Modificacin de un mtodo para colinesterasa plasmtica empleando

la reduccin del ferricianuro como indicador

Manuel Jimnez Daz 1

Resumen

Se describe la modificacin de un mtodo para la cuantificacin de colinesterasa plasmtica mediante monitoreo

continuo empleando ferricianuro como indicador. La tiocolina liberada de la propioniltiocolina reduce el ferricianuro
a ferrocianuro y la disminucin de absorbancia a 405 nm es proporcional a la actividad de la enzima.

Las precisiones da a da para muestras con valores de colinesterasa bajos y altos mostraron coeficientes de
variacin de 3,2 y 1,2 por ciento y en un mismo da de 1,1 y 0,52 por ciento respectivamente. La bilirrubina no
presenta una interferencia importante y cada 50 mg/dL de hemoglobina producen una interferencia de -4 por
ciento. El reactivo de ferricianuro almacenado en botella mbar es estable por al menos 3 meses a temperatura
ambiente y 6 meses a 4-8C.

Al comparar los resultados con un mtodo que emplea la reaccin de Ellman se obtuvo una ecuacin de regresin
lineal de Y = 1,23 (X) - 732, con un coeficiente de correlacin (r) de 0,988 y una desviacin estndar sobre la lnea
de regresin (Sy/ x) de 378 U/L.

Palabras clave

Colinesterasa srica, organofosfatos, carbamatos, pesticidas, mtodos colorimtrico, toxicologa.

Abstract

A kinetic method for the determination o serum cholinesterase is presented. Th hydrolysis of propionyithiocholine
liberates thiocholine, that reduces yellow ferricyanide to colourless ferrocyanide The decrease in absorbance at
405 nm is proporcional to enzyme activity. The CV of the between run precision range from 1,2 to 3,2 per cent.
Within-run precision ranged from 0,52 to 1,1 per cent. Bilirrubin do not interfere up to 15 mg/dL and 50 mg/dL
hemoglobin cause an interference of -4 percent. The working reagent, stored in an amber-colored bottle, is stable
for at least 3 months at room temperatura and 6 months at 4-8C.

Comparisons with results by a commercial method based on the Ellman's reaction gave a linear regression of Y =
1,23 (X) - 732, with a correlation coefficient (r) of 0.988 and a standard error (Sy/x) of 378 U/L.

Key words

serum cholinesterase, organophosphates, carbamates, pesticides, colorimetric methods, toxicology.

Introduccin

La colinesterasa plasmtica, butirilcolinesterasa o seudocolinesterasa (colinesterasa, EC 3.1.1.8) pertenece a un

grupo de isoenzimas hepticas con masa molecular de aproximadamente 300000 Da (1). A pesar de su amplia
distribucin en tejidos humanos y animales, su funcin fisiolgica an no se conoce claramente. Algunos sugieren
que juega un papel importante en el metabolismo de lpidos y lipoprotenas, regulando la concentracin de la
colina en plasma o evitando la acumulacin de butirilcolina, con sus efectos nicotnicos, durante el metabolismo de
cidos grasos y lipognesis (2).

La determinacin de su actividad es de importancia clnica para detectar pacientes con intoxicacin por plaguicidas
organofosforados y carbamatos, para identificar pacientes con formas atpicas con sensibilidad aumentada hacia
el anestsico succinilcolina y tambin puede ser utilizada en el diagnstico de desrdenes hepticos (1, 3).
Aunque se seala que la actividad de la colinesterasa es un marcador de metabolismo lipdico anormal, tal como
hiperlipoproteinemia, obesidad y diabetes mellitus (2), esto no ha sido totalmente comprobado (1).

La colinesterasa plasmtica ha adquirido gran importancia clnica debido a la amplia aplicacin de plaguicidas.
Para su determinacin se emplea su capacidad de hidrolisar los steres de colina en sus respectivos cidos. Se
han desarrollado varios mtodos, entre los que se incluyen la determinacin del cambio de pH que acompaa la
hidrlisis de los steres de colina (4, 5) y aquellos basados en la deteccin de la liberacin de tiocolina de sus
steres empleando como indicador el reactivo de Eliman [(5,5-ditiobis-(2-cido nitrobenzoico)), DTNB] (6, 7) o
ferricianuro (8). Aquellos que emplean DTNB tienen mayor aceptacin, sin embargo, la alta actividad cataltica de
la enzima en suero, aunado a la alta sensibilidad de la reaccin indicadora, demandan una predilucin o un
volumen muy pequeo de la muestra. Ambas medidas contribuyen necesariamente a una imprecisin inevitable y
hace difcil la automatizacin del mtodo (8). En este estudio se presenta una modificacin del mtodo con
ferricianuro, empleando propioniltiocolina como sustrato, amortiguador de fosfatos, una concentracin de 1,22
mmoL/L de ferricianuro de potasio y realizando la determinacin por monitoreo continuo. Estas modificaciones
hacen que la tcnica sea ms precisa y barata que aquellas que emplean DTNB.

Bajo las condiciones de reaccin, a partir de propioniltiocolina la colinesterasa libera tiocolina, la cual reduce
inmediatamente el ferricianuro (de color amarillo) a ferrocianuro (incoloro), permitiendo as el monitoreo directo de
la reaccin:

Materiales y mtodos

Muestras

Las muestras adecuadas son suero o plasma heparinizado o con EDTA. No se debe emplear el fluoruro como
preservante. Las clulas deben separarse del suero o plasma en las dos horas siguientes a su recoleccin.

La colinesterasa plasmtica es muy estable; congelamiento y descongelamiento repetido no afecta su actividad.

La enzima no pierde actividad por almacenamiento al menos tres das a temperatura ambiente, dos semanas a
4C, seis meses a -20C o dos aos a 75C (9).

Reactivos

Los reactivos utilizados fueron obtenidos de la compaa Sigma, St. Louis, USA.

1. Solucin amortiguadora de fosfato, 100 mmol/L, pH 7,6. Disolver 2,33 g de Na 2H PO4 y 0,831 g de KH2PO4 en
800 mL de agua destilada, ajustar el pH a 7,6 con NAOH 0,02M y trasvasar a un matraz volumtrico de un litro,
aforar hasta la marca con agua destilada y mezclar.

2. Ferricianuro de potasio (K3[FE(CN )6]), 1,22 mmol/L. Colocar 403 mg de ferricianuro de potasio en un matraz
volumtrico de un litro, aforar hasta la marca con solucin amortiguadora de fosfatos (100 mmol/L, pH 7,6) y
mezclar. Almacenar en botella mbar. Esta solucin es estable por lo menos durante 3 meses a 25C y 6 meses
en refrigeracin (4 - 8 C).

3. Sustrato, ioduro de propioniltiocolina, 95,6 mmol/L. Disolver 290 mg de ioduro de propioniltiocolina en 10 mL de

agua destilada. Esta solucin es estable por lo menos 3 meses en congelacin a -20 C.

Procedimiento

1. Colocar 1,0 mL de la solucin de ferricianuro de potasio en un tubo de vidrio de 13 x 100mm.

2. Agregar 20 L de muestra (plasma o suero). Mezclar e incubar a 37 C por tres minutos.

3.Agregar 100 L de sustrato. Mezclar, esperar 90 segundos y determinar la disminucin de absorbancia por
minuto a 405 nm y a 37 C, ajustando previamente el cero de absorbancia con agua destilada.

Clculos

Bajo las condiciones de la prueba, el coeficiente de absortividad molar del ferricianuro de potasio a 405 nm y 37 0
es 92,40 L mol -1 cm-1.

Resultados

Espectro de absorcin del ferricianuro y ferrocianuro de potasio. Se realiz el espectro de absorcin del
ferricianuro y del ferrocianuro de potasio. Se determinaron las absorbancias en un intervalo que comprendi
longitudes de onda de 250 a 500 nm. En la figura 1 se muestran los espectros de absorcin de ambos
compuestos.

Efecto de la concentracin de ferricianuro de potasio. En la figura 2 se muestra el efecto de la concentracin de

ferricianuro de potasio sobre la velocidad de la reaccin. Se analizaron diferentes concentraciones del compuesto
en el intervalo de 0,61 a 2,44 mmol/L. Como se puede observar los mejores resultados se obtuvieron con 0,81 y
1,22 mmol/L; a concentraciones superiores se pierde sensibilidad. Se eligi la concentracin de 1,22 mmol/L por
presentar una mayor absorbancia y proporcionar as un mayor intervalo de linealidad.

Efecto de la concentracin sustrato. El efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad de la colinesterasa

se muestra en la figura 3. Se analizaron diferentes concentraciones de propioniltiocolina en el intervalo de 2 a 1 5
mmol/L en la mezcla de reaccin. Se observa que con concentraciones superiores a 7,5 mmol/L se obtienen
valores similares de actividad. Por lo tanto, se decidi utilizar en la mezcla final una concentracin de sustrato de
8,5 mmol/L. La evaluacin se realiz utilizando una mezcla de sueros con una actividad de colinesterasa de 8800
U/L.

Efecto del volumen de muestra. Se analiz el efecto del volumen de muestra (10, 20, 30,40 y 50 uL) sobre la
velocidad de reaccin. Se observ que con todos los volmenes analizados se obtienen resultados similares, por
lo que se eligi un volumen de muestra de 20 uL como adecuado.

Imprecisin. El cuadro 1 muestra las imprevisiones obtenidas en un mismo da y da a da, con mezclas de sueros
conteniendo actividades de colinesterasa baja y alta. Las precisiones da a da para muestras con valores de
colinesterasa de 2603 y 8820 U/L, mostraron coeficientes de variacin de 3,2 y 1,2 por ciento y en un mismo da
de 1,1 y 0,52 por ciento respectivamente.

Linealidad del mtodo. Se comprob la linealidad del mtodo analizando diluciones de un suero con actividad alta,
lo cual mostr un coeficiente de correlacin (r) de 0,998 (Fig. 4).

Efecto de sustancias interferentes. Se evalu el efecto interferente de bilirrubina y hemoglobina en la

determinacin. Como se puede observar en el cuadro 2, cada miligramo de bilirrubina por 100 mL de suero
produce una disminucin de un 0,2 % en la actividad. En tanto con la hemoglobina se encontr que por cada 50
mg de hemoglobina por 100 mL de suero se produce una disminucin de un 4 % en la actividad.

Estudio comparativo. En la Figura 5 se observan los resultados del estudio comparativo del mtodo propuesto con
la determinacin enzimtica de colinesterasa plasmtica por un mtodo comercial de amplia utilizacin en el
mbito nacional que emplea DTNB como indicador (Biotec Internacional S.A.), el cual fue empleado como
referencia. Se analizaron 42 sueros con actividades de colinesterasa entre 2200 y 12200 U/L. La ecuacin de
regresin obtenida fue: y = 1,23x - 732. El coeficiente de correlacin (r) fue de 0,988 y el error estndar del
estimado (Sy/x) de 378 U/ L.

Discusin

En Costa Rica es comn el empleo de plaguicidas organofosforados y carbamatos, que inhiben las colinesterasas
(10). La intoxicacin por plaguicidas organofosforados puede causar enfermedad severa incluyendo la muerte y
dao cerebral permanente en los sobrevivientes (11). Como una medida preventiva, los trabajadores en contacto
con tales compuestos deben ser controlados continuamente, para identificar a las personas sobreexpuestas. Esto
se realiza mediante la determinacin de la actividad de las colinesterasas, ya que la actividad enzimtica
disminuye antes de que se presenten manifestaciones clnicas (11, 12).

La toxicidad producida por organofosforados y carbamatos es semejante y se asocia con la inhibicin de la

acetilcolinesterasa, enzima responsable de la interrupcin de la actividad biolgica del neurotransmisor acetilcolina
(13). Dentro del grupo de las colinesterasas se incluyen la acetilcolinesterasa (E.C.3.1.1.7) o colinesterasa
eritroctica y la acilcolina acilhidrolasa (E. C. 3.1.1.8) o colinesterasa plasmtica. La enzima plasmtica es de
importancia clnica para detectar pacientes con intoxicacin por plaguicidas, formas atpicas de la misma o
disfuncin heptica (1, 3). En contacto con plaguicidas la actividad de la enzima plasmtica disminuye ms
rpidamente que la actividad de la enzima eritroctica, por lo que se considera un ndice muy sensible para
prevenir intoxicacin. La determinacin de la actividad de la colinesterasa eritrocitaria es de importancia en los
sistemas de vigilancia para intoxicaciones crnicas, por permanecer deprimida mayor tiempo y es considerada
como un mejor ndice de exposicin, ya que puede reflejar en mejor forma lo que ocurre en el tejido nervioso y es
menos afectada que la plasmtica por otras condiciones (1, 3, 13).

En Costa Rica el sistema de vigilancia relacionado con los plaguicidas inhibidores de las colinesterasas ha
adoptado el anlisis frecuente de los niveles de estas enzimas como uno de los criterios fundamentales para
decidir el diagnstico. Generalmente los mtodos empleados a nivel nacional e internacional se basan en la
reaccin de Ellman, que como reaccin indicadora emplea la reduccin del DTNB por la tiocolina liberada del ster
de colina. Esta reaccin tiene una alta sensibilidad analtica, lo que aunado a la alta actividad cataltica de la
enzima en plasma hace necesario la predilucin de la muestra o el empleo de volmenes muy pequeos de
muestra. Ambas medidas redundan en un aumento de la imprecisin de los mtodos (8). En el mtodo descrito se
presenta una modificacin en la cual se emplea propioniltiocolina como sustrato, amortiguador de fosfatos y una
concentracin de 1,22 mmoL/L de ferricianuro de potasio como indicador. En este sistema, la tiocolina liberada
reduce al ferricianuro a ferrocianuro, permitiendo la determinacin mediante el monitoreo continuo de la
disminucin de absorbancia a 405 nm. Este mtodo permite la determinacin de colinesterasa plasmtica de una
manera rpida, exacta, ms precisa y ms econmica.

Al realizar el espectro de absorcin del ferricianuro y ferrocianuro de potasio se observ que el ferricianuro
presenta un pico de absorcin a 420 nm, sin embargo se decidi elegir 405 nm como una longitud de onda
adecuada ya que permite tambin el empleo de fotmetros. El coeficiente de absortividad molar del ferricianuro a
405 nm es de 92,40 L mol-1 cm-1, mientras que a 420 nm es de 98,30 L mol-1 cm-1. De manera que si la
determinacin se realiza a 420 nm el factor sera de 57000.

Se llevaron a cabo estudios de imprecisin en un mismo da y da a da, utilizando mezclas de sueros con
diferentes actividades de colinesterasa.

En un mismo da se obtuvieron coeficientes de variacin (CV) de 0,52 y 1,1 por ciento para actividades de 8788 y
2557 U/L, respectivamente. Los CV da a da fueron de 1,2 y 3,2 por ciento para actividades de 8820 y 2603 U/L,
respectivamente. La imprecisin obtenida con este mtodo es menor a la informada por otros autores empleando
mtodos basados en la reaccin de Ellman (7) o en los panfletos de casas comerciales (14, 15).

En cuanto al anlisis de posibles interferentes, se encontr, que cada mg de bilirrubina por decilitro produce una
disminucin de un 0,2%, lo que indica que la interferencia por bilirrubina en esta prueba es despreciable. Por otro
lado, cada 50 mg por decilitro de hemoglobina producen una disminucin de actividad de un 4 %, por lo que no es
conveniente el anlisis de muestras muy hemolisadas. Empleando 20 uL de muestra, el mtodo presenta una
buena linealidad en el intervalo dentro del cual se esperan los valores de las muestras. Sin embargo, si se requiere
cambiar el volumen de muestra, este puede variarse entre 10 y 50 uL, con el correspondiente cambio en el factor,
sin afectar los resultados.
Los reactivos empleados son bastante estables. El ferricianuro de potasio en buffer de fosfatos es estable al
menos por 3 meses a temperatura ambiente y en refrigeracin (4 a 8 C) es estable al menos por un periodo de 6
meses. El sustrato es estable en congelacin (-20 C) por lo menos 4 meses.

Al realizar un estudio comparativo con un sistema comercial de amplia utilizacin a nivel nacional y empleado para
determinar los valores de referencia en poblacin costarricense (16), se obtuvo muy buena correlacin. El
coeficiente de correlacin (r) fue de 0,988 y la ecuacin de regresin lineal y 1,23x - 732 (n = 42).

En resumen, el mtodo propuesto constituye una alternativa ms precisa y ms barata para la determinacin de
colinesterasa plasmtica. Los datos obtenidos indican que el mtodo es lineal y reproducible dentro del intervalo
en el que se espera encontrar los valores de las muestras. El estudio comparativo con mtodos comerciales
mostr una buena correlacin.

Cuadro 1
Impresicin de la determinacin de colinesterasa plasmtica.

en un mismo da Da a da
8 DE CV 8 DE CV
N (mg/dL) % n (mg/dL) %

10 2557 27,4 1,1 10 2603 84,2 3,2

10 8788 45,9 0,52 10 8820 105 1,2

Cuadro 2
Efecto de la bilirrubina y hemoglobina sobre la
determinacin de colinesterasa plasmtica.

Sustancia segregada Colinesterasa (U/L) Interferencia*

Bilirrubina (mg/dL)
0 5380 --
5,0 5343 -9,0
7,5 5295 -11,3
10 5280 -10,0
15 5220 -10,7
8 = -10,3

Hemoglobina (mg/dL)
0 4505 --
50 4332 -3,5
100 4194 -3,1
200 3738 -3,8
400 2952 -3,9
8 = -3,6
* Interferencia = [(valor obtenido - valor basal)/ cantidad agregada]
 Figura 1. Espectro de absorcin del ferricianuro y ferrocianuro de potasio

Figura 2. Efecto de la concentracin de ferricianuro sobre la determinacin de colinesterasa plasmtica.

Figura 3. Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad de la colinesterasa plasmtica.

Figura 4. Linealidad del mtodo para colinesterasa plasmtica.

 Figura 5. Comparacin del mtodo de ferricianuro con un mtodo que emplea DNTB como indicador.

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1
Departamento de Anlisis Clnicos, Facultad de Microbiologa, Universidad de Costa Rica.