Análisis de Flujos Metabólicos en La Producción de Ácido Clavulánico

ANLISIS DE FLUJOS METABLICOS EN LA
PRODUCCIN DE CIDO CLAVULNICO A PARTIR DE

Streptomyces clavuligerus
CLAUDIA PATRICIA SNCHEZ HENAO

Ingeniera Qumica, M.Sc.
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE INGENIERA
DOCTORADO EN INGENIERA
MEDELLIN (ANT.)
2013
ANLISIS DE FLUJOS METABLICOS EN LA
PRODUCCIN DE CIDO CLAVULNICO A PARTIR DE
Streptomyces clavuligerus
CLAUDIA PATRICIA SNCHEZ HENAO

Ingeniera Qumica, M.Sc.
Tesis para optar al ttulo de Doctora en Ingeniera
Director
JUAN CARLOS QUINTERO DAZ
Ingeniero Qumico, M.Sc., Ph.D.
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE INGENIERA
DOCTORADO EN INGENIERA
MEDELLIN (ANT.)
2013
Gracias Dios:
Por los dones que me has dado y por iluminarme

para saber cul es el mejor camino a seguir,
por ensearme a aceptar y aprender de las dificultades
y darme nimos para seguir en la lucha de mis metas propuestas.
Porque he aprendido no slo de los buenos resultados,

y de las excelentes personas que has puesto en m camino,
sino tambin de aquellos que en ciertos momentos desearon hacerme dao.
Por permitirme ser un ser integral.
Debo este logro a la memoria de mi padre, por siempre creer en m y brindarme su apoyo.
Inyect energa a mi vida, mi hija, quien me motivo a continuar con mi trabajo.
Otra razn de inspiracin, mi amor, quien me ense aprender a desaprender,
Sin duda, gracias a mis amigos y a toda mi familia por confiar en m .
iii
AGRADECIMIENTOS
La autora expresa sus agradecimientos a:
La Universidad de Antioquia por su apoyo para iniciar mis estudios a travs de la beca de
Estudiante instructor y posteriormente facilitar la culminacin a travs de Comisin de Estudios. Al
Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnologa e Innovacin - COLCIENCIAS, por financiar
mi estudios a travs de la Convocatoria de Doctorados Nacionales 2007.
La Universidad de Antioquia y a Colciencias, por el apoyo econmico al proyecto Modelado

metablico de la produccin de cido clavulanico a travs del contrato 227 de 2009 y por el apoyo
para dotacin a travs del proyecto de Sostenibilidad.
Los profesores evaluadores Claudio Avignone-Rosa, Pablo Ivn Nikel y Rodrigo Torres por su
colaboracin y disponer parte de su tiempo para la revisin, mejoramiento y sustentacin de este
trabajo.
El Profesor Juan Carlos Quintero Daz, Director de la Investigacin, por sus enseanzas, por su
compresin, por la confianza depositada en m y la motivacin durante el desarrollo del trabajo.
Los profesores Paloma Liras y Juan Francisco Martn por permitirme realizar la pasanta en
INBIOTEC y brindarme las orientaciones y acompaamiento para la realizacin de los cultivos de
produccin de cido clavulnico en este trabajo.
Los profesores Silvia Ochoa C. y Rigoberto Ros E. por sus orientaciones para la realizacin del
proyecto modelado metablico de la produccin de AC y por su apoyo en este trabajo.
La estudiante de Maestra Nathalia Gmez Grimaldos por permitir profundizar ms en los aspectos
de modelado cintico y por toda su colaboracin en la realizacin de las pruebas experimentales y
en especial por su amistad.
Al profesor Rodrigo Torres Sez y sus estudiantes Cesar Vargas Garca y Carlos Garca Snchez
por su apoyo en el manejo del software CellNetAnalyzer y algunos tips para el trabajo en modelado
metablico en sistemas subdeterminado (FBA).
La profesora Mara Esperanza Lpez y el Ingeniero Cesar Augusto Botache por confiar en m, y ser
mis codeudores ante el ICETEX en el crdito condonable concedido por COLCIENCIAS. Al
profesor Mauricio Snchez por confiar en m al servirme de codeudor ante la Universidad de
Antioquia para acceder a la comisin de Estudios.
Los integrantes del Grupo de Bioprocesos por su compaa, apoyo e inters en el buen desarrollo
de este trabajo.
A los profesores del Departamento de Alimentos de la Facultad de Qumica Farmacutica, por

creer en m y tener paciencia para la buena culminacin de mis estudios doctorales.
Y a todos aquellos que se me escapan sus nombres de la mente, pero estn en mi corazn y que de
alguna manera han estado colaborndome, como amigos o como personas silenciosas, pero
importantes tambin para el cumplimiento de esta meta.
iv
ABREVIACIONES
AA Aminocido proclavamnico
AAs Aminocidos dGTP Deoxiguanosina-5 trifosfato
Ac. cido DHAP Dihidroxiacetona fosfato
AC cido clavulnico DHC Ac. dihidroxiclavamnico
ACCOA Acetil-coenzima A DMC Ac. dihidroxiclavamnico
ACM Dimtil citraconato
Ac. clavamnico
AICAR 5-aminoimidazol-4- dTTP Deoxitimidina-5-fosfato
carboxamida E4P Eritrosa-4-fosfato
aIPM Alfa-isopropilmalato ED Entner- Deudoroff
aKG Alfa-cetoglutarato EMP Embden Meyerhoff Parnas
aKI Alfa-cetoisovalerato F Grados de libertad
aKIC Alfa-cetoisocaproato F16P Fructosa-1.6-bifosfato
aKMETVAL Alfa-ceto-beta-metilvalerato F6P Fructosa-6-fosfato
ALA Alanina FADH2 Dinucletido de flavina-
APC Ac. proclavamnico adenina (forma reducida)
ARG Arginina, C-5 FBA Flux balance analysis, balance
ARG-SUC Argino-succnico de flujo metablico
ASN Asparagina FC Fuente de carbono
ASP Aspartato FN Fuente de nitrgeno
ASPSEMALD Semialdehido aspartato FOBJ Funcin objetivo
ATP Adenosina-5-trifosfato FUM Fumarato
IPM -isopropilmalato G6P Glucosa-6-fosfato
-LS -lactama sintetasa GAP Gliceraldehido -3-fosfato
C55P Undecaprenil-fosfato GCL Glicerol
C55PP Undecaprenil-pirofosfato GCL3P Glicerol-3-fosfato
CAR Clavaldehdo reductasa GLN Glutamina
CARBP Carbamoilfosfato GLU Ac. glutmico
CCHO Clavaldehdo GLY Glicerol
CEA Carboxietil arginina GPC Ac. guanidinoproclavamnico
Ceas Carboxietil arginina sintasa gN1P Glucosamina-1-fosfato
CDP Citidina-5-trifosfato gN6P Glucosamina-6-fosfato
CHOR Ac. corsmico GTP Guanosina-5-trifosfato
CITRU Citrulina HIS Histidina
CMP Citidina-5-monofosfato HOMCYS Homocistena
CO2 Dixido de carbono HSER Homoserina
CTP Citidina-5-trifosfato ILE Isoleucina
CYS Cistena IM Ingeniera Metablica
dATP Deoxiadenosina-5-trifosfato ISOBUTCOA IsobutirilCoA
dCTP Deoxicitidina-5-trifosfato ISOPP Isopentenil-pirofosfato
D Tasa de dilucin LEU Leucina
DFM Distribucin de flujos LLDIAPIM Ac. LL-diaminopimlico
metablicos LYS Lisina
DGPC Ac. deoxiguanidino- MAL Malato
v
MCC Metabolismo central del TRP Triptfano
carbono TYR Tirosina
MET Metionina
METHF n5-n10-metilen- UREA Urea
tetrahidrofolato UTP Uridina-5-trifosfato
MP Medio de produccin VAL Valina
MK-9H Menaquinona-9-(reducida) X5P Xilulosa-5-fosfato
NADH Nicotinamida-adenina-di
nucletido-(reducida)
NADPH Nicotinamida-adenina-di DGPC Ac. deoxiguanidino
nucletido-fosfato-(reducida) proclavamnico
NAG1P N-acetil-glusosamina-1-fosfato 2METBUTCOA 2-metilbutirilCoA
NH4 Amonio 3METBUTCOA 3-metilbutirilCoA
O2 Oxgeno 3PG 3-fosfoglicerato,
OD Oxgeno disuelto
OAA Oxaloacetato
ORN Ornitina
OTR Velocidad de transferencia de
O2 (oxygen transfer rate).
OUR Velocidad de consumo de O2
por la clula (oxygen uptake
rate).
P Fsforo
PAH Proclavaminato
amidinohidrolasa
PEP Fosfoenolpiruvato
PHE Fenilalanina
PP Pentosa fosfato
ppGpp Nucletido de guanosina
tetrafosfato
PRO Prolina
PRPP 5-fosforibosil-pirofosfato
PYR Piruvato
R5P Ribulosa-5-fosfato
RIB5P Ribosa-5-fosfato
RNA cido ribonucleico (ARN)
mRNA Mensajero RNA
rRNA RNA ribosomal
tRNA RNA de transferencia
Sc Streptomyces clavuligerus
SED7P Sedoheptulosa-7-fosfato
SER Serina
SUC Ac. succnico
SUCCOA Succinil-CoA
T Temperatura
THR Treonina
vi
CONTENIDO
AGRADECIMIENTOS .......................................................................................... iv
ABREVIACIONES ................................................................................................. v
LISTA DE TABLAS .............................................................................................. xii
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ xii
LISTA DE APNDICES ....................................................................................... xii
LISTA DE ANEXOS. ............................................................................................ xii
RESUMEN .......................................................................................................... xv
SUMMARY ......................................................................................................... xvii
INTRODUCCIN ................................................................................................ 19
CAPTULO 1. ..........................................................................................................
SALUD PBLICA VS ENFERMEDADES INFECCIOSAS. ................................ 29
1.1. LOS ANTIBITICOS -LACTMICOS..................................................... 31
1.1.1. Generalidades............................................................................................. 31
1.1.2. Clasificacin de los antibiticos. ............................................................... 33
1.2. RESISTENCIA MICROBIANA A LOS ANTIBITICOS. ........................... 36
1.3. PRODUCCIN INDUSTRIAL DE -LACTMICOS ................................. 38
REFERENCIAS................................................................................................... 41
CAPTULO 2 ...........................................................................................................
METABOLISMO DE S. Clavuligerus .................................................................. 43
2.1. BIOLOGA DE Streptomyces sp. ................................................................. 44
2.1.1. Ciclo de Vida: ................................................................................................. 44
2.1.2. Clasificacin del microrganismo en estudio: ................................................. 48
vii
2.1.3. Generalidades de algunos Estreptomicetos: .................................................. 49
2.1.4. Metabolitos secundarios producidos por Estreptomicetos: .......................... 51
2.2. CARACTERSTICAS METABLICAS DE Streptomyces .......................... 51
2.2.1. Requerimientos de energa........................................................................ 53
2.2.2. Sntesis de biomasa ................................................................................... 54
2.2.3. Ruta de Gluconeognesis. .......................................................................... 54
2.2.4. Ruta de las pentosas fosfato. ..................................................................... 54
2.2.5. El ciclo de Krebs (ciclo de los cidos tricarboxlicos)............................... 55
2.2.6. Ciclo de la urea. ......................................................................................... 56
2.2.7. Biosntesis de aminocidos: ....................................................................... 57
2.2.8. Biosntesis del cido clavulnico y otras clavamas ................................... 63
2.3. REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO Y FORMULACIN DEL

MEDIO DE CULTIVO. ......................................................................................... 68
2.3.1. Fuentes de nitrgeno.................................................................................. 69
2.3.2. Fuentes de carbono: ................................................................................... 72
2.3.3. Estudios del efecto de la fuente de fsforo. ............................................... 73
2.3.4. Efecto de elementos trazas. ....................................................................... 74
2.3.5. Efecto del oxgeno .................................................................................... 75
2.4. TIPO DE OPERACIN: LOTE, LOTE ALIMENTADO y CONTINUO. ........ 78
2.5. MODELADO Y SIMULACIN EN BIOPROCESOS. ................................. 80
2.5.1. Modelado cintico de Streptomyces sp........ Error! Marcador no definido.
2.5.2. Modelado metablico .................................................................................. 85
REFERENCIAS................................................................................................. 107
viii
CAPTULO 3 ...........................................................................................................
PRODUCCIN DE CIDO CLAVULNICO POR FERMENTACIN DE

Streptomyces clavuligerus: EVALUACIN DE DIFERENTES MEDIOS DE
CULTIVO Y MODELADO MATEMTICO. ....................................................... 115
3.1. INTRODUCCIN .................................................................................... 116
3.2 MATERIALES Y MTODOS................................................................... 118
3.2. 1. Tcnicas microbiolgicas. ...................................................................... 118
3.2.2. Mtodos analticos .................................................................................. 120
3.2.3. Modelo matemtico. ............................................................................... 121
3.3. RESULTADOS Y DISCUSIN ............................................................... 122
3.3.1. Evaluacin de los medios de cultivo........................................................ 122
3.3.2. Evaluacin de la concentracin de glicerol. ............................................ 124
3.3.3. Fermentacin en biorreactor de laboratorio ............................................. 126
3.4. CONCLUSIONES ....................................................................................... 129
BIBLIOGRAFA ................................................................................................. 130
CAPTULO 4 ..................................................................................................... 133
UNA COMBINACIN DE ANLISIS DE SENSIBILIDAD Y AFM MUESTRAN

LA IMPORTANCIA DE LA ESTRATEGIA DE ALIMENTACIN DE
AMINOCIDOS PARA LA BIOSNTESIS DE AC EN Sc. ................................ 133
4.1. INTRODUCCIN ....................................................................................... 134
4.2. MATERIALES Y MTODOS:.................................................................. 136
4.2.1. Tcnicas microbiolgicas. ....................................................................... 136
4.2.2. Mtodos experimentales. ......................................................................... 138
4.2.3. Mtodos analticos ................................................................................... 141
4.2.4. Planteamiento de la red metablica. ........................................................ 143
4.2.5. Anlisis de flujos metablicos y de sensibilidad. .................................... 146
ix
4.3. RESULTADOS Y DISCUSIN ................................................................. 147
4.3.1. Cultivos en biorreactor en lote y continuo, para la produccin de AC. . 147
4.3.2. Anlisis cuantitativo del comportamiento metablico intracelular. ......... 151
4.3.3. Anlisis de la distribucin de flujos metablicos en Sc. ........................... 160
4.4. CONCLUSIONES ...................................................................................... 164
REFERENCIAS:................................................................................................ 166
CAPTULO 5 ...........................................................................................................
ANLISIS DE BALANCES DE FLUJOS (FBA) EN LA PRODUCCIN DE AC

EN Streptomyces clavuligerus .......................................................................... 169
5.1. INTRODUCCIN .................................................................................... 170
5.2. METODOLOGA: .................................................................................... 172
5.2.1. Planteamiento de la red metablica. ........................................................ 172
5.2.2. Anlisis de balances de flujos metablicos (FBA). ............................... 175
5.2.3. Evaluacin de la funcin objetivo (FOBJ): ............................................ 176
5.2.4. Evaluacin del efecto del flujo de nutrientes sobre la produccin de AC....
................................................................................................................. 178
5.3. RESULTADOS Y DISCUSION .................................................................. 180
5.3.1. Ajuste del modelo metablico evaluando tres funciones objetivo. ......... 180
5.3.2. Efecto de los flujos de nutrientes (C, O2, N, P) sobre la produccin de

biomasa y AC y sobre algunos flujos metablicos intracelulares. .......... 182
5.4. CONCLUSIONES ..................................................................................... 190
REFERENCIAS:................................................................................................ 192
x
LISTA DE TABLAS
CAPTULO 1.
Tabla 1. 1. Formulaciones comerciales, prescripciones mdicas y microorganismos
susceptibles de provocar enfermedades infecciosas ................................................... 32
CAPTULO 2.
Tabla 2. 1. Relacin simplificada entre los aminocidos y su producto de biosntesis en
la va principal del carbono y los aminocidos productos de sntesis.......................... 72
Tabla 2. 2. Importancia biolgica de los elementos qumicos en los microorganismos. 76
CAPTULO 3.
Tabla 3.1. Parmetros del modelo cintico estimados con un 95% de nivel de
confianza, que fueron utilizados para la simulacin de la fermentacin de S.
clavuligerus. ............................................................................................................... 127
CAPTULO 4.
clavuligerus 149
Tabla 4. 2. Valores de flujos medidos obtenidos a dos tasas de dilucin. ............... 151
Tabla 4. 3. Anlisis de sensibilidad para los flujos calculados con respecto a cambios
en los flujos medidos ................................................................................................. 153
Tabla 4. 4. Reacciones que corresponden a los flujos medidos de mayor incidencia en
el sistema, de acuerdo con el anlisis de sensibilidad. .............................................. 160
CAPTULO 5.
Tabla 5. 1. Flujos medidos a una tasa de dilucin de 0.03 h-1. 177
Tabla 5. 2. Condiciones de evaluacin de los flujos de algunos sustratos a
condiciones de limitacin de nutrientes. 179
Tabla 5. 3. Comparacin entre flujos experimentales y simulados para diferentes

funciones objetivos (tasa de dilucin 0.03 h-1). 180
xi
LISTA DE FIGURAS
CAPTULO 1.
Figura 1. 1. Estructura qumica de algunos antibiticos -lactmicos 34
Figura 1. 2. Diagrama esquemtico de una penicilina genrica, la hidrlisis catalizada por

-lactamasa 38
CAPTULO 2.
Figura 2. 1. Ciclo de vida de Streptomyces sp. en medio slido. 46
Figura 2. 2. Presentacin jerarquica de la taxonomia de Streptomyces 48
Figura 2. 3. Morfologa macroscpica de colonias de Streptomyces coelicolor. 50
Figura 2. 4. Esquema simplificado de requerimiento de precursores para la biosntesis

de antibiticos 53
Figura 2. 5. Ruta de biosntesis de cido clavulnico y bifurcacin hacia-ruta de las

clavamas. 66
Figura 2. 6. Esquema de un sistema de elementos que se tienen en cuenta para el

modelado en bioprocesos 82
Figura 2. 7. Diagrama de flujo de los pasos a seguir en la solucin al modelado

metablico. 88
Figura 2. 8. Presentacin esquemtica de la metodologa empleada para realizar AFM.

90
Figura 2. 9 Modelo simplificado del metabolismo de S. clavuligerus 94
Figura 2. 10. Matriz estequiomtrica correspondiente al ejemplo de estudio 94
Figura 2. 11. Desarrollo del AFM 95
Figura 2. 12. Representacin esquemtica de la metodologa empleada para realizar

FBA 101
CAPTULO 3
Figura 3. 1. Efecto del uso de diferentes medios de cultivo sobre la produccin de cido
clavulnico (AC) 123
xii
Figura 3. 2. Efecto de la concentracin de glicerol (2, 5 y 10%), empleada como fuente
de carbono en cultivos de S. clavuligerus, sobre la produccin de cido clavulnico 125
Figura 3. 3. Cintica de fermentacin de S. clavuligerus en un biorreactor de 5L,

empleando el medio 5 a una concentracin de glicerol de 5%. 127
CAPTULO 4
Figura 4. 1. Representacin esquemtica del proceso de produccin de AC en lote y en

continuo. 135
Figura 4. 2. Representacin esquemtica de la red bioqumica empleada para AFM en

Sc. 143

empleando el medio qumicamente definido. 148
Figura 4. 4. Distribucin de flujos metablicos de la produccin de AC a partir de

Streptomyces clavuligerus (Sc). 163
CAPTULO 5.
Figura 5.1. Representacin sinttica de la red bioqumica empleada para modelado
metablico en Sc. 173
Figura 5.2. Representacin simplificada de la red metablica de Sc, incluyendo los flujos
intracelulares ms representativos. 182
Figura 5.3. Efecto de la disminucin del flujo de glicerol, sobre el flujo de AC y de

biomasa y sobre los flujos internos, "In Silico" para S. clavuligerus. 184
Figura 5.4. Efecto de la disminucin del flujo de amonio, sobre el flujo de AC y de

biomasa y sobre los flujos internos, " In Silico" para S. clavuligerus. 185
Figura 5.5. Efecto de la disminucin del flujo de oxgeno, sobre el flujo de AC y de

biomasa y sobre los flujos internos, " In Silico" para S. clavuligerus. 187
Figura 5.6. Efecto de la disminucin del flujo de fosfato, sobre el flujo de AC y de

biomasa y sobre los flujos internos," In Silico" para S. clavuligerus. 189
xiii
LISTA DE APNDICES
CAPTULO 4
APNDICE A. Modelo de reacciones metablicas para producir cido clavulnico a
partir de Sc. 194
APNDICE B. Anlisis de sensibilidad y de flujos metablicos

Tabla B1. Anlisis de sensibilidad de los flujos considerados como medidos. 196
Tabla B2. Anlisis de flujos metablicos, a dos tasas de dilucin, en la produccin de AC

a partir de S. clavuligerus. 197
CAPTULO 5
APNDICE A. Modelo de reacciones metablicas para producir cido clavulnico a partir
de ScError! Marcador no definido.
198
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1. IMPACTOS DEL TRABAJO DE INVESTIGACIN 201
ANEXO 2. PRODUCCIN CIENTFICA DERIVADA DE LA TESIS 205
xiv
RESUMEN
El cido clavulnico (AC) es un inhibidor -lactmico que se usa combinado con otros -
lactmicos con propiedades antibiticas para combatir algunas enfermedades infecciosas.
Actualmente se produce por fermentacin a un costo elevado debido a que se obtiene en
muy bajas concentraciones (menores a 1 g L-1). Hasta la fecha se han realizado importantes
avances para mejorar la produccin de cido clavulnico (AC) tanto por el estudio de las
variables ambientales que afectan su sntesis como por el establecimiento de las vas
metablicas y los genes involucrados en stas, encontrndose muy pocos trabajos que
involucran anlisis de flujo. Para el mejoramiento gentico de la produccin de AC se han
empleado las tcnicas mutaciones, logrndose algunos avances al respecto.
Con el presente trabajo se quiere resaltar la importancia de la aplicacin del anlisis de
flujo metablico, una herramienta de la Ingeniera Metablica, para incrementar la
produccin de metabolitos de inters industrial, especialmente del cido clavulnico
obtenido a partir de Streptomyces clavuligerus. La importancia de esta estrategia radica en
el anlisis racional de las vas metablicas para lograr identificar las enzimas responsables
de una ptima biocatlisis en donde se maximice el rendimiento y la productividad del AC.
Dentro de las metodologas usadas en ingeniera metablica estn: anlisis de la capacidad
celular, anlisis de flujo metablico, anlisis de control metablico, sntesis de sistemas e
integracin de datos bioinformticos. En este trabajo se abordar el anlisis de flujo
metablico a partir de las rutas bioqumicas ya establecidas y del conocimiento fisiolgico
y de fermentacin existente. Para esto se valid alguna informacin de la literatura sobre el
medio de cultivo a emplear y las condiciones operacionales de produccin en lote y en
xv
continuo. Una vez obtenidas las cinticas de fermentacin en lote, las cuales fueron
referente de la investigacin, se abordaron estudios en sistemas de operacin continuos,
para evaluar, en estado estacionario, los flujos metablicos de los diferentes compuestos
presentes en la ruta bioqumica ya definida, como glicerol, nitrgeno (asparagina), AC,
oxgeno y aminocidos de forma directa y los otros de manera indirecta empleando el
balance de flujo metablico tanto en sistema determinado (AFM) como subdeterminado
(FBA). Estos se calcularon a travs de un modelo matemtico del sstema en estado
estacionario haciendo uso del paquete computacional CellNetAnalyzer.
El resultado obtenido sobre la cuantificacin de los flujos metablicos, sirvi para conocer
cuantitativamente el mapa metablico de biosntesis de AC y permiti realizar anlisis de
distribucin de flujos bajo diferentes condiciones y estrategias para proponer posibles
cuellos de botella, los cuales pueden servir para orientar posteriores trabajos de anlisis de
control metablico o mejoramiento gentico para la biosntesis de antibiticos en
Streptomyces clavuligerus. Se espera que conociendo las etapas controlantes de biosntesis
de AC de Sc, se incremente el ttulo de AC en la fermentacin a travs de modificaciones
genticas u otras estrategias de alimentacin de nutrientes y por ende se puedan disminuir
los costos de produccin.
xvi
SUMMARY
Clavulanic acid (CA) is a potent -lactamase inhibitor that is commonly used in
combination with other -lactam antibiotics for the treatment of certain infection diseases.
Currently, CA is produced by fermentation at a relatively high cost, mainly because of the
low concentration levels that are achieved (typically below 1g L-1). To date, there have
been accomplished important advances for improving CA production, both by means of
studying environmental parameters and culture medium, and by identifying metabolic
pathways and their related genes; however it has been found relatively few studies related
to flux analysis. Genetic improvements have also been performed for larger CA production.
This work is aim at highlighting the importance of performing metabolic flux analysis (a
Metabolic Engineering tool) for increasing the production of commercially important
metabolites, e.g. CA produced by Streptomyces clavuligerus. The importance of this
strategy relies on a metabolic-pathway rational analysis for the purpose of ascertaining the
enzymes responsible of optimal bio-catalysis, thus maximizing CA yield and productivity.
The following are the most frequently used methodologies in Metabolic Engineering:
analysis of cellular capacity, metabolic flux analysis, metabolic control analysis, systems
biology and data mining and bioinformatics.
In this work, metabolic flux analysis has been applied to the production of clavulanic acid,
based on the already established biosynthetic pathways, and the knowledge gained from of
Streptomcyes physiology and from fermentation studies.
xvii
Taking this into consideration, various experimental reports on culture media and batch and
continuous operation conditions were validated. Once the batch kinetic data, were
obtained, the continuous operation was performed with the aim of evaluating the steady
state flux distribution of the different external, internal and intermediate metabolites, e. g.
glycerol, nitrogen (asparagine), CA, oxygen and aminoacids. Flux measurements were
completed directly, by analytical techniques and indirectly by metabolic flux analysis
(MFA), for a determined system, and flux balance analysis (FBA), for an undetermined
system. MFA and FBA were calculated by means of a mathematical model of the system,
under steady-state conditions, employing the computational package CellNetAnalyzer.
The results, related to metabolic flux quantification, were useful for quantitatively
deciphering the metabolic map of clavulanic acid biosynthesis; they also did allow
performing an analysis of metabolic flux distribution under diverse conditions, and to
advise strategies for proposing feasible bottlenecks that eventually would guide further
studies of metabolic control analysis and genetic improvements for the synthesis of CA in
Streptomyces clavuligerus. It is expected that knowing the controlling steps, CA titers
during fermentation would increase by virtue of genetic modification and feeding
strategies, thus contributing to reduce the costs of production.
xviii
INTRODUCCIN
Las enfermedades infecciosas constituyen uno de los principales problemas de salud
pblica en el mundo por la alta morbilidad y mortalidad que generan. Para la poblacin
adulta se tiene un ndice de mortalidad (nmero de fallecidos/1000 habitantes) 12 por
malaria y 15 por tuberculosis [1]. Este problema se ha venido combatiendo desde hace
cerca de 60 aos con el uso de antibiticos, donde el descubrimiento de la penicilina, dio
origen a toda una familia de antibiticos, entre los que se encuentran los -lactmicos.
La elevada exposicin de los microorganismos a los antibiticos ha generado que
ocurran mutaciones naturales conduciendo a estos microorganismos a desarrollar
mecanismos de resistencia a los antibiticos. Este fenmeno ha obligado a la comunidad
cientfica a conducir investigaciones para obtener nuevos antibiticos y para mejorar los
procesos existentes para su obtencin. La resistencia a los antimicrobianos se ha
convertido rpidamente en un grave problema de salud pblica, con repercusiones
econmicas, sociales y polticas de alcance mundial [2, 3].
El mecanismo de resistencia ms frecuente entre las bacterias es la de no verse afectadas
por la presencia de antibiticos -lactmicos, esto ocurre debido a la excrecin de
enzimas -lactamasas, que desdoblan el antibitico impidiendo su accin. Para este tipo
de resistencia se ha encontrado una sustancia denominada cido Clavulnico (AC) que
acta como inhibidor de las enzimas -lactamasas, impidiendo que el antibitico sea
desdoblado [4]. El AC posee baja actividad como antibitico, pero es un potente
inhibidor de estas enzimas, por lo que se usa en conjunto con un antibitico -
lactmico, en formulaciones farmacuticas.
19
El AC se produce mediante cultivo sumergido de la bacteria Streptomyces clavuligerus
(Sc) que emplea glicerol como su principal fuente de carbono, obtenindose una
titulacin menor a 1 g L-1 [5]. Este bajo nivel de produccin hace que el AC tenga un
alto valor en el mercado causando dificultad de acceso para la poblacin de bajos
recursos (la formulacin combinada de amoxicilina y AC tiene un precio de mercado 40
veces mayor que el del antibitico genrico amoxicilina). Por estas razones, se han
realizado mltiples investigaciones orientadas a incrementar la produccin de AC
mediante la mejora del microorganismo y el proceso. Entre las estrategias que se han
empleado se encuentran tecnologas clsicas como mutagnesis aleatoria y
determinacin de condiciones operacionales adecuadas para los cultivos, y otras
tecnologas ms recientes como son la ingeniera genmica e ingeniera metablica (IM)
[6].
La IM ha adoptado el nombre de ingeniera, dado que involucra dos aspectos esenciales
de ella, el anlisis y la sntesis de procesos. En este caso, los procesos son las actividades
metablicas que la clula lleva a cabo por medio de su metabolismo. En la clula se
llevan a cabo un gran nmero de reacciones que son acopladas y reguladas por otra serie
de reacciones y por sistemas selectivos de transporte membranal. La IM emerge a
comienzos de los 90s [6, 7]. Clsicamente, el mejoramiento de especies de
microorganismos (MO) para obtener metabolitos secundarios de inters industrial se han
basado en tcnicas genticas de seleccin y mutagnesis aleatoria, conllevando esto
muchos aos de investigacin, por lo que se pretende mediante IM racionalizar el
proceso de mejoramiento al disminuir el espectro de posibilidades de alteraciones
moleculares de la especie [8, 9]. Una de las herramientas empleadas para hacer IM es el
anlisis de flujos metablicos (AFM) que permite a partir de un modelo metablico

20
establecido y mediante el uso de procedimientos matemticos calcular los flujos
metablicos intracelulares. A travs de la comparacin de diferentes cambios en los
valores de los flujos, se puede conocer o prever los efectos de perturbaciones
ambientales o genticas sobre los metabolitos de inters. La metodologa empleada para
llevar a cabo el AFM va desde la recopilacin de informacin para el modelado
metablico pasando por el desarrollo matemtico necesario para hacer las respectivas
simulaciones hasta el anlisis de las variaciones de los flujos intracelulares como
respuesta a perturbaciones [6, 8].
Se han realizado importantes avances en el estudio de las variables ambientales que
afectan la sntesis de AC y condiciones operacionales del proceso de fermentacin. Entre
estos avances estn el establecer que el glicerol y fuentes de nitrgeno complejas como
la harina de soja son nutrientes favorables para incrementar la titulacin de AC y
lograr minimizar los efectos de represin catablica por glicerol o amonio mediante
operacin en continuo y en lote alimentado [5, 6, 9, 10, 11]. Los valores de produccin
de AC observada en las diferentes investigaciones reportadas en la literatura, muestran
una gran variabilidad dependiendo de las condiciones de cultivo, el mejoramiento de la
cepa, el tipo de nutrientes, etc., y oscilan entre 50 y 1000 mg L -1 [5, 6]. Tambin se ha
trabajado en la identificacin de la va metablica y los genes involucrados en la
produccin de AC, lo cual ha permitido establecer en mayor detalle la influencia de la
arginina y el glicerol en la biosntesis de AC, establecer la importancia del ciclo de la
urea en esta bacteria, conocer las enzimas y los genes en la va de biosntesis de AC, y
conocer que a partir de cido clavamnico (un intermediario en la va de sntesis de AC)
21
se producen tambin otras clavamas que se ha encontrado, tienen propiedades anti
fngicas y antibacteriales [9, 11].
Pocos trabajos con Sc se han orientado a la optimizacin del metabolismo para
identificar los efectos o las relaciones entre unos flujos metablicos respecto de otros y
as orientar los flujos hacia la va deseada, trabajos que se logran a travs del uso del
AFM [9,12]. Esto se puede explicar porque solo hasta hace pocos aos se han
confirmado ciertas reacciones de biosntesis para la produccin de AC [9,12] y tan slo
en el 2011 se obtuvo un modelo metablico a escala genmica de S. clavuligerus [13,
14]. Con esta nueva informacin es posible seguir realizando investigaciones que
permitan hacer inferencias importantes sobre el comportamiento de este
microorganismo, no slo en la produccin de una clavama como el AC, sino tambin en
la produccin de otras como alanilclavama y en la produccin de cefamicina
Existen pocos trabajos orientados al planteamiento de modelos matemticos que
describan el comportamiento cintico del Streptomyces [6, 15] y los que hay han sido
propuestos para cultivos en medios qumicamente definidos, estos modelos son de gran
importancia pues permiten analizar posibles fenmenos involucrados en el crecimiento
como inhibiciones, sustratos limitantes, importancia del consumo de sustrato para
mantenimiento celular, etc. As como emplearlos para predecir la produccin de
metabolitos y crecimiento celular a diferentes condiciones ambientales deseadas. Por lo
anterior, el planteamiento de modelos cinticos que ajusten a los resultados
experimentales permitir avanzar en el entendimiento del proceso tendiente a
incrementar la produccin de AC. En esta misma direccin, son relevantes los estudios
para evaluar el efecto de la limitacin de los nutrientes esenciales sobre el crecimiento
22
celular y la produccin de AC, sin embargo hay pocos estudios relacionados que
emplean la tcnica de AFM [16], tambin se han realizado trabajos analizando el efecto
de suplementar al medio de cultivo aminocidos, especialmente de la familia del
aspartato, analizando sus efectos mediante el uso de AFM [12], o empleando modelos de
caja negra [6, 17], pero no se ha determinado la incidencia que tiene el tipo de
aminocido sobre el metabolismo global y como un efecto combinado entre los
aminocidos y el metabolismo central del carbono sirve para detectar puntos crticos del
proceso.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en donde se indica que tanto las fuentes de C
y N y algunos aminocidos afectan significativamente la produccin de AC, se propone
como hiptesis de trabajo que es posible plantear un modelo matemtico que describa el
proceso de crecimiento y produccin de AC como funcin de algunos de estos factores
as como la posibilidad del empleo de las tcnicas de AFM para identificar los efectos de
estos mismos factores en el metabolismo celular que finalmente conduzcan a generar
efectos en la sntesis de AC.
Con base en la hiptesis planteada se propusieron los siguientes objetivos para
desarrollar en esta Tesis:
Objetivo General:
Evaluar y modelar la produccin del cido clavulnico (AC) por fermentacin de
Streptomyces clavuligerus (Sc) e identificar el efecto sobre el modelo metablico de Sc
de los principales factores que afectan la produccin de AC.
Objetivos especficos:
23
1) Identificar y modelar la cintica de fermentacin de Sc en un reactor de tanque
agitado a escala de laboratorio;
2) Establecer las posibles rutas bioqumicas en Sc para la produccin del AC, de
acuerdo con los reportes en la literatura.
3) Evaluar el comportamiento de flujos metablicos de la ruta bioqumica propuesta en
funcin de cambios en los flujos de algunos aminocidos y de las fuentes de C, N,
P, O
La presentacin de este trabajo de investigacin est estructurado en captulos, en los
cuales los dos primeros corresponden a aspectos tericos que permitieron la justificacin
de este trabajo y la orientacin del trabajo experimental para lograr los objetivos
propuestos. Los captulos 3, 4 y 5 corresponden al trabajo experimental realizado para
lograr los objetivos propuestos, mencionados anteriormente y estn estructurados en
formato de artculo, donde se incluye resumen, introduccin, resultados y discusin,
conclusiones y referencias empleadas. A continuacin se darn algunos aspectos que se
abordaran con mayor detalle en cada uno de los captulos:
En el captulo 1 se presenta un contexto del problema de la salud pblica causada por
enfermedades infecciosas generadas por microorganismos patgenos que tienden a
desarrollar resistencia a los antibiticos y cmo el AC ha entrado a jugar un papel
protagnico para contrarrestar dicha resistencia.
En el captulo 2 se presenta un marco terico general sobre los aspectos relacionados
con la produccin del AC, incluyendo las condiciones de crecimiento y mantenimiento
de Sc, as como las condiciones de produccin de AC incluyendo el modelado del
proceso. Sobre el modelado del proceso se tuvieron en cuenta los conceptos tericos de
24
dos tipos de modelado, uno cintico y otro metablico. Se presentan algunos modelos
de tipo cintico que se han aplicado para la produccin de antibiticos, entre los que se
encuentran modelos tipo Monod y Contois. Sobre el modelado metablico se presentan
los aspectos que se deben tener en cuenta para su concepcin hasta algunas de las
diferentes posibilidades de desarrollo matemtico que existen y se han aplicado a este
tipo de microorganismo.
En el captulo 3, se presentan los estudios de produccin de AC con diferentes medios
de cultivo: Medios complejos y medios qumicamente definidos. Tambin se propone un
modelo cintico y se evala su capacidad de ajuste a resultados experimentales,
permitiendo as la identificacin de algunas caractersticas del proceso con respecto al
crecimiento y a la produccin de AC.
En el captulo 4, Se evalu la distribucin de flujos metablicos de Sc. empleando un
modelo metablico reducido, de 60 reacciones con 47 metabolitos, a partir de datos
experimentales obtenidos en cultivos quimistato a dos tasas de dilucin. Este trabajo
permiti analizar la produccin de AC usando una cepa salvaje de Sc y diversas
estrategias de enriquecimiento de medios. Adicionalmente se estudi la distribucin de
flujos metablicos como resultado directo de la adicin de aminocidos y cambio de tasa
de dilucin, permitiendo hacer una descripcin cuantitativa del efecto de la variacin de
flujos metablicos individuales sobre la acumulacin de AC.
En el captulo 5 se estudi in silico el comportamiento de los flujos metablicos de Sc
para la produccin de AC en funcin de cambios en las condiciones nutricionales del
cultivo tales como consumo de fuente de carbono, nitrgeno, fsforo y oxgeno
empleando como funcin objetivo maximizacin del flujo de ATP. Para esto se emple
25
un modelo metablico ampliado de 100 reacciones con 91 metabolitos, en el cual la
reaccin de biosntesis de biomasa de Sc es ms detallada que la empleada en el
captulo cuarto, se consider un mayor nmero de aminocidos y macromolculas. .
Este trabajo permiti hacer una descripcin cuantitativa del efecto de la variacin de los
flujos de los nutrientes sobre la generacin de biomasa y la acumulacin de AC e
identificar los cambios en los flujos internos de mayor importancia.
26
BIBLIOGRAFIA
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27
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production and associated metabolic fluxes in Streptomyces clavuligerus, Biotechnology
Letters, vol. 22, pp. 180309, 2000.
53, no. 1, pp. 711, 2010.
28
CAPTULO 1.
SALUD PBLICA VS ENFERMEDADES INFECCIOSAS.
En 1928, el cientfico britnico Alexander Fleming observ los efectos antibiticos del
moho Penicillium notatum. El producto de este hongo aparentemente modesto mostr
ser tan eficaz para combatir infecciones anteriormente consideradas mortales, que
desencaden una revolucin sanitaria sin precedentes en los anales de las ciencias
mdicas. De esa primera muestra surgi toda una familia de antibiticos derivados de la
penicilina. Entre los antibiticos descubiertos posteriormente figuran las
estreptomicinas, tetraciclinas, quinolonas, antimicticos, antiparasitarios y, ms
recientemente, antivricos. Estos medicamentos, llamados colectivamente
antimicrobianos han evitado muchas muertes, han reducido tanto la morbilidad como
las enfermedades nosocomiales (intrahospitalarias) [1, 2].
Despus de la gran cantidad de descubrimientos efectuados entre 1930-1970, vinieron
unas dcadas donde han sido menos los hallazgos en la lucha contra las enfermedades
infecciones. La bsqueda de nuevas molculas que logren contrarrestar las enfermedades
infecciosas contina, y se han realizado grandes avances en el desarrollo y
mejoramiento de los procesos existentes para incrementar los rendimientos [1]. Los
antibiticos -lactmicos an siguen aportando en el mejoramiento de la calidad de vida,
dado que se contina investigando en el incremento en los rendimientos en los procesos
existentes como en el descubrimiento de nuevas molculas [3].
29
Las enfermedades infecciosas constituyen la tercera causa de muertes en el mundo, en
especial en los pases de bajos recursos econmicos. El mayor problema se tiene con la
malaria y la tuberculosis con unos ndices de mortalidad (nmero de muertos por cada
cien mil habitantes) de 12 y 15 respectivamente y los ndices de morbilidad fueron de
3000 y 128 por cada cien mil habitantes por ao, respectivamente [4, 5]. Para nios
menores de cinco aos, se tiene un ndice de mortalidad de 65 por cada mil nacidos
vivos. Amrica Latina se encuentra entre las regiones con ms alta incidencia de brotes
nosocomiales producidos por bacterias que presentan resistencia a mltiples antibiticos
[6]. Colombia como gran territorio tropical tiene per se una alta incidencia de
enfermedades infecciosas, siendo estas relevantes en todos los grupos de edad. Se tiene
proyectada para el quinquenio de 2010 a 2015 una mortalidad infantil en menores de
cinco aos de 12.5 por mil nacidos vivos [7].
La forma de contrarrestar una infeccin es mediante el uso del antibitico que se
clasifican de acuerdo con su funcin sobre la clula, ms que de acuerdo con su
estructura qumica. Un antibitico puede buscar la inhibicin de la sntesis de la pared
celular (-lactmicos, polipptidos o glucopptidos), de la sntesis de protenas
(macrlidos, lincosaminas, aminoglucsidos, tetraciclinas y anfenicoles), del
metabolismo bacteriano (sulfonamidas), la actividad o sntesis del cido nucleico
(aminoglucsidos, tetraciclinas, macrolidos, etc.) o alteracin en la permeabilidad de la
membrana celular [8, 9]. Sin embargo, las bacterias pueden generar mecanismos de
resistencia que las protegen contra la accin de los antibiticos [10]. Las infecciones
causadas por bacterias resistentes a los antibiticos -lactmicos son tratadas con
frecuencia con dos drogas: Una es la penicilina que inhibe la sntesis de la pared celular
de las bacterias patgenas y el otro es un inhibidor de las -lactamasas evitando as la

30
hidrlisis de la penicilina [8]. Hay tres inhibidores de -lactamasas de uso clnico AC,
Sulbatam y Tazobactam, el primero producido a partir de S. clavuligerus y los otros
obtenidos por sntesis qumica. En la tabla 1.1 se presenta las diferentes formulaciones
de estos inhibidores con alguna -lactamasa de uso comercial de acuerdo con la
indicacin mdica y el microorganismo susceptible de provocar la enfermedad [9, 11].
Las aplicaciones y usos de estos inhibidores y nombres comerciales cambian de acuerdo
con los pases y las regiones [8, 11], por ejemplo en varios pases Europeos, Japn e
India se utiliza ms Cefoperazone-Sulbatam, el cual no se comercializa en E.U. (Estados
Unidos) [11], . Dada la importancia de encontrar nuevas molculas activas que
contrarresten las enfermedades infecciosas, se estn realizando estudios para demostrar
la eficacia clnica de nuevos inhibidores como son penems, derivados de monobactamas
de penicilinas y cefalosporinas [11, 12].
1.1. LOS ANTIBIOTICOS -LACTMICOS
1.1.1. Generalidades.
Los antibiticos -lactmicos representan el grupo de antibiticos ms numeroso y de
mayor uso en la clnica. Su nombre se debe a la presencia de un anillo -lactmico en su
estructura conformado por un oxgeno en la posicin con respecto a un nitrgeno (ver
figura 1.1). De acuerdo con los radicales que se unen al anillo se derivan diversos
subgrupos, los cuales se mencionarn ms adelante. Pero antes se describir el
mecanismo general de cmo estos antibiticos logran destruir la bacteria infecciosa.
Las bacterias tienen una pared conformada en parte por peptiduglucano que tiene como
funcin la estabilidad osmtica y proteger la clula. Este compuesto no est presente en
31
Tabla 1.1. Formulaciones comerciales, prescripciones mdicas y microorganismos
susceptibles de provocar enfermedades infecciosas [11].
Formulacin Eficacia clnica demostrada
Nombre
-lactmico- Indicacin clnica para estos microorganismo
comercial /
inhibidor aprobada susceptibles de provocar
manufactura
-lactmico enfermedades
Amoxicilina- Augmentin / Otitis media S. pneumoniae, H. influenzae,
clavulanato GlaxoSmithKline Moraxella catarrhalis
Neumona, sinusitis H. influenzae,M. catarrhalis, K y S.
bacteriana pneumoniae, methicillin-
susceptible,S. aureus,
Infecciones en la piel S. aureus, E. coli, Klebsiella sp.

Infecciones en el tracto E. coli, Klebsiella spp.,
urinario Enterobacter sp
Ticarcilina- Timentin / Infecciones vas respiratorias S. aureus, H. influenzae,
clavulanato GlaxoSmithKline Klebsiella sp.
Infecciones seas y
articulares S. aureus
Infecciones en la piel
Infecciones en el tracto S. aureus, Klebsiella sp, E. coli
urinario E. coli, Klebsiella sp, P.
aeruginosa, Citrobacter sp,
Enterobacter cloacae, Serratia
Infecciones ginecolgicas marcescens, S. aureus
Infecciones intra-abdominales Prevotella melaninogenicus,
Enterobacter sp,
E. coli, K. pneumoniae, S. aureus,
S. epidermidis
E. coli, K. pneumoniae, B. fragilis

Ampicilina- Unasyn / Pfizer Infecciones en la piel S. aureus, E. coli, Klebsiella sp,P.
sulbactam mirabilis,
a B. fragilis, Enterobacter sp, A.
Infecciones intra-abdominales calcoaceticus
Infecciones ginecolgicas E. coli, Klebsiella sp., Bacteroides

sp, Enterobacter sp
E. coli, Bacteroides sp
Piperacilina- Zosyn / Wyeth Apendicitis E. coli, Bacteroides sp
tazobactam
Piel y tejidos blandos S. aureus
infecciones, incluyendo
infecciones del pie diabtico
Endometriosis posparto o E. coli,

inflamacin plvica
Neumona H. influenza
Nosocomiales S. aureus, A. baumannii, H.

(intrahospitalarias) influenzae, K. pneumoniae,
P. aeruginosab
32
los eucariotas. El petidoglucano est conformado por unidades glucosdica (N-acetilD-
glucosamina y N-acetil-cido murmico), las cuales se entrelazan por transglucosidasas.
Hay unas cadenas laterales pentapptidos unidas al N-acetil-cido murmico la cual es
entrelazada con otra molcula igual por la enzima transpeptidasa, PBP (penicillin-
binding-proteins) confirindole a la clula una pared protectora. El anillo -lactmico es
estricamente similar al pentapptido unido a N-acetil-cido murmico por lo que la
PBP lo asume como sustrato propio y lo integra en su sntesis de peptidoglucano, siendo
este proceso infructuoso evitando que se forme la pared celular y favoreciendo la lisis
osmtica [2, 8, 11].
1.1.2. Clasificacin de los antibiticos.

Los antibiticos de mayor importancia, incluyendo el AC que es inhibidor de -
lactamasas se muestran en la figura 1.1 y son:
a) Las penicilinas: Tienen como ncleo qumico el anillo 6-aminopenicilnico o ncleo
penam que consta a su vez de un anillo de tiazolidina (un anillo aminofenlico de los
tiazoles), enlazado a un anillo -lactmico y un grupo amino. Los compuestos difieren
entre s por la estructura de su cadena lateral unida al grupo amino, el cual le confiere
las propiedades farmacolgicas. Entre las penicilinas comerciales estn los productos
Penicilina G, Amoxicilina, Ampicilina, [9, 11].
b) Las cefalosporinas: (derivados del cido 7-aminocefalospornico): son
antimicrobianos similares a la penicilina en su estructura y modo de accin, poseen un
anillo de dihidrotiazina de seis tomos en lugar del anillo de tiazolina de cinco tomos
caracterstico de las penicilinas, enlazado a un anillo -lactmico y un grupo amino. Sin
33
O
O R1 C NH S
R C NH S CH3 1
2
1 7 6
6 5 2
CH3
8
7 4 3 N5 3
N O
O COOH 4 R2
HO O
penicilinas cefalosporinas
R2
R1 NH S OCH3
NH2 NH S
O N
O CH 2R COOH O N OCONH2
O
COOH
COOH
cefamicinas cefamicina C
R1
O .
R C NH
S-R
N
O
N
O SO3H C O
OH
monobactamas carbapenems
O
CH 2 OH
O
R
N N H
O O
R1
CO 2H
clavamas cido clavulnico
Figura 1.1. Estructura qumica de algunos antibiticos -lactmicos: La naturaleza de

los sustituyentes R es responsable de cambios en las propiedades qumicas y
biolgicas de las molculas.
34
embargo presentan ms resistencia a las -lactamasas y tienen un espectro de actividad
antibacterial ms amplio que las penicilinas, gracias al desarrollo de modificaciones
semisintticas de los radicales R1 y R2 [2, 13]. Entre los productos comerciales esta la
Cefalexina. Las cefamicinas son similares a las cefalosporinas, la nica diferencia es
que tienen un grupo metoxi en el cido 7-aminocefalospornico. Son producidas por
hongos productores de -lactamasa (Cephalosporium acremonium ), sin embargo se
han encontrado especies de Streptomyces (como clavuligerus) productoras tanto de
penicilinas como de cefalosporinas [2, 13]. Un producto comercial es la Cefamicina C,
con un anillo -lactmico, un anillo dihidrotiacnico, una cadena lateral de cido -
aminoadpico, un grupo metoxi en el carbono C-7, y un grupo carbamato en C-3.
c) Otros -lactmicos no convencionales son las monobactamas, carbapenems,
clavamas y nocardicinas. El principal mecanismo de accin de estos compuestos es la
inhibicin de la sntesis de la pared celular por lo que alteran la integridad de la
membrana citoplasmtica impidiendo la sntesis de protenas y la sntesis de los cidos
nucleicos. Las monobactamas son antibiticos -lactmicos mono cclicos que
interactan con las PBP induciendo la formacin de largas estructuras bacterianas
filamentosas. En caso de ser alrgico a la penicilina se usa una monobactama
[3,14].Clavamas es una familia de compuestos con una estructura bsica de anillos
similar al del cido clavulnico, pero son opuestos en su configuracin estereoqumica.
La clavamas diferentes al AC poseen estructura 3S, 5S por lo que carecen de actividad
inhibidora de -lactamasas, pero algunos poseen actividad anti fngica o antibacteriana.
Como modelo, la alanil-clavama posee actividad bacteriosttica frente a bacterias Gram-
positivas y Gram-negativas y frente a hongos, mediante la inhibicin de la enzima
homoserina transacetilasa, que participa en la biosntesis de metionina [3, 14].

35
Entre las calvamas, est el cido clavulnico, una molcula inhibidora de -lactamasas.
Se han realizado diversos estudios para determinar la eficacia clnica de varios
inhibidores de -lactamasas bacterianas (AC, sulbactam, tazobactam) donde se ha
demostrado que el AC tiene mayor efectividad sobre bacterias aerobias y anaerobias
[13-15].
1.2. RESISTENCIA MICROBIANA A LOS ANTIBITICOS.

El problema de resistencia de microorganismos Gram negativos a los antimicrobianos -
lactmicos se describe a partir de 1960, cuando aparecieron cepas de Escherichia coli
productoras de -lactamasas. Posteriormente tambin se describieron Klebsiella
pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, resistentes a -lactmicos
por produccin de -lactamasas[11, 16]. La resistencia a los antibiticos es un ejemplo
de como las bacterias desarrollan de forma natural nuevos fenotipos a travs de
combinaciones de mecanismos difciles de predecir y los cuales pueden estar
influenciados por el ambiente, el cual juega un papel importante en la seleccin y
mantenimiento de tales fenotipos [10, 14].
Los antibiticos son empleados para eliminar la capacidad de reproduccin
bacteriananas atacando partes especficas en su estructura. Sin embargo estas bacterias
pueden generar mecanismos que las protegen de la actividad de los antibiticos. Entre
los mecanismos de resistencia que han sido identificados se encuentran: i) La
produccin de enzimas principalmente en bacterias Gram negativas que destruyen el
antibitico, especialmente de la familia de -lactmicos y aminoglucsidos, ii) Cambios
en los sitios activos de las PBP que disminuyen la afinidad por los antibiticos -
lactmicos, esta informacin se pasa a travs de transformacin natural y recombinacin
36
de DNA con otros organismos confirindoles a las clulas resistencia. iii) El desarrollo
de protenas complejas capaces de bombear el antibitico hacia fuera de la clula, iv)
Modificaciones en la molcula de la clula que es objetivo del antibitico [10, 11].
Las de -lactamasas se clasifican en cuatro clases: A, B, C y D. Las pertenecientes a las
clases A, C y D poseen serina (SER) como el nuclefilo en un sitio activo, mientras que
en la de clase B un in metlico (Zn2+) es responsable de la inactivacin de las -
lactamasas. En Enterobacteriaceae (por ejemplo, en Escherichia coli y Klebsiella
pneumoniae) las -lactamasas ms frecuentes pertenecen a la clase A [19]. En la
actualidad la mayor parte de estudios estn orientados a entender el mecanismo de
accin de -lactamasas tipo A, donde algunas de ellas son inhibidas irreversiblemente
por AC, Sulbatam y Tazobactam [8, 11].
Las -lactamasas (E.C. 3.5.2.6) son enzimas bacterianas periplsmicas (hidrolasas) que
son producidas principalmente en bacterias del gnero Enterobacteriaceae y son
responsables de la resistencia que estas bacterias presentan frente a la penicilina,
cefalosporina y carbapenems. Las enzimas hidrolizan el anillo lactmico, el cual
inactiva las propiedades antibacteriales de la molcula. En la figura 1.2 se presenta de
forma esquemtica el mecanismo de reaccin de hidrlisis de un genrico de penicilina
denominado como antibitico activo (AA) con la enzima -lactamasa (E). Con la
reaccin horizontal se representa como la enzima -lactamasa reacciona con parte de la
estructura del antibitico denominada cido 6-aminopenicilnico, del cual se derivan las
penicilinas, desdoblando esta estructura (antibitico inactivo) y regenerndose la
enzima, esto se da en varias etapas que son mostradas en detalle en las referencias [11,
17]. Para evitar la destruccin del antibitico, este se aplica en combinacin con algn
inhibidor de las -lactamasas (I) (reaccin vertical en la figura 1.2), las -lactamasas
37
reaccionan con el anillo -lactmico de estos inhibidores formando el complejo EI de
forma covalente e irreversible, quedando disponible la penicilina para ser enlazada a la
PBP y provocar la destruccin de la clula por lisis osmtica [11, 17].
K1
Antibitico Activo Antibitico Inactivo
Enzima (E)
+
Inhibidor (I)
K2 >> K1
K2
Complejo EI
Figura 1. 2. .Diagrama esquemtico de una penicilina genrica, la hidrlisis

catalizada por -lactamasa (parte superior) e inhibidores de -lactamasa en la
parte inferior [17].
1.3. PRODUCCIN INDUSTRIAL DE -LACTMICOS
El desarrollo de diversas formulaciones requiere de una alta produccin industrial de AC
[15, 18, 19]. Los antibiticos generaron ventas por USD 42 mil millones en el mercado
global, en 2009. Aproximadamente el 50% de las ventas corresponden a productos -
lactmicos incluyendo penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, monobactamas, cido
clavulnico y carbapenems [3]. El AC obtuvo un crecimiento anual del 4% entre 2005 y
2010 [20],
Muchos -lactmicos de uso clnico son sintetizados qumicamente por procedimientos
costosos y generando con bajos rendimientos [3], Es por esto que para producir
antibiticos a gran escala se combinan procesos fermentativos mediante los cuales se
38
obtiene la molcula base que es sometida subsecuentemente a modificaciones
semisintticas, obtenindosen productos con adecuadas propiedades antimicrobianas y
farmacolgicas. Hoy en da, la fermentacin contina siendo el procedimiento ms
utilizado, empleando cepas mejoradas genticamente, logrando altos rendimientos a
costos moderados, en particular con penicilina [3]. Se pueden destacar las siguientes
molculas producidas a escala industrial:
Penicilinas: La Penicilina V y Penicilina G son las nicas penicilinas naturales de uso
clnico. Estas se obtienen a gran escala y con una alta titulacin (50 g L-1) por el cultivo
de Penicillium chrysogenum. Existen otras variaciones de penicilinas que se obtienen
por modificaciones semi sintticas [2, 3].
Cefalosporinas y cefamicinas: Todas las cefalosporinas comerciales de mayor difusin
como antibitico, son obtenidas mediante procesos semi sintticos. Desafortunadamente
el proceso de produccin es de bajo rendimiento y costoso. En la actualidad se obtienen
altos rendimientos de Cefalosporina C en cultivos del moho Acremonium chrysogenum
a gran escala con una alta titulacin (30 g L-1). Sin embargo, el compuesto presenta
problemas de estabilidad debido a su tendencia a degradarse durante la fermentacin [2,
21].
cido clavulnico: El proceso de produccin a partir de la bacteria Streptomyces
clavuligeus es de bajo rendimiento y de alto costo. La productividad del proceso,
depende de diversos factores, entre ellos tipo y concentracin de nutrientes, condiciones
de operacin de la fermentacin y mecanismos intracelulares de biosntesis. A pesar de
los esfuerzos de los investigadores que trabajan en el tema en el mundo, no se ha
alcanzado valores de produccin (ttulo) de AC superiores a 1 g L-1[18, 22]. El mayor
productor mundial de AC, GlaxoSmithKline, ha reportado titulaciones de 561 mg L-1

39
[23] y algunas empresas como Antibiticos S.A. indican que algunos mtodos de
purificacin requieren que la concentracin de AC en el medio de cultivo debe ser
mayor a 1 g L-1 para hacerlos ms eficientes [24],
40
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Mejorar la Extraccin de cido clavulnico, U.S. Patent 537, 158, 1984.
42
CAPITULO 2
METABOLISMO DE S. Clavuligerus
En los ltimos 20 aos, se han desarrollado unas estrategias de modelado del
metabolismo celular, con el objetivo de identificar a partir de un anlisis sistmico y
racional, los cuellos de botella en las rutas de biosntesis de metabolitos de inters.
Eliminar estas limitaciones permitira incrementar los rendimientos de productos as
como encontrar nuevos productos de inters. La aplicacin de estas estrategias mediante
el uso de tcnicas para el anlisis racional del metabolismo celular que facilite y oriente
las posteriores estrategias de manipulacin gentica con el objetivo de mejorar los
bioprocesos, se conoce como Ingeniera Metablica (IM). En la actualidad, la IM se
viene aplicando con acelerado crecimiento permitiendo entender mucho mejor los
procesos de biocatlisis orientados a maximizar el rendimiento y la productividad de
metabolitos de inters en campos, como Biotecnologa de alimentos, Biotecnologa
ambiental y, ms recientemente, Biotecnologa farmacutica [1, 2, 3]. En este ltimo
campo se han logrado obtener titulaciones ms altas de algunos -lactmicos y el
desarrollo de nuevos productos de inters farmacutico [3]. La metodologa incluye el
anlisis de la capacidad celular, anlisis de flujos metablicos, anlisis de control
metablico (MCA) y sntesis de sistemas e integracin de datos bioinformticos. Dentro
de los trabajos para el mejoramiento de la produccin de compuestos -lactmicos se
han empleado como modelos diversas especies del gnero Streptomyces. Existen pocos
43
trabajos en los cuales se ha aplicado IM para incrementar la titulacin de cido
clavulnico (AC), inhibidor de -lactamasas.
En este captulo se presenta una discusin sobre el metabolismo de S. calvuligerus que
permitir establecer el mapa o modelo metablico que se emplear ms adelante para
trabajos de anlisis de flujos metablicos (AFM) y anlisis de balance de flujos
metablicos (ABM).
2.1. BIOLOGIA DE Streptomyces sp.
2.1.1. Ciclo de Vida:
Los Estreptomicetos presentan un ciclo de vida complejo que implica procesos de
diferenciacin morfolgica y fisiolgica. Estas bacterias son capaces de colonizar
sustratos con restos de materia orgnica, formando una red de hifas ramificadas y
septadas que dan lugar al micelio sustrato. Estas hifas obtienen los nutrientes de la
degradacin del material orgnico insoluble gracias a sus numerosas enzimas
hidrolticas [4, 5, 6]. En una primera fase, las zonas ms alejadas de la fuente de
nutrientes empiezan a acumular sustancias de reserva (lpidos, glucgeno, etc.) hasta que
en un determinado momento, debido a la carencia de nutrientes reciben una serie de
seales en esta zona, que disparan la expresin de genes implicados en la formacin del
micelio areo. Se produce as, el desarrollo de hifas que emergen del micelio sustrato
para dar lugar al micelio areo. Estas hifas se nutren de los productos de degradacin
del micelio sustrato viejo, y en una segunda etapa sufren un proceso de curvatura,
enrollamiento, formacin de septos y engrosamiento de la pared celular para dar lugar a
una cadena de esporas uninucleares, que se liberan al medio y que con las condiciones
adecuadas, germinan y desarrollan un nuevo micelio sustrato [5, 6]

44
El inters cientfico en las bacterias del gnero Streptomyces radica fundamentalmente
en dos importantes caractersticas: i) Su rico metabolismo secundario y ii) La
diferenciacin morfolgica que acompaa al primero (i) y se basa en el desarrollo
secuencial de un micelio areo, hifas y finalmente esporas descritas ms adelante (ver
figura 2.1). Cuando una espora de Streptomyces se libera al medio ambiente y encuentra
las condiciones necesarias para su germinacin, se pone en marcha una compleja
maquinaria molecular capaz de llevar a cabo un control gentico temporal y espacial que
culmina con la formacin de varios tejidos: micelio substrato, micelio areo y ms
esporas, caractersticas morfolgicas y fisiolgicas similares a la de los hongos. Si bien
todas estas caractersticas asociadas a la bacteria Streptomyces son muy similares a la de
los organismos eucariotas multicelulares, las caractersticas celulares (tpica de
procariotas) y el mecanismo de reproduccin son muy diferentes. En la figura 2.1 se
presenta en forma grfica y sinttica el ciclo de vida de Streptomyces sp, y a
continuacin se presenta en mayor detalle la forma como se lleva a cabo la interaccin
micelio-sustrato [6, 7]:
Desarrollo del micelio sustrato: Cuando germina una espora unigenmica se forma un
tubo de germinacin mediante crecimiento apical de la pared celular. Posteriormente las
clulas empiezan a desarrollar ramificaciones laterales logrando estabilizar la tasa de
crecimiento comenzando la septacin [6, 7]. Las partes de micelio ms viejas
comienzan a septarse, formando zonas apicales y sub-apicales. En las sub-apicales a
pesar de que an hay sntesis de ADN, y se detiene el crecimiento de la pared celular
(en ocasiones, nuevas ramificaciones pueden aparecer en los compartimentos sub-
apicales, lo que lleva consigo la recuperacin de ciertas caractersticas de la regin
apical) [6]. Poco a poco el micelio sustrato se va expandiendo, la regin ms vieja se va

45
aglomerando y empiezan a ocurrir cambios en la colonia que llevarn a la creacin de
micelio areo.
(d)
(a)
(b)
(c)
Figura 2. 1. Ciclo de vida de Streptomyces sp. en medio slido. (a) Inicialmente un

micelio filamentoso coloniza su sustrato. (b) Tras un periodo de crecimiento asimilativo,
las hifas areas crecen hacia la atmsfera. (c) Posteriormente se septan (tabicacin).
Para (d) formar cadenas de esporas pigmentadas [3].
Desarrollo del micelio areo: Una vez desarrollado el aglomerado de hifas sobre el
sustrato, este se torna muy compacto en la zona central (y ancestral) donde ocurre un
agotamiento de las reservas de nutrientes y varios tipos de estrs fisiolgico comienzan a
ejercer presin selectiva sobre la expresin de determinados genes. El
acondicionamiento a estos fenmenos est probablemente mediado por el gen relA y
nucletidos polifosforilados como ppGpp [6, 8, 9]. Este fenmeno es conocido como
respuesta estricta y se basa en los siguientes mecanismos: i) El metabolismo primario se
46
vuelve ms lento; ii) comienza la induccin del metabolismo secundario (protenas
extracelulares, antibiticos, etc.); iii) hay un metabolismo acumulativo en la superficie
de la colonia; iv) comienza la lisis de ciertas regiones del micelio sustrato y se inicia el
crecimiento areo [6, 10].
Existe una muerte celular programada en la interaccin micelio sustrato por la cual la
sntesis de diversas enzimas extracelulares permite a la colonia degradar el micelio
sustrato muerto as como otra materia orgnica remanente en el medio. La acumulacin
de los nutrientes en la superficie de la colonia, permite el crecimiento de las hifas
areas de una forma saprofita (se alimentan de los segmentos an viables del micelio
sustrato) y posteriormente forman esporas para colonizar nuevas reas y la sntesis de
los compuestos biocidas del metabolismo secundario. Estos dos mecanismos otorgan
una importante ventaja a la bacteria a la hora de dominar su nicho [10].
La morfologa de Estreptomicetos en medio lquido no ha sido muy estudiada por
considerar que bajo estas condiciones no hay esporulacin y por ende diferenciacin
morfolgica [10]. Al crecer el microorganismo en medio lquido, el ciclo de vida
descrito anteriormente no se observa normalmente. Dependiendo del tipo de agitacin,
componentes del medio de cultivo pueden formar agregados miceliares sencillos o en
tipo de pelet, el tamao y la forma de stos son relativos a la especie. En medio de
cultivo qumicamente definido se tiene un crecimiento ms disperso que el presentado
en medio de cultivo complejo con hidrolizados de harina soja. En este tipo de cultivos,
algunos componentes del medio, como el anti-espumante, almidn o agar a bajas
concentraciones pueden favorecer la dispersin del microorganismo, lo cual es bueno
para minimizar algunos problemas de transferencia de O2 y de nutrientes que se pueden
presentar. Sin embargo, el crecimiento disperso es frecuentemente acompaado por una

47
inhibicin de metabolismo secundario. Indicando esto una relacin entre la morfologa y
la diferenciacin fisiolgica y la existencia de alguna seal involucrada en ambos
procesos de diferenciacin [10].
2.1.2. Clasificacin del microrganismo en estudio:
Hay aproximadamente 1017 especies de Streptomyces, de las cuales unas 100 son de
inters para la industria farmacutica. Una clasificacin de esta especie se basa en sus
caractersticas morfolgicas, nutricionales y fisiolgicas (ver la figura 2.2). Los
estreptomicetos antifngicos son el ms grande gnero de produccin de antibiticos, el
cual produce antibacteriales y anti fngicos, y un amplio rango de compuestos
bioactivos tales como immunosupresantes [7, 11, 12].
Dominio: Bacteria
Phylum: Actinobacteria
Clase I: Actinobacteria
Subclase V: Actinobacteridae
Orden I: Actinomycetales
Suborden
XIV:Streptomycineae
Familia I:
Streptomycetaceae
Genero I: Streptomyces
Figura 2.2. Presentacin jerrquica de la taxonoma de la bacteria Streptomyces [11].
Streptomyces clavuligerus fue originalmente aislada de una muestra de suelo de Amrica
del Sur, y se emple inicialmente como productora de cefalosporinas. El nombre
clavuligerus se debe a la forma de bastn de las ramificaciones cortas que dan lugar a las
cadenas de esporas (del Latn clavula, pequeos bastones, e -igerus, que lleva). S.
48
clavuligerus est clasificado dentro de la Serie Gris de la Categora IV del gnero
Streptomyces, con base en el color verde-grisceo oscuro de las esporas maduras [11].
2.1.3. Generalidades de algunos Estreptomicetos:
Los Actinomicetos del gnero Streptomyces son los principales productores de
compuestos bioactivos para la industria biotecnolgica [4, 5]. Son fuente de antibiticos
y biocompuestos de aplicacin contra diversas enfermedades incluyendo el cncer, as
como una amplia variedad de sustancias qumicas inhibidoras de diversos procesos
celulares, como fungicidas, citostticos, moduladores de la respuesta inmune y efectores
para el crecimiento de plantas [5, 10].
Los Estreptomicetos estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, siendo el suelo su
hbitat ms comn, aunque tambin se han hallado en lechos marinos [4, 12]. Estn
actualmente clasificados como bacterias debido a que poseen una pared celular con
caractersticas bioqumicas que se asemejan ms a las de bacterias que a los de hongos.
Su similitud con estos reside en su morfologa filamentosa (figura 2.3), pero se
diferencian notablemente por el reducido dimetro de su filamento vegetativo. Presentan
otras caractersticas tpicas de procariotas tales como la carencia de ncleo definido,
mitocondrias y cloroplastos [4]. Los Estreptomicetos son bacterias aerobias, Gram
positivas y con un elevado contenido de guanidina y citosina (G + C) en el DNA de 69-
78 % mol.
Las bacterias del gnero Streptomyces son productoras de ms de la mitad de los
antibiticos conocidos. Tambin son productoras de gran cantidad de enzimas
extracelulares de inters en el sector industrial, entre las que destacan: proteasas,
celulasas, nucleasas, amilasas, lipasas, quitinasas y xilanasas [4].
49
Figura 2. 3. Morfologa macroscpica de colonias de Streptomyces coelicolor
(www.ecured.cu/index.php/Actinomiceto, junio 2013)
.
Los Estreptomicetos ms ampliamente estudiados son: S. grieseus, la primera especie
utilizada para la produccin comercial de antibiticos (estreptomicina) y S. coelicolor,
que es la cepa ms ampliamente usada en los laboratorios de investigacin. Los genomas
de estas dos especies han sido secuenciados, encontrando cromosomas lineales (8-10
Mb) que contienen ms de 7000 genes, entre los cuales el 45% es comn entre si [5].
Las redes metablicas de estos microorganismos han servido de base para el
secuenciamiento de S. clavuligerus, del cual se cuenta ya con un 100% del genoma [13].
Streptomyces clavuligerus (Sc) produce un nmero de compuestos -lactmicos,
incluyendo cefamicina C, cido clavulnico (AC) y al menos otros cuatro metabolitos
de la familia de las clavamas cuyas rutas de biosntesis son an desconocidas [14]. El
AC y las clavamas difieren de la cefamicina C, por presentar un ncleo bicclico que
contiene un tomo de oxgeno en lugar de un tomo de azufre, como ocurre en los
antibiticos ms convencionales del tipo de la cefamicina [15]. De las clavamas,
solamente el cido clavulnico (AC) posee actividad inhibitoria de -lactamasa por su
50
estereoqumica 3R, 5R, que le permite unirse a la enzimas PBP (protenas enlazadoras
de penicilina) y a las -lactamasas [6, 16].
2.1.4. Metabolitos secundarios producidos por Estreptomicetos:

Los actinomicetos producen alrededor de 61% de todos los metabolitos secundarios
conocidos, de los cuales el 70-80% son producidos por especies de Streptomyces sp [11].
Los metabolitos secundarios son compuestos no esenciales para el crecimiento ni
supervivencia del microrganismo, presentan una diversidad de estructuras qumicas
complejas, y en su mayora son producidos en la fase de desaceleracin de crecimiento
en cultivo sumergido en lote. La mayora de los metabolitos secundarios tienen actividad
antibitica. Adems de antibiticos, entre los metabolitos secundarios producidos por
Streptomyces se cuentan siderforos, antitumorales, factores de crecimiento en plantas,
herbicidas e inmunosupresores [10-12]
Se ha propuesto que la produccin de antibiticos est sujeta a una red compleja de
interacciones entre pequeas molculas, protenas regulatorias y promotores de genes.
Estas molculas reflejan el estado fisiolgico y nutricional de la clula y sirven como
seal para la expresin de genes involucrados en la biosntesis de los antibiticos. Al
presente se conoce poco acerca de esta red compleja, la cual puede ser general o
especfica para cada especie productora de antibiticos. La gentica de produccin de
antibiticos en general, y la de S. clavuligerus en particular ha sido muy investigada
debido a su importancia farmacutica y comercial [11,16].
2.2. CARACTERSTICAS METABLICAS DE Streptomyces

El metabolismo primario involucra reacciones catablicas y anablicas que resultan en
un incremento en la biomasa; las reacciones de aprovechamiento de energa y poder
51
reductor son empleadas en la sntesis de los componentes macromoleculares de la clula
(protenas, cidos nucleicos, lpidos y polisacridos). El metabolismo secundario resulta
en la sntesis de metabolitos que no tienen una funcin aparente en el metabolismo. Los
miembros del gnero Streptomyces se han estudiado a profundidad para entender como
opera el metabolismo secundario, dada su importancia biotecnolgica [5,10].
El metabolismo secundario es frecuentemente relacionado con el primario por el uso de
cofactores necesarios para la biosntesis (aminocidos o cofactores energticos), as
como por el uso de ciertos metabolitos del MCC (piruvato, acetil CoA, oxaloacetato,
alfacetoglutarato, entre otros). Para lograr mejorar los procesos de produccin de
metabolitos secundarios es necesario tener un conocimiento del metabolismo global
celular; consistente en conocer qu cambios (metablicos y genticos) en el
metabolismo secundario estn relacionados con cambios en el metabolismo primario
[6, 17-18]. Si bien existen trabajos de investigacin que profundizan en el metabolismo
primario y secundario para la produccin de antibiticos [19-20, 22], hay pocos trabajos
orientados a conocer estas relaciones mencionadas del metabolismo [6, 18, 23-25].
A continuacin se presentan algunos aspectos de cada una de las vas catablicas y
anablicas en cuanto a su interaccin para aportar precursores y energa al crecimiento y
a la biosntesis de antibiticos. En la figura 2. 4 se presentan de forma resumida el
aporte de algunos metabolitos generados en el MCC (metabolismo primario) para la
generacin de antibiticos (metabolismo secundario). Algunos aspectos caractersticos
del metabolismo encontrados en otras especies de Streptomyces se tienen en cuenta
para plantear el mapa metablico de S. clavuligerus [17]
52
Azucares
PEPTIDOS
cidos NUCLEOSIDOS
AMINOGLUCOSIDOS nucleicos
PP
Aminocidos
Triosa Shikmico GLICOPEPTIDOS
aromticos
Piruvato POLIPPTIDOS
Acetil-CoA Aminocidos
POLICTIDOS
alifticos
lactamas
Krebs
Figura 2.4. Esquema simplificado de requerimiento de precursores para la biosntesis

de antibiticos. Figura adaptada [17]
2.2.1. Requerimientos de energa.
Los requerimientos de energa pueden ser categorizados en tres grupos. El primer grupo
involucra los requerimientos energticos para la biosntesis de precursores de
macromolculas dentro de la clula, en trminos del consumo de ATP en bioreacciones
y la energa de polimerizacin necesaria para la biosntesis de macromolculas. Esta
cantidad es una funcin lineal de la velocidad especfica de crecimiento, asumiendo que
la composicin celular es constante se denomina requerimiento de energa para
crecimiento. El segundo grupo involucra la energa para formacin y secrecin de
productos que no son dependientes del crecimiento. En este caso la energa requerida
depende de la formacin del producto especfico y de los productos de secrecin. El
tercer grupo incluye la energa de mantenimiento requerida para reparar daos celulares
y controlar la presin osmtica y la movilidad de las clulas. La energa de
mantenimiento requerida puede depender de la concentracin y de la composicin de los
53
nutrientes del medio y as es un factor importante cuando se habla de un medio limitado
[25].
2.2.2. Sntesis de biomasa

En ausencia de informacin con miras a los requerimientos de precursores para la
acumulacin de biomasa en Streptomyces sp, la ecuacin estequiomtrica para la sntesis
de biomasa en E. coli ha sido empleada como modelo para anlisis de flujo metablico
de S. coelicolor [25] y de S. lividans [26] y en otros actinomicetos. Para S. clavuligerus
se cuenta con un estudio detallado de la composicin celular, tanto de sus
macromolculas como de su composicin elemental [27].
2.2.3. Ruta de Gluconeognesis.

Muchos actinomicetos tienen la capacidad de crecer en glicerol como fuente de carbono,
como es el caso de Streptomyces sp. y pueden convertir fructosa 1-6 bisfosfato a
fructosa 6-fosfato, pero lo hacen de forma inusual (lo comn es que la reaccin se de por
la accin de la enzima fructosa 1-6 bisfosfatasa). Se ha propuesto en varios trabajos que
esta reaccin se da por la accin de la enzima fosfofructokinasa dependiente de
pirofosfato [28]. Esta va incluye todas las reacciones que van de fructosa 6 fosfato a
piruvato [27]. Intermediarios de esta va forman aminocidos como serina, glicina,
cistena, triptfano, tirosina, fenilalanina, valina, alanina, leucina y precursores de
biomasa.
2.2.4. Ruta de las pentosas fosfato.
Esta ruta tiene como funcin producir equivalentes de reduccin en forma de NADPH y
precursores para biomasa. Debido a que el NADPH es necesario para el crecimiento, es
54
lgico que la actividad de la ruta sea ms importante en la fase de crecimiento que en la
formacin de productos para metabolitos secundarios. Los flujos en esta ruta varan
entre 25 y 40% del flujo de carbono, excepto para cultivos de bajas velocidad de
crecimiento [29]. Varios estudios sugieren un importante rol para la ruta de las pentosas
fosfato (PP) en la produccin de antibiticos de Streptomyces [19, 25].
En el metabolismo central del carbono, el NADPH es regenerado de NADP+
principalmente a travs de la ruta oxidativa de PP. En esta ruta, dos unidades de
NADPH son generadas por cada unidad de glucosa-6-fosfato por la accin de la enzima
glucosa-6-fosfato dehidrogenasa y 6-fosfoglucanato dehidrogenasa. En algunas
especies, esta ltima enzima requiere NAD+ en lugar de NADP+ como cofactor [17, 30].
El NADPH es tambin regenerado por isocitrato dehidrogenasa en el ciclo de Krebs.
Algunos polictidos y compuestos -lactmicos requieren un incremento en el flujo de
NADPH para su biosntesis [17].
2.2.5. El ciclo de Krebs (ciclo de los cidos tricarboxlicos).

El ciclo de Krebs, conocido como el ciclo de los cidos tricarboxlicos o ciclo del cido
ctrico tiene funcin anfiblica (participar en reacciones catablicas y anablicas), este
ciclo es fundamental en todos los microorganismo aerobios. Este sirve de medio para
enlazar las rutas metablicas encargadas de la degradacin de los carbohidratos, las
grasas y las protenas, mediante la transformacin de metabolitos empleando un
complejo enzimtico en gas carbnico y agua con formacin de energa qumica. En
este ciclo se generan muchas molculas que sirven como precursores en la biosntesis de
aminocidos y de antibiticos. Este complejo enzimtico est ubicado en la mitocondria
55
en el caso de microorganismos eucariotas y en el citoplasma para microorganismos
procariotas [17, 22].
Este ciclo tiene como funcin generar precursores de energa en forma de NADH y
NADPH. Para todos los organismos se ha encontrado que la enzima citrato sintasa es la
puerta de entrada al ciclo de Krebs (cataliza la condensacin de ACCOA y OAA en
citrato). Algunos Streptomyces como coelicolor e hygroscopicus han presentado como
funcional la enzima de la ruta anaplertica del ciclo del glioxilato en el ciclo de Krebs.
Sin embargo la actividad para esta enzima no fue detectada en otros Streptomyces como
lividans y aureofaciens. Estas especies presentan escaso crecimiento en acetato, por lo
esta va en el ciclo de Krebs no se considera activa [30]. En este ciclo se producen
precursores de aminocidos glutamato y aspartato y productos de biosntesis de los
aminocidos fenilalanina, tirosina, isoleucina, leucina, triptfano, isoleucina, metionina,
treonina, valina, adems se produce uno de los precursores directos (alfacetoglutarato)
y uno de los subproductos (succnico) de la biosntesis de AC. El alfacetoglutarato es
precursor de biomasa tambin [27, 32].
2.2.6. Ciclo de la urea.

El ciclo de la urea conocido como tambin como ciclo de la ornitina tiene lugar por lo
general en mamferos y se presenta de forma inusual en bacterias, su funcin principal es
la de expulsar urea y sustancias txicas del organismo producto de la sntesis y
degradacin de protenas enzimticas especficas. Los mamferos en la dieta de protenas
para satisfacer sus requerimientos de fuente de carbono y energa, emplean los
aminocidos como fuente de energa, liberando grupos aminos que son excretados en
forma de urea. Al modificar diferentes contenidos proteicos en la dieta de un mamfero,
56
se encontr que el complejo enzimtico que hace parte del ciclo de la urea se vio
afectado ms por la modificacin del contenido en la dieta que por cambios en las
actividades de las enzimas ( uso de inhibidores o alteraciones en la estructura molecular
de las enzimas). Se propuso que el fenmeno observado era anlogo al presentado en
algunas bacterias por alteraciones en la fuente de energa o de nitrgeno [33], este
efecto se ha presentado en S. clavuligerus [34]. Este ciclo involucra cinco enzimas:
carbamoil fosfato sintasa, ornitina transcarboxilasa, arginino succinato sintetasa, enzima
arginino succinato clivaja y arginasa [33]. Por la presencia de arginasa [35] y la fuerte
interrelacin entre arginina y ornitina como precursores de AC en S. clavuligerus,
muestran la presencia de este ciclo [35, 36]. Es importante resaltar adems la relacin
entre el ciclo de la urea y el ciclo de Krebs al emplear aspartato como precursor y
generar fumarato. El fumarato generado del ciclo de la urea a su vez puede
transformarse enzimticamente en malato y posteriormente en oxaloacetato, siendo
todos estos precursores en el ciclo de Krebs.
2.2.7. Biosntesis de aminocidos:

Los aminocidos son los bloques de construccin de protenas y sirven como
precursores directos en la biosntesis de muchos antibiticos [22]. Un -aminocido
est constituido por un tomo de carbono central, que corresponde al carbono , ste
est unido a un grupo amino, un grupo de cido carboxlico, un tomo de hidrgeno y a
un grupo R. Este grupo R corresponde a la cadena lateral del aminocido y es el que
confiere caractersticas a la molcula como tamao, carga, capacidad de enlace de
hidrgeno, carcter hidroflico y reactividad qumica. Todas las especies (bacterias,
hongos, etc.) estn construidas de al menos veinte aminocidos proteicos, aquellos
57
codificados en el genoma (alanina, arginina, asparagina, aspartato, cistena, fenilalanina,
glicina, glutamato, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina,
serina, tirosina, treonina, triptfano y valina). La ornitina es un aminocido de tipo no
proteicos [37]. Los aminocidos considerados en estas discusiones estn involucrados
en la relacin estequiomtrica de biomasa y en la sntesis de producto, los cuales
corresponden a metabolitos intermediarios. La ruta de biosntesis de aminocidos en
Streptomyces es muy similar a la presente en otras bacterias [22, 27, 31]. A continuacin
se presentarn algunos detalles del catabolismo y anabolismo de aminocidos agrupados
por familias, teniendo en cuenta su precursor en el MCC.
Aminocidos de la familia de fosfoenol piruvato.
Incluye los aminocidos aromticos fenilalanina (PHE), tirosina (TYR) y triptfano
(TRP). Para PHE el sustituyente R es un grupo fenilo, para TYR el R es un grupo
hidroxifenilo, lo que lo hace menos hidrofbico y ms reactivo, y para TRP el R es un
grupo indol [37]. Estos aminocidos aromticos se usan como fuente de nitrgeno para
la produccin de antibiticos. Existen reportes de vas catablicas para PHE y TYR en
varios organismos, incluyendo varias especies de Streptomyces [22, 38, 39], por
ejemplo, S. setonii presenta la enzima homogentisata y es capaz de catabolizar todos los
aminocidos de esta familia[38]. El TRP es un precursor importante para la biosntesis
de varios metabolitos secundarios, como es la biosntesis de actinomicina D a partir de
S. parvulus (A12) [40].
Aminocidos de la familia del glutamato.
Corresponde a esta familia los aminocidos, cido glutmico (GLU) y su amida
glutamina (GLN), histidina (HIS), prolina (PRO), ornitina (ORN) y arginina (ARG).
58
Los aminocidos de esta familia se ven favorecidos por el flujo de aKG en el ciclo de
Krebs El GLU es uno de los aminocidos ms importantes para la regulacin de
asimilacin de nitrgeno junto con lisina, metionina y valina [40].
El GLU tiene como R una cadena lineal acdica (cido carboxlico) y la GLN tiene
como R una carboxamida [37]. Estos dos aminocidos son casos especiales en los
Estreptomicetos, as como otras bacterias, pues representan la principal ruta de
asimilacin de nitrgeno. El GLU dona el amonio a muchos aminocidos, mientras la
GLN suministra el grupo amino a HIS, TRP y asparagina (ASN). La glutamina es
tambin un donor de amonio para compuestos tales como pirimidinas y purinas [40].
La histidina tiene el grupo R un imidazol cargado positivamente, hace parte de los
aminocidos bsicos junto con la lisina y la arginina, con un pKa cercano a 6 [37]. El
metabolismo de HIS se ha estudiado ampliamente en muchas bacterias, como son S.
coelicolor [41, 42] y S. clavuligerus [43]. ste induce las enzimas de su biosntesis,
siendo el urocanato y otros metabolitos intermediarios (GLU y aKG) inductores
fisiolgicos [43].
La PRO es el nico aminocido proteinognico que tiene la -amina como una amina
secundaria en lugar de una amina primaria: Este aminocido se conoce como un
iminocido por poseer, como grupo R, una cadena lateral cclica compuesta por 3
unidades de metileno; los cuales estn unidos al carbono alfa y al grupo amino [44]. Este
iminocido sirve como fuente de C y de N para la produccin de antibiticos [40]. Por
ejemplo al utilizarlo como fuente de N para la produccin de cefalosporina de Sc [45],
y para la produccin del antibitico undecilprodigiosin a partir de S. lividans (es uno de
los precursores directos de la biosntesis) [26, 40]
59
La ARG es un importante precursor de varios metablicos secundarios, como son
estreptomicina, sinefungin, cido clavulnico y azomicina [21]. Las etapas de inicio de
la biosntesis de dan desde glutamato y comparte parte de la va con la biosntesis de
prolina. Las enzimas involucradas en la biosntesis son N-acetil glutamato kinasa,
ornitina N-carbamoil transferasa (OCTasa), arginino succinato sintasa, N-acetil
transferasa cclica y N-acetil ornitinasa [21, 46]. Los aminocidos ORN y arginina
(ARG) se han empleado como fuente de nitrgeno para la produccin de AC,
obtenindose buena titulacin en ambos casos [21, 34, 35]. La ARG es el precursor
directo de la biosntesis de AC y se produce en el ciclo de la urea, con ORN como
metabolito inductor del ciclo [21]. Al comparar la titulacin de AC en cultivos
empleando medio complejo (por ej. fuente de nitrgeno harina de soja) con y sin
adicin de aminocido (ARG u ORN) se encontr que la ORN ms ms que la ARG
favorece la biosntesis de AC [34, 35]. Existen reportes del mejoramiento de la titulacin
de AC al adicionar ARG al medio [24, 47]. En ambos casos los aumentos no se dan de
forma directa con el incremento de la disponibilidad del aminocido en medio, lo cual
evidencia un posible efecto de inhibicin en una de las enzimas en esta va catablica
de ARG. Tambin se puede decir que los aminocidos que estn presentes en el medio
complejo tienen un efecto positivo en el metabolismo global, aun no descrito.
Aminocidos de la familia del aspartato.
Los aminocidos pertenecientes a esta familia son cido asprtico (ASP) y su amida
asparagina (ASN), los aminocidos bsicos ARG, lisina (LYS), el aminocido azufrado
metionina (MET), el aminocido hidroxilado treonina (THR) y su derivado isoleucina
(ILE).
60
Algunos medios de cultivo definidos han empleado ASN como fuente de nitrgeno
para producir cefalosporina a partir de Sc, en donde obtuvieron que las fuentes de
nitrgeno ASN y GLN comparadas con ARG y amonio son ms favorables para la
biosntesis del antibitico [48], tambin se ha empleado en la produccin de cefamicina
y AC [46] y para produccin de AC solamente [49]
Al emplear medios de cultivos complejos y qumicamente definidos en los cuales se
hace adicin de aminocidos de esta familia tanto de forma individual [24, 47, 50-51]
como varios a la vez [47], se encontr que los resultados acerca del efecto del
aminocido en la biosntesis difiere con el tipo de medio de cultivo, cuando se emple
por ejemplo adicionar THR en el medio complejo produjo un incremento en la
titulacin de AC [51], mientras que en el definido no hubo incremento de AC
comparado con el medio sin adicin de aminocido [47]. Y al adicionar varios
aminocidos de esta familia juntos en el medio definido, si hubo incremento de la
titulacin de AC con respecto al medio sin la adicin de aminocidos [47]. Al comparar
estos efectos de adicin de aminocidos sobre la titulacin, se sugiere que hay un efecto
sinrgico entre los aminocidos y el metabolismo global que favorece la biosntesis de
AC y que pueden estar relacionados con la regulacin que debe ejercer el N en el
metabolismo secundario.
El aminocido LYS es precursor de una gran cantidad de metabolitos secundarios de
inters industrial como penicilinas y Cefamicina C. Las clulas pueden asimilarlo
como fuente de C o N. La biosntesis de LYS se puede dar por la va aminoadipato, la
cual no usa ASP como intermediario o por va diaminopimelato que si lo incluye [22,
52]. Es importante tener un control sobre la concentracin de LYS en el medio de
61
cultivo, ya que se da inhibicin por retroalimentacin de este aminocido sobre las
enzimas especficas de la biosntesis (homocitrato sintasa). La LYS es un inhibidor de la
sntesis de penicilina en P. chrysogenum [40] y ejerce un efecto positivo en Sc para la
produccin de cefamicina [52], mas no para la produccin de AC [53].
La metionina junto con LYS, GLU y VAL son los aminocidos ms importantes desde
un punto vista de regulacin de la fuente de N en la produccin de -lactmicos, ejerce
una estimulacin en la produccin de penicilina N y cefalosporina [40].
Aminocidos de la familia del piruvato.
Corresponden a los aminocidos alifticos valina (VAL), alanina (ALA) y leucina
(LEU).
La VAL es uno de los aminocidos ms importantes desde el punto de vista de
regulacin [40]. Al alimentar un aminocido sea VAL o LEU en un cultivo en continuo
empleando un medio definido para produccin de AC a partir de Sc., mostr que se
produce un aumento en la titulacin de AC con respecto al control sin aminocidos, este
aumento fue del 77% al compararse con un medio al cual se aliment ARG [50], se nota
entonces un efecto de regulacin de estos aminocidos en la biosntesis de AC, a pesar
de no ser precursores directos como lo es la ARG [50]. La valina es necesaria en altas
cantidades como precursor de penicilina y cefalosporina [40].
Familia de la serina
Comprende serina (SER) que es un aminocido hidroxilado y sus aminocidos derivados
glicina (GLY) y Cistena (CYS). La GLY es un aminocido aliftico y CYS es un
aminocido azufrado.
La SER produce GLY a travs de la transferencia de un grupo hidroximetil a
tetrahidrofolato. La SER a su vez provee una fraccin significante del carbono

62
necesario para la biosntesis de purina , timina, metionina e histidina y otra parte de
carbono se incorpora directamente para triptfano y fosfolpidos; la GLY provee el
carbn para compuestos de purinas y los que contienen grupos homo. Las biosntesis de
estas reacciones hacen que haya un brazo de bifurcacin apreciable en la va glicoltica
a travs del metabolito 3-fosfoglicerato (3PG) [54].
La SER no es adecuada como fuente de nitrgeno, y se ha observado toxicidad en
algunos Estreptomicetos a este aminocido. Posiblemente este aminocido reprime o
inhibe una o varias enzimas necesarias para la biosntesis de metionina (MET) y GLY
[20], pero resulta favorable como fuente de N para la produccin de AC a partir de Sc
[50]. El alimentar SER en un cultivo en continuo empleando un medio definido para
produccin de AC, produjo un incremento del 77% en la titulacin de AC con respecto
a un cultivo control (sin aminocido) y con respecto a otro que se aliment ARG [50],
se nota entonces un efecto de regulacin de este aminocido en la biosntesis de AC, a
pesar de no ser precursor directo como lo es la ARG.
2.2.8 Biosntesis del cido clavulnico y otras clavamas
Las reacciones que dan origen a la sntesis de AC involucran los metabolitos GAP,
ARG, aKG, NADPH, O2 y ATP como sustratos y urea, CO2, NH4, SUC y AC, como
productos [27, 32]. En la Figura 2.5 se describe cada una de las etapas llevadas a cabo
en la ruta especfica de biosntesis de AC, incluyendo la bifurcacin de cido
clavamnico hacia otras clavamas. A continuacin se detallan los compuestos y las
enzimas involucradas en cada una de las etapas de biosntesis de AC.
Etapa 1. Involucra la condensacin de gliceraldehdo 3-fosfato (GAP) (abreviado como
como C-3) y arginina (ARG) (abreviado como C-5) para producir N2-(2-carboxietil)
63
arginina (CEA) mediante la accin de la enzima carboxietil arginina sintasa (Ceas), la
cual requiere tiamina, pirofosfato y Mg2+ para su actividad. El gen que codifica esta
enzima se describe con diferentes nombres pyc, orf2 o ceaS [16, 55].
Etapa 2. La enzima -lactama sintetasa (-LS) dependiente de ATP/Mg2+, cierra el
anillo -lactmico de CEA para dar lugar al cido deoxiguanidino-proclavamnico
(DGPC). La -LS es codificada por el gen bls [56].
Etapa 3. El DGPC sufre una hidroxilacin mediada por la enzima clavaminato sintasa
(CAS) para producir cido guanidinoproclavamnico (GPC). La enzima CAS es una
dioxigenasa intermolecular que requiere alfa-cetoglutarato (aKG), O2 y Fe (II) para
llevar a cabo la catlisis, y entre otros, genera los siguientes productos: cido succnico,
CO2 y agua. Esta enzima cataliza tres reacciones oxidativas no consecutivas en la ruta
[57- 58].
Etapa 4. La enzima proclavaminato amidinohidrolasa (PAH) hidroliza el residuo
guandico del GPC para formar cido proclavamnico (APC), en presencia de agua y
Mg2+, en esta reaccin se libera adems urea. Esta enzima es codificada por el gen pah.
La reaccin llevada a cabo por PAH es esencial para permitir a CAS la catlisis de la
ciclizacin del cido proclavamnico para formar el anillo oxazolidnico [56].
Etapa 5. El APC es transformado a cido dihidroxiclavamnico (DHC) por la presencia
de la enzima CAS (segunda etapa de CAS, ciclacin oxidativa) [57- 58].
Etapa 6. El DHC es transformado a cido clavamnico (ACM), reaccin de la
desaturacin de CAS. Este es el ltimo intermediario comn entre el AC y otras
clavamas [23, 59].
64
Etapa 1. OH
2- NH
O OPO3
CEAS (orf2) NH
GAP HOOC
NH NH2
NH II
TnP2/Mg
H2N COOH
NH NH2
COOH ARG CEA ( N2-(2-carboxietil) arginina
Etapa 2.
NH
NH
NH BLS (orf3)
NH NH2 N
HOOC II NH NH2
O
ATP/Mg
COOH
.
COOH
CEA (N2-(2-carboxietil) arginina) DGPC (cido de-oxiguanidinoproclavamnico)
Etapa 3.
II
NH Fe /O2 OH NH
C N aKG N
O NH NH2 O NH NH2
-
COOH CAS (orf 5) COOH
DGPC (cido de-oxiguanidinoproclavamnico) GPC (cido guanidinoproclavamnico)
Etapa 4.
OH NH
OH
N PAH (orf 4)
O NH NH2 N
MgII O NH2
COOH
COOH
GPC (cido guanidinoproclavamnico) PC (cido proclavamnico)
Etapa 5
H
II O H
OH Fe /O 2
N aKG N
O NH2 O NH2
-
COOH CAS (orf 5)
COOH
PC (cido proclavamnico) DHC (cido dihidoxiproclavamnico)
Etapa 6
H H
O H II O
Fe /O2 NH2
N 2 OG N
O NH2 O
-
COOH CAS (orf 5) COOH
DHC (cido dihidroproclavamnico) ACM (cido clavamnico)
Figura 2.5. Ruta de biosntesis de cido clavulnico y bifurcacin hacia-ruta de las

clavamas. (Continua)
65
Etapa 7.
H H
GCAS O
O O NH
NH2
deaminaci n NH2
N oxidativa N
O O
COOH COOH
ACM (cido clavamnico) NGC (cido N-glicilclavamnico)
Etapa 8.
H
O deaminacin
O NH H H
oxidativa O
O
N NH2
O enantiomerizacin N
O
COOH
COOH
NGC (cido N-glicilclavamnico)
CCHO (clavaldehido)
Etapa 9.
H H H
O CAD(orf 9) O OH
O
N N
NADPH, O2 O
O
COOH COOH
CCHO (clavaldehido) AC (cido clavulnico)
Bifurcacin de etapa 7 hacia otras clavamas
H
O H O
NH2 O COOH H
N O
O N H
O N O
COOH O H
COOH
ACM (cido clavamnico)
2 - carboximetilodenemclavama 2 - Formiloximetilclavama
H
O H
COOH O
N OH
O H N
O H
clavama - 2 - carboxilato 2 - Hidroximetilclavama
Figura 2. 5. .Ruta de biosntesis de cido clavulnico y bifurcacin hacia-ruta de las

clavamas. Continuacin
Etapa 7. Recientemente ha sido descrito un nuevo intermediario, el cido N-glicil-
66
clavamnico (NGC). Se forma por condensacin de GLY y ACM en presencia de ATP,
Mg 2+ y K+ y la enzima glicilclavamino sintasa (GCAS) para producir NGC [59].
Etapa 8. El NGC es transformado a clavaldehdo (CCHO), pero an se desconocen
detalles de su reaccin. Para efectos de construccin del modelo metablico propuesto,
para el balance de la reaccin se considera que la GLY consumida en la etapa anterior
es usada por la enzima como un cofactor que la activa, por lo tanto es liberada en esta
etapa y no se incluye en la reaccin neta de biosntesis de AC. Esta reaccin comprende
una desaminacin oxidativa dependiente de oxgeno molecular y durante la cual se
produce el cambio de la estereoisomera del grupo carboxilo de C-3 y el hidrgeno de C-
5 para dar lugar a una estereoqumica 3R, 5R, esencial para la actividad inhibidora de -
lactamasas [16, 27].
Etapa 9. El grupo aldehdo del CCHO es reducido a AC por la accin de la enzima
clavaldehdo reductasa (CAR), tambin llamada cido clavulnico deshidrogenasa
(CAD), dependiente de NADPH. Esta enzima es codificada por el gen car. Este
compuesto que participa en la etapa final de la produccin de AC es qumicamente muy
inestable [16, 27].
Bifurcacin de la etapa 7 hacia otras clavamas:
Existe la posibilidad de bifurcacin del flujo de carbono en la etapa 7 hacia la
formacin de otras clavamas. La presencia de diferentes modificaciones de la cadena en
el C-2 desde cido clavamnico y la eliminacin del grupo carboxlico en C-3, conducen
a la diversidad de clavamas 3S,
5S producidas por S. clavuligerus [23]. Alguna de las clavamas producidas a partir de
cido clavamnico, como competencia en la va hacia AC y a las cuales no se les
67
conoce en detalle el mecanismo de sntesis son: clavam2-carboxilato (txico), 2-
hidroximetilclavama, 2-formiloximetilclavama y clavulanato-9-alanilclavama [23, 59].
2.3. REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO Y

FORMULACIN DEL MEDIO DE CULTIVO.
Los microorganismos obtienen la energa para realizar la biosntesis y el crecimiento
desde los componentes de su ambiente en muchas formas. De acuerdo con la fuente de
energa, el organismo requiere diversas fuentes de compuestos qumicos para la
biosntesis de material celular como son las protenas, cidos nucleicos y para la sntesis
de metabolitos presentes en el metabolismo primario y secundario, para mantenimiento
y reproduccin. Estos deben ser suministrados por el medio de cultivo [61].
Los medios de mantenimiento y de produccin se caracterizan por tener una o varias
fuentes de carbono (FC), fuentes de nitrgeno (FN) y fuente de nutrientes traza, que por
lo general incluyen sales de magnesio, sodio, potasio, azufre, zinc, etc., as como
vitaminas. Los requerimientos nutricionales para el crecimiento son diferentes de los
necesarios para la produccin de metabolitos secundarios.
Los resultados en la produccin de antibiticos a partir de Streptomyces son sensibles a
las variaciones de subcultivo y conservacin, las cuales muchas veces no se relacionan.
An queda mucho por entender acerca de la complejidad de la interaccin entre
pequeas molculas, protenas regulatorias y promotores de genes claves para la
activacin de la produccin de antibiticos [23]. A continuacin se detallan las
caractersticas de los nutrientes y su efecto en el metabolismo, resaltando las
aplicaciones para la produccin de antibiticos por Streptomyces sp. Todas las
68
condiciones establecidas en este numeral buscan suplir las necesidades bsicas de la
clula para lograr multiplicarse y la generacin de productos.
2.3.1. Fuentes de nitrgeno.
La fuente de nitrgeno (FN) por lo general es de tipo inorgnico (estructura molecular
sencilla) ya que la clula la asimila ms fcilmente, pero puede a la vez tener un efecto
adverso para el crecimiento y el producto, por variacin en el pH en el medio, como
ejemplos de FN inorgnica estn las sales de amonio y nitratos. Para contrarrestar este
efecto adverso de cambio de pH en el medio se prefiere usar una FN orgnica o
compleja, ya que representa un mayor esfuerzo celular para ser consumida y hay mayor
regulacin del amonio presente. Entre los tipos de FN orgnica estn los aminocidos, la
urea, hidrolizados de protenas, etc. Estos presentan ventaja al ser usados en la
produccin de metabolitos secundarios ya que actan como como precursores de
antibiticos y tienen un papel regulatorio sobre el metabolismo de nitrgeno [22, 63],
Los aminocidos son usados como FN en medios qumicamente definidos, entre ellos el
de uso ms comn es el glutamato monosdico [22, 63]. Ya se describi en la seccin
2.2.7 como el tipo de aminocido precursor de un producto especfico, puede tener un
papel regulatorio en todo el metabolismo. La regulacin global del catabolismo
metablico del nitrgeno tiene un efecto negativo sobre el crecimiento celular debido al
agotamiento de aminocidos como nutrientes, lo cual provoca un incremento en la
concentracin celular de alarmones ppGpp y pppGpp [9, 22-23], Estos nucletidos son
responsables de la inactivacin de la transcripcin del rRNA, tRNA y operones de
protena ribosomal y de detener el crecimiento de la pared celular as como ser
69
responsables en provocar modificaciones del metabolismo favoreciendo la produccin
de metabolitos secundarios [22- 23].
Nitrgeno inorgnico: El nitrgeno inorgnico slo puede ser incorporado a la biomasa
a travs del metabolismo de glutamato y glutamina. Cuando la fuente de N es nitrato o
urea, el N inorgnico debe ser primero convertido a amonio, el cual puede difundirse a
travs de la membrana citoplasmtica para participar en la transaminacin de glutamato
a glutamina [29].
La represin por nitrgeno en la produccin de metabolitos secundarios se refiere a la
inhibicin, reduccin, y / o retraso en el inicio del metabolismo secundario por la
presencia de una fuente de nitrgeno rpidamente asimilable. La fuente de N que
reprime el metabolismo secundario lo hace incluso en presencia de una segunda fuente
de N que no causa represin [22]. Es importante notar que la concentracin de la fuente
de nitrgeno necesaria para provocar la represin del metabolismo secundario es
usualmente alta, por ejemplo 10-120 mM [50, 65]. En el metabolismo primario se
conoce la cantidad de nitrgeno que necesita la clula, mientras que en el metabolismo
secundario es difcil saber que compuesto se est usando como fuente de N y como
puede causar represin en alguno de los precursores en el MCC y afectar el
metabolismo secundario [22].
Nitrgeno orgnico: Muchos organismos sintetizan y secretan proteasas extracelulares
las cuales hidrolizan protenas a pptidos de bajo peso molecular y aminocidos (AAs).
Los pptidos no son hidrolizados completamente a AAs antes de ser transportados como
nutrientes. Por ejemplo, muchos organismos pueden transportar hasta pentapptidos
hacia el interior de la clula, los que son luego hidrolizados por proteasas intracelulares
70
o peptidasas. Una vez estn dentro de la clula, estos son luego hidrolizados por
proteasas o peptidasas intracelulares. Las proteasas intra y extracelulares son
normalmente reprimidas por amonio y sus sntesis son frecuentemente inhibidas por
exceso de carbono, azufre y fosfato [66, 67]. Despus de la hidrlisis de la protena, el
catabolismo de muchos AAs resultantes comienza con la transaminacin, donde el -
amino nitrgeno es transferido a aKG por la accin de la enzima glutamato transaminasa
(ver reaccin (1)), y posteriormente el glutamato sufre una deaminacin oxidativa por
la enzima glutamato-dehidrogenasa NAD+ dependiente, y regenerando el aKG (ver
reaccin (2)). La enzima glutamato-dehidrogenasa NAD+ dependiente tiene funcin
catablica principalmente y su actividad es baja durante el crecimiento en un medio
mnimo que no contiene AAs. Despus de la deaminacin el compuesto de carbono
obtenido es transformado a PYR, ACCOA o algn otro intermediario del ciclo de Krebs,
ver tabla 2.1 [66].
Glutamato + alfa-ceto-cido = alfa-ceto-glutarato + aminocido (1)
Alfa-ceto-glutarato + NH4 + NADH = glutamato + NAD+ + H2O (2)
Tabla 2. 1. Relacin simplificada entre los aminocidos y su producto de biosntesis en

la va principal del carbono y los aminocidos productos de la sntesis.
Aminocidos Producto
ALA(1), SER(1), CYS(3) Y GLY(2) PYR
THR(1), LYS(10), LEU(8), TYR(7), PHE(8) Y ACCOA
TRP (12)
GLU(1), GLN(2), PRO(3), ARG(4), HIS (5) aKG
ME(9), ISOLEU(9) Y VA (8) SUCCOA
ASP(1) Y ASN (2) OAA
Nota: El nmero entre parntesis se refiere al nmero de reacciones necesarias para transformar el aminocido en
producto.
Algunos medios de cultivo para Sc contienen una FN compleja tal como extracto de
levadura, licor de maz, protena vegetal, protenas de semillas o hidrolizado de tales

71
protenas. La protena de harina de soja (o su hidrolizado) ha resultado ser el ms
eficiente nutriente para la produccin de AC [34, 62]. Al hidrolizar la protena se obtiene
una mezcla de AAs, los cuales presentan un efecto cruzado entre ellos que favorece la
sntesis de AC y cuyo mecanismo no ha sido an elucidado [47, 63].
2.3.2. Fuente de carbono:
La fuente de carbono (FC) por lo general es un monosacrido como glucosa o fructosa,
disacridos como lactosa, polisacridos como dextrinas, almidones y celulosa, polioles
como glicerol, aceites y alcoholes [61, 64]. La glucosa es atractiva como FC, sin
embargo, el catabolismo rpido de la glucosa y otros carbohidratos se ha visto que
disminuyen la velocidad de biosntesis de antibiticos, por ejemplo se ha reportado que
inhibe sntesis de penicilina de P. chrysogenum y la sntesis de Cefalosporina y AC de
Sc [64]. Debido a la dificultad de Sc para utilizar glucosa, se han utilizado como FC
lpidos (aceites vegetales) [68-71] y glicerol [61, 72-74], los cuales favorecen tanto el
crecimiento como la produccin de antibiticos.
Es importante tener en cuenta el reto que tienen los procesos biotecnolgicos por ser
procesos econmicos, sostenibles, que empleen fuentes renovables, que sean escalables,
entre los aspectos a tener en cuenta esta la seleccin de las fuentes de carbono y de
nitrgeno, entre otros. Evitar efectos adversos que dificulten las etapas de purificacin y
concentracin del producto [75]. Por ejemplo emplear como FC lpidos, los cuales
presentan baja solubilidad en el medio de cultivo, lo que sirve como medio para evitar
represin catablica. Los microorganismos al consumir lpidos exigen un mayor
requerimiento de oxgeno para su metabolismo, comparado con los carbohidratos.
Adems hay necesidad de hacer tratamientos de purificacin para eliminar los aceites
72
residuales [61, 64]. El emplear GLC como sustrato es ventajoso por no presentar los
problemas antes descritos (sustrato empleado actualmente a nivel industrial) [76-77],
sino por ser una alternativa de aplicacin de un subproducto de la industria del biodisel
(10% de la produccin total del biodisel) [78]. Desde hace ms de dos dcadas se est
estudiando el papel que desempea el glicerol como FC tanto para el crecimiento como
para la biosntesis de AC a partir de S. clavuligerus. Existen reportes acerca de
represin catablica por glicerol a concentraciones superiores de 2% (20g/L) [50] las
cuales se han mitigado por estrategias como variacin de la concentracin de GLC y de
la FN en el medio [79] as como estrategias de cultivo en lote alimentado con GLC [74],
estos cambios en el proceso lograron incrementar la titulacin y la estabilidad del AC.
2.3.3. Estudios de efecto de fuente de fsforo.
Los microorganismos requieren para subsistir de algunos elementos nutricionales en
menor cantidad, adicionales a la fuente de carbono y nitrgeno como son fsforo,
azufre, potasio, magnesio, calcio y cloro, entre otros. Los fosfatos son la principal
fuente de fsforo (FP) para la nutricin microbiana, ya que en el crecimiento celular
muchas de las enzimas del metabolismo primario y la expresin de genes de sntesis de
macromolculas se estimulan con fosfato (PO4) [80]. El fosfato, usado como agente
buffer en los medios de cultivo, es crtico para la biosntesis de cidos nucleicos y para
el metabolismo de energa [63]. Las concentraciones de fosfato ptimas para
crecimiento celular se encuentran en el intervalo de 0.3300 mM [80], pero dependiendo
del tipo de producto que se quiera obtener, estos lmites varan as, a concentraciones de
fosfato 100 mM en el medio de cultivo pueden reducir la produccin de AC en un
80%. Concentraciones de fosfato 50 mM pueden reducir en un 50% la produccin de
73
cefamicina [48]. Se encontr que en Sc, el fosfato reprime la biosntesis de las
enzimas cefamicina sintetasa y AC sintetasa, involucradas en la sntesis de cefamicina y
de AC. En la presencia de 2mM de fosfato, las actividades de estas enzimas fueron ms
altas que a una concentracin de 75mM de fosfato [61, 81]. Bajo limitacin de fosfato
se ha encontrado mayor produccin de AC [50].
Se ha encontrado que el nivel de fosfato inorgnico en el medio de cultivo, tiene un
efecto regulatorio en la biosntesis de muchos antibiticos, como actinorrodina e
undecilprodigiosin de para S. coelicolor. Bajo condiciones de limitacin de fosfato, se
da la sntesis del nucletido guanosina tetrafosfato ppGpp activa la transcripcin para
cambios en la produccin de genes de rpido crecimiento a produccin de genes para
iniciar fase estacionaria de la clula que reducen el crecimiento por limitacin del
nucletido y se inicia el metabolismo secundario, y en caso de suficiencia de fosfato se
reprime la transcripcin del grupo de genes en la biosntesis de antibiticos [5, 80]. El
mecanismo de regulacin del fosfato no ha sido an esclarecido [8, 23]. Se ha sugerido
que la concentracin de ATP es el mediador intracelular para la regulacin del fosfato
[8, 64]. Tambin se comprob para varias especies de Streptomyces (lividans,
avermitilis, antibioticus y giseus) que el ATP trabaja como molcula reguladora,
cambios que se den en el ATP a nivel intracelular estn relacionados con la produccin
de antibiticos [82]
2.3.4. Efecto de elementos trazas.

Los elementos trazas, en los cuales se incluye el magnesio, cobre, hierro, cobalto,
molibdeno, manganeso, calcio, boro, zinc, sulfatos y cloruros, no slo son muy
importantes para la nutricin microbiana, sino que algunos de estos pueden afectar la
74
produccin de antibiticos. En la tabla 2.2 se presenta cada uno de los elementos
importantes dentro de la clula y su funcin [61]. Las sales de cobalto tienen un efecto
positivo en la produccin de tienamicina a partir de S. cattleya [64]. Existen pocos
trabajos orientados a optimizar el efecto de los nutrientes en el medio de cultivo [25, 83].
Se ha encontrado que el incremento de la concentracin de sulfato estimula la
produccin de AC [84], mientras que se observa una mayor estabilidad de AC con el
aumento de la concentracin de magnesio en el medio [85] y de acuerdo con el tipo de
sal (NaCl >, CaCl2, > MgSO4 > Na2SO4) que se mezcle [60].
2.3.5. Efecto del oxgeno
Los procesos aerobios requieren oxgeno para el crecimiento celular, por lo que es
necesario suministrarlo de forma adecuada [86], y se requiere tambin para reoxidar
NAD(P)H2 o FADH2 para generar ATP, necesario para el metabolismo [17]. Adems,
el suministro de oxgeno tiene un efecto importante tanto en la biosntesis de AAs [27,
87] como en la biosntesis de antibiticos en microrganismos aerobios [17], como en el
caso de Sc, el oxgeno es requerido para biosntesis de AC [27, 32].
En un cultivo sumergido, la velocidad de transferencia de oxgeno est dada por la
ecuacin (3)
d [O2]
OTR OUR (3)
dt
75
Tabla 2. 2. Importancia biolgica de los elementos qumicos en los
microorganismos [58].
Nmero
Elemento Smbolo Funcin fisiolgica
atmico
Hidrgeno H 1 Constituyente del agua celular y materiales celulares orgnicos
Carbono C 6 Constituyente de materiales celulares orgnicos
Nitrgeno N 7 Constituyente de protenas, cidos nucleicos y coenzimas
Constituyente del agua celular y materiales orgnicos tales como

Oxigeno O 8
aceptor de electrones en respiracin de aerobios
Sodio Na 11 Principal catin extracelular
Importante catin divalente celular, cofactor inorgnico para muchas

Magnesio Mg 12
reacciones enzimticas, incluidas las que involucran ATP.
Fosforo P 15 Constituyente de los fosfolpidos, coenzimas y cidos nucleicos.
Constituyente de la cistena, cistina, metionina y protenas ((COA y

Azufre S 16
cocarboxilasa).
cloro Cl 17 Principal anin intracelular y extracelular
Potasio K 19 Principal catin intracelular, cofactor para algunas enzimas.
Calcio Ca 20 Importante catin celular, cofactor para enzimas como las proteinasas.
Catin cofactor inorgnico, cofactor para enzimas como las

Manganeso Mn 25
proteinasas.
Constituyente de citocromos y otros hemo y no hemo protenas,

Hierro Fe 26
cofactor para muchas enzimas
Cobalto Co 27 Constituyente de la vitamina B, y sus coenzimas derivadas
Cobre Cu 29 Constituyente inorgnico de enzimas especiales
El cambio de la concentracin de oxgeno con el tiempo est dado por la diferencia entre
velocidad de transferencia de oxgeno (OTR) y la velocidad de consumo de oxgeno por
la clula (OUR).
76
El OTR se relaciona con parmetros fsicos de operacin mediante la relacin (4)
OTR = KL.a (C * - C ) (4)
El OTR corresponde a la cantidad de oxgeno entregada al sistema, y est expresado en
unidades de mmol O2 L-1 h-1. En la ecuacin (4), KL es el coeficiente de transferencia de
masa interfacial, a es el rea interfacial entre la fase gaseosa y liquida, C*, es la
concentracin de saturacin del oxgeno en el lquido, y C es la concentracin de
oxgeno.
La OUR est dada por la ecuacin (5).
OUR QO2 X (5)
El QO2X corresponde a la demanda de oxgeno por parte de las clulas, y se expresa en
unidades de mmol O2 L-1 h-1 donde QO2 es la demanda especfica de oxgeno (mmol O2
gx-1 h-1) y X es la concentracin de biomasa (gx L-1) [86].
Algunas investigaciones muestran que los niveles de oxgeno disuelto (OD) influyen en
la interaccin entre las reacciones metablicas y los mecanismos de regulacin gentica,
as como en la formacin de productos y subproductos en los procesos de produccin de
metabolitos secundarios a partir de Streptomyces [8-89]. Se encontr que a valores de
OD inferiores al 10% no hay produccin penicilina a partir de P. chrysogenum [90].
En la produccin de cefamicina C de Streptomyces clavuligerus se encontr que durante
la trofofase, el OD baja hasta 0% y para la idiofase este alcanza un valor de 50% y si se
mantiene el oxgeno en valores altos se logra altos rendimientos [88]. Valores de OD
superiores a 20% suplen las necesidad de oxgeno para la produccin de AC de Sc.
Enriquecer el aire con oxgeno no representa mejoras en la produccin, mientras que
variaciones en las condiciones de aireacin y de agitacin si mostraron cambios
77
favorables significativas en la titulacin de AC, en la produccin y en la OUR [89]. Una
estrategia de suministro de oxgeno moderada y por etapas represent un aumento en la
produccin de ARG y la disminucin de subproductos para Corinobacterium crenatum
[87].
Entender las caractersticas fisiolgicas de los microorganismos en la produccin de
metabolitos secundarios bajo diferentes condiciones metablicas de asimilacin de
oxgeno, empleando un mtodo sistmico como el AFM, puede proporcionar
informacin interesante que permita entender y conocer los mecanismos metablicos del
proceso. Basados en la informacin y el conocimiento obtenido por AFM se pueden
establecer estrategias de suministro ptimo de oxgeno que favorezcan el producto. Los
trabajos en los cuales se muestran interrelacin entre perfiles de velocidad de consumo
de oxgeno con los flujos de metabolitos y producto es muy limitada [47, 87].
2.4. TIPO DE OPERACIN: LOTE, LOTE ALIMENTADO y

CONTINUO.
Las fermentaciones pueden ser operadas en reactores en lote, lote alimentado (LA) y
continuo. En reactor en lote todos los componentes, excepto los sustratos gaseosos tales
como oxgeno, agentes de regulacin de pH y de espuma son adicionados al reactor al
inicio de la fermentacin. En el proceso en lote alimentado, no se remueve nada del
reactor durante el proceso, pero el medio de cultivo o alguno de sus componentes, es
adicionado continuamente a modo de controlar la velocidad de reaccin para evitar
efectos de represin catablica sea por FC o FN. En un proceso continuo hay suministro
constante de nutrientes y salida constante de productos, regulando los caudales de
modo que el volumen de cultivo se mantiene constante y el sistema se mantiene en un
78
estado estacionario. La operacin en continuo es ms eficiente que en lote o LA en
trminos de tiempo de proceso, debido a que hay menos tiempo muerto debido a la carga
y descarga de productos [61].
Para la produccin de antibiticos han sido muchas las estrategias de modificacin del
proceso empleadas hasta el momento. En el caso de AC se han realizado estudios
comparando estos tres tipos de procesos (lote, LA y continuo) para determinar el efecto
de la variacin operacional sobre el producto, obteniendo titulaciones de AC de 194, 404
y 293 mg L-1 en lote, LA y continuo respectivamente. La productividad fue mayor en el
continuo obteniendo 10.6 mg L-1 h-1, casi tres veces a la obtenida en lote, encontrando en
el proceso continuo una estrategia prominente para producir AC [91].
Cultivos en lote se han empleado para estudiar el efecto de algunos nutrientes, tratando
de optimizar un medio para la produccin de AC. Variando la FN, se obtuvieron
titulaciones de AC de 380 mg L-1 para una concentracin de aislado de protena de soja
de 20 g L-1 (3 g de N total L-1) [70].
Cultivos en lote alimentado se han empleado para controlar la velocidad de
crecimiento, prolongar la fase estacionaria y contrarrestar algn efecto de inhibicin o
represin de algn metabolito. En la produccin de AC, el sustrato ms utilizado en este
tipo de procesos es el glicerol (GLC) [34, 70, 92], tambin se han empleado como
sustrato mezclas de GLC con un aminocido sea ORN o ARG [34, 73], observando la
duplicacin de la produccin con respecto al lote, con ttulos de 250 mg L-1 y mayor
estabilidad del producto en todos los casos [34, 73].
Cultivos en continuo se han empleado para recopilar informacin que permita hacer
anlisis de flujos metablicos, en el cual a travs de ciertas herramientas matemticas se
79
pueden establecer los flujos al interior de la clula [24, 93]. La discusin sobre esta
metodologa se presenta en la seccin 2.5.3.2.
2.5. MODELADO Y SIMULACIN EN BIOPROCESOS.

El modelado y la simulacin juegan un papel muy importante en la optimizacin de
bioprocesos. Clsicamente, los modelados cinticos de los procesos tienen como
objetivo, obtener algn parmetro que pueda predecir su comportamiento y obtener
criterios para escalar o hacer alguna variacin en el proceso. Esto ha ido cambiando en
los ltimos 20 aos, en donde paulatinamente ha venido incursionando el concepto de
modelado metablico, con el cual se permite un mayor acercamiento al comportamiento
celular como tal y se puede conocer ms en detalle cmo se distribuyen los flujos
metablicos para establecer posibles cuellos de botella y limitaciones estequiomtricas
o energticas. Esta informacin puede relacionarse con alguna estrategia de tipo
molecular para entender y optimizar los procesos. Puede decirse que la mayora de los
trabajos orientados a mejorar y optimizar los procesos biolgicos para la sntesis de
metabolitos de inters, estn enfocados desde la observacin macroscpica de los
fenmenos, y que con el modelado metablico se logra un enfoque molecular de los
bioprocesos analizando las rutas bioqumicas que incluyen las reacciones de ensamble,
polimerizacin, biosntesis y combustin.
En la figura 2.6 se presenta de manera esquemtica un sistema de bioprocesos y alguno
de sus componentes. Se observa en dicha figura un sistema multi-jerarquico de
interaccin entre variables intra y extra-celulares donde el propsito general es
maximizar productividad y rendimiento. A nivel extracelular (macroscpico) el
concepto de velocidad especfica de crecimiento se usa no slo como un importante
80
parmetro que indica la actividad microbiana, sino tambin como un parmetro cintico
en el campo de ingeniera de las reacciones para diseo de bioreactores y plantear
estrategias de operacin. As, las velocidades especficas de reaccin se definen como
flujos de reaccin de metabolitos extracelulares tales como sustratos y productos, los
cuales son parmetros tiles para el modelado metablico. Al considerar el proceso
como un sistema en estado estacionario, se pueden plantear reacciones estequiomtricas
que corresponden a balances de sustratos, productos, energa, incluye reacciones de
transporte, polimerizacin. Estas reacciones estequiomtricas se pueden resolver por
anlisis de flujos metablicos y sntesis de los resultados. Si en el sistema se consideran
las reacciones cinticas y un estado dinmico, se habla de control metablico y el
sistema se resuelve por anlisis de control metablicos. En la parte inferior de la figura
2.6 se observa como a medida que se profundiza en el conocimiento del funcionamiento
celular, la descripcin de los sistemas se hace ms compleja y por ende se requiere de
mayor nmero de variables y del uso de herramientas computacionales que permitan
ayudar a organizar, manejar y obtener informacin de una manera sistmica. Para el
modelado metablico se requiere de informacin de la ruta metablica, la cual se puede
obtener de reportes bibliogrficos o bases de datos cientficas (como se explica en la
seccin 2.2), el modelado metablico se va haciendo tan complejo como se requiera, a
medida que se van adicionando reacciones de diferente tipo, hasta llegar a incluir
reacciones de tipo gentico. El anlisis y solucin de los modelos metablicos generados
requieren del uso de programas matemticos de alta especializacin [94, 95].
81
Variables extracelular
Variables intracelulares
Propsito en el proceso:
Aumentar la Velocidades especficas de: Flujos metablicos:
productividad y el crecimiento estequimetra Bioinformtica:
rendimiento consumo de sustrato polimerizacin Genoma
formacin de producto transporte Transcriptoma
formacin de CO2 termodinmica Proteoma
Metaboloma
consumo de O2 Control metablico
formacin de subproductos. reacciones
Nmero de
< 10 10-103 103-105
variables
Modelado metablico:
Metodologa Microarreglos
Modelado Anlisis de flujos metablicos
Y Electroforesis
macroscpico Anlisis de control metablico
herramientas LC-masas
Sntesis
Figura 2. 6. Esquema de un sistema de elementos que se tienen en cuenta para el

modelado en bioprocesos. El recuadro subrayado simboliza la clula y cada cuadro
interno se refiere al nivel de complejidad para las variables del modelo. La metodologa
de solucin al problema corresponde a modelado macroscpico y modelado
metablico [94].
A continuacin se describirn algunos aspectos relevantes en el modelado cintico y
metablico a tener en cuenta, orientados en su mayora a casos de estudio con
Streptomyces sp.
2.5.1 Modelado cintico de Streptomyces sp.
Todo el esfuerzo realizado para poder construir un modelo matemtico que describa un
sistema en estudio, se ve recompensado al obtener una herramienta para analizar en
forma cualitativa y cuantitativa, permitiendo su utilizacin para realizar predicciones,
optimizacin, control y diseo de equipos o para la determinacin de nuevas condiciones
operacionales que mejoren el comportamiento del sistema [79].
En los modelos dinmicos propuestos para las fermentaciones, la concentracin de
biomasa, sustrato y producto son variables temporales, que permiten evaluar la
evolucin de la fermentacin. Para describir la relacin entre la velocidad de
crecimiento y la concentracin de sustrato, se han propuesto diferentes modelos de
82
crecimiento microbiano, dentro de los cuales el ms famoso de ellos es la expresin
propuesta por Jaques Monod en 1943, sin embargo la falta de consistencia en muchas
ocasiones con los datos experimentales, ha conducido a desarrollar modelos alternativos
como los propuestos por Contois, Teissier, Moser, entre otros [96].
Mientras las simulaciones constituyen una herramienta esencial para el desarrollo de
nuevos productos en diversas reas industriales, este no es el caso en el desarrollo de
bioprocesos en la industria farmacutica. Una de las razones es la complejidad de los
sistemas biolgicos y el poco entendimiento que hay an de los mismos. Este sector se
vera beneficiado si se emprenden esfuerzos para desarrollar modelos matemticos y
programas de simulacin que permitan incrementar la productividad y reducir costos
del proceso [95].
A pesar de que los modelos cinticos son una importante herramienta para la
optimizacin y control de procesos, existen pocos modelos planteados para describir las
dinmicas de los procesos de fermentacin de Estreptomicetos [64, 97]. Algunos
modelos cinticos generados son el de tipo logstico para predecir el comportamiento de
crecimiento de S. coelicolor y el modelo tipo Luedeking-Piret para modelar la
produccin de actinorrodina, los cuales se ajustan bien a los datos experimentales [98].
Es de resaltar que una caracterstica de la produccin de metabolitos secundarios es que
la cintica del producto no est asociada al crecimiento [97- 98], sin embargo, en este
microorganismo, donde la produccin de actinorrodina resulta estar asociada al
crecimiento [98], puede atribuirse a diferencias en la naturaleza de los medios
empleados (definido vs complejo); se tom informacin de velocidad de crecimiento de
un slo grupo de datos empleando medio definido, pero se trabaj en medio complejo.
A pesar de esta diferencia en la cintica del producto, los parmetros encontrados

83
estuvieron dentro del rango de valores esperados comparado con los obtenidos para
otros cultivos microbianos.
El complejo comportamiento dinmico de S. tendae se ha descrito usando un modelo
estructurado y compartimentalizado y extrapolndolo luego a otras especies. En este
caso se presenta la velocidad de crecimiento como una funcin del contenido de
algunos compartimentos intracelulares [99-100]. Tambin se han empleado modelos
cinticos de crecimiento celular como los de Contois, Monod, Tessier y Logstico en
cultivo en lote para S. peucetius productora de rodomicina, encontrando en el Logstico
un mayor ajuste al comportamiento de crecimiento y consumo de sustrato [101]. Para Sc
existen pocos reportes de modelado cintico, entre los que estn el modelo tipo Monod
que se ajusta bien al crecimiento. El modelo considera represin catablica sobre
produccin de AC durante la fase de crecimiento, y se asume formacin de producto no
asociada al crecimiento, presentando un efecto mixto. La formacin de AC comienza
cuando la concentracin de glicerol (Cs) alcanza un valor crtico, Cs2, mayor que Cs1.
La muerte celular y la degradacin del producto son consideradas como reacciones de
primer orden en relacin a la concentracin celular (Cx) y concentracin de producto
(Cp) respectivamente. El efecto de la concentracin de oxgeno disuelto (OD) no se
consider en el modelo por mantenerse por encima del valor crtico para evitar
limitacin por este sustrato. El modelo propuesto, el cual se ajust bien a la cintica de
Sc para producir AC, se presentan en las ecuaciones (6), (7) y (8). Los parmetros
cinticos son entonces encontrados al resolver este sistema de ecuaciones [102].
84
dCx Cs
r max . .Cx k d .Cx.f (Cs1 ) (6)
x dt Ks Cs
dCs 1 Cs (7)
r . max . .Cx
s dt Yx / s Ks Cs
dCp (8)
r .Cx.f (Cs 2 ) k p .Cp
p dt
Donde: rx, rs, rp son las velocidades de crecimiento microbiano, consumo de sustrato y
generacin de producto, respectivamente. f (Cs1) es una funcin de etapa, inicialmente
igual a cero y que asume valores iguales a 1 para concentraciones menores al valor
crtico, Cs1, cuando comienza la muerte celular; f(Cs2), es tambin una funcin de
etapa, inicialmente igual a cero, durante la represin catablica. Esta asume un valor
igual a 1 cuando la concentracin de glicerol cae por debajo del valor crtico, Cs2.
Tambin se ha empleado una cintica de Contois para modelar mltiples sustratos
aditivos, en un proceso continuo para la produccin de AC por Sc. El modelo describe
el comportamiento de crecimiento celular, de consumo de sustrato y de formacin de
producto aplicado a diferentes bioreactores. En este caso el producto se consider con
una cintica de produccin no asociada al crecimiento [103].
2.5.2 Modelado metablico
El modelado metablico es el resultado de plantear las reacciones bioqumicas que
mejor representen la reacciones catablicas y anablicas relacionadas con la biosntesis
de un producto y a travs de herramientas matemticas poder resolver el sistema
matricial obtenido, de tal manera que se puedan conocer todos los flujos hacia y desde
sistema. Esto se conoce como anlisis de flujos metablicos, el cual, entre otras
aplicaciones, es una herramienta de la ingeniera metablica.
85
2.5.2.1. Fundamentos de modelado metablico.
La mutagnesis al azar fue la primera estrategia tecnolgica empleada para modificar
genticamente organismos. Sin embargo sus resultados son tan aleatorios que se puede
considerar ms un arte que una ciencia. La seleccin de cepas a travs de mutaciones
naturales y la tecnologa del ADN recombinante dieron paso a la manipulacin gentica
o de vas metablicas generando resultados especficos a modificaciones deseadas. En
los aos 80 aparecieron los primeros conceptos acerca de la manipulacin dirigida de
vas metablicas y algunas formas de llamar a esta nueva estrategia fueron produccin
molecular, evolucin in vitro, ingeniera de vas metablicas e ingeniera
metablica [104]. A comienzos de los 90s un artculo en honor a James E. Bailey,
considerado uno de los primeros investigadores en IM, donde se defini la disciplina
como el mejoramiento dirigido de la actividad celular a travs de modificaciones de
reacciones bioqumicas especficas por manipulacin de la actividad de sus enzimas, del
transporte y de las funciones regulatorias de la clula mediante el uso de la tecnologa
del ADN recombinante [105], definicin que aun hoy est en uso, con algunas
actualizaciones debidas al desarrollo y aplicacin de poderosas tcnicas -omicas y
bioinformticas para el estudio de sistemas biolgicos.
Entre las diversas metodologas que se pueden aplicar en IM estn: Anlisis de la
capacidad celular, anlisis de flujo metablico (AFM), anlisis de control metablico
(ACM) y sntesis de sistemas e integracin de datos bioinformticos [104].
El AFM es de gran utilidad para: Calcular flujos extracelulares no medidos, calcular
rendimientos tericos mximos, identificar vas alternas en el metabolismo e identificar
puntos de ramificacin de control metablico (rigidez de nodos) [95]. En la figura 2.7 se
86
presentan de forma esquemtica las posibilidades que brinda el uso de modelado
metablico. Una vez establecidas las reacciones bioqumicas ms representativas, se
realiza un balance de materia o balance molar para cada uno de los metabolitos
intermediarios, generando una matriz estequiomtrica, denominada como E, un vector
de flujos y se asume que el sistema est en estado estacionario. De acuerdo con la
posibilidad de solucin a este sistema, sea considerado determinado, subdeterminado o
sobre especificado, se presentan alternativas para solucionarlo: Anlisis de flujos
metablicos (AFM), para sistemas determinados, el cual provee, una nica respuesta y
balances de flujos metablicos (FBA), anlisis de modo de flujos elementales (EFM) y
anlisis de vas extremas (EPA), para sistemas subdeterminados, donde se debe recurrir
a programas de optimizacin que proveen una familia de soluciones que satisfacen el
sistema. Los programas de optimizacin se basan en mtodo Simplex para FBA y
mtodo de anlisis convexo para EPA y EFM. El mtodo de anlisis de consistencia de
datos se aplica para sistemas sobre especificados, el mtodo se describe en la seccin
2.5.2 [95,106].
87
Fuentes bibliogrficas Plantear la Ruta bioqumica
Plantear la reacciones
Para conocer y seleccionar las rutas Ruta clavamas, ruta PP, TCA, X,
metablicas. Se consultan de: estequiomtricas del metabolismo
PO 4, cidos orgnicos,
Gluconeognesis, ruta de Rxnes dedevarios
PP, ciclo Krebs,
Bases de datos, artculos de revista y
AA.
ciclo de la urea, sntesis de X, ruta clavamas,
libros.
Consideraciones: cofactores
ruta, sntesis de aminocidos. son
Consideraciones:
energticamente covalentes,
Cofactores son
composicin energticamente
celular constante, covalentes,
balance
composicin
en es celular constante, balance en
estado estacionario.
Metabolitos extracelulares con poco aporte se
Matriz estequiomtrica 1 0 0
(Ecuaciones estequiomtricas
derivadas del modelo
0 1 0
metablico) 02 1
=
Balance de materia de cada
metabolito
Grados de libertad, F 1 0 0 1
Clasificacin de flujos a medir y a calcular = 0 1 0 . 2
F= flujos- metabolitos 0 0 1
Determinar NC
= 0
Propuesta de flujos
medidos (tericos)
Subdeterminado: FBA Sobredeterminado
Establecer funcin objetivo (Z)
Solucin por Datos redundantes
Anlisis de sensibilidad programacin lineal
Anlisis de consistencia
Flujos medidos: Un ptimo (Z) de datos experimentales
datos experimentales
Varios ( Z)
+Balances elementales
Y de xido reduccin
El sistema puede ser: +Determinar matriz de
redundancia
+Obtener vector de
residuos, matriz de
Determinado: AFM varianza-covarianza y el
ndice de consistencia
nica respuesta AFM

Anlisis de resultados
a cambops
Figura 2. 7. Diagrama de flujo de los pasos a seguir en la solucin al modelado
metablico
88
2.5.2.2. Anlisis de flujos metablicos (AFM).
El anlisis de flujo metablico (AFM) es una herramienta de IM que permite mediante
el uso de programas matemticos calcular los flujos metablicos intracelulares, y
determinar as como estos flujos se distribuyen a travs de las distintas rutas metablicas
cuando el sistema se encuentra estado estacionario. A travs de la aplicacin de
diferentes cambios en la red metablica, se puede conocer o prever los efectos de esas
modificaciones sobre alguna ruta o metabolito de inters. En la figura 2.8 se presenta la
metodologa empleada para llevar a cabo un anlisis de flujos metablicos (AFM); el
proceso va desde la recopilacin de informacin para el modelado metablico hasta el
desarrollo matemtico necesario para hacer las respectivas simulaciones y analizar la
variacin de los flujos en el interior de la clula como resultado de modificaciones o
manipulaciones en el sistema.
La fisiologa celular puede ser interpretada o entendida por observacin de la
distribucin de flujos bajo las condiciones ambientales investigadas. El impacto de una
estrategia de mejoramiento gentico de un microrganismo, puede ser evaluada por
comparacin de su distribucin de flujos con respecto a la especie silvestre del
microrganismo [107].
Un mtodo sistmico que detalla el procedimiento matemtico a seguir para determinar
la distribucin de flujos metablicos ha sido presentado por varios autores [20, 106,
107]. El proporcionar la mayor informacin posible sobre reacciones y genes, etc.
permite el poder construir una red metablica para trabajar y facilitar el obtener
informacin muy importante sobre el sistema. Sin embargo, ya que el anlisis
cuantitativo del metabolismo, requiere de datos experimentales, es importante que la
89
consistencia de datos sea confirmada, antes de utilizarlos en la determinacin de los
flujos metablicos.
Fuentes bibliogrficas
Rutas metablicas obtenidas

de bases de datos, artculos
de revistas y libros
Plantear el Modelo estequiomtrico ( E) 1 0 0

(ecuaciones estequiomtricas derivadas del modelo 0 1 0 E
metablico), determinar NC
0 2 1
Balance de materia de cada metabolito
dCA / dt 1 0 0 1 Clasificacin de flujos a medir y a calcular

dCB / dt 0 1 2 . Anlisis de grados de libertad
2 F = nmero de flujos - nmero de componentes
dCi / dt 0 0 1 j C = - EC-1. Em.m, para realizar AFM
Matriz estequiomtrica
ET= 0, estado estacionario
Datos de flujos medidos para
sistema determinado
Simulaciones para AFM Simulaciones para

Anlisis de sensibilidad (AS) AFM
Figura 2. 8. Representacin esquemtica de la metodologa empleada para realizar

AFM. Donde E es matriz estequiomtrica, Ci: concentracin de metabolitos en estado
estacionario. V: vector de fluxes metablicos, subndice c y m se refiere a calculados y
medidos respectivamente, F: grados de libertad.
2.5.2.2.1 Modelizacin matemtica de sistemas determinados
El anlisis de flujo metablico es realizado empleando un modelo estequiomtrico en el
que se incluyen las reacciones bioqumicas ms representativas para la biosntesis de un
90
producto de inters. En caso de no tener suficiente informacin acerca del
microorganismo de estudio, se pueden agregar datos de otros microorganismos que
presenten rutas bioqumicas similares. El AFM se realiza mediante un balance de
materia alrededor de los metabolitos presentes en el modelo estequiomtrico propuesto y
se asume estado estacionario, lo cual permite obtener un sistema de ecuaciones
algebraicas lineales, como se presenta en (21).
dC
E 0 (21)
dt
Siendo E la matriz estequiomtrica de dimensiones (e x n), donde las e filas representan
cada uno de los metabolitos y las n columnas representan las reacciones en las que
estos participan. El vector de dimensin (nx1), es el vector de flujos de todas las
reacciones. Los valores en cada columna corresponden a los coeficientes
estequiomtricos de los metabolitos que participan en la reaccin. Hay un coeficiente
negativo para cada metabolito consumido y positivo para cada metabolito producido. Un
coeficiente estequiomtrico de cero se usa para metabolitos que no participan en la
reaccin considerada. Se asume estado estacionario para las concentraciones todos los
metabolitos intracelulares (Ci) [66], con lo cual la velocidad de acumulacin de todos
ellos es cero (lado derecho de (21)).
Para resolver este sistema de ecuaciones lineales (e x n), se deben establecer los grados
de libertad (F) que indican si el sistema es determinado, indeterminado o sobre
especificado; estos corresponden a la diferencia entre el nmero de reacciones presentes
(n) y el total de compuestos (e) empleados para los balances de materia. En caso de
poder medir el nmero de flujos dado por F, el sistema se considera determinado. Otra
91
situacin que puede presentarse es que el nmero de flujos medidos sea inferior a F, lo
que implica que el sistema es insuficiente para obtener una nica solucin, en tal caso se
obtiene un sistema subdeterminado. En este caso el sistema debe resolverse utilizando el
anlisis de balance de flujos (FBA, flux balance analysis). Para la solucin de un
sistema subdeterminado se requiere definir una funcin objetivo a optimizar y unas
restricciones al sistema de acuerdo con el conocimiento que se tenga de la ruta
metablica. El FBA se ha empleado para redes bioqumicas muy grandes en donde es
difcil o imposible agotar todos los grados de libertad [56, 107]. Ms detalles se
presentan en la seccin 2.5.2.3.
El trmino E., presente en la ecuacin (21), se puede reorganizar en dos matrices
considerando los flujos medidos (m) y calculados (c), como se presenta en la ecuacin
(22). Al reorganizar la matriz E separando los flujos a calcular, se puede solucionar el
sistema matricial como se muestra en ecuacin (23), que es la base para realizar los
clculos de anlisis de flujo metablico (AFM) [56, 108].
Em m + E C C = 0 (22)
De donde
1
C = - EC Em m (23)
2.5.2.2.2 Metodologa para realizar AFM
La construccin de un modelo metablico, en principio parece depender slo del
conocimiento de las reacciones estequiomtricas. Sin embargo, asegurar la consistencia
dentro del grupo de reacciones escogidas para el balance de metabolitos y la
calculabilidad de las velocidades escogidas, no siempre es sencilla y sobre todo en
92
presencia de redes muy grandes. Por ejemplo, puede ocurrir que existan reacciones
dependientes, lo cual puede hacer que el problema sea no solucionable. Si la matriz
estequiomtrica es de rango completo y no tiene reacciones dependientes, se puede
solucionar. Por el contrario si la matriz no es de rango completo y tiene una o ms
reacciones dependientes, se puede obtener una solucin. Por el contrario si la matriz no
es de rango completo y tiene una o ms reacciones dependientes, no ser posible obtener
una solucin. . Se plantea a manera de ejemplo sencillo como es la estrategia de AFM
con una red simplificada para Sc.
Despus de plantear la matriz estequiomtrica derivada de las reacciones
estequiomtricas definidas como el modelo metablico, (figura 2.9), el siguiente paso es
encontrar qu reacciones o columnas de la matriz tienen dependencia lineal con otras.
Para esto se hace uso del algebra lineal y de programas computacionales, tales como
Matlab.
Cuando la matriz estequiomtrica es pequea, el anlisis puede realizarse mediante una
simple inspeccin visual. Para el ejemplo citado en esta seccin, puede verse que hay
linealidad entre los flujos de los metabolitos ORN y ACE (ver figura 2.10), por lo que
se elimina uno de ellos (en este caso se elimin acetato, ya que se mide ORN). Una vez
se haya obtenido la matriz estequiomtrica y verificado que no posee reacciones con
dependencia lineal entre s, el siguiente paso consiste en determinar el nmero mnimo
de flujos a ser medidos, calculados a partir de los grados de libertad (F). En este caso,
los grados de libertad son 12-9 =3. Los flujos seleccionados medidos son las
velocidades netas de consumo de GLC, NH4 y velocidad de produccin de ORN, que
corresponden a los flujos 1, 6 y 8.
93
GLC

PEP 1 GLC + 2NAD PEP + 2NADH

2 PEP + CO2 + ATP OAA + ADP
3 PEP + NAD ACCOA + CO2 + NADH

ACCOA
4 ACCOA + OAA + NADP aKG + NADPH + CO2

5 aKG + NAD OAA + NADH + ATP + CO2
Asp OAA 6 aKG + NH4 +NADPH GLU + NADP

7 OAA + GLU ASP + aKG
TCA
8 2GLU + ACCOA + ATP + NADPH ORN + aKG +ACE
ORN
aKG 9 GLU GLUEXT
GLU

GLUEXT NH4
Figura 2.9. Modelo simplificado del metabolismo de S. clavuligerus. Siglas usadas:

GLC, glicerol; PEP, fosfoenolpiruvato; OAA, oxaloacetato; GLU, glutamato; ASP,
aspartato; ACE, acetato; ORN, ornitina; EXT. Externo.
flujos
metabolitos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
GLC -1 0 0 0 0 0 0 0 0
NH4 0 0 0 0 0 -1 0 0 0
ASP 0 0 0 0 0 0 1 0 0
ORN 0 0 0 0 0 0 0 1 0
ACE 0 0 0 0 0 0 0 1 0
GLUext 0 0 0 0 0 0 0 0 1
C02 0 -1 1 1 1 0 0 0 0
PEP 1 -1 -1 0 0 0 0 0 0
aKG 0 0 0 1 -1 -1 1 1 0
OAA 0 1 0 -1 1 0 -1 0 0
ACCOA 0 0 1 -1 0 0 0 -1 0
GLU 0 0 0 0 0 1 -1 -2 -1
NADH(NADPH) 2 0 1 1 1 -1 0 -1 0
Figura 2. 10. Matriz estequiomtrica correspondiente al ejemplo de estudio. Las celdas

punteadas corresponden a los flujos medidos. Las celdas sombreadas corresponden a
metabolitos intermediarios.
94
Reorganizando la matriz de la figura 2.10 de acuerdo con los flujos medidos y los que se
van a calcular y aplicando la ecuacin (23) se tiene la relacin presente en la figura
2.11.
1
0 0 0 0 1 0 1 0 0

0 0 0 0 0 1 0 1 0
2 1
1 1 1 0 0 0 0 1

3
1 1 0 0 0 0 0 0 1 1

0
4
0 1 1 1 0 1 0 0 6
5
1 0 1 1 1 0 0 1 1 8

7
0 1 1 0 0 0 0 0 1
9 0 0 0 0 1 1 0 1 2

0 1 1 1 0 0 2 1 1
2 - 40

3 140
1 100 90

con m : 6 10 se tiene c : 4
50 5 -157
8 - 287
7
197
9
Figura 2. 11. Desarrollo del AFM, La solucin de la ecuacin permite obtener la

distribucin de los flujos intracelulares indicados en el modelo de la figura 2.9.
Con los resultados se puede analizar el comportamiento de la red, identificar los flujos
que aumentan o disminuyen y la magnitud de esos cambios frente a un cambio en uno de
esos flujos, ocasionado por una perturbacin en el sistema, ya sea de tipo experimental o
por simulacin, por citar algunas preguntas que se resuelven con AFM.
2.5.2.2.2.1 Anlisis de sensibilidad
Es importante sealar que cualquier modelo estequiomtrico est sujeto a un anlisis
matemtico para determinar si el problema est bien condicionado, de manera que, al
resolver la ecuacin (23), la matriz de los flujos a calcular representan la menor

95
propagacin del error de los flujos medidos. En caso de estar mal condicionado se debe
replantear la red metablica, cambiando alguno de los flujos a medir. El nmero de
condicin (NC) refleja la sensibilidad de una solucin de las ecuaciones lineales al
error en los datos para la estequiometria asumida, y se calcula por medio de la ecuacin
(24). El NC no solo es proporcional al error actual propagado sino tambin al tamao
de la matriz. Un NC por debajo de 1000 puede reflejar que est bien condicionado [31].
NC EC EC# (24)
Las barras () describen una norma matricial. La matriz pseudo-inversa es
EC# (ECT * EC )1 * ECT , el superndice T indica que es matriz transpuesta.
El anlisis de sensibilidad se realiza una vez que la matriz est bien condicionada. Este
anlisis puede proporcionar informacin considerable no slo de la precisin de los
clculos, sino tambin de las propiedades dinmicas de la red metablica propuesta. Al
variar el vector de los flujos medidos puede ayudar a mejorar el diseo experimental al
permitir la escogencia de un buen grupo de flujos medidos tal que proporcione un valor
de NC bajo [31].
Partiendo de un sistema determinado, y siguiendo la metodologa propuesta por Daae
and Ison (1999) para realizar el anlisis de sensibilidad de la ruta metablica propuesta,
a partir de la ecuacin (22), se puede proponer que un cambio en el flujo medido
ocasiona un cambio en el flujo calculado, como se muestra en la ecuacin (25) [31].
-1
C2 - C1 = - EC Em ( m2 - m1 ) (25)
96
La ecuacin (25) se puede presentar en forma diferencial mediante la ecuacin (26), la
cual es la base para el anlisis de sensibilidad y depende de la estequiometria
nicamente.
d -1
C
=-E Em (26)
C
d m
El impacto acumulado sobre el sistema de cada uno de los flujos medidos (m) se
encuentra al extraer la raz cuadrada de la sumatoria de los valores individuales de los
coeficientes de sensibilidad asociados a cada flujo elevado al cuadrado. Una vez que se
ha determinado cuales son los flujos a medir que generan un bajo nmero de condicin,
e identificado el impacto acumulado por cada flujo medido, se procede luego a realizar
el anlisis de flujo metablico (AFM) empleando la ecuacin (23).
2.5.2.2.3 Trabajos reportados sobre AFM para Streptomyces.
El anlisis de flujo metablico (AFM) ha sido aplicado exitosamente en el diseo de
procesos, usando pequeas redes metablicas y buscando optimizar el rendimiento del
producto (ej. antibiticos). Entre los estudios realizados, es posible citar trabajos con S.
tenebrarius [19], S. lividans [20, 26], S. coelicolor [25, 29, 41, 83, 98, 109] y los
trabajos realizados con Sc [13, 24, 27, 47, 93].
Para la produccin de un antibitico a partir de S. tenebrarius, se estudi la interaccin
entre el metabolismo primario y secundario al trabajar con dos medios, uno con glucosa
como nica FC y el otro con una combinacin de glicerol y glucosa. Con este ltimo
medio se obtuvo que en la idiofase los flujos en la va Entner- Deudoroff (ED)
disminuyeron e incrementaron los flujos en las vas PP y EMP, relacionado esto con
altos flujos de NADH y NADPH y este hecho fue asociada con mayor produccin del
97
antibitico tobramicina y disminucin en el porcentaje del subproducto indeseado,
kanamicina B [19].
Para S. lividans productor de los antibiticos actinorrodina y undecilprodigiosin se ha
encontrado que un increment en la produccin de biomasa promueve un aumento en la
va PP y en la glicolisis. En un medio limitado en fosfato, las distribuciones de los
flujos de carbono a travs de las rutas catablicas mostraron la dependencia de las vas
EMP y PP con respecto a la velocidad de crecimiento y la fuente de carbono y energa
empleada (glucosa o gluconato). Las sntesis de ambos antibiticos fueron
desfavorecidas con aumento en los flujos en va PP [26].
Son diversas las estrategias que han sido implementadas para mejorar la produccin de
AC haciendo uso del AFM. Mediante el conocimiento de la distribucin de flujos en el
metabolismo central del carbono (MCC) de Sc, generados al limitar el medio de cultivo
en las fuentes de carbono, nitrgeno y fsforo se pudo proponer una estrategia racional
de mejoramiento del medio a travs de alimentacin de aminocidos que favorecieran la
disponibilidad del precursor C5 (ARG). Se estableci que bajo limitacin de nutrientes
en el medio, el flujo a travs de la va anaplertica (carboxilacin de PEP para producir
oxaloacetato) era bajo, consistente con la carencia del precursor ARG, limitando as los
flujos hacia la sntesis de AC. Con base en los resultados obtenidos se propuso que la
limitacin de carbono restringe el flujo de carbono por la va anaplertica, reduciendo el
potencial requerido para el ciclo de Krebs. En este ciclo estn involucrados los
metabolitos OAA y aKG que son precursores necesarios para sntesis de aminocidos
como ASP y GLU necesarios en la biosntesis de ARG, uno de los precursores directos
de AC. Bajo limitacin de nitrgeno se encuentra una disminucin en los flujos de
aminocidos precursores de la biosntesis de AC. Bajo limitacin de fsforo, los

98
resultados mostraron altos valores de flujos en los precursores C3 y C5 que resultan en
un aumento de la produccin de AC [93].
El AFM sirve para establecer estrategias de alimentacin al cultivo de acuerdo con el
conocimiento previo de la distribucin de flujos del MCC para Sc. Al comparar cultivos
en continuo con medio basal y con medio enriquecido por la adicin de aminocidos
individuales y combinados, se encontr que la adicin de ASP, ASN y THR se
incrementan los flujos de la va de sntesis de ARG con el consecuente aumento de 18
veces el rendimiento de AC, con respecto al medio sin adicin de estos AAs [47]. Estos
resultados provenientes de resultados de modelado metablico fueron confirmados
independientemente en experimentos donde al comparar una cepa silvestre con
mutantes, se identificaron los cuellos de botella de la biosntesis de AC, y se propone
como estrategia alimentar ARG al cultivo, logrando incrementar la produccin de AC
[24].
2.5.2.3 Anlisis de balances de flujos (FBA).

Cuando se plantea un modelo metablico como el representado en ecuacin (21), se
pueden presentar tres situaciones dependiendo del nmero de flujos que se puedan
determinar experimentalmente para agotar los grados F del sistema. Para el caso donde
el nmero de flujos medidos es menor que los F, hay un nmero infinito de soluciones
que satisfacen el sistema, y los flujos pueden ser calculados mediante el uso de
algoritmos de programacin lineal. Con esta tcnica es posible obtener una solucin
para los flujos intracelulares a partir de la optimizacin de una funcin objetivo
apropiada [104, 111].
99
La construccin de un modelo metablico para aplicar anlisis de balances de flujos
requiere establecer restricciones de diferente tipo, fisicoqumicas, espaciales,
topolgicas, dependientes de las condiciones ambientales, de tipo regulatorio o gentico.
El anlisis asume que bajo algunas condiciones ambientales dadas, el organismo
alcanzar el estado estacionario que satisface esas restricciones fisicoqumicas. Ya que
las restricciones del sistema celular no se conocen en su totalidad, se pueden obtener
mltiples soluciones del estado estacionario. Para identificar un estado fisiolgico
significativo en estado estacionario, se requiere de una optimizacin para encontrar los
valores ptimos de una funcin objetivo especfica con respecto a las restricciones
dadas. El balance de masa es definido en trminos de flujo a travs de cada reaccin y
se tiene en cuenta la estequiometria de la reaccin. Esto da un conjunto acoplado de
reacciones diferenciales [111].
En la figura 2.12 se presenta la metodologa empleada para llevar a cabo un anlisis de
distribucin de flujos metablicos; el proceso va desde la recopilacin de informacin
para la construccin del modelo metablico hasta la solucin matemtica del modelo.
Posteriormente viene un anlisis de los resultados de la distribucin de los flujos al
interior de la clula en funcin de la implementacin de algn cambio en el sistema.
El objetivo de FBA es identificar los flujos metablicos desconocidos que proporcionan
una solucin en estado estacionario bajo restricciones de tipo estequiomtrico y de uno
o varios flujos medidos que permitan una nica distribucin de flujos. Un organismo
puede tener dos o ms rutas redundantes y bajo diferente conjunto de datos se pueden
obtener los mismos ptimos. Para abordar esta problemtica, recientemente se ha hecho
uso de anlisis de variabilidad de flujos (FVA). Este tipo de anlisis proporciona un
100
Modelo metablico propuesto
Balance de materia para cada metabolito
[dCi/dt] = E
Suposicin estado estacionario
Anlisis de grados de libertad
Grados de libertad (F)

F = nmero de flujos - nmero de componentes
Definicin de nmero de observaciones

experimentales menores que los grados de
libertad del sistema
Modelo subdeterminado (FBA)

, siendo C : ATP, o AC
Sujeto a :
Figura 2.12 Representacin esquemtica de la metodologa empleada para realizar FBA.

Donde E es matriz estequiomtrica, Ci: concentracin de metabolitos en estado estacionario.
: vector de flujos metablicos, subndice c y m se refiere a calculados y medidos
respectivamente, F: grados de libertad.
101
intervalo de valores para cada reaccin en el sistema. Como el intervalo de solucin es
nico, los flujos considerados como verdaderos son los que estn incluidos en el
intervalo [111, 112].
2.5.3.3.1 Sistema subdeterminado, modelizacin matemtica

Para encontrar la solucin al sistema subdeterminado es necesario aplicar mtodos de
programacin lineal. En donde se plantea una funcin objetivo Z como hiptesis de que
el metabolismo celular es regulado de modo tal que se optimizan ciertas funciones de la
clula. La descripcin del problema matemtico a resolver se puede describir como se
presenta en la ecuacin (27).
Maximizar/minimizar Z f ( C ) (27)
La combinacin lineal de flujos C minimiza o maximiza bajo las siguientes
restricciones:
E 0
inf sup
j exp
Siendo los subndices inf, sup, exp: inferior, superior y experimental respectivamente.
Los valores inferior y superior corresponden a valores lmites inferiores o superiores
que son establecidos por las diversas restricciones metablicas, fisiolgicas,
fisicoqumicas o ambientales. Las reacciones irreversibles se representan fijando el
lmite inferior del valor del flujo en cero. Para reacciones reversibles sobre las que no se
tiene informacin acerca de los lmites de su velocidad, se asignan a los lmites inferior
y superior valores de gran magnitud (hasta del orden de 105). Un valor alto da libertad
para que todas las reacciones transcurran, negativo el primero y positivo el segundo
[113]. Si se quiere reducir ms el espacio de solucin, estas restricciones pueden
102
reducirse mediante la inclusin en el modelo de valores de flujos medidos a las
condiciones ambientales y/o genticas en que se desea simular el comportamiento
celular. Estos valores se incluyen como restricciones de igualdad, y son los que permiten
ajustar el comportamiento celular a la situacin particular que se desea analizar [111,
113].
Las suposiciones dadas para lograr obtener el ptimo son : Que la clula ha encaminado
su metabolismo a obtener el comportamiento ptimo respecto al objetivo propuesto, y
que dicho objetivo puede ser establecido matemticamente en una forma apropiada
como se muestra en la ecuacin (27), dando un peso relativo de 1 a la variable a
optimizar.
Maximizar Z ( ) (27)
Donde el vector representa el peso relativo que se asigna a cada flujo en la funcin
objetivo.
2.5.2.3.2. Funciones objetivo

En la mayora de los trabajos con FBA se emplea como funcin objetivo la
maximizacin del crecimiento celular o velocidad de biosntesis de biomasa [110, 111,
114], ya que se ha encontrado mucha consistencia entre los resultados del modelo y
datos experimentales. Sin embargo numerosas funciones objetivos adicionales pueden
ser empleadas y es posible compararlas de forma sistmica para seleccionar la ms
apropiada [111, 115]. La simulacin de produccin de antibiticos presenta nuevos
cambios en la definicin de la funcin objetivo, ya que estos como metabolitos
secundarios no se requieren para el crecimiento celular, y adicionalmente, bajo muchas
circunstancias puede decirse que el crecimiento celular ptimo y el metabolismo

103
secundario ptimo son mutuamente excluyentes, ya que la reduccin de la velocidad de
crecimiento comnmente induce el metabolismo secundario [115]. Otras funciones
objetivo que se pueden emplear son minimizacin de produccin de ATP, minimizacin
de produccin de poder reductor (NADH/NADPH), esto representa el concepto que el
metabolismo de la clula se esfuerza en operar en trminos de eficiencia de energa [25,
110, 116]. Tambin se ha empleado como funcin objetivo minimizar consumo de un
sustrato o maximizar algn producto de inters [115, 116]. Tambin se puede emplear
una funcin objetivo mltiple, relacionando varios compuestos a maximizar o
minimizar [117].
La optimizacin puede ser realizada usando cualquier mtodo de minimizacin
multivariable como por ejemplo la variacin del algoritmo Simplex [118]. Existen
diversos programas especializados como CNA [119], COBRA [120], etc. que son
paquetes de programas que corren en el ambiente de Matlab, y que proporcionan una
interfase adecuada para la solucin de problemas de FBA, FVA y para la simulacin del
comportamiento de mutantes por eliminacin de genes o la modificacin de variables
ambientales (composicin de medios de cultivo, etc.) [121].
2.5.2.3.3. Trabajos reportados sobre FBA para Streptomyces.
Se han realizado estudios de anlisis de distribucin de flujos metablicos para algunas
Streptomyces entre los que se encuentra: El estudio del efecto de la limitacin de
nutrientes (N, P, S, y K) sobre el metabolismo primario y secundario para S. coelicolor,
considerando como funciones objetivo maximizar la velocidad especfica de
crecimiento y minimizar el requerimiento de energa. Al considerar el objetivo de
104
maximizar la velocidad de crecimiento, bajo limitacin de P, los flujos calculados
coincidieron con los datos experimentales. Por el contrario, bajo limitacin de N, el
objetivo celular que mejor se ajust a los datos experimentales fue la minimizacin de
requerimiento de energa, se obtuvo por simulacin mayor produccin de actinorrodina
pero tambin hubo presencia de subproductos indeseables [25]. Esta bacteria tambin es
productora de un antibitico dependiente de calcio (CDA), para el cual se ha estudiado
la distribucin de los flujos, considerando como objetivo celular la maximizacin de
velocidad especfica de crecimiento y la formacin de producto, cada una de forma
independiente. Se encontr la produccin de CDA est relacionada con la velocidad
especfica de crecimiento. Con los resultados in silico con FBA se proponen estrategias
de manipulacin gentica para estudiar los efectos metablicos deseados, logrando
buenas predicciones [29].
Se han logrado avances a nivel de la optimizacin, para redes a escala genmica. En el
caso de un mutante de S. coelicolor, se hizo uso de FVA y FBA para lograr seleccionar
una adecuada funcin objetivo. Para este caso se encontr que es necesaria una
aproximacin indirecta, tal como examinar el efecto del proceso de alimentacin sobre
la asimilacin de nutrientes. Se encontr entonces que la mayor influencia del mutante
sobre la produccin de antibitico fue el resultado indirecto de la mutacin sobre la
velocidad de asimilacin de fosfato, cuando se consider como funcin objetivo
maximizar la velocidad de consumo de glucosa [115]. Para S. clavuligerus se encontr
una muy buena correlacin entre los resultados experimentales y los resultados
simulados empleando balance de flujo dinmico (FBAd).Este modelado sirvi para ver
que la mayora de las modificaciones genticas no contribuyen al entramado complejo

105
del metabolismo primario, pero son coincidentes con una regulacin (upregulation) de
varios grupos de genes de biosntesis de antibiticos. Los resultados conducen a que es
necesario realizar nuevos cambios a nivel transcripcional, tales como el incremento de
transcripcin de genes en la transcripcin de genes de glutamina y glutamato sintetasa, y
en los genes que codifican tansportadores de amonio y fosfato. Para los anlisis se
compara la informacin experimental obtenida durante la fase de produccin de AC y
cefamicina C para la cepa silvestre y cepas mutantes (obtenidos por mutagnesis al azar
y por IM) y con la informacin obtenida por simulacin variando los flujos durante la
produccin de antibiticos [13]. Tambin para un mutante de S. lividans TK 24, se ha
empleado FBA para entender de forma sistmica e interpretativa diferentes
modificaciones a escala genmica, considerando como objetivo celular la maximizacin
del crecimiento y diferentes estrategias de alimentacin al medio. Los resultados
experimentales fueron confrontados con los obtenidos en el modelado metablico de
acuerdo con las restricciones dadas al sistema y stos fueron consistentes entre si [122].
106
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Actinomycetes, A. Press, Ed. London, UK: , 1984, pp. 229286.
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114
CAPITULO 3
PRODUCCIN DE ACIDO CLAVULNICO POR

FERMENTACIN DE Streptomyces clavuligerus:
EVALUACIN DE DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO Y
MODELADO MATEMTICO.
El cido clavulnico (AC) es un antibitico -lactmico con una potente capacidad
inhibidora de la actividad -lactamasa, cuya produccin por fermentacin presenta bajos
rendimientos. En el presente trabajo se evaluaron cuatro medios de cultivo reportados en
la bibliografa y se compararon con un medio de cultivo desarrollado en esta
investigacin para la produccin de AC por S. clavuligerus. Asimismo, se estableci
tambin la concentracin ptima de glicerol en el medio seleccionado, y con base en los
resultados obtenidos, se estudi la produccin de AC en un biorreactor de laboratorio.
Los resultados obtenidos muestran que medios complejos con presencia de una mezcla
de aminocidos libres son adecuados para la produccin de AC, y que la concentracin
de glicerol ptima para la produccin de AC es de 50 g L-1. Concentraciones superiores
a 100 g L-1 causan inhibicin de la sntesis del antibitico. Con el medio complejo y 50 g
L-1 de glicerol, la concentracin de AC alcanzada fue de 994 mg L-1. El proceso puede
ser representado mediante un modelo matemtico, que incluye una cintica tipo Contois
para la biomasa y una cintica de formacin de producto parcialmente asociado al
crecimiento. El modelo presenta un ajuste significativo con un 95% de nivel de
confianza.
115
3.1. INTRODUCCIN
El cido clavulnico (AC), es una molcula que exhibe una potente actividad inhibitoria
de las enzimas -lactamasas, por lo que se ha convertido en un importante producto
comercial disponible en combinaciones con antibiticos -lactmicos como amoxicilina

TM TM
(Augmentin ), tetraciclina (Timentn ) [1] y tambin como producto genrico. Su
efecto inhibidor fue descubierto en 1976 y desde entonces se han realizado exhaustivos
estudios con el fin de mejorar los ttulos de antibitico empleando procesos de
fermentacin con la bacteria que naturalmente lo produce, Streptomyces clavuligerus
(Sc).
La productividad del proceso, depende de muchos factores, entre ellos del tipo y
concentracin de nutrientes, de las condiciones de operacin de la fermentacin y de los
propios mecanismos intracelulares de biosntesis. A pesar de los esfuerzos de los
investigadores que trabajan en el tema alrededor del mundo, an no se ha conseguido
obtener valores de produccin (ttulo) de AC superiores a 1g L-1 [2-3], e incluso en la
gran mayora de trabajos y despus de estudios de optimizacin estos valores han sido
inferiores a 500 mg L-1 [4-6]. De acuerdo con informacin de patentes registradas a
nombre de importantes empresas farmacuticas, se han reportado valores de produccin
de AC entre 561 y 1000 mg L-1 [7-8]. Por tanto, es de gran importancia continuar
abordando estudios tendientes a mejorar la produccin del AC, lo que permitir reducir
sus costos y hacerlo ms accesible a la poblacin de escasos recursos.
En diferentes estudios publicados, se ha observado el empleo de una gran variedad de

formulaciones de medios para el cultivo de S c [2, 7-12]. Algunos de ellos son
qumicamente definidos y otros son medios complejos. Estos ltimos favorecen la
116
produccin de AC puesto que la bacteria requiere para su biosntesis la presencia de
aminocidos [13], los cuales estn presentes en sustratos complejos como harina de
cereales o digeridos de protenas, que presentan la ventaja de ser nutrientes de bajo
costo. Sin embargo, debido a la complejidad del medio y la baja concentracin del
producto, su purificacin se torna compleja y costosa [8, 14]. Los carbohidratos son la
fuente de carbono y energa preferida por muchos microorganismo, pero Sc presenta
una inusual incapacidad de consumir glucosa y otros carbohidratos simples. La
principales fuentes de carbono para Sc producir antibiticos son los lpidos y el glicerol
[15-17]. Dado que el glicerol ha sido identificado como el precursor de 3 tomos de
carbono para la sntesis de AC [3, 18], en la gran mayora de trabajos se emplea esta
sustancia como la fuente de carbono.
Debido a la gran heterogeneidad en la composicin de los medios de cultivo reportados
en la literatura para la produccin de AC, los cuales han sido desarrollados y evaluados,
no siempre a las mismas condiciones, se hace necesario evaluarlos bajo las mismas
condiciones y con la misma especie bacteriana, con el fin de determinar la verdadera
capacidad de estos medios para la produccin de AC.
En este trabajo se evaluaron 5 diferentes composiciones de medios de cultivo para
produccin de AC bajo las mismas condiciones de cultivo de S c, en Erlenmeyers. Una
vez seleccionado el medio de mayor produccin se evaluaron diferentes concentraciones
de la fuente de carbono en Erlenmeyers, y el medio seleccionado se emple para
producir AC en un biorreactor a escala de laboratorio. Basndose en las caractersticas
de los cultivos, se propuso un modelo matemtico para describir el comportamiento
cintico de la fermentacin.
117
3.2 MATERIALES Y MTODOS
3.2. 1. Tcnicas microbiolgicas.
3.2.1.1. Microorganismo y medio de conservacin.

Se emple un liofilizado de la cepa de Streptomyces clavuligerus ATCC 27064. La
activacin se realiz en caldo TSB (Tryptic Soy Broth) incubado a 28 C por 36 h. La
cepa activada se almacen a -80C en tubos Eppendorf con medio TSB y glicerol al
40%. Estos tubos se emplearon como semilla para todos los ensayos [19].
3.2.1.2. Medios de cultivo.

Los inculos empleados para cada ensayo se prepararon mezclando en Erlenmeyers de
500 mL, el contenido de un tubo semilla con 100 mL de medio TSB, e incubndolos a
28 C y 220 rpm por 36 h. Bajo estas condiciones, la DO600nm obtenida oscil entre 0.6 y
0.8[19].
Los medios de cultivo utilizados para evaluar la produccin de AC fueron: Medio 1:
Almidn (10 g L-1), L-asparagina (2 g L-1), MgSO4.7H2O (0.6 g L-1), K2HPO4 (4.4 g L-
1
), FeSO4.7H2O (1 mg L-1), MnCl2.4H2O (1mg L-1), ZnSO4.7H2O (1 mg L-1) y
CaCl2.3H2O (1.3 mg L-1). El medio se regul con MOPS (100 mM) y se ajust a pH 6.9
[2]. Medio 2: Es una modificacin del medio 1, empleando en lugar de almidn, glicerol
a una concentracin de 20 g L-1 [20]. Medio 3: glicerol (10 g L-1), harina de soya (40 g
L-1), aceite de soya (16 g L-1), K2HPO4 (1.2 g L-1), MnCl2.4H2O (1 mg L-1),
ZnSO4.7H2O (1mg L-1) y CaCl2.3H2O (1.3 mg L-1). El medio se regul con MOPS (100
mM) y se ajust a pH 6.8 [9]. Medio 4: glicerol (20 g L-1), harina de soya (5.5 g L-1) y
K2HPO4 (0.8 g L-1). El medio se regul con MOPS (100 mM) y se ajust a pH 7.0 [10].
118
Medio 5: glicerol (20 g L-1), harina de soya (15 g L-1) y casaminocidos (5 g L-1). El
medio se regul con MOPS (100 mM) y se ajust a pH 7.0 [21]. Antes de su
inoculacin, los medios de cultivo se esterilizaron en autoclave a 121 C durante 20 min.
3.2.1.3. Mtodos experimentales

Se realizaron cinco cultivos de fermentacin por triplicado en Erlenmeyers de 500 mL.
A cada frasco se adicion 100 mL del medio de cultivo a evaluar y la biomasa contenida
en 10 mL de inculo. Esta biomasa se obtuvo centrifugando 10 mL de inculo a 5000
rpm por 10 min., eliminando el sobrenadante y resuspendiendo la biomasa con 10 mL de
medio de prueba del Erlenmeyer y retornndolo nuevamente al Erlenmeyer. Los frascos
se sellaron con tapones de algodn para permitir la difusin del oxgeno al cultivo y se
incubaron a 28 C y 220 rpm por 36 h.
Con el medio de cultivo seleccionado, se evaluaron tres concentraciones de glicerol: 20
g L-1 (2%), 50 g L-1 (5%) y 100 g L-1 (10%). Los cultivos se realizaron por triplicado
bajo las mismas condiciones operacionales ya descritas.
Para ambos ensayos, al final del periodo de incubacin se tomaron muestras para
cuantificar la concentracin de biomasa y de AC. Los valores medios de cada ensayo se
compararon estadsticamente mediante la prueba de rangos mltiples de Duncan, con el
fin de determinar las diferencias significativas entre ellos [22, 23].
La produccin de AC se evalu por duplicado en un biorreactor de laboratorio de 5 L
(Biostat B Braun), con un volumen de trabajo de 3 L e inculo al 10% v/v. La
fermentacin se llev a cabo a 28C, 400 rpm y un flujo de aire de 1 vvm. El pH se
control en 6.8 +/- 0.2 con soluciones de NaOH (2N) y HCL (2N) adicionadas
119
automticamente. La espuma se control adicionando 008 mL L-1 de anti-espumante
(Antifoam A, sigma Aldrich) al inicio de la fermentacin. El cultivo se desarroll por
144 h y se tomaron muestras peridicamente para determinar las concentraciones de
biomasa, glicerol y AC.
3.2.2. Mtodos analticos
Las muestras de la fermentacin se centrifugaron a 14000 rpm por 10 min. a 4C. Los
pellets se emplearon para determinar la concentracin de biomasa y los sobrenadantes se
diluyeron con solucin de MOPS (pH 6.8 y 100 mM) y se filtraron a travs de
membranas de PTFE de 0.2 m previo al anlisis de AC y glicerol [19].
3.2.2.1. Determinacin de biomasa:

El micelio se lav dos veces con 10 mL de solucin salina (NaCl 0.9%) y su biomasa se
determin indirectamente mediante la tcnica colorimtrica de DNA, basada en lectura
de la absorbancia a 600 nm del color azul generado por la reaccin de la difenilamina
con la desoxirribosa [19, 24].
3.2.2.2. Determinacin de cido clavulnico:

La concentracin de AC se determin por HPLC empleando el mtodo descrito por
Foulstone and Reading (1982) [25]. El AC presente en cada muestra, fue derivatizado
con imidazol y analizado en un HPLC Agilent/Hewlett Packard Chemstation 1100,
operado con columna C18 -Bondapack fase reversa (Waters), una fase mvil
compuesta por una solucin de 94% v/v de KH2PO4 (50mM, pH 3.2) y 6% v/v de
metanol, aun flujo de 1mLmin-1 y un detector de arreglo de diodos. El AC derivatizado
se detect a 311 nm.
120
3.2.2.3. Determinacin de glicerol:
La concentracin de glicerol se determin por espectrofotometra a 412 nm, basado en la
reaccin de oxidacin del glicerol por cido perclrico [13].
3.2.3. Modelo matemtico.
El modelo propuesto para el proceso de produccin de AC a partir de Sc, se obtuvo
realizando balances de masa para la biomasa, el sustrato y el producto en un sistema por
lote. Para la velocidad de crecimiento especfica se propuso el modelo de Contois, se
representa en la ecuacin (1), donde la velocidad especfica de crecimiento es
inversamente proporcional a la biomasa. La velocidad de crecimiento microbiano se
representa por la ecuacin (2). La velocidad de consumo de glicerol se representa como
una funcin directa de la velocidad de crecimiento microbiano, ecuacin (3) y la
velocidad de produccin de AC se representa como una funcin aditiva de la velocidad
de crecimiento microbiano y la concentracin de biomasa, ecuacin (4), es decir, se
representa como un metabolito producido con un aporte del metabolismo primario y un
aporte del metabolismo secundario. El retraso en la aparicin de AC hasta el inicio del
crecimiento exponencial, se representa con la funcin de paso (t), siendo cero desde el
inicio del cultivo hasta un tiempo to y para tiempos superiores a to, la funcin toma un
valor de 1.
S
max
Ks. X S (1)
dX
. X
dt (2)
121
dS
. X (3)
dt Y XS
dP
. X . (t )
dt YXP (4)

Donde X es la concentracin de la biomasa (g L-1), S es la concentracin de GLC (g L-1),
P es la concentracin de AC (mg L-1), es la velocidad de crecimiento especfica (h-1),
max es la velocidad de crecimiento mxima especfica (h-1), KS es la constante de
saturacin de Monod (g L-1), YXS es el rendimiento biomasa en glicerol, YXP es el
rendimiento de biomasa en AC (g mg-1), que es una productividad de AC especfica
(mg g-1 h-1) y (t) es una funcin de paso que asume un valor de 0 en los rangos de
tiempo entre 0-48 h y el valor de 1 en el rango de tiempo entre 48-136 h.
La estimacin de los parmetros del modelo cintico y la solucin numrica de las
ecuaciones diferenciales que representan el modelo, se realizaron empleando el mtodo
de optimizacin no lineal lsqnonline, basado en el algoritmo de Levenberg-Marquardt,
asociado con la herramienta ODE45 de Matlab 2008b (MathWorks, Cambridge, etc).
3.3. RESULTADOS Y DISCUSIN
3.3.1. Evaluacin de los medios de cultivo.

Los resultados de la evaluacin de los cinco medios de cultivo se presentan en la Figura
3.1. La concentracin de AC y el rendimiento de producto en biomasa (YP/X) son las
variables de eleccin para seleccionar el mejor medio de cultivo. Al realizar un anlisis
estadstico empleando el test de rangos mltiples de Duncan, se observ que hay
diferencia significativa entre todos los medios evaluados. Los medios sintticos (medios
122
1 y 2) presentan una baja produccin de AC y un bajo rendimiento en producto. Igual
comportamiento se observ en el medio 3, que contiene harina de soja. El medio 4
present un alto rendimiento de AC con base a biomasa producida, pero una baja
concentracin durante el cultivo. El medio de cultivo que report los ms altos valores
de produccin de AC fue el medio 5, con 335 mg L-1, mientras que con los medios
qumicamente definidos se alcanzaron valores de 140 mg L-1.
De acuerdo con resultados de la bibliografa, la produccin de AC con los medios
qumicamente definidos se encuentra entre 5.6 y 25.4 mg L-1 [2], mientras que con
medios complejos se han alcanzado valores de entre 135 y 742 mg L-1 [3, 10, 26], lo que
coincide con los resultados encontrados en este trabajo. La baja produccin de AC en los
medios 1 y 2 se puede explicar por la carencia de suficiente fuente de nitrgeno y la
ausencia de aminocidos esenciales para su sntesis como leucina, serina, valina,
arginina, ornitina, entre otros, que han sido reportados por diferentes autores y sus
funciones estn definidas en la ruta metablica de biosntesis de AC [10, 27].

120
100
80
60
40
20
0
1 2 3 4 5
Medios de cultivo
Figura 3. 1. Efecto del uso de diferentes medios de cultivo sobre la produccin de cido
clavulnico (AC) en mg L-1 (barras claras) y sobre el rendimiento de producto en mg
AC g de biomasa seca -1 (barras oscuras) en cultivos de S. clavuligerus. Los valores de
concentracin de AC deben multiplicarse por 10.
123
Actualmente para la formulacin de medios de cultivo para la produccin de AC se
emplean mezclas de aminocidos con el fin de proveer los nutrientes necesarios para la
sntesis [21, 28], y por esta causa los medios 4 y 5 fueron incluidos en el estudio. El
medio 4 contiene una mezcla compleja de aminocidos presentes en las protenas de la
harina de soja, mientras que el medio 5, adems de tener los aminocidos presentes en
harina de soja se suplementa con los aminocidos libres presentes en los
casaminocidos. Como se muestra en la figura 3.1, los resultados sugieren que la
presencia de aminocidos libres incrementa la produccin de AC de 100 a 330 mg L-1.
Un fenmeno similar fue observado en cultivos con harina de soja y con protena
hidrolizada de soja, donde con este ltimo componente se increment la concentracin
en un 100% [9]. La presencia de fuentes complejas de aminocidos al parecer
desfavorece la formacin de biomasa incrementando el rendimiento de producto. Podra
pensarse que hay un incremento en el potencial redox (NADH/NADPH) en la clula
dado por la sntesis de aminocidos y la generacin de biomasa, este potencial debe ser
equilibrado al interior de la clula, provocando un cese en el crecimiento y la activacin
del metabolismo secundario.
3.3.2. Evaluacin de la concentracin de glicerol.

Basndose en los resultados de los medios de cultivo, la concentracin de glicerol fue
evaluada en el medio 5 y los resultados se presentan en la figura 3.2. Al realizar un
anlisis estadstico empleando el test de rangos mltiples de Duncan [22-23] para
comparar las velocidades especficas de crecimiento y concentracin de producto, se
observan diferencias significativas entre todos los medios para la velocidad especfica de
crecimiento pero no para la concentracin del producto entre los medios con 2 y 10% de
124
glicerol. Se observ un mximo en la produccin de AC con 5% de glicerol alcanzando
994 mg L-1, mientras que a 2% y 10% de glicerol la produccin fue menor. El
rendimiento de producto no presenta este mximo y se observa una disminucin del
rendimiento con el aumento de la concentracin de glicerol, debido a un aumento en la
formacin de biomasa.
Un comportamiento tipo campana de Gauss fue observado en la produccin de AC en
funcin de la concentracin de glicerol, tambin ha sido reportado este comportamiento
por otros autores, quienes indican que altas concentraciones de glicerol inhiben la
produccin de cido clavulnico y reprimen la produccin de otros antibiticos en Sc [3,
29- 30].
140
120
100
80
60
40
20
0
2% 5% 10%
Contenido de glicerol
Figura 3. 2. Efecto de la concentracin de glicerol (2, 5 y 10%), empleada como fuente

de carbono en cultivos de S. clavuligerus, sobre la produccin de cido clavulnico
(AC) en mg L-1 (barras claras) y sobre el rendimiento de producto en mg de AC.g de
biomasa seca-1 (barras oscuras), empleando el medio 5. Los valores de concentracin
de AC deben multiplicarse por 10.
125
3.3.3. Fermentacin en biorreactor de laboratorio
Una vez evaluado el medio apropiado para la produccin de AC y definida la
concentracin de glicerol para este medio, se cultiv S. clavuligerus en un fermentador
con el fin de determinar las cinticas de crecimiento, de consumo de sustrato y de
produccin de AC, y evaluar el modelo matemtico propuesto. Los resultados se
presentan en la figura 3. 3. Se observa que el AC se detect a partir de las 24 h de
cultivo pero fue a partir de las 48 h que comenz su fase de produccin exponencial.
Durante este periodo y hasta las 81 h se observ crecimiento de la biomasa lo que
demuestra que la produccin de AC est, en parte, asociada a la produccin de biomasa.
Debido a que la concentracin de AC es muy baja hasta las 48 h, se asumi en el modelo
que hasta este tiempo la produccin era nula. Sin embargo los resultados experimentales
se muestran sin eliminar estos puntos. La velocidad de produccin de biomasa cae a cero
cuando la concentracin de glicerol est por debajo de 4.6 g L-1, sin embargo el consumo
de glicerol contina hasta las 107 h, donde la concentracin de glicerol alcanza niveles
por debajo del lmite de deteccin. Esto podra significar que velocidad de produccin
de biomasa es en realidad el balance entre formacin y disrupcin de material celular. A
partir de las 81 h la velocidad de produccin de AC experiment una fuerte reduccin
correlacionndose con la presencia de una baja concentracin de glicerol. Esta menor
velocidad de produccin se mantuvo constante hasta las 126 h. Durante este periodo, la
produccin de AC, no estuvo asociada a la velocidad de crecimiento sino a la
concentracin de biomasa presente.
126
60 1200
50 1000
Biomasa y Glicerol (g/L)

40 800
AC (mg/L)
30 600
20 400
10 200
0 0
0 50 100 150
Tiempo (h)

empleando el medio 5 a una concentracin de glicerol de 5%. Los smbolos
representan datos experimentales, las lneas continuas representan el ajuste con el
modelo matemtico propuesto. Smbolos: Glicerol (O), biomasa ( ) y cido clavulnico
().
De acuerdo con el comportamiento del modelo, se puede observar que hay un ajuste
significativo con los datos de consumo de glicerol y de formacin de AC y un mejor
ajuste con los datos de produccin de biomasa, cuyos valores predichos son menores que
los observados durante la fase de crecimiento. Un mejor ajuste de los valores de biomasa
se observa en la fase estacionaria. Los valores de los parmetros del modelo se presentan
en la Tabla 3.1.
clavuligerus.
Parmetros Valores estimados
mx (h-1) 0.046+/-0.002
Ks (g L-1) 0.450+/-0.005
Yxs (g g-1) 0.21+/-0.03
Yxp (g mg-1) 0.010+/-0.003
(mg g-1) 0.0025+/- 0.0002
127
El valor de velocidad especfica de crecimiento celular es del mismo orden que algunos
de los valores reportados en la bibliografa [27, 31-32]. Los valores de rendimiento de
producto Yxp obtenidos con el ajuste del modelo fueron similares a los que se presentan
en las figuras 3.1 y 3.2 para el medio 5.
El modelo tipo Contois propuesto comparado con los modelos tipo Modod y Teisser es
el que mejor ajusta a los resultados experimentales (menor error residual, 3.71%) y
permite explicar el comportamiento de la fermentacin con base en las hiptesis
postuladas al establecer las cinticas de biomasa, sustrato y producto. Esto es, la
biomasa y el sustrato limitan la velocidad especfica de crecimiento, y el AC es
producido con componentes asociados y no asociados a la velocidad de crecimiento.
A pesar de que los modelos matemticos son una herramienta importante para desarrollo
de tcnicas de optimizacin y control de procesos [33], existen pocos estudios al
respecto para Streptomyces. Ozergin-Ulgen en 1993, propuso el primer trabajo orientado
en obtener los parmetros cinticos que describen la actividad de S. coelicolor para
producir actinorrodina en cultivo en lote. El modelo de formacin de producto del tipo
Luedeking-Piret, permiti plantear que la produccin era asociada al crecimiento [32].
Continuando con esta hiptesis, Baptista y colaboradores en el 2000, utilizaron un
modelo cintico basado en la ecuacin de Monod para describir los datos experimentales
de Sc y emplearon un modelo cintico para el producto de efecto mixto, que considera
dos trminos asociado y no asociado al crecimiento [34-35]. El modelo propuesto en
este trabajo incluye las consideraciones de estos autores para la formacin de producto
observndose un buen ajuste con los resultados experimentales.
128
3.4. CONCLUSIONES
Un medio de cultivo complejo con fuentes de aminocidos libres o hidrolizados de
protenas favorece la sntesis de cido clavulnico. Un medio con estas caractersticas, es
el medio 5, evaluado en el presente trabajo. El glicerol empleado como fuente de
carbono mostr un valor ptimo de concentracin en 50 g L-1, dentro de los valores de
concentracin evaluados, confirmndose que a altas concentraciones de glicerol inhiben
la sntesis de AC. Los resultados obtenidos en la seleccin del medio y concentracin de
glicerol se emplearon para realizar una fermentacin en biorreactor de laboratorio, y el
modelo propuesto simul con alto grado de ajuste los resultados experimentales,
confirmando la bondad del modelo, que incluye una cintica tipo Contois para la
biomasa y una cintica de formacin de producto con componentes de formacin
asociado y no asociado al crecimiento.
129
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131
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132
CAPTULO 4
UNA COMBINACIN DE ANLISIS DE SENSIBILIDAD Y

AFM MUESTRAN LA IMPORTANCIA DE LA ESTRATEGIA
DE ALIMENTACIN DE AMINOCIDOS PARA LA
BIOSNTESIS DE AC EN Sc.
El anlisis de flujo metablico (AFM) es una herramienta de la IM, cuyo propsito es
proveer un nuevo enfoque de tipo sistmico para el diseo racional de sistemas biolgicos
complejos. La aplicacin de AFM implica la necesidad de realizar desarrollos matemticos
que se vuelven robustos y difciles de manejar a simple vista, por lo que se requiere
herramientas matemticas que permiten resolver el sistema, y, previo a la experimentacin,
poder definir las mejores variables a analizar de acuerdo con un anlisis de sensibilidad. En
este trabajo se realiz un anlisis de sensibilidad y un AFM, a partir de la representacin
matemtica de las rutas bioqumicas ms importantes, consideradas en la biosntesis de AC
por Sc. Se observ que los flujos metablicos medidos que ms inciden en el sistema
celular fueron los de las sntesis de los AAs fenilalanina, isoleucina, tirosina y lisina.
Tambin se pudo establecer que, de acuerdo con la distribucin de flujos a dos D (0.02 y
0.03 h-1), la biosntesis de AC se ve favorecida a una menor D, dando lugar a mayores
valores en los flujos de produccin de gliceraldehido-3-fosfato, fosfoenolpiruvato y
piruvato, flujos precursores del ciclo de Krebs y del ciclo de la urea. Se encontr adems
que el flujo de produccin de ORN afecta directamente la biosntesis de AC en mayor
grado que el flujo de ARG, lo cual deja ver la importancia del control del flujo de carbono
133
a travs del ciclo de la urea, en la biosntesis de AC.
4.1. INTRODUCCIN
Los antibiticos son sintetizados a partir de precursores metablicos producto del MCC,
por lo que una mayor produccin requerir un adecuado suministro de algunos
metabolitos intermediarios relevantes, resultantes de la actividad de la clula. El
mejoramiento de la produccin de antibiticos ha estado ligado a actividades de
mutagnesis aleatoria con importantes avances en los ltimos aos; uno de los organismos
ms estudiados es Sc, especialmente en lo que respecta a sus caractersticas genticas y
proceso de biosntesis de antibiticos [1-3]. La combinacin de aspectos genticos y el
empleo de tcnicas de IM permiten introducir cambios racionales en el metabolismo
central, y propender por el incremento de flujos de precursores metablicos y cofactores
que permitan mejorar la concentracin de un producto de inters [4], o minimizar la
generacin de subproductos [5]. El AFM es uno de los ncleos metodolgicos de la IM el
cual particularmente ayuda a la optimizacin de la distribucin de flujos metablicos
(DFM) [6-7].
Algunos trabajos en los cuales se ha empleado el AFM como herramienta para mejorar el
proceso se discuten a continuacin. Kirk et al, (2000), realizaron un AFM para conocer la
distribucin de flujos en el metabolismo central del carbono (MCC) de Sc, generados al
limitar el medio de cultivo en las FC, FN, FP [8]; esto permiti proponer una estrategia
racional de mejoramiento del medio a travs de alimentacin de AAs favoreciendo la
disponibilidad del precursor C5 (ARG). En este trabajo tambin se encontr que, bajo
limitacin de nutrientes en el medio, el flujo a travs de la va anaplertica (carboxilacin
de PEP para producir oxaloacetato) era bajo, consistente con la carencia del precursor
134
ARG, desfavoreciendo as una buena produccin de AC. Con base en los resultados
obtenidos se propuso que la limitacin de carbono restringe el flujo de carbono por la va
anaplertica, reduciendo el potencial requerido para que en el ciclo de Krebs se pueda
favorecer la biosntesis de los AAs precursores de AC. Estudios experimentales que
incluan limitacin de N mostraron una reduccin de los flujos de los precursores de la
biosntesis de AC, debido a la reduccin de los flujos de la biosntesis de AAs. En el caso
de estudios con limitacin de P, los resultados mostraron altos valores de flujos en los
precursores C3 y C5 que favorecieron la produccin de AC [8].
Bushell et al, (2006), realizaron cultivos en continuo con medio basal y con medio
enriquecido por la adicin de AAs individuales y mezclados, buscando favorecer la
produccin de AC; para la estrategia de seleccin de estos AAs emplearon como
herramienta el AFM. Mediante la adicin de AAs sintetizados a partir de ASP, ASN y
THR, entre otros, se incrementaron los flujos de la va de sntesis de ARG, generando un
aumento de 5 veces el rendimiento de AC, con respecto al medio sin adicin de estos AAs
[9].
Con el fin de estudiar el comportamiento del metabolismo celular ante cambios en
condiciones ambientales, se ha desarrollado un mtodo basado en anlisis de sensibilidad,
teniendo en cuenta la estequiometria, de la red metablica propuesta. Empleando este
mtodo se ha logrado analizar el efecto de perturbaciones en los flujos medidos sobre el
sistema y tambin el efecto de cambios de la composicin de la biomasa sobre las
reacciones metablicas calculadas [10]. Daae e Ison (1999), encontraron que un cambio en
el flujo de oxgeno es el que genera mayor impacto sobre la distribucin de flujos del
sistema [10]. Adems, demostraron que el uso de la composicin de la biomasa de E. coli,
135
como modelo de biomasa para para S. lividans, es una buena aproximacin, ya que no
afecta significativamente el patrn de flujos calculados en el metabolismo de S. lividans.
De esta manera es aceptable adoptar la composicin de biomasa de E. coli para
representar la biomasa de S. lividans en estudios de IM [10].
Dada la importancia que amerita el estudio de medios y su efecto en la distribucin de
flujos metablicos (DFM), en el presente trabajo se analiza la produccin de AC en medio
continuo, usando una cepa salvaje de Sc y diversas estrategias de enriquecimiento de
medios. Adicionalmente se estudia la DFM como resultado directo de la adicin de AAs y
de la tasa de dilucin (D), y se hace una descripcin cuantitativa del efecto de la variacin
de flujos metablicos individuales sobre la acumulacin de AC.
4.2. MATERIALES Y MTODOS:

En la figura 4.1 se presenta de manera esquemtica la metodologa empleada para llevar a
cabo la recopilacin de datos experimentales para realizar el AFM; el trabajo experimental
consider un proceso en continuo y la cuantificacin de los flujos en estado estacionario,
tomando el promedio de tres tiempos de residencia, despus de estado estacionario del
proceso.
4.2.1. Tcnicas microbiolgicas.
4.2.1.1. Microorganismo y medio de conservacin.
Se emple un liofilizado de la cepa Streptomyces clavuligerus (Sc) ATCC 27064. La
activacin se realiz en caldo TSB a 28 C por 36 h. La cepa activada se almacen a -80 C
en tubos eppendorff con medio TSB/glicerol al 40%. Estos tubos se emplearon como
semilla para todos los ensayos [11].
136
Botn de 10 mL Inculo en MP
Centrifugado a 23C V: 100 mL,
10 min a 4000 rpm Erlenmeyer con 4
bafles,
T:28C, 220rpm, pH:7
t: 24-36 h
Stock de Sc. Preinculo, Medio TSB X= 8 +/- 1 g L-1
Medio TSB con V: 100 mL
Glicerol al 40% Erlenmeyer con 4 bafles
T : -80C T: 28C, 220 rpm, pH: 7 100 mL de inculo
Tubo semilla t: 24-36 h
X = 8 +/- 1 g L-1
Anlisis de AC,
MP X, AA, GLC, PO4
para AFM
Continuo:
Bioflo 110, 3L, V: 1L de MP
T:28C, pH: 6.8+/-0.2, t lote: 36-40 h
Continuo hasta 6 , D: 0.03 y 0.02 h-1
Productos
500-1200 rpm, agitadores Rushton (AC)
Lote:
Flujo de aire: 1 vvm.
Bioflo 110, 3L, V: 1L de MP
T:28C, pH: 6.8+/-0.2, t: 100 h
500 rpm, agitadores Rushton
Flujo de aire: 1 vvm.
Figura 4.1. Representacin esquemtica del proceso de produccin de AC en lote y en

continuo. Siglas: AC: Acido clavulnico, Sc. Streptomyces clavuligerus, MP: Medio de
produccin de AC, X, biomasa; AAs, aminocidos; GLC, glicerol; , tiempo de residencia;
D, tasa de dilucin, V: volumen del cultivo T: temperatura, t: tiempo del cultivo
4.2.1.2. Medios de cultivo.

Para la preparacin del preinculo se emple el medio de cultivo TSB (Triptone Soy Broth)
que est compuesto de: Bactotriptona (digerido pancretico de casena) 17 g L-1, Bacto
Soytone (digerido de harina de soja) 3 g L-1, glucosa 2.5 g L-1, NaCl 5 g L-1 y K2HPO4 2.5 g
L-1.
Para realizar el modelado metablico se requiere de un medio qumicamente definido, por
esto se seleccion el medio 2 trabajado en el captulo 3. Los ensayos de fermentacin se
realizaron con un medio de produccin (MP) conteniendo la siguiente composicin:
Glicerol 20 g L-1, MgSO47H2O 1.23 g L-1, K2HPO4 3.5 g L-1, asparagina 2 g L-1 y 1 mL L-1
de solucin de elementos traza. La composicin de la solucin de los elementos traza fue:
137
FeSO4.7H2O 1 g L-1, MnCl2.4H2O 1g L-1, ZnSO4.7H2O 1 g L-1 y CaCl2.3H2O 1.3 g L-1. El
medio de produccin fue ajustado a pH 6.9 con solucin buffer MOPS (buffer [3-(N-
Morfolino)-cido propanosulfnico]) (100 mM) [12].
Los medios fueron autoclavados a 121 C durante 20 min. Para el medio de produccin, las
soluciones traza fueron esterilizadas por filtracin.
4.2.2. Mtodos experimentales.
4.2.2.1. Preparacin del inculo

Con el propsito de identificar la cintica de produccin de AC y establecer las condiciones
para trabajar en continuo, se realizaron cultivos en lote bajo las siguientes condiciones:
Se desarroll un preinculo a partir de un tubo semilla de Sc, adicionando el contenido del
vial a un Erlenmeyer bafleado de 500 mL, que contena 100 mL de medio TSB. Una vez se
alcanz la fase exponencial, se tom una muestra de 10 mL de cultivo, se centrifug a 5000
rpm por 10 min con el fin de separar la biomasa. Despus de eliminar el sobrenadante, la
biomasa fue resuspendida en 10 mL de medio de produccin y transferida a otro
Erlenmeyer bafleado de 500 mL con 90 mL de medio de produccin, con el fin de
desarrollar el inculo para los ensayos en biorreactor. Los cultivos de preinculo e inculo
se incubaron a 28 C y 220 rpm por 36 h, tiempo en el cual se aseguraba un cultivo en fase
exponencial con una concentracin de biomasa entre 8 y 9 g L-1.
4.2.2.2. Cultivos en biorreactor

Los cultivos en biorreactor se desarrollaron en un fermentador BIOFLO 110 (New
Brunswick, USA), de 3 L, con dos agitadores tipo Rushton de 6 paletas planas y sistemas
de control de T, pH y OD.
138
Se oper con un volumen de trabajo de 1L de MP y un porcentaje de inculo del 10% (v/v).
Las fermentaciones se llevaron a cabo a 28 C, 500 rpm y un flujo de aire de 1 vvm. El pH
se control a 6.8 +/- 0.2 con soluciones de NaOH (2N) y HCL (2N), adicionadas
automticamente. La espuma se control adicionando 0.08 ml L-1 de anti-espumante
siliconado (Antifoam A, sigma Aldrich) al inicio de la fermentacin. Los cultivos por lote
cumplieron una cintica de 100 h y peridicamente se tomaron muestras para determinar la
concentracin de X, GLC, AAs, fosfato, O2 y AC. A partir de estos cultivos se evaluaron
los parmetros cinticos velocidad especfica de crecimiento y rendimientos de producto
necesarios para definir las condiciones de operacin en continuo. Se evaluaron los
modelos cinticos tipo Monod, Contois y Teisser.
Los cultivos en modo continuo se realizaron con el fin de evaluar el efecto de la D sobre la
produccin de AC, y obtener informacin experimental sobre la D. Para poner en marcha
un proceso continuo, inicialmente se realiz un cultivo en lote; el proceso se llev hasta el
final de la fase de crecimiento exponencial (aproximadamente 36 h), tiempo en el cual se
iniciaba la alimentacin y descarga, en forma continua, usando medio MP y ajustando las
bombas peristlticas al caudal correspondiente a la D a evaluar. Se trabaj a dos D (0.02 y
0.03 h-1). Para asegurar condiciones de estado estacionario se estableci en seis tiempos de
residencia () el tiempo para tomar las muestras correspondientes a las condiciones
estudiadas. El estado estacionario se verific por la medicin de biomasa y AC en cada
tiempo de residencia, para el tercer tiempo de residencia se inicia el estado estacionario y se
mantiene hasta el sexto tiempo de residencia (los datos se toman del promedio de las tres
ltimos tiempos de residencia). Se tomaron muestras con el fin de evaluar X, AC, GLC,
PO4, OD, ASN, PHE, TYR, TRP, VAL, ILE, PRO, GLY y ALA.
139
Los cultivos en lote se realizaron por triplicado y el continuo se realiz por duplicado; los
anlisis de las muestras se realizaron por duplicado.
4.2.2.3. Modelo matemtico
Dado que para el modelado metablico se requiere de un medio qumicamente definido, es
necesario obtener los parmetros cinticos bajo las condiciones experimentales detalladas
en este captulo. Se sigui la misma metodologa planteada en la Seccin 3.2.3 para
plantear el modelo y validar los datos experimentales. Para la velocidad de crecimiento
especfica se propuso el modelo de Monod, se representa en la ecuacin (1), donde la
velocidad especfica de crecimiento es inversamente proporcional a la concentracin de
sustrato limitante. La velocidad de crecimiento microbiano se representa por la ecuacin (2)
en la cual se considera tambin el trmino de muerte celular. La velocidad de consumo de
glicerol se representa como una funcin directa de la velocidad de crecimiento microbiano,
ecuacin (3) y la velocidad de produccin de AC se representa como una funcin aditiva de
la velocidad de crecimiento microbiano y la concentracin de biomasa, ecuacin (4), es
decir, se representa como un metabolito producido con un aporte del metabolismo primario
y un aporte del metabolismo secundario. A diferencia del modelo Contois planteado en la
Seccin 3.2.3. No se considera funcin de paso..
max
S (1)

Ks. S
dX
( kd ) X (2)
dt
dS
. X (3)
dt Y XS
140
dP
. X (4)
dt YXP
Donde X es la concentracin de la biomasa (g L-1), S es la concentracin de GLC (g L-1), P es
la concentracin de AC (mg L-1), es la velocidad de crecimiento especfica (h-1), max es la
velocidad de crecimiento mxima especfica (h-1), KS es la constante de saturacin de
Monod (g L-1), YXS es el rendimiento biomasa en glicerol, YXP es el rendimiento de biomasa
en AC (g mg-1), que es una productividad de AC especfica (mg g-1 h-1).
4.2.3. Mtodos analticos
Todas las muestras de fermentacin se centrifugaron a 14000 rpm durante 10 min a 4 C.
Los pellets obtenidos se emplearon para determinar la concentracin de biomasa y el
sobrenadante se filtr a travs de membranas de PTFE de 0.2 m. Los sobrenadantes
fueron almacenados a -20 C para su posterior anlisis.
Determinacin de biomasa: Los slidos precipitados despus de la centrifugacin, fueron
secados por 4 h a 105 C en tubos de micro centrfuga eppendorff, previamente secados y
pesados.
Determinacin de cido clavulnico: El AC presente en el sobrenadante de las muestras,
fue derivatizado con imidazol en relacin 1:3 durante 30 min a 30 C y almacenado a -80
C para posterior anlisis (no superando el mes de almacenamiento). Como estndar se
emple el antibitico Curam de 250 mg / 5 mL, presentacin en polvo para suspensin
oral (cada mL de suspensin contiene en su mayora amoxicilina, con 12.5 mg de AC).
El AC fue analizado por HPLC (Agilent Technologies Series 1200) equipado con detector
UV/VIS con arreglo de diodos, DAD, con una columna analtica de 5 m, ZORBAX
141
Eclipse XDB-C18 de 4.6 x 150 mm, una fase mvil compuesta por una solucin de 94 %
v/v de KH2PO4 (50 mM, pH 3.2) y 6% v/v de metanol, a un flujo de 1 mL min-1. El AC
derivatizado se detect a 311 nm [13].
Determinacin de glicerol: El GLC fue analizado por HPLC (Agilent Technologies Series
1200, detector: RID a 30C), operado con columna de 9 m, SUPELCOGEL C-610H, 30
cm x 7.8 mm, una fase mvil compuesta por cido sulfrico 5mM, una T de 80 C y un
flujo de 1.2 mL min-1[14]. Como estndar se emple glicerina al 99.5%.
Determinacin de aminocidos: Los AAs fueron analizados por HPLC (Agilent
Technologies Series 1200, con detector UV/VIS con arreglo de diodos DAD); operado con
columna analtica de 5 m, ZORBAX Eclipse AAA - C18, 4.6 x 150 mm, una fase mvil
en forma de gradiente preparada por bomba cuaternaria al mezclar las soluciones agua,
metanol, acetonitrilo y 40 mM Buffer NaH2PO4, ajustado el pH a 7.8 con solucin de
NaOH (10N), una temperatura de 40 C y un flujo de 2 mL min-1.
Previo a los anlisis la muestra de AAs fue derivatizada en lnea usando O-ftalaldehdo
(OPA) para amino cidos primarios y 9-fluorenil-metil-oxi-carbonilo (FMOC) para amino
cidos secundarios (prolina, iminocido). Los primarios son detectados a 338 nm y los
secundarios a 262 nm. La prolina por ser un iminocido no reacciona con el OPA pero si
con el FMOC. La recta de calibracin se elabor empleando una mezcla de estndares de
AA entre 90 y 900 pmol L-1 de Agilent Technologies [15]. Los AAs analizados
corresponden a VA, TRP, PHE, ISOLEU, PRO, ASN, GLN, GLY y THR presentes en el
sobrenadante de la muestras tomadas para anlisis de AC.
Determinacin de fosfatos: El fosfato se determin por colorimetra empleando un
espectrofotmetro Helios alfa. La reaccin de 1 mL de sobrenadante con 1 ml de mezcla

142
reaccionante produce un complejo de color azul intenso, fosfomolibdeno, que se detecta a
828 nm. La mezcla reaccionante est compuesta de 1 mL de H2SO4 6 N, 2 mL de agua
destilada, 1 mL de molibdato de amonio al 2.5% y 1 mL de cido ascrbico al 10%. La
calibracin se realiz en un rango de 0 a 8 mg L-1 de PO4 [16].
Determinacin de consumo de oxgeno: Para determinar la velocidad de consumo de
oxgeno (OUR) en el biorreactor con 1 L de volumen de operacin, se emple la tcnica
dinmica [17], a 1 vvm, 500 rpm y a una concentracin celular de 7 g L-1. Para monitorear
la concentracin de oxgeno disuelto (OD) se emple un electrodo de oxgeno (electrodo
polarogrfico Clark Inpro6800G, Mettler, Toledo, USA). El valor del OUR se corrigi
teniendo en cuenta el tiempo de respuesta del electrodo de 18 s [18].
4.2.4. Planteamiento de la red metablica.

El modelo metablico estequiomtrico empleado en el presente captulo consisti de 60
reacciones que involucran 47 metabolitos. Estas reacciones se presentan en el apndice A1
y un esquema de ellas se presenta en la figura 4.2.
El modelo toma en consideracin las reacciones que involucran el MCC (gluconeognesis,
ruta de la pentosa fosfato (PP) y ciclo de Krebs comn en la mayora de Streptomyces sp
[19]; tambin se tuvo en cuenta la biosntesis de todos los precursores involucrados en la
produccin de biomasa [10], el ciclo de la urea [9, 20-21] y biosntesis de AC [20]. Las
rutas correspondientes a Entner-Doudoroff y glioxilato no se consideraron ya que no son
comunes para la gran mayora de Streptomyces sp [9, 22]. Adems de la informacin
obtenida de la literatura, se utilizaron las bases de datos The Kyoto Encyclopedia of Genes
and Genomes KEGG (www.genome.org/kegg).
143
AC GCL
CO2
G6P R5P 37
34 35 36
NADPH(NADH) + ADP X5P RIB5P
AC GLC
1
F6P 39
E4P
NADP(NAD) + ATP
SUC, UREA, 33 40
CO2, NH4 GAP SED7P
aKG, 02 2 38
43 GLY
NADPH 3 3PG
SER 44 CYS
4 7 8
PHE
ILE
NADH 9 TYR
26 PEP TRP
10 12 VAL
LYS THR CO2
PYR
13 ALA
MET 14
24
25 23 11 LEU
ASPSEMALD 6 ACCOA
FUM 22
ARG 19 15
20 ASP OAA
18
21
31 CO2
ASN FUM
17 TCA
SUC
ORNt 16 aKG
SUCCOA 42
UREA 28
GLU 27
3
0
29
MEMBRANA NH4
CELULAR GLN CITOPLAMA
PRO

NH4
MEDIO EXTRACELULAR
AAs O2 CO X
2
Figura 4. 2. Representacin esquemtica de la red bioqumica empleada para AFM en Sc.

i indica el flujo de cada reaccin y el subndice i se refiere a una reaccin especfica.
En el MCC, el NADPH es regenerado de NADP+ principalmente a travs de la ruta
oxidativa de pentosa fosfato (PP). En esta ruta, dos unidades de NADPH son generadas por
cada unidad de glucosa-6-fosfato por la accin de las enzimas glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa y 6-fosfogluconato deshidrogenasa. El NADPH es tambin regenerado por
la enzima isocitrato deshidrogenasa en el ciclo de Krebs y constituye el principal agente
reductor en la ruta de sntesis de antibiticos, especficamente del AC [23]. El sistema de
144
reacciones que conforman el modelo, considera tambin la presencia de la enzima
nicotinamida nucletido transhidrogenasa, la cual cataliza la reaccin reversible de
NADPH a NADH [9, 25]. La alta productividad de metabolitos secundarios es
principalmente determinada por la disponibilidad de precursores de biosntesis como
ACCOA y malonil-COA, los cuales son productos metablicos del MCC [26].
A continuacin se describen, de manera ms detallada, las diferentes vas involucradas en
el modelo metablico propuesto.
Gluconeognesis: Muchos actinomicetos tienen la capacidad de crecer en glicerol como
fuente de carbono, como es el caso de Streptomyces sp, y pueden convertir fructosa 1-6
fosfato a fructosa 6-fosfato, por la accin de la enzima fosfofructokinasa dependiente de
pirofosfato. La fructosa-6-fosfato es usada en la va de EMP (Embden-Meyerhof-Parnas).
Esta va incluye todas las reacciones de conversin de fructosa 6-fosfato a piruvato [23].
A partir de esta va se derivan las rutas de sntesis de los AAs SER, GLY, CYS, TRP,
TYR, PHE, VAL, ALA, LEU y precursores de biomasa.
Sntesis de biomasa: La reaccin estequiomtrica para la sntesis de biomasa de Sc se bas
en la composicin de la biomasa de E. coli. Esta misma ecuacin ha sido usada en modelos
metablicos de S. coelicolor [27] y de S. lividans [10].
Biosntesis de aminocidos: Los aminocidos considerados fueron aquellos involucrados en
la relacin estequiomtrica de biomasa [10], en el ciclo de la urea [9] y en la biosntesis de
producto (AC) [20].
Ciclo de la urea: Este ciclo tiene el papel de regulador del metabolismo de nitrgeno en
estas especies, y es esencial como intermediario en la generacin de ORN y ARG y de
precursores de la biosntesis de AC. En experimentos donde se emplearon compuestos
145
marcados isotpicamente se demostr que ORN era convertida a ARG (va una secuencia
de reacciones anlogas al ciclo de la urea) antes que esta fuera incorporada al AC [23].
Reportes de actividad arginasa en Sc sugiere la existencia del ciclo de la urea [24].
Biosntesis de AC: La produccin de AC conlleva varias etapas que unidas corresponden a
la reaccin v3 de la figura 4.2. Estas etapas son descritas en detalle en la seccin 2.2.8. La
reaccin de biosntesis de AC, (v3 de la Tabla A1 del apndice) involucra entonces GAP,
ARG, aKG, NADPH, O2 y ATP como sustratos y urea, CO2, NH4, SUC y AC, como
productos [20].
4.2.5. Anlisis de flujos metablicos y de sensibilidad.

En la figura 2.8 se presenta la metodologa empleada para llevar a cabo un AFM y en las
secciones 2.5.2.2.1 y 2.5.2.2.2 se describen en detalle los procedimientos para el clculo y
el anlisis de resultados. El proceso va desde la recopilacin de informacin para el
modelado metablico hasta el desarrollo matemtico necesario para hacer las respectivas
simulaciones y analizar la variacin de los flujos en el interior de la clula como resultado
de modificaciones o manipulaciones en el sistema.
El anlisis de DFM resultado del efecto de adicin de nutrientes al medio de cultivo, y de
trabajar a diferentes D, sobre la actividad metablica de Sc, se realiz mediante la
construccin y uso de un modelo matemtico que representa la actividad metablica de la
cepa.
El AFM es realizado empleando un modelo estequiomtrico en el que se incluyen las
reacciones ms representativas propuestas para la biosntesis de AC. Se realiza mediante
un balance de materia alrededor de los metabolitos presentes en el modelo estequiomtrico
146
sealado en la seccin 4.2.4 y se asume estado estacionario, lo cual permite obtener un
sistema de ecuaciones algebraicas lineales.
Dado que la matriz estequiomtrica en este captulo corresponde a las dimensiones (60 x
47), los grados de libertad son 13; as, para determinar el sistema se deben definir 13 flujos
dando una nica respuesta de DFM.
Para el anlisis de sensibilidad se seleccionaron los flujos medidos de los siguientes
metabolitos: GLC, O2, CO2, AC, NH4, X, ARG, GLU, SER, PHE, TYR, GLN, TRP,
VAL, ALA, LEU, ORN, ASN, CYS, MET, THR, LYS, PRO, ILE, GLY, OAA, PYR,
aKG y GAP, lo que da la posibilidad de seleccionar y hacer diferentes anlisis de
sensibilidad, considerando alguno de estos como sustratos o como producto. Algunos de
estos metabolitos seleccionados presentan una mayor conectividad (metabolitos presentes
en gran cantidad reacciones) con respecto a otros metabolitos intermediarios en el MCC
[25].
4.3. RESULTADOS Y DISCUSIN
4.3.1. Cultivos en biorreactor en lote y continuo, para la produccin

de AC.
En la figura 4.3 se presentan los resultados obtenidos durante el cultivo de Sc en medio
qumicamente definido. Se observa una fase de produccin de AC no asociada a la fase de
crecimiento que alcanza una mxima concentracin de 62.3 mg L-1, a las 72 h de cultivo. El
descenso en este valor despus de las 72 h se puede explicar por agotamiento de los
nutrientes, en especial de la FN, una justificacin puede ser que el AC por ser tan
inestable y contener N en su estructura, la Sc lo emplee como fuente alternativa de N [26].
Otra justificacin puede deberse a que este producto, en su forma natural, es qumicamente
147
inestable; ya se conoce a travs de algunos estudios cinticos, que hay unas velocidades de
produccin y de degradacin simultneas de AC, siendo en la idiofase ms alta la
produccin que la degradacin y en la trofofase estas se invierten, la velocidad de
degradacin es mayor que la velocidad de produccin, por lo que se nota el declive en la
curva cintica para la produccin de AC por parte de Sc [27]. De acuerdo con la cintica
observada se puede establecer que entre las 36 y 42 h, la ASN, que es la nica FN, se
encuentra en condiciones de limitacin y a las 48 h se ha consumido completamente.
Durante el tiempo de cultivo estudiado, no se observ limitacin de P ni de FC. El OD se
mantuvo a concentraciones superiores al 50% del valor se la saturacin (datos no
reportados).
24
60
20
Biomasa y sustratos (g L-1)
16 AC (mg L-1)
40
12
8 20
0 0
0 24 48 72 96
Tiempo (h)
Figura 4. 3. Cintica de fermentacin de S. clavuligerus en un biorreactor de 3L, Cultivo

en lote. OD superior al 50%, 500rpm, 28C, 1vvm, pH 7, medio qumicamente definido.
Los smbolos representan los datos experimentales. Smbolos: Glicerol (O), biomasa (),
cido clavulnico (), fosfato () y asparagina ().
148
El modelo que mejor se ajusta a los datos experimentales empleando el medio
qumicamente definido es el modelo cintico tipo Monod (menor error residual, 4% ). Los
valores de los parmetros del modelo se presentan en la Tabla 4.1.
Tabla 4.1. Parmetros del modelo cintico estimados con un 95% de nivel de confianza, que fueron
utilizados para la simulacin de la fermentacin de S. clavuligerus
Parmetros Valores estimados

mx (h-1) 0.041 0.005
Ks (g L-1) 0.12 0.01
Yxs (g g-1) 0.38 0.00
Yxp (g mg-1) 0.15 0.02
(mg g-1) 0.00015 0.00012
Kd (h-1) 0.0085 0.0004
El valor de velocidad especfica de crecimiento celular es del mismo orden que algunos de
los valores reportados en la bibliografa [9, 24] y el reportado en el captulo 3. El valor de
Ks, es menor que el obtenido en el captulo 3 y para ambos casos este valor bajo muestra la
afinidad del microorganismo por el sustrato. El valor de rendimiento de producto Yxp es
un orden de magnitud mayor que el obtenido en el medio complejo, correspondiente esto
con los bajos rendimientos de producto que se obtienen para un medio de cultivo de estas
caractersticas.
El parmetro cintico max es muy importante para establecer las condiciones de operacin
del proceso en modo continuo. Para trabajar en continuo la D debe ser inferior al 80% del
valor de la mxima velocidad especfica de crecimiento (max) obtenida en lote. De
149
acuerdo con la literatura, a menor D se obtiene mayor produccin de AC [9]. En estas
fermentaciones se obtuvo un agotamiento de nitrgeno despus de las 50 h de iniciado el
cultivo, en este tiempo no se encontr limitacin de P ni de GLC y se evidencia un
crecimiento exponencial de produccin de AC. Para iniciar los ensayos en modo continuo,
se puso en marcha un proceso en lote y se tom como base de tiempo para iniciar la
alimentacin de nutrientes y salida de productos un tiempo entre 40 y 48 h, tiempo en el
cual se presenta una desaceleracin de produccin de biomasa, agotamiento de la fuente de
nitrgeno y mxima produccin de AC, caractersticas estas dadas en cultivos de
metabolito secundarios.
En la Tabla 4.2 se muestran los resultados de los flujos medidos a las dos tasas de dilucin
evaluadas. Despus de alcanzar el estado estacionario, los valores obtenidos fueron
normalizados con respecto al flujo de glicerol a la mayor tasa de dilucin con dos
propsitos, uno mitigar errores de clculo y para facilitar la comparacin entre las dos
condiciones. Estos valores sern utilizados para determinar la DFM calculados.
De estos resultados se puede notar que al reducir la tasa de dilucin se obtiene una mayor
produccin de AC (dos veces), lo que correlaciona con observaciones hechas por otros
autores [9]. Tambin se observa que al reducir la tasa de dilucin se genera una mayor
demanda de glicerol y de oxgeno, y se incrementa la demanda de la FN (ASN).
La velocidades de sntesis de los AAs, en su mayora, fueron mayores a menor D, como es
el caso de PHE, TRP, ILE, ASN, GLY y ALA, correlacionando con una menor X, que pas
de 1.17 a 0.78 g L-1, cuando se cambi D, de 0.03 a 0.02 h-1.
150
Tabla 4. 2. Valores de flujos extracelulares medidos, obtenidos a dos tasas de dilucin.
Para efectos de AFM se seleccionaron los flujos normalizados.
TASA DILUCIN D (h-1)

flujos medidos 0.03 0.02
0.03 0.02
(mmolg-1h-1) sin normalizar normalizado
vGLC (1) 0.3522 0.6895 100 195.7
vPHE (7) 4.6 E-05 5.33 E-05 0.013 0.015
-05 -05
TYR (8) 7.21E 2.17 E 0.021 0.006
TRP (9) 0.0000 6.67 E-05 0.0000 0.0189
-05 -05
VAL (12) 8.2 E 8.33 E 0.0233 0.0237
ASN (21) 3.03E-07 2.5 E-04 8.59E-05 0.0710
-05 -05
ILE (26) 5.33E 7.33 E 0.0151 0.0208
PRO (29) 5.6 E-05 2.67 E-05 0.0159 0.0076
X (32) 1.17 0.78 332 221
O2 (41) 0.1740 0.2175 49.4 61.8
-05
GLY (43) 0.0000 8.33 E 0.0000 0.0237
NH4 (47) 0.06 0.05 17.2 14.2
-04
ALA (13) 1.7E 0.04827 0.000143 0.0406
4.3.2. Anlisis cuantitativo del comportamiento metablico intracelular.

El modelo estequiomtrico propuesto, mostrado en la figura 4.2 y apndice A1, presenta
un grupo de ecuaciones lineales independientes que conforman una matriz de 60 x 47, con
un nmero de condicin de 42, indicando que la matriz tiene baja sensibilidad a posibles
errores experimentales de los flujos medidos. Como se dispona de suficiente informacin
experimental para agotar los F, se trabaj un sistema determinado. Para la seleccin de los
flujos a medir se tuvo en cuenta el anlisis de sensibilidad aplicando la ecuacin (26)
(captulo 2).
En la tabla 4.3 se presentan los resultados obtenidos para el anlisis de sensibilidad del
modelo metablico con 13 flujos medidos, y en la tabla B1 del apndice B, se muestra un
anlisis de sensibilidad con 6 compuestos adicionales, considerndolos como posibles
151
flujos medidos. El anlisis de sensibilidad con estos compuestos adicionales se realiz con
el fin de determinar su efecto sobre el sistema metablico definido y adems determinar
cul matriz de flujos calculados presenta el menor nmero de condicin (ver Apndice B).
En la primera columna de la tabla 4.3 estn indicados los flujos a calcular y en la primera
fila los flujos propuestos a medir. Cada celda de la tabla muestra el efecto o la sensibilidad
de un flujo calculado con respecto a cambios en un flujo medido. Este coeficiente, permite
determinar cul de las perturbaciones generadas en los flujos medidos genera el cambio
ms significativo en los flujos calculados, o lo que es lo mismo, cul de los flujos
calculados presenta mayor sensibilidad a cambios finitos en los valores de los flujos
medidos. En la ltima fila de la tabla se presenta el efecto total de cada flujo medido sobre
el sistema metablico, es decir sobre todos los flujos calculados.
De los flujos medidos con los que se obtiene un menor nmero de condicin, los flujos de
PHE, ILE y TYR, son los que generan un mayor efecto sobre el sistema metablico
propuesto, alcanzando cuantitativamente un 55% del efecto global de todos los 13 flujos
medidos.
Sin embargo, con todos los flujos medidos y analizando su sensibilidad sobre el sistema,
(Tabla 4.3 y Tabla B1), se observa que el mayor efecto de un flujo sobre el sistema recae
152
Tabla 4. 3. Anlisis de sensibilidad para los flujos calculados (c) con respecto a
cambios en los flujos medidos (m). El nombre del flujo que se toma como medido est
en la fila superior y los resultados de los flujos calculados estn en la primera columna.
El valor de cada casilla corresponde al cociente d d .
C m
Flujos Sensibilidad de los flujos medidos

c PHE ILE TYR TRP VAL GLC PRO O2 X ALA ASN NH4 GLY
3PG (2) -3.6636 -2.6636 -3.1364 -1.6091 -1.5182 2.0818 -1.0727 -0.9455 -0.8307 -0.4727 -0.0091 -0.0273 0.0000
AC (3) -0.3273 -0.3273 -0.2727 -0.2182 -0.0364 0.1636 -0.1455 0.1091 -0.0984 0.0545 -0.0182 -0.0545 0.0000
PEP (4) -1.7545 -1.7545 -1.0455 -1.3364 0.0273 1.6273 0.1091 -0.5818 0.0438 0.7091 1.2636 -0.2091 0.0000
SER (5) -1.9091 -0.9091 -2.0909 -0.2727 -1.5455 0.4545 -1.1818 -0.3636 -0.8745 -1.1818 -1.2727 0.1818 0.0000
OAA (6) -0.3273 0.6727 -0.2727 -0.2182 -0.0364 0.1636 0.8545 0.1091 0.2416 0.0545 0.9818 -0.0545 0.0000
PYR (10) -3.4273 -2.4273 -2.7727 -3.1182 0.0636 1.4636 -0.7455 -0.6909 -0.2367 0.6545 0.2818 -0.1545 0.0000
ACCOA (11) -3.4273 -3.4273 -2.7727 -2.1182 -1.9364 1.4636 -0.7455 -0.6909 -0.4917 -0.3455 0.2818 -0.1545 0.0000
ALA (13) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000
LEU (14) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0650 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
aKG (15) -3.1000 -3.1000 -2.5000 -1.9000 -1.9000 1.3000 -0.6000 -0.8000 -0.6233 -0.4000 0.3000 -0.1000 0.0000
SUC (16) -1.7909 -1.7909 -1.4091 -1.0273 -1.7545 0.6455 -1.0182 -1.2364 -0.4356 -0.6182 0.3727 0.1182 0.0000
FUM (17) -2.7727 -2.7727 -2.2273 -1.6818 -1.8636 1.1364 -1.4545 -0.9091 -0.6619 -0.4545 0.3182 -0.0455 0.0000
OAA(TCA) (18) -1.5364 -2.5364 -0.8636 -2.1909 -1.2818 0.5182 -1.1273 -0.6545 -0.1709 -0.3273 -0.3909 0.8273 0.0000
ASP (19) 1.2364 1.2364 1.3636 -0.5091 0.5818 -0.6182 0.3273 0.2545 0.5840 0.1273 0.2909 0.8727 0.0000
ARG (20) 1.2364 0.2364 1.3636 -0.5091 0.5818 -0.6182 0.3273 0.2545 0.4910 0.1273 -0.7091 0.8727 0.0000
ASPSEMALD (22) 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0930 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
MET (23) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0190 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
THR (24) 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0240 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
LYS (25) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0500 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
GLU (27) -0.3273 0.6727 -0.2727 -1.2182 -0.0364 0.1636 -0.1455 0.1091 -0.3104 0.0545 -1.0182 0.9455 0.0000
ORN (27) -0.3273 -0.3273 -0.2727 -0.2182 -0.0364 0.1636 -0.1455 0.1091 -0.0984 0.0545 -0.0182 -0.0545 0.0000
GLN (30) 0.0000 0.0000 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0310 0.0000 1.0000 0.0000 0.0000
UREA (31) 1.5636 0.5636 1.6364 -0.2909 0.6182 -0.7818 0.4727 0.1455 0.5894 0.0727 -0.6909 0.9273 0.0000
GAP-F6P (33) 2.9909 2.9909 2.4091 1.8273 1.5545 -1.2455 1.2182 0.8364 0.7292 0.4182 0.0273 0.0818 0.0000
G6P (34) 7.9727 8.9727 6.2273 4.4818 4.6636 -3.7364 3.6545 2.5091 1.8325 1.2545 0.0818 0.2455 0.0000
R5P (35) 7.9727 8.9727 6.2273 4.4818 4.6636 -3.7364 3.6545 2.5091 1.8025 1.2545 0.0818 0.2455 0.0000
X5P (36) 4.9818 5.9818 3.8182 2.6545 3.1091 -2.4909 2.4364 1.6727 1.1143 0.8364 0.0545 0.1636 0.0000
RIB5P (37) 2.9909 2.9909 2.4091 1.8273 1.5545 -1.2455 1.2182 0.8364 0.6882 0.4182 0.0273 0.0818 0.0000
X5P-F6P (39) 1.9909 2.9909 1.4091 0.8273 1.5545 -1.2455 1.2182 0.8364 0.5392 0.4182 0.0273 0.0818 0.0000
E4P (40) 2.9909 2.9909 2.4091 1.8273 1.5545 -1.2455 1.2182 0.8364 0.5752 0.4182 0.0273 0.0818 0.0000
ATP (41) 1.3091 1.3091 1.0909 0.8727 0.1455 -0.6545 0.5818 0.5636 0.3937 -0.2182 0.0727 0.2182 0.0000
SED7P (38) 2.9909 2.9909 2.4091 1.8273 1.5545 -1.2455 1.2182 0.8364 0.5752 0.4182 0.0273 0.0818 0.0000
SUCCOA (42) -1.7909 -1.7909 -1.4091 -1.0273 -1.7545 0.6455 -1.0182 -1.2364 -0.3666 -0.6182 0.3727 0.1182 0.0000
CYS (44) -1.9091 -0.9091 -2.0909 -1.2727 -1.5455 0.4545 -1.1818 -0.3636 -0.8745 -1.1818 -1.2727 0.1818 -1.0000
NADH (45) 10.5364 9.5364 7.8636 6.1909 6.2818 -5.5182 4.1273 2.6545 2.2249 2.3273 1.3909 -0.8273 0.0000
Acumulado * 19.5885 19.9704 15.4284 11.7135 11.4679 9.4872 8.3402 5.8183 4.4421 4.0670 3.4122 2.2542 1.0000
* El acumulado corresponde a la sumatoria de la sensibilidad para cada flujo medido.
153
en el flujo del AC con un valor de sensibilidad de 77.64. La relativa alta sensibilidad del
sistema a cambios en el flujo de AC est ntimamente relacionada con su estequiometria
(involucra el 22% de los compuestos de todo el sistema). La sntesis de AC involucra
precursores C3 (GAP) y C5 (ARG), precursores energticos como ATP, NADPH,
intermediarios del metabolismo de los cidos tricarboxlicos (SUC y aKG). Siendo el
AC un metabolito secundario, su produccin est condicionada por la manera como se
distribuyen los diferentes flujos a lo largo del metabolismo central del carbono, el cual
contribuye a la sntesis de estos precursores
Dado que el fosfoenol piruvato, el piruvato y el oxaloacetato se derivan del metabolismo
central de carbono, y que estos son precursores directos de los aminocidos PHE, ILE y
TYR, es posible explicar el alto efecto en la sensibilidad del sistema al cambio de los
flujos de estos aminocidos. Es preciso resaltar el elevado nmero de metabolitos que
estn involucrados en las reacciones de sntesis de estos tres aminocidos (involucran
entre el 16-18% los compuestos de todo el sistema). Adicionalmente, algunos
investigadores han encontrado evidencia experimental de que estos tres aminocidos
muestran un alto coeficiente sensibilidad sobre el AC [9]. Estos mismos autores,
encontraron que los aminocidos ASP, GLU y ASN, no afectan sensiblemente la
produccin de AC, lo cual est en concordancia con los resultados de anlisis de
sensibilidad indicados en la Tabla B1.
Al realizar el anlisis de sensibilidad considerando los flujos de ARG y ORN como
medidos, se observa baja incidencia acumulada de los flujos calculados sobre el
sistema. Adicionalmente, se obtienen diferentes sensibilidades en el flujo calculado de
la urea, el cual es ms sensible y favorable al perturbar el flujo de ARG que el de ORN.
154
Al analizar la sensibilidad de la adicin de cualquiera de estos dos AAs, precursores
importantes y directos en la produccin de AC, se observa que la sensibilidad es baja, de
0.0727, lo que implica que a grandes cambios en los flujos de ARG u ORN se dan
pequeos cambios considerables en el flujo de AC. Sin embargo en diversos estudios se
ha considerado como estrategia para mejorar la produccin de AC, adicionar ARG y
ORN al cultivo en medios complejos, obtenindose mejores resultados al adicionar ORN
[14, 28]; igualmente, se ha evaluado la adicin de ORN o ARG a un medio
qumicamente definido, y se ha observado una mejora importante en la produccin
especfica de AC al adicionar ORN [9], mientras que la adicin de ARG no logra
mejoras en la produccin [24].
Era de esperarse que la perturbacin de flujos precursores en la formacin de
antibiticos pudiera repercutir de una manera significativa en la distribucin de flujos
anablicos orientados a la formacin de producto [25]. Sin embargo, de acuerdo con los
resultados obtenidos, se observa poca incidencia de algunos de estos flujos, tales como
PYR, aKG, OAA y GAP. As, es posible que existan otros factores alternos al
metabolismo, como el caso de las caractersticas cinticas de cada reaccin o
inhibiciones por sustrato o producto, las cuales no son tenidas en cuenta en el anlisis
de sensibilidad.
Al hacer un anlisis de los efectos individuales de la incidencia de perturbacin de los
flujos medidos sobre la distribucin de los flujos calculados, es posible identificar
perturbaciones en aquellos flujos especficos, factibles de vencer el umbral de
robustez, principalmente de la actividad catablica del metabolismo central. As por
ejemplo, para perturbaciones en los flujos de PHE, TYR y TRP, los flujos calculados
155
que ms se ven afectados son los flujos, 34, 35, 36 y 45. El 45 es el de mayor
incidencia positiva y corresponde a la reaccin de transhidrogenacin de NADPH a
NADH. Los flujos que le siguen en importancia son, 34, que corresponden a los flujos
de formacin de G6P a partir de F6P. El metabolito intermediario G6P fue propuesto
para estudio en S. coelicolor, por ser considerado un indicador muy sensible del inicio
de la limitacin de nutrientes, antes de cesar el crecimiento microbiano [25]. El 35,
relativo a la reaccin de formacin de R5P a partir de G6P, el cual corresponde a la
etapa de inicio de la ruta PP oxidativa, y el 36, flujo de formacin de X5P a partir de
R5P. Los coeficientes de sensibilidad para estos flujos son positivos, lo que implica que
un incremento en el flujo de precursores de PEP, genera un incremento global del flujo
en la ruta oxidativa PP. De otra parte, al analizar la sensibilidad para el flujo calculado
del producto AC, 3, se observa que los coeficientes son negativos, lo que indica que
para alcanzar una mayor produccin de AC se debe generar una reduccin en el flujo de
formacin de los AAs precursores de PEP. Es evidente entonces que un incremento en
el flujo de precursores de PEP promueve el crecimiento celular a partir del aumento en
el flujo de carbono a lo largo de la ruta oxidativa PP, y consecuentemente, se promueve
una disminucin en el carbono disponible para la generacin de producto; este aspecto
es consistente con lo reportado por otros autores en medio qumicamente definido [9],
pero no se cumple en el medio complejo empleando S. peucetius, donde hay otros
factores, tales como interaccin o efectos cruzados, ocasionados por la presencia de
varios AAs [29].
156
Perturbaciones en el flujo de precursores de OAA como los flujos de ASP, que a su vez
son precursores de ILEU y ASN, generan su mayor efecto en los flujos, 34, 35, 36
y 45. Al analizar la distribucin del PHE en un medio sin y con adicin de ILEU, se
encontr que el PHE se triplica por la presencia de ILE en el medio, indicando que la
presencia de ILE favorece la disponibilidad del metabolito PYR, el cual a su vez
favorece el PEP. Algunos autores encontraron una correlacin negativa con el AC al
comparar la produccin de AC en un medio basal con uno al que se le adiciona ILE [9];
esto concuerda con el anlisis de sensibilidad aqu presentado.
Perturbaciones en el flujo medido de ASN muestran que los flujos calculados que ms
se ven afectados son los flujos 5, 44 y 45. Al incrementar el ASN, incrementa el
45, transhidrogenacin (generacin de NADH) y presenta una disminucin en los 5,
44 que corresponden a los flujos de SER y CYS respectivamente. Tambin se observa
que con bajos flujos de ASN se estimula la produccin de AC. Bushell et al, (2006)
realizaron estudios en continuo comparando un medio basal con uno al que se le
adiciona ASN y encontraron que aumenta el x, pero el AC se mantiene y la
concentracin de AC como tal, disminuye en un 61% [9]; este efecto es observado
tambin en el anlisis de sensibilidad (ver figura 4.2).
Para perturbaciones en los flujos medidos de VAL y ALA, GLC y O2, los flujos
calculados que ms se ven afectados son los flujos 34, 35, 36 y 45, los mismos
flujos analizados para el caso de considerar el PHE como medido. Para el flujo medido
157
VAL se tiene una sensibilidad negativa con respecto al flujo calculado 3 (AC), mientras
que para la ALA esta sensibilidad es positiva, lo que implica que para promover la
produccin de AC se requiere una disminucin en las velocidades del flujo de VAL y
un aumento de ALA. En trabajos realizados en donde se compara un medio basal con
otro al que se alimenta VAL, se encontr que el flujo de AC increment un 45%, lo cual
pudo deberse al favorecimiento en la disponibilidad de PYR precursor anablico de la
sntesis de VAL, LEU y ALA [28]. Al comparar un medio basal con otro al que se
alimenta ARG o VAL result un incremento en la disponibilidad de glutamato [24],
pero ya se ha reportado que una mayor disponibilidad de este precursor (GLU) no
produce mejora en el flujo de AC [9]. La VAL favorece la biosntesis de antibiticos
como cefalosporina y penicilina [30]. El favorecimiento del flujo de AC al aumentar el
flujo de ALA puede estar dado por la produccin de aKG, intermediario en el ciclo de
Krebs, anablico, ms que por la ALA, que por s sola es precursor de otros
antibiticos. La regulacin de los iones amonio ejerce un control negativo sobre la
formacin de antibiticos -lactmicos en casi todos los microrganismos que los
producen [31]. La ALA tambin parece jugar un papel importante en la inhibicin de la
actividad de la cefalosporina sintasa [3], hecho que favorecer la sntesis de AC.
Para perturbaciones en un incremento en el flujo medido de GLY, precursor de 3-
fosfoglicerato, el nico flujo calculado que se ve afectado es el 44, la disminucin del
GLY favorece el CYS, mientras el aumento o disminucin de este flujo no afecta el
AC, segn la estequiometria planteada. Se tiene adems que con disminuciones en el
GLC se puede lograr un aumento en los flujos en la va PP y en el flujo de
158
transhidrogenacin (generacin de NADH). Por el contrario, al analizar la sensibilidad
para el flujo 3 (AC), se observa que es positivo, lo que implica que para promover la
produccin de AC se debe estimular el consumo de GLC (aumentar GLC). En una
investigacin realizada, donde se vari la concentracin de GLC para ver su efecto
sobre la produccin de antibiticos, empleando cepas mutantes; los autores encontraron
que todas las especies crecan en ausencia de GLC, sin embargo, si ste estaba presente,
su crecimiento aumentaba al doble, aproximadamente. Por otro lado, investigaciones
donde se compararon cultivos continuos empleando un medio de alimentacin con y
sin glicerol, encontraron que bajo limitacin se ve afectada la va anaplertica,
minimizando el potencial hacia el ciclo de Krebs, e inhibiendo la sntesis de AC,
mientras que la produccin de biomasa se obtuvo hasta en ausencia de GLC [8].
Por otro lado, un aumento en el flujo de consumo de O2 favorece el aumento en los
flujos de la va PP y en el flujo de transhidrogenacin (generacin de NADH). En el
anlisis de sensibilidad la velocidad de consumo de O2 no se encontr como uno de los
flujos medidos dominantes. En investigaciones realizadas con variacin de O2,
encontraron que al aumentar la velocidad de produccin de biomasa, aumentaba la
velocidad de consumo de oxgeno en el medio, pero la relacin con la formacin de
producto, AC, fue inversa, demostrando esto que aparte de la relacin estequiomtrica
hay otros factores como las caractersticas cinticas que afectan el proceso metablico
que en este primer anlisis no se tienen en cuenta [9].
Para perturbaciones en el flujo medido de NH4., los flujos calculados que ms se ven
afectados son los flujos 27 y 31 correspondientes a los flujos de glutamato y de
159
urea, respectivamente. Un aumento en el NH4 ocasiona una disminucin en el AC.
En algunos trabajos se ha estudiado el efecto de la concentracin de amonio sobre la
produccin de AC y se ha demostrado que este puede ser un represor del crecimiento a
ciertas concentraciones [24]. Los iones amonio ejercen un control negativo sobre la
formacin de antibiticos en virtud de los organismos que lo producen [32].
Finalmente, para perturbaciones en el flujo medido de X, los flujos calculados que ms
se ven afectados son los flujos 34, 35, 36 y 45. Se tiene que con un aumento en el
flujo de generacin de X se puede lograr un aumento en los flujos en la va PP y en el
flujo de transhidrogenacin. Este flujo presenta una relacin inversa con respecto al
flujo calculado del producto AC, 3, lo cual est en concordancia con lo reportado [9];
igualmente, esta relacin inversa se encontr en el caso de la produccin del antibitico
actinorrodina a partir de S. coelicolor [33].
En general, pueden considerarse vlidas las conclusiones obtenidas usando una red
metablica tan limitada en el nmero de reacciones, ya que los resultados obtenidos por
las simulaciones en su gran mayora son confirmados con muchas de las observaciones
realizadas experimentalmente sin tener en cuenta este tipo de anlisis apoyados en AFM.
4.3.3. Anlisis de la distribucin de flujos metablicos en Sc.
El modelo estequiomtrico propuesto, mostrado en la figura 4.2 y apndice A1, presenta
un grupo de ecuaciones lineales independientes, matriz (60 x 47), cuyo grado de
libertad es de 13. Los valores medidos para el anlisis de flujo metablico se presentan
en la tabla 4.2; el sistema se resolvi empleando la ecuacin (3) para determinar la
distribucin de flujos de la red metablica, al comparar procesos llevados a cabo a dos
160
D. La distribucin de los flujos se presenta de manera resumida en la figura 4.5; se
incluyen en ella los compuestos de mayor importancia en la biosntesis de AC, teniendo
en cuenta las reacciones de mayor incidencia en el sistema, de acuerdo con el anlisis de
sensibilidad.
Para realizar el AFM se tuvieron en cuenta los resultados obtenidos en el anlisis de
sensibilidad, incluyndose como flujos medidos a los flujos de mayor incidencia en los
sistemas PHE, ILE y TYR, que estn incluidos en la tabla 4.2, y cuyas reacciones
estequiomtricas se presentan en la tabla 4.4.
Los flujos de mayor efecto sobre el modelo metablico obtenidos en el AFM a las dos
D, corresponden a: i) fosforilacin oxidativa, 41, ii) flujo de transhidrogenacin, 45,
iii) flujo de pentosa fosfato oxidativa, 35, iv) los flujos presentes en la ruta glicoltica
(EMP), 33 y en la ruta del ciclo de Krebs, 15, vi) flujo de biomasa, 32 y vii) flujo
de AC, 3.
Al incrementar la D de 0.02 a 0.03 h-1, se observa un significativo incremento en los
flujos de la fosforilacin oxidativa, va PP y transhidrogenacin. A menor D los tres
flujos funcionan en sentido inverso, y, en el caso de la va PP, favorece la formacin de
GAP, precursor del metabolismo de sntesis de AC.
Los resultados mostrados en la figura 4.4 indican que bajas D favorecen la velocidad de
formacin AC (3) lo cual coincide con una reduccin en la velocidad de formacin de
biomasa (32). Este comportamiento es tpico de la produccin de antibiticos.
161
Tabla 4. 4. Reacciones que corresponden a los flujos medidos de mayor
incidencia en el sistema, de acuerdo con el anlisis de sensibilidad.
flujos a Reaccin estequiomtrica Valores de

analizar sensibilidad
referidos a AC
AC 4 O2 + GAP + 3 aKG + ARG + 2 NADPH + ATP ==>AC +NH4 + UREA + 3 CO2 1

+ 3 SUC
PHE 2 PEP + GLU+ NADPH + ATP+ E4P<==>PHE + CO2 + aKG -0.3273
TYR 2 PEP + GLU+ NADPH + ATP+ E4P <==>TYR + CO2 + aKG + NADH -0.2727
ILE * PYR + GLU + 3NADPH + 2ATP+ASP <==>ILE + CO2 + aKG + NH4 -0.3273
LYS* PYR + GLU+ 2NADPH + ATP + ASP + SUCCOA<==>LYS +CO2+aKG + SUC 0.2182
*
Corresponde a las reacciones netas de ILE (suma de reacciones de biosntesis de ASPSEMALD, THR e
ILE, equivalente a las reacciones 22, 24 y 26, respectivamente) y de LYS (suma de reacciones de
biosntesis ASPSEMALD y LYS que corresponden a 22 y 25, respectivamente).
Al reducir la tasa de dilucin, se observan tambin mayores valores en algunos flujos de
la va glicoltica como son 3PG, PEP y PYR que generan una mayor disponibilidad de
carbono en el MCC. El flujo anaplertico (6), se encuentra muy activo en ambas D,
siendo ste el que logra promover la actividad metablica en el ciclo de Krebs, ms que
el 11, que es la va principal de flujo de carbono. En la figura 4.4 tambin se observa
que hay un gasto de PYR, a la D ms alta, orientado hacia otros metabolitos como X,
LYS, ILE, LEU, ALA y VAL, lo que ocasiona una restriccin en el flujo de carbono
hacia el ciclo de Krebs, dando lugar a una limitacin en los precursores OAA y aKG.
162
NADPH(NADH)
G6P R5P

GLC
RIB5P

F6P

NADP(NAD) + ATP

GAP
CA

NADPH
3PG
PHE

NADH
PEP
TYR

LYS

PYR
X
ASPSEMALD
ACCOA

ARG
ASP OAA

16

129 TCA
SUCCOA

ORN aKG

16.2 GLU

-11.9

Figura 4. 4. Distribucin de flujos metablicos de la produccin de AC a partir

de Streptomyces clavuligerus (Sc). Los valores de los flujos correspondientes a
la tasa de dilucin 0.02 h-1 se nuestra en la parte superior de cada flujo, y los
correspondientes a la tasa 0.03 h-1 en la parte inferior. Las siglas se presentan
en la lista de abreviaciones.
El aKG es precursor de GLU el cual favorece la biosntesis de ORN; los flujos en esta
direccin aumentan al aumentar la D, mientras que se observa un efecto inverso a
menores tasas de dilucin. El rol de GAP, PEP y PYR, en la sntesis de AC ha sido
ampliamente discutido por diversos autores [9, 24]. Los altos flujos de estos
intermediarios del metabolismo glicoltico generan altos flujos de carbono en el ciclo de
Krebs, necesarios para la posterior formacin ARG como precursor de AC.
163
Un aspecto difcil de establecer a la luz de los resultados, es la generacin de ATP en
concentracin suficiente para mantener activa la red metablica completa [28]. En los
resultados mostrados en la figura 4.5, se observa una relacin inversa entre el flujo de
ATP y el de AC, lo cual est de acuerdo con las reacciones establecidas en la tabla 4.3,
en donde el ATP debe estar disponible como sustrato mientras que el AC est disponible
como producto. Lo anterior es consistente con lo observado en otros trabajos, donde en
cultivos de S. lividans, se encontr una relacin inversa entre la presencia de ATP
intracelular y la acumulacin de antibiticos [34].
Los valores de los flujos obtenidos para ORN y AC, a las D evaluadas, fueron iguales
(figura 4.4) por lo que se puede inferir que el flujo de ORN, ms que el de ARG, es
limitante para la biosntesis de AC. Esto se observa claramente a la mayor D, en donde
a pesar de estar disponible el precursor de ARG y haber limitacin del flujo de ORN, no
se vio favorecida la biosntesis de AC. Ya en trabajos previos, otros autores haban
reportado que el simple aumento en los niveles de acumulacin de ARG, no conduca
de manera directa a la mayor produccin de AC [14, 24].
4.4. CONCLUSIONES
A partir de la combinacin de un anlisis de sensibilidad y de flujo metablico, fue
posible establecer la incidencia de la velocidad de formacin de diversos flujos de
aminocidos y/o productos metablicos, sobre la distribucin de flujos metablicos
dirigidos a la formacin de cido clavulnico, a partir de Streptomyces clavuligerus. El
sistema celular fue representado a partir de una modelo matemtico que consideraba 60
reacciones bioqumicas, representativas de las capacidades metablicas de Streptomyces
clavuligerus.
164
De manera general se observ que, para lograr altos rendimientos en la formacin de
AC, se debe garantizar una buena disponibilidad de los flujos de los metabolitos
intermediarios, GAP, PEP, PYR, OAA y ORN. Para la red metablica propuesta se
encontr que los flujos metablicos medidos que ms afectan el sistema celular son los
flujos de PHE, TYR, ILE. A su vez, los flujos calculados que ms se ven afectados por
los flujos medidos corresponden a los flujos generadores de NADPH, tanto por la va
oxidativa de la pentosa fosfato, como por la reaccin de transhidrogenacin de NADPH.
A partir del anlisis de sensibilidad, tambin fue posible observar que a pesar de ser
algunos compuestos puntos nodales de mucha conectividad en la red metablica
propuesta (OXA, aKG, GAP, ARG, ORN y ASP) no constituyen etapas
significativamente incidentes en la distribucin del flujo de carbono, durante el proceso
de sntesis de AC. Finalmente, se encontr que el flujo de la ornitina, ms que el flujo de
arginina, afecta directamente la biosntesis de AC, dejando ver la importancia del control
del flujo de carbono a travs del ciclo de la urea, en la biosntesis de AC.
165
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168
CAPITULO 5
ANLISIS DE BALANCE DE FLUJOS (FBA) EN LA

PRODUCCIN DE AC EN Streptomyces clavuligerus.
El Anlisis de Balances de flujos (FBA) es una herramienta que facilita el estudio de
procesos metablicos permitiendo proponer estrategias para el mejoramiento de la
produccin de metabolitos en biotecnologa. Se emple FBA para analizar la red
metablica estequiomtrica correspondiente a Sc, que tiene en cuenta las reacciones ms
representativas que involucran catabolismo y anabolismo en la biosntesis de AC a partir
de Sc. Se emple la teora de optimizacin para cuantificar todos los flujos y as poder
entender las limitaciones que tiene la clula impuestas por su estequiometria, adems de
entender como influye el flujo a travs de cada ruta en el comportamiento global del
metabolismo. La solucin matemtica del modelo metablico se realiz aplicando
criterios de maximizacin de tres funciones objetivo (FOBJ): la velocidad especfica de
crecimiento, los requerimientos de energa como ATP y formacin de producto. Se
observ que la maximizacin de ATP, muestra la mejor aproximacin del modelo
metablico a valores experimentales. Posteriormente se emple FBA con maximizacin
de ATP como objetivo celular para predecir bajo condiciones de limitacin de nutrientes
(glicerol, amonio, oxgeno y fosfato) el efecto sobre las velocidades especficas de
crecimiento y de produccin de AC especficas. Con los resultados obtenidos bajo las
limitaciones de nutrientes se puede inferir que las condiciones de limitacin de amonio y
de fosfato son las que ms favorecen la biosntesis de AC, y mientras que los flujos
169
internos que ms afectan la biosntesis de AC por la limitacin de los nutrientes
(concentraciones en el medio de C, N, P y O2 en cantidades menores a las requeridas por
la clula para su mantenimiento) son los flujos ORN y el flujo que alimenta al ciclo de
Krebs, 12.
5.1. INTRODUCCIN
Una de las herramientas fundamentales en IM es el anlisis de balances de flujos
(FBA), con el cual se logra determinar una DFM en una clula y su anlisis permite
entender el comportamiento metablico del microorganismo en funcin del inters
deseado para la sntesis de metabolitos, eliminacin de subproductos entre otros. En los
ltimos aos se ha logrado un incremento en el desarrollo de la metodologa FBA a nivel
experimental, con la incorporacin de tcnicas de anlisis para detectar marcadores
isotpicos por GC-MS o NMR, y a nivel computacional como el uso de software para
analizar redes metablicas extensas y algoritmos matemticos mejorados [1-2]. Existen
pocos trabajos en los cuales se ha aplicado modelado metablico con el objetivo de
incrementar la produccin de AC [3- 4].
La descripcin del metabolismo se representa por un modelo estequiomtrico que puede
incluir varios cientos de reacciones. Estas reacciones implican una serie de restricciones
al comportamiento celular y cada una de ellas representa un flujo metablico activo.
Es por esto que un entendimiento de la estequiometria es crucial para identificar y
caracterizar el comportamiento celular a nivel de la distribucin de los flujos
metablicos. Cuando la clula crece en un medio de cultivo definido, la metodologa
FBA tambin permite evaluar cmo la adicin o remocin de nutrientes puede afectar la
170
DFM y con esto, la sntesis de metabolitos de inters. La estrategia para realizar esta
prediccin parte de la identificacin de la red metablica de la clula del
microorganismo de inters, la cual es normalmente muy grande y contiene ms
metabolitos que reacciones estequiomtricas. Para la determinacin de los flujos
metablicos del modelo metablico propuesto se requiere la medicin experimental de
algunos flujos para agotar los grados de libertad del sistema. Sin embargo a menudo esto
no es posible, con lo que el sistema se torna subdeterminado requiriendo para su
solucin tcnicas de optimizacin. Los mtodos matemticos de optimizacin se
emplean para maximizar o minimizar una FOBJ biolgica, permitiendo as la obtencin
de los flujos metablicos del modelo. La identificacin de un modelo metablico
subdeterminado y su solucin con estrategias de optimizacin, se conoce como anlisis
de balance de flujo (FBA-flux Balance Analysis) [5].
Existen varios trabajos reportados en la literatura aplicando FBA tendientes a identificar
condiciones de alta produccin de antibiticos con cepas del gnero Streptomyces. En
estos trabajos se han evaluado estrategias para la formulacin de medios de cultivo,
resolviendo el modelo con funciones objetivo basadas en el crecimiento de la biomasa
bacteriana [6-7].
Se han realizado estudios con FBA para evaluar los efectos del cambio en la FC y en los
AAs (GLU, ASP, THR y ARG), que permitieron encontrar condiciones ptimas para
incrementar el rendimiento del producto de inters [3, 6, 8]. Estos estudios se basaron en
el empleo de una FOBJ basada en el crecimiento de la biomasa
La funcin objetivo a ser optimizada (maximizada o minimizada) en el sistema, el
modelo de reacciones estequiomtricas que describen el metabolismo y la definicin de
171
algunos flujos medidos, como el flujo de carbono y de producto de inters por ejemplo,
son restricciones que limitan el espacio de solucin del sistema para encontrar un ptimo
[2, 6]. La FOBJ que ms ha sido empleada para estudios con FBA es la tasa de
crecimiento especfico, lo cual es consistente con la ventaja evolutiva de las especies de
rpido crecimiento. La funcin objetivo de biomasa se define como una ecuacin
estequiomtrica a partir de la las macromolculas que la componen, generando tambin
una demanda metablica de metabolitos para el crecimiento [2]. Otras FOBJ que han
sido consideradas para el anlisis del metabolismo de Streptomyces por FBA han sido la
produccin de ATP [6- 7] y la formacin de producto de inters [9-10].
Este trabajo pretende evaluar el efecto de la variacin de los flujos de las fuentes de C,
N, P, O2, sobre las velocidades de crecimiento de Sc y la produccin de AC empleando
FBA con el fin de identificar condiciones de cultivo adecuadas aplicables a escala de
laboratorio. Para realizar el FBA, previamente se evaluaron tres FOBJ metablicas
(produccin de biomasa, de energa (ATP) y formacin de AC) con el fin de seleccionar
la que permita alcanzar resultados ms ajustados respecto de valores experimentales
tomados de la bibliografa.
5.2. METODOLOGA:
5.2.1. Planteamiento de la red metablica.

El modelo metablico estequiomtrico empleado en el presente trabajo consisti de 100
reacciones que involucraban 92 metabolitos [11]. Estas reacciones se presentan en el
apndice A1 y una representacin sinttica a modo de mapa metablico se presenta en la
figura 5.1. Para este caso no se consideraron las reacciones de transporte de
aminocidos.
172
ACext GCLext
97
,N
H4 98 GCL
3 17 CO2,NADPH HIS
O2
,C R5P aKG
EA GCL3P G6P
UR
SU
C, AC 4 5 GLITEICH
X5P RiB5P
GLN
PRPP
6
7 F16P
84
DHAP GL
CDP, F6P N
E4P GL ,
aKG, CO2 CTP AS Y,
NADPH,ATP P\
CO
GLITEICH ISOPP 2
CO2
GAP SED7P
FU
9
GLU
NADH NADPPH AICAR

GLY, METHF ASP, GLN
ADP
3PG SER CYS GLU
ILE 2METBUTCOA
10
CO2, GAP,GLU,PYR
26
TRP
GTP
P RPP ,CO2
ATPEXT ATP
ME GLN, aK G
AKMETVAL GLU
27 E4P TYR
CHOR
24 THR
HOMCYS PEP GLU
aKG,C PHE
dGTP
MK9H NADH 90
aKG ALA
O2
28 LYS HSER CO2 G

PYR
L U GLU aKG
aKI VAL
CO2, NA
NADPH CO2 DH aIPM
23 11
3METBUTCOA
ASPSEMALD LEU
ACCOA
ARG
45
NAG1P
Fu
40 44
3M
39
E TB
UT
SUC
C ASP OAA
CO
A
ARG
93 UTP NH4
91 12 CO2, NADH
CITRU MAL
38 CARBP
ASN
LLDIAPIM
16
FUM TCA
ORN GLN
15
37 CO2
SUC
aKG
UREA
36
14 OA
UCS
C
13
NADH
NADPH 29 CO2
GLU
CITOPLASMA
NA
30
DP
NH4 , NADPH

aKG, NADPH
H
PRO
85
GLN
96 2 1 100
NH4 O2 CO2 X PO4
MEDIO EXTRACELULAR
Figura 5.1. Representacin sinttica de la red bioqumica empleada para modelado

metablico en Sc. vi indica el flujo de cada reaccin y el subndice i se refiere a una
reaccin especfica
.
173
El modelo tiene en consideracin las reacciones del modelo planteado en el captulo 4, a
excepcin de la reaccin de biomasa. La reaccin de sntesis de biomasa empleada para FBA
es propia para Sc, y se cuenta con informacin acerca de su composicin macromolecular.
Adems se describen ms reacciones de sntesis de aminocidos, se detallan ms las
reacciones involucradas en el ciclo de la urea y que conectan el ciclo de la urea con el ciclo de
Krebs. La gluconeognesis involucra las reacciones en el MCC que corresponden a los flujos
5 a 10 y 90. La va PP involucra los flujos 17 a 22 y el ciclo de Krebs involucra los
flujos 12 a 16 y 91 comn en la mayora de Streptomyces sp [12]. Tambin se tuvo en
cuenta la biosntesis de todos los precursores involucrados en la produccin de biomasa de Sc
(85) [11-12], el ciclo de la urea (38 a 40 y 93) [3, 13] y biosntesis de AC (84) [14].
A continuacin se describen las reacciones metablicas que fueron incorporadas al modelo y

que no estn incluidas en el modelo propuesto en el captulo 4.
Sntesis de biomasa: La reaccin estequiomtrica para la sntesis de biomasa de Sc se bas en
su contenido macromolecular el cual est representado en la siguiente ecuacin
estequiomtrica [10]:
= 0.075CARBO + 0.01 DNA + 0.065 GLYTEICH + 0.15 LIPID + 0.1 PEPGLY + 0.5 PROTEIN + 0.1 RNA
Teniendo en cuenta la reaccin de sntesis de cada contenido macromolecular se genera la
ecuacin de biosntesis de biomasa representada por la reaccin 85 del Apndice A1.
La composicin elemental de la biomasa de Sc para los elementos C, H, N, O y P, est dada
por CH1.77N0.22O0.51P0.02 (PM 25.68 g mol-1) [8].
Biosntesis de aminocidos: Los aminocidos considerados en el modelo metablico fueron
todos aquellos involucrados en la relacin estequiomtrica de biomasa [11], en el ciclo de la
174
urea [11] y en la biosntesis AC [14] y en la va de la PP [11,14].
Ciclo de la urea: Adems de los metabolitos que se tuvieron en cuenta en el modelo del
captulo 4, se tuvo en cuenta la sntesis de carbamoil fosfato y sntesis de sus precursores [11,
14].
Requerimientos de energa: Los cofactores moleculares ATP, NADH, NADPH, son
indispensables, debido a su importancia en la reacciones de abastecimiento energtico y como
puntos de interconexin entre las reacciones del catabolismo y anabolismo. Las reacciones de
abastecimiento energtico tienen como propsito, generar energa libre de Gibbs,
principalmente en forma de ATP, y generar poder reductor (o equivalentes de reduccin),
principalmente en forma del cofactor NADPH, el cual es requerido en las reacciones
biosntesis y para formacin de metabolitos precursores en la biosntesis de biomasa [15].
Para el modelo metablico se consideraron adems otras reacciones de biosntesis de
nucletidos y los componentes de energa de polimerizacin para construccin de bloques
(reacciones 24, 25, 63 a 71, 77, 79, 87 y 88) [11]. Un mayor detalle de estas
reacciones se puede encontrar en: (http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-2105-1-1-
s2.pdf).
5.2.2. Anlisis de balances de flujos metablicos (FBA).
La matriz estequiomtrica empleada en este captulo corresponde a las dimensiones (100 x
91), con 8 grados de libertad. Para lograr que el sistema quede determinado se deben medir
experimentalmente 8 flujos metablicos. En este captulo, se aborda un anlisis del efecto de
algunos flujos de nutrientes esenciales para el microorganismo y por esto se requiere permitir
175
que el sistema tenga libertad para evaluar soluciones posibles a estas restricciones, y esto no es
posible cuando el sistema est completamente determinado. Para este caso se plantea entonces
un sistema subdeterminado con tres restricciones de flujos. El sistema se puede resolver por
programacin lineal definiendo una funcin objetivo de optimizacin.
En la figura 2.13 se presenta la metodologa empleada para llevar a cabo un FBA y en la
seccin 2.5.3.3.1 se describen en detalle los procedimientos para los clculos y los anlisis.
El proceso va desde la recopilacin de informacin para el modelado metablico hasta el
desarrollo matemtico necesario para hacer las respectivas simulaciones y analizar la
variacin de los flujos en el interior de la clula como resultado de modificaciones en el
sistema.
5.2.3. Evaluacin de la funcin objetivo (FOBJ):
Se evaluaron tres FOBJ maximizar flujo de ATP (FBA-ATP), maximizar flujo especfico de
biomasa (FBA-) y maximizar flujo de AC (FBA-AC). El criterio para seleccionar estas
funciones objetivo se presentan en detalles en la seccin 2.5.3.3.2. La maximizacin de
cualquiera de estas funciones objetivo es una buena consideracin para la produccin de
antibiticos de Streptomyces, ya que hay buena similitud entre los resultados experimentales
con los simulados.
De los resultados obtenidos de la modelacin en el captulo 4, se obtuvo que las los flujos de
mayor incidencia en el metabolismo celular involucran NADPH y ATP como sustratos, se
espera que al tener la clula suficiente energa en esta forma, se pueda favorecer la sntesis de
AC. La funcin objetivo biomasa es interesante por tener involucrada en su sntesis gran
cantidad de componentes del MCC y de reacciones de sntesis de macromolculas y sus
precursores, como se observa en el mapa metablico en la figura 5.1.
176
Los valores de los flujos medidos que se tuvieron en cuenta para resolver los problemas de
optimizacin fueron los reportados en la literatura a una D de 0.03 h-1, en la tabla 5.1 se
presentan los flujos medidos experimentalmente, unos corresponden a los datos de entrada
para la simulacin (flujos de entrada) , estn descritos como Simulacin de FBA y los otros
flujos medidos se emplean para los clculos de error descritos como Validacin de FBA.
Adems de los flujos medidos GLC, O2 y NH4, se tuvo como restriccin la matriz
estequiomtrica. Al medir el flujo de GLC, ste valor de flujo debe orientarse en su mayora
a travs del MCC hacia producto y al medir el flujo de O2, en el metabolismo queda
restringido el crecimiento microbiano. En todos los casos, los flujos medidos que se dejan
libres para ser calculados por FBA (flujos de CO2, AC, ) sirvieron para calcular la medida
del error y probar el desempeo de cada funcin objetivo sin exceso de informacin,
permitiendo de esta manera obtener una buena representacin matemtica del objetivo celular
[16].
Tabla 5.1. Flujos medidos a una D de 0.03 h-1 [3]. Se emplearon para FBA considerando
como funcin objetivo, maximizar biomasa, ATP o AC.
Flujos (mmol gx-1h-1) vGLC (97) NH4 (96) O2 (2) CO2 (1) (85) (h-1) AC (98)
Simulacin de FBA 4.89 1.16 12.81
Validacin de FBA 8.86 0.03 0.0016
Evaluacin del error en el ajuste del modelo:

Con el fin de evaluar cual funcin objetivo predice mejor el comportamiento celular en el
FBA, en cuanto a la exactitud de las predicciones obtenidas, se emple el clculo del error en
la prediccin de la tasa especfica de crecimiento y el error en la prediccin de los flujos de
intercambio para los cuales se conoca el valor experimental.
177
El error en la prediccin de la tasa especfica de crecimiento, o error de biomasa, fue calculado
como la diferencia entre flujo de biomasa especfico simulado con el experimental como se
muestra en la ecuacin (1).
-
medido simulado
% Error flujo msico = * 100 (1)

medido
El error en la prediccin de los flujos de intercambio, o error flujos, consiste en la distancia
euclidiana entre los valores experimentales de los flujos de intercambio, y los valores
estimados por el FBA de estos flujos, como se indica en la ecuacin (2). El cual corresponde a
la diferencia de los flujos medidos extracelulares con respecto al valor de dichos flujos
simulados.
( medido simulado )
% Error flujos = * 100 (2)
medido
Se consideran ambos tipos porque las unidades de las magnitudes comparadas en cada uno de
ellos son diferentes (la tasa especfica de crecimiento se expres en h-1, mientras que los flujos
fueron representados en mmol gx-1 h-1). En cualquier caso, se tuvieron en cuenta ambos tipos
de errores para el anlisis de las diferentes funciones objetivo exploradas.
5.2.4. Evaluacin del efecto del flujo de nutrientes sobre la produccin de AC:
Una vez seleccionada la FOBJ para el modelo metablico, se realizan nuevas simulaciones por
medio de FBA empleando este objetivo celular y considerando cambios en los valores de los
flujos de los nutrientes tal como se muestra en la tabla 5.2. Entre los flujos considerados para
este estudio estn los flujos medidos descritos en la tabla 5.1, valores que corresponden a la
178
mxima expresin metablica de formacin de producto, que se genera a la menor D. Los
valores de estos flujos se tomaron como un punto dentro de los clculos de los flujos
estudiados. Para establecer el rango de valores de dichos flujos se tuvo en cuenta el valor de
referencia obtenido en la bibliografa a menor tasa de dilucin (0.03 h-1) y algunos valores de
limitacin de tipo estequiomtrico. Para establecer el rango de valores se aplic la regla urea
para los segmentos equidistantes a tener en cuenta entre los valores a estudiar, excepto para O2
y el valor de fosfato de 0.06. Para el efecto de variacin de flujo de fosfato se seleccion 0.06
por ser un dato de referencia para Coelicolor [17]. El medio de cultivo empleado para los
cultivos en quimistato est limitado en N y P [3]. Para la FOBJ estudiada, se emplearon como
restricciones al modelo, la matriz estequiomtrica y los flujos como se describen en la tabla
5.2. Se busc mantener la misma relacin C/N, para poder encontrar el verdadero efecto de la
variacin del flujo del nutriente a condiciones inferiores al requerimiento celular. Cuando se
consider la variacin en el flujo de GLC o NH4, se incluy el flujo de O2 como restriccin
del modelo. Los valores de la primera columna corresponden a los requerimientos celulares
en condiciones estequiomtricas, los valores al lado derecho de la primera columna son
limitantes al requerimiento celular, lo que implica la limitacin del nutriente.
Tabla 5.2. Condiciones de evaluacin de los flujos de algunos sustratos a

condiciones de limitacin de nutrientes.
Flujo de sustrato (mmol g -1 h -1) Valor de flujo para simulacin Flujo fijo *
GLC 4.89 3.27 1.62 0.83 O2, NH4
NH4 1.58 1.16 0.34 0.16 GLC, O2
O2 12.81 7 5 3 GLC, NH4
PO4 0.2885 0.1443 0.06 0.0024 GLC, NH4
*Valores definidos en la tabla 5.1.
Los resultados de este estudio permiten predecir cmo se afecta la produccin de AC y la
sntesis de biomasa, entre otros flujos, como una funcin del cambio en los flujos de algunos
179
nutrientes esenciales. Igualmente, los resultados permiten identificar cambios en flujos
intracelulares originados tambin por cambios en los flujos de estos nutrientes. Los resultados
de este anlisis se muestran por medio de los flujos intracelulares representativos de cada una
de las vas principales del metabolismo celular como son va de pentosa fosfato (17), va de la
gluconeognesis (10), vas del ciclo de Krebs (23 y 12), va de biosntesis de ASP (44), va
de biosntesis de GLU (29), va de biosntesis de GLN (30), vas del ciclo de la urea (36,
37 y 39) y va de produccin de AC (84).
5.3. RESULTADOS Y DISCUSION
5.3.1. Ajuste del modelo metablico evaluando tres funciones objetivos.
En la tabla 5.3 se comparan los valores de los flujos predichos por el modelo metablico para
cada FOBJ evaluada, con los valores de los flujos experimentales para diferentes metabolitos
extracelulares indicados en la tabla 5.1.
Tabla 5.3 Comparacin entre flujos experimentales y simulados para diferentes funciones
objetivos (tasa de dilucin 0.03h-1).
FBA-ATP FBA- FBA-AC
Flujos medidos
simulados error (%) simulados error (%) simulados error (%)
CO2 (1) 8.86 11.00 24 7.29 18 6.64 25
(85) 0.03 0.03 0 0.03 0 0 100
AC (98) 0.0016 0.0196 1125 0 100 1.16 72400
De los resultados se observa que el menor % de error acumulado de los flujos est dado para
la FOBJ maximizacin de biomasa. Esto se puede explicar porque la reaccin de produccin
de biomasa es la que tiene la mayor conectividad y mayor sensibilidad dentro de la red
metablica. De otro lado, se observa una produccin nula de AC que est en correspondencia
con la maximizacin biolgica de la biomasa, pues para que esto ocurra la clula deja de
180
producir AC. Aunque el mejor ajuste se haya obtenido con la maximizacin de la biomasa, las
condiciones metablicas proporcionadas por esta suposicin, no son las adecuadas para la
produccin de AC, ya que este metabolito se produce en condiciones de baja velocidad de
crecimiento, comportamiento propio del metabolismo secundario. De otro lado, la
optimizacin celular maximizando el flujo de produccin de ATP, tambin muestra un ajuste
importante a los resultados experimentales de flujo de CO2 y biomasa. El flujo de biomasa
simulado con la funcin ATP, tiene el mismo valor que el obtenido con la funcin objetivo de
maximizacin de biomasa, lo cual es completamente consistente ya que la maximizacin de la
biomasa demanda un mximo de produccin de ATP y la maximizacin de ATP genera una
mxima produccin de biomasa, puesto que estos dos flujos son directamente proporcionales
entre s. De otro lado, la funcin objetivo produccin de ATP exhibe un valor de flujo de AC
mayor que cero y ms cercano a los que debe dar experimentalmente, ya que solo es un orden
de magnitud superior al valor experimental. Otras simulaciones realizadas con esta misma
funcin objetivo, a tasas de dilucin mayores que 0.03 h-1 (datos no mostrados) mostraron que
la produccin de AC se reduce al aumentar la tasa de dilucin, lo que tambin es consistente
con resultados experimentales observados para AC [3]. Para el objetivo celular de maximizar
AC, a pesar de no haber un error considerable en el flujo de CO2, se observa un valor de flujo
de AC tres rdenes de magnitud superior al valor experimental, por lo que para fines de
anlisis, esta funcin no conduce a una aproximacin deseable. De acuerdo con todas estas
consideraciones y a pesar de ser matemticamente mejor modelo de prediccin la
optimizacin de biomasa especfica, no lo es desde un punto de vista biolgico. Adems,
algunos reportes para predecir comportamiento de Streptomyces sp, han mostrado este
objetivo celular como una buena aproximacin al metabolismo secundario [6-7]. Por lo que la
181
FOBJ de maximizacin de ATP es adoptada para continuar los estudios del efecto de los flujos
de nutrientes.
5.3.2. Efecto de los flujos de nutrientes (C, O2, N, P) sobre la produccin

de biomasa y AC y sobre algunos flujos metablicos intracelulares.
Los resultados del efecto de la variacin de los flujos de carbono (GLC), nitrgeno (NH4),
oxgeno (O2) y fsforo (PO4-2), se presentan en las figuras 5.3 a 5.6 respectivamente. El efecto
de estos cuatro flujos de nutrientes esenciales para Sc, se complementa con un anlisis del
cambio en algunos de los flujos internos ms representativos de la red metablica. Estos flujos
internos se muestran esquemticamente en la figura 5.2.
GLC

pp
GAP
AC
3PG

10
PEP
23 PYR
ACCOA
ARG ASP
44
OAA 12
MAL
CITRU CARBP TCA
37

GLN FU
ORN aKG
0
SUC
UREA GLU 29
Figura 5.2. Representacin simplificada de la red metablica de Sc, incluyendo los flujos
intracelulares ms representativos.
182
El efecto de cambios en el flujo de la FC se muestra en la figura 5.3A. All se observa que al
disminuir el flujo de GLC a valores inferiores al requerimiento celular estequiomtrico se
genera una menor produccin de AC, mientras que la velocidad especfica de crecimiento de
biomasa se mantiene constante. La reduccin en la produccin de AC con la reduccin del
flujo de carbono es consistente con resultados obtenidos por otros autores en donde incluso a
flujos de consumo muy bajos de carbono, el flujo de AC llega a ser cero [13]. El resultado
observado durante la simulacin en donde la velocidad especfica de crecimiento se mantiene
constante al incrementar la limitacin de carbono, es un fenmeno atpico dado que, tal como
lo explica la ecuacin de Monod, la velocidad de biomasa debera disminuir conforme
disminuye la FC en condiciones de limitacin. Este comportamiento atpico solo podra
explicarse si el rendimiento de biomasa en sustrato (YXS) se incrementa a medida que la fuente
de carbono disminuye, sin embargo no se encontraron estudios experimentales al respecto para
confrontar este resultado.
Con relacin a los flujos internos, una reduccin en el flujo de consumo de la FC (GLC),
ocasiona una disminucin en la mayora de estos flujos como se puede observar en la figura
5.4B. La reduccin de la produccin de AC, se genera por la disminucin de sus flujos
precursores como 29, 36 y 39. Tambin se observa un incremento en la actividad del ciclo de
Krebs lo que es consistente con la maximizacin de la funcin objetivo de produccin de ATP
y lo cual genera una reduccin en los flujos perifricos al ciclo como se observa en la
importante reduccin del 29 de produccin de glutamato. Dado los flujos 12, 17, 29 y 44,
son flujos precursores de metabolitos de biomasa, se observa que algunos de ellos se
incrementan y otros disminuyen durante la simulacin de una reduccin en el flujo de
183
carbono, con lo cual se puede esperar un equilibrio en la sntesis de biomasa que la conlleve a
permanecer constante
0.035
0.030
0.025
Flujo AC y
0.020
0.015
0.010
Grfica A
0.005
0.000
0 1 2 3 4 5 6
Flujo de glicerol
40
Grfica B
20
Cambio en el flujo (%)
0
v84 v10 v12 v17 v23 v29 v30 v36 v37 v39 v44
-20
-40
-60
-80
-100
Flujos intracelulares
Figura 5.3. Efecto de la disminucin del flujo de glicerol (mmol g-1 h-1), sobre el flujo de AC y
de biomasa (grfica A) y sobre los flujos internos (grfica B), "In Silico" para Sc. Smbolos:
() flujo de cido clavulnico (mmol g-1 h-1); () flujo de biomasa (h-1).
Los resultados del efecto la reduccin del flujo de N (NH4) se presentan en la figura 5.4. En la
figura 5.4A, se observa que en el intervalo de flujos de nitrgeno entre 1.2 y 0.3, el flujo de
AC es constante y mximo con respecto a valores de flujo de nitrgeno superiores e inferiores
184
0.045
Grfica A
0.040
0.035
Flujo AC y
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Flujo de amonio
40
Grfica B
20
0
v84 v10 v12 v17 v23 v29 v30 v36 v37 v39 v44
-20
-40
-60
*5
-80
-100
500 %
-120
Figura 5.4. Efecto de la disminucin del flujo de amonio (mmol g-1 h-1), sobre el flujo de AC y
de biomasa (grfica A) y sobre los flujos internos (grfica B), " In Silico" para S. clavuligerus.
Smbolos: () flujo de cido clavulnico (mmol g-1 h-1); () flujo de biomasa (h-1).
a este rango. Algunos autores han observado que incrementando el flujo de amonio en
condiciones de exceso, el flujo de AC experimenta una disminucin, por lo que se ha
explicado que el nitrgeno reprime su sntesis [13, 18]. Esta observacin es consistente con los
resultados de las simulaciones de este trabajo. Es interesante resaltar el resultado de encontrar
tambin una disminucin del flujo de AC a muy bajos valores de flujo de amonio, por debajo
de 0.3. Este comportamiento tambin se ha observado a nivel experimental en el cual, una alta
185
limitacin de nitrgeno genera que el microorganismo consuma AC como FN y se
experimente un flujo medido menor [19], sin embargo, aunque el modelo genera una
tendencia de acuerdo con la evidencia experimental, este resultado no es generado por una
representacin adecuada del microorganismo in silico, dado que el modelo metablico no
incluye reacciones de consumo de AC.
Tambin se observa que el flujo de biomasa se reduce linealmente con el incremento de la
limitacin de nitrgeno, que dentro del modelo se evidencia por la alta sensibilidad que tiene
el flujo de biomasa con respecto al de amonio. Igualmente este fenmeno se ha evidenciado
experimentalmente, en donde cultivos continuos de Sc alimentados bajo la misma tasa de
dilucin pero reduciendo alternativamente el flujo de nitrgeno, han mostrado una reduccin
significativa de la velocidad de produccin de biomasa concomitante con el incremento de la
produccin de AC [18].
En la figura 5.4B se observa que hay una reduccin del flujo de AC con la reduccin del flujo
de nitrgeno. Esto se debe a que en la figura se est tomando la reduccin del flujo de
nitrgeno en todo el intervalo de estudio, sin embargo ya se ha dicho que existe un intervalo
donde el flujo de AC es mximo. La actividad del ciclo de Krebs disminuye en un 500% con
forme se limita el flujo de nitrgeno, lo que explica la cada en el flujo de biomasa en ms del
87% en el mismo intervalo.
Los resultados del efecto de cambios en el flujo de oxgeno se presentan en la figura 5.5. En la
figura 5.5A, se observa que mientras se disminuye el flujo de consumo de oxgeno entre 13 y
7 no se observa ningn cambio los flujos de biomasa y de AC, sin embargo, una mayor
reduccin en el flujo por debajo de 7, genera un aumento exponencial en el flujo de AC
186
1.2 0.035
1.0 0.030
Flujo AC 0.025
0.8
0.020
0.6
0.015
0.4
0.010
Grfica A
0.2 0.005
0.0 0.000
0 3 6 9 12 15
Flujo de oxgeno
120
5000% 6000% 3500%
Cambio en el flujo ( %)
100
80
60
40
20
0
-20 v84 v10 v12 v17 v23 v29 v30 v36 v37 v39 v44
-40
-60
-80 Grfica B
-100
-120 145%217%
Figura 5.5. Efecto de la disminucin del flujo de oxgeno (mmol g-1 h-1), sobre el flujo de AC y
de biomasa (grfica A) y sobre los flujos internos (grfica B), " In Silico" para S. clavuligerus.
Smbolos: () flujo de cido clavulnico (mmol g-1 h-1); () flujo de biomasa (h-1).
conjuntamente con una disminucin en el flujo de biomasa. Como se observa, el modelo
metablico muestra un efecto significativo del flujo de oxgeno y permite identificar que una
manera plausible de incrementar la produccin de AC es regular la transferencia de oxgeno en
el proceso fermentativo obligando a la clula a consumir oxgeno de acuerdo con la oferta del
mismo. Estas predicciones del modelo son consistentes con resultados experimentales toda vez
187
que al ser Sc un microorganismo aerobio, una mayor demanda de oxgeno corresponde a un
mayor aumento del flujo de biomasa y dado que el AC es un metabolito secundario,
incrementos en la velocidad de produccin de biomasa reducen la produccin de AC [3, 20].
En la figura 5.5B se observa que hay un aumento en el flujo de AC muy superior a los valores
reportados experimentalmente, lo que lleva a concluir que son valores poco realistas en cuanto
a la prediccin deseada por un modelo. Este resultado es congruente con el aumento
igualmente poco realista de los flujos de los precursores 36, 37, 39. Sin embargo, estos
resultados sirven para analizar de forma cualitativa tendencias sobre los efectos esperados del
flujo de oxgeno. Por ejemplo, una reduccin del flujo consumo de oxgeno incrementa la
produccin de AC, como fuera mencionado antes. Tambin reduce el flujo de produccin de
biomasa el cual est relacionado con los flujos 17 y 30 que tambin disminuyen. Con
relacin al incremento en la actividad en el ciclo de Krebs dada por 12, es difcil encontrar
una explicacin coherente sobre este fenmeno debido a la disminucin del flujo de consumo
de oxgeno. Al contrario, se esperaba que una reduccin del flujo de oxgeno generara una
reduccin en el flujo hacia el ciclo de Krebs por la limitacin que se generara en la etapa de la
fosforilacin oxidativa impidiendo una adecuada regeneracin del NAD+ para volver al ciclo
de Krebs y formacin de ATP.
Estos resultados permiten recordar que el estudio realizado es basado en un modelo que ha
sido previamente validado con algunos datos experimentales pero que de ninguna forma puede
tomarse como una herramienta completamente elaborada y es vlida para obtener primeras
aproximaciones al comportamiento fisiolgico del microorganismo.
Los resultados del efecto del cambio en el flujo de fosfato sobre la produccin de AC y flujo
de biomasa, se presentan en la figura 5.6. En la figura 5.6A, se observa que la disminucin de
188
0.102 0.028
0.101
0.100
Flujo de AC
0.099
0.0275
0.098
0.097 Grfico A
0.096
0.095 0.027
0.0 0.1 0.2 0.3
Flujo de fosfato
10
8
6
4
2
0
-2 v84 v10 v12 v17 v23 v29 v30 v36 v37 v39 v44
-4
-6
-8
-10
Figura 5.6. Efecto de la disminucin del flujo de fosfato (mmol g-1 h-1), sobre el flujo de AC y
de biomasa (grfica A) y sobre los flujos internos (grfica B)," In Silico" para S. clavuligerus.
Smbolos: () flujo de cido clavulnico (mmol.g-1.h-1); () flujo de biomasa (h-1).
este flujo de consumo de la fuente de fsforo no genera efectos o cambios significativos en los
flujos de biomasa y AC. Al comparar estos valores de flujo de AC bajo limitacin de fosfato
con respecto a los obtenidos por simulacin con el modelo metablico bajo limitacin de otros
nutrientes (flujo de glicerol y flujo de amonio), se observa que los valores ms altos de flujos
de AC se obtienen justamente bajo esta limitacin, aumentando en un 500%. Este valor
189
aunque elevado en comparacin con los resultados de los flujos de glicerol y nitrgeno, es un
resultado realista ya que la evidencia experimental de diversos autores muestra que la
limitacin de fsforo es el detonante principal para incrementarla produccin de AC [13]. De
otro lado, bajo las consideraciones de alimentacin de fsforo de la figura 5.6A, la biomasa no
se ve afectada.
Los flujos intracelulares muestran muy poca variacin con relacin al cambio en el flujo de
consumo de fosfato (figura 5.6B), que correlaciona con las mnimas variaciones predicas para
los flujos de AC y de biomasa.
Una reduccin del flujo de fsforo, reduce la actividad del ciclo de Krebs y por consiguiente
se incrementa la actividad de las reacciones de bifurcacin del ciclo como la de produccin de
glutamato 29. Sin embargo, como ya se indic, los cambios observados son mnimos.
5.4. CONCLUSIONES
El modelo metablico propuesto para Sc permite realizar anlisis preliminares sobre el
comportamiento celular, como para analizar los efectos de variables de inters como el flujo
de carbono, nitrgeno y fsforo sobre variables relevantes como el flujo de biomasa y de AC.
El modelo presenta las mejores predicciones empleando como funcin objetivo la
maximizacin de la produccin de ATP con respecto a las dems funciones evaluadas,
produccin de biomasa y produccin de AC.
Bajo las consideraciones de limitacin de nutrientes se puede establecer que bajo limitacin de
glicerol y amonio, los flujos de AC se ven disminuidos, siendo crtica la limitacin de C,
mientras que la limitacin de NH4 en cierto rango se mantiene constante el valor de flujo de
AC obtenindose el mximo valor permitido de acuerdo con las restricciones del modelo
metablico.
190
Los flujos internos ms relevantes a condiciones de limitacin de carbono fueron el flujo de
GLU, flujo de la va PP y el flujo de biosntesis de GLN. Para el caso de limitacin de
nitrgeno los flujos que tuvieron mayor disminucin por la disminucin del flujo de amonio
fueron los flujos en el ciclo de Krebs con el 12 y el 36 correspondientes a biosntesis de
ORN.
Para los casos de disminucin de oxgeno y fsforo se obtuvieron los valores mximos de
flujo de AC. El caso de disminucin de flujo de oxgeno el modelo no explica el aumento del
AC. Se encontr que los flujos de mayor aumento fueron los flujos en el ciclo de Krebs y 36
que corresponde al flujo de ORN. Bajo condiciones de limitacin de fosfato, se ve favorecido
el flujo de GLU.
Para el ciclo de la urea, se consideraron los flujos precursores 36 (flujo de ORN), 37 (flujo
de CARBP) y 39 (flujo de ARG-SUC), encontrando que el mayor efecto bajo las
condiciones de limitacin de todos los nutrientes est dada por el cambio en el flujo de ORN
ms que en los otros dos precursores del ciclo de la urea. Adems de verse el mismo cambio
para los 37 y 39 para todas las condiciones de limitacin.
En conclusin general, la comparacin de los resultados experimentales con los resultados
obtenidos por FBA a diferentes funciones objetivo, resulta muy til, ya que se puede evaluar
el potencial biolgico de un cultivo particular. Entre los propsitos de este tipo de estudio est
el poder indicar algn objetivo o estrategia a seguir para la manipulacin gentica o
modificaciones en el proceso de produccin, que permitan disminuir u optimizar los tiempos
destinados para obtener mayores valores en los flujos de AC.
191
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193
APNDICES
CAPTULO 4.
APNDICE A. Modelo de reacciones metablicas para producir AC a partir de Sc.
Flujos Reacciones
1 GLC ==> GAP + NADH
2 GAP <==> 3PG + NADH + ATP
3 4 O2 + GAP + 3 aKG + ARG + 2 NADPH + ATP ==> NH4 + UREA + 3 CO2 + AC + 3 SUC
4 3PG <==> PEP
5 3PG + GLU ==> aKG + NADH + SER
6 CO2 + PEP + ATP <==> OAA
7 2 PEP + GLU + E4P + NADPH + ATP <==> CO2 + PHE + aKG
8 2 PEP + GLU + E4P + NADPH + ATP <==> CO2 + TYR + aKG + NADH
9 GLN + 2 PEP + E4P + NADPH + ATP + SER ==> CO2 + TRP + GAP + PYR + GLU
10 PEP <==> PYR + ATP
11 PYR <==> CO2 + ACCOA + NADH
12 2 PYR + GLU + NADPH <==> CO2 + VAL+ aKG
13 PYR + GLU <==> ALA + aKG
14 2 PYR + ACCOA + GLU + NADPH ==> 2 CO2 + LEU + aKG + NADH
15 ACCOA + OXA <==> CO2 + aKG + NADPH
16 SUCCOA <==> SUC + ATP
17 SUC<==> FUM
18 FUM<==> OAA + NADH
19 OAA + GLU <==> aKG + ASP
20 ASP + ORN + CARBMP + ATP <==> FUM + ARG
21 GLN + ASP + ATP ==>ASN + GLU
22 ASP + NADPH + ATP <==> ASPSEMALD
23 ASPSEMALD + ATP + CYS + SUCCOA<==> NH4 + MET + PYR + SUC
24 ASPSEMALD + NADPH + ATP <==>THR
25 PYR + A ASPSEMALD + GLU + NADPH + SUCCOA ==> CO2 + LYS + aKG + SUC
26 PYR + THR + GLU + NADPH <==> NH4 + CO2 + ILE + aKG
27 NH4 + aKG + NADPH <==> GLU
28 ACCOA + 2 GLU + NADPH + ATP <==> aKG + ORN + ACE
30 NH4 + GLU + ATP <==> GLN
31 ARG <==> UREA + ORN
32 0.2 NH4 + 0.065 LEU + 0.05 LYS + 0.031 GLN + 0.019 MET + 0.01 GAP + 0.039 PEP + 0.094 PYR
194
0.165 ACCOA + 0.075 aKG + 0.11 OAA + 0.024 THR + 0.031 GLU + 0.011 F6P + 0.03 G6P
+ 0.113 RIB5P + 0.036 E4P + 0.343 NADPH + 0.973 ATP ==> 0.036 CO2 + X + 0.078 NADH
33 2 GAP <==> F6P + ATP
34 F6P <==> G6P
35 G6P <==> CO2 + R5P + 2 NADPH
36 R5P <==> X5P
37 R5P <==> RIB5P
39 X5P + E4P <==> GAP + F6P
40 GAP + SED7P <==> F6P + E4P
41 O2 + 2 NADPH <==> 4 ATP
29 GLU + 2 NADPH + ATP ==>PRO
38 X5P + RIB5P <==> GAP + SED7P
42 aKG <==> CO2 + SUCCOA
44 ATP + SER<==> CYS
45 NADPH <==> NADH
43 ATP + SER<==>GLY
46 NH4-up ==> NH4
47 GLC-up ==> GLC
48 PHEexit<==> PHE
49 TYRexit<==> TYR
50 Xexit ==> X
51 O2_up ==> O2
52 ASNexit ==> ASN
53 TRP exit ==> TRP
54 VALexit ==> VAL
55 ILEexit<==> ILE
56 PROexit ==> PRO
57 GLYexit<==> GLY
58 ACexit ==> AC
59 ALAexit<==> ALA
60 CYS exit <==> CYS
195
Flujos Sensibilidad de flujos medidos
c ALA AC CYS LYS ORN ARG ASP SER MET THR LEU GLU GLN OAA PYR aKG GAP G6P
3PG (2) -0.4727 -8.6667 -0.0273 2.1091 1.0364 1.0364 -0.0182 -0.0273 0.6455 1.0909 -0.8307 -0.0091 -0.0091 -0.5182 -0.0273 -0.5091 1.5545 3.0818
CA (3) 0.0545 1.0000 -0.0545 0.2182 0.0727 0.0727 -0.0364 -0.0540 0.2909 0.1818 -0.0984 -0.0182 -0.0182 -0.0364 -0.0545 -0.0182 0.1091 0.1636
PEP (4) 0.7091 13.0000 -0.2091 0.8364 -1.0545 -1.0545 -1.4727 -0.2091 1.2818 0.3636 0.0438 -1.7364 -1.7364 -1.9727 -1.2091 -2.2364 0.9182 1.6273
SER (5) -1.1818 -21.6667 0.1818 1.2727 2.0909 2.0909 1.4545 0.1818 -0.6364 0.7273 -0.8745 1.7273 1.7273 1.4545 1.1818 1.7273 0.6364 1.4545
OAA (6) 0.0545 1.0000 -0.0545 -0.7818 -0.9273 -0.9273 -1.0364 -0.0545 -0.7091 -0.8182 0.2416 -1.0182 -1.0182 -1.0364 -0.0545 -1.0182 0.1091 0.1636
PYR (10) 0.6545 12.0000 -0.1545 1.6182 -0.1273 -0.1273 -0.4364 -0.1545 1.9909 1.1818 -0.2367 -0.7182 -0.7182 -0.9364 -1.1545 -1.2182 0.8091 1.4636
ACCOA (11) -0.3455 -6.3333 -0.1545 2.6182 -0.1273 -0.1273 -0.4364 -0.1545 0.9909 1.1818 -0.4917 -0.7182 -0.7182 -0.9364 -0.1545 -1.2182 0.8091 1.4636
ALA (13) 1.0000 18.3333 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
matriz con los flujos a calcular.

LEU (14) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0650 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
aKG (15) -0.4000 -7.3333 -0.1000 2.4000 0.8000 0.8000 -0.4000 -0.1000 0.7000 1.0000 -0.6233 -0.7000 -0.7000 -0.9000 -0.1000 -1.2000 0.7000 1.3000
SUC (16) -0.6182 -11.3333 0.1182 2.5273 1.5091 1.5091 -0.2545 0.1182 0.5364 0.2727 -0.4356 0.3727 0.3727 -0.7545 0.1182 -0.1273 0.2636 0.6455
FUM (17) -0.4545 -8.3333 -0.0455 2.1818 1.7273 1.7273 -0.3636 -0.0455 0.4091 0.8182 -0.6619 0.3182 0.3182 -0.8636 -0.0455 -0.1818 0.5909 1.1364
OAA(TCA) (18) -0.3273 -6.0000 0.8273 2.6909 1.5636 1.5636 -0.7818 -0.1727 0.7545 0.9091 -0.1709 -0.3909 0.6091 -2.2818 -1.1727 -1.8909 -0.1545 -0.4818
ASP (19) 0.1273 2.3333 0.8727 -0.4909 -0.1636 -0.1636 -1.4182 -0.1273 -0.6545 -0.9091 0.5840 -0.7091 0.2909 -1.4182 -1.1273 -1.7091 -0.7455 -1.6182
ARG (20) 0.1273 2.3333 0.8727 0.5091 -0.1636 -0.1636 -0.4182 -0.1273 0.3455 0.0909 0.4910 -0.7091 0.2909 -1.4182 -1.1273 -1.7091 -0.7455 -1.6182
ASPSEMALD (22) 0.0000 0.0000 0.0000 -1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 -1.0000 -1.0000 0.0930 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
MET (23) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 -1.0000 0.0000 0.0190 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
THR (24) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 -1.0000 0.0240 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
LYS (25) 0.0000 0.0000 0.0000 -1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0500 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
196
GLU (27) 0.0545 1.0000 0.9455 0.2182 0.0727 0.0727 -0.0364 -0.0545 -0.7091 0.1818 -0.3104 -0.0182 0.9818 -0.0364 -0.0545 -0.0182 0.1091 0.1636
ORN (28) 0.0545 1.0000 -0.0545 0.2182 -0.9273 -0.9273 -0.0364 -0.0545 0.2909 0.1818 -0.0984 -0.0182 -0.0182 -0.0364 -0.0545 -0.0182 0.1091 0.1636
GLN (30) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0310 0.0000 -1.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
UREA (31) 0.0727 1.3333 0.9273 0.2909 -0.2364 0.7636 -0.3818 -0.0727 0.0545 -0.0909 0.5894 -0.6909 0.3091 -1.3818 -1.0727 -1.6909 -0.8545 -1.7818
GAP-F6P (33) 0.4182 7.6667 0.0818 -2.3273 -1.1091 -1.1091 0.0545 0.0818 -0.9364 -1.2727 0.7292 0.0273 0.0273 0.5545 0.0818 0.5273 -0.6636 -2.2455
G6P (34) 1.2545 23.0000 0.2455 -6.9818 -3.3273 -3.3273 0.1636 0.2455 -2.8091 -3.8182 1.8325 0.0818 0.0818 1.6636 0.2455 1.5818 -1.9909 -4.7364
APNDICE B. Anlisis de sensibilidad y de flujos metablicos
R5P (35) 1.2545 23.0000 0.2455 -6.9818 -3.3273 -3.3273 0.1636 0.2455 -2.8091 -3.8182 1.8025 0.0818 0.0818 1.6636 0.2455 1.5818 -1.9909 -3.7364
X5P (36) 0.8364 15.3333 0.1636 -4.6545 -2.2182 -2.2182 0.1091 0.1636 -1.8727 -2.5455 1.1143 0.0545 0.0545 1.1091 0.1636 1.0545 -1.3273 -2.4909
RIB5P (37) 0.4182 7.6667 0.0818 -2.3273 -1.1091 -1.1091 0.0545 0.0818 -0.9364 -1.2727 0.6882 0.0273 0.0273 0.5545 0.0818 0.5273 -0.6636 -1.2455
X5P-F6P (39) 0.4182 7.6667 0.0818 -2.3273 -1.1091 -1.1091 0.0545 0.0818 -0.9364 -1.2727 0.5392 0.0273 0.0273 0.5545 0.0818 0.5273 -0.6636 -1.2455
E4P (40) 0.4182 7.6667 0.0818 -2.3273 -1.1091 -1.1091 0.0545 0.0818 -0.9364 -1.2727 0.5752 0.0273 0.0273 0.5545 0.0818 0.5273 -0.6636 -1.2455
ATP (41) -0.2182 -4.0000 0.2182 -0.8727 -0.2909 -0.2909 0.1455 0.2182 -1.1636 -0.7273 0.3937 0.0727 0.0727 0.1455 0.2182 0.0727 -0.4364 -0.6545
Tabla B1. Anlisis de sensibilidad de los flujos considerados como medidos.
SED7P (38) 0.4182 7.6667 0.0818 -2.3273 -1.1091 -1.1091 0.0545 0.0818 -0.9364 -1.2727 0.5752 0.0273 0.0273 0.5545 0.0818 0.5273 -0.6636 -1.2455
SUCCOA (42) -0.6182 -11.3333 0.1182 1.5273 1.5091 1.5091 -0.2545 0.1182 -0.4636 0.2727 -0.3666 0.3727 0.3727 -0.7545 0.1182 -0.1273 0.2636 0.6455
CYS (44) -1.1818 -21.6667 0.0000 1.2727 2.0909 2.0909 1.4545 1.1818 -0.6364 0.7273 -0.8745 1.7273 1.7273 1.4545 1.1818 1.7273 0.6364 1.4545
NADH (45) 2.3273 42.6667 -0.8273 -8.6909 -4.5636 -4.5636 -0.2182 0.1727 -1.7545 -3.9091 2.2249 -0.6091 -1.6091 2.2818 0.1727 1.8909 -2.8455 -5.5182
Acumulado 4.0670 77.6459502 2.2400 16.4873 9.0510 9.0801 3.6700 1.8155 6.4427 8.456 4.531 4.1154 4.4853 6.3798 3.5195 6.5640 5.3715 10.9575
* El acumulado corresponde a la sumatoria de la sensibilidad para cada flujo medido, NC: nmero de condicin de la
NC: 138.00 370.00 167.00 89.00 88.53 87.80 131.00 104.00 89.64 135.60 86.40 132.00 94.50 131.95 132.00 133.50 124.27 104.95
Tabla B2. Anlisis de flujos metablicos, a dos tasas de dilucin, en la produccin de
AC a partir de Sc, (flujos normalizados respecto a glicerol).
Anlisis de flujos metablicos

Flujos D:0.03(h-1) D:0.02(h-1)
1 100 195.7694
2 3 -115.1844 164.5832
3 -11.9008 16.1787
4 144.9166 289.4033
5 -260.101 -124.8201
6 101.0783 91.5762
7 0.013 0.0151
8 0.0205 0.0062
9 0 0.0189
10 30.8155 189.1095
11 -54.0055 132.546
12 0.0233 0.0237
13 0.0483 0.0406
14 21.593 14.3952
15 -118.5107 65.4304
16 -139.3567 -44.9138
17 -152.1372 18.9034
18 () -23.2021 34.7202
19 159.8449 36.5049
20 128.9351 15.8168
21 0.0001 0.071
22 30.9097 20.6171
23 6.3118 4.2078
24 7.9879 5.336
25 16.61 11.0733
26 0.0151 0.0208
27 -65.1222 -16.4445
28 -11.9008 16.1787
30 10.2983 6.9553
31 140.8359 -0.3619
32 332.2 221.4651
33 6 160.6117 -29.3068
34 6 363.8706 -166.5808
35 5 353.9046 -173.2247
36 5 206.9131 -134.8378
37 5 146.9915 -38.3869
39 56 97.4602 -71.4254
40 4 109.4529 -63.4125
41 2 97.0031 -2.9601
29 0.0159 0.0076
38 7 109.4529 -63.4125
42 -116.4349 -29.6327
197
CAPTULO 5.
APENDICE A. Modelo de reacciones metablicas para producir cido clavulnico a

partir de Sc.
1: CO2_EX : CO2 <==>
2: O2_UP : <==> O2
3: GCL_GCL3P : ATP + GCL <==> GCL3P + ADP
4: GCL3P_DHAP : GCL3P <==> DHAP + MK-9H
5: F6P_G6P : F6P <==> G6P
6: F16P_F6P : F16P <==> ATP + F6P
7: DHAP+GAP_F16P : DHAP + GAP <==> F16P
8: GAP_DHAP : GAP <==> DHAP
9: GAP_3PG : GAP + PO4 + NAD <==> 3PG + ATP + NADH
10: 3PG_PEP : 3PG <==> PEP
11: PYR_ACCOA : PYR + NAD <==> ACCOA + CO2 + NADH
12: ACCOA_aKG : ACCOA + OAA <==> aKG + CO2 + NADPH
13: aKG_SUCCOA : aKG <==> CO2 + SUCCOA
14: SUCCOA_SUC : SUCCOA + ADP + PO4 <==> ATP + SUC
15: SUC_FUM :SUC <==> FUM + MK-9H
16: FUM_MAL : FUM <==> MAL
17: G6P_R5P : G6P + 2 NADP <==> CO2 + 2 NADPH + R5P
18: R5P_RIB5P : R5P <==> RIB5P
19: R5P_X5P : R5P <==> X5P
20: E4P+X5P_F6P+GAP : E4P + X5P <==> F6P + GAP
21: GAP+SED7P_E4P+F6P : GAP + SED7P <==> E4P + F6P
22: RIB5P+X5P_GAP+SED7P : RIB5P + X5P <==> GAP + SED7P
23: ANAPLEROTIC : CO2 + PEP <==> OAA
24: NADH_MK-9H : NADH <==> MK-9H
25: METHF_NADPH : METHF <==> NADPH
26: ATP_DISSIPATION : ATP <==>
27: OX_PHOSPHORYLATION : 2 NADH + O2 <==> 4 ATP
28: TRANSHYDROGENASE : NADPH <==> NADH
29: GLU_SYNTH : aKG + NADPH + NH4 <==> GLU + NADP
30: GLN_SYNTH : ATP + GLU + NH4 <==> GLN + ADP
31: GLN_GLU :aKG + GLN + NADPH <==> 2 GLU + NADP
32: CHOR_SYNTH : ATP + E4P + NADPH + 2 PEP <==> CHOR + ADP + 4 PO4 + NADP
33: PHE_SYNTH : CHOR + GLU <==> aKG + CO2 + PHE
34: TYR_SYNTH : CHOR + GLU + NAD <==> aKG + CO2 + NADH + TYR
35: PRO_SYNTH : ATP + GLU + 2 NADPH <==> PRO + ADP + PO4 + 2 NADP
36: ORN_SYNTH : ATP + 2 GLU + NADPH <==> aKG + ORN + ADP + PO4 + NADP
37: CARBP_SYNTH : 2 ATP + CO2 + GLN <==> CARBP + GLU + ADP + PO4
38: CITRU_SYNTH : CARBP + ORN <==> CITRU + PO4
198
39: ARG-SUC_SYNTH : ASP + ATP + CITRU <==> ARG-SUC
40: ARG_SYNTH : ARG-SUC <==> ARG + FUM
41: SER_SYNTH : 3PG + GLU <==> aKG + NADH + SER + PO4
42: GLY_SYNTH : SER <==> GLY + METHF
43: CYS_SYNTH : ATP + SER <==> CYS + ADP + PO4
44: ASP_SYNTH : GLU + OAA <==> aKG + ASP
45: ASPSEMALD_SYNTH : ASP + ATP + NADPH <==> ASPSEMALD + ADP + PO4
46: HSER_SYNTH : ASPSEMALD + NADPH <==> HSER
47: THR_SYNTH : ATP + HSER <==> THR + ADP + PO4
48: HOMCYS_SYNTH1 : CYS + HSER + SUCCOA <==> HOMCYS + NH4 + PYR + SUC
49: HOMCYS_SYNTH2 : HSER + SUCCOA <==> HOMCYS
50: MET_SYNTH : HOMCYS <==> MET
51: aKMETVAL_SYNTH : NADPH + PYR + THR <==> aKMETVAL + CO2 + NH4
52: ILE_SYNTH : aKMETVAL + GLU <==> aKG + ILE
53: ALA_SYNTH : GLU + PYR <==> aKG + ALA
54: PYR_aKI : NADPH + 2 PYR <==> aKI + CO2
55: VAL_SYNTH : aKI + GLU <==> aKG + VAL
56: LEU_SYNTH : ACCOA + aKI + GLU <==> aKG + LEU + NADH
57: RIB5P_PRPP : ATP + RIB5P <==> PRPP
58: TRP_SYNTH : CHOR + GLN + PRPP + SER <==> CO2 + GAP + GLU + PYR + TRP
59: AICAR_SYNTH : ASP + 4 ATP + CO2 + GLN + GLY + PRPP <==> AICAR + FUM + GLU + 4 ADP +
4 PO4
60: HIS_SYNTH : ATP + GLN + PRPP <==> AICAR + aKG + HIS + 2 NADH + PO4
61: LYS_SYNTH : ASPSEMALD + GLU + NADPH + PYR + SUCCOA <==> aKG + CO2 + LYS + SUC
62: ASN_SYNTH : ASP + ATP + GLN <==> ASN + GLU
63: CMP_CDP : ATP + CMP <==> CDP
64: GTP_SYNTH : AICAR + ASP + 3 ATP + GLN <==> GLU + GTP
65: dGTP_SYNTH : GTP <==> dGTP
66: dATP_SYNTH : ATP <==> dATP
67: UTP_SYNTH : ASP + 2 ATP + CARBP + O2 <==> CO2 + UTP + 2 ADP + 2 PO4
68: CTP_SYNTH : ATP + NH4 + UTP <==> CTP + ADP + PO4
69: dCTP_SYNTH : CTP <==> dCTP
70: dTTP_SYNTH : 2 ATP + dCTP + METHF + NH4 <==> dTTP
71: LLDIAPIM_SYNTH : ASP + ATP + GLU + 2 NADPH + PYR + SUCCOA <==> aKG + LLDIAPIM
+ SUC
72: aKI_aIPM : ACCOA + aKI <==> aIPM
73: aIPM_DMC : aIPM <==> DMC
74: DMC_bIPM : DMC <==> bIPM
75: bIPM_aKIC : bIPM <==> aKIC + CO2 + NADH
76: aKI_ISOBUTCOA : aKI <==> CO2 + ISOBUTCOA + NADH
77: aKIC_3METBUTCOA : aKIC <==> 3METBUTCOA + CO2 + NADH
78: aKMETVAL_2METBUTCOA : aKMETVAL <==> 2METBUTCOA + CO2 + NADH
79: C55PP_C55P : C55PP <==> C55P
80: F6P+GLN=GLU+gN6P : F6P + GLN <==> GLU + gN6P
199
81: gN6P=gN1P : gN6P <==> gN1P
82: gN1P_NAG1P : ACCOA + gN1P <==> NAG1P
83: UREA_NH4 : UREA <==> CO2 + 2 NH4
84: CA_SYNTH : 3 aKG + ARG + ATP + GAP + 2 NADPH + 4 O2 ==> CA + 3 CO2 + NH4 + 3 SUC +
UREA + PO4 + 2 NADP
85: mue : 0.0393 2METBUTCOA + 0.1101 3METBUTCOA + 3.0001 ACCOA + 0.9654 ALA + 0.391
ARG + 0.0795 ASN + 0.287 ASP + 12.1708 ATP + 0.19159 C55P + 0.55387 CTP + 0.0365 CYS
+ 0.004545 dATP + 0.01169 dCTP + 0.01169 dGTP + 0.004545 dTTP + 0.09009 F6P + 0.4695
G6P + 0.124 GLN + 0.2665 GLU + 0.5578 GLY + 5.7969 GTP + 0.11 HIS + 0.134 ILE + 0.078
ISOBUTCOA + 0.478 LEU + 0.1078 LLDIAPIM + 0.096 LYS + 0.0795 MET + 2.7251 NADH +
2.7928 NADPH + 0.2155 NAG1P + 0.1078 NH4 + 0.03825 O2 + 0.1078 PEP + 0.1235 PHE +
0.29 PRO + 0.02895 PYR + 0.44005 SER + 0.0285 SUCCOA + 0.289 THR + 0.071 TRP + 0.096
TYR + 0.2815 UTP + 0.3995 VAL + 0.2235 GCL3P ==>
86: ISOPP_SYNTH : ATP + CTP + GAP + 2 NADPH + PYR <==> CMP + CO2 + ISOPP
87: C55PP_SYNTH : 4 ISOPP <==> C55PP
88: CTP_CDP : CTP <==> ATP + CDP
89: OAA_PEP : ATP + OAA <==> CO2 + PEP
90: PEP_PYR : PEP <==> ATP + PYR
91: MAL_OAA : MAL <==> NADH + OAA
92: MAL_PYR : MAL <==> CO2 + NADH + PYR
93: ARG_ORN+UREA : ARG <==> ORN + UREA
94: THR_GLY : ATP + THR <==> ACCOA + GLY + NADH
95: SER_PYR : SER <==> NH4 + PYR
96: NH4_up : <==> NH4
97: GCL_up : <==> GCL
98: clav_export : CA ==>
99: ADP_ATP : ADP + PO4 <==> ATP
100: PO4_up : <==> PO4
200
ANEXO 1. IMPACTOS DEL TRABAJO DE INVESTIGACIN
1.1. IMPACTO AMBIENTAL DEL PROYECTO:
Colombia es un pas agrcola que ha entrado en la era de los biocombustibles, y de la

industria del biodiesel se genera un subproducto (glicerina) que es la principal materia
prima a emplear como sustrato de la bacteria Streptomyces clavuligerus, en la
elaboracin de cido clavulnico. Empleando la glicerina como substrato, en este trabajo
se ha logrado obtener rendimientos hasta de 20 mg AC / g de glicerina empleada valor
superior a los reportados en la bibliografa. Se producen actualmente 56000 Ton de
glicerina/ao y se espera que en los prximos aos se pueda suplir una demanda de
396000 Ton de glicerina/ao. En la actualidad hay 83 plantas productoras de biodiesel
en el pas.
Se puede observar como una posibilidad dentro del empleo de tecnologa limpias y en
caso de que este proceso se lleve a cabo a nivel industrial en nuestro Pas, el poder
utilizar a mediano plazo parte de la glicerina generada en los procesos de fabricacin de
biodisel, para la produccin de cido clavulnico u otros antibiticos provenientes del
cultivo de Streptomyces. La selectividad del cido clavulnico en este medio es de
alrededor de 1 g/L.
1.2. PERTINENCIA SOCIAL:
Incrementar la productividad en la produccin de cido clavulnico y emplear materias

primas de bajo costo, permitirn lograr producir medicamentos a un costo ms asequible
a las personas de bajos recursos econmicos, para lograr mejorar la calidad de vida de
las personas con enfermedades infecciosas.
Lograr formar personal altamente calificado que continu con el proceso de formacin
de otros profesionales que propendan por el desarrollo de nuevos productos y procesos
para mejorar la calidad de vida y el nivel educativo del pas, generacin de expertos en
estos temas de tercera generacin.
Esta tesis permite incrementar la cultura de investigacin y mejoramiento de los

procesos desde el conocimiento fenomenolgico del mismo, ms que con el solo estudio
201
del proceso como una caja negra. Esto permite el mantenimiento de altos estndares de
conocimiento de frontera. Los resultados de esta Tesis, pueden motivar a entidades
gubernamentales a destinar ms recursos para investigar en la generacin de nuevos
productos orientados hacia el mantenimiento y mejoramiento de la salud humana.
1.3. APORTE A LA EDUCACION:
Formacin de personal altamente calificado con conocimientos de tecnologa de punta

que permiten aplicacin de las herramientas de Ingeniera Metablica a otros tipos de
microorganismos y de procesos. Dado que la persona formada con esta Tesis
actualmente es profesora Universitaria, sin duda su experiencia y conocimiento
adquirido ir a redundar en las aulas en los cursos que imparta y en la formacin de ms
investigadores.
Con el inicio de esta Tesis, se cre en el grupo de Bioprocesos de la universidad de

Antioquia la lnea de investigacin en ingeniera metablica y mejoramiento de
produccin de antibiticos. Esta lnea actualmente pervive y cuenta con tres estudiantes
de doctorado y uno de maestra realizando sus tesis. Este trabajo es pionero en el pas
para este tipo de bacteria.
1.4. APORTE A LA UNIVERSIDAD:
El desarrollo de esta Tesis estuvo incluido dentro de un proyecto de investigacin

financiado por Colciencias, que permiti conseguir una infraestructura importante para
la Universidad en dotacin de equipos y capacitacin de profesores y estudiantes.
1.5. APORTE AL CONOCIMIENTO:
El desarrollo de esta Tesis ha generado los siguientes aportes al conocimiento:
Se demostr que S. clavuligerus puede crecer y producir AC a concentraciones de
glicerol incluso de 100 g L-1, sin embargo, una concentracin ms adecuada para la
produccin es de 50 g L-1. Estos resultados no se haban reportado antes en la literatura.

202
Se pudo establecer un modelo cintico tipo Contois para la biomasa y una cintica de
formacin de producto asociado y no asociado al crecimiento que mostr un buen ajuste
a los resultados experimentales. Estos resultados no se haban reportado antes en la
literatura.
El anlisis de Flujo metablico empleando una red metablica de 60 reacciones
estequiomtricas, permiti conocer que, para lograr altos rendimientos en la formacin
de AC, se debe garantizar una buena disponibilidad de los flujos de los metabolitos
intermediarios, GAP, PEP, PYR, OAA y ORN.
Con esta red se encontr que los flujos metablicos medidos que ms afectan el
sistema celular son los flujos de PHE, TYR, ILE.
A su vez, los flujos calculados que ms se ven afectados por los flujos medidos
corresponden a los flujos generadores de NADPH, tanto por la va oxidativa de la
pentosa fosfato, como por la reaccin de transhidrogenacin de NADPH.
A partir del anlisis de sensibilidad, tambin fue posible observar que a pesar de ser
algunos compuestos puntos nodales de mucha conectividad en la red metablica pro-
puesta (OXA, aKG, GAP, ARG, ORN y ASP) no constituyen etapas significativamente
incidentes en la distribucin del flujo de carbono, durante el proceso de sntesis de AC.
Finalmente, se encontr que el flujo de la ornitina, ms que el flujo de arginina, afecta
directamente la biosntesis de AC, dejando ver la importancia del control del flujo de
carbono a travs del ciclo de la urea, en la biosntesis de AC.
Analizando una red metablica de 100 reacciones estequiomtricas mediante FBA, se
pudieron obtener resultados preliminares sobre el comportamiento celular para analizar
los efectos de variables de inters como el flujo de carbono, nitrgeno y fsforo sobre
203
variables relevantes como el flujo de biomasa y de AC. Ningn estudio similar fue
hallado en la literatura para la produccin de AC este microorganismo, por lo que el
estudio y los resultados se consideran inditos.
El modelo propuesto present las mejores predicciones empleando como funcin
objetivo la maximizacin de la produccin de ATP con respecto a las dems funciones
evaluadas, produccin de biomasa y produccin de AC.
Bajo las consideraciones de limitacin de nutrientes se pudo establecer la limitacin de
glicerol y amonio, los flujos de AC se ven disminuidos, siendo crtica la limitacin de C,
mientras que la limitacin de NH4, en cierto rango, se mantiene constante el valor de
flujo de AC obtenindose el mximo valor de acuerdo con las restricciones del modelo
metablico. Algunas de estas consideraciones ya haban sido obtenidas
experimentalmente por otros autores y aplicando AFM, pero a redes metablicas ms
pequeas en el cual se considera el modelo determinado.
En general se pudo establecer que los flujos precursores en el ciclo de la UREA, en
especial el flujo de ORN es el que presenta mayor variacin frente a las limitaciones de
nutrientes consideradas.
En conclusin general, la comparacin de los resultados experimentales con los resulta-
dos obtenidos por FBA a diferentes funciones objetivo, result muy til, ya que se pudo
evaluar el potencial biolgico de este cultivo de S. clavuligerus. Entre los propsitos de
este tipo de estudio est el poder indicar algn objetivo o estrategia a seguir para la
manipulacin gentica o modificaciones en el proceso de produccin, que permitan
disminuir u optimizar los tiempos destinados para obtener mayores valores en los flujos
de AC.
204
ANEXO 2. PRODUCCIN CIENTFICA DERIVADA DE LA TESIS.
2. 1. TRABAJOS PUBLICADOS
Artculos en Revista (2)
Captulo 3:
C. Patricia, S. Henao, N. Andrea, G. Grimaldos, J. Carlos, and Q. Daz, Produccin de

cido clavulnico por fermentacin de Streptomyces clavuligerus: evaluacin de
diferentes medios de cultivo y modelado matemtico, Dyna, vol. 79, no. 1975, pp. 158
165, 2012.
Captulo 4:
SANCHEZ C. P., GOMEZ N. A., QUINTERO J. C., OCHOA S. and RIOS R. A

combined sensitivity and metabolic flux analysis unravel the importance of amino acid
feeding strategies on clavulanic acid biosynthesis in Streptomyces clavuligerus. Los
artculos sern publicados en la Serie: Advances in Intelligent Systems and
Computing de Springer (Esta serie ser indexada en Thomson Reuters y en la Base de
Datos de Proceeding por EI/Compendex y SCOPUS). (Aprobado).
N. A. Gmez, C. P. Snchez and J. C. Quintero, "Phenomenological Model of the

Clavulanic Acid production, inhibitor of the enzymes -lactamases using a method of
multiple regression analysis nonlinear" 2013 Panamerican Health Care Exchanges
(PAHCE) Conference, Worshops and exhibits. Cooperation/linkages. April 29-May 4,
2013, Medelln Colombia. ISBN 978-1-4673-6157-3. IEEEcatalog number CFP 13186-
ART; ISSN 2327-8161, pp. 1-4. www. ieeexplore.ieee.org/xpr/aboutUs.jsp
Trabajos en eventos (11)
PONENCIA ORAL "cintica de produccin de cido clavulnico en medios complejos,

usando diferentes concentraciones de glicerol como fuente de carbono. V Simposio
sobre Biofbricas y I Congreso de Flujos Reactivos. Agosto 30 y 31. Medelln-
Colombia, Universidad Nacional.
PONENCIA ORAL "Anlisis de flujo metablico in silico de la biosntesis de cido
clavulanico. Congreso Iberoamericano de Biotecnologa y Biodiversidad. Septiembre
21 al 24 de 2011. Manizales-Colombia.
205
PONENCIA ORAL Modelado de la cintica de Produccin de cido clavulanico
empleando un medio complejo. Congreso Iberoamericano de Biotecnologa y
Biodiversidad. Septiembre 21 al 24 de 2011. Manizales-Colombia.
PONENCIA ORAL Phenomenological Model of the Clavulanic acid production,
inhibitor of the enzymes -lactamases using a method of multiple regression analysis
nonlinear. VIII Panamerican Health Care Exchanges Conference (PAHCE-2013) y
el V Congreso Colombiano de Bioingeniera e Ingeniera Biomdica (V-CCBIO-
2013).Medelln- Colombia. Abril 29 a Mayo 4 de 2013.
PONENCIA ORAL. A combined metabolic flux and sensitivity analysis unravel the
importance of amino acid feeding strategies in clavulanic acid biosynthesis. Segundo
Congreso Colombiano de Biologa Computacional y Bioinformtica (CCBCOL 2013),
a presentar en Manizales del 25 al 27 de Septiembre de 2013.
PONENCIA EN POSTER "Anlisis de flujo metablico en la produccin de cido

clavulnico a partir de la fermentacin con Streptomyces clavuligerus". Congreso
Colombiano de Biologa Computacional. Fecha de realizacin: 23 al 25 de Marzo de
2011, Bogot, Colombia
PONENCIA EN POSTER Estudio del efecto de la variacin de la concentracin de
fosfato y glicerol sobre la biomasa de Streptomyces clavuligerus. XIV Congreso
Nacional de Biotecnologa y Bioingeniera. Fecha de realizacin: 19 al 24 de Junio de
2011, en Quertero, Mxico.
PONENCIA EN POSTER. Metabolic flux analysis of clavulanic acid biosynthesis
using glycerol as the unique carbon source. Libro de memorias del evento 12th
Mediterranean Congress of Chemical Engineering. Noviembre 15 al 18 de 2011.
Barcelona, Espaa.
PONENCIA EN POSTER. Determination of kinetic parameters for the production of
clavulanic acid antibiotic in culture of streptomyces clavuligerus using as source
nitrogen the soy flour. Libro de memorias del evento 12th Mediterranean Congress of
Chemical Engineering. Noviembre 15 al 18 de 2011. Barcelona, Espaa
PONENCIA EN POSTER. Evaluating ornithine effects on clavunic acid biosynthesis
with the aid of metabolic flux analysis. XV Congreso Nacional de Biotecnologa y
Bioingeniera y en el 12 Simposio Internacional sobre la Gentica de
Microorganismos Industriales (SMBB/GIM-2013). Junio 23 al 28 de 2013. Cancn,
Q.R., Mxico
PONENCIA EN POSTER. Modeling the production of clavulanic acid from
Streptomyces clavuligerus. XV Congreso Nacional de Biotecnologa y Bioingeniera y
206
en el 12 Simposio Internacional sobre la Gentica de Microorganismos Industriales
(SMBB/GIM-2013). Junio 23 al 28 de 2013. Cancn, Q.R., Mxico.
2.2. TRABAJOS EN REVISIN POR EL TUTOR.
Captulo 2.
ARTCULO 1. Fundamentos de la ingeniera metablica: caso de estudio produccin

de cido clavulnico. Revisin de literatura (en preparacin).
Captulo 5.
ARTCULO 2. Efecto de la limitacin de nutrientes en la produccin de AC a partir de

Streptomyces clavuligerus empleando anlisis de balance de flujos (FBA) (para
someter).
207

Análisis de Flujos Metabólicos en La Producción de Ácido Clavulánico

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ANLISIS DE FLUJOS METABLICOS EN LA

PRODUCCIN DE CIDO CLAVULNICO A PARTIR DE

CLAUDIA PATRICIA SNCHEZ HENAO

CLAUDIA PATRICIA SNCHEZ HENAO

Por los dones que me has dado y por iluminarme

Porque he aprendido no slo de los buenos resultados,

Por permitirme ser un ser integral.

La Universidad de Antioquia y a Colciencias, por el apoyo econmico al proyecto Modelado

A los profesores del Departamento de Alimentos de la Facultad de Qumica Farmacutica, por

LISTA DE TABLAS .............................................................................................. xii

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ xii

LISTA DE APNDICES ....................................................................................... xii

LISTA DE ANEXOS. ............................................................................................ xii

SUMMARY ......................................................................................................... xvii

SALUD PBLICA VS ENFERMEDADES INFECCIOSAS. ................................ 29

1.1. LOS ANTIBITICOS -LACTMICOS..................................................... 31

1.1.2. Clasificacin de los antibiticos. ............................................................... 33

1.2. RESISTENCIA MICROBIANA A LOS ANTIBITICOS. ........................... 36

1.3. PRODUCCIN INDUSTRIAL DE -LACTMICOS ................................. 38

METABOLISMO DE S. Clavuligerus .................................................................. 43

2.1. BIOLOGA DE Streptomyces sp. ................................................................. 44

2.1.1. Ciclo de Vida: ................................................................................................. 44

2.1.2. Clasificacin del microrganismo en estudio: ................................................. 48

2.1.4. Metabolitos secundarios producidos por Estreptomicetos: .......................... 51

2.2. CARACTERSTICAS METABLICAS DE Streptomyces .......................... 51

2.2.1. Requerimientos de energa........................................................................ 53

2.2.2. Sntesis de biomasa ................................................................................... 54

2.2.3. Ruta de Gluconeognesis. .......................................................................... 54

2.2.4. Ruta de las pentosas fosfato. ..................................................................... 54

2.2.5. El ciclo de Krebs (ciclo de los cidos tricarboxlicos)............................... 55

2.2.6. Ciclo de la urea. ......................................................................................... 56

2.2.7. Biosntesis de aminocidos: ....................................................................... 57

2.2.8. Biosntesis del cido clavulnico y otras clavamas ................................... 63

2.3. REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO Y FORMULACIN DEL

2.3.1. Fuentes de nitrgeno.................................................................................. 69

2.3.2. Fuentes de carbono: ................................................................................... 72

2.3.3. Estudios del efecto de la fuente de fsforo. ............................................... 73

2.3.4. Efecto de elementos trazas. ....................................................................... 74

2.3.5. Efecto del oxgeno .................................................................................... 75

2.4. TIPO DE OPERACIN: LOTE, LOTE ALIMENTADO y CONTINUO. ........ 78

2.5. MODELADO Y SIMULACIN EN BIOPROCESOS. ................................. 80

2.5.1. Modelado cintico de Streptomyces sp........ Error! Marcador no definido.

2.5.2. Modelado metablico .................................................................................. 85

PRODUCCIN DE CIDO CLAVULNICO POR FERMENTACIN DE

3.1. INTRODUCCIN .................................................................................... 116

3.2 MATERIALES Y MTODOS................................................................... 118

3.2. 1. Tcnicas microbiolgicas. ...................................................................... 118

3.2.2. Mtodos analticos .................................................................................. 120

3.2.3. Modelo matemtico. ............................................................................... 121

3.3. RESULTADOS Y DISCUSIN ............................................................... 122

3.3.1. Evaluacin de los medios de cultivo........................................................ 122

3.3.2. Evaluacin de la concentracin de glicerol. ............................................ 124

3.3.3. Fermentacin en biorreactor de laboratorio ............................................. 126

3.4. CONCLUSIONES ....................................................................................... 129

BIBLIOGRAFA ................................................................................................. 130

CAPTULO 4 ..................................................................................................... 133

UNA COMBINACIN DE ANLISIS DE SENSIBILIDAD Y AFM MUESTRAN

4.1. INTRODUCCIN ....................................................................................... 134

4.2. MATERIALES Y MTODOS:.................................................................. 136

4.2.1. Tcnicas microbiolgicas. ....................................................................... 136

4.2.2. Mtodos experimentales. ......................................................................... 138

4.2.3. Mtodos analticos ................................................................................... 141

4.2.4. Planteamiento de la red metablica. ........................................................ 143

4.2.5. Anlisis de flujos metablicos y de sensibilidad. .................................... 146