Controlul microbiologic al

produselor farmaceutice
conform FRX i
Suplimentelor
 Controlul contaminrii
microbiene
= determinarea numrului total de
microorganisme aerobe sau lipsa unor
microorganisme patogene sau
condiionat-patogene, eventual prezente
n produsele farmaceutice, de la materiile
prime pn la formele finite (FRX)
FRX cuprinde:
IX. Monografii Metode generale de analiz
IX.F. Determinri biologice i biochimice
IX.F.1. Sterilizare
IX.F.2. Controlul sterilitii
IX.F.3. Contaminare microbian
IX.F.4. Controlul eficacitii conservanilor
antimicrobieni
IX.F.5. Activitatea microbiologic a antibioticelor
IX.F.9. Impuriti hipotensive
IX.F.10. Impuriti pirogene
IX.F.11. Impuriti toxice
FRX Suplimentul 2001 cuprinde:
5.1.4. Calitatea microbiologic a
preparatelor farmaceutice
5.2.8. Reducerea riscului transmiterii
agenilor infecioi responsabili de
encefalopatia spongiform animal prin
produse medicamentoase
Farmacopeea European cuprinde:
2.6. Biological tests
2.6.1. Sterility
2.6.2. Mycobacteria
2.6.7. Mycoplasmas
2.6.8. Pyrogenes
2.6.12. Microbiological examination of non-sterile
products total viable aerobic count
2.6.13. Microbiological examination of non-sterile
products test for specified microrganisms
2.6.14. Bacterial endotoxins
2.6.27. Microbiological control of cellular products
Controlul calitii substanelor
farmaceutice i a formelor
farmaceutice reprezint o obligaie
i n acelai timp o msur de
verificare a siguranei utilizrii
compuilor respectivi.
 Forme farmaceutice sterile
FORME PARENTERALE
FORME OFTALMICE
PREPARATE PENTRU
IRIGAREA ORGANELOR
n condiii sterile se prepar i
formele farmaceutice aplicate pe
plgi deschise, arsuri, pielea
sugarilor sau cele care conin
antibiotice.
 Preparate farmaceutice
parenterale
Se injecteaz direct prin piele sau
mucoase n compartimentele
interne ale organismului se
sustrag primei linii de aprare =
pielea i mucoasele.
 Preparate farmaceutice
oftalmice
Sunt plasate n contact direct cu
esuturi foarte sensibile (mucoasa
ocular) la contaminarea
microbian, ceea ce impune
aceleai exigene ca i pentru
formele parenterale.
 Soluii pentru irigare, splare sau
aplicare n cavitile corpului
n timpul irigrii, cantiti
substaniale din aceste soluii pot
ptrunde n patul circulator, prin
vasele de snge deschise ale
rnilor sau mucoaselor distruse.
 Gradul de puritate microbian a preparatelor farmaceutice
(dup F.I.P. Richtlinien, citat de Bauer K.H. -1993)
Grupa Forma farmaceutic Exigene
1a Forme parenterale Sterilizare n condiii impuse de Farmacopee
1b Forme oftalmice Absena germenilor viabili n 1 g sau 1 mL
Forme destinate a fi applicate n
caviti corporale, normal lipsite de
germeni, pe ulceraii grave i arsuri

2 Forme pentru aplicaii locale, de ex.
Pe leziuni ale pielii, nas, gt, ureche
(produse cu risc ridicat)
3 Alte forme farmaceutice
Limite n germeni viabili 102 germeni/g sau mL fr enterobacterii,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus
Limite n germeni viabili: 103-104 bacterii aerobe/g sau /mL;
102/g sau /mL levuri i ciuperci;
Limite pentru germeni specificai:
absena E.coli n 1g sau 1mL n unele cazuri;
absena de Salmonella n 1g sau 1 mL;
alte enterobacteriacee max: 102/g sau /mL
absena Pseudomonas aeruginosa n 1g sau 1 ml
absena Staphylococcus aureus n 1g sau 1mL.
 Contaminarea microbian
Prelevarea i prelucrarea probelor
I. Determinarea numrului total
de microorganisme aerobe
a. nsmnare direct n mediul de
cultur
b. Filtrare prin membran
II. Punerea n eviden a
microorganismelor patogene
sau condiionat-patogene
 Prevenirea contaminrii
microbiene
Presupune procese tehnologice n
care sunt prevzute camere
sterile, ce corespund celor 4 clase
de curenie. Cea mai riguroas
este clasa A: numrul maxim de
particule pe m3 este 0, UFC este
0, ritmul de schimb al aerului este
0,3m/s (curgere laminar/vertical
a aerului).
 Prevenirea contaminrii
microbiene
Aerul este filtrat prin filtre HEPA (=
High Efficiency Particulate Air), pentru
limitarea particulelor de praf sau a
germenilor n camerele de preparare.
Operatorii vor purta echipament din
fibre monofilament, materiale poliamidice
sau terilen, pentru a ceda un numr
sczut de scame, alturi de mnui,
nclminte, masc. NU ceasuri, farduri,
bijuterii!!!!!
 Prevenirea contaminrii
microbiene
Materiile prime vor fi cu precdere
de sintez (= nu reprezint medii
prielnice pentru dezvoltarea
microorganismelor, spre
deosebire de cele vegetale i cele
animale). Apa folosit la
preparatele sterile trebuie s fie
ea nsi steril monografia
Aqua destillata ad iniectabilia
 Prelevarea i prelucrarea
probelor
Se efectueaz n condiii aseptice.
Se iau n lucru 10 g sau 10 mL prob rezultat
prin omogenizarea coninutului din mai multe
recipiente.
n funcie de natura probei de analizat
substane i preparate farmaceutice hidrosolubile,
substane i preparate farmaceutice de natur nelipidic
insolubile n ap,
substane i preparate farmaceutice de natur lipidic,
aceasta se dilueaz, se dizolv, se suspend
sau se emulsioneaz ntr-un solvent
corespunztor.
I. Determinarea numrului total
de microorganisme aerobe
a. nsmnare direct n mediul de
cultur
Determinarea numrului de
bacterii aerobe
Determinarea numrului total de
fungi (levuri i fungi filamentoi)
Determinarea numrului total de
bacterii coliforme pe gram sau pe
mlilitru prob
a. nsmnare direct n mediul de cultur
Determinarea numrului de bacterii aerobe

Diluiile probelor se aduc n plci Petri

cu mediu corespunztor.
Se rotete uor placa pentru
amestecarea celor dou.
Se las la solidificat la temperatura
camerei i apoi se incubeaz la 30-
35C, 48 h.
Se numr coloniile de bacterii
aerobe dezvoltate.
 a. nsmnare direct n mediul de cultur
Determinarea numrului total de fungi

Fa de determinarea anterioar,
se folosete un mediu adecvat
(Sabouraud) i incubarea se
efectueaz la 20-25C, 7 zile.
Numrarea coloniilor se
realizeaz dup 3, 5, 7 zile.
 a. nsmnare direct n mediul de cultur
Determinarea numrului total de bacterii
coliforme pe gram sau pe mlilitru prob
Bacterie coliform = bacterie Gram-negativ, ce
nu formeaz spori, ce fermenteaz lactoza i
care triete n tractul gastro-intestinal a
numeroase organisme
Se nsmneaz diluii n eprubete cu dou
medii de cultur diferite, meninndu-se la
dou temperaturi diferite 48 h.
Se examineaz eprubetele n care s-au
dezvoltat bacteriile cu depunere de gaz.
Numrul maxim de bacterii coliforme pe gram
sau mililitru prob se calculeaz conform
tabelului din FRX.
 b. Filtrare prin membran
Se folosete pentru preparate farmaceutice
sub form de soluie.
Se folosesc membrane filtrante cu diametrul
porilor de cel mult 0,45 0,02 m.
Dup filtrarea probei prin dou membrane
filtrante, se aeaz:
prima membrana filtrant pe suprafaa unei plci
Petri care se incubeaz la 30-35C, 48 h colonii
de bacterii
a doua membran filtrant pe suprafaa unei plci
Petri care se incubeaz la 20-25C, 7 zile
colonii de fungi
Plcile au medii diferite!
Se calculeaz numrul de bacterii sau de fungi
pe gram sau pe mililitru prob de analizat.
 II. Punerea n eviden a
microorganismelor patogene sau
condiionat-patogene
Proba prelevat i prelucrat se
adaug mediului de cultur i se
omogenizeaz.
Se incubeaz la 35-37C, 24-48h.
Se efectueaz treceri pe alte
medii de cultur turnate n plci.
Se incubeaz la 35-37C, 24 h.
Staphyloccocus
aureus
Se confirm prezena
microorganismului
prin:
Efectuarea unui frotiu
colorat Gram
prezena cocilor gram
pozitivi rotunzi, n
grmezi
Testul de coagulare
al plasmei
Pseudomonas
aeruginosa
Se confirm
prezena
microorganis-
mului prin
testul
oxidazei.
Escherichia
coli
Se confirm
prezena
microorganis-
mului prin
testul indolului.
Salmonella
Se confirm
prezena
microorganis-
mului prin teste
biochimice
(testul TSI i
producerea de
H2S) i teste
serologice.
 Controlul eficacitii
conservanilor antimicrobieni
Conservani antimicrobieni =
substane chimice care se adaug
preparatelor farmaceutice sterile n
scopul evitrii unei eventuale
contaminri microbiene a acestora,
pe perioada folosirii sau unor
preparate nesterile n scopul
reducerii ncrcturii microbiene a
acestora
 Controlul eficacitii
conservanilor antimicrobieni
Microrganismele test folosite
pentru controlul eficacitii
conservanilor antimicrobieni sunt:
Staphylococcus aureus (ATCC 6538P)
Escherichia coli (ATCC 8739)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)
Candida albicans (ATCC 10231)
Aspergillus niger (ATCC 16404)
ATCC = American Type Culture Collection
http://www.lgcstandards-
atcc.org/en/Products/Cells_and_Microorganisms/Bacteria.aspx
 Interpretarea rezultatelor
Conservantul antimicrobian folosit
este considerat eficient pentru
proba de analizat dac reduce cu
un factor de cel puin 103 pe mililitru
numrul iniial de bacterii (n decurs
de 6 h de la inuculare) i cu un
factor de cel puin 102 pe mililitru
numrul iniial de fungi (n decurs
de 7 zile de la inoculare).
Activitatea microbiologic a
antibioticelor
Folosete metoda difuzimetric.
Se bazeaz pe compararea
zonelor de inhibiie ale creterii unui
microorganism-test, produse de
concentraii cunoscute dintr-un
antibiotic cu zonele de inhibiie
produse de concentraii presupuse
egale ale antibioticului de testat.
 Activitatea microbiologic a
antibioticelor
Activitatea microbiologic a antibioticelor
se exprim n uniti internaionale sau n
micrograme pe miligram antibiotic de
analizat.
Proba de analizat este corespunztoare
dac activitatea microbiologic a
acesteia este de cel puin 90,0% i de cel
mult 110,0% fa de activitatea
microbiologic a antibioticului standard.
 Impuriti hipotensive
n biosinteza antibioticelor pot s
apar metabolii a cror aciune
principal = scderea tensiunii
arteriale = impuriti hipotensive.
Controlul lor se realizeaz prin
msurarea tensiunii arteriale a
pisicilor adulte de ambele sexe cu
masa corporal de 2-3 kg.
 Impuriti hipotensive
n prealabil, se testeaz
sensibilitatea animalelor prin
administrare de soluie standard
de histamin. Dac animalele au
rspuns corespunztor la acest
test, li se administreaz iv proba
de medicament supus controlului.
 Impuriti hipotensive
Medicamentul este considerat
corespunztor, dac produce o
scdere a tensiunii arteriale a
animalului echivalent cu
hipotensiunea provocat de 0,10
g histamin baz pe kilogram
corp.
 Impuriti pirogene
Impuriti pirogene = endotoxine
(=complexe proteolipopolizaharidice)
produse de diferite microorganisme care
difuzeaz n mediul n care se dezvolt.
USP XX: o soluie care injectat la iepuri,
n cantitate de 10 mg/kg mas corporal,
provoac o cretere a temperaturii de
0,6C sau mai mult de 1,4C, n total
pentru 3 iepuri.
O soluie poate fi steril, dar pirogen,
dac ea conine cadavre de bacterii sau
fragmente ale pereilor microbieni (deci cu
endotoxine).
 Impuriti pirogene
Proprieti:
Pirogenitate
Toxicitate
Rezisten la cldur (distrugere
180C, 2 h)
Trec prin cea mai mare parte a filtrelor
sterilizante utilizate n procesul de
fabricaie a preparatelor injectabile
 Impuriti pirogene
1-2 g endotoxin injectat la un om adult determin o
febr ce dureaz 4-5 ore, frisoane intense, cianoz,
puls rapid, dispnee, cefalee, tulburri lombare.
Surse de pirogene:
Solveni apa distilat nesteril sau pstrat
necorespunztor pn la nfiolare
Substana activ confer pirogenitate ntregii
soluii, chiar dac apa este depirogenat
Utilajele tehnologice
Personalul operator
Aeromicroflora spaiilor de producie
Recipiente de condiionare primar: fiole, flacoane
nesplate sau nesterilizate, fisurate sau nchise
defectuos
 Impuriti pirogene
Msuri de prevenire:
Utilizarea unor materii prime
conform standardelor de calitate
Curarea sticlriei cu soluii
alcaline i apoi ap apirogen
Desfurarea procesului tehnologic
s se realizeze n condiii controlate.
 Impuriti pirogene
Testul de pirogenitate se execut
pe 3 iepuri, prin injectarea iv a
unei cantiti de soluie prevzut
n monografie.
nainte de injectare, se determin
temperatura animalelor luate n
lucru.
 Impuriti pirogene
Dup injectare, iepurii se menin
n aceleai condiii timp de 3 ore,
iar msurarea temperaturii se face
de 4 ori la intervale de 45 minute.
Produsul se consider
corespunztor, dac suma celor
trei modificri individuale maxime
de temperatur nu depete
1,15C.
 Impuriti pirogene
Dac aceast valoare depete
2,65C, produsul este respins.
Dac valoarea este cuprins ntre
1,15C i 2,65C, se repet proba
pe nc trei animale.
Determinarea se poate repeta
pn la un total de maxim 12
animale.
 Impuriti toxice
Determinarea impuritilor toxice se
efectueaz pe oareci albi, sntoi,
de ambele sexe (femelele nu trebuie
s fie gestente) cu masa corporal de
18-22 g.
Proba luat n lucru se dizolv n ap
steril sau n solventul specificat n
monografie, n concentraia prevzut
n monografia respectiv.
 Impuriti toxice
Dac nu se prevede altfel, se
administreaz iv la 5 oareci albi
cte 0,5 mL soluie-prob, ntr-un
interval de 5-10 secunde, cu un
debit constant.
Animalele se in sub observaie
24 h.
 Impuriti toxice
Proba de analizat este
considerat corespunztoare,
dac nici un animal nu prezint
fenomene toxice (convulsii,
parez, etc), imediat dup
injectare i dac toate animalele
supravieuiesc pn la sfritul
perioadei de incubaie.
 Impuriti toxice
n caz contrar, determinarea se repet
o dat sau de mai multe ori, pe loturi
nefolosite de 5 oareci, dar fr s se
depeasc 30 de animale de
experien.
Proba de analizat este
corespunztoare dac cel mult 10%
din numrul total al animalelor prezint
fenomene toxice sau mor.
Toate determinrile pe animale se
efectueaz n conformitate cu
prevederile Comisiei de Etic.
Comisie de etic - organ independent, compus din
profesioniti din domeniul sntii i din membri care nu
sunt medici, nsrcinat cu protejarea drepturilor,
siguranei i strii de bine a participanilor la un studiu i
cu asigurarea publicului cu privire la aceast protecie, n
special prin formularea unei opinii asupra protocolului
studiului, aptitudinilor investigatorilor i adecvrii
facilitilor, precum i asupra metodelor i documentelor
care ar trebui utilizate pentru informarea participanilor la
studiu, n vederea obinerii consimmntului lor exprimat
n cunotin de cauz. (Anexa OMS 904/2006, Capitolul
IV, art. 21, alineat k).
http://www.bioetica-medicala.ro/
 Endotoxine bacteriene
Endotoxine = componente
structurale ale peretelui celular
(lipopolizaharide) al unor bacterii
Gram negative i sunt eliberate n
cursul distrugerii acestora.
Determin reacie febril.
Rezist unor temperaturi foarte
nalte. Pot fi inactivate la 180C, 3
h.
 Endotoxine bacteriene
Este foarte important testarea prezenei n
preparatele farmaceutice cu administrare
parenteral, ce pot fi absorbite cu uurin n
circulaia sistemic.
Testul pentru endotoxine bacteriene este
utilizat n vederea detectrii sau cuantificrii
endotoxinelor provenite de la bacterii Gram -,
utiliznd lizat amoebocitic din Limulus
polyphemus sau Tachypleus tridentatus
(specii de crabi-potcoav).
 Endotoxine bacteriene
F Eur 6 specific 6 metode de lucru:
Metoda A: gel-cheag (Gel clot
method) test limit
Metoda B: gel-cheag test semi-
cantitativ
Metoda C: metoda turbidimetric
cinetic (Turbidimetric kinetic
method)
 Endotoxine bacteriene
Metoda D: metoda cromogen
cinetic (Chromogenic kinetic
method)
Metoda E: metoda punctului final
cromogen (Chromogenic end-
point method)
Metoda F: metoda punctului final
turbidimetric (Turbidimetric end-
point method)
 Endotoxine bacteriene
Reactivul este chiar lizatul liofilizat de
amoebicid.
ntr-o fiol apirogen se introduc un volum
egal din reactiv i soluia de testat.
Se incubeaz la 37C, 1 h.
Reacie + n amestec are loc o
cretere a vscozitii, o coagulare sau
gelificare, prezentnd aderen de pereii
eprubetei
https://www.youtube.com/watch?v=N_IK
Ms2I-do
 Endotoxine bacteriene
Pentru efectuarea testului, se pot
efectua oricare din cele 6 metode.
n cazul unor dezacorduri, decizia
final se va lua n baza metodei
A, cu excepia situaiilor n care
monografia prevede o alt
metod.
 Endotoxine bacteriene
Cantitatea de endotoxine prezent n
prob este exprimat n Uniti
Internaionale (UI).
Echivalena n Uniti Internaionale a
Standardului Internaional este stabilit
de Organizaia Mondial a Sntii.
O Unitate Internaional (UI) este
egal cu o Unitate de Endotoxin (UE).
 Endotoxine bacteriene
Decizia de a folosi testul pentru endotoxine
bacteriene drept test limit implic:
Cunoaterea concentraiei maxime
admise de endotoxin pentru produsul
analizat
Scopul testului este de a afla dac
valoarea concentraiei de endotoxin n
produsul analizat este mai mic sau mai
mare dect concentraia limit.
 Endotoxine bacteriene
Exemple (F Eur 6):
Amoxicillinum natricum
endotoxine bacteriene < 0,25 UI/mg
Amphotericinum B endotoxine
bacterine < 1,0 UI/mg
Ampicillinum natricum
endotoxine bacteriene < 1,0 UI/mg
Gel Clot Chromogenic Chromogenic Turbidimetric
Endpoint Kinetic
Semi- Quantitative Quantitative Quantitative
quantitative
Simple Least Requires Requires Requires
expensive, spectrophotometer incubating plate or incubating plate or
Requires 37 or plate reader tube reader tube reader
degree bath
Manually read and Can be automated, Can be automated, Can be automated,
recorded allows electronic allows electronic allows electronic
data storage data storage data storage

Sensitive down Sensitive down Sensitive down Sensitive down

to 0.03 EU/ml to 0.1 EU/ml to .005 EU/ml to .001 EU/ml *

* (Sensitivities vary by reagent manufacturer, instrumentation and testing conditions)

Manufacture of sterile medicines Advanced workshop for SFDA GMP

inspectors - Nanjing, November 2009
Reducerea riscului transmiterii agenilor infecioi
responsabili de encefalopatia spongiform animal
prin produse medicamentoase

Familia encefalopatiilor
spongiforme transmisibile (EST)
include:
Boala tremuratului la oi i capre
Encefalopatia spongiform a cervidelor
Encefalopatia spongiform bovin
Maladia Creutzfeldt-Jakob (MCJ) la om
Kuru la om
 Monografia urmrete implicaiile EST fa de
produsele medicamentoase de uz uman i
msurile ce trebuie luate pentru reducerea
riscului de transmitere prin utilizarea lor.
Se iau n considerare produsele de origine
animal utilizate pentru obinerea de:
Substane active
Excipieni
Materii prime utilizate n procesul de
producie (albumin seric uman,
enzime, medii de cultur, inclusiv cele
pentru prepararea bncilor de celule de
lucru sau a bncilor noi de celule
mam)
 Acceptabilitatea unui produs medicamentos
coninnd astfel de materiale depinde de mai
muli factori:
Documente i certificate de nregistrare
care s ateste originea animalelor
Natura esutului animal utilizat la fabricaie
Procedee de fabricaie
Calea de administrare
Cantitatea de esut utilizat pentru
produsul medicamentos
Doza terapeutic maxim
Utilizarea prevzut pentru produsul
medicamentos
 GELATINA
Produsul de hidroliz parial a colagenului,
proteina principal din constituia esuturilor
conjunctive
Materia prim pentru nveliul capsulelor
Gelatina Materia prim Tip

160 LB oase de bovine, porcine B(procesat alcalin)

160 LH piele bovine B

160 LB/LH Amestec de bovine/porcine oase i piele B

de bovine

200 AB Oase bovine A (procesat acid)

200 PS Piele de porc A

160 PS/LB/LH Amestec din piele de porc/oase de bovine A/B

i piele de bovine
S avei o zi frumoas!