
fueron recuperados mediante la incubacin del tejido en un horno de
microondas. 23 Las concentraciones ptimas de muestras de antisuero y
los anticuerpos se utilizaron para detectar RRM1, PTEN, ERCC1, y
citoqueratina. Se generaron muestras de antisuero a fragmentos RRM1
de conejos y purificado por afinidad. Anticuerpos comerciales se
utilizaron para el anlisis de ERCC1 (Ab-2 clon 8F1, MS-671-R7,
Laboratorio Visin), PTEN (A2B1, sc-7974, Santa Cruz Biotech), y
citoqueratina (pancytokeratin antihumano AE1/AE3, M3515, y Z0622,
Dako Cytomation). Ellos se visualizaron con el uso de muestras de
antisuero marcados con fluorocromos. Las diapositivas finales fueron
escaneados con SpotGrabber (HistoRx), y los datos de imagen se
analizaron con AQUA (PM-2000, HistoRx). Las puntuaciones finales AQUA
van desde 0 (sin expresin) a 255 (la mxima expresin) (vase el anexo
complementario , disponible con el texto completo de este artculo en
www.nejm.org).
Aislamiento de ARN y anlisis de expresin gnica
Fresco congelado y fijado con formalina, las muestras de tumor incluidas
en parafina se obtuvieron de 44 pacientes. Los especmenes frescos
congelados fueron procesadas para el aislamiento de ARN, y, en tiempo
real, la reaccin en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa
cuantitativa anlisis de la expresin (RT-PCR) a base de para los RRM1,
PTEN, y ERCC1 y los genes para el ARN ribosmico 18S-como
anteriormente descrito. 11,24
Anlisis estadstico
Se calcularon los valores medios de las puntuaciones AQUA de lecturas
por triplicado para cada gen y se tratan como variables continuas
independientes. El anlisis de la expresin de genes basados en RNA fue
tratado igualmente como una variable continua independiente. Los
coeficientes de correlacin entre las variables de expresin de genes y
entre los genes se calcularon como variables continuas segn el
coeficiente de rango de correlacin de Spearman (rho), y se calcularon
los niveles de significacin de dos colas. Hicimos una decisin a priori
una de clasificar los valores de expresin gnica como altas o bajas,
utilizando la mediana de la muestra para el anlisis de la supervivencia;
esta clasificacin se realiz con el uso de estimaciones de Kaplan-Meier
y la prueba de log-rank. El objetivo primario fue determinar la asociacin
entre la expresin RRM1 en el tumor y la supervivencia. Los objetivos
secundarios fueron evaluar la asociacin entre la expresin de RRM1 y
ERCC1, entre RRM1 y PTEN, y entre el mRNA y los niveles de protena de
RRM1. Las asociaciones entre la expresin gnica y de los valores
clnicos discretos fueron analizados con el uso de la prueba de suma de
rangos de Wilcoxon para variables con dos categoras y la prueba de
Kruskal-Wallis para las variables con ms de dos categoras. Se realiz
un anlisis de regresin de Cox para evaluar el efecto de la expresin
gnica, con el ajuste de la etapa del tumor, el Eastern Cooperative
Oncology Group (ECOG) estado funcional, el sexo y la condicin de
fumador.

RESULTADOS

Expresin de RRM1 y su ARNm correspondiente


Las muestras de antisuero a pptidos RRM1 se generaron y se designan
R1AS-1 a R1AS-10. La especificidad para la protena RRM1 se muestra, y
la inmunoreactividad se encontr en los extractos nucleares de las lneas
celulares de cncer de pulmn ( Figura 1 FIGURA 1
Inmunotransferencias de lneas celulares de cncer de pulmn.
). Con el uso de la microscopa confocal, tincin RRM1 mostr un patrn
grueso nuclear ( Figura 2 FIGURA 2
Microscopa Confocal de RRM1, ERCC1, y PTEN expresin en la lnea
celular NCI-H23.
). ERCC1 y PTEN se incluyeron en el anlisis porque los datos anteriores
haban sugerido una correlacin positiva en los niveles de expresin
entre estos genes. ERCC1 se localizan predominantemente en el ncleo
y tena un patrn de grano fino, mientras que PTEN se encuentra
principalmente en el citoplasma.
Utilizando la tcnica de AQUA, evaluamos la expresin RRM1 con R1AS-6
y R1AS-10 en un microarray. Esta matriz contiene triplicados de 25
ejemplares de una variedad de tejidos humanos, incluyendo 12 de
clulas no pequeas muestras de cncer de pulmn. En todos los
tejidos, la expresin RRM1 mostr un patrn nuclear granular, y el
anlisis de ambas muestras de antisuero confirm los resultados
obtenidos en las lneas celulares ( Figura 2 ). Las puntuaciones de
expresin gentica vari desde 20,3 hasta 200,5 (mediana, 114,1, con
una media, 111.0) para R1AS-6 y 36,1 a 182,7 (mediana, 85,4; media,
93,5) para R1AS-10. RRM1 expresin era ms alta en el intestino
delgado, corteza renal, y el estmago y el ms bajo en la epidermis, de
la laringe y trquea.
Especmenes tumorales de 44 pacientes estaban disponibles para el
anlisis de protena y ARN RRM1. Con la muestra R1AS-6 antisuero, hubo
correlacin significativa entre la protena RRM1 y su mRNA (rho de
Spearman = 0,41, P = 0,004). Tambin se analizaron las mismas 44
muestras para ERCC1 y PTEN y ARNm. No hubo correlacin significativa
entre la protena y la expresin de ARNm de ERCC1 (rho = 0.1, P> 0,30)
o para PTEN (rho = 0.1, P> 0,30).
RRM1 y supervivencia despus de la reseccin quirrgica
Hemos construido un microarray de tejido con el uso de ncleos por
triplicado 0,6 mm de fijado con formalina y embebido en parafina las
muestras de tumor primario. El anlisis de la expresin RRM1 por AQUA
con R1AS-6 se realiz en muestras obtenidas de 187 pacientes que
haban sido sometidos a una reseccin quirrgica completa de la etapa I
del cncer de pulmn de clulas no pequeas y no haban recibido
quimioterapia o radioterapia antes de la reseccin. R1AS-6 fue
seleccionado en lugar de R1AS-10 debido a su mejor correlacin con la
expresin de RRM1 ARN y su mayor rango dinmico de expresin.
Adems, las condiciones de tincin especficas eran ms adecuados para
la identificacin simultnea de los ncleos, citoqueratina y RRM1 . La
puntuacin AQUA vari desde 8,3 hasta 96,2 (mediana, 40,5; media,
43,2) para todas las muestras. El valor medio para la expresin RRM1
fue elegida a priori para dividir a los grupos de pacientes en un grupo de
alta expresin y de un grupo de bajo expresin.
La mediana de supervivencia libre de enfermedad en pacientes con
tumores que tenan bajos niveles de RRM1 (puntuacin de la expresin
de genes, <40,5) fue 54,5 meses (95% intervalo de confianza [IC], 32,9-
74,2). Para los pacientes con tumores que tenan altos niveles de RRM1
(puntuacin de la expresin de genes,> 40,5), la supervivencia libre de
enfermedad fue de ms de 120,0 meses. Esta diferencia fue
estadsticamente significativa (P = 0,004; razn de riesgo de baja vs alta
expresin, 2,2)
Las estimaciones de Kaplan-Meier de supervivencia libre de enfermedad
y la supervivencia general entre los 187 pacientes con completamente
resecado, en estadio I no pequeas -Cncer de pulmn, segn nivel de
expresin RRM1.
). La mediana de supervivencia global fue de 60,2 meses (IC 95%, 47,3-
88,2) de los pacientes con tumores con niveles bajos de RRM1 y ms de
120 meses para aquellos con altos niveles de RRM1. Esta diferencia fue
significativa (P = 0,02; razn de riesgo de muerte para los pacientes con
niveles RRM1, 1,6) .En un anlisis multivariado que incluy la expresin
RRM1, estadio del tumor, el estado funcional ECOG, el sexo y la
condicin de fumador, RRM1 fue la nica variable que se asoci
significativamente con la supervivencia libre de enfermedad (p = 0,03);
la asociacin con la supervivencia global, sin embargo, no fue
estadsticamente significativa (P = 0,11).
No se encontr asociacin significativa entre la expresin RRM1 y
estadio tumoral, tipo histolgico, o la edad, el sexo, el estado funcional
ECOG, la ausencia o presencia de prdida de peso y el consumo de
tabaco.
Asociacin de Expresin RRM1 con ERCC1 y la expresin de PTEN
AQUA calificaciones de RRM1, PTEN, y la expresin de ERCC1 en 184
pacientes estaban disponibles. Las calificaciones de RRM1 no se
correlacionaron con los de PTEN (rho = -0,07, P> 0,37), y la expresin de
PTEN no se asoci significativamente con la supervivencia (P = 0,08
para la supervivencia libre de enfermedad, y P = 0,11 para la
supervivencia global). Sin embargo, las puntuaciones AQUA se
correlacionaron significativamente con ERCC1 (rho = 0,3, P <0.001)
Diagrama de dispersin Comparando RRM1 y expresin ERCC1 Protena.
Se agruparon los 184 pacientes con puntuaciones de ambas protenas
en cuatro categoras. Con las puntuaciones medianas para RRM1 y
ERCC1 utilizados como valores de corte, 55 pacientes tenan tumores
con elevada expresin de ambas protenas (alta / baja), 54 tenan una
baja expresin de ambos (bajo / bajo), 38 tenan una alta expresin
RRM1 y baja expresin ERCC1 (alto / bajo), y 37 tenan bajo RRM1 y alta
ERCC1 (alta / baja). Se generaron curvas de supervivencia de Kaplan-
Meier.
Los pacientes en el grupo alto alto / tuvieron una mediana de
supervivencia libre de enfermedad y una mediana de supervivencia
global de ms de 120 meses, que fueron significativamente ms largos
que los de los pacientes de los otros grupos (p = 0,01 para la
supervivencia libre de enfermedad, y P = 0,02 para la supervivencia
global). Los resultados para los pacientes en el grupo de alto-bajo /
(supervivencia libre de enfermedad, 56,0 meses, la supervivencia global,
80,0 meses), el grupo alto / bajo (supervivencia libre de enfermedad,
51,0 meses, la supervivencia global, 56,8 meses), y el bajo / grupo bajo
(supervivencia libre de enfermedad, 61,4 meses, la supervivencia global,
66,5 meses) fueron similares (P> 0,51 para la supervivencia libre de
enfermedad, y P> 0,73 para la supervivencia global).
DISCUSIN
RRM1 est involucrado en la invasividad tumoral y la metstasis. 12,13
PTEN, una fosfatasa bifuncional que regula la sealizacin celular, la
supervivencia, y la migracin, 25 se piensa para mediar estos efectos de
RRM1. El aumento de la expresin de RRM1 disminuye la formacin de
metstasis, inhibe el desarrollo de tumores pulmonares inducidos por
carcingenos, y prolonga la supervivencia en los ratones portadores de
tumores. 12-14 Una asociacin entre la alta expresin de RRM1, segn lo
determinado por cuantitativa, en tiempo real de RT -PCR, y la
supervivencia prolongada se ha informado en pacientes con cncer de
pulmn de clulas no pequeas. 11 Datos similares fueron reportados
por ERCC1 . 24 Los resultados de los conjuntos de datos pequeos han
sugerido la expresin de coordenada de RRM1 y ERCC1 en el cncer de
pulmn de clulas no pequeas . 17,26 Los datos recientes han
proporcionado evidencia de una fuerte asociacin entre la expresin de
ERCC1 nuclear, segn lo medido por la puntuacin inmunohistoqumica
visual, y el resultado clnico. 27
Anlisis de la protena RRM1 en clulas no pequeas muestras de cncer
de pulmn no ha sido posible hasta la fecha debido a las limitaciones
tcnicas. Nuestro estudio mostr que la protena RRM1 en clulas de
cncer de pulmn de clulas no pequeas es nuclear, altamente
correlacionada con la expresin de ERCC1, y se asocia
significativamente con la supervivencia general y libre de enfermedad.
Nuestros datos muestran que la cota alta expresin de RRM1 y ERCC1
define un subgrupo de pacientes con un resultado excelente. Estos
pacientes representaban aproximadamente el 30% de nuestros
pacientes (55 de 184) que se sometieron a ciruga de cncer de pulmn
potencialmente curativo. Aunque la alta expresin de cualquiera de las
protenas por s sola se asoci con un buen pronstico, la co-expresin
de las dos protenas caracteriza al grupo con un resultado excelente.
La aparente falta de una asociacin entre RRM1 y PTEN contrasta con la
correlacin positiva se inform anteriormente entre estos genes a nivel
del ARN. 11 Esta discrepancia puede deberse a la diferencial,
procesamiento post-traduccional o compartimentacin de PTEN y RRM1
o a problemas tcnicos.
Anteriormente, la determinacin de la expresin RRM1 era tcnicamente
difcil. Sin embargo, con el desarrollo de una tcnica de
inmunohistoqumica y la integracin de un sistema totalmente
automatizado y cuantitativa, el anlisis de expresin gentica para
RRM1 y ERCC1 ahora es objetiva, fiable y reproducible.
Este desarrollo tcnico es importante en el contexto de los datos
recientes que muestran que altos niveles de expresin de RRM1 y ERCC1
son predictivos de la resistencia del cncer de pulmn de clulas no
pequeas a la gemcitabina y el platino. Por otra parte, no estn
animando a los datos preliminares de los ensayos utilizando Anlisis de
la expresin basada en el ARN de estos genes para la toma de
decisiones sobre el tratamiento. 30,31 Dado que los altos niveles de
expresin de ambos genes estn asociados con la supervivencia a largo
en los pacientes con cncer de pulmn completamente resecado y
tambin se asocian con una mala respuesta a la quimioterapia con
gemcitabina y platino, un ensayo que comparaba el tratamiento
estndar actual con el tratamiento adyuvante seleccionado sobre la
base de RRM1 y expresin ERCC1 parece estar justificado.
Apoyado en parte por subvenciones (R01-CA102726 y R21-CA110487)
del Instituto Nacional del Cncer y de las donaciones de Ann y David
Murphey y Amy y James Shimberg.
El Dr. Bepler informa que tiene una solicitud de patente pendiente en el
uso de RRM1 con o sin ERCC1 como marcador pronstico de resultado
en el cncer y para la prediccin de la respuesta a la terapia. Se inform
de ningn otro posible conflicto de intereses pertinentes a este artculo.

FUENTE DE INFORMACIN
Desde la Divisin de Oncologa Torcica del Centro del Cncer H. Lee
Moffitt y el Instituto de Investigacin, Tampa, FL.
Dirigir las solicitudes de reimpresin al Dr. Bepler del Centro Oncolgico
H. Lee Moffitt y el Instituto de Investigacin, MRC-4W, Rm. 4046, 12902
Magnolia Drive, Tampa, FL 33.612 a 9497, o al beplerg@moffitt.usf.edu .

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