LOS ISTOPOS ESTABLES

Los istopos estables y la espectrometra de masas de istopos

estables

Los istopos estables

Muchos elementos de la Tabla Peridica y entre ellos, el H, C, N, O y S, poseen dos o

ms istopos (nclidos de diferente masa pero idntica configuracin electrnica)
estables que no participan en ningn proceso de desintegracin nuclear, de ah su
nombre. Estos elementos (y sus istopos) se encuentran ampliamente distribuidos por la
litosfera, hidrosfera, biosfera y atmsfera en forma de diferentes molculas,
constituyendo unos excelentes trazadores naturales de los procesos fisicoqumicos que
ocurren en la naturaleza.

En los istopos estables, las diferencias de masa son lo suficientemente grandes como
para que las caractersticas fsicas y qumicas de las molculas que los contienen, sean
ligeramente diferentes. El ejemplo ms clsico es el de la presin de vapor de una
molcula de agua que contiene los istopos pesados de oxgeno e hidrgeno (18O y 2H),
que es ligeramente inferior a la de aquella que contiene los ligeros (16O y 1H). Al
evaporarse, las molculas que pasarn primero a vapor sern aquellas ms ligeras
(1H1H 16O). En la naturaleza tienen lugar muchos procesos fisicoqumicos (incluyendo
las reacciones enzimticas) que determinan la forma en que los istopos se reparten
entre diferentes sustancias o entre diferentes fases de una misma sustancia, y a esto se le
conoce como fraccionamiento isotpico. Como resultado de estos procesos de
fraccionamiento nos encontramos con sustancias que difieren ligeramente en la
distribucin de los istopos estables y por tanto en su masa, diferencias que pueden
medirse mediante la Espectrometra de Masas de Razones Isotpicas (IRMS o GIRMS,
en sus siglas inglesas) en lo que denominamos estudios de abundancia natural. No
obstante, est alcanzando una enorme popularidad el uso de los istopos estables como
trazadores aadidos al medio que se estudia. En este caso las diferencias seran mucho
mayores y hablaramos de anlisis de muestras enriquecidas o muestras marcadas.

La espectrometra de masas de razones isotpicas

El anlisis de los istopos estables se realiza en forma de molculas gaseosas del tipo
H2, CO2, N2 o SO2 que son introducidas en el espectrmetro de masas. Por lo tanto, se
requiere siempre de un proceso analtico previo que transforme la materia a analizar en
estas molculas. Para ello existen diferentes procedimientos que han ido cambiando a lo
largo de la historia y que dependen del tipo de muestra, pero que podran dividirse en
dos grandes grupos: a) sistemas off-line de extraccin en vaco que se caracterizan
porque el gas final se recoge en un portamuestras que es llevado posteriormente al
espectrmetro. Requieren gran cantidad de muestra y estn poco automatizados. b)
sistemas on-line que se diferencian en que el gas se introduce en el espectrmetro a la
vez que se produce, de tal forma que el sistema de preparacin y el de medida estn
unidos y trabajan simultneamente. Necesitan menos muestra y estn altamente
automatizados.
El diseo bsico de un espectrmetro de masas ha cambiado poco desde sus inicios en
la primera mitad del siglo pasado, aunque los avances tcnicos permiten cada vez
mejores precisiones y exactitudes con menores cantidades de muestra. Consta de una
fuente de ionizacin por impacto electrnico, un tubo de vuelo con analizador
magntico y un sistema colector de iones. La fuente de ionizacin produce un chorro de
electrones que al chocar con las molculas originan cationes monovalentes, los cuales
son extrados y aceleradas mediante potenciales crecientes (3Kv) y dirigidos hacia el
campo magntico donde el haz nico ser separado en otros tantos segn las diferentes
masas moleculares (que estn determinadas por los diferentes istopos presentes en
ellas). Finalmente, los iones de cada uno de estos haces separados, impactan en Copas
de Faraday dispuestas en posiciones fijas. En cada impacto, el catin toma el electrn
necesario para neutralizarse y este potencial elctrico producido se neutraliza al pasar
por una resistencia de precisin conectada a tierra. La caida de voltaje en la resistencia
ser proporcional a la intensidad del haz de iones. Este voltaje tras un convertidor
voltaje/frecuencia (V/F) se amplifica y contabiliza con el software correspondiente. Un
elevado vaco en todo el sistema (superior a 10-6 mbar.) garantiza que el recorrido de los
iones est libre de posibles impactos. El sistema, en su conjunto, debe asegurar una alta
sensibilidad y linealidad, que se obtiene mediante una elevada eficiencia en la
ionizacin y extraccin (con alta presin de gas) y una buena separacin y focalizacin
del analizador magntico para que ningn in impacte fuera de las copas.

Esquema de la fuente de ionizacin.

La composicin isotpica se obtiene al comparar la razn de las intensidades de los

haces inicos del gas de la muestra con la misma razn de un gas de referencia o patrn
interno. Existen dos tipos diferentes de Espectrmetros segn la forma en que se realice
este proceso. Espectrmetros de Doble Ingreso: en los que ambos gases se miden
alternativamente durante un nmero determinado de veces consiguindose la mejor
precisin analtica posible (ntese que ambos gases van a sufrir los mismos errores
instrumentales de forma casi simultanea). Ambos gases se deben introducir en la fuente
de ionizacin manteniendo el mismo flujo inico, lo que se consigue variando la presin
del contenedor variable o below donde se alojan. Dos capilares de admisin aseguran
que dicho flujo sea viscoso lo que minimiza los posibles fraccionamientos.
Espectrmetros de Flujo Continuo: la introduccin tanto de la muestra como del gas
de referencia se hace inmersos en un flujo de He que acta como gas portador o de
arrastre. Este flujo de He conlleva un vaco mucho menor en el sistema y una menor
precisin terica. En este caso muestra y patrn no se miden consecutivamente, ms
bien al contrario, los pulsos de patrn suelen estar separados por varios de muestra y
viceversa. La muestra llega en forma de pico gaussiano procedente de un sistema de
separacin cromatogrfica, esto conlleva un fraccionamiento inherente al sistema que se
minimiza por una integracin total del pico a analizar. La mayor ventaja de este tipo de
espectrmetro radica en su conexin con los sistemas de preparacin de muestra on-
line que comentabamos anteriormente. Aunque la precisin inherente sea menor,
presentan la enorme ventaja de su alta productividad y la posibilidad de poder medir
muestras mucho menores, en el rango de picomoles.

Esquema de un espectrmetro de masas de razones isotpicas.

Los resultados finales se dan en notacin delta () para las mediciones de abundancia
natural o sustancias ligeramente marcadas, o mediante notacin tomo por ciento (At%)
para las sustancias fuertemente enriquecidas en algn istopo.

Inicialmente, el estudio de los istopos estables estuvo relacionado mayoritariamente

con la geoqumica y los estudios de abundancia natural, pero con el desarrollo de los
espectrmetros de masas de flujo continu y la posibilidad de usar las sustancias
marcadas, su aplicacin se extendi a las ciencias biolgicas, de tal modo que hoy en
da es una tcnica analtica casi rutinaria en muchos campos de investigacin.

Anlisis isotpico de compuestos especficos

La determinacin de la composicin isotpica de C, N o H de compuestos moleculares

o biomolculas (biomarcadores tambin pueden denominarse) mediante la tcnica GC-
C-IRMS (tambin se puede encontrar como GC-IRMS, GC-C/TC-IRMS o irmGC/MS)
es una aplicacin relativamente reciente que ha revolucionado el campo de la isotopa.
Poder medir a nivel de picomoles de compuesto, en mezclas previamente separadas por
medio de la cromatografa de gases, permite la aplicacin de los anlisis de istopos
estables en situaciones donde hasta hace poco tiempo era imposible por la enorme
cantidad de tiempo y esfuerzo necesario para aislar las sustancias de inters. As
podemos encontrar anlisis isotpicos en estudios metablicos, en biodegradacin, en
ecologa microbiana, en arqueologa o en estudios paleoambientales por poner slo
algunos ejemplos. Siendo los compuestos estudiados del tipo cidos grasos,
aminocidos, alcanos, alcoholes, PAHs, PCBs, entre otros. Una revisin extensa de esta
metodologa y sus aplicaciones puede encontrarse en los siguientes trabajos:
Compound-specific stable-isotope (13C) anlisis in soil science. Bruno Glaser. J. Plant Nutr. Soil Sci.,
(2005), 168, 633-648.

Compound-specific sable isotope anlisis of organic contaminants in natural environments: a critical

review of the state of the art, prospects, and future challenges. Torsten C. Schmidt, Luc Zwank, Martin
Elsner, Michael Berg, Rainer U. Meckenstock, Stefan B. Haderlein. Anal Bioanal Chem (2004), 378,
283-300.

What can stable isotope probing do for bioremediation?. M. Manefield, A.S. Whiteley, M.J. Bailey.
International Biodeterioration & Biodegradation (2004), 54, 163-166.

Applied gas chromatography coupled to isotope ratio mass spectrometry. W. Meier-Augenstein. Journal
of Chromatogrpahy A., (1999), 842, 351-373.

New chromatographic, mass spectrometric and stable isotope approaches to the classification of
degraded animal fats preserved in archaeological pottery. H.R. Mottram, S.N. Dudd, G.J. Lawrence,
A.W. Stott, R.P. Evershed. Journal of Chromatography A., (1999), 833, 209-221.

Esquema representativo de la tcnica denominada GC-C-IRMS.

Actualidad
Istopos estables: Fundamento y aplicaciones
Ricardo Guerrero y Mercedes Berlanga
Departamento de Microbiologa, Universidad de Barcelona, Av. Diagonal, 645, 08028 Barcelona. E-
mail: guerrero@retemail.es
A partir de los tomos formados en los primeros
tiempos de nuestro actual universo, hace
unos 15.000 millones de aos, se constituyeron
las galaxias. Dentro de las galaxias, fueron for-
mndose y desapareciendo estrellas. Y al formar-
se las estrellas se originan planetas, que tambin
desaparecern con ellas. As ocurri con nuestra
estrella, el Sol, y con nuestro planeta, la Tierra,
que se formaron hace unos 4.550 millones de
aos. A partir de los tomos del universo atrapa-
dos en nuestro planeta se organizaron y evolucio-
naron los sistemas vivientes, hace unos 3.850
millones de aos. Todos los tomos de nuestro
cuerpo proceden de la Tierra y eran parte de nues-
tra galaxia. Por tanto, somos de carne y hueso,
pero tambin "polvo de estrellas".
Las diferentes especies atmicas se formaron
durante perodos de expansin muy primitivos,
cuando toda la materia del universo se hallaba
an comprimida, con densidades muy elevadas, y
sometida a temperaturas altsimas, lo que ofreca
unas condiciones favorables para toda clase de
transformaciones nucleares. Geofsicos y astrofsi-
cos han calculado la abundancia relativa de los
elementos a partir del anlisis qumico de la cor-
teza terrestre y del estudio de los meteoritos, del
anlisis espectral del Sol, de las estrellas y de la
materia difusa esparcida en el abismo sideral. El
resultado de este estudio indica que la constitu-
cin qumica del espacio interestelar es sorpren-
dentemente uniforme: el 55 % de toda la materia
csmica es hidrgeno, el 44 % est constituido por
helio (parejas siamesas de hidrgeno) y slo el res-
tante 1 % corresponde a todos los dems elemen-
tos. Sin embargo, la composicin qumica de la
Tierra representa una notable excepcin a dicha
uniformidad. En nuestro planeta, el helio y el
hidrgeno son muy escasos. El principal depsito
de hidrgeno lo constituye el agua, en forma de
gas, lquida o en estado slido. Pero esta cantidad
es despreciable si la comparamos con las rocas
granticas y baslticas que constituyen la corteza
de la Tierra, o con el resto de la parte slida de
nuestro planeta. La escasez de hidrgeno y helio
es consecuencia de los procesos que ocurrieron
durante el nacimiento de la Tierra. La formacin
de los planetas menores (Mercurio, Venus, la
Tierra o Marte) empez por un proceso de agrega-
cin de polvo del disco que dio origen al sistema
solar, que form pequeas partculas slidas lla- minora pesan 45 (13+16+16), porque tienen car-
30:17
madas planetsimos. Sin embargo, estas agrega-
ciones de planetsimos no crecieron lo suficiente
para que su gravedad pudiera capturar aquellos
gases. En cambio, Jpiter, Saturno y otros plane-
tas mayores s fueron capaces de rodearse de
pesadas atmsferas de hidrgeno y helio.
Cada elemento qumico se caracteriza por pose-
er un nmero determinado de protones, que se
denomina nmero atmico y se representa por la
letra Z. Como los tomos son entidades elctrica-
mente neutras, el nmero atmico tambin indica
el nmero de normal de electrones. El nmero
msico (A) es la suma de protones y neutrones del
ncleo del tomo. Para representar esquemtica-
mente un ncleo, se escribe el smbolo del ele-
mento y se aaden dos ndices en el lado izquier-
do, uno en la parte superior (A) y otro en la parte
inferior (Z). La representacin sera: AZX. Por ejem-
plo, 11H, 42He, 126C, 147N, 168O, 3216S.
Fraccionamiento isotpico
U n mismo elemento (definido por su nmero
atmico) puede tener diferente nmero de
neutrones, y por tanto diferente peso atmico. Los
tomos con el mismo nmero atmico pero con
diferente peso atmico se denominan istopos
("igual lugar"). Los tomos de carbono tienen gene-
ralmente 6 protones y 6 neutrones, y por tanto un
peso atmico de 12. Pero hay tomos de carbono
con peso atmico 13, istopo estable y pesado, o
con peso atmico 14, istopo inestable o radiacti-
vo, ya que emite radiactividad a medida que se
transforma en un elemento estable. Una cosa
similar ocurre con el hidrgeno: existe el hidrge-
no normal, el deuterio (pesado y estable, con un
neutrn), y el tritio (radiactivo e inestable, con dos
neutrones). El primer istopo pesado observado,
en 1931, fue el deuterio; su descubridor fue
Harold Urey, el mismo que, muchos aos despus,
en 1952, dirigira los trabajos del joven Stanley
Miller sobre sntesis abitica de aminocidos.
Las molculas que componen las sustancias
estn compuestas por tomos. La mayor parte de
las molculas tienen tomos normales, pero algu-
nas, menos frecuentes, tienen tomos pesados.
As, por ejemplo, la mayor parte de las molculas
de CO2 del aire pesan 44 (12+16+16), pero una
30:18
bono pesado. Los organismos fotolitotrofos y qui-
miolitotrofos fijan CO2 para formar materia viva.
La materia viva tiene carbono, que en su mayor
parte es 12C, pero tambin hay tomos 13C (y, por
supuesto, tambin 14C). Como el 13C es estable,
esta cantidad no va disminuyendo a partir de la
muerte del organismo, como ocurre con la
cantidad de 14C, que se va desintegrando.
Sorprendentemente, la cantidad o proporcin de
13
C (con respecto a la de 12C) en la materia viva es
menor que la que existe en el material de partida,
en este caso el CO2 del aire. No se sabe el meca-
nismo molecular ltimo, pero las enzimas de los
seres vivos "discriminan" negativamente las mol-
culas de CO2 que tienen el istopo pesado, y "esco-
gen" preferentemente las que tienen el istopo
normal. Y lo mismo ocurre en el caso de las mol-
culas con oxgeno (donde escogen el 16O, y no el
18
O), con nitrgeno (donde prefieren el 14N, y no el
15
N), o con azufre (donde eligen mayormente el 32S,
y no el 34S). (A estas alturas del relato, no hace
falta aclarar que 18O, 15N, y 34S son istopos pesa-
dos de los correspondientes elementos). Nadie
sabe la causa pero el efecto es que la materia viva
"discrimina en contra" de las molculas que tienen
istopos pesados.
Midiendo la cantidad de 14C de un resto orgni-
co se puede saber su "edad", es decir, el tiempo
que hace que dej de incorporar nuevo 14C; que
muri. Midiendo la cantidad de istopos estables
en una sustancia no se puede saber su edad pero
s si es de origen biolgico. La materia viva prefie-
Ricardo Guerrero es Doctor en
Ciencias por la Universidad de
Barcelona. Fue investigador postdoc-
toral en la University of California-
Davis, bajo la direccin del Prof.
John L. Ingraham. Ha sido Visiting
Professor en la University of
California-Davis, en la Boston
University y lo es actualmente de la
University of Massachusetts-Amherst. Fue catedrtico
de la Universidad Autnoma de Barcelona, y actual-
mente lo es de Microbiologa de la Universidad de
Barcelona. Ha organizado diferentes congresos y reu-
niones cientificas internacionales; es autor de gran
nmero de artculos cientficos en revistas de referen-
cia y redactor de diversas obras de comunicacin cien-
tfica. Su investigacin se centra en el estudio de las
comunidades procariotas multilaminadas semejantes a
las existentes en la Tierra primitiva, la evaluacin de
riesgos de la liberacin al ambiente de bacterias modi-
ficadas genticamente, el estudio de bacterias magne-
totcticas y la produccin de plsticos biodegradables
por bacterias. Su trabajo sobre interacciones poblacio-
Actualidad
re las molculas con istopos ligeros e incorpora
menos de los pesados que estn a su disposicin
en el material de partida. Y adems, lo hace dife-
rencialmente. Las distintas vas metablicas (que
tienen enzimas distintas) producen molculas con
diferente disminucin de istopos pesados. Viendo
la proporcin de stos en un producto biolgico
puede deducirse las posibles vas metablicas que
lo han originado. La discriminacin isotpica de
un elemento se indica por la letra delta minscu-
la (). Para hacer comparables las frecuencias
obtenidas en distintas muestras, los resultados se
refieren a un valor estndar, un material que se
toma como referencia del valor del istopo pesado
con respecto al ligero. Adems, para facilitar la
expresin de los resultados, los nmeros resul-
tantes se multiplican por mil (es ms fcil hablar
y escribir 4 40 0/00, que 0,004 0,040). As, la
discriminacin de un istopo pesado, AX, en par-
tes por mil ( 0/00), es:
0/00 AX = {[Rm - Rst] /Rst} 1000
Donde R es la cantidad de istopo pesado divi-
dida por la cantidad del ligero, tanto en la mues-
tra, "m", como en el estndar, "st". Es evidente que
si los organismos discriminan contra el istopo
pesado, los valores de 0/00 de la materia viva
sern negativos.
Los principales elementos de inters para el
fraccionamiento isotpico son el carbono, azufre,
nitrgeno, oxgeno e hidrgeno. Los respectivos
estndares son: para el C, el PDB; para el S, el
CDM; para el N, el aire; para el O y el H, el SMOW.
nales procariticas primitivas ha atrado la atencin de
microbilogos de todo el mundo hacia ese tipo de
comunidades. Es de destacar su descripcin del con-
cepto de ecopoyesis y su aplicacin al estudio de los
primeros ciclos biogeoqumicos.
Mercedes Berlanga es Doctora en
Biologa por la Universidad de
Barcelona. Realiz la tesis doctoral en
el Departamento de Microbiologa y
Parasitologa Sanitarias, Facultad de
Farmacia y Unidad de Microbiologa
del Campus de Bellvitge de la
Universidad de Barcelona, bajo la
direccin del Dr. Miquel Vias. Su actividad investiga-
dora se ha centrado en el estudio de los mecanismos de
resistencia a los antibiticos, en concreto la resistencia
a las quinolonas en patgenos nosocomiales, as como
la del gnero Vibrio presente en moluscos y peces de las
piscifactoras del delta del Ebro. Adems de sus activi-
dades cientficas, posee una gran habilidad para repre-
sentar humorsticamente el mundo de los microbios, y
sus protagonistas, las bacterias.
Actualidad
(El significado de las siglas se explica despus.) La
medicin de la cantidad de los distintos istopos
se lleva a cabo mediante el espectrmetro de
masas.
Algunos ejemplos de discriminacin isotpica
L os valores de d 13C referidos en 0 / 00 (para
abreviar, 13C) se calculan respecto al estn-
dar PDB (PeeDee Belemnite), que corresponde a
un fsil marino del Cretcico (Belemnitella ameri-
cana) de la formacin "PeeDee" (probablemente un
nombre indio) en Carolina del Sur, EE. UU. Dado
que la fijacin biolgica de CO2 discrimina contra
13
C, los valores 13C del material celular biosinte-
tizado son "ms negativos" que el sustrato de car-
bono utilizado, generalmente, CO2 atmosfrico o
carbonato marino. Los principales pasos de discri-
minacin isotpica en la incorporacin biolgica
del carbono son: (i) la captacin y difusin intra-
celular del CO2, y (ii) la fijacin fotosinttica del
CO2.
Se conocen tres vas fotosintticas principales:
el ciclo de Calvin-Benson o C3, el ciclo de Hatch-
Slack, o C4, y el ciclo CAM (Crassulacean acid
metabolism). La va C3 opera en aproximadamen-
te el 85 % de las plantas y domina los ecosistemas
terrestres. Las plantas C3 fijan el CO2 con la enzi-
ma rubisco (ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa
oxigenasa). Sin embargo, sta tambin puede
admitir oxgeno como sustrato alternativo del CO2,
proceso que se denomina fotorrespiracin, que
disminuye el rendimiento fotosinttico. Parece ser
que esta "dualidad" enzimtica es resultado de un
artefacto evolutivo, ya que en la atmsfera no
haba apenas oxgeno y en consecuencia, la foto-
sntesis de los primeros organismos no estaba dis-
minuida por la fotorrespiracin. Fue precisamente
la accin de los organismos fotosintticos la que
determin un aumento de la concentracin de O2
en la atmsfera. Pero lo que en principio no era un
problema, signific una disminucin sustancial de
la eficacia fotosinttica. El desarrollo de las plan-
tas con fotosntesis C4, que se expandieron rpi-
damente a finales del Mioceno (aproximadamente
entre 8 a 4 millones de aos) les permiti ciertas
ventajas selectivas, al menos en zonas de elevada
temperatura y secas, e incluso a veces en ambien-
tes salinos. Las C4 representan menos del 5 % de
las fanergamas. Las plantas C4 tienen un paso
inicial en la fijacin donde el fosfoenol piruvato
(PEP) aporta ms carbono a la rubisco para la fija-
cin de CO2. La mayora de plantas C3 tienen valo-
res de 13C entre 24 a 30 0/00. La PEP carboxila-
sa discrimina menos que la rubisco, de tal mane-
30:19
ra que, en plantas C4, los valores de 13C se sit-
an entre 10 y 16 0/00. Estas diferencias de com-
posicin isotpica sirven para saber si una planta
tiene fotosntesis C4 o C3. Y aparte del inters
acadmico, dicho resultado permite distinguir, por
ejemplo, el azcar de caa (planta C4) del azcar
de remolacha (planta C3), lo que puede tener valor
econmico. Finalmente, la fotosntesis CAM domi-
na en los ecosistemas desrticos, con plantas tales
como los cactos. Tienen la capacidad de cambiar
de una fotosntesis C3 durante el da a otra C4
durante la noche. El fraccionamiento isotpico es
intermedio entre las plantas C3 y las C4.
Las plantas y algas, cianobacterias, bacterias
rojas del azufre y bacterias rojas no del azufre (y
la mayor parte de las bacterias quimiolitotrofas),
fijan CO2 mediante el ciclo de Calvin-Benson. Por
el contrario, las bacterias verdes (y algunas bacte-
rias quimiolitotrofas) lo hacen mediante el ciclo del
cido carboxlico reductivo (ciclo de Arnon, anab-
lico), posiblemente el precursor anaerbico del
ciclo de Krebs (oxidativo y catablico). Hay que
destacar la diferencia entre el fraccionamiento iso-
tpico de las cianobacterias cultivadas y las "natu-
rales". Anlisis detallados han mostrado que
muchos tapetes microbianos (en cuya capa supe-
rior dominan las cianobacterias) actuales estn
enriquecidos con carbono pesado. Este hecho, sin
embargo, no se debe a una va especial de asimi-
lacin fototrofa, sino al resultado de una baja con-
centracin de CO2 en el ambiente, caracterstica
de los hbitats hipersalinos, ya que las cianobac-
terias cultivadas, no sujetas a estas restricciones
ambientales, presentan valores de 13C compati-
bles con los obtenidos mediante la va C3. No cabe
duda de que la eliminacin de la barrera de difu-
sin por aumento en la presin ambiental de CO2,
situacin que pudo darse en la atmsfera
Precmbrica (estudio de los valores 13C de los
estromatolitos), podra restablecer instantnea-
mente la carboxilacin enzimtica de la va foto-
sinttica como principal paso de discriminacin
del fraccionamiento isotpico.
El azufre tiene cuatro istopos estables: 32S, 33S,
34
S, y 36S. El 35S es radiactivo y deriva del argn-40.
El estndar es el azufre de un meteorito, el CDM
(Canyon Diablo Meteorite Troilite, Arizona,
EE.UU.). Por tanto, la proporcin 34S/32S en este
caso se supone que es la existente en el espacio
interplanetario. La variacin de los valores de
34S en los seres vivos se deben a los distintos pro-
cesos en los que interviene el azufre, desde las
reducciones del sulfato (asimilatoria, produciendo
aminocidos, o desasimilatoria, produciendo H2S),
hasta las oxidaciones del H2S y el S0 en las bacte-
rias fotosintticas y quimiolitotrofas. Las diferen-
30:20
tes vas metablicas producen distintas discrimi-
naciones isotpicas.
El nitrgeno tiene dos istopos estables, 14N y
15
N (existe tambin un istopo radiactivo, pero es
extremadamente raro). Debido a que la proporcin
de 15N en el aire es constante (0,366 %), sta se
utiliza como estndar para la determinacin de los
valores de 15N. El nitrgeno es un elemento esca-
so en la Tierra; se encuentra solamente en la
atmsfera, como gas (N2), y en la superficie del pla-
neta, fundamentalmente formando parte de com-
puestos orgnicos, amonio y nitrato. Estas diver-
sas formas del nitrgeno son interconvertibles. La
mayor parte de estos cambios qumicos los reali-
zan organismos vivos, principalmente los microor-
ganismos. Prcticamente, todas las molculas de
nitrgeno gaseoso de nuestra atmsfera actual
han formado parte de algn organismo vivo. Las
reacciones biolgicas (asimilacin, nitrificacin y
desnitrificacin) controlan la dinmica de los cam-
bios o ciclo del nitrgeno. Estas reacciones dan
como resultado, por lo general, un empobreci-
miento en 15N del producto respecto del sustrato.
El hidrgeno tiene dos istopos estables: protio
(1H) y deuterio (2H, D), y un istopo radiactivo, tri-
tio (3H, T). Como el agua es el reservorio dominan-
te del hidrgeno en la Tierra, las variaciones isot-
picas de las rocas sedimentarias, gneas y meta-
mrficas reflejan la proporcin isotpica del agua
con la cual estuvieron en contacto durante su for-
macin. La distribucin D/H (expresado como D)
en diversas muestras geolgicas utiliza como refe-
rencia el SMOW (Standard Mean Ocean Water). En
el caso del oxgeno, el estndar es tambin el agua
de mar.
Algunas aplicaciones del fraccionamiento iso-
tpico
L os istopos se han empleado como "trazadores",
que nos permite seguir la pista de los elemen-
tos C, S, N, O, H, en las plantas, suelos, agua o
atmsfera. Generalmente, sus aplicaciones se han
centrado en estudios de ecologa (ciclos biogeoqu-
micos, cadenas trficas, contaminantes) y paleon-
tologa. El estudio isotpico de restos fosilizados,
en rocas sedimentarias, permite utilizarlo como
posible "biomarcador" para la deteccin de vida
antigua. Ms recientemente, se ha utilizado como
herramienta en el diagnstico mdico, bien de
enfermedades infecciosas o enfermedades meta-
blicas. Sin embargo, a pesar de ser una tcnica
que no supone dao para el paciente, todava no
se emplea en la prctica diaria, y generalmente
est en fase de experimentacin. A continuacin
Actualidad
se describen algunas de estas aplicaciones.
Estudios de contaminacin. Las actividades
industriales y agrcolas han tenido como resulta-
do la dispersin de contaminantes virtualmente
en todas las partes de la atmsfera, hidrosfera,
pedosfera y biosfera. El anlisis de la abundancia
de los istopos estables en los materiales natura-
les orgnicos e inorgnicos constituye una herra-
mienta til para la determinacin del origen e his-
toria de un material presente en un ambiente.
Especficamente, se puede emplear en el estudio
de la contaminacin de nitrgeno por abonos, con-
taminacin fecal de las aguas subterrneas, iden-
tificacin de compuestos contaminantes de azufre
y nitrgeno en la atmosfera, y su posterior preci-
pitacin en forma de lluvia a los ambientes acu-
ticos. Por ltimo, y entre otros muchos, puede uti-
lizarse para la estimacin de la contaminacin de
los sedimentos por derivados del petrleo.
La mayor parte del nitrgeno de la biosfera y
hidrosfera proviene de la fijacin del nitrgeno
atmosfrico por microorganismos, aunque en
algunos lugares el nitrgeno es consecuencia de la
deposicin antropognica. Los abonos industriales
se producen utilizando la sntesis qumica de
Haber, en la cual se convierte nitrgeno atmosf-
rico en amonio, por lo que esta molcula conserva
las caractersticas isotpicas del nitrgeno de aire.
Valores aproximados a 10 0/00 de 15N en los sue-
los es indicativo de la aplicacin de abonos sint-
ticos.
Cambios climticos. El registro del CO2 atmosf-
rico de hace siglos o milenios proviene de testigos
o muestras de hielo recogidos de los glaciares. El
ltimo y ms importante de estos estudios es el
realizado con un muestreo de 2,9 km de profundi-
dad del hielo que cubre el gran lago Vostok, en la
Antrtida. De ste y otros estudios similares se
deduce que la concentracin de dixido de carbo-
no no ha sido constante a travs del tiempo , inter-
calndose perodos de mayor y menor concentra-
cin. La concentracin de CO2 ha incrementado en
un 12 % en los ltimos 35 aos (hasta alcanzar
las 360 ppm actuales), debido posiblemente a la
actividad industrial humana. Los cambios atmos-
fricos de CO2 parecen depender de su capacidad
de captacin por el mar. Durante los perodos
calientes, la circulacin ocenica est gobernada
por la salinidad. La superficie ecuatorial caliente
se mueve hacia el Atlntico norte, liberando calor
a la atmsfera, y posteriormente las aguas fras se
hunden retornando al Pacfico. Cambios en el sis-
tema de circulacin durante los perodos fros
pueden variar la alcalinidad del ocano, aumen-
Actualidad
tando la productividad en latitudes altas, incre-
mentando la captacin ocenica de CO2 y produ-
ciendo, por tanto, una disminucin de la concen-
tracin atmosfrica de CO2.
La historia atmosfrica del metano tambin
puede ser reconstruida por medidas del aire atra-
pado en los testigos de hielo. El elevado aumento
de CH4 entre la era preindustrial y la actual es
debida al aumento antropognico de la produc-
cin de metano por los rumiantes, plantaciones de
arroz, procesos industriales e incendio de grandes
cantidades de biomasa. La reconstruccin de la
abundancia histrica de los gases atmosfricos en
diferentes escalas de tiempo pasado permitir, en
la mayor parte de los casos, entender las implica-
ciones climticas del reciente aumento de estos
gases por la actividad de nuestra especie.
Identificacin de bacterias y de su papel en el
ambiente. Los istopos estables han sido utiliza-
dos para identificar microorganismos que estn
activamente implicados en un proceso metablico
especfico, bajo condiciones similares a las que
ocurren en los ambientes naturales. Como ejem-
plo, se estudiaron las bacterias metilotrofas, que
pueden utilizar molculas de un slo carbono, C1
(es decir, que no tienen uniones carbono-carbono)
como nica fuente de energa y carbono. El creci-
miento de la bacteria metilotrofa Methylobacterium
extorquens con 13CH3OH (99 % 13C-metanol),
aumenta la densidad relativa del DNA respecto a
M. extorquens en presencia de 12CH3OH, en un gra-
diente de densidad de cloruro de cesio. Resultados
similares se han obtenido con Methylomicrobium
album en presencia de 12CH4 y 13CH4. Esta caracte-
rstica permite distinguir los microorganismos
activos metablicamente en una muestra ambien-
tal en funcin del sustrato presente en el medio.
Las fracciones de 12C-DNA y 13C-DNA recogidas de
suelos expuestos a metanol 12C y 13C, respectiva-
mente, fueron utilizadas como moldes para la
PCR. Se emple un gen especfico de la subunidad
pequea del rRNA de bacterias, arqueas y euca-
rias como cebador. La amplificacin del 13C-DNA
del suelo expuesto a 13CH3OH mostr que slo las
bacterias estaban implicadas en la asimilacin del
metanol. El anlisis filogentico de la secuencia
16S del rRNA amplificado, puso de manifiesto dos
lneas distintas de bacterias que asimilan meta-
nol: el subgrupo de las proteobacterias y la divi-
sin Acidobacterium. Este resultado fue inespera-
do, ya que el metanol puede ser metabolizado y
asimilado por un amplio rango de microorganis-
mos que incluyen Gram-negativos, Gram-positi-
vos y algunas levaduras. El anlisis paralelo de la
secuencia del gen mxaF, que codifica la subuni-
30:21
dad a de la metanol deshidrogenasa encontrada
en las bacterias metilotrofas Gram-negativas,
corroboran los datos obtenidos con 16S rRNA, lo
que indica que los metilotrofos Gram-negativos
activos del suelo del bosque estn restringidos al
subgrupo a de las proteobacterias.
Cadenas trficas. Los istopos estables pueden
constituir una herramienta muy til para el estu-
dio de los flujos de energa en las cadenas alimen-
ticias. La composicin isotpica del carbono de los
animales depende de la ingesta. En general, exis-
te un ligero incremento (0,5 a 1 0/00) en el animal
respecto a su dieta. Algunos de los procesos que
contribuyen a este enriquecimiento son: (i) prdi-
da preferencial de 12CO2 en la respiracin; (ii) cap-
tacin selectiva de compuestos 13C durante la
digestin; (iii) fraccionamiento metablico durante
la formacin de distintos tipos de tejidos (pelo >
cerebro > msculo > hgado > adiposo). Esta
transferencia conservativa de la composicin iso-
tpica (< 10/00) del animal respecto a la dieta, por
tanto, se puede emplear como trazador de la red
trfica en sistemas donde existan diferencias en
los valores de 13C, tales como plantas C3 o C4 o
sistemas marinos respecto a terrestres. Se estima
que existe un enriquecimiento de aproximada-
mente el 1,1 0/00 por nivel trfico.
A diferencia del carbono, el nitrgeno ha sido
menos estudiado. Sin embargo, tambin se ha
observado un enriquecimiento del 15N (3,2 0/00) en
el animal respecto de su dieta. Este aumento
puede deberse a la excrecin preferente de 14N. Se
estima que el enriquecimiento de 15N es del 3 0/00
por nivel trfico. En el caso del 34S no parece haber
un incremento en el animal respecto a la dieta, a
lo largo de los distintos niveles trficos.
Dietas fsiles. La composicin de istopos esta-
bles de los alimentos y fluidos ingeridos por los
animales influyen de forma manifiesta en la com-
posicin isotpica de los tejidos que sintetiza. Sin
embargo, la relacin exacta entre la composicin
isotpica de los materiales ingeridos y un tejido o
componente molecular del animal es bastante
complejo, ya que depende del estado nutricional,
del recambio intrnseco de un tejido o de las vas
biosintticas implicadas. Para el estudio isotpico
de la paleodieta se escogen los istopos de carbo-
no y nitrgeno de los constituyentes fosilizados del
colgeno. Para los istopos de carbono y oxgeno,
los minerales biognicos, la hidroxiapatita de los
huesos y dientes, y el CaCO3 de la cscara de los
huevos de aves y reptiles. La composicin isotpi-
ca del colgeno del hueso reflejara la dieta media
ingerida a lo largo de la vida del animal (debido a
30:22
la remodelacin constante del tejido seo, que pre-
senta mayor intensidad durante las fases de des-
arrollo del individuo). La protena en la dentina y
esmalte reflejara nicamente la composicin iso-
tpica de la dieta durante la formacin del diente,
en una etapa temprana de la vida del individuo.
Los valores de 13C del colgeno animal es el refle-
jo de la composicin isotpica de las plantas, base
de la cadena alimentaria en un ecosistema. Las
plantas varan en su composicin isotpica en res-
puesta a factores fisiolgicos y ambientales.
El inters de la investigacin de la paleodieta se
ha centrado en la determinacin en la proporcin
de plantas C3 o C4 en la dieta de los homnidos y
herbvoros acompaantes en diferentes perodos.
Este estudio permite entender la dieta de anima-
les extintos. Por ejemplo, en el Pleistoceno tardo,
los mastodontes de la costa este de los EE.UU.
tenan una dieta formada ntegramente por plan-
tas C3, mientras que los mamuts de la misma
zona ingeran una proporcin considerable de
plantas C4.
La proporcin entre plantas C4 y C3 en una
regin es sensible a la temperatura y humedad, de
tal manera que el estudio de la composicin isot-
pica permite estimar cuantitativamente los cam-
bios paleoclimticos. Por ejemplo, la 13C del col-
geno del bisonte vara desde un -7 0/00 actual hasta
un -19 0/00 hace 10.000 aos. Este resultado pare-
ce estar relacionado con los cambios de la flora, de
clima fro y hmedo, caracterstica del Pleistoceno
tardo, a condiciones ms secas en el Holoceno.
Las 13C del colgeno de un animal depredador y
su presa no varan significativamente. Se han rea-
lizado estudios de 15N entre los animales herb-
voros y carnvoros terrestres para calibrar el grado
de consumo de alimentos animales en los huma-
nos. De ellos se deduce que el Neandertal era prin-
cipalmente carnvoro, si se comparan los valores
de 15N del colgeno con herbvoros y carnvoros
conocidos. Tradicionalmente, el estudio de la
paleodieta de un organismo se ha relacionado con
los dientes y, en su conjunto, el aparato mastica-
dor. Con el estudio del fraccionamiento isotpico
se ahonda en el conocimiento de la dieta del orga-
nismo fosilizado, no solamente en si eran herbvo-
ros o carnvoros, sino en qu tipo de plantas o ani-
males basaban su dieta, o, incluso su "posicin"
en la cadena trfica.
Diagnstico clnico. Diversas enfermedades
infecciosas humanas, de plantas o de animales,
estn causadas por agentes etiolgicos desconoci-
dos o incultivables (o ambos). Helicobacter pylori,
identificado como el agente etiolgico de la gastri-
tis humana, cuya persistencia puede conducir a la
Actualidad
ulceracin y cncer gstrico, se aisl por primera
vez en 1982. Es un patgeno que infecta crnica-
mente al 50 % de la poblacin humana mundial.
El adenocarcinoma gstrico ocupa el lugar 14
entre las causas de muerte en el mundo y, con el
aumento de la edad de la poblacin mundial, se
cree que el 2.010 alcanzar el octavo. Los factores
de virulencia incluyen una citotoxina y una poten-
te enzima, la ureasa. Esta ltima crea un micro-
ambiente alcalino que permite el desarrollo del
microorganismo a pesar de la acidez del estmago.
Tradicionalmente, la deteccin de H. pylori se ha
realizado por un mtodo invasivo, mediante una
biopsia del tejido, a partir del cual se inoculaba en
placas de medio de cultivo selectivos como el agar
Skirrow o Tayer Martin, donde se realizaban las
pruebas de la oxidasa, catalasa y ureasa. La ure-
asa hidroliza la urea a amonio, agua y CO2 . Otros
mtodos alternativos no invasivos incluyen el test
de respiracin de la urea-13C y test serolgico con
anticuerpos. El test de la urea-13C consiste en
administrar oralmente (como bebida) una solucin
de cido ctrico 10 minutos antes de la adminis-
tracin de la urea-13C. La tasa 13CO2/12CO2 se midi
en muestras de aliento cogidas a los 10, 20 30, 60
min despus de la administracin de urea-13C.
Astrobiologa e historia de la Tierra. El estudio
del meteorito marciano ALH84001, que es del tipo
SNC (vase Guerrero y Berlanga, Actualidad
SEM [29] pp. 14-20), contiene un tipo de carbono
orgnico asociado con los minerales de piroxeno
del meteorito, que incluye hidrocarbonos policcli-
cos y otras molculas orgnicas de elevado peso
molecular (quergenos) con un valor de 13C de
15 0/00. Todas estas molculas orgnicas podran
ser de origen biolgico. Sin embargo, este valor es
similar a la materia orgnica de los meteoritos
carbonceos, y por tanto algunos cientficos inter-
pretan que este material cay previamente en
Marte y no es consecuencia de un proceso biolgi-
co. La cantidad de materia que entra en la Tierra
procedente del espacio interplanetario es conside-
rable; se calcula que cada da impactan sobre
nuestro planeta un total de meteoritos cuyo peso
conjunto superara las 20 toneladas.
Los estudios del fraccionamiento isotpico,
especialmente del carbono y azufre, en relacin
con la antigedad de la vida, son un tema recu-
rrente en las revistas ms destacadas.
Peridicamente se publican estudios sobre la dis-
criminacin isotpica de la materia (supuesta-
mente) pre-biolgica de una de las rocas ms anti-
guas que se conocen: las de la formacin de Issua,
en Groenlandia, de hace algo menos de 3.900
millones de aos. Inmediatamente despus de la
Actualidad
publicacin, el significado de los datos expuestos,
o su validez experimental, son puestos en duda
por otros investigadores. En este campo, como en
el del significado de los restos que se encuentran
en los meteoritos SNC, la polmica y la incerti-
dumbre va a durar todava algunos aos.
Coda
S i miramos la tabla peridica de los elementos,
arriba, casi a la derecha, veremos tres smbo-
los seguidos, C, N, O, e inmediatamente debajo
otros dos, P y S. Podramos llamar a esta curiosa
agrupacin "el quinteto de la vida". Los procesos
bioqumicos de los principales elementos en los
que se basa la vida implican un fraccionamiento
isotpico. La evidencia de este fraccionamiento lo
encontramos en la materia orgnica fosilizada
(quergenos) presente en las rocas; el estudio de
las mismas pone de manifiesto procesos biolgicos
esenciales como la fijacin de CO2 o la reduccin
de sulfato. Los istopos estables proporcionan
una base experimental para inferir el estableci-
miento de la vida sobre la Tierra, la reconstruc-
cin secuencial de la invencin de los diferentes
procesos metablicos, la evolucin de distintas
microbiotas, faunas y floras. El conjunto de los
ciclos biogeoqumicos observados en el mundo
contemporneo es el resultado de la evolucin de
3.500 millones de aos de historia "viva" de la
Tierra.
El espacio interestelar (que nos parece vaco)
rebosa material orgnico e inorgnico. Se calcula
que en el volumen determinado por un mero
parsec (es decir, un parsec cbico) hay sufi-
ciente materia para formar 200 Tierras.
Recordemos que un parsec es aproximadamente
3. 000.000.000.000.000.000 cm. (S, el lector ha
contado bien, hay 18 ceros; o sea, "solamente"
unos 3 aos-luz.) Con esta enorme cantidad de
materia, en la an ms enorme inmensidad del
espacio, pueden formarse miles de millones de
estrellas y planetas. Y, efectivamente, se forman,
transforman y destruyen. Desde el punto de vista
csmico, la Tierra es slo un pequeo planeta que
ocupa el tercer lugar en orden de distancia de su
estrella, el Sol, quien a su vez es una estrella
mediana de una galaxia mediana, situada en un
lugar del espacio intergalctico. El origen y des-
arrollo de la Tierra, as como la evolucin de la
vida sobre ella, han sido fenmenos contingentes
que pudieron ocurrir o no ocurrir, y, dado que
ocurrieron, que pudieron haberse dado de una
manera o de otra. Una nica lnea de aconteci-
mientos, la que efectivamente ocurri, ha dado
30:23
origen a la Tierra, a la vida, a nuestra especie, tal
como las conocemos. A pesar de la certeza de la
vida, como una continuidad necesaria de las leyes
de la fsica, y de su muy posible ubicuidad, podr-
amos preguntarnos si en algn otro lugar del uni-
verso, en esa inmensidad csmica, hace ya mucho
tiempo, o ahora, o bien en el futuro, han podido
darse exactamente los mismos fenmenos vitales
que se han producido en nuestro planeta. Si es
verdad que los cientficos interpretan el mundo,
los filsofos explican las causas ltimas, pero slo
los poetas lo comprenden, tal vez podamos enten-
der las palabras de Gngora que describen, con
muy contados versos, los cambios y destino de las
partes de una dama:
No slo en plata o viola troncada
se vuelva, mas t y ello juntamente
en tierra, en humo, en polvo, en sombra, en nada.
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