Diagnóstico Laboratorial Da Clamídia

Ministrio da Sade
Carlos Csar Silva Albuquerque

Ministro de Estado da Sade
Antnio Joaquim Werneck

Secretrio de Assistncia Sade
Pedro Jos Novais Chequer

Coordenador Geral do Programa Nacional de DST/AIDS-MS
Miriam Franchini
Coordenadora Geral do projeto TELELAB
Autores:
Cludia Renata Fernandes Martins
Geni Neumann Nocetti de Lima Cmara
Jos Antnio Pinto de S Ferreira
Luiz Alberto Peregrino Ferreira
Luiz Fernando de Goes Siqueira
Maria Luza Bazzo
Miriam Franchini
Oscar Jorge Berro
Slvio Valle
Assessoria Pedaggica:
Maria Lcia Ricciotti Ribinik
Maristela Arantes Marteleto
Diagnstico laboratorial da Clamdid. - Braslia:

Ministrio da Sade, Programa Nacional de Doenas
Sexualmente Transmissveis e AIDS. 1997.
63p. : il. (Srie TELELAB)
1. Clamdia I. Programa Nacional de Doenas

Sexualmente Transmissveis e AIDS (Brasil). II. Srie
TELELAB.
Os responsveis pela implantao do
TELELAB empenharam toda sua capacidade
profissional para tornar este projeto digno da
qualidade tcnica e cientfica e da eficincia
que nossa coordenadora geral sempre
imprimiu s realizaes do Programa Nacional
de DST/AIDS do Ministrio da Sade.
Dr. Lair Guerra de Macedo Rodrigues,

exemplo de coragem e liderana, dedicamos
este trabalho.
Pedro Chequer
APRESENTAO _________________________________________________ 04
INTRODUO e CONCEITOS BSICOS _____________________________ 09

antgeno e anticorpo __________________________________________________ 09
anticorpos monoclonais, conjugado monoclonal, linhagem de clulas McCoy 10
fase slida_____________________________________________________________ 11
tipos de sistema de deteco __________________________________________ 12
sensibilidade e especificidade__________________________________________ 13
reprodutibilidade ______________________________________________________ 13
FUNDAMENTOS E METODOLOGIAS ________________________________ 17

as clamdias e seu ciclo biolgico ______________________________________ 18
metodologias disponveis para o diagnstico laboratorial ________________ 20
isolamento da Chlamydia trachomatis __________________________________ 22
metodologias recomendadas pelo PN-DST/AIDS_________________________ 24
IMUNOFLUORESCNCIA DIRETA ___________________________________ 27

funcionamento da IFD _________________________________________________ 27
material necessrio para IFD ___________________________________________ 28
execuo da IFD ______________________________________________________ 29
leitura e interpretao da IFD __________________________________________ 30
ENSAIOS IMUNOENZIMTICOS - TRIAGEM E CONFIRMATRIOS ______ 35

funcionamento do ELISA _______________________________________________ 35
material necessrio para ELISA _________________________________________ 40
execuo do ELISA ____________________________________________________ 41
leitura e interpretao dos resultados ___________________________________ 42
diagnstico confirmatrio ______________________________________________ 43
sorologia, Papanicolau e diagnstico da infeco por clamdia _________ 44
mtodo de controle aps o tratamento da infeco ____________________ 45
CONTROLE DE QUALIDADE _______________________________________ 49

preparo de lminas de controle ________________________________________ 49
importncia do protocolo e controle de qualidade internos _____________ 50
programa de avaliao externa da qualidade__________________________ 51
FRMULAS ______________________________________________________ 55
ANEXOS _________________________________________________________ 59
BIOSSEGURANA _________________________________________ I - XIV
CONSIDERAES FINAIS___________________________________ a - g
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
PNDST/AIDS/Ministrio da Sade Diagnstico laboratorial da CLAMDIA

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x identificar os procedimentos e tcnicas

recomendados pelo Programa Nacional
de DST/AIDS, do Ministrio da Sade, para
o diagnstico laboratorial da clamdia; e
x executar o diagnstico laboratorial da
clamdia obedecendo aos critrios
tcnicos, critrios de controle de
qualidade e cuidados de biossegurana
recomendados.

9
Introduo
Embora o tracoma, doena ocular causada pela Chlamydia

trachomatis, fosse conhecido desde 1500a.C., as primeiras suspeitas de
que pudessem ocorrer infeces por clamdia no trato genital feminino
datam de 1910. Em 1907, haviam sido descritas por Halberstaedter e
Von Prowazek incluses citoplasmticas em clulas raspadas da
conjuntiva de pacientes com tracoma. Em 1933, Findlay relacionou a
clamdia ao linfogranuloma venreo e, em 1957, foi relatado o primeiro
isolamento de Chlamydia trachomatis em material inoculado em ovos
embrionados de galinha. Foi somente a partir de 1965 que o isolamento
da clamdia passou a ser mais utilizado, com a padronizao do
mtodo de isolamento em cultura celular por Gordon e Quan. Esse
mtodo substituiu as tcnicas de isolamento em animais de laboratrio
e em ovos embrionados de galinha.
Conceitos bsicos
Antgeno - Ag
Antgeno qualquer agente que induz no organismo a produo dos
anticorpos e ao qual esses anticorpos podem se ligar especificamente.
Anticorpo - Ac
Anticorpo uma protena produzida pelo sistema imune em resposta a
um ou mais antgenos. O anticorpo pode se ligar de maneira especfica
ao antgeno. essa ligao entre antgeno e anticorpo que constitui a
base dos testes imunolgicos.
PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Diagnstico laboratorial da CLAMDIA

10
Anticorpos monoclonais
So anticorpos produzidos por hibridomas. Hibridomas so clones de
clulas originadas da fuso entre uma clula plasmtica normal,
produtora de anticorpos e uma clula de mieloma. Por exemplo, a
partir de um antgeno purificado da principal protena da membrana
mais externa (MOMP) da Chlamydia trachomatis , pode-se produzir Acs
em clulas plasmticas e depois fundir essas clulas com clulas de
mieloma. As clulas hbridas resultantes produziro anticorpos
especficos contra a MOMP, indefinidamente.
Conjugado monoclonal
um conjugado obtido pela unio de um anticorpo monoclonal com
uma molcula de substncia fluorescente ou com uma enzima.
Linhagem de clulas McCoy

Chama-se cultura celular cultura in vitro de clulas de um tecido.
Quando essas clulas so cultivadas sucessivamente, temos uma
linhagem celular. A linhagem de clulas McCoy originada de
fibroblastos de um tumor de camundongo. Essa linhagem forma uma
nica camada de clulas, monocamada, na superfcie plana de um
frasco para cultura celular. As figuras a seguir mostram um frasco de
cultura celular e uma monocamada de clulas McCoy, observada em
microscopia de contraste-de-fase.

11
Figura 1: frasco Figura 2: viso microscpica em

de cultura celular contraste de fase de uma mono-
camada de clulas McCoy
Fase slida
Fase slida qualquer material no qual se fixa o antgeno ou o
anticorpo para realizao de testes imunolgicos. No diagnstico das
infeces por Chlamydia trachomatis, as fases slidas podem ser:
placas de microtitulao - so o suporte slido mais comumente

utilizado. Normalmente, so produzidas com poliestireno transparente.
Os poos ou cavidades podem possuir fundo chato, arredondado ou
em "U". Sua apresentao geralmente corresponde a 96 cavidades em
uma pea nica ou em tiras de 8 ou 12 poos; e
prolas - esferas plsticas em cuja superfcie os antgenos e anticorpos

podem ser adsorvidos. So freqentemente utilizadas esferas com 4 ou 6
mm de dimetro.

12
Tipos de sistema de deteco

Sistema de deteco um conjunto de procedimentos utilizados para
determinar se o antgeno e o anticorpo ligaram-se de maneira
especfica. Podem ser de vrios tipos, tais como:
imunoenzimtico (ELISA) - A fosfatase alcalina e a peroxidase so as

enzimas mais utilizadas para detectar as ligaes antgeno e anticorpo.
Essas enzimas so conjugadas ou covalentemente ligadas a um
antgeno ou anticorpo, constituindo o conjugado imunoenzimtico. O
substrato especfico da enzima adicionado e degradado pela ao
da enzima. O produto da degradao do substrato vai agir no
cromgeno adicionado reao. A ortofenileno-diamina (OPD) ou a
3,31,5,51 - tetrametil-benzidina (TMB) so os cromgenos mais rotineiros.
O resultado da reao pode ser lido em espectrofotmetro com
filtros de comprimento de onda variando de 405 a 492 nm ou ainda
visualmente, quando o teste assim o permitir, ou for expressamente
indicado pelo fabricante. Dependendo do cromgeno utilizado, a cor
observada pode ser amarela, azul ou verde-azulada; e
imunofluorescncia - o detector um composto qumico fluorescente,

conjugado com uma anti-imunoglobulina. A substncia fluorescente
mais comumente usada o isotiocianato de fluorescena (FITC). Para a
leitura da reao, esse ensaio requer um microscpio para
imunofluorescncia.

13
Reprodutibilidade
Reprodutibilidade de um teste a capacidade de se obter
repetidamente, com uma mesma metodologia, resultados semelhantes
frente s mesmas amostras, mesmo quando estas forem testadas em
ordem ou momentos distintos.
Sensibilidade e Especificidade
Nenhum teste de diagnstico 100% eficaz. Alguns erros podem ser
decorrentes de questes relativas aos prprios testes. Dentre vrios
parmetros para descrever a qualidade dos testes, a sensibilidade e a
especificidade so as mais conhecidas.
Sensibilidade de um teste a capacidade que esse teste tem de
detectar a presena de antgeno ou de anticorpo em uma amostra
verdadeiramente positiva.
Especificidade de um teste a capacidade do teste de
identificar amostras verdadeiramente negativas.
Os resultados de sensibilidade e especificidade geralmente so
expressos em valores percentuais e so calculados por meio das
frmulas apresentadas a seguir.

14
AP-amostras positivas Sensibilidade = AP X 100

AN-amostras negativas
AP+FN
FP-amostras falso-positivas
FN-amostras falso-negativas
Especificidade = AN X 100
AN + FP
Veja um exemplo de aplicao dessa frmula.

Duzentas amostras de secreo uretral foram examinadas por
uma metodologia padro. Dessas, 50 eram positivas e 150 negativas.
Quando submetidas a um determinado teste, esse apresentou os
seguintes resultados: detectou 48 amostras positivas, ou seja, apresentou
resultado falso-negativo com 2 amostras; confirmou as 150 amostras
negativas, sem nenhum resultado falso-positivo.
AP = 48
AN = 150
FP = ZERO
FN = 2
Sensibilidade = 48 X 100
48 + 2 Sensibilidade = 96%
Especificidade = 150 X 100

150 + 0 Especificidade = 100%

17
O que so clamdias?
As clamdias so bactrias gram-negativas, parasitas obrigatrios

de clulas eucariticas. As clamdias dependem do aparato energtico
da clula hospedeira, porque no possuem um sistema de produo
de energia para o desenvolvimento do seu ciclo biolgico.
Devido s caractersticas peculiares da sua biologia, so
classificadas em uma ordem prpria, uma famlia, um nico gnero e
trs espcies. Veja:
Figura 1: classificao das clamdias

18
A espcie Chlamydia trachomatis possui quinze sorotipos, descritos

de acordo com seus determinantes antignicos que podem ser
relacionados a vrias doenas. Veja o quadro a seguir:
Principais doenas associadas aos sorotipos da Chlamydia trachomatis:
Sorotipos Principais doenas associadas
A, B, Ba, C Tracoma
L1, L2, L3 Linfogranuloma venreo (LGV)
D, E, F, G, H, I, J e K Uretrite no gonoccica (UNG), uretrite ps-gonoccica

(UPG), cervicite, doena inflamatria plvica (DIP),
endometrite, paratracoma, conjuntivite de incluso,
pneumonia do recm-nascido.
Como o ciclo biolgico da Chlamydia trachomatis?
O ciclo biolgico da Chlamydia trachomatis envolve a

participao de duas formas distintas: o corpsculo elementar (CE) e o
corpsculo reticular (CR). O CE com 300 a 400 nm de dimetro a
forma infectante e que resiste ao meio extracelular. O CE penetra na
clula por fagocitose, formando um vacolo citoplasmtico tambm
chamado corpsculo de incluso ou incluso citoplasmtica. Em
seguida, o CE diferencia-se em CR, com dimetro de 800 a 1000 nm. O
CR a forma replicativa, metabolicamente ativa e no infectante da
bactria. Os CR reproduzem-se por diviso binria e reorganizam-se em
CE. Durante o processo de reproduo, ocorre um acmulo de
glicognio na incluso citoplasmtica. Alm disso, o processo de
reproduo aumenta consideravelmente o tamanho da incluso
citoplasmtica, que chega a conter mais de 10.000 partculas,
ocupando at 3/4 do volume da clula hospedeira. Isso causa o
rompimento do vacolo e da clula, a liberao das partculas e,
conseqentemente, o reincio do ciclo biolgico, com a manuteno
do processo infeccioso.

19
Acompanhe, no esquema a seguir, o ciclo biolgico da

Chlamydia trachomatis, observando a seqncia de 1 a 6 indicada.
Figura 2: esquema representativo do ciclo biolgico da clamdia
Lembre-se
O CE a forma infectante que resiste ao meio extracelular e o CR
a forma replicativa, no infectante e intracelular.

20
Quais as metodologias disponveis para o diagnstico laboratorial da

Chlamydia trachomatis?
Existem diversas metodologias que podem ser utilizadas. A escolha

de um determinado mtodo deve levar em considerao a
prevalncia da infeco na populao que vai ser examinada, para
que se defina uma metodologia com sensibilidade, especificidade e
reprodutibilidade compatveis. Alm disso, importante que se
considere o custo-benefcio do teste, as dificuldades para a sua
execuo, os equipamentos, infra-estrutura laboratorial e o tempo
necessrio para a liberao dos resultados.
Os mtodos mais amplamente utilizados so os de deteco do
antgeno de clamdia na amostra clnica. Independente da
metodologia adotada, a qualidade da amostra clnica coletada fator
determinante do sucesso do teste. Lembre-se de que a clamdia uma
bactria intracelular obrigatria e que, se a amostra colhida no
contiver pelo menos 50 clulas epiteliais, podero ocorrer resultados
falso-negativos.
At esse momento a metodologia "padro-ouro" para o
diagnstico da clamdia a cultura celular, entretanto a rpida
evoluo dos testes de amplificao do DNA (PCR e LCR, por exemplo)
j suscitaram a reavaliao desse padro na comunidade cientfica. O
PN-DST/AIDS atualizar suas orientaes sempre que necessrio.
Veja, na prxima pgina, o quadro que relaciona as
metodologias disponveis, suas vantagens e limitaes:

21
METODOLOGIA VANTAGENS LIMITAES
Especificidade elevada Sensibilidade varivel

(98% ou mais). (70 a 95%).
Estocagem de cepas para Necessidade de infra-

controle de resistncia a estrutura laboratorial
antibiticos e concentrao compatvel.
Isolamento em inibitria mnima.
cultura celular Dificuldade em avaliar a
Visualizao das incluses de qualidade da amostra.
clamdia dentro das clulas.
Necessidade de cuidados
especiais para transporte
e acondicionamento da
amostra.
Sensibilidade e especificidade Necessidade de

acima de 95%. microscpio de
imunofluorescncia.
Infra-estrutura laboratorial simples. Leitura da lmina difcil e
Facilidade no transporte e subjetiva.
Imunofluorescncia acondicionamento das amostras.
direta (IFD) Execuo rpida da colorao.
Possibilidade de avaliao da
qualidade da amostra.
Possibilidade de uso como teste
confirmatrio para o ELISA de
triagem.
Sensibilidade de 85 a 95%. Especificidade de 80 a 95%.

Possibilidade de processamento Impossibilidade de
simultneo de um grande nmero controle de qualidade da
Ensaio imunoenzimtico de amostras. amostra.
ELISA de triagem Facilidade no transporte e Necessidade absoluta de
acondicionamento da amostra. teste confirmatrio.
Objetividade na leitura dos
resultados.
Testes realizados em menos de 30 Baixa especificidade

minutos. (entre 65 a 85%).
Testes rpidos Leitura feita a olho nu. Necessidade absoluta de
Possibilidade de execuo em testes confirmatrios.
consultrios e ambulatrios.
Sensibilidade e especificidade Necessidade de pessoal

PCR e LCR elevadas (acima de 95%). qualificado.
Custo elevado.

22
Como feito o isolamento da Chlamydia trachomatis?
Pelas suas exigncias energticas as clamdias no podem ser

cultivadas em meios artificiais, sendo imprescindvel a utilizao de
sistemas vivos, tais como linhagens contnuas de clulas.
A tcnica de isolamento em cultura celular, considerado "padro-
ouro", mtodo sensvel e especfico para o diagnstico das infeces
por Chlamydia trachomatis, exigindo, entretanto, uma infra-estrutura
laboratorial para o cultivo de clulas. por isso que os laboratrios de
virologia tm, em geral, melhores condies de realizar esta tcnica do
que os laboratrios de bacteriologia.
A linhagem de clulas McCoy, a mais utilizada para a cultura de
Chlamydia trachomatis. As clulas so mantidas em garrafas de plstico
estreis, atravs de repiques peridicos. Para o isolamento da clamdia
as clulas so cultivadas sobre lamnulas circulares em tubos de
centrfuga de fundo chato. Observe nas figuras 3 e 4.
Figura 3 Figura 4

23
A amostra deve ser mantida sob refrigerao entre 4 e 8C e o

intervalo de tempo entre a coleta e a inoculao no pode ultrapassar
24 horas. O transporte ao laboratrio deve ser feito em caixa trmica
com gelo. As amostras no inoculadas no prazo de 24 horas devem ser
estocadas a -70C at serem processadas.
O preparo da amostra para a inoculao comea logo aps a
coleta. O swab lavado vigorosamente em meio de transporte 2SP
(sacarose 0,2M; fosfato 0,02M; soro fetal bovino 10%; gentamicina,
10Pg/ml; vancomicina, 10Pg/ml e fungizona, 2,5Pg/ml).
A inoculao feita substituindo-se o meio de crescimento celular
no tubo de fundo chato pelo meio de transporte contendo a amostra.
Em seguida, o tubo centrifugado a 2000g por 1 hora a 35C, para que
os corpsculos elementares eventualmente presentes nas amostras
possam aderir-se membrana celular e ento penetrar na clula.
Os tubos so incubados a 37C e aps 48 horas as monocamadas
so fixadas com metanol por 10 minutos. A lamnula circular corada
com lugol ou com conjugado fluorescente.
Pela colorao com o lugol, as incluses contendo glicognio se
coram de castanho escuro, contra um fundo amarelo, sendo
examinadas em microscpio comum de campo claro.
Figura 4: incluso de clamdia

corada pelo lugol em microscpio
de campo claro

24
Na colorao de imunofluorescncia podem ser usados

conjugados de fluorescena com anticorpos monoclonais
comercialmente disponveis para esse fim. As lminas circulares coradas
so examinadas ao microscpio de fluorescncia. Os corpsculos de
incluso aparecero, rechaando o ncleo, como massas
citoplasmticas fluorescentes, verde-brilhantes, contra um fundo escuro
ou avermelhado. Observe a figura 5.
Figura 5: incluso de clamdia

corada por imunofluorescncia
Quais as metodologias recomendadas pelo PNDST-AIDS para o

diagnstico laboratorial da Chlamydia trachomatis?
Como regra geral, o Ministrio da Sade, atravs do PN-DST/AIDS

sugere um ensaio imunoenzimtico ELISA indireto para teste de triagem
e uma variao do mesmo como teste confirmatrio. Alm dos testes
do tipo ELISA, tambm a imunofluorescncia direta sugerida como
padro de trabalho.
A escolha de um desses mtodos deve ser avaliada levando em
considerao a prevalncia da infeco por clamdia na populao
que ser examinada. Alm disso, importante considerar o custo-
benefcio e as dificuldades para a execuo do teste; os equipamentos
e a infra-estrutura laboratorial necessrios e o tempo para a liberao
dos resultados.

27
Como funciona o teste de imunofluorescncia direta para clamdia?
O teste de imunofluorescncia direta corresponde a uma reao

especfica entre um antgeno MOMP da clamdia e um anticorpo
monoclonal especfico contra esse antgeno, conjugado a uma
fluorescena (isotiocianato de fluorescena - FITC). Veja, a seguir, a
representao esquemtica das reaes positiva e negativa do teste
IFD.
Figura 1: reao positiva de IFD
Figura 2: reao negativa de IFD

28
Qual o material necessrio para executar uma reao de IFD para

clamdia?
Conjunto diagnstico para IFD para deteco de clamdia;

lminas-controle;
pipeta de vidro para volumes de 1 a 5 ml;
pipeta automtica para volumes de 10 a 50 Pl;
ponteiras descartveis para pipeta automtica;
papel absorvente;
cmara mida;
cuba para lavagem de lmina tipo Koplin;
lamnula de vidro 22 x 40 mm ou 24 x 50 mm; e
microscpio de fluorescncia com sistema de filtro para isotiocianato
de fluorescena (FITC) e com capacidade de aumento de 400-500X e
1000X.
Diagnstico laboratorial da CLAMDIA PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade

29
Como fazer o teste de IFD?
O teste de IFD para diagnstico da clamdia deve ser realizado de

acordo com as instrues do fabricante do conjunto diagnstico
utilizado.
Mas, para executar corretamente esse teste e assegurar a
qualidade dos resultados, voc deve observar alguns procedimentos
bsicos:
1. leia as instrues do conjunto diagnstico;

2. separe todo o material necessrio para a execuo do teste;
3. siga rigorosamente as instrues do fabricante para o preparo de
tampes e outros reagentes;
4. deixe as lminas das amostras e as lminas de controle atingirem a
temperatura ambiente, antes de iniciar a colorao. O conjugado e
a soluo para a lavagem das lminas tambm devem estar em
temperatura ambiente;
5. organize seu protocolo;
6. siga rigorosamente as instrues do fabricante quanto aos volumes
pipetados, tempos de incubao, temperatura, nmero de lavagens
e montagem;
7. faa, obrigatoriamente, a colorao das lminas de controle em
paralelo com as lminas das amostras; e
8. utilize as lminas de controle como referncia para a leitura das
lminas em teste.
Veja no ttulo Controle de Qualidade deste manual como

preparar as lminas de controle para IFD da clamdia.
A temperatura ambiente em laboratrios clnicos deve estar entre
20 e 26C.

30
Como fazer a leitura e a interpretao da IFD?
A leitura das lminas feita em microscpio de fluorescncia com

aumento de 40 X ou 100 X (imerso).
Inicie a leitura pelas lminas-controle, observando atentamente o
padro de cor e tamanho dos corpsculos elementares.
O ponte de corte (cut off) da reao varia de um fabricante para
outro. Geralmente, para se confirmar um resultado positivo, preciso
encontrar 5 ou mais corpsculos elementares por esfregao. Este critrio
pode ser ajustado segundo sua experincia na prtica profissional.
O quadro a seguir apresenta os critrios para leitura e
interpretao dos resultados.
LEITURA INTERPRETAO
Ausncia de corpsculos fluorescentes em

Amostra no reagente
esfregao com mais de 50 clulas epiteliais.
Presena de pelo menos 5 corpsculos

elementares de cor verde-brilhante em tom
Amostra reagente
de ma verde com a forma de crculos
perfeitos.
Qualquer padro diferente dos descritos

anteriormente ou quando houver menos Amostra indeterminada
de 50 clulas epiteliais no esfregao.

31
Em funo da sensibilidade e especificidade acima de 95% do

teste de IFD, no necessria a realizao de um outro teste
confirmatrio.
A leitura das lminas da imunofluorescncia exige experincia e

ateno. aconselhvel a leitura de at 4 lminas por hora, com
intervalo entre as leituras.
Por isso, se seu laboratrio trabalha com um pequeno nmero de

amostras, voc pode escolher a IFD como padro de trabalho.
Caso contrrio, utilize um ELISA de triagem, submetendo as
amostras reagentes e indeterminadas a um teste confirmatrio.

35
Como funciona o ELISA para a deteco de antgeno de clamdia?
O ELISA para a deteco de clamdia diretamente de amostras

clnicas um ELISA indireto.
1. Esse teste usa anticorpo monoclonal anticlamdia, recobrindo prolas

plsticas (a), ou a superfcie interna de poos de microplacas (b), e que
corresponde fase slida da reao. Veja esse esquema:
2. A amostra clnica, tratada conforme recomendao do fabricante,

adicionada ao poo, contendo os anticorpos aderidos, por exemplo,
quando trabalhamos com microplacas:

36
3. Os antgenos de clamdia presentes na amostra ligam-se aos

anticorpos especficos da fase slida, mediante a incubao em
temperatura adequada e tempo determinado, segundo a procedncia
do teste. Observe o esquema a seguir:
4. A lavagem dos poos da microplaca vo retirar todo o antgeno que

no se ligou especificamente ao anticorpo monoclonal. Repare:
A etapa seguinte utiliza um anticorpo IgG anticlamdia produzido em

coelho, que representamos assim:

37
5. Esse anticorpo vai ligar-se durante a incubao ao conjunto do

antgeno e anticorpo de fase slida, representado j no item 4.
6. Outra etapa de lavagem vai retirar o que no se ligou ao complexo

antgeno-anticorpo da fase slida:
A prxima etapa utiliza um conjugado imunoenzimtico que pode ser

esquematizado assim:

38
7. A ltima etapa de incubao corresponde ao esquema abaixo:
8. Essa ltima etapa de lavagem muito importante para que no

fique conjugado no ligado ao complexo antgeno-anticorpo.

39
9. Por ltimo, adicionado o substrato da enzima, perxido de

hidrognio (H2O2), alm de um revelador, que pode ser o OPD (orto-
fenilenodiamina) ou o TMB. A presena de cor indica que havia
antgeno de clamdia na amostra.
ausncia de cor observao de cor

amostra positiva
Observe que essa metodologia para triagem. Para que se

considere um resultado positivo, necessrio o uso de um segundo
teste confirmatrio.
A vantagem do ELISA que podemos processar numerosas
amostras ao mesmo tempo e possvel a interpretao objetiva do
resultado por intermdio da leitura pelo espectrofotmetro.

40
Qual o material necessrio para executar uma reao de ELISA para

clamdia?
conjunto diagnstico de ELISA para clamdia, para triagem ou

confirmao;
pipeta de vidro de 1 e 5 ml;
pipetas automticas monocanal de 200-300 Pl, ou outros volumes
especificados pelo fabricante;
pipetas automticas multicanal, quando exigidas pelo conjunto
diagnstico;
lavadora compatvel com o conjunto diagnstico utilizado;
banho-maria a temperatura de 37 2C;
tubos de vidro;
estante para tubos de vidro;
recipiente de paredes rgidas, boca larga e tampa, contendo
hipoclorito de sdio a 2%;
agitador de tubos tipo vrtex; e
espectrofotmetro com filtro compatvel com o conjunto diagnstico
utilizado.

41
Quais os procedimentos para executar os ELISA?
Os procedimentos variam segundo o fabricante do conjunto de

diagnstico. Alguns procedimentos gerais devem ser observados:
1. leia todas as instrues do conjunto, antes de iniciar a reao;

2. confira os componentes, materiais e reagentes desse conjunto e
verifique que outros, no fornecidos, devem estar disponveis para a
realizao dos testes;
3. leia atentamente como preparar todas as solues antes de iniciar o
ensaio. Utilize exatamente os volumes indicados, no faa qualquer
alterao com o intuito de economizar tempo ou reagentes;
4. deixe as amostras e os reagentes atingirem a temperatura ambiente
antes de iniciar a reao;
5. organize seu protocolo;
6. siga rigorosamente os ciclos de lavagem indicados pelo fabricante,
tendo o cuidado de evitar a contaminao cruzada das amostras;
7. inclua, alm dos controles fornecidos pelo fabricante, controles
positivos e negativos produzidos em seu laboratrio (Controle de
Qualidade Interno - CQI); e
8. faa a leitura da absorbncia em espectrofotmetro com filtro
recomendado pelo fabricante.
Jamais extraia o antgeno da amostra clnica com agitao manual.

Sempre agite os controles e as amostras por agitao mecnica
vigorosa.

42
Alm disso, para garantir a qualidade dos resultados importante

que voc:
no use reagentes com prazo de validade vencido. Verifique se

os reagentes encontram-se dentro das especificaes, sem
turvao, precipitados ou com colorao alterada;
no misture controles, conjugados, prolas ou placas de
diferentes lotes e/ou fabricantes;
armazene os conjuntos para diagnstico de acordo com as
recomendaes do fabricante;
evite a contaminao microbiana dos reagentes;
no exponha o substrato luz durante a estocagem ou
incubao, pois poder ocorrer a fotodecomposio do mesmo;
no coloque o substrato em contato com substncias oxidantes
ou metais para evitar a precipitao que torna o produto
imprprio para o uso;
faa a limpeza e a manuteno peridica dos equipamentos de
lavagem, evitando assim o acmulo de sais e outros compostos
qumicos;
verifique sempre se o filtro usado para a leitura da absorbncia
aquele indicado pelo fabricante; e
certifique-se de que o filtro de leitura da absorbncia esteja
ntegro, livre de fungos e de sujidades e devidamente ajustado.

43
Como definir se um resultado de ELISA reagente ou no reagente?
Nos ELISA, o resultado de uma reao determinado pela leitura

da absorbncia ou densidade ptica (DO) obtida no final do ensaio.
Usualmente, cada ensaio tem sua forma de calcular o ponto de corte
(cut off) acima ou abaixo do qual as amostras so caracterizadas como
reativas ou no reativas. Os clculos so realizados a partir da mdia de
DO dos controles.
Ateno
Verifique como determinado o ponto de corte definido pelo
fabricante de cada conjunto e se este encontra-se dentro dos
valores aceitveis para os controles e para as amostras.
Para os ensaios indiretos, os valores de DO acima do ponto de

corte indicam que a amostra reagente e abaixo do ponto de corte
que a amostra no reagente.
Existe, porm, uma zona circunvizinha, chamada zona cinza ou
"borderline", dentro da qual no se pode ter certeza do resultado. As
formas de calcular o ponto de corte e a zona cinza variam de acordo
com o fabricante.
As amostras que apresentarem resultados positivos ou se
encontrarem na zona cinza - as indeterminadas - devem ser submetidas
a testes confirmatrios.

44
Como fazer o diagnstico confirmatrio quando o ELISA de triagem for

reagente ou indeterminado?
O teste confirmatrio pode ser um outro ELISA chamado de

reao de bloqueio ou "blocking test", que realizado em paralelo com
a repetio do ensaio de triagem. Para isso, utilize a mesma amostra
extrada para o primeiro teste.
Voc ter um resultado definitivo por meio da comparao dos
valores de densidade ptica obtidos nos dois ensaios.
A amostra ser positiva para clamdia quando a densidade ptica
obtida no ELISA de bloqueio for pelo menos 50% menor do que os
valores obtidos no outro ELISA. Caso contrrio, a amostra ser negativa.
Se voc no dispe dos reagentes para o ELISA de bloqueio, use
uma reao de imunofluorescncia direta para o diagnstico
confirmatrio.
Como preparar, a partir de uma amostra coletada para o ELISA de

triagem, lminas para confirmao por IFD?
1. pipete 250 microlitros do tampo de transporte, contendo a amostra

clnica extrada do "swab" em tubo cnico tipo Eppendorff e identifique
o tubo com o nmero da amostra;
2. centrifugue por 15 minutos a 13.000 a 15.000rpm;
3. despreze o sobrenadante e adicione 50 microlitros de tampo
fosfato PBS;
4. ressuspenda o "pellet" ou depsito, agitando vigorosamente em um
agitador de tubos at a completa dissoluo do depsito;
5. identifique a lmina com o nmero de amostra;
6. pipete 10 microlitros em cada demarcao da lmina de
imunofluorescncia;
7. deixe o lquido das lminas secar em temperatura ambiente; e
8. fixe o esfregao pingando 3 gotas de metanol e deixe secar em
temperatura ambiente.

45
A partir desse momento, siga as instrues que voc j viu no ttulo

Imunofluorescncia Direta deste manual.
O resultado positivo pela imunofluorescncia confirma os resultados
positivos indeterminados do teste de triagem por ELISA.
possvel fazer o diagnstico das infeces por clamdia por sorologia?
As tcnicas sorolgicas tm pouco valor no diagnstico das

infeces genitais. So raros os casos em que se consegue detectar os
anticorpos IgM anticlamdia, porque o primeiro contato com o antgeno
de clamdia, na maioria das vezes, passa despercebido clinicamente.
Quando se detectam anticorpos IgG, no possvel afirmar se foram
produzidos em infeco recente, se correspondem a cicatriz sorolgica
ou a reaes cruzadas. Os ttulos de IgG so geralmente baixos, mesmo
em indivduos com infeco em curso.
A deteco de anticorpos IgM tem valor diagnstico quando
usada em casos de suspeita de pneumonia por Chlamydia trachomatis
em recm-nascidos.
Em pessoas com sintomas de linfogranuloma venreo, a sorologia
pode ser til quando se constata o aumento significativo dos ttulos de
anticorpos IgG em duas amostras coletadas, com intervalo de 14 dias.
Essas amostras so chamadas amostras pareadas.
O exame citopatolgico pelo Papanicolau pode detectar clamdia?
O exame citopatolgico de esfregaos cervicais, corados pelo

mtodo de Papanicolaou, no recomendado para o diagnstico das
cervicites por Chlamydia trachomatis. A tcnica de baixa
sensibilidade e especificidade, devendo ser usada com extrema
cautela, apenas como diagnstico presuntivo, que deve
obrigatoriamente ser confirmado pelas tcnicas recomendadas pelo
PN-DST/AIDS-MS.

46
Qual o mtodo indicado para o controle aps tratamento das

infeces por clamdia?
Rotineiramente, no se faz controle de cura das infeces por

clamdia, pois, at o momento, no foi identificada resistncia da
clamdia aos antimicrobianos preconizados para o seu tratamento.
Apesar disso, se o clnico considerar necessria a realizao de
controle aps tratamento, o mtodo recomendado o isolamento em
cultura celular. A coleta do material deve ser feita duas semanas aps o
trmino do tratamento. As tcnicas de IFD e ELISA no devem ser
utilizadas, pois podem ocorrer resultados falsos-positivos decorrentes da
presena de antgenos de clamdia. Os antgenos de clamdia levam,
no mnimo, duas semanas para serem eliminados do organismo.

49
Como preparar lminas de controle de qualidade para IFD?
Se no for possvel adquirir comercialmente essas lminas,

possvel prepar-las no laboratrio.
Para o preparo dessas lminas, utilize uma amostra clnica positiva
para clamdia, no teste ELISA com D.O. acima de 2.
1. homogeneze o contedo do tubo de ELISA positivo e pingue uma
gota em cada lmina controle;
2. deixe secar temperatura ambiente;
3. fixe, pingando 3 ou 4 gotas de metanol;
4. deixe evaporar naturalmente;
5. identifique e embrulhe as lminas, uma a uma, em papel alumnio;
6. guarde em congelador a -20C;
7. core duas lminas de cada lote por IFD;
8. faa a leitura conforme referido no ttulo Imunofluorescncia Direta
deste manual; e
9. caso o resultado no seja o esperado, despreze-as e faa um novo
lote de lminas-controle.
O mesmo procedimento deve ser utilizado para o preparo de

lminas-controle negativo, partindo-se do tampo com amostra clnica
negativa para clamdia pelo teste ELISA.
Se o seu laboratrio no realiza a metodologia ELISA, entre em

contato com o PN-DST-AIDS TELELAB, para obter informaes
sobre como conseguir amostras positivas para o controle de
qualidade.

50
Qual a importncia de um protocolo de trabalho na realizao de um

teste?
O protocolo estabelece a ordem das amostras a serem testadas,

de forma que qualquer tcnico possa interpretar os resultados. Alguns
mtodos utilizam equipamentos para imprimir os resultados e o material
impresso deve ser guardado junto com o protocolo. Veja, no item
Anexos deste manual, alguns exemplos de protocolo.
Que outras medidas podem ser adotadas para assegurar resultados

confiveis?
Para assegurar que os resultados finais sejam confiveis, so

requisitos fundamentais:
utilizar amostras para controle de qualidade internos;
participar de um programa que fornea amostras-controle; e
participar de um programa de avaliao externa de qualidade.
O que controle de qualidade interno?
Controle de qualidade interno de um ensaio corresponde ao uso

de amostras positivas e negativas, obrigatoriamente includas em cada
ensaio. Essas amostras podem ser fornecidas pelos fabricantes ou
preparadas em seu laboratrio.
O preparo ou uso de amostras-controle prprias constitui um
excelente mecanismo de anlise de possveis variaes lote a lote. Os
controles tambm podem ser utilizados para avaliao da
reprodutibilidade dos testes, em um mesmo ensaio (intra-ensaio) ou
ensaios diferentes (interensaio), de um mesmo lote.

51
O que um programa de avaliao externa da qualidade?
Um programa de avaliao externa da qualidade envolve um

mecanismo de controle, no qual o laboratrio recebe um painel de
amostras que so includas na sua rotina. Os resultados obtidos so
enviados a um Centro de Referncia e analisados, possibilitando a
avaliao confidencial do desempenho de cada laboratrio.
Por que adotar medidas de controle e participar de avaliao externa

da qualidade?
A adoo das medidas descritas permite ao laboratrio garantir a

qualidade dos procedimentos utilizados e conseqentemente a
confiabilidade dos resultados.

55
EXEMPLO DE PROTOCOLO
ENSAIO IMUNOENZIMTICO (ELISA)
Protocolo n: __________ Data:

___/___/___
Nome comercial do conjunto para diagnstico: ___________________
Fabricante: ______________ Lote: ___________ Validade: ___/___/___
Tcnico responsvel: __________________
A B C D
1
2
3
4
5
Observaes "CUT OFF":
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

I
Para cuidar da sua segurana, da segurana de

seus colegas de trabalho e do meio ambiente,
obedea aos procedimentos bsicos de
biossegurana em laboratrios:
Figura 1. Smbolo de risco biolgico
PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Biossegurana

II
Todo cuidado pouco na manipulao de materiais biolgicos,

tais como soro, sangue ou secrees, fluidos orgnicos, tecidos, etc.
Redobre suas precaues, pois esses materiais so potencialmente
infectantes e muitas vezes esto contaminados com agentes etiolgicos
diferentes do que se est pesquisando, ou ainda desconhecidos. Nunca
pipete com a boca e jamais cheire placas de cultura.
A inativao do soro em banho-maria a 56 C por 30 minutos no
elimina o potencial infectante da amostra.
Lembre-se de que, com a automao, aumentou muito o nmero

de amostras processadas em laboratrio e, conseqentemente,
aumentou tambm o risco de contaminao. Como voc sabe, difcil
afirmar que um profissional se contaminou, de fato, em servio. Isso faz
com que as doenas infecto-contagiosas causadas por acidentes de
trabalho no sejam devidamente notificadas; em conseqncia, as
medidas de segurana envolvendo o biorrisco acabam no sendo
implementadas.
Biossegurana PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade

III
Use sempre Equipamento de Proteo Individual (EPI): avental ou

jaleco longo de mangas compridas e punho retrtil, luvas descartveis,
culos de proteo, pipetadores manuais ou automticos e, quando for
o caso, protetor facial.
Os EPI so regulamentados pelo Ministrio do Trabalho e seu uso

visa a minimizar a exposio do tcnico aos riscos e evitar possveis
acidentes nos laboratrios. Note que, s vezes, os profissionais de
laboratrio precisam de um tempo para se adaptar ao uso dos
equipamentos na sua rotina. O importante que voc se adapte e
incorpore a utilizao dos EPI sua prtica profissional. O uso indevido
dos EPI, ao invs de proteger, poder ocasionar acidentes.
Figura 2. Ilustrao dos principais equipamentos de proteo individual (EPI)

IV
Evite a formao e disperso de aerossis.

Aerossis so micropartculas slidas e lquidas com dimenses
aproximadas entre 0,1 e 50 micra que podem, caso contenham
microorganismos, permanecer em suspenso e plenamente viveis por
vrias horas.
A pipetagem, flambagem de alas, abertura de frascos e
ampolas, manipulao de seringas, agulhas, lancetas, lminas e outros
assemelhados podem gerar e propagar aerossis.
Abertura de frascos, ampolas, tubos e garrafas de cultura requer

cuidados especiais. Envolva a parte a ser aberta com um pedao de
gaze. Utilize um pedao de gaze para cada material, prevenindo assim
a contaminao cruzada. Descarte-a imediatamente em hipoclorito de
sdio a 2%.
Centrfugas, agitadores e maceradores, quando manipulados sem
as precaues e abertos antes da total parada ou trmino da
operao, igualmente podem contaminar o ambiente laboratorial.

V
Jamais reencape agulhas. Esse procedimento uma das

principais causas da contaminao de profissionais de sade por
microorganismos, existentes no sangue e em outros fluidos orgnicos,
como por exemplo, o vrus da hepatite B e o HIV. Aps a coleta, voc
deve descartar esse material diretamente em recipiente de paredes
rgidas com tampa, contendo hipoclorito de sdio a 2% em volume
superior a metade do recipiente.
Lembre-se: cada mililitro de sangue contaminado com o vrus da

hepatite B contm 100.000.000 de partculas virais, que podem
permanecer viveis por at uma semana. Basta 1(uma) dessas
partculas para contaminar uma pessoa.
Figura 3. Ilustrao do descarte de agulha em recipiente apropriado.

VI
Reduza ao mximo o manuseio de resduos, em especial, os

perfurocortantes. Descarte o rejeito perfurocortante diretamente em
recipiente de paredes rgidas, contendo hipoclorito de sdio a 2%. Deixe
em imerso total no mnimo por 24 horas e, em seguida, faa a
autoclavao desse material.
Esta uma regra bsica para diminuir os riscos de acidente nos

laboratrios. fundamental que os materiais perfurocortantes sejam
autoclavados depois da imerso em hipoclorito de sdio a 2%. S ento
esses materiais devem ser encaminhados ao lixo hospitalar. O
acondicionamento dos resduos de laboratrio deve seguir a Norma
Brasileira (NBR) 9190 da Associao Brasileira de Normas Tcnicas - ABNT,
que recomenda sacos brancos leitosos para os resduos potencialmente
infectantes e hospitalares e escuros para o lixo comum.
Os profissionais responsveis pela limpeza e conservao devem
ser bem orientados e usar equipamentos de proteo. Todos os
recipientes para descarte devem estar identificados.
Lembre-se de que, pela legislao brasileira, quem gera o resduo
o responsvel pela sua eliminao e controle.
No caso dos materiais reutilizveis, como vidraria e utenslios,
deposite-os em recipiente contendo o desinfetante prprio, pelo tempo
de contato recomendado e, em seguida, faa a autoclavao.
Depois, lave normalmente esses materiais e guarde-os para uso
posterior.

VII
Identifique e sinalize os principais riscos presentes em seu

laboratrio. Produtos e reas que oferecem risco devem ser marcados
com os devidos smbolos internacionais em etiquetas auto-adesivas
padro.
Veja, a seguir, os principais smbolos associados aos riscos em

laboratrios.
Figura 4. Smbolo de risco biolgico para entrada de laboratrios.

VIII
Figura 5. Principais smbolos internacionais associados aos riscos

em laboratrios.

IX
Verifique sempre as condies de funcionamento dos

Equipamentos de Proteo Coletiva (EPC): extintores de incndio,
chuveiros de segurana, lava-olhos, pia para lavagem de mos, caixa
de areia e cabine de segurana biolgica.
Existem trs tipos de cabines de segurana biolgica disponveis

no mercado: as de classe I, classe II e classe III. So recomendadas para
o uso em laboratrios clnicos as de classe II. Veja a figura 6, na pgina
seguinte.
Procedimentos que devem ser observados na cabine de

segurana biolgica:
descontamine a superfcie interior, antes e depois do uso, com gaze

estril embebida em desinfetante adequado;
ligue a cabine e a luz ultravioleta 20 minutos antes e deixe tudo
ligado pelo mesmo tempo ao final de sua utilizao;
use avental de mangas longas, luvas descartveis e mscara;
no efetue movimentos rpidos ou bruscos dentro da cabine e evite
operaes que causem turbulncia;
no use bico de Bunsen, pois pode acarretar danos ao filtro HEPA e
causar desequilbrio do fluxo de ar. Se necessrio, use incinerador
eltrico ou microqueimador automtico; e
mantenha as grelhas anteriores e posteriores da cabine
desobstrudas. A cabine no um depsito. Evite guardar
equipamentos ou quaisquer outros objetos no seu interior.

X
Figura 6 : ilustrao das cabines de segurana biolgica - classes I, II e III.
As cabines de classe I e II so consideradas como barreira de

proteo parcial e a de classe III uma barreira de proteo total.

XI
Para descontaminao pessoal, de equipamentos e superfcies

fixas, utilize desinfetantes eficientes e adequados. Use sempre produtos
registrados no Ministrio da Sade.
No existe um desinfetante nico que atenda a todas as

necessidades. fundamental conhecer os diversos agentes qumicos e
sua compatibilidade de uso para evitar custos excessivos e utilizao
inadequada.
Para a descontaminao de amostras biolgicas na rotina dos
laboratrios clnicos, recomendamos os compostos liberadores de cloro.
O mais comumente utilizado o hipoclorito de sdio a 2%. Sua forma
mais ativa o cido hipocloroso (HOCI), que formado em solues
com pH entre 5 e 8. A eficcia do cloro decresce com o aumento do
pH e vice-versa. Cabe lembrar que a atividade desse cido diminuda
na presena de matria orgnica, fato que deve ser considerado
quando aplicado em superfcies contendo sangue e outros lquidos
corpreos. Os hipocloritos tm sua estabilidade dependente de fatores
como concentrao, temperatura, pH, luz, metais e prazo de validade.
Os hipocloritos so corrosivos para metais. Objetos de prata,
alumnio e at mesmo de ao inoxidvel so atingidos, quando imersos
em solues rotineiramente utilizadas em laboratrio. Hipoclorito de
sdio txico e causa irritao na pele e olhos. Se ingerido, provoca
corroso das membranas e mucosas e sua inalao causa irritao
severa no trato respiratrio. Jamais misture os hipocloritos com outras
substncias qumicas, tais como desinfetante, lcool, solues
germicidas, etc.
Aps o tratamento por 24 horas com hipoclorito de sdio a 2%, os
materiais devem ser autoclavados. A autoclavao recomendada
tendo em vista a possibilidade do hipoclorito no atingir as partes do
material a ser esterilizado. Caso isso no seja possvel, a alternativa o
mtodo de fervura por perodo no inferior a 30 minutos.

XII
Observe, na tabela abaixo, a indicao de alguns agentes qumicos e

seu espectro de ao antimicrobiana.
Eficincia antimicrobiana de alguns agentes qumicos desinfetantes

frente a agentes microbianos
Bactrias Vrus Vrus Microbactrias Fungos Esporos

lipoflicos hidroflicos bacterianos
Etanol + + - + V -
Formaldedo + + + + + +
Glutaraldedo + + + + + +
Comp. Cloro + + + + + +
Fenis + + - + + -
Quaternrios + + + - + -
de amnia
lodforos + + + - + -
(+) Atividade
(-) Ausncia de atividade
(V) Varivel de acordo com o microorganismo

XIII
Tenha muito cuidado com a manipulao e estocagem de

substncias qumicas. Leia com ateno as informaes contidas nos
rtulos.
A estocagem de matria-prima deve ser feita em armrios

apropriados, bem ventilados, ao abrigo da luz solar e calor.
importante observar a incompatibilidade entre as diferentes
substncias.
Sempre que recomendado pelo fabricante, os agentes qumicos
devem ser manipulados em capelas de exausto qumica devidamente
instaladas. Ateno: no confunda capela de exausto qumica com
cabine de segurana biolgica.
Veja a seguir os riscos relacionados a cada categoria qumica:
Categoria qumica e riscos relacionados
Grupo Qumico Risco
cidos Corroso
Bases Corroso
Cianetos e Sulfetos Envenenamento
Lquidos Inflamveis Incndio
Slido Inflamvel Incndio

XIV
Seja sempre consciente da importncia de suas aes na

preservao da biossegurana em seu local de trabalho:
lave as mos antes e depois de qualquer procedimento laboratorial;
nunca pipete com a boca;
jamais cheire placas de cultura;
dentro do laboratrio, no fume, no coma, no beba, no prepare

refeies;
quando estiver usando luvas, no manuseie objetos de uso comum,

como telefones, maanetas de portas e janelas, jornais, revistas, etc.;
no guarde alimentos ou bebidas em geladeiras e congeladores

para armazenagem de material biolgico; e
vacine-se rotineiramente contra a hepatite B.
Seguindo essas recomendaes, voc vai estar contribuindo para a

diminuio de acidentes
Se acontecer um acidente de trabalho em seu laboratrio, notifique

imediatamente a sua chefia.

a
Consideraes finais
Muitas das atividades aqui descritas j fazem parte do seu

cotidiano. Faa uma reflexo sobre o que acabou de ler e verifique o
que pode ser mantido, modificado e incorporado a seu trabalho e ao
seu laboratrio para que a sua prtica profissional se desenvolva de
acordo com os procedimentos tcnicos e cuidados de biossegurana
recomendados pelo Programa Nacional de Doenas Sexualmente
Transmissveis e AIDS, do Ministrio da Sade. As questes colocadas a
seguir facilitaro essa reflexo.

b
Condies gerais do laboratrio
As reas de circulao esto desobstrudas?

Qual a situao geral quanto ao aspecto de limpeza?
Qual o estado de conservao e manuteno de pisos, escadas,
paredes e tetos?
O local de trabalho est adequado para atividades envolvendo o
risco biolgico?
As bancadas e demais mobilirios do laboratrio esto em
condies de uso?
Existem bancadas apropriadas para trabalhos com solventes e
demais substncias qumicas corrosivas?
Existe pia diferenciada para lavagem das mos no laboratrio?
Existem mecanismos de conteno que previnam a entrada de
insetos e roedores?
Existem programas de manuteno preventiva de equipamentos?
Estocagem
Os produtos armazenados e a rea de estocagem esto

organizados com os devidos cuidados de segurana?
Existe o cuidado de se estocar materiais e/ou substncias
incompatveis separadamente?

c
Local de higiene pessoal e de alimentao
O local mantido limpo e em condies de higiene?

Existe gua potvel disponvel?
Existem sabo e toalha em condies de uso?
Existe local para troca de roupa e guarda de objetos pessoais?
Existe rea para alimentao separada da rea de laboratrio?
Existe adequada organizao para coleta de lixo e demais rejeitos
(no infecciosos)?
Refrigerao e ventilao
A temperatura de trabalho est entre 20 e 26C?

As janelas esto protegidas contra o excesso de luz solar?
Existe ventilao adequada, especialmente nas salas com cabines
de fluxo laminar?
Iluminao
A iluminao geral adequada?

Existe iluminao dirigida nas bancadas de trabalho?
Servios
O laboratrio tem suficiente abastecimento de gua, energia

eltrica e gs?
Existe adequada manuteno de fusveis, lmpadas e cabos
eltricos?
A limpeza e higienizao das caixas d'gua so realizadas com
periodicidade recomendada?

d
Segurana geral
O laboratrio devidamente fechado e seguro quando no est

ocupado?
As portas e janelas so mantidas devidamente fechadas?
Os materiais txicos e equipamentos de risco so estocados em rea
segura?
Preveno de incndio
Existe sistema de alarme?

As passagens pelas portas de emergncia esto desobstrudas?
O sistema de deteco de incndio est em bom funcionamento e
regularmente testado?
Existe sinalizao de emergncia?
Existem extintores de incndio para os diversos tipos de materiais e
em quantidade suficiente?
Os extintores esto dentro do prazo de validade?
Existe sinal de "no fumar" na rea de laboratrio?
A equipe est treinada em combate a incndio?
Estocagem de lquidos inflamveis
O local est separado do prdio principal?

Existe ventilao suficiente para retirar vapores?
O local est devidamente sinalizado?
Existem lmpadas seladas para proteo contra ignio nos
vapores?
Existe advertncia de "no fumar"?

e
Risco com eletricidade
As instalaes esto de acordo com os padres estabelecidos pela

ABNT?
Existe fio de terra? Os equipamentos esto devidamente aterrados?
Os equipamentos com potencial de risco de desligamento esto
devidamente ligados a um circuito de emergncia para os casos de
queda ou interrupo de energia?
Os cabos de conexo aos diversos equipamentos esto em perfeito
estado de manuteno?
Cada equipamento est ligado em uma tomada; evita-se o uso de
benjamim?
Todas as tomadas tm sua voltagem identificada?
Voc sabe onde fica o quadro-geral de fora da sua unidade?
Gases e lquidos comprimidos
Os diversos tipos de gases esto devidamente identificados?

Os cilindros possuem vlvulas de segurana?
Existe advertncia de no-utilizao de leo nas vlvulas?
Os cilindros esto devidamente seguros contra quedas?
Existe ventilao suficiente para evitar a formao de bolses de
gases e exploses?
Proteo pessoal
Existem em quantidade suficiente:

Lava-olhos?
Chuveiros de emergncia?
Protees contra radiaes, incluindo os dozmetros?
Mscara contra partculas?
Luvas descartveis?
Pipetadores manuais e/ou automticos?
culos de proteo e outros?

f
Segurana e sade ocupacional
Existe servio de sade ocupacional?

Existe caixa com materiais para primeiros socorros?
Existem profissionais treinados em primeiros socorros?
Existem informaes sobre como agir em caso de emergncia, tais
como: telefone de hospitais, pronto-socorros e bombeiros?
Existe um programa de vacinao atualizado?
Existe sinalizao educativa para prevenir o risco?
Equipamento de laboratrio
Os equipamentos esto validados e certificados quanto a seu uso?

Existe procedimento de desinfeco de equipamentos antes de
enviar-los manuteno?
As cabines de segurana biolgica e qumica so regularmente
testadas?
As autoclaves esto validadas?
As centrfugas, rotores e frascos tm seus tempos de utilizao
devidamente anotados?
Vidrarias quebradas e trincadas so descartadas?
Existem recipientes adequados para descartar frascos quebrados e
material perfurocortante?
As capelas de exausto para manipulao esto devidamente
sinalizadas?
Suas balanas esto certificadas pelo INMETRO?
Seus congeladores, geladeiras, fornos, estufas ou equipamentos
termo-regulveis possuem sinais de controle e registro de temperatura?

g
Material infeccioso, qumico e radioativo
Os materiais biolgicos so recebidos em condies de segurana?

Utilizam-se luvas descartveis, quando se est manipulando material
biolgico?
As bancadas so desinfetadas com a devida freqncia?
Existe protocolo de descarte de material contaminado?
Os desinfetantes so apropriados e devidamente validados?
As substncias esto devidamente etiquetadas?
Existe cartaz com os riscos e categorias toxicolgicas das diversas
substncias?
O estoque de radioistopos devidamente controlado?
Existe procedimento de descarte de substncias qumicas e
radioistopos?
Existem procedimentos que visam a evitar contato entre substncias
qumicas incompatveis?
Utilize este manual, junto com o vdeo, como fonte

permanente de consulta. Mantenha este manual sempre ao
seu alcance e faa dele um instrumento a mais de trabalho.
Voc tem comunicao direta e gratuita com o:
TELELAB - PN-DST/AIDS MS
Telefax gratuito: 0800 - 61 2436

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
AARNAES,S.L.; PTREOS, E.M.; DELA MAZA, L.M. The effect of media and
temperature on the storage of Chlamydia trachomatis. Am. J. Clin.
Pathol., 81: 237-239, 1984.
ADLER, M.W. ABC of sexually transmitted diseases: pregnancy and

neonates. Br. Med. J., 288 (6417): 624-627, 1984.
BIRD, B.R. & FORRESTER, F.T. Laboratory diagnosis of Chlamydia

trachomatis infections. U.S. Dep of Health, Education and Welfare,
Public Health Service, CDC Bureau of Laboratories, Atanta, 1980.
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION. Recommendations

for the prevention and management of Chlamydia trachomatis
infections. MMWR 42 (RR-12), 1993.
GRAYSTON, J.T.; KUO, C-C; CAMPBELL, L.A. Chlamydia pneumoniae sp.

nov. for Chlamydia sp. strain TWAR.Int. J. Syst. Bacteriol., 39 (1): 88-90,
1990.
HAMMERSCHLAG, M.R. Chlamydia pneumoniae. A new respiratory

pathogen.lnfect. Dis. Newsletter. 11 (1): 1-4, 1992.
HARE, M.J. & THIN, R.N. Chlamydial infections of lower genital tract of
women. Br. Med. Bull. 39 (2): 138-144, 1983.
KIVIAT, N.B. et alli. Cytologic manifestations of cervical and vaginal

infections. II. Confirmation of Chlamydia trachomatis infection by
direct immunofluorescence using monoclonal antibody. JAMA, 253
(7): 997-1000, 1985.

MARDH, P.A. Bacteria, chlamydia and mycoplasmas. In: HOLMES,K.K. et
alli. Sexually transmitted diseases. New York, McGraw-Hill 1984 cap
69, pp 829-56.
MARDH, P.A.; PAAVONEN, J.; PUOLLAKKAINEN, M. Chlamydia. New York:

Plenum Medical Book Company, 1989. 370p.
ORIEL, J.D.; RIDGWAY, G.L. Genital infection in men.Br. Med. Bull., 39 (2):
133-137, 1983.
SCHATTER, J. Biology of Chlamydia trachomatis. In: HOLMES, K.K. et alli.

Sexually transmitted diseases. New York, Mc Graw-Hill, 1984. cap 23,
p.243-257.
LA SCOELA, L.J. The value of nonculture chlamydial diagnostic test. Clin.

Microbiol. Newsletter, 13 (3): 21-24, 1991.
WEISBURG, N.G. Eubacterial origin of Chlamydiae. J. Bacteriol., 167: 570-

574, 1986.

Agradecimentos: equipe do:
Instituto de Sade Pblica do Distrito
Federal - ISDF;
Ao Laboratrio ControlBio, So Paulo; e
Ao Hospital Universitrio - Universidade
Federal de Santa Catarina - UFSC.
Vdeo, projeto grfico, arte-final e impresso:

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